title: Komission direktiivi 2000/33/EY, annettu 25 päivänä huhtikuuta 2000, vaarallisten aineiden luokitusta, pakkaamista ja merkintöjä koskevien lakien, asetusten ja hallinnollisten määräysten lähentämisestä annetun neuvoston direktiivin 67/548/ETY mukauttamisesta tekniikan kehitykseen kahdennenkymmenennenseitsemännen kerran (ETA:n kannalta merkityksellinen teksti.)

eurovoc_concepts:
analytical chemistry
approximation of laws
chemical product
cytology
toxicology

text: L 136/90 FI Euroopan yhteis(cid:246)jen virallinen lehti 8. 6. 2000 KOMISSION DIREKTIIVI 2000/33/EY, annettu 25 p(cid:228)iv(cid:228)n(cid:228) huhtikuuta 2000, vaarallisten aineiden luokitusta, pakkaamista ja merkint(cid:246)j(cid:228) koskevien lakien, asetusten ja hallinnollisten m(cid:228)(cid:228)r(cid:228)ysten l(cid:228)hent(cid:228)misest(cid:228) annetun neuvoston direktiivin 67/548/ETY mukauttamisesta tekniikan kehitykseen kahdennenkymmenennenseitsem(cid:228)nnen kerran (*) (ETA:n kannalta merkityksellinen teksti) EUROOPAN YHTEIS(cid:214)JEN KOMISSIO, joka ON ANTANUT T˜M˜N DIREKTIIVIN: ottaa huomioon Euroopan yhteis(cid:246)n perustamissopimuksen, 1 artikla ottaa huomioon vaarallisten aineiden luokitusta, pakkaamista ja merkint(cid:246)j(cid:228) koskevien lakien, asetusten ja hallinnollisten m(cid:228)(cid:228)- r(cid:228)ysten l(cid:228)hent(cid:228)misest(cid:228) 27 p(cid:228)iv(cid:228)n(cid:228) kes(cid:228)kuuta 1967 annetun neuvoston direktiivin 67/548/ETY (1), sellaisena kuin se on vii- meksi muutettuna Euroopan parlamentin ja neuvoston direktii- vill(cid:228) 1999/33/EY (2), ja erityisesti sen 28 artiklan, sek(cid:228) katsoo seuraavaa: (1) Direktiivin 67/548/ETY liitteess(cid:228) V s(cid:228)(cid:228)det(cid:228)(cid:228)n menetel- mist(cid:228) aineiden ja valmisteiden fysikaalis-kemiallisten omi- naisuuksien, toksisuuden ja ekotoksisuuden m(cid:228)(cid:228)ritt(cid:228)mi- seksi. Kyseinen liite on mukautettava tekniikan kehityk- seen. (2) Kokeisiin ja muihin tieteellisiin tarkoituksiin k(cid:228)ytett(cid:228)vien el(cid:228)inten suojelua koskevien j(cid:228)senvaltioiden lakien, asetus- ten ja hallinnollisten m(cid:228)(cid:228)r(cid:228)ysten l(cid:228)hent(cid:228)misest(cid:228) 24 p(cid:228)i- v(cid:228)n(cid:228) lokakuuta 1986 annetun neuvoston direktiivin 86/609/ETY (3) 7 artiklan 2 kohdan s(cid:228)(cid:228)nn(cid:246)sten mukaan (cid:148)koetta ei saa suorittaa, jos tavoitellun tuloksen saavutta- miseksi on mahdollista soveltaa jotakin toista tieteellisesti luotettavaa menetelm(cid:228)(cid:228), joka ei edellyt(cid:228) el(cid:228)imen k(cid:228)ytt(cid:246)(cid:228)(cid:148). (3) Komissio aikoo lis(cid:228)t(cid:228) direktiivin 67/548/ETY liitteeseen V uusia vaihtoehtoisia koemenetelmi(cid:228), joihin ei sis(cid:228)lly el(cid:228)in- ten k(cid:228)ytt(cid:246)(cid:228), jotta sellaisia menetelmi(cid:228) voitaisiin k(cid:228)ytt(cid:228)(cid:228) direktiivin 67/548/ETY 3 artiklan 1 kohdassa tarkoitettu- jen kemiallisten aineiden testaukseen. (4) T(cid:228)ss(cid:228) direktiiviss(cid:228) s(cid:228)(cid:228)detyt toimenpiteet ovat vaarallisten aineiden ja valmisteiden kaupan teknisten esteiden pois- tamiseksi annettujen direktiivien mukauttamista tekniikan kehitykseen k(cid:228)sittelev(cid:228)n komitean lausunnon mukaiset, Lis(cid:228)t(cid:228)(cid:228)n t(cid:228)m(cid:228)n direktiivin liitteen I 67/548/ETY liitteess(cid:228) V olevaan B osaan. ja II teksti direktiivin 2 artikla 1. J(cid:228)senvaltioiden on saatettava t(cid:228)m(cid:228)n direktiivin noudatta- misen edellytt(cid:228)m(cid:228)t lait, asetukset ja hallinnolliset m(cid:228)(cid:228)r(cid:228)ykset voimaan viimeist(cid:228)(cid:228)n 1. lokakuuta 2001. Niiden on ilmoitettava t(cid:228)st(cid:228) komissiolle viipym(cid:228)tt(cid:228). N(cid:228)iss(cid:228) j(cid:228)senvaltioiden antamissa s(cid:228)(cid:228)d(cid:246)ksiss(cid:228) on viitattava t(cid:228)h(cid:228)n direktiiviin tai niihin on liitett(cid:228)v(cid:228) t(cid:228)llainen viittaus, kun ne virallisesti julkaistaan. J(cid:228)senvaltioiden on s(cid:228)(cid:228)dett(cid:228)v(cid:228) siit(cid:228), miten t(cid:228)llaiset viittaukset tehd(cid:228)(cid:228)n. 2. J(cid:228)senvaltioiden on toimitettava komissiolle t(cid:228)ss(cid:228) direktii- viss(cid:228) tarkoitetuista kysymyksist(cid:228) antamansa keskeiset kansalliset s(cid:228)(cid:228)nn(cid:246)kset ja vastaavuustaulukko t(cid:228)m(cid:228)n direktiivin s(cid:228)(cid:228)nn(cid:246)k- sist(cid:228) ja antamistaan kansallisista s(cid:228)(cid:228)nn(cid:246)ksist(cid:228). 3 artikla T(cid:228)m(cid:228) direktiivi tulee voimaan kolmantena p(cid:228)iv(cid:228)n(cid:228) sen j(cid:228)lkeen, kun se on julkaistu Euroopan yhteis(cid:246)jen virallisessa lehdess(cid:228). 4 artikla T(cid:228)m(cid:228) direktiivi on osoitettu kaikille j(cid:228)senvaltioille. Tehty Brysseliss(cid:228) 25 p(cid:228)iv(cid:228)n(cid:228) huhtikuuta 2000. Komission puolesta Margot WALLSTR(cid:214)M Komission j(cid:228)sen (*) Annettu ennen 26:tta mukauttamista. (1) EYVL 196, 16. 8. 1967, s. 1. (2) EYVL L 199, 30. 7. 1999, s. 57. (3) EYVL L 358, 18. 12. 1986, s. 1. 8. 6. 2000 FI Euroopan yhteis(cid:246)jen virallinen lehti L 136/91 LIITE I (cid:148)B. 40. IHOSY(cid:214)VYTT˜VYYS 1 MENETELM˜ 1. 1 Johdanto Euroopan vaihtoehtoisten menetelmien validointikeskus (ECVAM, Euroopan komission Yhteinen tutkimuskes- kus) on validoinut tieteellisesti kaksi in vitro ihosy(cid:246)vytt(cid:228)vyystesti(cid:228), rotan ihon s(cid:228)hk(cid:246)vastusm(cid:228)(cid:228)rityksen (trans- cutaneous electrical resistance, TER) ja ihmisihomallitestin (1) (2) (3). ECVAMin validointitutkimuksessa osoi- tettiin, etta molemmilla testeill(cid:228) voidaan erottaa luotettavasti tunnetut ihoa sy(cid:246)vytt(cid:228)v(cid:228)t kemikaalit ja sellaiset kemikaalit, jotka eiv(cid:228)t sy(cid:246)vyt(cid:228) ihoa. Lis(cid:228)ksi ihmisihomalliin perustuvalla tutkimuksella voitiin erottaa eriastei- nen ihosy(cid:246)vytt(cid:228)vyys (ihoa voimakkaasti sy(cid:246)vytt(cid:228)v(cid:228)t aineet, R35, ja ihoa sy(cid:246)vytt(cid:228)v(cid:228)t aineet, R34) (2). Seuraa- vassa esitet(cid:228)(cid:228)n molemmat testit ja niiden suoritusmenetelm(cid:228)t. K(cid:228)yt(cid:228)tt(cid:228)v(cid:228) testi valitaan k(cid:228)ytt(cid:228)j(cid:228)n erityisvaa- timusten ja mahdollisuuksien mukaan. Ks. my(cid:246)s osan B Yleisjohdanto. 1. 2 Begriffsbestimmung Ihosy(cid:246)vytt(cid:228)vyys (ihokorroosio): palautumattoman kudosvaurion ilmeneminen ihossa testiaineen aplikaation j(cid:228)lkeen. 1. 3 Vertailuaineet Vertailuaineita ei t(cid:228)smennet(cid:228). Ks. kuitenkin kohdat 1. 5. 3. 4 ja 1. 7. 2. 3. 1. 4 Testimenetelm(cid:228)n periaate (cid:151) rotan ihon s(cid:228)hk(cid:246)vastusm(cid:228)(cid:228)ritys Testiainetta aplikoidaan enint(cid:228)(cid:228)n 24 tunnin ajan inhimillisell(cid:228) tavalla lopetetuista nuorista rotista otettujen ihon(cid:228)ytteiden orvaskesipinnalle. Aineen katsotaan olevan sy(cid:246)vytt(cid:228)v(cid:228), jos se rikkoo marraskeden ja tuhoaa sen suojavaikutuksen, mik(cid:228) mitataan ihon suhk(cid:246)vastuksen pienenemisen(cid:228) tietyn raja-arvon (5 kh) alapuolelle (4) (5). ˜rsytt(cid:228)v(cid:228)t ja ei-(cid:228)rsytt(cid:228)v(cid:228)t aineet eiv(cid:228)t pienenn(cid:228) ihon s(cid:228)hk(cid:246)vastusta raja-arvon alapuolelle. Pinta-aktii- visia aineita ja neutraaleja orgaanisia aineita (ks. m(cid:228)(cid:228)ritelm(cid:228) viitteess(cid:228) 6) tutkittaessa testimenetelm(cid:228)(cid:228)n voidaan lis(cid:228)t(cid:228) v(cid:228)riaineensitomisvaihe, jolla voidaan v(cid:228)hent(cid:228)(cid:228) erityisesti kyseisen tyyppisill(cid:228) kemikaaleilla saatujen v(cid:228)(cid:228)- rien positiivisten tulosten m(cid:228)(cid:228)r(cid:228)(cid:228) (2) (7). 1. 5 Testimenetelm(cid:228)n kuvaus (cid:151) rotan ihon s(cid:228)hk(cid:246)vastusm(cid:228)(cid:228)ritys 1. 5. 