Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada penyangga padat (biasanya pelat mikrotiter polistiren) baik secara non-spesifik (melalui adsorpsi ke permukaan) atau secara spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk antigen yang sama, dalam sandwich ELISA ). antibodinya terkait dengan enzim, dan, pada langkah terakhir, zat yang mengandung substrat enzim ditambahkan. Reaksi selanjutnya menghasilkan sinyal yang dapat dideteksi, yang paling umum adalah perubahan warna pada substrat. Melakukan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifisitas untuk antigen tertentu.