Reversed-phase chromatography
বিপরীত-পর্যায় তরল ক্রোমাটোগ্রাফি (আরপি-এলসি) হল তরল ক্রোমাটোগ্রাফির একটি পদ্ধতি যেখানে অ-মেরু স্থির পর্যায় এবং মেরু গতিশীল পর্যায়গুলি জৈব যৌগগুলির পৃথকীকরণের জন্য ব্যবহার করা হয়। সাম্প্রতিক বছরগুলিতে হাই পারফরম্যান্স লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি-এইচপিএলসি ব্যবহার করে বেশিরভাগ পৃথকীকরণ এবং বিশ্লেষণ বিপরীত পর্যায় মোড ব্যবহার করে করা হয়। বিপরীত পর্যায় মোডে, নমুনা উপাদানগুলি সিস্টেমে ধরে রাখা হয়, সেগুলি যত বেশি হাইড্রোফোবিক হয়। বিপরীত পর্যায় ক্রোমাটোগ্রাফিক সিস্টেমে দ্রবণের ধারণ এবং পৃথকীকরণকে প্রভাবিত করে এমন কারণগুলি নিম্নরূপঃ স্থির পর্যায়ের রাসায়নিক প্রকৃতি, অর্থাৎ, লিগ্যান্ডগুলি তার পৃষ্ঠে আবদ্ধ, সেইসাথে তাদের বন্ধন ঘনত্ব, অর্থাৎ তাদের কভারেজের পরিমাণ। বি। ভ্রাম্যমাণ পর্যায়ের গঠন। বাল্ক দ্রাবকগুলির প্রকার যার মিশ্রণগুলি মোবাইল পর্যায়ের মেরুকরণকে প্রভাবিত করে, তাই মোবাইল পর্যায়ের মেরুকরণকে প্রভাবিত করার জন্য একটি দ্রাবকের নাম পরিবর্তনকারী যোগ করা হয়। সি. অ্যাডিটিভ, যেমন বাফার, মোবাইল পর্যায়ের পিএইচ-কে প্রভাবিত করে, যা দ্রবণগুলির আয়নীকরণ অবস্থা এবং তাদের মেরুকরণকে প্রভাবিত করে। মিশ্রণে জৈব উপাদানগুলি ধরে রাখার জন্য, কলামের মধ্যে প্যাক করা স্থির পর্যায়গুলি একটি হাইড্রোফোবিক স্তর নিয়ে গঠিত, যা বিভিন্ন জ্যামিতিতে (গোলাকার, অনিয়মিত) ছিদ্রযুক্ত সিলিকা-জেল কণাগুলির পৃষ্ঠের সাথে বিভিন্ন ব্যাসে (উপ-2,3,5,7,10 উম), বিভিন্ন ছিদ্র ব্যাস (60,100,150,300, এ) সহ আবদ্ধ থাকে। কণার পৃষ্ঠটি রাসায়নিকভাবে আবদ্ধ হাইড্রোকার্বন দ্বারা আচ্ছাদিত, যেমন সি3, সি4, সি8, সি18 এবং আরও অনেক কিছু। স্থির পর্যায়ের সঙ্গে যুক্ত হাইড্রোকার্বন যত দীর্ঘ হবে, নমুনার উপাদানগুলি তত বেশি সময় ধরে রাখা হবে। কিছু স্থির পর্যায় হাইড্রোফোবিক পলিমারিক কণা বা সংকর সিলিকা-জৈব গোষ্ঠীর কণা দিয়েও তৈরি করা হয়, যে পদ্ধতিতে চরম পিএইচ-এ সচল পর্যায়গুলি ব্যবহার করা হয়। বায়োমেডিক্যাল উপকরণগুলি পৃথক করার বেশিরভাগ বর্তমান পদ্ধতিগুলি সি-18 কলাম ব্যবহার করে, কখনও কখনও বাণিজ্যিক নাম দ্বারা ডাকা হয়, যেমন ওডিএস (অক্টাডেসিলসিলেন) বা আরপি-18। সচল পর্যায়গুলি হল জল এবং মেরু জৈব দ্রাবকগুলির মিশ্রণ, যার বেশিরভাগই মিথেনল এবং অ্যাসিটোনাইট্রিল। এই মিশ্রণগুলিতে সাধারণত বিভিন্ন সংযোজন