Kháng thể thứ cấp liên kết với enzym được áp dụng làm kháng thể phát hiện cũng liên kết đặc hiệu với vùng Fc của kháng thể (không đặc hiệu). Đĩa được rửa để loại bỏ các liên hợp kháng thể-enzym không liên kết. Một chất hóa học được thêm vào để chuyển đổi bởi enzyme thành màu sắc hoặc tín hiệu huỳnh quang hoặc điện hóa.