1 El(cid:228)imet Ihon(cid:228)ytteiden valmistusta varten tarvitaan nuoria (20(cid:151)23 p(cid:228)iv(cid:228)n ik(cid:228)isi(cid:228)) rottia (Wistar tai vastaava kanta). Sel(cid:228)sta ja kyljist(cid:228) ajetaan karvat tarkasti pienill(cid:228) el(cid:228)inten karvaleikkureilla. El(cid:228)imet pest(cid:228)(cid:228)n pyyhkim(cid:228)ll(cid:228) huolel- lisesti, ja n(cid:228)ytteenottoaluetta k(cid:228)sitell(cid:228)(cid:228)n runsaalla m(cid:228)(cid:228)r(cid:228)ll(cid:228) antibioottiliuosta (jossa on bakteerikasvua tehok- kaasti est(cid:228)v(cid:228)t pitoisuudet esim. streptomysiini(cid:228), penisilliini(cid:228), kloramfenikolia ja amfoterisiini(cid:228)). El(cid:228)imet pes- t(cid:228)(cid:228)nn j(cid:228)lleen antibioottiliuoksella kolmantena tai nelj(cid:228)nten(cid:228) p(cid:228)iv(cid:228)n(cid:228) ensimm(cid:228)isen pesun j(cid:228)lkeen ja k(cid:228)ytet(cid:228)(cid:228)n kokeisiin kolmen p(cid:228)iv(cid:228)n sis(cid:228)ll(cid:228) (el(cid:228)imet eiv(cid:228)t saa olla 31 p(cid:228)iv(cid:228)(cid:228) vanhempia ihon(cid:228)ytteit(cid:228) otettaessa). 1. 5. 2 Ihon(cid:228)ytteiden valmistus El(cid:228)imet lopetetaan inhimillisesti. Kunkin el(cid:228)imen selk(cid:228)nahka poistetaan ja nahasta kuoritaan ylim(cid:228)(cid:228)r(cid:228)inen rasva huolellisesti. Nahka asetetaan polytetrafluoroeteeni-(PTFE) putken toisen p(cid:228)(cid:228)n yli siten, etta orvaskesi- pinta on kosketuksissa putken kanssa. Nahkan(cid:228)yte kiristet(cid:228)(cid:228)n paikalleen kumisella O-renkaalla, ja liika nahka leikataan pois. Kuvassa 1 esitet(cid:228)(cid:228)n putken ja O-renkaan mitat. O-rengas tiivistet(cid:228)(cid:228)n huolellisesti PTFE-putken p(cid:228)(cid:228)han vaseliinilla. Putki kiinnitet(cid:228)(cid:228)n jousipidikkeell(cid:228) koeastian sis(cid:228)lle, jossa on magnesiumsulfaattiliuosta (154 mM) (Kuva 2). 1. 5. 3 Testin suoritus 1. 5. 3. 1 T e s t i a i n e e n a p l i k o i m i n e n Nestem(cid:228)iset testiaineet (150 (cid:181)l) aplikoidaan putken sis(cid:228)puolella olevalle orvaskesipinnalle (Kuva 2). Kun tes- tataan kiinteit(cid:228) aineita, ainetta on pantava n(cid:228)ytepalan p(cid:228)(cid:228)lle riitt(cid:228)v(cid:228) m(cid:228)(cid:228)r(cid:228), ett(cid:228) se peitt(cid:228)(cid:228) koko orvaskesipin- nan. Kiinte(cid:228)n aineen p(cid:228)(cid:228)lle lis(cid:228)t(cid:228)(cid:228)n sitten deionisoitua vett(cid:228) (150 (cid:181)l) ja putkia ravistellaan varovasti. Testiainei- den on oltava mahdollisimman hyvin kosketuksissa ihon kanssa. Joitakin kiinteit(cid:228) aineita voidaan t(cid:228)m(cid:228)n saa- vuttamiseksi l(cid:228)mmitt(cid:228)(cid:228) aina 30 (cid:176)C:een testiaineen sulattamiseksi tai jauhaa rakeiseen tai jauhemaiseen muo- toon. L 136/92 FI Euroopan yhteis(cid:246)jen virallinen lehti 8. 6. 2000 Kutakin testiainetta varten k(cid:228)ytet(cid:228)(cid:228)n kolme ihon(cid:228)ytett(cid:228). Testiaineita aplikoidaan 24 tunnin ajaksi (ks. my(cid:246)s 1. 5. 3. 4). Testiaine poistetaan pesem(cid:228)ll(cid:228) vesihanan alla enint(cid:228)(cid:228)n 30 (cid:176)C:n l(cid:228)mp(cid:246)tilassa, kunnes ainetta ei en(cid:228)(cid:228) irtoa. Jos testiaineet ovat j(cid:228)hmettyneet putkessa, niiden irtoamista voi auttaa noin 30 (cid:176)C:n l(cid:228)mminvesisuihkul- la. 1. 5. 3. 2 I h o n s (cid:228) h k (cid:246) v a s t u s m i t t a u s Ihon s(cid:228)hk(cid:246)vastus mitataan matalaj(cid:228)nnitevaihtovirtasillalla (esim. AIM 401 tai 6401 tai vastaava). Ennen s(cid:228)h- k(cid:246)vastuksen mittausta ihon pintaj(cid:228)nnityst(cid:228) pienennet(cid:228)(cid:228)n lis(cid:228)(cid:228)m(cid:228)ll(cid:228) putkeen 70-prosenttista etanolia riitt(cid:228)v(cid:228)sti ja orvaskeden peitt(cid:228)miseksi. Etanoli poistetaan muutaman sekunnin kuluttua k(cid:228)(cid:228)nt(cid:228)m(cid:228)ll(cid:228) putki yl(cid:246)salaisin, kudos hydratoidaan lis(cid:228)(cid:228)m(cid:228)ll(cid:228) 3 ml magnesiumsulfaattiliuosta (154 mM). Mittaussillan elektrodit asetetaan ihon(cid:228)ytteen molemmille puolille vastuksen mittaamiseksi kilo-ohmeina (kh) (Kuva 2). Elektrodien mitat ja hauenleukapidikkeen alapuolella olevan elektrodin pituus esitet(cid:228)(cid:228)n kuvassa 1. Sisemm(cid:228)n (paksun) elektrodin pidike pidet(cid:228)(cid:228)n mittauksen aikana PTFE-putken p(cid:228)(cid:228)ll(cid:228) sen varmistamiseksi, ett(cid:228) sama pituusm(cid:228)(cid:228)r(cid:228) elektrodia on upotettuna magnesiumsulfaattiliuokseen. Ulompi (ohut) elektrodi asetetaan koe- astian sis(cid:228)lle siten, ett(cid:228) se lep(cid:228)(cid:228) astian pohjalla. Jousipidikkeen pohjan ja PTFE-putken pohjan v(cid:228)linen et(cid:228)isyys pidet(cid:228)(cid:228)n vakiona (Kuva 1), koska t(cid:228)m(cid:228) et(cid:228)isyys vaikuttaa mitattavaan vastuksen arvoon. ihon(cid:228)ytett(cid:228) kohti Jos mitattu vastuksen arvo on yli 20 kh, se voi johtua siit(cid:228), ett(cid:228) testiaine kyll(cid:228)st(cid:228)(cid:228) ihon(cid:228)ytteen orvaskesipin- nan. T(cid:228)t(cid:228) kerrosta voidaan yritt(cid:228)(cid:228) poistaa esim. sulkemalla PTFE-putki peukalolla (hansikas k(cid:228)dess(cid:228)) ja ravis- telemalla putkea noin 10 sekuntia; magnesiumsulfaattiliuos heitet(cid:228)(cid:228)n pois ja vastusmittaus toistetaan tuoreen magnesiumsulfaattiliuoksen kanssa. Ihon s(cid:228)hk(cid:246)vastusmittausten keskiarvot hyv(cid:228)ksyt(cid:228)(cid:228)n, jos samaan aikaan mitatut positiivisten ja negatiivisten kontrollin(cid:228)ytteiden arvot ovat t(cid:228)lle menetelm(cid:228)lle m(cid:228)(cid:228)ritellyiss(cid:228) hyv(cid:228)ksytt(cid:228)viss(cid:228) rajoissa. Suositellut kontrolli- aineet ja niiden hyv(cid:228)ksytt(cid:228)v(cid:228)t vastusalueet k(cid:228)ytett(cid:228)ess(cid:228) t(cid:228)t(cid:228) menetelm(cid:228)(cid:228) ja n(cid:228)it(cid:228) laitteita ovat: Kontrolli Aine Positiivinen Negatiivinen 10 M kloorivetyhappo (36 %) Tislattu vesi Vastuualue (kh) 0,5(cid:151)1,0 10(cid:151)25 1. 5. 3. 3 M u u n n e t t u m e n e t e l m (cid:228) p i n t a - a k t i i v i s i l l e a i n e i l l e j a n e u t r a a l e i l l e o r g a a n i s i l l e a i n e i l l e Jos testiaineet ovat pinta-aktiivisia aineita tai neutraaleja orgaanisia aineita ja niill(cid:228) saatavat ihon s(cid:228)hk(cid:246)vastus- arvot ovat enint(cid:228)(cid:228)n 5 kh, voidaan m(cid:228)(cid:228)ritt(cid:228)(cid:228) v(cid:228)riaineen tunkeutuminen kudokseen. Siten selvitet(cid:228)(cid:228)n, ovatko tulokset v(cid:228)(cid:228)ri(cid:228) positiivisia (2). 1. 5. 3. 3. 1 Sulforodamiini B -v(cid:228)riaineen aplikaatio ja poistaminen Kun ihoa on ensin k(cid:228)sitelty testiaineella, kunkin ihon(cid:228)ytteen orvaskesipinnalle aplikoidaan 2 tunniksi 150 (cid:181)l 10-prosenttista (paino/tilavuus) sulforodamiini B -liuosta tislatussa vedess(cid:228). Ihon(cid:228)ytteit(cid:228) pest(cid:228)(cid:228)n sen j(cid:228)lkeen vesihanan alla huoneenl(cid:228)mp(cid:246)tilassa n. 10 sekuntia liian tai sitoutumattoman v(cid:228)riaineen poistamiseksi. Ihon(cid:228)- ytteet poistetaan varovasti PTFE-putkista ja pannaan pulloon (esim. 20 ml:n lasinen tuikelaskentapullo), jossa on deionisoitua vett(cid:228) (8 ml). Pulloja ravistellaan varovasti 5 minuuttia mahdollisen liian tai sitoutumattoman v(cid:228)riaineen poistamiseksi. Huuhtelu toistetaan. Ihon(cid:228)ytteet otetaan pulloista, pannaan toisiin pulloihin, joissa on 5 ml 30-prosenttista (paino/tilavuus) natriumdodekyylisulfaattia (SDS) tislatussa vedess(cid:228) ja inkuboidaan yli y(cid:246)n 60 (cid:176)C:ssa. Inkubaation j(cid:228)lkeen ihon(cid:228)ytteet otetaan pulloista ja heitet(cid:228)(cid:228)n pois. J(cid:228)ljell(cid:228) olevaa liuosta sentri- fugoidaan 8 minuuttia 21 (cid:176)C:ssa (suhteellinen keskipakoisvoima p 175). Supernatantista otetaan 1 ml:n n(cid:228)yte, joka laimennetaan 1:5:een (tilavuus/tilavuus) [ts. 1 ml + 4 ml] 30-prosenttisella (paino/tilavuus) SDS:ll(cid:228) tis- latussa vedess(cid:228). Liuoksen optinen tiheys (OD) mitataan aallonpituudella (noin) 565 nm. 1. 5. 3. 3. 2 V(cid:228)riaineen pitoisuuden laskeminen Sulforodamiini B -v(cid:228)riaineen pitoisuus ihon(cid:228)ytteess(cid:228) lasketaan OD-arvoista (sulforodamiini B:n molaarinen ekstinktiokerroin aallonpituudella 565 nm = 8,7 (cid:215) 104; molekyylipaino = 580). Sulforodamiini B-pitoisuus m(cid:228)(cid:228)ritet(cid:228)(cid:228)n kullekin ihon(cid:228)ytteelle, ja rinnakkaism(cid:228)(cid:228)rityksille lasketaan keskiarvo. V(cid:228)riaineen sitoutumiskokeen keskiarvotulokset hyv(cid:228)ksyt(cid:228)(cid:228)n, jos samaan aikaan tehtyjen kontrolliaineiden m(cid:228)(cid:228)ritysten tulokset ovat t(cid:228)lle menetelm(cid:228)lle m(cid:228)(cid:228)ritellyiss(cid:228) hyv(cid:228)ksytt(cid:228)viss(cid:228) rajoissa. Suositellut kontrolliaineiden hyv(cid:228)ksytt(cid:228)v(cid:228)t v(cid:228)riainepitoi- suusalueet k(cid:228)ytett(cid:228)ess(cid:228) t(cid:228)t(cid:228) menetelm(cid:228)(cid:228) ja n(cid:228)it(cid:228) laitteita ovat: 8. 