যেমন বাফার (অ্যাসিটেট, ফসফেট, সাইট্রেট) এবং/অথবা সার্ফ্যাক্ট্যান্ট (অ্যালকাইল অ্যামাইন বা অ্যালকাইল সালফোনেট) এবং/অথবা বিশেষ সংযোজন (ইডিটিএ) থাকে। এক বা অন্য ধরনের সম্পূরক ব্যবহারের লক্ষ্য হল দক্ষতা এবং/অথবা নির্বাচনশীলতা বৃদ্ধি করা এবং দ্রবণ ধারণ নিয়ন্ত্রণ করা। মেজরস, ডোলন, কার এবং স্নাইডারের একটি নিবন্ধে বিস্তারিতভাবে বর্ণিত বিপরীত পর্যায় স্থির পর্যায়গুলির ইতিহাস এবং বিবর্তন 1970-এর দশকে, বেশিরভাগ তরল ক্রোমাটোগ্রাফি রানগুলি অপরিবর্তিত সিলিকা-জেল বা অ্যালুমিনা দিয়ে তৈরি স্থির পর্যায় হিসাবে কঠিন কণাগুলি ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল। এই ধরনের কৌশলকে এখন নরমাল-ফেজ ক্রোমাটোগ্রাফি বলা হয়। যেহেতু এই কৌশলে স্থির পর্যায়টি হাইড্রোফিলিক, এবং গতিশীল পর্যায়টি একটি-মেরু ছিল, যা হেক্সেন এবং হেপ্টেনের মতো অ-মেরু জৈব দ্রাবক নিয়ে গঠিত ছিল, তাই নমুনায় হাইড্রোফিলিক বৈশিষ্ট্যযুক্ত জৈব অণুগুলির স্থির পর্যায়ের সাথে উচ্চ সম্পর্ক ছিল, তাই তারা এটিকে দৃঢ়ভাবে শোষণ করে। উপরন্তু, এগুলি সচল পর্যায় দ্রাবকগুলিতে সহজে দ্রবীভূত হয়নি। একই সময়ে হাইড্রোফোবিক অণুগুলি মেরু স্থির পর্যায়ে কম আকর্ষণ অনুভব করে এবং পর্যাপ্ত ধারণ না করে এর মধ্য দিয়ে তাড়াতাড়ি বেরিয়ে যায়। এই কারণেই 1970-এর দশকে সিলিকা ভিত্তিক কণাগুলিকে হাইড্রোকার্বন দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল, তাদের পৃষ্ঠে স্থির বা আবদ্ধ করা হয়েছিল এবং জৈব-চিকিৎসা পদার্থের সমন্বয়ের জন্য গতিশীল পর্যায়গুলি জলীয় এবং মেরু প্রকৃতিতে পরিবর্তিত হয়েছিল। হাইড্রোফোবিক স্থির পর্যায় এবং মেরু গতিশীল পর্যায়গুলির ব্যবহার মূলত স্বাভাবিক পর্যায় ক্রোমাটোগ্রাফির বিপরীত, যেহেতু মোবাইল এবং স্থির পর্যায়গুলির মেরুকরণ বিপরীত হয়েছে-তাই বিপরীত-পর্যায় ক্রোমাটোগ্রাফি শব্দটি ব্যবহৃত হয়। ফলস্বরূপ, মেরু গতিশীল পর্যায়ে হাইড্রোফোবিক অণুগুলি হাইড্রোফোবিক স্থির পর্যায়ে শোষণ করে এবং নমুনার হাইড্রোফিলিক অণুগুলি কলামের মধ্য দিয়ে যায় এবং প্রথমে বিচ্ছিন্ন হয়। হাইড্রোফোবিক অণুগুলিকে একটি জৈব (অ-মেরু) দ্রাবক ব্যবহার করে গতিশীল পর্যায়ের মেরুতা হ্রাস করে কলাম থেকে বিচ্ছিন্ন করা যেতে পারে, যা হাইড্রোফোবিক মিথস্ক্রিয়া হ্রাস করে। অণুটি যত বেশি হাইড্রোফোবিক হবে, তত বেশি দৃঢ়ভাবে এটি স্থির পর্যায়ে আবদ্ধ হবে এবং জৈব দ্রাবকের ঘনত্ব তত বেশি হবে