Bisulfite sequencing
বাইসালফাইট সিকোয়েন্সিং (বাইসালফাইট সিকোয়েন্সিং নামেও পরিচিত) হল মিথাইলেশনের প্যাটার্ন নির্ধারণের জন্য রুটিন সিকোয়েন্সিংয়ের আগে ডিএনএর বাইসালফাইট চিকিৎসার ব্যবহার। ডি. এন. এ মিথাইলেশন ছিল প্রথম আবিষ্কৃত এপিজেনেটিক চিহ্ন, এবং এখনও সবচেয়ে বেশি অধ্যয়নরত। প্রাণীদের মধ্যে এটি প্রধানত ডাইনিউক্লিওটাইড সিপিজির সাইটোসিন অবশিষ্টাংশের কার্বন-5 অবস্থানে একটি মিথাইল গ্রুপের সংযোজন জড়িত, এবং প্রতিলিপিগত ক্রিয়াকলাপের দমনে জড়িত। বাইসালফাইট দিয়ে ডি. এন. এ-র চিকিৎসা সাইটোসিনের অবশিষ্টাংশকে ইউরাসিলে রূপান্তরিত করে, তবে 5-মিথাইলসাইটোসিনের অবশিষ্টাংশকে প্রভাবিত করে না। অতএব, বাইসালফাইট দিয়ে চিকিত্সা করা ডি. এন. এ শুধুমাত্র মিথাইলেটেড সাইটোসিন ধরে রাখে। এইভাবে, বাইসালফাইট চিকিৎসা ডিএনএ অনুক্রমের নির্দিষ্ট পরিবর্তন প্রবর্তন করে যা পৃথক সাইটোসিন অবশিষ্টাংশের মিথাইলেশন অবস্থার উপর নির্ভর করে, ডিএনএ-র একটি অংশের মিথাইলেশন অবস্থা সম্পর্কে একক-নিউক্লিওটাইড রেজোলিউশন তথ্য প্রদান করে। এই তথ্য পুনরুদ্ধারের জন্য পরিবর্তিত ক্রমের উপর বিভিন্ন বিশ্লেষণ করা যেতে পারে। এই বিশ্লেষণের উদ্দেশ্য তাই বাইসালফাইট রূপান্তরের ফলে একক নিউক্লিওটাইড পলিমরফিজমের (সাইটোসিন এবং থাইমাইডিন) মধ্যে পার্থক্য হ্রাস করা হয় (চিত্র 1)। পদ্ধতি বিসালফাইট সিকোয়েন্সিং সিপিজি ডাইনুক্লিওটাইডগুলিতে মিথাইলেশন অবস্থা নির্ধারণ করতে বাইসালফাইট-ট্রিটেড জিনোমিক ডিএনএর উপর নিয়মিত সিকোয়েন্সিং পদ্ধতি প্রয়োগ করে। নির্দিষ্ট স্থানে বা জিনোম-ব্যাপী স্তরে মিথাইলেশনকে জিজ্ঞাসাবাদ করার জন্য অন্যান্য অ-অনুক্রম কৌশলও নিযুক্ত করা হয়। সমস্ত কৌশলগুলি ধরে নেয় যে বাইসালফাইট-প্ররোচিত অ-মিথাইলযুক্ত সাইটোসিনের ইউরাসিলে রূপান্তর সম্পূর্ণ হয়েছে এবং এটি পরবর্তী সমস্ত কৌশলের ভিত্তি হিসাবে কাজ করে। আদর্শভাবে, ব্যবহৃত পদ্ধতিটি প্রতিটি অ্যালিলের জন্য আলাদাভাবে মিথাইলেশন অবস্থা নির্ধারণ করবে। বাইসালফাইট সিকোয়েন্সিংয়ের বিকল্প পদ্ধতির মধ্যে রয়েছে কম্বাইন্ড বাইসালফাইট রিস্ট্রিক্শন অ্যানালাইসিস এবং মিথাইলেটেড ডিএনএ ইমিউনোপ্রেসিপিটেশন (এমইডিআইপি)। বাইসালফাইট-চিকিত্সা করা ডিএনএ বিশ্লেষণের পদ্ধতিগুলি ক্রমাগত বিকশিত হচ্ছে। এই দ্রুত বিবর্তিত পদ্ধতিগুলির সংক্ষিপ্তসার হিসাবে, অসংখ্য পর্যালোচনা নিবন্ধ লেখা হয়েছে। পদ্ধতিগুলিকে সাধারণত মিথাইলেশন-নির্দিষ্ট পিসিআর (এমএসপি) (চিত্র 4) এর উপর ভিত্তি করে কৌশলগুলিতে বিভক্ত করা যেতে পারে এবং পলিমারিস চেইন রিঅ্যাকশন (পিসিআর) নিযুক্ত কৌশলগুলি অ-মিথাইলেশন-নির্দিষ্ট অবস্থার অধীনে সঞ্চালিত হয় (চিত্র 3)। মাইক্রো-অ্যারে-ভিত্তিক পদ্ধতিগুলি অ-মিথাইলেশন-নির্দিষ্ট অবস্থার উপর ভিত্তি করে পিসিআর ব্যবহার করে। অ-মিথাইলায়ন-নির্দিষ্ট পিসিআর ভিত্তিক পদ্ধতি সরাসরি সিকোয়েন্সিং বাইসালফাইট-ট্রিটেড ডিএনএ ব্যবহার করে মিথাইলেশন বিশ্লেষণের প্রথম রিপোর্ট করা