6. 2000 FI Euroopan yhteis(cid:246)jen virallinen lehti L 136/93 Kontrolli Aine Positiivinen Negatiivinen 10 M kloorivetyhappo (36 %) Tislattu vesi V(cid:228)riaineen pitoisuusalue ((cid:181)g/ihon(cid:228)yte) 40(cid:151)100 15(cid:151)35 1. 5. 3. 4 L i s (cid:228) t i e t o j a Testiaineet voidaan my(cid:246)s aplikoida ihon(cid:228)ytteille lyhyemm(cid:228)ksi ajaksi (esim. 2 tunniksi), jos halutaan selvitt(cid:228)(cid:228), mitk(cid:228) aineet ovat eritt(cid:228)in sy(cid:246)vytt(cid:228)vi(cid:228). Validointitutkimuksessa havaittiin kuitenkin, ett(cid:228) ihon s(cid:228)hk(cid:246)vastuskoe, jonka avulla voitiin erottaa oikein sy(cid:246)vytt(cid:228)v(cid:228)t ja ei-sy(cid:246)vytt(cid:228)v(cid:228)t aineet 24 tunnin aplikaation j(cid:228)lkeen, yliarvioi useiden testikemikaalien sy(cid:246)vytt(cid:228)vyyden, kun niit(cid:228) aplikoitiin ihon(cid:228)ytteille 2 tunniksi (2). Testauslaitteiden ominaisuudet ja mitat sek(cid:228) koemenetelm(cid:228) voivat vaikuttaa saatuihin ihon s(cid:228)hk(cid:246)vastusarvoi- hin. Viiden kh:n sy(cid:246)vytt(cid:228)vyysraja saatiin t(cid:228)ss(cid:228) ohjeessa selostetuilla erityislaitteilla ja -menetelm(cid:228)ll(cid:228) saatujen tulosten perusteella. Jos testiolosuhteita muutetaan merkitt(cid:228)v(cid:228)sti, voi olla tarpeen k(cid:228)ytt(cid:228)(cid:228) eri raja- ja kontrolli- arvoja. Siksi suositellaan, ett(cid:228) menetelm(cid:228) ja vastuksen raja-arvo kalibroidaan testaamalla sarja vertailustandar- deja, jotka on valittu validointitutkimuksessa k(cid:228)ytettyjen kemikaalien joukosta (3). 1. 6 Testimenetelm(cid:228)n periaate (cid:151) ihmisihomallim(cid:228)(cid:228)ritys Testiainetta aplikoidaan enint(cid:228)(cid:228)n 4 tunniksi kolmiulotteiseen ihmisihomalliin, jossa on rekonstruoitu orvaskesi ja toimiva marraskesi. Sy(cid:246)vytt(cid:228)viksi aineiksi katsotaan aineet, jotka v(cid:228)hent(cid:228)v(cid:228)t solujen el(cid:228)vyyden (m(cid:228)(cid:228)ritettyn(cid:228) esim. MTT-pelkistyskokeella) m(cid:228)(cid:228)riteltyjen raja-arvojen alapuolelle tiettyjen altistusaikojen j(cid:228)lkeen. M(cid:228)(cid:228)ritys perustuu olettamukseen, ett(cid:228) sy(cid:246)vytt(cid:228)v(cid:228)t kemikaalit pystyv(cid:228)t tunkeutumaan marrasketeen (diffundoitumalla tai eroosion seurauksena) ja ovat niin myrkyllisi(cid:228) soluille, ett(cid:228) aiheuttavat solukuolemaa alla olevissa soluker- roksissa. 1. 7 Testimenetelm(cid:228)n kuvaus (cid:151)ihmisihomallim(cid:228)(cid:228)ritys 1. 7. 1 Ihmisihomallit Ihmisihomallit voivat olla per(cid:228)isin eri l(cid:228)hteist(cid:228), mutta niiden on t(cid:228)ytett(cid:228)v(cid:228) tietyt vaatimukset. Mallissa on oltava toimiva marraskesi, jonka alla on kerros el(cid:228)vi(cid:228) soluja. Marraskeden suojaavan vaikutuksen on oltava riitt(cid:228)v(cid:228). T(cid:228)m(cid:228) voidaan osoittaa toteamalla, ett(cid:228) sellaisten aineiden aplikointi, joiden tiedet(cid:228)(cid:228)n olevan myrkylli- si(cid:228) soluille mutta jotka eiv(cid:228)t normaalisti tunkeudu marraskeden l(cid:228)pi, ei aiheuta sytotoksisia vaikutuksia iho- malliin. On osoitettava, ett(cid:228) mallilla saadaan toistettavia tuloksia m(cid:228)(cid:228)r(cid:228)tyiss(cid:228) koeolosuhteissa. Mallin el(cid:228)vien solujen elinkelpoisuuden on oltava riitt(cid:228)v(cid:228) positiivisten ja negatiivisten kontrolliaineiden erotta- miseen. Kun malli altistetaan negatiiviselle kontrolliaineelle, solujen elinkelpoisuuden (mitattuna esim. MTT:n pelkistyksen avulla eli OD-arvona) on oltava kyseiselle mallille hyv(cid:228)ksyttyjen rajojen sis(cid:228)ll(cid:228). Samoin positii- viselle kontrolliaineelle altistettujen solujen el(cid:228)vyyden (verrattuna negatiivisen kontrollin arvoihin) on oltava m(cid:228)(cid:228)ritellyiss(cid:228) rajoissa. T(cid:228)rkeint(cid:228) on, ett(cid:228) k(cid:228)ytetyn ennustemallin osoitetaan t(cid:228)ytt(cid:228)v(cid:228)n kansainv(cid:228)liset validointi- vaatimukset (2). 1. 7. 2 Testin suoritus 1. 7. 2. 1 T e s t i a i n e e n a p l i k o i m i n e n Nestem(cid:228)ist(cid:228) testiainetta aplikoidaan m(cid:228)(cid:228)r(cid:228), mik(cid:228) peitt(cid:228)(cid:228) ihonpinnan (v(cid:228)hint(cid:228)(cid:228)n 25 (cid:181)l/cm2). Kiinte(cid:228)(cid:228) testiai- netta aplikoidaan m(cid:228)(cid:228)r(cid:228), mik(cid:228) peitt(cid:228)(cid:228) ihonpinnan, ja ainetta pit(cid:228)isi kostuttaa, jotta se olisi hyvin kosketuksissa ihoon. Tarvittaessa kiinte(cid:228)t aineet on jauhettava aplikointia varten. On osoitettava, ett(cid:228) aplikaatiomenetelm(cid:228) sopii monenlaisille kemikaalityypeille (2). Altistuksen p(cid:228)(cid:228)ttyess(cid:228) testiaine pest(cid:228)(cid:228)n huolellisesti ihon pinnalta suolaliuoksella. 1. 7. 2. 2 S u l u j e n e l i n k y k y i s y y s m i t t a u k s e t Solujen el(cid:228)vyyden m(cid:228)(cid:228)ritt(cid:228)miseksi voidaan k(cid:228)ytt(cid:228)(cid:228) mit(cid:228) tahansa kvantitatiivista ja validoitua menetelm(cid:228)(cid:228). Tavallisin m(cid:228)(cid:228)ritysmenetelm(cid:228) on MTT:n pelkistys, jonka on osoitettu antavan tarkkoja ja toistettavia tuloksia eri laboratorioissa (2). Ihon(cid:228)yte pannaan MTT-liuokseen, 0,3 mg/ml, 20(cid:151)28 (cid:176)C:n l(cid:228)mp(cid:246)tilassa 3 tunniksi. Saostunut sininen formatsaani uutetaan (liuotinuutolla), ja formatsaanipitoisuus m(cid:228)(cid:228)ritet(cid:228)(cid:228)n mittaamalla OD aallonpituudella 545(cid:151)595 nm. L 136/94 FI Euroopan yhteis(cid:246)jen virallinen lehti 8. 6. 2000 1. 7. 2. 3 L i s (cid:228) t i e t o j a K(cid:228)ytetty ihomalli sek(cid:228) altistusajat ja pesuohjelmat vaikuttavat huomattavasti solujen el(cid:228)vyyteen. Menetelm(cid:228) ja ennustemalli on suositeltavaa kalibroida testaamalla sarja vertailustandardeja, jotka on valittu ECVAMin vali- dointitutkimuksessa k(cid:228)ytettyjen kemikaalien joukosta (3). On t(cid:228)rke(cid:228)(cid:228), ett(cid:228) k(cid:228)ytetyn menetelm(cid:228)n on osoitettu olevan toistettava laboratorioissa ja niiden v(cid:228)lill(cid:228) useille kemikaaleille kansainv(cid:228)listen standardien mukaisesti. Menetelm(cid:228)n on v(cid:228)hint(cid:228)(cid:228)nkin t(cid:228)ytett(cid:228)v(cid:228) tieteelliselle validiteetille aiemmin m(cid:228)(cid:228)ritellyt vaatimukset (2), ja t(cid:228)llai- sen validointitutkimuksen tulokset on julkaistava referee-k(cid:228)yt(cid:228)nt(cid:246)(cid:228) noudattavassa tieteellisess(cid:228) aikakauslehdes- s(cid:228). 2. MITTAUSTULOKSET 2. 1 Tulosten k(cid:228)sittely 2. 1. 1 Rotan ihon s(cid:228)hk(cid:246)vastusm(cid:228)(cid:228)ritys Testiaineiden, positiivisten ja negatiivisten kontrollien ja mahdollisten vakiovertailukemikaalien vastusarvot (kh) olisi esitett(cid:228)v(cid:228) taulukkomuodossa, ja my(cid:246)s tulokset rinnakkaiskokeista tai toistetuista kokeista, keskiarvot ja tuloksena johdettu luokitus olisi esitett(cid:228)v(cid:228). 2. 1. 2 Ihmisihomallim(cid:228)(cid:228)ritys Testiaineiden, positiivisten ja negatiivisten kontrollien ja mahdollisten standardien vakiovertailukemikaalien OD-arvot ja lasketut prosentuaaliset solujen el(cid:228)vyydet olisi esitett(cid:228)v(cid:228) taulukkomuodossa, ja my(cid:246)s tulokset rin- nakkaiskokeista tai toistetuista kokeista, keskiarvot ja tuloksena johdettu luokitus olisi esitett(cid:228)v(cid:228). 2. 2 Tulosten arviointi ja tulkinta 2. 2. 1 Rotan ihon s(cid:228)hk(cid:246)vastusm(cid:228)(cid:228)ritys Jos testiaineelle saatu ihon s(cid:228)hk(cid:246)vastusarvo on yli 5 kh, aine ei ole sy(cid:246)vytt(cid:228)v(cid:228). Jos testiaineelle saatu ihon s(cid:228)hk(cid:246)vastusarvo on enint(cid:228)(cid:228)n 5 kh, eik(cid:228) testiaine ole pinta-aktiivinen aine tai neutraali orgaaninen aine, tes- tiaine on sy(cid:246)vytt(cid:228)v(cid:228). Jos pinta-aktiivinen aine tai neutraali orgaaninen aine antaa enint(cid:228)(cid:228)n 5 kh:n ihon s(cid:228)hk(cid:246)vastusarvoja, aineelle voidaan tehd(cid:228) v(cid:228)riaineen tunkeutumiskoe. Jos ihon(cid:228)ytteen sis(cid:228)lt(cid:228)m(cid:228)n v(cid:228)riaineen keskipitoisuus on v(cid:228)hint(cid:228)(cid:228)n sama kuin samanaikaisesti m(cid:228)(cid:228)ritetyn positiivisen kontrollin (36 % HCl) aiheuttama ihon(cid:228)ytteen sis(cid:228)lt(cid:228)m(cid:228)n v(cid:228)riaineen keskipitoisuus, testiaine on oikeasti positiivinen ja siis sy(cid:246)vytt(cid:228)v(cid:228). Jos ihon(cid:228)ytteen sis(cid:228)lt(cid:228)m(cid:228)n v(cid:228)ri- aineen keskipitoisuus on pienempi kuin samanaikaisesti m(cid:228)(cid:228)ritetyn positiivisen kontrollin (36 % HCl) aiheut- tama ihon(cid:228)ytteen sis(cid:228)lt(cid:228)m(cid:228)n v(cid:228)riaineen keskipitoisuus, testiaine on v(cid:228)(cid:228)r(cid:228) positiivinen, eik(cid:228) siis ole sy(cid:246)vytt(cid:228)v(cid:228). 