যা অণুটি বের করার জন্য প্রয়োজন হবে। ক্রোমাটোগ্রাফি তত্ত্বের অনেক গাণিতিক পরামিতি এবং অন্যান্য ক্রোমাটোগ্রাফিক পদ্ধতিতে ব্যবহৃত পরীক্ষামূলক বিবেচনাগুলি আরপি-এলসি-র ক্ষেত্রেও প্রযোজ্য (উদাহরণস্বরূপ, সিলেক্টিভিটি ফ্যাক্টর, ক্রোমাটোগ্রাফিক রেজোলিউশন, প্লেট গণনা ইত্যাদি)। এটি বিভিন্ন ধরনের অণু পৃথকীকরণের জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে। এটি সাধারণত প্রোটিন পৃথকীকরণের জন্য ব্যবহৃত হয়, কারণ স্বাভাবিক-পর্যায়ের ক্রোমাটোগ্রাফিতে ব্যবহৃত জৈব দ্রাবকগুলি অনেক প্রোটিনকে বিকৃত করতে পারে। বর্তমানে, আরপি-এলসি একটি প্রায়শই ব্যবহৃত বিশ্লেষণাত্মক কৌশল। আরপি-এলসি-তে ব্যবহারের জন্য প্রচুর সংখ্যক স্থির পর্যায় রয়েছে, যা পৃথকীকরণ পদ্ধতির বিকাশে দুর্দান্ত নমনীয়তার অনুমতি দেয়। সিলিকা-ভিত্তিক স্থির পর্যায় সিলিকা জেল কণা সাধারণত উচ্চ-কার্যকারিতা তরল ক্রোমাটোগ্রাফি (এইচ. পি. এল. সি)-তে একটি স্থির পর্যায় হিসাবে বিভিন্ন কারণে ব্যবহৃত হয়, যার মধ্যে রয়েছেঃ উচ্চ পৃষ্ঠ এলাকাঃ সিলিকা জেল কণাগুলির একটি উচ্চ পৃষ্ঠ এলাকা থাকে, যা দ্রবণগুলির সাথে সরাসরি মিথস্ক্রিয়া করতে দেয় বা নমুনা অণুগুলির সাথে বহুমুখী মিথস্ক্রিয়ার জন্য বিভিন্ন লিগ্যান্ডের বন্ধনের পরে, যা আরও ভাল পৃথকীকরণের দিকে পরিচালিত করে। রাসায়নিক এবং তাপীয় স্থায়িত্ব এবং জড়তাঃ সিলিকা জেল রাসায়নিকভাবে স্থিতিশীল, কারণ এটি সাধারণত চলন্ত পর্যায়ের দ্রাবক বা যৌগগুলি পৃথক করার সাথে প্রতিক্রিয়া করে না, যার ফলে সঠিক, পুনরাবৃত্তিযোগ্য এবং নির্ভরযোগ্য বিশ্লেষণ হয়। ব্যাপক প্রয়োগযোগ্যতাঃ সিলিকা জেল বহুমুখী এবং বিভিন্ন কার্যকরী গোষ্ঠীর সাথে সংশোধন করা যেতে পারে, যা এটিকে বিস্তৃত বিশ্লেষণ এবং প্রয়োগের জন্য উপযুক্ত করে তোলে। দক্ষ পৃথকীকরণঃ সিলিকা জেল কণাগুলির অনন্য বৈশিষ্ট্য, তাদের উচ্চ পৃষ্ঠ এলাকা এবং নিয়ন্ত্রিত গড় কণা ব্যাসের ছিদ্র আকারের সাথে মিলিত হয়ে এইচ. পি. এল. সি-তে যৌগগুলির দক্ষ এবং সুনির্দিষ্ট পৃথকীকরণকে সহজতর করে। প্রজননযোগ্যতাঃ সিলিকা জেল কণা উচ্চ ব্যাচ-টু-ব্যাচ পুনরুত্পাদনযোগ্যতা প্রদান করতে পারে, যা কয়েক দশক ধরে সামঞ্জস্যপূর্ণ এবং নির্ভরযোগ্য এইচপিএলসি বিশ্লেষণের জন্য গুরুত্বপূর্ণ। কণার ব্যাস এবং ছিদ্রের আকার নিয়ন্ত্রণঃ সিলিকা জেল নির্দিষ্ট ছিদ্রের আকারের জন্য ইঞ্জিনিয়ার করা যেতে পারে, যা আণবিক আকারের উপর ভিত্তি করে পৃথকীকরণের