পদ্ধতিটি বাইসালফাইট রূপান্তর প্রতিরোধী নিউক্লিওটাইডগুলি সরাসরি নির্ধারণ করতে পিসিআর এবং স্ট্যান্ডার্ড ডাইডিওক্সিন্যুক্লিয়টাইড ডিএনএ সিকোয়েন্সিং ব্যবহার করে। প্রাইমারগুলি স্ট্র্যান্ড-নির্দিষ্ট হওয়ার পাশাপাশি বাইসালফাইট-নির্দিষ্ট হওয়ার জন্য ডিজাইন করা হয়েছে (অর্থাৎ, নন-সিপিজি সাইটোসিনযুক্ত প্রাইমারগুলি যেমন তারা নন-বাইসালফাইট-ট্রিটেড ডিএনএর পরিপূরক নয়), আগ্রহের মিথাইলেশন সাইটের পার্শ্ববর্তী (তবে জড়িত নয়)। অতএব, এটি মিথাইলেশন-নির্দিষ্ট পিসিআর-এর বিপরীতে মিথাইলেটেড এবং আনমিথাইলেটেড উভয় ক্রমকেই প্রশস্ত করবে। অমাইথাইলেটেড সাইটোসিনের সমস্ত সাইট ইন্দ্রিয় স্ট্র্যান্ডের ফলস্বরূপ পরিবর্ধিত ক্রমে থাইমিন হিসাবে এবং পরিবর্ধিত অ্যান্টিসেন্স স্ট্র্যান্ডে অ্যাডেনিন হিসাবে প্রদর্শিত হয়। পিসিআর প্রাইমারগুলিতে উচ্চ থ্রুপুট সিকোয়েন্সিং অ্যাডাপ্টারগুলিকে অন্তর্ভুক্ত করে, পিসিআর পণ্যগুলিকে ব্যাপকভাবে সমান্তরাল সিকোয়েন্সিংয়ের সাথে সিকোয়েন্স করা যেতে পারে। বিকল্পভাবে, এবং শ্রম-নিবিড়ভাবে, পিসিআর পণ্য ক্লোন এবং সিকোয়েন্স করা যেতে পারে। নেস্টেড পিসিআর পদ্ধতিগুলি সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য পণ্যটি উন্নত করতে ব্যবহার করা যেতে পারে। বাইসালফাইট-ট্রিটেড ডিএনএ ব্যবহার করে পরবর্তী সমস্ত ডিএনএ মিথাইলেশন বিশ্লেষণ কৌশল ফ্রমর এট আল-এর এই প্রতিবেদনের উপর ভিত্তি করে তৈরি। (চিত্র 2)। যদিও বেশিরভাগ অন্যান্য পদ্ধতিগুলি প্রকৃত সিকোয়েন্সিং-ভিত্তিক কৌশল নয়, "বাইসালফাইট সিকোয়েন্সিং" শব্দটি প্রায়শই সাধারণভাবে বাইসালফাইট-রূপান্তর ডিএনএ মিথাইলেশন বিশ্লেষণ কৌশলগুলি বর্ণনা করতে ব্যবহৃত হয়। মিথাইলেশন-নির্দিষ্ট পিসিআর ব্যবহার না করে বাইসালফাইট-ট্রিটেড ডিএনএ বিশ্লেষণ করতেও পাইরোসেকুয়েন্সিং ব্যবহার করা হয়েছে। আগ্রহী অঞ্চলের পিসিআর পরিবর্ধন অনুসরণ করে, এই অঞ্চলের নির্দিষ্ট সিপিজি সাইটগুলির বাইসালফাইট-রূপান্তরিত ক্রম নির্ধারণ করতে পাইরোসিকোয়েন্সিং ব্যবহার করা হয়। পৃথক স্থানে সি-টু-টি-র অনুপাত ক্রম সম্প্রসারণের সময় সি এবং টি অন্তর্ভুক্তির পরিমাণের উপর ভিত্তি করে পরিমাণগতভাবে নির্ধারণ করা যেতে পারে। এই পদ্ধতির প্রধান সীমাবদ্ধতা হল প্রযুক্তির খরচ। যাইহোক, পাইরোসেকুয়েন্সিং উচ্চ-থ্রুপুট স্ক্রিনিং পদ্ধতিতে সম্প্রসারণের অনুমতি দেয়। ওয়াং এবং অন্যান্যদের দ্বারা বর্ণিত এই কৌশলের একটি বৈকল্পিক অ্যালিল-নির্দিষ্ট প্রাইমার ব্যবহার করে যা একক-নিউক্লিওটাইড পলিমরফিজমকে সিকোয়েন্সিং প্রাইমারের ক্রমে অন্তর্ভুক্ত করে, এইভাবে মাতৃ এবং পিতৃ অ্যালিলগুলির পৃথক বিশ্লেষণের অনুমতি দেয়। জিনোমিক ইমপ্রিন্টিং বিশ্লেষণের জন্য এই কৌশলটি বিশেষভাবে কার্যকর। মিথাইলেশন-সংবেদনশীল একক-স্ট্র্যান্ড গঠন বিশ্লেষণ (এমএস-এস. এস. সি. এ) এই পদ্ধতিটি একক-নিউক্লিওটাইড পলিমরফিজম (এস. এন. পি) বিশ্লেষণের জন্য বিকশিত একক-স্ট্র্যান্ড গঠন পলিমরফিজম বিশ্লেষণ (এস. এস. সি. এ) পদ্ধতির উপর ভিত্তি করে তৈরি। এস. এস. সি. এ নন-ডিনাচুরেটিং ইলেক্ট্রোফোরেসিসে ডিফারেনশিয়াল মাইগ্রেশনের উপর ভিত্তি করে অভিন্ন আকারের কিন্তু স্বতন্ত্র ক্রমের একক-স্ট্র্যান্ডেড ডি. এন. এ টুকরোগুলির মধ্যে পার্থক্য করে। এমএস-এস. এস. সি. এ-তে, এটি বাইসালফাইট-ট্রিটেড, পি. সি. আর-পরিবর্ধিত অঞ্চলগুলির মধ্যে পার্থক্য করতে ব্যবহৃত হয় যেখানে সি. পি. জি সাইটগুলি রয়েছে। যদিও এস. এস. সি. এ-তে সংবেদনশীলতার অভাব থাকে যখন শুধুমাত্র একটি নিউক্লিওটাইডের পার্থক্য উপস্থিত থাকে, বাইসালফাইট চিকিত্সা প্রায়শই আগ্রহের বেশিরভাগ অঞ্চলে বেশ কয়েকটি সি-টু-টি রূপান্তর করে এবং ফলস্বরূপ সংবেদনশীলতা <আই. ডি1>-এর কাছে পৌঁছায়। এমএস-এস. এস. সি. এ ব্যান্ড তীব্রতার অনুপাতের উপর ভিত্তি করে ডি. এন. এ মিথাইলেশনের মাত্রার আধা-পরিমাণগত বিশ্লেষণও প্রদান করে। যাইহোক, এই পদ্ধতিটি পৃথক মিথাইলেশন সাইটের পরিবর্তে আগ্রহের অঞ্চলে সামগ্রিকভাবে সমস্ত সিপিজি সাইটগুলি মূল্যায়ন করার জন্য ডিজাইন করা হয়েছে। উচ্চ রেজোলিউশন গলন বিশ্লেষণ (এইচ. আর. এম) রূপান্তরিত বাইসালফাইট-ট্রিটেড ডি. এন. এ থেকে আলাদা করার আরও একটি পদ্ধতি হল উচ্চ-রেজোলিউশন গলন বিশ্লেষণ (এইচ. আর. এম) ব্যবহার করা, যা প্রাথমিকভাবে এস. এন. পি-কে আলাদা করার জন্য পরিকল্পিত একটি পরিমাণগত পি. সি. আর-ভিত্তিক কৌশল। পিসিআর এম্পলিকনগুলি সরাসরি তাপমাত্রা র্যাম্পিং দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয় এবং গলনের সময় একটি আন্তঃক্যালটিং ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জক মুক্ত হয়। পরিবর্ণীতে সি-টু-টি উপাদান দ্বারা প্রতিনিধিত্ব করা মিথাইলেশনের মাত্রা, গলনের দ্রুততা এবং ফলস্বরূপ রঞ্জক নিঃসরণ নির্ধারণ করে। এই পদ্ধতিটি একক-নল পরীক্ষায় সরাসরি পরিমাণ নির্ধারণের অনুমতি দেয়, তবে নির্দিষ্ট সিপিজি সাইটগুলির পরিবর্তে সামগ্রিকভাবে পরিবর্ধিত অঞ্চলে মিথাইলেশন মূল্যায়ন করে। মিথাইলেশন-সংবেদনশীল একক-নিউক্লিওটাইড প্রাইমার এক্সটেনশন (এমএস-স্নুপিই) এমএস-স্নুপিই প্রাথমিকভাবে একক-নিউক্লিওটাইড পলিমরফিজম বিশ্লেষণের জন্য ডিজাইন করা প্রাইমার এক্সটেনশন পদ্ধতি ব্যবহার করে। ডি. এন. এ বাইসালফাইট-রূপান্তরিত হয়, এবং বাইসালফাইট-নির্দিষ্ট প্রাইমারগুলি আগ্রহের সিপিজির ঠিক আগে বেস জোড়া পর্যন্ত ক্রমের সাথে সংযুক্ত করা হয়। প্রাইমারকে ডিএনএ পলিমারেজ ব্যবহার করে সি (বা টি)-তে একটি ক্ষার জোড়া প্রসারিত করার অনুমতি দেওয়া হয় যা ডাইডিওক্সিন্যুক্লিয়োটাইডগুলি শেষ করে এবং সি থেকে টি-এর অনুপাত পরিমাণগতভাবে নির্ধারিত হয়। এই সিঃটি অনুপাত নির্ধারণের জন্য বেশ কয়েকটি পদ্ধতি ব্যবহার করা যেতে পারে। শুরুতে, এম. এস-স্নুপি প্রাইমার এক্সটেনশনের রিপোর্টার হিসাবে তেজস্ক্রিয় ডি. ডি. এন. টি. পি-র উপর নির্ভর করত। ফ্লুরোসেন্স-ভিত্তিক পদ্ধতি বা পাইরোসেকুয়েন্সিংও ব্যবহার করা যেতে পারে। যাইহোক, ম্যাট্রিক্স-অ্যাসিস্টেড