กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกน
หลักการของการถ่ายภาพแบบคอลโฟคอลนั้นได้การจดสิทธิบัตรโดย Marvin Minsky ในปี ค.ศ. 1957[2] แต่การพัฒนาการของการใช้แสงเลเซอร์นั้นใช้เวลาอีก 30 ปี จึงสามารถนำมาใช้กับกล้องจุลทรรศน์แบบคอลโฟคอล จนกระทั่งในปี ค.ศ. 1980 กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนได้กลายเป็นเทคนิคอีกชนิดหนึ่งที่ได้รับความนิยม โดยในปี ค.ศ. 1978 นั้น Thomas Cremer และ Christoph Cremer ได้ออกแบบกระบวนการใช้แสงเลเซอร์ในการสแกนแบบทีละจุดโดยใช้จุดโฟกัสของลำแสงเลเซอร์เพื่อให้ได้ภาพ 3 มิติ[3] โดยกล้องคอนโฟคอลที่ใช้แสงเลเซอร์ในการสแกนและใช้ตัวรับแสงเพื่อสร้างภาพ 3 มิติ ตัวแรกที่ถูกออกแบบนั้นได้ถูกใช้สำหรับถ่ายภาพวัตถุทางชีววิทยาซึ่งถูกเคลือบสารฟลูออเรสเซ็นต์ ในทศวรรตต่อมากล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลทำงานด้วยแสงฟลูออเรสเซ็นได้ถูกพัฒนาอย่างจริงจังโดยกลุ่มนักวิจัย University of Amsterdam และ European Molecular Biology Laboratory (EMBL) และ องกรณ์ซึ่งเป็นหุ้นส่วนทางธุรกิจ
กล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกน
การเกิดภาพของกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลชนิดที่ใช้เลเซอร์ในการสแกนเริ่มต้นจากลำแสงเลเซอร์ผ่านช่องของแล่งกำเนิดแสงแบบจุดและถูกโฟกัสด้วยเลนส์วัตถุเป็นปริมาตรของจุดโฟกัส (focal volume) ภายในหรือบนพื้นผิวของชิ้นเนื้อตัวอย่าง แสงสะท้อนจากวัตถุถูกสะท้อนกลับมายังเลนส์วัตถุอีกครั้งโดยแสงสะท้อนนี้มีความยาวคลื่นแตกต่างจากแสงที่มาจากแหล่งกำเนิดแสงแบบจุด เมื่อแสงสะท้อนเดินทางมาถึงตัวแยกแสง (beam slitter) โดยตัวแยกแสงนี้มีคุณสมบัติคือจะยอมให้แสงความยาวคลื่นหนึ่งผ่านไปได้แต่จะสะท้อนแสงอีกความยาวคลื่นหนึ่ง โดยแสงที่สามารถผ่านไปได้จะเป็นแสงจากแหล่งกำเนิดแสงแต่แสงที่สะท้อนมาจากวัตถุจะถูกสะท้อนอีกครั้งหนึ่งเพื่อผ่านไปยังรูขนาดเล็กด้านตัวรับแสง ซึ่งรูขนาดเล็กนี้จะทำการกำจัดแสงที่ไม่ได้มาจากจุดโฟกัสทำให้ได้ภาพที่คมชัดกว่ากล้องจุลทรรศน์แบบปกติ และสามารถเก็บภาพเฉพาะชั้นความลึกที่ต้องการเท่านั้น และในที่สุดจะเดินทางไปถึงตัวรับแสงแบบตัวคูณ (Photo Multiplier Tube; PMT) ซึ่งตัวรับแสงแบบตัวคูณจะทำหน้าที่แปลงสัญญาณแสงเป็นสัญญาณไฟฟ้า[4] โดยส่วนมากจะมีตัวกรองแสง (optical filter) ระหว่างรูขนาดเล็กกับตัวรับแสงเพื่อกรองแสงที่ไม่ต้องการออกอีกครั้งหนึ่งเพื่อให้ได้ภาพที่คมชัดขึ้น