Asetilkolin juga digunakan sebagai neurotransmitter dalam sistem saraf otonom, baik sebagai pemancar internal untuk sistem saraf simpatik dan sebagai produk akhir yang dilepaskan oleh sistem saraf parasimpatis. Setilkolin memiliki fungsi baik di sistem saraf perifer (PNS) dan di sistem saraf. sistem saraf pusat (SSP) sebagai neuromodulator. Dalam sistem saraf perifer, asetilkolin mengaktifkan otot, dan merupakan neurotransmitter utama dalam sistem saraf otonom.