Il sequenziamento del DNA con il metodo Sanger sfrutta quale proprietà della sintesi del DNA per generare una scala di sequenziamento?
L'aggiunta di nucleotidi richiede un gruppo OH libero sull'estremità 3' del filamento di DNA
Il DNA ha un gruppo fosforilico libero in 5'
La DNA polimerasi ha capacità di correzione di bozze
I nucleotidi sono legati da legami fosfodiestere
L'aggiunta di nucleotidi richiede un gruppo OH libero sull'estremità 3' del filamento di DNA. Il metodo Sanger di sequenziamento del DNA è noto anche come sequenziamento della terminazione di catena. In questo metodo, i filamenti di DNA vengono sintetizzati in presenza di una bassa concentrazione di dideossinucleosidi (ddNTP) oltre ai deossinucleosidi (dNTP). L'incorporazione di un dNTP consente alla sintesi di continuare poiché è presente un gruppo 3'-OH libero per l'aggiunta del nucleotide successivo. L'incorporazione di un ddNTP termina la sintesi del filamento di DNA poiché non esiste un gruppo 3-OH libero per l'aggiunta del nucleotide successivo. Nel sequenziamento di Sanger vengono eseguite quattro reazioni (A, C, T e G), ciascuna contenente il ddNTP appropriato. La miscela di filamenti di DNA generata in ciascuna reazione include filamenti che terminano in ciascun nucleotide (ad esempio, la reazione A contiene filamenti di DNA terminati in ciascun nucleotide). Le quattro reazioni vengono eseguite una accanto all'altra su un gel di acrilammide per separare i filamenti in base alle dimensioni. La sequenza del DNA viene determinata leggendo l'ordine delle catene terminate che risalgono il gel.