2. 2. 2 Ihmisihomallim(cid:228)(cid:228)ritys Negatiivisen kontrollin OD-arvo edustaa 100 % solujen el(cid:228)vyytt(cid:228). Siksi kullekin testin(cid:228)ytteelle saaduista OD-ar- voista voidaan laskea solujen elinkykyisyys prosentteina negatiivisesta kontrollista. Prosentuaalinen solujen el(cid:228)- vyyden raja-arvo, jolla erotetaan sy(cid:246)vytt(cid:228)v(cid:228)t testiaineet ei-sy(cid:246)vytt(cid:228)vist(cid:228) (tai eri sy(cid:246)vytt(cid:228)vyysluokat), on m(cid:228)(cid:228)- ritelt(cid:228)v(cid:228) selv(cid:228)sti ennustemallissa ennen menetelm(cid:228)n validointia, ja sen j(cid:228)lkeen teht(cid:228)v(cid:228)ss(cid:228) validointitutkimuk- sessa on osoitettava, ett(cid:228) erottava raja-arvo on asianmukainen (2). 3. TULOSTEN ILMOITTAMINEN Testiraportti Testiraportissa on esitett(cid:228)v(cid:228) v(cid:228)hint(cid:228)(cid:228)n seuraavat tiedot: Testiaine: (cid:151) tunnistetiedot, fysikaalinen olomuoto ja tarvittaessa fysikokemialliset ominaisuudet. N(cid:228)m(cid:228) tiedot on esitet- t(cid:228)v(cid:228) my(cid:246)s mahdollisesti k(cid:228)ytetyist(cid:228) vertailuaineista. Testiolosuhteet: (cid:151) k(cid:228)ytetty testimenetelm(cid:228) yksityiskohtaisesti (cid:151) mahdolliset muutokset ja niiden perustelut. 8. 6. 2000 FI Euroopan yhteis(cid:246)jen virallinen lehti L 136/95 Tulokset: (cid:151) taulukoidaan vastusarvot (ihon s(cid:228)hk(cid:246)vastuskokeesta) tai prosentuaalinen solujen el(cid:228)vyys (ihmisihomalli- m(cid:228)(cid:228)rityksest(cid:228)) testiaineelle, positiiviselle ja negatiiviselle kontrollille ja mahdollisille vertailukemikaaleille sek(cid:228) tulokset rinnakkaiskokeista tai toistetuista kokeista ja keskiarvot, (cid:151) kuvataan mahdolliset muut havaitut vaikutukset. Tulosten tarkastelu. P(cid:228)(cid:228)telm(cid:228)t. 4. VIITTEET (1) ECVAM (1998), ECVAM News & Views, ATLA 26, s. 275-280. (2) Fentem, J. H. , Archer, G. E. B. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. , Holzhutter, H-G. & Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivi- ty. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in Vitro 12, s. 483-524. (3) Barratt, M. D. , Brantom, P. G. , Fentem, J. H. , Gerner, I. , Walker, A. P. & Worth, A. P. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals, Toxicology in Vitro 12, s. 471-482. (4) Oliver, G. J. A. , Pemberton, M. A. & Rhodes, C. (1986), An in vitro skin corrosivity test (cid:151) modifications and validation, Food & Chemical Toxicology 24, s. 507-512. (5) Botham, P. A. , Hall, T. J. , Dennett, R. , McCall, J. C. , Basketter, D. A. , Whittle, E. , Cheeseman, M. , Esdaile, D. J. & Gardner, J. (1992), The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial, Toxicology in Vitro 6, s. 191-194. (6) Worth, A. P. , Fentem, J. H. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. & Liebsch, M. (1998), An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion, ATLA 26, s. 709-720. (7) Botham, P. A. , Chamberlain, M. , Barratt, M. D. , Curren, R. D. , Esdaile, D. J. , Gardner, J. R. , Gordon, V. C. , Hil- debrand, B. , Lewis, R. W. , Liebsch, M. , Logemann, P. , Osborne, R. , Ponec, M. , Regnier, J. F. , Steiling, W. , Walker, A. P. & Balls, M. (1995), A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM workshop 6, ATLA 23, s. 219-255. L 136/96 FI Euroopan yhteis(cid:246)jen virallinen lehti 8. 6. 2000 Kuva 1 8. 6. 2000 FI Euroopan yhteis(cid:246)jen virallinen lehti L 136/97 Kuva 2 L 136/98 FI Euroopan yhteis(cid:246)jen virallinen lehti 8. 6. 2000 LIITE II (cid:148)B. 41 VALOMYRKYLLISYYS (cid:151) IN VITRO 3T3 NRU (cid:151) VALOMYRKYLLISYYSTESTI 1 MENETELM˜ 1. 1 Johdanto Valomyrkyllisyys m(cid:228)(cid:228)ritell(cid:228)(cid:228)n toksiseksi vasteeksi, joka ilmenee sen j(cid:228)lkeen, kun iho on ensin altistunut tietyille kemikaaleille ja sen j(cid:228)lkeen valolle tai jonka kemikaali aiheuttaa ihoa s(cid:228)teilytett(cid:228)ess(cid:228) aineen p(cid:228)(cid:228)sty(cid:228) systeemisesti elimist(cid:246)(cid:246)n. In vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestill(cid:228) saadun informaation avulla voidaan tunnistaa testiaineen valomyr- kyllisyystaipumus, ts. voiko testiaine yhdess(cid:228) UV-valolle ja n(cid:228)kyv(cid:228)lle valolle tapahtuvan altistuksen kanssa aiheuttaa vauriota. Koska valomyrkyllisyys m(cid:228)(cid:228)ritet(cid:228)(cid:228)n in vitro -testiss(cid:228) kemikaalin ja valon yhteisvaikutuksesta aiheutuvana foto- sytotoksisuutena, testill(cid:228) voidaan tunnistaa sek(cid:228) yhdisteit(cid:228), jotka ovat valomyrkyllisi(cid:228) in vivo elimist(cid:246)(cid:246)n annet- tuna ja ihoon jakautuneina, ett(cid:228) yhdisteit(cid:228), jotka ovat valo(cid:228)rsytt(cid:228)vi(cid:228) sen j(cid:228)lkeen, kun niit(cid:228) on aplikoitu iholle paikallisesti. In vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystesti kehitettiin ja validoitiin EU:n ja COLIPAn (Eurooppalainen kosmetiik- (3). Tarkoituksena oli ka- ja hajuvesivalmisteyhdistys) yhteisess(cid:228) hankkeessa vuosina 1992(cid:151)1997 (1) kehitt(cid:228)(cid:228) validi in vitro -vaihtoehto erilaisille k(cid:228)yt(cid:246)ss(cid:228) oleville in vivo -testeille. Vuonna 1996 OECD:n ty(cid:246)ryh- m(cid:228)ss(cid:228) suositeltiin vaiheittaiseen in vitro -testaukseen perustuvaa l(cid:228)hestymistapaa valomyrkyllisyyden m(cid:228)(cid:228)ritt(cid:228)- miseksi (4). (2) In vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestin tuloksia verrattiin akuutteihin valomyrkyllisyys- ja valo(cid:228)rsytysvaiku- tuksiin el(cid:228)imill(cid:228) ja ihmisill(cid:228) in vivo, ja testin osoitettiin ennustavan erinomaisesti n(cid:228)it(cid:228) vaikutuksia. Testin tar- koituksena ei ole ennustaa muita kemikaalien ja valon yhteisvaikutuksesta aiheutuvia haitallisia vaikutuksia, esim. fotogenotoksisuutta, valoallergiaa ja fotokarsinogeenisuutta, vaikka monet t(cid:228)llaisia erityisominaisuuksia omaavat kemikaalit reagoivat positiivisesti in vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestiss(cid:228). Testi ei pysty arvioi- maan aineen valomyrkyllisyyspotenssia kvantitatiivisesti. Lis(cid:228)yksess(cid:228) esitet(cid:228)(cid:228)n vaiheittainen l(cid:228)hestymistapa kemikaalien valomyrkyllisyyden m(cid:228)(cid:228)ritt(cid:228)miseksi. 1. 2 M(cid:228)(cid:228)ritelm(cid:228)t S(cid:228)teilyvoimakkuus: pintaan kohdistuvan ultraviolettivalon (UV) tai n(cid:228)kyv(cid:228)n valon (VIS) intensiteetti mitattuna watteina neli(cid:246)metri(cid:228) kohti tai watteina neli(cid:246)senttimetri(cid:228) kohti (W/m2 tai mW/cm2). Valoannos: pintaan kohdistuvan ultraviolettis(cid:228)teilyn (UV) tai n(cid:228)kyv(cid:228)n valon s(cid:228)teilyn m(cid:228)(cid:228)r(cid:228) (= intensiteetti (cid:215) aika) ilmaistuna jouleina (= W (cid:215) s) pinta-alayksikk(cid:246)(cid:228) kohti, esim. J/m2 tai J/cm2. UV-valon aallonpituusalueet: Kansainv(cid:228)lisen valaistustoimikunnan (ICI) suosittelemat nimitykset ovat: UVA (315(cid:151)400 nm), UVB (280(cid:151)315 nm) ja UVC (100(cid:151)280 nm). Muitakin m(cid:228)(cid:228)ritelmi(cid:228) k(cid:228)ytet(cid:228)(cid:228)n: UVB- ja UVA-alueen raja asetetaan usein 320 nanometriin ja UVA-alue voidaan jakaa alueisiin UV-A1 ja UV-A2, jolloin raja on noin 340 nanometriss(cid:228). Solujen el(cid:228)vyys: muuttuja, jolla mitataan solupopulaation kokonaisaktiivisuutta (esim. neutraalipunan ottoa solujen lysosomeihin), joka mittaussuureesta ja testimenetelm(cid:228)st(cid:228) riippuen korreloi solujen kokonaism(cid:228)(cid:228)r(cid:228)(cid:228)n ja/tai elinkykyyn. Suhteellinen solujen el(cid:228)vyys: solujen el(cid:228)vyys ilmaistuna suhteessa negatiivisiin kontrolleihin (liuotinkontrolleihin), jotka k(cid:228)yv(cid:228)t l(cid:228)pi testin muuten (joko + UV tai ﬂ UV), mutta joita ei ole k(cid:228)sitelty testikemikaalilla. Ennustemalli: algoritmi, jonka avulla myrkyllisyystestin tulokset muunnetaan ennusteeksi myrkyllisyyspotentiaa- lista. T(cid:228)ss(cid:228) ohjeessa voidaan k(cid:228)ytt(cid:228)(cid:228) PIF:i(cid:228) ja MPE:t(cid:228) in vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestin tulosten muun- tamiseen valomyrkyllisyyspotentiaaliennusteeksi. PIF (valo(cid:228)rsytt(cid:228)vyystekij(cid:228)): tekij(cid:228), joka muodostetaan vertaamalla testikemikaalin kahta yht(cid:228) tehokasta solumyr- kyllisyyspitoisuutta (EC50), jotka on saatu, kun soluja s(cid:228)teilytet(cid:228)(cid:228)n UVA-/n(cid:228)kyv(cid:228)ll(cid:228) valolla (+ UV), joka ei ole solumyrkyllist(cid:228), ja kun soluja ei s(cid:228)teilytet(cid:228) (ﬂ UV). MPE (keskim(cid:228)(cid:228)r(cid:228)inen valovaikutus): uusi suure, joka saadaan analysoimalla matemaattisesti kokonaan kaksi pitoi- suus(cid:151)vaste(cid:151)kuvaajaa, jotka on saatu, kun soluja s(cid:228)teilytet(cid:228)(cid:228)n UVA-/n(cid:228)kyv(cid:228)ll(cid:228) valolla, joka ei ole solumyrkyl- list(cid:228), ja kun soluja ei s(cid:228)teilytet(cid:228) (ﬂ UV). 8. 6. 2000 FI Euroopan yhteis(cid:246)jen virallinen lehti L 136/99 Valomyrkyllisyys: akuutti toksinen vaste, joka ilmenee sen j(cid:228)lkeen, kun iho on ensimm(cid:228)isen kerran altistettu tie- tyille kemikaaleille ja sen j(cid:228)lkeen valolle, tai jonka ihon s(cid:228)teilytys aiheuttaa samalla tavalla sen j(cid:228)lkeen, kun kemikaalia on annettu elimist(cid:246)(cid:246)n. Valo(cid:228)rsytt(cid:228)vyys: valomyrkyllisyyden alak(cid:228)site, jota k(cid:228)ytet(cid:228)(cid:228)n vain sellaisista valomyrkyllisist(cid:228) reaktioista, jotka ilmenev(cid:228)t ihossa (paikallisesti tai suun kautta annetulle) kemikaalille altistumisen j(cid:228)lkeen. T(cid:228)llaiset valomyrkyl- liset reaktiot aiheuttavat aina ep(cid:228)spesifist(cid:228) solutuhoa (auringonpolttaman tapaisia reaktioita). Valoallergia: hankittu immunologinen reaktiivisuus, joka ei ilmene ensimm(cid:228)isen kemikaali- ja valok(cid:228)sittelyn yhteydess(cid:228) ja joka tarvitsee yhden tai kahden viikon induktioajan ennen kuin reaktiivisuus voidaan osoittaa. Fotogenotoksisuus: genotoksinen vaste, joka havaitaan genotoksisuusm(cid:228)(cid:228)rityksell(cid:228) ja joka ilmenee altistettaessa soluja sellaiselle UV-/n(cid:228)kyv(cid:228)n valon annokselle, joka ei ole genotoksinen, ja kemikaalille, joka ei ole genotoksi- nen. Fotokarsinogeenisuus: toistuvalla valo- ja kemikaalialtistuksella aiheutettu karsinogeenisuus. Termi(cid:228) (cid:146)foto-kokarsi- nogeneesi(cid:146) k(cid:228)ytet(cid:228)(cid:228)n, jos kemikaali voimistaa UV-valon aiheuttamaa tuumorigeneesi(cid:228). 1. 3 Vertailuaineet Kun 3T3 NRU -valomyrkyllisyystesti otetaan k(cid:228)ytt(cid:246)(cid:246)n, suositellaan, ett(cid:228) positiivisena kontrollina k(cid:228)ytetyn, klooripromatsiinin, joka olisi testattava samanaikaisesti jokaisessa m(cid:228)(cid:228)rityksess(cid:228), lis(cid:228)ksi k(cid:228)ytet(cid:228)(cid:228)n vertailukemi- kaaleina joitakin t(cid:228)m(cid:228)n testin yhteydess(cid:228) laboratorioiden v(cid:228)lisiss(cid:228) vertailuissa k(cid:228)ytetyist(cid:228) kemikaaleista (1) (3) (13). 1. 4 Alustavia huomioita Useantyyppisten kemikaalien on ilmoitettu olevan valomyrkyllisi(cid:228) (5) (6) (7) (8). Niiden ainoa yhteinen omi- naisuus on kyky absorboida valoenergiaa auringonvalon spektrialueella. Valokemian ensimm(cid:228)isen lain (Grott- haus-Draperin laki) mukaan valoreaktio edellytt(cid:228)(cid:228) riitt(cid:228)v(cid:228)(cid:228) valokvanttien absorptiota. T(cid:228)m(cid:228) merkitsee sit(cid:228), ett(cid:228) ennen kuin harkitaan t(cid:228)m(cid:228)n ohjeen mukaista biologista testausta, testikemikaalin UV-valon ja n(cid:228)kyv(cid:228)n valon absorptiospektri olisi m(cid:228)(cid:228)ritett(cid:228)v(cid:228) (esim. OECD:n testiohjeen 101 mukaisesti). Jos kemikaalin mooliekstinktio- tai absorptiokerroin on pienempi kuin 10 1 (cid:215) molﬂ 1 (cid:215) cmﬂ 1, kemikaalilla ei ole valoreaktiokyky(cid:228) eik(cid:228) sit(cid:228) tar- vitse testata in vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestill(cid:228) tai mill(cid:228)(cid:228)n muulla haitallisia valokemiallisia vaikutuksia m(cid:228)(cid:228)ritt(cid:228)v(cid:228)ll(cid:228) biologisella testill(cid:228) (Lis(cid:228)ys). 1. 5 Testimenetelm(cid:228)n periaate Tunnetaan nelj(cid:228) mekanismia, joilla valomyrkyllisyysvaste voi synty(cid:228), kun (kemiallinen) kromofori absorboi valoa (7). Kaikista aiheutuu soluvaurioita. Sen vuoksi in vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystesti perustuu kemi- kaalin solumyrkyllisyyden vertaamiseen, kun kemikaalia testataan altistettaessa sellaiselle UVA- tai n(cid:228)kyv(cid:228)lle valolle, joka ei ole solumyrkyllinen, ja ilman t(cid:228)llaista valoaltistusta. Solumyrkyllisyys ilmaistaan t(cid:228)ss(cid:228) testiss(cid:228) pitoisuudesta riippuvana neutraalipunan (9) soluunoton/kertymisen v(cid:228)henemisen(cid:228) 24 tuntia kemikaalik(cid:228)sitte- lyn ja s(cid:228)teilytyksen j(cid:228)lkeen. Balb/c 3T3 -soluja viljell(cid:228)(cid:228)n 24 tuntia yhden solun vahvuisen kerroksen aikaansaamiseksi. Kutakin testikemi- kaalia kohti inkuboidaan aluksi yhden tunnin ajan kahta 96 kuopan levy(cid:228), joissa on kahdeksaa eri pitoisuutta testattavaa kemikaalia. Sen j(cid:228)lkeen toinen levyist(cid:228) altistetaan ei-solumyrkylliselle UVA-valon ja n(cid:228)kyv(cid:228)n valon annokselle 5 J/cm2 UVA:ta (+ UV-koe), ja toinen levy pidet(cid:228)(cid:228)n pime(cid:228)ss(cid:228) (ﬂ UV-koe). Sitten kummankin levyn k(cid:228)sittelyneste korvataan viljelynesteell(cid:228), inkuboidaan toiset 24 tuntia, ja m(cid:228)(cid:228)ritet(cid:228)(cid:228)n solujen el(cid:228)vyys neutraa- lipunan ottona (NRU) kolmessa tunnissa. Suhteellinen solujen el(cid:228)vyys, joka ilmaistaan prosenttiosuutena k(cid:228)sit- telem(cid:228)tt(cid:246)mist(cid:228) negatiivisista kontrolleista, lasketaan kullekin kahdeksalle testipitoisuudelle. Valomyrkyllisyys- kyvyn ennustamiseksi verrataan pitoisuusvasteita, jotka on saatu UV-s(cid:228)teilytyksen kanssa (+ UV) ja ilman sit(cid:228) (ﬂ UV), yleens(cid:228) EC50 -tasolla, ts. siin(cid:228) pitoisuudessa, joka v(cid:228)hent(cid:228)(cid:228) solujen el(cid:228)vyytt(cid:228) 50 prosentilla verrattuna k(cid:228)sittelem(cid:228)tt(cid:246)miin kontrolleihin. 1. 6 Laatuvaatimukset Solujen herkkyys UVA-valolle, solujen aiempaa k(cid:228)ytt(cid:246)(cid:228) koskevat tiedot: solujen herkkyys UVA-valolle on tarkistet- tava s(cid:228)(cid:228)nn(cid:246)llisesti. Soluja pannaan viljelyyn samassa tiheydess(cid:228), jota k(cid:228)ytet(cid:228)(cid:228)n in vitro 3T3 NRU -valomyrkylli- syystestiss(cid:228), s(cid:228)teilytet(cid:228)(cid:228)n seuraavana p(cid:228)iv(cid:228)n(cid:228) UVA-valoannoksilla, joiden suuruus on 1(cid:151)9 J/cm2, ja m(cid:228)(cid:228)rite- t(cid:228)(cid:228)n solujen el(cid:228)vyys p(cid:228)iv(cid:228)(cid:228) my(cid:246)hemmin NRU-m(cid:228)(cid:228)rityksell(cid:228). Solut t(cid:228)ytt(cid:228)v(cid:228)t laatuvaatimukset, jos niiden el(cid:228)- vyys UVA-s(cid:228)teilytyksen j(cid:228)lkeen, jonka voimakkuus on 5 J/cm2, on v(cid:228)hint(cid:228)(cid:228)n 80 % pime(cid:228)ss(cid:228) pidettyjen kont- rollien elinkykyisyydest(cid:228). Suurimmalla UVA-annoksella 9 J/cm2 el(cid:228)vyyden pit(cid:228)isi olla v(cid:228)hint(cid:228)(cid:228)n 50 % pime- (cid:228)ss(cid:228) pidettyjen kontrollien el(cid:228)vyydest(cid:228). T(cid:228)m(cid:228) tarkistus olisi teht(cid:228)v(cid:228) suunnilleen joka 10. kerta soluja siirrostettaessa. Negatiivisten kontrollisolujen UVA-herkkyys, nykyinen testi: testi t(cid:228)ytt(cid:228)(cid:228) laatuvaatimukset, jos negatiivisten kontrol- lien (Earlen tasapainotetussa suolaliuoksessa, EBSS, jossa on tai ei ole 1 % dimetyylisulfoksidia, DMSO, tai 1 % etanolia, EtOH, olevat solut) el(cid:228)vyys + UVA-kokeessa on v(cid:228)hint(cid:228)(cid:228)n 80 % samassa liuottimessa olevien s(cid:228)teilyt- t(cid:228)m(cid:228)tt(cid:246)mien solujen elinkykyisyydest(cid:228) samaan aikaan tehdyss(cid:228) pime(cid:228)kokeessa (ﬂ UVA). L 136/100 FI Euroopan yhteis(cid:246)jen virallinen lehti 8. 6. 