Non è un componente della PCR?
Primer
Taq polimerasi
DNA polimerasi
Enzima di restrizione
I passaggi in PCRPCR utilizzano la DNA polimerasi per amplificare ripetutamente il veleno mirato del DNA. Ogni ciclo raddoppia la quantità di DNA nel campione, portando ad un aumento esponenziale con cicli ripetuti di amplificazione. Pertanto l'amplificazione dopo 'n' numero di cicli in (2)". Venti cicli forniscono un'amplificazione di 106 (milioni) e 30 cicli di 109 (miliardi). La PCR avviene nei seguenti passaggi -i) Isolamento della sequenza di DNA target: - A Il DNA contenente le sequenze da amplificare viene isolato. ii) Costruzione dei primer:- La sequenza della regione fiancheggiante (sequenza nucleotidica di segmenti sho su ciascun lato della sequenza di DNA target) viene utilizzata per costruire 2 oligonucleotidi a filamento singolo che sono complementari ai rispettivi fiancheggianti regione Questi oligonucleotidi funzionano come primer nella reazione PCR.iii) Denaturazione del DNA: - Il DNA bersaglio viene riscaldato per separare il doppio filamento del DNA in singoli filamenti.iv) Ricottura dei primer su DNA a filamento singolo: - I filamenti separati vengono raffreddati e lasciato ricotturare ai due primer, uno per ciascun filamento.v) Estensione della catena: la DNA polimerasi e i deossiribonucleotidi (dNTP) vengono aggiunti alla miscela La DNA polimerasi (Taq polimerasi) utilizza quindi il primer per la sintesi del DNA utilizzando i filamenti bersaglio come modelli. Su entrambi i filamenti, il Primer è amplificato nella direzione 5'-43' mediante aggiunta di nucleotidi (dNTP) all'estremità 3'. La miscela viene nuovamente riscaldata per sciogliere (separare) tutta la struttura a doppio filamento. Ora ci sono quattro filamenti di DNA. Un secondo ciclo di raffreddamento consente il ulteriore legame dei primer e viene ripetuto un secondo ciclo di polimerizzazione. Il processo di riscaldamento (denaturazione), raffreddamento (ricottura) e polimerizzazione viene ripetuto molte volte. Poiché la Taq polimerasi non viene denaturata con il riscaldamento e pertanto non deve essere aggiunta ad ogni ciclo successivo. Pertanto nella PCR sono richiesti: - Target double DNA a filamento, due primer specifici, una DNA polimerasi termostabile (Taq polimerasi), desossiribonucleotidi (dNTP).