উপর সুনির্দিষ্ট নিয়ন্ত্রণ সক্ষম করে। খরচ-কার্যকরীঃ সিলিকা পৃথিবীর সবচেয়ে প্রচুর পরিমাণে পাওয়া উপাদান, তাই এর জেল এইচ. পি. এল. সি প্রয়োগের জন্য একটি খরচ-কার্যকরী পছন্দ, যার ফলে এটি পরীক্ষাগারগুলিতে ব্যাপকভাবে গৃহীত হয়। মার্কিন যুক্তরাষ্ট্রের ফার্মাকোপিয়া (ইউএসপি) এইচপিএলসি কলামগুলিকে এল #প্রকার দ্বারা শ্রেণীবদ্ধ করেছে। এই শ্রেণীবিভাগের সবচেয়ে জনপ্রিয় কলাম হল একটি অক্টাডেসিল কার্বন চেইন (সি18)-বন্ডেড সিলিকা (ইউএসপি শ্রেণীবিভাগ এল1)। এর পরে রয়েছে সি8-বন্ডেড সিলিকা (এল7), বিশুদ্ধ সিলিকা (এল3), সায়ানো-বন্ডেড সিলিকা (সিএন) (এল10) এবং ফিনাইল-বন্ডেড সিলিকা (এল11)। লক্ষ্য করুন যে সি18, সি8 এবং ফিনাইল হল ডেডিকেটেড রিভার্স-ফেজ স্থির পর্যায়, যেখানে সিএন কলামগুলি অ্যানালাইট এবং মোবাইল পর্যায়ের অবস্থার উপর নির্ভর করে রিভার্স-ফেজ মোডে ব্যবহার করা যেতে পারে। সমস্ত সি 18 কলামের একই ধরে রাখার বৈশিষ্ট্য নেই। সিলিকার পৃষ্ঠের কার্যকারিতা একটি মনোমেরিক বা পলিমারিক বিক্রিয়ায় বিভিন্ন শর্ট-চেইন অর্গানোসিলেনের সাথে সম্পাদিত হতে পারে যা অবশিষ্ট সিলানোল গোষ্ঠীগুলিকে (শেষ-ক্যাপিং) আচ্ছাদন করার জন্য দ্বিতীয় ধাপে ব্যবহৃত হয়। যদিও সামগ্রিক ধরে রাখার প্রক্রিয়াটি একই থাকে, বিভিন্ন স্থির পর্যায়ের পৃষ্ঠের রসায়নের সূক্ষ্ম পার্থক্য নির্বাচনশীলতার পরিবর্তনের দিকে পরিচালিত করবে। স্থির পর্যায়ের সাথে আবদ্ধ লিগ্যান্ডের উপর নির্ভর করে আধুনিক কলামগুলির বিভিন্ন মেরুতা রয়েছে। পি. এফ. পি হল পেন্টাফ্লোরফিনাইল। সিএন হল সায়ানো। NH2 হল অ্যামিনো। ওডিএস হল অক্টাডেসিল বা সি18। ওডিসিএন হল সি18 এবং নাইট্রাইল সমন্বিত একটি মিশ্র মোড কলাম। তরল ক্রোমাটোগ্রাফি (এলসি)-র জন্য ক্রোমাটোগ্রাফিক সমর্থন এবং যন্ত্রের সাম্প্রতিক উন্নয়নগুলি বিভিন্ন স্থির পর্যায় জ্যামিতি ব্যবহার করে দ্রুত এবং অত্যন্ত দক্ষ পৃথকীকরণকে সহজতর করে। বিভিন্ন বিশ্লেষণাত্মক কৌশল প্রস্তাব করা হয়েছে, যেমন সিলিকা-ভিত্তিক মনোলিথিক সাপোর্ট, উন্নত মোবাইল ফেজ তাপমাত্রা, এবং অতি-উচ্চ-চাপ এলসি সিস্টেমে (ইউএইচপিএলসি) ব্যবহারের জন্য সাব-3 মাইক্রোমিটার উপরিভাগের ছিদ্রযুক্ত কণা (ফিউজড বা কঠিন কোর) বা সাব-2 মাইক্রোমিটার সম্পূর্ণ ছিদ্রযুক্ত কণা দিয়ে ভরা কলাম। মোবাইল ফেজ রিভারসড ফেজ ক্রোমাটোগ্রাফিতে মোবাইল ফেজ নির্বাচনের আধুনিক প্রবণতা এবং সর্বোত্তম অনুশীলনের উপর একটি বিস্তৃত