লেজার ডিসরপশন আয়নীকরণ/টাইম-অফ-ফ্লাইট (মাল্ডি-টিওএফ) মাস স্পেকট্রোমেট্রি বিশ্লেষণ দুটি পলিমরফিক প্রাইমার এক্সটেনশন পণ্যের মধ্যে পার্থক্য করতে ব্যবহার করা যেতে পারে, মূলত, এসএনপি জিনোটাইপিংয়ের জন্য ডিজাইন করা গুড অ্যাসের উপর ভিত্তি করে। আয়ন পেয়ার রিভার্স-ফেজ হাই-পারফরম্যান্স লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি (আইপি-আরপি-এইচপিএলসি) প্রাইমার এক্সটেনশন পণ্যগুলিকে আলাদা করতেও ব্যবহার করা হয়েছে। বেস-স্পেসিফিক ক্লিভেজ/মালদি-টোফ এ সম্প্রতি এহরিচ এট আল দ্বারা বর্ণিত পদ্ধতি। নিউক্লিওটাইড পরিবর্তন থেকে প্রাপ্ত তথ্য বাড়ানোর জন্য একটি বেস-নির্দিষ্ট ক্লিভেজ ধাপ যোগ করে বাইসালফাইট-রূপান্তরের সুবিধা নেয়। প্রথমে আর. এন. এ-তে আগ্রহের অঞ্চলের ইন ভিট্রো ট্রান্সক্রিপশন ব্যবহার করে (প্রাথমিক পরিবর্ধনতে পি. সি. আর প্রাইমারের সাথে একটি আর. এন. এ পলিমারেজ প্রবর্তক সাইট যুক্ত করে), আর. এন. এ-এ বেস-নির্দিষ্ট স্থানগুলিতে আর. এন. এ প্রতিলিপি বিভক্ত করতে ব্যবহার করা যেতে পারে। যেহেতু আরএনএজ এ বিশেষত সাইটোসিন এবং ইউরাসিল রাইবোনিউক্লিওটাইডগুলিতে আরএনএ বিভক্ত করে, সাইটোসিন-নির্দিষ্ট (সি-নির্দিষ্ট) বিভাজন পছন্দ হলে ক্লিভেজ-প্রতিরোধী ডিটিটিপি অন্তর্ভুক্ত করে এবং ইউরাসিল-নির্দিষ্ট (ইউ-নির্দিষ্ট) বিভাজন পছন্দ হলে ডিসিটিপি অন্তর্ভুক্ত করে বেস-নির্দিষ্টতা অর্জন করা হয়। ছেঁড়া টুকরোগুলি তখন মালদি-টোফ দ্বারা বিশ্লেষণ করা যেতে পারে। বাইসালফাইট চিকিত্সার ফলে হয় সি-টু-ইউ রূপান্তর দ্বারা ক্লিভেজ সাইটগুলির প্রবর্তন/অপসারণ বা পরিবর্ধিত বিপরীত স্ট্র্যান্ডে জি-টু-এ রূপান্তর দ্বারা খণ্ডের ভর স্থানান্তরিত হয়। সি-নির্দিষ্ট ক্লিভেজ বিশেষভাবে সমস্ত মিথাইলেটেড সিপিজি সাইটে কেটে যাবে। ফলস্বরূপ টুকরোগুলির আকার বিশ্লেষণ করে, সমগ্র অঞ্চলের মিথাইলেশনের পরিমাণ নির্ধারণের পরিবর্তে, অঞ্চলের মধ্যে সিপিজি সাইটগুলির ডিএনএ মিথাইলেশনের নির্দিষ্ট প্যাটার্ন নির্ধারণ করা সম্ভব। এই পদ্ধতিটি উচ্চ-থ্রুপুট স্ক্রিনিংয়ের জন্য কার্যকারিতা প্রদর্শন করে, যা ব্যয়-দক্ষ পদ্ধতিতে একাধিক টিস্যুতে অসংখ্য সিপিজি সাইটের জিজ্ঞাসাবাদের অনুমতি দেয়। মিথাইলেশন-নির্দিষ্ট পিসিআর (এমএসপি) মিথাইলেশন বিশ্লেষণের এই বিকল্প পদ্ধতিতে বাইসালফাইট-ট্রিটেড ডিএনএ ব্যবহার করা হয় তবে আগ্রহের ক্ষেত্রটি সিকোয়েন্স করার প্রয়োজনীয়তা এড়ানো হয়। পরিবর্তে, প্রাইমার জোড়া শুধুমাত্র অপরিবর্তিত 5-মিথাইলসাইটোসিনের পরিপূরক ক্রমগুলি অন্তর্ভুক্ত করে নিজেদের "মিথাইল-নির্দিষ্ট" হিসাবে ডিজাইন করা হয়, অথবা, বিপরীত দিকে, "আনমেথাইলেটেড-নির্দিষ্ট", আনমেথাইলেটেড সাইটোসিন থেকে রূপান্তরিত থাইমিনের পরিপূরক। নির্দিষ্ট প্রাইমারের পরিবর্ধন অর্জনের ক্ষমতা দ্বারা মিথাইলেশন নির্ধারিত হয়। এই পদ্ধতিটি সম্ভবত উচ্চ মিথাইলেশন ঘনত্ব সহ সিপিজি দ্বীপগুলিকে জিজ্ঞাসাবাদ করার জন্য বিশেষভাবে কার্যকর, কারণ প্রাইমারের সিপিজি জোড়ার সংখ্যা বৃদ্ধির ফলে পরীক্ষার নির্দিষ্টতা বৃদ্ধি পায়। প্রাইমারের 3 '-প্রান্তে সিপিজি জোড়া স্থাপন করাও সংবেদনশীলতা উন্নত করে। এমএসপি ব্যবহার করে প্রাথমিক প্রতিবেদনে 0.1% অ্যালিলের মিথাইলেশন সনাক্ত করার জন্য পর্যাপ্ত সংবেদনশীলতা বর্ণনা করা হয়েছে। সাধারণভাবে, একটি নির্দিষ্ট স্থানে মিথাইলেশন অবস্থা নিয়ে প্রশ্ন তোলার সময় এমএসপি এবং এর সম্পর্কিত প্রোটোকলগুলি সবচেয়ে সংবেদনশীল বলে মনে করা হয়। মেথিলাইট পদ্ধতিটি এম. এস. পি-র উপর ভিত্তি করে, তবে পরিমাণগত পি. সি. আর ব্যবহার করে একটি পরিমাণগত বিশ্লেষণ প্রদান করে। মিথাইলেটেড-নির্দিষ্ট প্রাইমার ব্যবহার করা হয়, এবং একটি মিথাইলেটেড-নির্দিষ্ট ফ্লুরোসেন্স রিপোর্টার প্রোবও ব্যবহার করা হয় যা পরিবর্ধিত অঞ্চলে অ্যানিল করে। বিকল্প পদ্ধতিতে, যদি জড়িত ক্রমের মধ্যে সিপিজি জোড়াগুলির মধ্যে বৈষম্যের প্রয়োজন হয় তবে প্রাইমার বা প্রোবটি মিথাইলেশন নির্দিষ্টতা ছাড়াই ডিজাইন করা যেতে পারে। একটি মিথাইলেটেড রেফারেন্স ডি. এন. এ-র প্রসঙ্গে পরিমাপ করা হয়। সফলভাবে বাইসালফাইট-রূপান্তরিত ডি. এন. এ (কনলাইট-এম. এস. পি)-এর জন্য পি. সি. আর-এর নির্দিষ্টতা বাড়ানোর জন্য এই প্রোটোকলের একটি পরিবর্তন এই অ-নির্দিষ্ট পরিবর্ধনকে পরিমাপ করতে বাইসালফাইট-রূপান্তরিত ডি. এন. এ-তে একটি অতিরিক্ত তদন্ত ব্যবহার করে। এমএসপি-পরিবর্ধিত ডিএনএ ব্যবহার করে আরও পদ্ধতি গলন বক্ররেখা বিশ্লেষণ (ম্যাক-এমএসপি) ব্যবহার করে পণ্যগুলি বিশ্লেষণ করে। এই পদ্ধতিটি বাইসালফাইট-রূপান্তরিত ডি. এন. এ-কে মিথাইলেটেড-নির্দিষ্ট এবং আনমিথাইলেটেড-নির্দিষ্ট উভয় প্রাইমারের সাথে পরিবর্ধিত করে এবং গলিত বক্ররেখা বিশ্লেষণে উত্পন্ন ডিফারেনশিয়াল শিখরগুলির তুলনা করে দুটি পণ্যের পরিমাণগত অনুপাত নির্ধারণ করে। একটি উচ্চ-রেজোলিউশন গলন বিশ্লেষণ পদ্ধতি যা পরিমাণগত পিসিআর এবং গলন বিশ্লেষণ উভয়ই ব্যবহার করে, বিশেষত, নিম্ন-স্তরের মিথাইলেশন মাইক্রো-অ্যারে-ভিত্তিক পদ্ধতির সংবেদনশীল সনাক্তকরণের জন্য মাইক্রো-অ্যারে-ভিত্তিক পদ্ধতিগুলি বাইসালফাইট-ট্রিটেড ডিএনএ বিশ্লেষণের জন্য উপলব্ধ প্রযুক্তির একটি যৌক্তিক সম্প্রসারণ যাতে মিথাইলেশনের জিনোম-ব্যাপী বিশ্লেষণের অনুমতি দেওয়া যায়। অলিগোনিউক্লিওটাইড মাইক্রোএরেগুলি আগ্রহী সিপিজি সাইটগুলিকে লক্ষ্য করে অলিগোনিউক্লিওটাইড হাইব্রিডাইজেশন প্রোবের জোড়া ব্যবহার করে ডিজাইন করা হয়েছে। একটি অপরিবর্তিত মিথাইলেটেড ক্রমের পরিপূরক এবং অন্যটি সি-টু-ইউ-রূপান্তরিত মিথাইলেটেড ক্রমের পরিপূরক। বাইসালফাইট দ্বারা অসম্পূর্ণভাবে রূপান্তরিত ডিএনএর সাথে বন্ধন রোধ করার জন্য প্রোবগুলি বাইসালফাইট-নির্দিষ্ট। ইলুমিনা মিথাইলেশন অ্যাসে এমন একটি পরীক্ষা যা জিনোম-ওয়াইড মিথাইলেশন ডেটা তৈরি করতে মাইক্রো অ্যারে স্তরে বাইসালফাইট সিকোয়েন্সিং প্রযুক্তি প্রয়োগ করে। সীমাবদ্ধতা 5-হাইড্রক্সিমিথাইলসাইটোসিন বিসালফাইট সিকোয়েন্সিং স্তন্যপায়ী জিনোম জুড়ে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়, তবে একটি নতুন স্তন্যপায়ী ডিএনএ পরিবর্তন 5-হাইড্রক্সিমিথাইলসাইটোসিন আবিষ্কারের সাথে জটিলতা দেখা দিয়েছে। 