2000 Negatiivisten kontrollien el(cid:228)vyys: negatiivisten kontrollien neutraalipunauutteesta mitattu absoluuttinen optinen tiheys (OD540 NRU) osoittaa, ovatko kuoppaa kohti aplikoidut 1 (cid:215) 104 solua lis(cid:228)(cid:228)ntyneet normaalilla nopeudella m(cid:228)(cid:228)ritykseen kuuluvien kahden p(cid:228)iv(cid:228)n aikana. Testi t(cid:228)ytt(cid:228)(cid:228) hyv(cid:228)ksymisvaatimukset, jos k(cid:228)sittelem(cid:228)tt(cid:246)mien kontrollien keskim(cid:228)(cid:228)r(cid:228)inen OD540 NRU on ¯ 0,2. Positiivinen kontrolli: kussakin in vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestiss(cid:228) on testattava samanaikaisesti jokin tunnetusti valomyrkyllinen kemikaali. EU/COLIPA-validointitutkimuksessa k(cid:228)ytettiin positiivisena kontrollina klooripromatsiinia (CPZ), jota sen vuoksi suositellaan. CPZ:n testaukselle in vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyy- den standardiprotokollassa m(cid:228)(cid:228)riteltiin seuraavat hyv(cid:228)ksynt(cid:228)vaatimukset: CPZ, s(cid:228)teilytetty (+ UVA): EC50 = 0,1(cid:151)2,0 (cid:181)g/ml; CPZ, ei s(cid:228)teilytetty (ﬂ UVA): EC50 = 7,0(cid:151)90,0 (cid:181)g/ml. Valo(cid:228)rsytt(cid:228)vyystekij(cid:228)n (PIF), ts. EC50:n muutoksen, olisi oltava v(cid:228)hint(cid:228)(cid:228)n 6. CPZ:n sijasta voidaan samanaikaisesti testattavina positiivisina kontrolleina k(cid:228)ytt(cid:228)(cid:228) muita tunnettuja valomyr- kyllisi(cid:228) kemikaaleja, jotka sopivat kyseess(cid:228) olevalle kemikaaliluokalle tai arvioitavana olevan testikemikaalin liukoisuusominaisuuksiin. T(cid:228)ll(cid:246)in testin hyv(cid:228)ksynt(cid:228)vaatimuksiksi pit(cid:228)isi m(cid:228)(cid:228)ritell(cid:228) asianmukaisesti EC50-arvo- jen vaihtelualue ja PIF- tai MPE-arvot (keskim(cid:228)(cid:228)r(cid:228)inen valovaikutus) aikaisempien tietojen perusteella (historial- linen kontrolli). 1. 7 Testimenetelm(cid:228)n kuvaus 1. 7. 1 Valmistelut 1. 7. 1. 1 S o l u t Validointitutkimuksessa k(cid:228)ytettiin joko ATCC:st(cid:228) tai ECACC:st(cid:228) hankittua pysyv(cid:228)(cid:228) hiiren fibroblastisolulinjaa Balb/c 3T3, kloonia 31, ja siksi sit(cid:228) suositellaan. Muita soluja tai solulinjoja voidaan k(cid:228)ytt(cid:228)(cid:228), kun tutkimus- suunnitelma on sama, jos viljelyolosuhteet mukautetaan solujen erityistarpeisiin. Samanlaisuus on t(cid:228)ll(cid:246)in osoi- tettava. Mykoplasmakontaminaatio on tutkittava s(cid:228)(cid:228)nn(cid:246)llisesti, ja soluja saa k(cid:228)ytt(cid:228)(cid:228) vain jos tutkimustulos on tyydyt- t(cid:228)v(cid:228). Koska solujen UVA-herkkyys voi lis(cid:228)(cid:228)nty(cid:228) siirrostamisten my(cid:246)t(cid:228), pit(cid:228)isi k(cid:228)ytt(cid:228)(cid:228) sellaisia Balb/c 3T3 -soluja, joita on siirrostettu mahdollisimman harvoja kertoja, mieluiten alle 100 kertaa. On t(cid:228)rke(cid:228)(cid:228), ett(cid:228) Balb/c 3T3 -solujen UVA-herkkyys tarkistetaan t(cid:228)ss(cid:228) ohjeessa selostetun laadunvalvontamenettelyn mukaisesti. 1. 7. 1. 2 V i l j e l y n e s t e j a v i l j e l y o l o s u h t e e t Sopivaa viljelynestett(cid:228) ja inkubaatio-olosuhteita olisi k(cid:228)ytett(cid:228)v(cid:228) solujen tavanomaiseen siirrostamiseen ja testin aikana. Balb/c 3T3 -soluille k(cid:228)ytet(cid:228)(cid:228)n DMEM:i(cid:228), jossa on 10 % vastasyntyneen vasikan seerumia, 4 mM gluta- miinia, penisilliini(cid:228) ja streptomysiini(cid:228), ja soluja inkuboidaan kaapissa, jonka l(cid:228)mp(cid:246)tila on 37 (cid:176)C ja CO2-pitoi- suus 7,5 %. On erityisen t(cid:228)rke(cid:228)(cid:228), ett(cid:228) viljelyolosuhteet ovat sellaiset, ett(cid:228) solusykli pysyy samanlaisena kuin se on aiemminkin ollut k(cid:228)ytetyill(cid:228) soluilla tai solulinjalla. 1. 7. 1. 3 V i l j e l m i e n v a l m i s t u s Pakastetuista varastoviljelmist(cid:228) otettuja soluja inokuloidaan viljelynesteess(cid:228) sopivassa tiheydess(cid:228), ja niit(cid:228) siir- rostetaan v(cid:228)hint(cid:228)(cid:228)n kerran ennen kuin ne k(cid:228)ytet(cid:228)(cid:228)n in vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestiss(cid:228). Valomyrkyllisyystesti(cid:228) varten soluja inokuloidaan sellaisessa tiheydess(cid:228), ett(cid:228) viljelm(cid:228)t eiv(cid:228)t ole konfluentteja testin p(cid:228)(cid:228)ttyess(cid:228), ts. kun solujen elinkykyisyys m(cid:228)(cid:228)ritet(cid:228)(cid:228)n 48 tunnin kuluttua solujen inokuloinnista. Balb/c 3T3 -soluille, joita viljell(cid:228)(cid:228)n 96-kuoppalevyill(cid:228), suositellaan solutiheytt(cid:228) 1 (cid:215) 104 solua kuoppaa kohti. Kutakin testikemikaalia varten soluja inokuloidaan t(cid:228)ysin samalla tavalla kahdelle erilliselle 96-kuoppalevylle, jotka k(cid:228)yv(cid:228)t l(cid:228)pi samanaikaisesti koko testiohjelman t(cid:228)ysin samanlaisissa olosuhteissa, lukuun ottamatta aikaa, jolloin yht(cid:228) kuoppalevy(cid:228) s(cid:228)teilytet(cid:228)(cid:228)n (+ UVA/VIS) ja toinen pidet(cid:228)(cid:228)n pime(cid:228)ss(cid:228) (ﬂ UVA/VIS). 1. 7. 1. 4 M e t a b o l i n e n a k t i v a a t i o Vaikka metaboloivia j(cid:228)rjestelmi(cid:228) yleens(cid:228) tarvitaan kaikissa in vitro -testeiss(cid:228), joilla ennustetaan genotoksisuutta ja karsinogeenisuutta, valomyrkyllisyydelle ei toistaiseksi tunneta kemikaaleja, jotka edellytt(cid:228)isiv(cid:228)t metabolista aktivaatiota, jotta ne voisivat olla valomyrkyllisi(cid:228) in vivo tai in vitro. Siten ei katsota olevan tarpeellista eik(cid:228) tie- teellisesti perusteltua suorittaa t(cid:228)t(cid:228) testi(cid:228) metabolisen aktivaatioj(cid:228)rjestelm(cid:228)n kanssa. 8. 6. 2000 FI Euroopan yhteis(cid:246)jen virallinen lehti L 136/101 1. 7. 1. 5 T e s t i k e m i k a a l i n v a l m i s t u s Testikemikaalit on valmistettava v(cid:228)litt(cid:246)m(cid:228)sti ennen k(cid:228)ytt(cid:246)(cid:228) ellei stabiilisuustiedoista ilmene, ett(cid:228) varastointi voidaan hyv(cid:228)ksy(cid:228). Valmistus on mahdollisesti tarpeen tehd(cid:228) punaisessa valossa, jos aine hajoaa nopeasti valos- sa. Testikemikaali pit(cid:228)isi liuottaa puskuroituun suolaliuokseen, esim. Earlin tasapainotettuun suolaliuokseen (EBSS) tai fosfaatilla puskuroituun fysiologiseen suolaliuokseen (PBS), joissa ei saa olla proteiinikontaminant- teja tai valoa absorboivia pH-indikaattoriv(cid:228)rej(cid:228), etteiv(cid:228)t ne h(cid:228)iritsisi reaktioita s(cid:228)teilytyksen aikana. Huonosti vesiliukoiset testikemikaalit pit(cid:228)isi liuottaa sopivaan liuottimeen 100-kertaisessa pitoisuudessa loppu- pitoisuuteen verrattuna ja laimentaa sitten suhteessa 1:100 puskuroidulla suolaliuoksella. Jos k(cid:228)ytet(cid:228)(cid:228)n liuotin- ta, sit(cid:228) on oltava 1 prosentin (tilavuus/tilavuus) vakiotilavuudessa kaikissa viljelmiss(cid:228), ts. my(cid:246)s negatiivisissa kontrolleissa ja kaikissa testikemikaalipitoisuuksissa. Dimetyylisulfoksidi (DMSO) ja etanoli (EtOH) ovat suositeltavia liuottimia. Muut liuottimet, jotka eiv(cid:228)t ole kovin solumyrkyllisi(cid:228) (esim. asetoni), voivat olla sopivia, mutta niiden erityisominaisuudet (esim. reaktiivisuus testikemikaalin kanssa, valomyrkyllisyysvaikutuksen vaimeneminen tai radikaalien sitomisominaisuus) on arvioitava huolellisesti. Vortex-sekoitusta ja/tai ultra(cid:228)(cid:228)nihajoitusta ja/tai l(cid:228)mmitt(cid:228)mist(cid:228) 37 (cid:176)C:een voidaan k(cid:228)ytt(cid:228)(cid:228) tarvittaessa liukene- misen helpottamiseksi. 1. 7. 1. 