নিবন্ধ বয়েস এবং ডং দ্বারা প্রকাশিত হয়েছিল। বিপরীত পর্যায় ক্রোমাটোগ্রাফির একটি সচল পর্যায় জল বা জলীয় বাফারের মিশ্রণ নিয়ে গঠিত, যেখানে জৈব দ্রাবক যোগ করা হয়, একটি নির্বাচিত পদ্ধতিতে বিপরীত-পর্যায় কলাম থেকে বিশ্লেষণের জন্য। যোগ করা জৈব দ্রাবকগুলি অবশ্যই জলের সাথে মিশ্রিত হতে হবে এবং ব্যবহৃত দুটি সর্বাধিক সাধারণ জৈব দ্রাবক হল অ্যাসিটোনাইট্রাইল, মিথানল। অন্যান্য দ্রাবকও ব্যবহার করা যেতে পারে যেমন ইথানল বা 2-প্রোপানল (আইসোপ্রোপাইল অ্যালকোহল) এবং টেট্রাহাইড্রোফুরান (টি. এইচ. এফ)। জৈব দ্রাবককে একটি সংশোধনকারীও বলা হয়, কারণ এটি গতিশীল পর্যায়ে জলীয় দ্রবণে যোগ করা হয় যাতে গতিশীল পর্যায়ের মেরুকরণ পরিবর্তন করা যায়। বিপরীত পর্যায় ভ্রাম্যমাণ পর্যায়ে জল হল সবচেয়ে মেরু দ্রাবক, অতএব, পরিবর্তনকারী যোগ করে ভ্রাম্যমাণ পর্যায়ের মেরুতা হ্রাস করা তার ইল্যুশন শক্তি বাড়ায়। দুটি সর্বাধিক ব্যবহৃত জৈব পরিবর্ধক হল অ্যাসিটোনিট্রাইল এবং মিথানল, যদিও অ্যাসিটোনিট্রাইল হল আরও জনপ্রিয় পছন্দ। আইসোপ্রোপানল (2-প্রোপানল) এর শক্তিশালী এলুটিং বৈশিষ্ট্যের কারণেও ব্যবহার করা যেতে পারে, তবে এর উচ্চ সান্দ্রতা দ্বারা এর ব্যবহার সীমিত, যার ফলে উচ্চ ব্যাকপ্রেসার হয়। অ্যাসিটোনিট্রাইল এবং মিথানল উভয়ই আইসোপ্রোপানল-এর তুলনায় কম সান্দ্র, যদিও 50:50% মিথানলের মিশ্রণঃ জলও খুব সান্দ্র এবং উচ্চ ব্যাকপ্রেসার সৃষ্টি করে। তিনটি দ্রাবকই মূলত অতিবেগুনি রশ্মি স্বচ্ছ। এটি সাধারণ বিপরীত পর্যায়ের ক্রোমাটোগ্রাফির জন্য একটি গুরুত্বপূর্ণ বৈশিষ্ট্য কারণ নমুনা উপাদানগুলি সাধারণত ইউভি ডিটেক্টর দ্বারা সনাক্ত করা হয়। অ্যাসিটোনিট্রাইল কম অতিবেগুনী তরঙ্গদৈর্ঘ্যের পরিসরের অন্যদের তুলনায় বেশি স্বচ্ছ, তাই এটি পেপটাইডের মতো দুর্বল বা কোনও ক্রোমোফর (ইউভি-ভিআইএস শোষণকারী গোষ্ঠী) সহ অণুগুলিকে পৃথক করার সময় প্রায় একচেটিয়াভাবে ব্যবহৃত হয়। বেশিরভাগ পেপটাইড শুধুমাত্র অতি-বেগুনি বর্ণালীতে কম তরঙ্গদৈর্ঘ্যে (সাধারণত 225 এনএম-এর কম) শোষণ করে এবং অ্যাসিটোনিট্রাইল অন্যান্য সাধারণ দ্রাবকগুলির তুলনায় কম তরঙ্গদৈর্ঘ্যে অনেক কম পটভূমি শোষণ প্রদান করে। গতিশীল পর্যায়ের পিএইচ একটি বিশ্লেষক ধরে রাখার ক্ষেত্রে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করতে পারে এবং নির্দিষ্ট বিশ্লেষকের নির্বাচনশীলতাকে পরিবর্তন করতে পারে। অ্যামাইন, কার্বক্সিল, ফসফেট, ফসফোনেট, সালফেট