Kehadiran ion Mg++ diperlukan dan konsentrasi optimal adalah 10mM. T4 DNA ligase memiliki kemampuan unik untuk menggabungkan fragmen ujung yang lengket dan tumpul. Ligasi ujung kohesif dilakukan pada suhu 12Ãƒâ€šÃ‚Â°C hingga 16Ãƒâ€šÃ‚Â°C untuk menjaga keseimbangan yang baik antara annealing ujung dan aktivitas enzim.