I metodi per introdurre il gene nelle cellule bersaglio sono tutti tranne:
Elettroporazione
Trasfezione
Ricombinazione diretta al sito
PESCARE
FISH L'ibridazione fluorescente in situ (FISH) è un metodo per rilevare o confermare anomalie genetiche o cromosomiche. Utilizza sonde di DNA marcate in modo fluorescente. Il DNA del campione viene prima denaturato (un processo che separa i filamenti complementari all'interno della struttura a doppia elica del DNA), quindi la sonda di interesse marcata in modo fluorescente viene aggiunta alla miscela del campione denaturato e si ibrida con il DNA del campione nel sito target mentre si ricompatta (o si riforma stesso) di nuovo in una doppia elica. Il segnale della sonda può quindi essere visto attraverso un microscopio a fluorescenza e il DNA del campione può essere valutato per la presenza o l'assenza del segnale. La terapia genica è una tecnica per correggere i geni difettosi responsabili dello sviluppo della malattia. inserire il seme in una posizione non specifica all'interno del genoma per sostituire un gene non funzionale. Una molecola trasportatrice chiamata vettore viene utilizzata per fornire il gene terapeutico alle cellule bersaglio del paziente. Attualmente, il vettore più comune è un virus che è stato geneticamente modificato per trasportare il normale DNA umano. Oltre ai sistemi di consegna genica mediati da virus, esistono diverse opzioni non virali per la consegna genica. Il metodo più semplice è l'introduzione diretta del DNA terapeutico nelle cellule bersaglio. Questo approccio è limitato nella sua applicazione perché può essere utilizzato solo con tessuti ceini e richiede grandi quantità di DNA. La trasfezione è definita come il processo di introduzione deliberata di acidi nucleici nelle cellule. Il termine viene utilizzato soprattutto per i metodi non virali. "Trasduzione" è il termine spesso utilizzato per descrivere il trasferimento del DNA mediato dal virus. Metodi di trasferimento genico Esistono vari metodi per introdurre DNA estraneo in una cellula eucariotica: alcuni si basano su trattamenti fisici (elettroporazione, nanopaicle, magnetofezione), altri su materiali chimici o paicle biologici (virus) che vengono utilizzati come trasportatori. Trasfezione chimica Il DNA terapeutico può penetrare nelle cellule bersaglio collegando chimicamente il DNA a una molecola che si legherà a speciali recettori cellulari. Una volta legati a questi recettori, i costrutti di DNA terapeutico vengono fagocitati dalla membrana cellulare e fatti passare all’interno della cellula bersaglio. I metodi utilizzati sono: a) Fosfato di calcio: (questo metodo dipende dall'uso di una soluzione salina tamponata con HEPES contenente cloruro di calcio per fornire il DNA plasmidico. La soluzione salina tamponata con HEPES (HeBS) contenente ioni fosfato è combinata con un cloruro di calcio soluzione contenente il DNA da trasfettare Quando i due vengono combinati, si formerà un fine precipitato di calcio caricato positivamente e fosfato caricato negativamente, che legherà il DNA da trasfettare sulla sua superficie cellule da trasfettare (solitamente una coltura cellulare coltivata in un monostrato). Mediante un processo non del tutto compreso, le cellule assorbono parte del precipitato e con esso il DNA.) b) Dendrimeri: sono composti organici altamente ramificati. utilizzato per legare il DNA e inserirlo nella cellula. C) Liposomi: sono piccoli corpi delimitati dalla membrana che sono in qualche modo simili alla struttura di una cellula e possono effettivamente fondersi con la membrana cellulare, rilasciando il DNA nella cellula. d) Polimeri cationici: come DEAE-destrano o polietilenimmina. Il DNA carico negativamente si lega al policatione e il complesso viene assorbito dall'endocitosi cellulare. Metodi non chimici a) Elettroporazione: è una tecnica mediante la quale la permeabilità della membrana plasmatica viene aumentata temporaneamente utilizzando una piccola corrente elettrica in modo da consentire l'assorbimento nella cellula delle macromolecole extracellulari (compreso il DNA). b) Sonoporazione: simile all'elettroporazione, la sonoporazione è l'uso del suono (tipicamente frequenze ultrasoniche) per modificare la permeabilità della membrana plasmatica cellulare. c) Trasfezione ottica: è un metodo in cui un minuscolo foro (--1 µm di diametro) viene generato transitoriamente nella membrana plasmatica di una cellula utilizzando un laser altamente focalizzato. d) Impalefezione: è un metodo di trasferimento genico utilizzando nanomateriali, come nanofibre di carbonio, nanolubi di carbonio, nanofili e) Consegna idrodinamica: dipende dalla rapida iniezione di un grande volume acquoso contenente DNA, RNA o altre molecole nei vasi sanguigni. Metodi basati su Paicle Gene gun: un approccio diretto alla trasfezione è il gene gull, in cui il DNA è accoppiato a un nanopaicle di un solido sottile (comunemente oro) che viene poi "sparato" direttamente nel nucleo della cellula bersaglio. Magnetofezione: o trasfezione assistita da magnete è un metodo di trasfezione che utilizza la forza magnetica per fornire DNA nelle cellule bersaglio. Gli acidi nucleici vengono inizialmente associati a nanopaicoli magnetici. Quindi, l'applicazione della forza magnetica spinge i complessi delle particelle di acido nucleico verso e nelle cellule bersaglio, dove viene rilasciato il carico.