এবং সালফোনেটের মতো আয়নাইজড কার্যকরী গোষ্ঠীর দ্রবণযুক্ত নমুনার জন্য, এই গোষ্ঠীগুলির আয়নীকরণ মোবাইল ফেজ বাফার ব্যবহার করে নিয়ন্ত্রণ করা যেতে পারে। উদাহরণস্বরূপ, দ্রবণে কার্বক্সিলিক গ্রুপগুলি ক্রমবর্ধমান নেতিবাচকভাবে চার্জ হয়ে যায় কারণ মোবাইল পর্যায়ের পিএইচ তাদের পিকেএ-এর উপরে উঠে যায়, তাই পুরো অণুটি আরও মেরু হয়ে যায় এবং এ-মেরু স্থির পর্যায়ে কম ধরে থাকে। এই ক্ষেত্রে, ফেজ মোবাইলের পিএইচ 4-5 = পিএইচ (যা কার্বক্সিলিক গ্রুপের জন্য সাধারণ পিকেএ পরিসীমা) এর উপরে বাড়ানো তাদের আয়নীকরণ বাড়ায়, তাই তাদের ধারণক্ষমতা হ্রাস পায়। বিপরীতভাবে, 4-এর কম পিএইচ-এ একটি সচল পর্যায় ব্যবহার করলে তাদের ধারণ ক্ষমতা বৃদ্ধি পাবে, কারণ এটি তাদের আয়নীকরণের মাত্রা হ্রাস করবে, যা তাদের কম মেরু প্রদান করবে। একই বিবেচনা মৌলিক কার্যকরী গোষ্ঠী ধারণকারী পদার্থের ক্ষেত্রে প্রযোজ্য, যেমন অ্যামাইন, যার পিকেএ পরিসীমা প্রায় 8 এবং তার বেশি, আরও বেশি ধরে রাখা হয়, কারণ মোবাইল পর্যায়ের পিএইচ বৃদ্ধি পায়, 8 এবং তার উপরে পৌঁছায়, কারণ তারা কম আয়নিত, তাই কম মেরু। যাইহোক, উচ্চ পিএইচ মোবাইল পর্যায়ের ক্ষেত্রে, বেশিরভাগ ঐতিহ্যবাহী সিলিকা জেল ভিত্তিক বিপরীত পর্যায় কলামগুলি সাধারণত পিএইচ 8 এবং তার উপরে মোবাইল পর্যায়ে ব্যবহারের জন্য সীমিত, তাই, এই পরিসরে অ্যামাইনের ধরে রাখার উপর নিয়ন্ত্রণ সীমিত। আরপি-এলসি পদ্ধতির বিকাশে বাফার প্রকারের পছন্দ একটি গুরুত্বপূর্ণ বিষয়, কারণ এটি আগ্রহের বিশ্লেষকদের ধরে রাখা, নির্বাচনযোগ্যতা এবং সমাধানকে প্রভাবিত করতে পারে। আরপি-এইচপিএলসি-র জন্য একটি বাফার নির্বাচন করার সময়, বিবেচনা করার মতো বেশ কয়েকটি বিষয় রয়েছে, যার মধ্যে রয়েছেঃ মোবাইল পর্যায়ের কাঙ্ক্ষিত পিএইচঃ বাফারগুলি তাদের পিকেএ মানের আশেপাশে সবচেয়ে কার্যকর, তাই একটি পিকেএ সহ একটি বাফার বেছে নেওয়া গুরুত্বপূর্ণ যা কাঙ্ক্ষিত মোবাইল পর্যায়ের পিএইচ-এর কাছাকাছি। জৈব দ্রাবকে বাফারের দ্রবণীয়তাঃ বাফারটি অবশ্যই জৈব দ্রাবকের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ হতে হবে যা সচল পর্যায়ে ব্যবহৃত হচ্ছে, বেশিরভাগ উপরে উল্লিখিত সাধারণ জৈব দ্রাবক, অ্যাসিটোনিট্রাইল, মিথানল এবং আইসোপ্রোপানল। বাফারের ইউভি কাট-অফঃ ইউভি সনাক্তকরণের ক্ষেত্রে, বাফারের একটি ইউভি শোষণ হওয়া উচিত যা আগ্রহের বিশ্লেষণের সনাক্তকরণ তরঙ্গদৈর্ঘ্যের