L'epigenetica si occupa delle modificazioni genetiche che non alterano la sequenza del DNA. Tutti i seguenti elementi possono rilevare modifiche epigenetiche tranne:
HPLC
PCR specifica per la metilazione
Metodo del bisolfito
Chip su chip
Ris. UN. HPLC (Rif: Robbins 9/e p180, 319-320 8/e p180-181) La PCR specifica per la metilazione, il metodo bisolfito e ChlP on Chip possono rilevare la modificazione epigenetica ma non l'HPLC. L'epigenetica è definita come lo studio della modificazione chimica ereditaria di DNA o cromatina che non altera la sequenza stessa del DNA. Esempi di tali modifiche includono la metilazione del DNA e la metilazione e acetilazione degli istoni. Poiché il sequenziamento tradizionale di Sanger da solo non è in grado di rilevare la metilazione del DNA; altre tecniche sono state sviluppate per scoprire queste modifiche chimiche. Un approccio comune è quello di trattare il DNA genomico con bisolfito di sodio, una sostanza chimica che converte le citosine non metilate in uracile, le citosine metilate bianche sono protette dalle modifiche. Un test chiamato PCR specifica per la metilazione utilizza due set di primer per PCR per analizzare singoli loci del DNA: uno per rilevare una sequenza di DNA con citosine non metilate (che vengono convertite in uracili dopo il trattamento con bisolfito) e l'altro per rilevare sequenze di DNA con citosine metilate (che rimangono citosine dopo il trattamento con bisolfito). Si stanno evolvendo ulteriori tecniche che forniscono un'istantanea dell'intero genoma del DNA epigeneticamente alterato. Queste tecniche si basano sulla capacità di rilevare modifiche degli istoni come la metilazione e l'acetilazione (che, come la metilazione del DNA, sono importanti regolatori dell'espressione genica) utilizzando anticorpi contro istoni specificamente modificati. Tali anticorpi possono essere utilizzati per abbattere sequenze di DNA legate, un metodo chiamato immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). Queste sequenze pull-down possono essere amplificate e analizzate mediante ibridazione su microarray ("ChIP on Chip") o sequenziamento ("ChIP-Seq") per mappare geni epigeneticamente modificati in tutto il genoma. - Robbins 8/e p180 Isolamento delle cellule della risposta immunitaria* Utilizzare il numero corretto di cellule: da 1 x 106 x a 10 x 106* Raccogliere replicati biologici delle cellule* Scegliere un controllo appropriato per la specificità dell'anticorpo (knockout o knockdown RNAi)Frammentazione mediante sonicazione o trattamento con MNasi* Tagliare la cromatina a un intervallo di dimensioni di ~ 150-300 bp* Sonicare gli estratti di cromatina per proteine ​​non istoniche Le condizioni di sonicazione devono essere determinate empiricamente per ciascun tipo di cellulaTrattare gli estratti di cromatina con MNasi per l'analisi delle modifiche dell'istoneNon digerire eccessivamente la cromatinaAnalisi ChIP di modifiche istoniche, fattori di trascrizione o regolatori epigenetici* Selezionare l'anticorpo: monoclonale o policlonale* Scegliere il controllo di riferimento (Input o IgG)* Eseguire ChIP con protocolli stabiliti* Purificare la costruzione della DNALibrary* Eseguire la riparazione delle estremità e la legatura dell'adattatore* Eseguire la PCR utilizzando primer compatibili con la piattaforma di sequenziamentoEvitare sovraamplificazione del DNA Sequenziamento* Determinare la profondità di sequenziamento sulla base della prevalenza del legame in tutto il genoma: potrebbero essere necessari più tag di sequenziamento per segnali diffusi (come H3K27me3)* Eseguire sequenziamento single-end o paired-endAlterazioni epigeneticheL'epigenetica è definita come lo studio di modifica chimica ereditaria del DNA o della cromatina che non altera la sequenza del DNA stessa. Esempi di tale modifica includono la metilazione del DNA. e la metilazione e l'acetilazione degli istoni. D. Poiché il tradizionale sequenziamento Sanger da solo non è in grado di rilevare la metilazione del DNA, sono state sviluppate altre tecniche per scoprire queste modifiche chimiche. Un approccio comune è quello di trattare il DNA genomico con bisolfito di sodio, una sostanza chimica che converte le citosine non metilate in uracile, mentre le citosine metilate sono protette dalle modificheQ. Un test chiamato PCR specifica per la metilazione utilizza due set di primer per PCR per analizzare singoli loci del DNA: uno per rilevare una sequenza di DNA con citosine non metilate (che vengono convertite in uracili dopo il trattamento con bisolfito) e l'altro per rilevare Sequenze di DNA con citosine metilateQ (che rimangono citosine dopo il trattamento con bisolfito). Si stanno sviluppando ulteriori tecniche che forniscono un'istantanea dell'intero genoma del DNA epigeneticamente alterato. Queste tecniche si basano sulla capacità di rilevare modifiche degli istoni come la metilazione e l'acetilazione (che, come metilazione del DNA, sono importanti regolatori dell'espressione genica) utilizzando anticorpi contro istoni specificatamente modificati. Tali anticorpi possono essere utilizzati per abbattere sequenze di DNA legate, un metodo chiamato immunoprecipitazione della cromatina (ChlP). Queste sequenze estratte possono essere amplificate e analizzate mediante ibridazione su microarray ("ChlP on Chip") o sequenziamento ("ChIP-Seq" ) per mappare i geni epigeneticamente modificati in tutto il genoma.
Molecular Biology Techniques