5-হাইড্রক্সিমিথাইলসাইটোসিন বাইসালফাইট ট্রিটমেন্টের মাধ্যমে সাইটোসিন-5-মিথাইলসালফোনেটে রূপান্তরিত হয়, যা তারপর সিকোয়েন্স করার সময় সি হিসাবে পড়ে। অতএব, বাইসালফাইট সিকোয়েন্সিং 5-মিথাইলসাইটোসিন এবং 5-হাইড্রক্সিমিথাইলসাইটোসিনের মধ্যে পার্থক্য করতে পারে না। এর মানে হল যে বাইসালফাইট সিকোয়েন্সিং থেকে আউটপুটকে আর শুধুমাত্র ডিএনএ মিথাইলেশন হিসাবে সংজ্ঞায়িত করা যায় না, কারণ এটি 5-মিথাইলসাইটোসিন এবং 5-হাইড্রক্সিমিথাইলসাইটোসিনের সংমিশ্রণ। শিকাগো বিশ্ববিদ্যালয়ে চুয়ান হে দ্বারা টেট-সমর্থিত অক্সিডেটিভ বাইসালফাইট সিকোয়েন্সিংয়ের বিকাশ এখন একক বেস রেজোলিউশনে দুটি পরিবর্তনের মধ্যে পার্থক্য করতে সক্ষম। অসম্পূর্ণ রূপান্তর বিসালফাইট সিকোয়েন্সিং প্রতিটি অসম্পূর্ণ সাইটোসিনের অবশিষ্টাংশকে ইউরাসিলে রূপান্তরিত করার উপর নির্ভর করে। যদি রূপান্তর অসম্পূর্ণ হয়, তবে পরবর্তী বিশ্লেষণটি মিথাইলিত নয় এমন সাইটোসিনগুলিকে মিথাইলিত সাইটোসিন হিসাবে ভুলভাবে ব্যাখ্যা করবে, যার ফলে মিথাইলেশনের জন্য ভুল ইতিবাচক ফলাফল পাওয়া যায়। শুধুমাত্র সিঙ্গল-স্ট্র্যান্ডেড ডি. এন. এ-তে সাইটোসিনগুলি বাইসালফাইট দ্বারা আক্রমণের জন্য সংবেদনশীল, তাই বিশ্লেষণের মধ্য দিয়ে যাওয়া ডি. এন. এ-র বিকৃতি গুরুত্বপূর্ণ। এটি নিশ্চিত করা গুরুত্বপূর্ণ যে তাপমাত্রা এবং লবণের ঘনত্বের মতো প্রতিক্রিয়া পরামিতিগুলি একক-আটকে থাকা গঠনে ডিএনএ বজায় রাখার জন্য উপযুক্ত এবং সম্পূর্ণ রূপান্তরের অনুমতি দেয়। অ্যাগারোজ জেলে ডি. এন. এ এম্বেড করা ডি. এন. এ-র স্ট্র্যান্ডগুলিকে শারীরিকভাবে আলাদা রেখে রূপান্তরের হার উন্নত করে বলে জানা গেছে। অসম্পূর্ণ রূপান্তর হারগুলি অনুমান করা এবং সামঞ্জস্য করা যেতে পারে-সিকোয়েন্সিং লাইব্রেরিতে একটি অভ্যন্তরীণ নিয়ন্ত্রণ অন্তর্ভুক্ত করে, যেমন ল্যাম্বডা ফেজ ডিএনএ (যা আনমিথাইলেটেড হিসাবে পরিচিত) বা ক্লোরোপ্লাস্ট জিনোমের মতো জীবের একটি পরিচিত আনমিথাইলেটেড অঞ্চলে বাইসালফাইট সিকোয়েন্সিং রিডগুলি সারিবদ্ধ করে। বাইসালফাইট চিকিৎসার সময় ডি. এন. এ-র অবক্ষয় বাইসালফাইট সিকোয়েন্সিংয়ের একটি বড় চ্যালেঞ্জ হল ডি. এন. এ-র অবক্ষয় যা রূপান্তরের সাথে একযোগে ঘটে। সম্পূর্ণ রূপান্তরের জন্য প্রয়োজনীয় শর্তগুলি, যেমন দীর্ঘ ইনকিউবেশন সময়, উচ্চতর তাপমাত্রা এবং উচ্চ বাইসালফাইট ঘনত্ব, ইনকিউবেটেড ডিএনএর প্রায় 90 শতাংশের অবক্ষয়ের কারণ হতে পারে। যেহেতু ডি. এন. এ-র প্রারম্ভিক পরিমাণ প্রায়শই সীমিত থাকে, তাই এই ধরনের ব্যাপক অবক্ষয় সমস্যাযুক্ত হতে পারে। অবক্ষয় ঘটে ডিপুরিনেশন হিসাবে যার ফলে এলোমেলো স্ট্র্যান্ড ভেঙে যায়। অতএব, কাঙ্ক্ষিত পিসিআর পরিবর্ধন যত দীর্ঘ হবে, অক্ষত টেমপ্লেট অণুগুলির