Di seguito sono richiesti per la PCR tranne:
Deossiribonucleotidi
Taq polimerasi
Dideossiribonucleotidi
DNA modello
Ris. C. DideossiribonucleotidiReazione a catena della polimerasia. La reazione a catena della polimerasi (PCR) è un metodo in provetta per amplificare una sequenza di DNA selezionata che non si basa sul metodo di clonazione biologica. La PCR consente la sintesi di milioni di copie di una specifica sequenza nucleotidica in poche ore.b. Può amplificare la sequenza, anche quando la sequenza target costituisce meno di una parte su un milione del campione iniziale totale. Il metodo può essere utilizzato per amplificare sequenze di DNA da qualsiasi fonte: batterica, virale, vegetale o animale.A. Le fasi di un PCRPCR utilizzano la DNA polimerasi per amplificare ripetutamente porzioni mirate di DNA. Ogni ciclo di amplificazione raddoppia la quantità di DNA nel campione, portando ad un aumento esponenziale del DNA con cicli ripetuti di amplificazione. La sequenza di DNA amplificata può quindi essere analizzata mediante elettroforesi su gel, ibridazione Southern o determinazione della sequenza diretta.a. Costruzione del primer: non è necessario conoscere la sequenza nucleotidica del DNA target nel metodo PCR. Tuttavia, è necessario conoscere la sequenza nucleotidica dei brevi segmenti su ciascun lato del DNA bersaglio. Questi tratti, chiamati sequenze fiancheggianti, racchiudono la sequenza di DNA di interesse. Le sequenze nucleotidiche delle regioni fiancheggianti vengono utilizzate per costruire due oligonucleotidi a filamento singolo, solitamente lunghi 20-35 nucleotidi, che sono complementari alle rispettive sequenze fiancheggianti. L'estremità 3'-idrossile di ciascun primer punta verso la sequenza target. Questi oligonucleotidi sintetici funzionano come primer nelle reazioni PCR.b. Denaturare il DNA: il DNA da amplificare viene riscaldato per separare il DNA bersaglio a doppio filamento in singoli filamenti.c. Ricottura dei primer su ssDNA: i filamenti separati vengono raffreddati e lasciati ricotturare ai due primer (uno per ciascun filamento).d. Estensione della catena: la DNA polimerasi e i trifosfati desossiribonucleosidici (in eccesso) vengono aggiunti alla miscela per avviare la sintesi di due nuove catene complementari alle catene di DNA originali. La DNA polimerasi aggiunge nucleotidi all'estremità 3'-idrossile del primer e la crescita del filamento si estende attraverso il DNA bersaglio, creando copie complementari del bersaglio. Al completamento di un ciclo di replicazione, la miscela di reazione viene nuovamente riscaldata per denaturare i filamenti di DNA (che ora sono quattro). Ciascun filamento di DNA si lega a un primer complementare e il ciclo di estensione della catena si ripete. Utilizzando una DNA polimerasi termostabile (ad esempio la Taq polimerasi) proveniente da un batterio (ad esempio Thermus acquatico) che normalmente vive ad alte temperature (un batterio termofilo), la polimerasi non viene denaturata e, quindi, non deve essere aggiunto ad ogni ciclo successivo. Durante questo processo vengono eseguiti tipicamente 20-30 cicli, amplificando il DNA da un milione a un miliardo di volte. e. I dideossiribonucleotidi assomigliano esattamente ai desossiribonucleotidi tranne per il fatto che non hanno un gruppo OH sul terzo carbonio dello zucchero.f. Ciò ha implicazioni molto serie. Questi nucleotidi possono aggiungersi alla catena del DNA in crescita (perché hanno un fosfato sul quinto carbonio che può legarsi all'ossidrile sul terzo carbonio del nucleotide all'estremità della catena in crescita) ma una volta attaccati non è possibile aggiungere ulteriori nucleotidi .G. In altre parole, i didesossiribonucleotidi agiscono come terminatori di catena. Una volta incorporati, la polimerizzazione termina. È la capacità di terminare le catene con queste molecole che costituisce la base per il sequenziamento del DNA mediante la procedura Sanger.
Molecular Genetics