Non è un componente della PCR
Primer
Taq polimerasi
DNA polimerasi
Enzima di restrizione
REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR): La PCR è una procedura di amplificazione del DNA in vitro in cui milioni di copie di una particolare sequenza di DNA possono essere prodotti in poche ore. Dovrebbero essere note le sequenze fiancheggianti del gene dell'interset. Possono essere sintetizzati due primer di DNA di circa 20-30 nucleotidi con sequenza complementare della regione fiancheggiante. FASE 1: Separazione (denaturazione): i filamenti di DNA vengono separati (fusi) riscaldando a 95 gradi Celsius per 15 secondi - 2 minuti. FASE 2: Adescamento (ricottura): i primer vengono ricotti raffreddando a 50 gradi Celsius per un tempo compreso tra 0,5 e 2 minuti. FASE 3: Polimerizzazione: i filamenti di DNA Nw sono sintetizzati dalla Taq polimerasi. Questo enzima è derivato dal bactris Thermus acquaticus che si trova nelle sorgenti termali. Pertanto l'enzima non viene denaturato ad alta temperatura. La reazione della polimerasi può avvenire a 72 gradi Celsius per 30 secondi in presenza di dNTP. Entrambi i filamenti di DNA vengono duplicati in questa fase. FASE 4: Vengono ripetuti i passaggi 1, 2 e 3. In ogni ciclo, i filamenti di DNA vengono raddoppiati. Pertanto 20 cicli forniscono 1 milione di amplificatine. Questi cicli vengono generalmente ripetuti da uno strumento automatizzato, chiamato Termociclatore. FASE 5: Dopo la procedura di amplificazione, la tecnica di ibridazione del DNA o l'analisi Southern blot con una sonda adatta, mostra la presenza del DNA nel tessuto campione. RIF:DM VASUDEVAN LIBRO DI TESTO:7a EDIZIONE; Pagina n.:638
Metabolism of nucleic acids