6 U V - s (cid:228) t e i l y t y s (cid:151) v a l m i s t e l u Valol(cid:228)hde: sopivan valol(cid:228)hteen ja sopivien suodattimien valitseminen on t(cid:228)rkein asia valomyrkyllisyyden tes- tauksessa. UVA ja n(cid:228)kyv(cid:228) valo liittyv(cid:228)t yleens(cid:228) valolle herkistymiseen (7) (10), kun taas UVB on v(cid:228)hemm(cid:228)n t(cid:228)rke(cid:228) ja v(cid:228)litt(cid:246)m(cid:228)sti soluille eritt(cid:228)in myrkyllinen. Sen valomyrkyllisyys lis(cid:228)(cid:228)ntyy 1000-kertaiseksi aallonpituu- delta 313 nm aallonpituudelle 280 nm (11). Perusteena sopivan valol(cid:228)hteen valitsemiseen pit(cid:228)isi olla mm. olennainen vaatimus, ett(cid:228) valol(cid:228)hde emittoi aallonpituuksia, joita testikemikaali absorboi, ja ett(cid:228) valoannoksen (joka pit(cid:228)(cid:228) saavuttaa j(cid:228)rkev(cid:228)ss(cid:228) ajassa) pit(cid:228)isi olla riitt(cid:228)v(cid:228) tunnettujen valolle herkist(cid:228)vien kemikaalien osoitta- miseksi. Lis(cid:228)ksi k(cid:228)ytetyt aallonpituudet ja annokset eiv(cid:228)t saisi olla liian tuhoisia testij(cid:228)rjestelm(cid:228)lle; t(cid:228)llainen vaikutus olisi mm. l(cid:228)mm(cid:246)n muodostuminen (infrapuna-alue). Auringonvalon simulointia pidet(cid:228)(cid:228)n parhaimpana valol(cid:228)hteen(cid:228). Sek(cid:228) ksenonkaarilamppuja ett(cid:228) (seostettuja) elohopeahalidikaarilamppuja k(cid:228)ytet(cid:228)(cid:228)n auringonvalosimulaattoreissa. J(cid:228)lkimm(cid:228)isill(cid:228) on se etu, ett(cid:228) ne muo- dostavat v(cid:228)hemm(cid:228)n l(cid:228)mp(cid:246)(cid:228) ja ovat halvempia, mutta niiden spektri ei t(cid:228)ysin vastaa auringonvalon spektri(cid:228). Koska kaikki auringonvalosimulaattorit l(cid:228)hett(cid:228)v(cid:228)t huomattavia m(cid:228)(cid:228)ri(cid:228) UVB-valoa, ne pit(cid:228)isi suodattaa sopi- vasti eritt(cid:228)in solumyrkyllisten UVB-aallonpituuksien vaimentamiseksi. In vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystesti(cid:228) varten olisi k(cid:228)ytett(cid:228)v(cid:228) s(cid:228)teilyspektri(cid:228), jossa ei k(cid:228)yt(cid:228)nn(cid:246)llisesti katsoen ole UVB-valoa (UVA:UVB p 1:20). Yksi esimerkki in vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestin validointitutki- muksessa k(cid:228)ytetyn suodatetun auringonvalosimulaattorin s(cid:228)teilyspektrijakaumasta on julkaistu (3). Dosimetria: valon voimakkuus (s(cid:228)teilyvoimakkuus, radianssi) olisi tarkistettava s(cid:228)(cid:228)nn(cid:246)llisesti ennen jokaista valomyrkyllisyystesti(cid:228) k(cid:228)ytt(cid:228)m(cid:228)ll(cid:228) sopivaa leve(cid:228)kaistaista UV-mittaria. UV-mittarin on oltava kalibroitu valo- l(cid:228)hteen suhteen. Sen suorituskyky pit(cid:228)isi tarkistaa, mit(cid:228) varten suositetaan toisen, samantyyppisen ja t(cid:228)ysin samalla tavalla kalibroidun vertailu-UV-mittarin k(cid:228)ytt(cid:246)(cid:228). Olisi toivottavaa, ett(cid:228) tasaisin v(cid:228)lein k(cid:228)ytett(cid:228)isiin spektros(cid:228)teilymittaria suodatetun valol(cid:228)hteen s(cid:228)teilyvoimakkuusspektrin mittaamiseen ja leve(cid:228)kaista-UV-mitta- rin kalibroimiseen, mutta t(cid:228)llaiset laitteet vaativat asianmukaisesti koulutettua ammattihenkil(cid:246)st(cid:246)(cid:228) niit(cid:228) k(cid:228)ytt(cid:228)- m(cid:228)(cid:228)n. s(cid:228)teilyvoimakkuus on s(cid:228)(cid:228)dett(cid:228)v(cid:228) arvoon 1,666 mW/cm2. Validointitutkimuksessa todettiin, ett(cid:228) annos 5 J/cm2 (UVA) ei ollut myrkyllinen Balb/c 3T3 -soluille ja ett(cid:228) se pystyi eksitoimaan jopa heikosti valomyrkyllisi(cid:228) kemikaaleja. Jotta saavutetaan arvo 5 J/cm2 50 minuutin aika- na, Jos k(cid:228)ytet(cid:228)(cid:228)n muuta solulinjaa tai eri valol(cid:228)hdett(cid:228), UVA-annosta voi olla tarpeen mukauttaa hiukan ottaen huomioon, ett(cid:228) se ei saa vahingoittaa soluja, mutta sen on oltava riitt(cid:228)v(cid:228) valomyrkyllisten standardiaineiden osoittamiseksi. Valoaltistusaika las- ketaan seuraavasti: 1. 7. 2 Testiolosuhteet Testikemikaalin enimm(cid:228)ispitoisuus ei saisi olla suurempi kuin 100 (cid:181)g/ml, koska kaikki valomyrkylliset kemi- kaalit on osoitettu alemmissa pitoisuuksissa, kun taas korkeammilla pitoisuuksilla v(cid:228)(cid:228)rien positiivisten tulosten m(cid:228)(cid:228)r(cid:228) nousee (13). Testikemikaalin pH:n pit(cid:228)isi olla sopiva suurimmassa pitoisuudessa (v(cid:228)lill(cid:228) 6,5(cid:151)7,8). L 136/102 FI Euroopan yhteis(cid:246)jen virallinen lehti 8. 6. 2000 UVA-valon kanssa (+ UVA) ja ilman sit(cid:228) (ﬂ UVA) testattavan kemikaalin pitoisuusalue on m(cid:228)(cid:228)ritett(cid:228)v(cid:228) riitt(cid:228)- v(cid:228)n laajasti edelt(cid:228)viss(cid:228) pitoisuusalueenm(cid:228)(cid:228)rittelykokeissa. Pitoisuussarjan vaihtelualue ja yksitt(cid:228)iset pitoisuudet on asetettava siten, ett(cid:228) koetuloksia on riitt(cid:228)v(cid:228)sti pitoisuus-vastekuvaajan laatimiseksi. Pitoisuussarjan olisi oltava geometrinen (vakio laimennuskerroin). 1. 7. 3 Testimenetelm(cid:228) (1) 1. 7. 3. 1 E n s i m m (cid:228) i n e n p (cid:228) i v (cid:228) Valmistetaan viljelynesteeseen solususpensio, jossa on 1 (cid:215) 105 solua/ml, ja 100 (cid:181)l viljelynestett(cid:228) pipetoidaan 96-mikrotitterikuoppalevyn laitimmaisiin kuoppiin (= nollakokeet). Muihin kuoppiin pipetoidaan 100 (cid:181)l solu- suspensiota, jossa on 1 (cid:215) 105 solua/ml (= 1 (cid:215) 104 solua/kuoppa). Kutakin testikemikaalia varten valmistetaan kaksi kuoppalevy(cid:228): yksi sytotoksisuuden m(cid:228)(cid:228)rityst(cid:228) varten (ﬂ UVA) ja toinen fotosytotoksisuuden m(cid:228)(cid:228)rityst(cid:228) varten (+ UVA). Soluja inkuboidaan 24 h (7,5 % CO2, 37 (cid:176)C), kunnes ne muodostavat puoliksi konfluentin yhden solun vahvui- sen kerroksen. T(cid:228)ss(cid:228) ajassa solut toipuvat ja tarttuvat levyn pohjaan sek(cid:228) aloittavat eksponentiaalisen kasvun. 1. 7. 3. 2 T o i n e n p (cid:228) i v (cid:228) Inkubaation j(cid:228)lkeen viljelyneste kaadetaan kuopista pois ja solut pest(cid:228)(cid:228)n kahdesti 150 (cid:181)l:lla EBSS/PBS:(cid:228)(cid:228) kuop- paa kohti. Lis(cid:228)t(cid:228)(cid:228)n 100 (cid:181)l EBSS/PBS:(cid:228)(cid:228), jossa on testikemikaalia tai ainoastaan liuotinta (negatiivinen kontrol- li). Kuoppiin lis(cid:228)t(cid:228)(cid:228)n 8 eri pitoisuutta testikemikaalia. Soluja inkuboidaan testikemikaalin kanssa pime(cid:228)ss(cid:228) 60 minuuttia (7,5 % CO2, 37 (cid:176)C). Testin (+UVA)-osaa varten soluja s(cid:228)teilytet(cid:228)(cid:228)n huoneenl(cid:228)mp(cid:246)tilassa 50 minuuttia 96-kuoppalevyn kannen l(cid:228)pi valolla, jonka voimakkuus on 1,7 mW/cm2 UVA (= 5 J/cm2). Vesih(cid:246)yryn tiivistyminen kuoppalevyn kannen alle estet(cid:228)(cid:228)n tuulettimella. Rinnakkaislevyt (ﬂ UVA) pidet(cid:228)(cid:228)n huoneenl(cid:228)mp(cid:246)tilassa pime(cid:228)ss(cid:228) laatikossa 50 min (= UVA-altistusaika). Testiliuos kaadetaan pois ja solut pest(cid:228)(cid:228)n kahdesti 150 (cid:181)l:lla EBSS/PBS:(cid:228)(cid:228). EBSS/PBS korvataan viljelynesteell(cid:228), ja soluja inkuboidaan (7,5 % CO2, 37 (cid:176)C) yli y(cid:246)n (18(cid:151)22 h). 1. 7. 3. 3 K o l m a s p (cid:228) i v (cid:228) Mikroskooppitutkimus Soluja tutkitaan faasikontrastimikroskoopissa. Kirjataan solujen muodonmuutokset, jotka johtuvat testikemi- kaalin myrkyllisist(cid:228) vaikutuksista. T(cid:228)t(cid:228) kontrollia suositellaan koevirheiden eliminoimiseksi, mutta n(cid:228)it(cid:228) muis- tiinpanoja ei k(cid:228)ytet(cid:228) sytotoksisuuden tai fotosytotoksisuuden arvioinnissa. Neutraalipunatesti Solut pest(cid:228)(cid:228)n 150 (cid:181)l:lla esil(cid:228)mmitetty(cid:228) EBSS/PBS:(cid:228)(cid:228). Pesuliuos kaadetaan pois ravistamalla levy(cid:228) varovasti. Kuoppiin lis(cid:228)t(cid:228)(cid:228)n 100 (cid:181)l NR-viljelynestett(cid:228) ja soluja inkuboidaan 3 tunnin ajan 37 (cid:176)C:ssa kostutetussa ilmake- h(cid:228)ss(cid:228), jossa on 7,5 % CO2. Inkubaation j(cid:228)lkeen NR-viljelyneste poistetaan ja solut pest(cid:228)(cid:228)n 150 (cid:181)l:lla EBSS/PBS:(cid:228)(cid:228). EBSS/PBS kaadetaan pois ja kuopat kuivataan t(cid:228)ysin imeytt(cid:228)en neste paperiin. (Vaihtoehtoisesti: alassuin k(cid:228)(cid:228)nnetty kuoppalevy sentrifugoidaan. ) Lis(cid:228)t(cid:228)(cid:228)n tarkasti 150 (cid:181)l NR-desorbointiliuosta (juuri valmistettu etanoli/etikkahappo). Mikrotitterilevy(cid:228) ravistetaan nopeasti ravistajassa 10 minuutin ajan, kunnes NR on uuttunut soluista ja muo- dostanut tasaisen liuoksen. NR-uutteen optinen tiheys luetaan aallonpituudella 540 nm spektrofotometriss(cid:228) k(cid:228)ytt(cid:228)en vertailuliuoksena nollan(cid:228)ytteit(cid:228). Mittaustulokset tallennetaan sopivassa muodossa (esim. ASCII) my(cid:246)hemp(cid:228)(cid:228) analysointia varten. (1) Lis(cid:228)tietoja annetaan viitteess(cid:228) 12. 8. 6. 2000 FI Euroopan yhteis(cid:246)jen virallinen lehti L 136/103 2 MITTAUSTULOKSET 2. 