Cần có sự hiện diện của ion Mg ++ và nồng độ tối ưu là 10mM. T4 DNA ligase có khả năng độc nhất để nối các đoạn kết thúc dính và cùn. Thắt đầu kết dính được thực hiện ở 12 ° C đến 16 ° C để duy trì sự cân bằng tốt giữa ủ các đầu và hoạt động của enzym.