Per la PCR quale dei seguenti non è richiesto:
Taq polimerasi
d-NTP
Primer
Sonda per DNA radiomarcato
Sonda per DNA radiomarcato La Polymerase Chain ReactionPCR è un metodo in provetta privo di cellule per amplificare una sequenza target di DNA. È molto più veloce e più sensibile della clonazione basata su cellule. Materiali richiesti: Due primer, ciascuno lungo circa 20-35 basi con sequenza complementare alla sequenza immediatamente adiacente al segmento di DNA di interesse (sequenza fiancheggiante). DNA polimerasi (ad esempio, Taq polimerasi) che può sostenere alte temperature (> 600 C). Un gran numero di deossinucleotidi liberi (dNTP). Il frammento di DNA bersaglio.Procedura:Ci sono tre passaggi principali in una PCR, che vengono ripetuti per 20 o 30 cicli.a. Denaturazione termica: il campione di DNA da amplificare viene prima riscaldato per separare i due filamenti b. Ricottura: i primer si legano ai due filamenti separati di DNA (uno per ciascun filamento) che fiancheggiano la sequenza target. c. Estensione: ciascun filamento viene copiato da la DNA polimerasi, colorando il sito del primer. I due filamenti di DNA servono ciascuno come modello per la sintesi di nuovo DNA dai due primer. I tre passaggi precedenti vengono ripetuti ancora e ancora. Il numero di copie raddoppia ad ogni ciclo. In genere durante questo processo vengono eseguiti 20-30 cicli. Si verifica un aumento esponenziale della quantità di DNA bersaglio, amplificandolo da un milione di volte a un miliardo di volte. Utilizzando una DNA polimerasi stabile al calore (Taq polimerasi), la polimerasi non viene denaturata e quindi non deve essere aggiunto ad ogni ciclo successivo.Vantaggi:Il vantaggio principale della PCR rispetto alla clonazione come meccanismo per amplificare una sequenza specifica di DNA è la sensibilità: le sequenze di DNA presenti solo in tracce possono essere amplificate per diventare la sequenza predominante senza alcuna difficoltà tecnica rispetto ai tradizionali metodi di clonazione che utilizzano DNA ricombinante tecniche. Svantaggi: per sintetizzare i primer, dobbiamo conoscere la sequenza che fiancheggia il segmento di DNA di interesse. Si applica solo ai frammenti di DNA sho, in genere inferiori a 10 kb.