সংখ্যা ততই সীমিত হবে। এর ফলে পিসিআর পরিবর্ধন ব্যর্থ হতে পারে, অথবা টেমপ্লেট অণুগুলির সীমিত নমুনার ফলে মিথাইলেশন স্তরের পরিমাণগতভাবে সঠিক তথ্য হারাতে পারে। সুতরাং, নিযুক্ত প্রতিক্রিয়া অবস্থার ফলে ডিএনএ অবক্ষয়ের পরিমাণ মূল্যায়ন করা গুরুত্বপূর্ণ এবং এটি কীভাবে পছন্দসই পরিবর্ধনকে প্রভাবিত করবে তা বিবেচনা করা গুরুত্বপূর্ণ। ডি. এন. এ-র অবক্ষয় হ্রাস করার জন্যও কৌশলগুলি ব্যবহার করা যেতে পারে, যেমন ইনকিউবেশন তাপমাত্রায় সাইকেল চালানো। 2020 সালে, নিউ ইংল্যান্ড বায়োল্যাবস এনইবি নেক্সট এনজাইম্যাটিক মিথাইল-সেক তৈরি করেছে যা ডিএনএ ক্ষতি হ্রাস করার জন্য একটি বিকল্প এনজাইম্যাটিক পদ্ধতি। অন্যান্য উদ্বেগ বাইসালফাইট চিকিত্সার পরে একটি সম্ভাব্য উল্লেখযোগ্য সমস্যা হল দ্রবণটির অপর্যাপ্ত ক্ষারীয়করণের কারণে পাইরিমিডিনের অবশিষ্টাংশের অসম্পূর্ণ ডিসালফোনেশন। এটি কিছু ডিএনএ পলিমারেজকে বাধা দিতে পারে, যা পরবর্তী পিসিআরকে কঠিন করে তোলে। যাইহোক, সালফোনেশন সম্পূর্ণ হবে তা নিশ্চিত করার জন্য দ্রবণটির পিএইচ পর্যবেক্ষণ করে এই পরিস্থিতি এড়ানো যেতে পারে। একটি চূড়ান্ত উদ্বেগ হ 'ল বাইসালফাইট চিকিত্সা নমুনার জটিলতার মাত্রা ব্যাপকভাবে হ্রাস করে, যা একাধিক পিসিআর প্রতিক্রিয়া সম্পাদন করা হলে সমস্যাযুক্ত হতে পারে (2006)। প্রাইমার ডিজাইন আরও কঠিন, এবং অনুপযুক্ত ক্রস-হাইব্রিডাইজেশন আরও ঘন ঘন হয়। প্রয়োগঃ জিনোম-ওয়াইড মিথাইলেশন বিশ্লেষণ বাইসালফাইট সিকোয়েন্সিংয়ের অগ্রগতির ফলে জিনোম-ওয়াইড স্কেলে এগুলি প্রয়োগ করার সম্ভাবনা দেখা দিয়েছে, যেখানে, পূর্বে, ডিএনএ মিথাইলেশনের বিশ্বব্যাপী পরিমাপ শুধুমাত্র অন্যান্য কৌশল ব্যবহার করে সম্ভব ছিল, যেমন সীমাবদ্ধতা ল্যান্ডমার্ক জিনোমিক স্ক্যানিং। হিউম্যান এপিজেনোমের ম্যাপিংকে অনেক বিজ্ঞানী হিউম্যান জিনোম প্রজেক্টের সমাপ্তির যৌক্তিক ফলো-আপ হিসাবে দেখেন। জেনেটিক সিকোয়েন্সের কার্যকারিতা কীভাবে প্রয়োগ ও নিয়ন্ত্রিত হয় তা বোঝার জন্য এই এপিজেনোমিক তথ্য গুরুত্বপূর্ণ হবে। যেহেতু এপিজেনোম জিনোমের তুলনায় কম স্থিতিশীল, তাই এটি জিন-পরিবেশের মিথস্ক্রিয়ায় গুরুত্বপূর্ণ বলে মনে করা হয়। এপিজেনোমিক ম্যাপিং জিনোম সিকোয়েন্সিংয়ের তুলনায় সহজাতভাবে আরও জটিল, কারণ এপিজেনোম জিনোমের তুলনায় অনেক বেশি পরিবর্তনশীল। একজনের এপিজেনোম বয়সের সাথে পরিবর্তিত হয়, টিস্যুগুলির মধ্যে পরিবর্তিত হয়, পরিবেশগত কারণগুলির দ্বারা পরিবর্তিত হয় এবং রোগগুলিতে বিচ্যুতি দেখায়। তবে, বিভিন্ন বয়স, টিস্যুর ধরন এবং রোগের অবস্থার প্রতিনিধিত্বকারী এই ধরনের সমৃদ্ধ এপিজেনোমিক ম্যাপিং এপিজেনেটিক চিহ্নগুলির স্বাভাবিক কার্যকারিতার পাশাপাশি বার্ধক্য এবং রোগের দিকে পরিচালিত প্রক্রিয়া সম্পর্কে মূল্যবান তথ্য প্রদান করবে। এপিজেনোমিক ম্যাপিংয়ের প্রত্যক্ষ সুবিধাগুলির মধ্যে ক্লোনিং প্রযুক্তিতে সম্ভাব্য অগ্রগতি অন্তর্ভুক্ত রয়েছে। এটি বিশ্বাস করা হয় যে