নিচে। এটি বাফারকে সেই বিশ্লেষকদের সনাক্তকরণে হস্তক্ষেপ করতে বাধা দেবে। ডিটেক্টরের সাথে বাফারের সামঞ্জস্যঃ যদি মাস স্পেকট্রোমেট্রি (এমএস) সনাক্তকরণের জন্য ব্যবহার করা হয়, তবে বাফারটি অবশ্যই মাস স্পেকট্রোমেট্রি (এমএস) যন্ত্রের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ হতে হবে। কিছু বাফার, যেমন ফসফেট লবণযুক্ত, এমএস ডিটেক্টরগুলির সাথে ব্যবহার করা যায় না, কারণ এগুলি প্রয়োজনের মতো উদ্বায়ী নয় এবং তারা অ্যানালাইট আয়নীকরণকে দমন করে এমএস সনাক্তকরণে হস্তক্ষেপ করে, যা তাদের এমএস দ্বারা সনাক্ত করা যায় না। আর. পি-এইচ. পি. এল. সি-তে ব্যবহৃত কিছু সাধারণ বাফারের মধ্যে রয়েছেঃ ফসফেট বাফারঃ ফসফেট বাফার বহুমুখী এবং 3 পি. কে. এ মানগুলির জন্য ধন্যবাদ, পিএইচ মানগুলির বিস্তৃত পরিসর অর্জন করতে ব্যবহার করা যেতে পারে। ইউভি সনাক্তকরণের জন্য তাদের খুব কম ইউভি ব্যাকগ্রাউন্ড রয়েছে। তবে, এগুলি এমএস সনাক্তকরণের জন্য উপযুক্ত নয়। অ্যাসিটেট বাফারঃ অ্যাসিটেট বাফারগুলি বহুমুখী এবং সাধারণত আরপি-এলসিতে ব্যবহৃত পিএইচ মানগুলির পরিসীমা অর্জন করতে ব্যবহার করা যেতে পারে। সাব 220 এনএম তরঙ্গদৈর্ঘ্যে ইউভি সনাক্তকরণের ক্ষেত্রে, এটি এতটা অনুকূল নয়। অ্যামোনিয়াম অ্যাসিটেট বাফার এমএস-এর সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। ফর্ম্যাট বাফারঃ ফর্ম্যাট বাফারগুলি ব্যবহৃত পিএইচ-এর পরিসীমা এবং 225 এনএম-এর নিচে সীমিত ইউভি সনাক্তকরণের ক্ষেত্রে অ্যাসিটেট বাফারের অনুরূপ। এর অ্যামোনিয়াম অ্যাসিটেট এমএস-এর সঙ্গেও সামঞ্জস্যপূর্ণ। অ্যামোনিয়াম বাফারঃ অ্যামোনিয়াম বাফারগুলি অস্থির এবং প্রায়শই এলসি-এমএস পদ্ধতিতে ব্যবহৃত হয়। এগুলি কম ইউভি সনাক্তকরণের জন্যও সীমাবদ্ধ। আয়ন-পেয়ারিং (যাকে আয়ন-মিথস্ক্রিয়াও বলা হয়) ব্যবহার করে চার্জযুক্ত বিশ্লেষণগুলি বিপরীত-পর্যায়ের কলামে পৃথক করা যেতে পারে। এই কৌশলটি রিভার্স-ফেজ আয়ন-পেয়ারিং ক্রোমাটোগ্রাফি নামে পরিচিত। জল-দ্রাবক সংমিশ্রণ পৃথক প্রক্রিয়া চলাকালীন পরিবর্তিত হয় না) অথবা দ্রবণ ঢাল ব্যবহার করে (পৃথকীকরণ প্রক্রিয়া চলাকালীন জল-দ্রাবক সংমিশ্রণ পরিবর্তিত হয়, সাধারণত মেরুতা হ্রাস করে) ইল্যুশন করা যেতে পারে। আরও দেখুন জলীয় স্বাভাবিক-পর্যায় ক্রোমাটোগ্রাফি রেফারেন্স বাহ্যিক লিঙ্ক বিভিন্ন ধরনের বিপরীত পর্যায়গুলির সংক্ষিপ্তসার এবং ক্রোমাটোগ্রাফি কার্যকরীকরণ প্রক্রিয়া সম্পর্কিত তথ্য।