এপিজেনেটিক চিহ্নগুলির অনুপযুক্ত নিদর্শনগুলির ফলে স্বাভাবিক কার্যকারিতা এবং জীবনকাল সহ ক্লোন করা প্রাণী তৈরি করতে ব্যর্থ হয়। এছাড়াও, অস্বাভাবিক মিথাইলেশন প্যাটার্নগুলি অনেক ক্যান্সারে ভালভাবে চিহ্নিত করা হয়। গ্লোবাল হাইপোমেথাইলেশনের ফলে জিনোমিক স্থিতিশীলতা হ্রাস পায়, যেখানে টিউমার দমনকারী জিন প্রবর্তকদের স্থানীয় হাইপারমেথাইলেশন প্রায়শই তাদের কার্যকারিতা হ্রাসের জন্য দায়ী। মিথাইলেশনের নির্দিষ্ট নিদর্শনগুলি নির্দিষ্ট ধরনের ক্যান্সারের ইঙ্গিত দেয়, এগুলির পূর্বাভাসমূলক মান রয়েছে এবং চিকিৎসার সর্বোত্তম পথ নির্দেশ করতে সহায়তা করতে পারে। বিশ্বজুড়ে বড় আকারের এপিজেনোম ম্যাপিংয়ের প্রচেষ্টা চলছে এবং হিউম্যান এপিজেনোম প্রকল্পের অধীনে সংগঠিত হয়েছে। এটি একটি বহু-স্তরযুক্ত কৌশলের উপর ভিত্তি করে, যার মাধ্যমে সীমিত সংখ্যক রেফারেন্স এপিজেনোমের জন্য উচ্চ-রেজোলিউশন মিথাইলেশন প্রোফাইল পেতে বাইসালফাইট সিকোয়েন্সিং ব্যবহার করা হয়, যেখানে নমুনার বিস্তৃত বর্ণালীতে কম পুঙ্খানুপুঙ্খ বিশ্লেষণ করা হয়। এই পদ্ধতির উদ্দেশ্য হল প্রদত্ত পরিমাণ সম্পদ থেকে প্রাপ্ত অন্তর্দৃষ্টি সর্বাধিক করা, কারণ উচ্চ-রেজোলিউশন জিনোম-ওয়াইড ম্যাপিং একটি ব্যয়বহুল উদ্যোগ হিসাবে রয়ে গেছে। জিন-সেট বিশ্লেষণ (উদাহরণস্বরূপ ডিএভিডি এবং গোসেক-এর মতো সরঞ্জাম ব্যবহার করে) উচ্চ-থ্রুপুট মিথাইলেশন ডেটাতে প্রয়োগ করা হলে গুরুতর পক্ষপাতদুষ্ট বলে প্রমাণিত হয়েছে। জিনোম-ওয়াইড বাইসালফাইট সিকোয়েন্সিং); এটি পরামর্শ দেওয়া হয়েছে যে এটি নমুনা লেবেল বিন্যাস ব্যবহার করে বা প্রতিটি জিনকে লক্ষ্য করে এমন সিপিজি প্রোব/সিপিজি সাইটগুলির সংখ্যার পার্থক্য নিয়ন্ত্রণ করতে একটি পরিসংখ্যানগত মডেল ব্যবহার করে সংশোধন করা যেতে পারে। অক্সিডেটিভ বাইসালফাইট সিকোয়েন্সিং 5-মিথাইলসাইটোসিন এবং 5-হাইড্রক্সিমিথাইলসাইটোসিন উভয়ই বাইসালফাইট সিকোয়েন্সিংয়ে সি হিসাবে পড়ে। অক্সিডেটিভ বাইসালফাইট সিকোয়েন্সিং হল একক বেস রেজোলিউশনে 5-মিথাইলসাইটোসিন এবং 5-হাইড্রক্সিমিথাইলসাইটোসিনের মধ্যে পার্থক্য করার একটি পদ্ধতি। পদ্ধতিটি 5-হাইড্রক্সিমিথাইলসাইটোসিনের একটি নির্দিষ্ট (টেট-সহায়ক) রাসায়নিক জারণকে 5-ফর্মাইলসাইটোসিনে নিযুক্ত করে, যা পরবর্তীকালে বাইসালফাইট চিকিত্সার সময় ইউরাসিলে রূপান্তরিত হয়। একমাত্র বেস যা তখন সি হিসাবে পড়ে তা হল 5-মিথাইলসাইটোসিন, যা ডিএনএ নমুনায় প্রকৃত মিথাইলেশন অবস্থার একটি মানচিত্র দেয়। বাইসালফাইট এবং অক্সিডেটিভ বাইসালফাইট সিকোয়েন্সিংয়ের মধ্যে পার্থক্য পরিমাপ করে 5-হাইড্রোক্সিমিথাইলসাইটোসিনের মাত্রাও পরিমাপ করা যেতে পারে। আরও দেখুন হ্রাসকৃত উপস্থাপনা বাইসালফাইট সিকোয়েন্সিং রেফারেন্স বাহ্যিক লিঙ্ক বাইসালফাইট রূপান্তর প্রোটোকল হিউম্যান এপিজেনোম প্রজেক্ট (এইচইপি)-ডেটা-স্যাঙ্গার ইনস্টিটিউট দ্বারা এপিজেনোম নেটওয়ার্ক অফ এক্সিলেন্স আণবিক জীববিজ্ঞান এপিজেনেটিক্স জিনোমিক্স কৌশল