1 Mittautulosten laatu ja m(cid:228)(cid:228)r(cid:228) Mittaustulosten avulla pit(cid:228)isi voida analysoida j(cid:228)rkev(cid:228)sti UVA-valon tai n(cid:228)kyv(cid:228)n valon kanssa ja ilman sit(cid:228) saadut pitoisuusvasteet. Jos havaitaan sytotoksisuutta, sek(cid:228) pitoisuusalue ett(cid:228) yksitt(cid:228)iset pitoisuudet on valit- tava siten, ett(cid:228) koetuloksiin voidaan sovittaa kuvaaja. Koska on mahdollista, ett(cid:228) testikemikaali ei ole myrkylli- nen soluille edes m(cid:228)(cid:228)ritellyss(cid:228) pitoisuusrajassa 100 pg/ml pime(cid:228)kokeessa (ﬂ UVA), mutta on eritt(cid:228)in myrkylli- nen soluille s(cid:228)teilytett(cid:228)ess(cid:228) (+ UVA), voi olla tarpeen valita kokeen kummassakin osassa testattavat pitoisuus- alueet siten, ett(cid:228) ne eroavat toisistaan jopa useita kymmenen potensseja, jotta mittaustulosten riitt(cid:228)v(cid:228)(cid:228) laatua koskevat vaatimukset t(cid:228)yttyv(cid:228)t. Jos kokeen kummassakaan osassa (ﬂ UVA ja + UVA) ei havaita solumyrkylli- syytt(cid:228), riitt(cid:228)(cid:228) testaaminen korkeimpaan pitoisuuteen asti siten, ett(cid:228) yksitt(cid:228)isten annosten valill(cid:228) on pitk(cid:228) v(cid:228)li. Selv(cid:228)sti positiivista tulosta ei tarvitse tarkistaa toistamalla koetta. My(cid:246)sk(cid:228)(cid:228)n selv(cid:228)sti negatiivisia tuloksia ei tar- vitse tarkistaa, jos testikemikaali on testattu riitt(cid:228)v(cid:228)n korkeissa pitoisuuksissa. T(cid:228)llaisissa tapauksissa riitt(cid:228)(cid:228) yksi koe, jota tukee yksi tai useampia pitoisuusaluetta m(cid:228)(cid:228)ritt(cid:228)vi(cid:228) alustavia kokeita. Testit, joissa on saatu l(cid:228)hell(cid:228) ennustemallin erotusrajaa olevia tuloksia, olisi toistettava tulosten tarkistuksen vuoksi. Jos testin toistaminen katsotaan tarpeelliseksi, koeolosuhteiden muuttaminen voi olla t(cid:228)rke(cid:228)(cid:228) selv(cid:228)n tuloksen saamiseksi. Keskeinen muuttuja t(cid:228)ss(cid:228) testiss(cid:228) on testikemikaaliliuosten valmistaminen. Valmistusolosuhteiden (muut liuottimet, hienontaminen, ultra(cid:228)(cid:228)nihajoitus) muuntelu voi siksi olla tarkoituksenmukaisinta testi(cid:228) tois- tettaessa. Vaihtoehtoisesti voidaan harkita s(cid:228)teilytyst(cid:228) edelt(cid:228)v(cid:228)n esi-inkubaatioajan muuntelua. Vedess(cid:228) hajoa- ville kemikaaleille voi lyhyt aika olla tarkoituksenmukainen. 2. 2 Tulosten k(cid:228)sittely Aina kun on mahdollista, m(cid:228)(cid:228)ritet(cid:228)(cid:228)n testikemikaalin pitoisuus, joka vastaa 50 prosentin laskua solujen NRU- otossa (EC50). T(cid:228)m(cid:228) voidaan tehd(cid:228) soveltamalla pitoisuus-vastetuloksiin mit(cid:228) tahansa sopivaa ei-lineaarista reg- ressiomenetelm(cid:228)(cid:228) (mieluiten Hill-funktiota tai logistista regressiota) tai k(cid:228)ytt(cid:228)m(cid:228)ll(cid:228) muita sovitusmenetelmi(cid:228) (14). Ennen kuin EC50:t(cid:228) k(cid:228)ytet(cid:228)(cid:228)n laskuissa, sovituksen laatu olisi tarkastettava asianmukaisesti. Vaihtoehtoi- sesti voidaan k(cid:228)ytt(cid:228)(cid:228) graafisia sovitusmenetelmi(cid:228) EC50:n laskemiseksi. T(cid:228)ll(cid:246)in suositellaan todenn(cid:228)k(cid:246)isyys- paperin k(cid:228)ytt(cid:246)(cid:228) (x-akseli: log, y-akseli: probiitti), sill(cid:228) usein pitoisuusvastefunktio tulee melkein lineaariseksi t(cid:228)m(cid:228)n muunnoksen j(cid:228)lkeen. 2. 3 Tulosten arviointi (ennustemallit) 2. 3. 1 Ennustemalli versio 1: Valo(cid:228)rsytt(cid:228)vyystekij(cid:228) (PIF) Jos molemmissa tapauksissa (cid:151) sek(cid:228) UVA-valon kanssa (+ UVA) ett(cid:228) ilman sit(cid:228) (ﬂ UVA) (cid:151) saadaan t(cid:228)ydelliset pitoisuus-vastekuvaajat, voidaan valo(cid:228)rsytt(cid:228)vyystekij(cid:228) (PIF) laskea seuraavasta kaavasta: Jos PIF < 5, ennuste on (cid:146)ei valomyrkyllisyyspotentiaalia(cid:146), kun taas PIF ¯ 5 ennustaa valomyrkyllisyyspotentiaa- lin olemassaoloa. Jos kemikaali on solumyrkyllinen ainoastaan UVA-valon kanssa testattaessa mutta ei ilman sit(cid:228), PIF:i(cid:228) ei voida laskea, vaikka tulos viittaakin valomyrkyllisyyspotentiaaliin. T(cid:228)ll(cid:246)in voidaan laskea (cid:146)> PIF(cid:146), jos ilman UV-valoa teht(cid:228)v(cid:228) solumyrkyllisyystesti tehd(cid:228)(cid:228)n suurimmalla testipitoisuudella (Cmax) ja t(cid:228)t(cid:228) arvoa k(cid:228)ytet(cid:228)(cid:228)n (cid:146)> PIF(cid:146):n las- kemiseen: Jos saadaan ainoastaan arvo (cid:146)> PIF(cid:146), kaikki arvot > 1 ennustavat valomyrkyllisyyspotentiaalia. Jos ei voida laskea sen enemp(cid:228)(cid:228) arvoa EC50 (ﬂ UV) kuin arvoa EC50 (+ UV), koska kemikaali ei osoita solu- myrkyllisyytt(cid:228) korkeimmassakaan pitoisuudessa, tulos merkitsee, ettei kemikaalilla ole valomyrkyllisyyspotenti- aalia. T(cid:228)ll(cid:246)in k(cid:228)ytet(cid:228)(cid:228)n muodollista arvoa (cid:146)PIF = *1(cid:146) karakterisoimaan tulosta: L 136/104 FI Euroopan yhteis(cid:246)jen virallinen lehti 8. 6. 2000 Jos saadaan ainoastaan arvo (cid:146)PIF = *1(cid:146), ennuste on (cid:146)ei valomyrkyllist(cid:228) potentiaalia(cid:146). Tapauksissa b) ja c) on valomyrkyllisyyspotentiaalia arvioitaessa huolellisesti tarkasteltava niit(cid:228) pitoisuuksia, jotka saatiin in vitro 3T3 NRU-valomyrkyllisyystestiss(cid:228). 2. 3. 2 Ennustemalli versio 2: Keskim(cid:228)(cid:228)r(cid:228)inen valovaikutus (MPE) Vaihtoehtoisesti voidaan soveltaa uutta valomyrkyllisyyspotentiaalin ennustamiseen tarkoitettua mallia, joka on kehitetty k(cid:228)ytt(cid:228)en EU/COLIPA-validointitutkimuksen (15) tietoja ja testattu sokkokoeolosuhteissa my(cid:246)hem- m(cid:228)ss(cid:228) UV-suodinkemikaalien in vitro -valomyrkyllisyystutkimuksessa (13). T(cid:228)ss(cid:228) mallissa ei esiinny PIF-mallin rajoitusta silloin, kun EC50-arvoa ei voida saada. Mallissa k(cid:228)ytet(cid:228)(cid:228)n (cid:146)keskim(cid:228)(cid:228)r(cid:228)ist(cid:228) valovaikutusta(cid:146) (MPE). Se on suure, joka perustuu t(cid:228)ydellisten pitoisuus-vastekuvaajien vertaamiseen. MPE-mallin soveltamiseen kehitet- tiin Humboldt-yliopistossa (Berliini) erityinen tietokoneohjelma, jonka saa maksutta k(cid:228)ytt(cid:246)(cid:246)n. 2. 4 Tulosten tulkinta Positiivinen tulos in vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestiss(cid:228) (PIF ¯ 5 tai MPE ¯ 0,1 ) merkitsee, ett(cid:228) testikemi- kaalilla on valomyrkyllisyyspotentiaalia. Jos t(cid:228)m(cid:228) tulos saadaan pitoisuuksilla, jotka ovat pienemm(cid:228)t kuin 10 (cid:181)g/ml, testikemikaali on my(cid:246)s todenn(cid:228)k(cid:246)isesti valomyrkyllinen erilaisissa altistusolosuhteissa in vivo. Jos positiivinen tulos saadaan vain suurimmalla testipitoisuudella 100 (cid:181)g/ml, voi vaaran arviointia tai valomyrkyl- lisyyspotentiaalin arviointia varten olla tarpeen hankkia lis(cid:228)tietoja esimerkiksi kemikaalin kyvyst(cid:228) l(cid:228)p(cid:228)ist(cid:228) iho sek(cid:228) sen imeytymisest(cid:228) ja mahdollisesta kertymisest(cid:228) ihoon, tai kemikaali on testattava muulla testill(cid:228) vahvis- tusta varten, esim. ihmisihoa k(cid:228)ytt(cid:228)v(cid:228)ll(cid:228) in vitro -testill(cid:228). Negatiivinen tulos in vitro 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestiss(cid:228) (PIF < 5 tai MPE < 0,1 ) merkitsee, ett(cid:228) testiaine ei ollut valomyrkyllinen kyseisille nis(cid:228)k(cid:228)ssoluille k(cid:228)ytetyiss(cid:228) olosuhteissa. Jos kemikaali pystyttiin testaamaan suurimmassakin pitoisuudessa 100 (cid:181)g/ml, negatiivinen tulos merkitsee, ettei kemikaalilla ole valomyrkyllisyys- potentiaalia, ja valomyrkyllisyys in vivo voidaan katsoa ep(cid:228)todenn(cid:228)k(cid:246)iseksi. Tapauksissa, joissa samat pitoi- suus-myrkyllisyysvasteet (EC50+ UV ja EC50ﬂ UV) on saatu pienemmill(cid:228) pitoisuuksilla, tulokset tulkittaisiin samalla tavalla. Jos sit(cid:228) vastoin myrkyllisyytt(cid:228) ei voida osoittaa (+ UV ja ﬂ UV) ja jos aineen liukenemattomuus veteen rajoittaa pitoisuudet pienemmiksi kuin 100 (cid:181)g/ml, voidaan asettaa kyseenalaiseksi, sopiiko testiaine kyseiseen m(cid:228)(cid:228)ritykseen, ja on harkittava vahvistavaa m(cid:228)(cid:228)rityst(cid:228) (esim. k(cid:228)ytt(cid:228)m(cid:228)ll(cid:228) in vitro -ihomallia, ex vivo -ihomallia tai in vivo -testi(cid:228)). 3 RAPORTOINTI Testiraportti Testiraportissa on esitett(cid:228)v(cid:228) seuraavat tiedot: Testikemikaali: (cid:151) tunnistetiedot ja CAS-numero, jos se tiedet(cid:228)(cid:228)n, (cid:151) fysikaalinen olomuoto ja puhtaus, (cid:151) fysikokemialliset ominaisuudet, jotka vaikuttavat tutkimuksen tekemiseen, (cid:151) stabiilius ja valostabiilius, jos tunnetaan. Liuotin: (cid:151) perustelut liuottimen valinnalle, (cid:151) testikemikaalin liukoisuus t(cid:228)h(cid:228)n liuottimeen, (cid:151) liuottimen pitoisuus prosentteina k(cid:228)sittelynesteess(cid:228) (EBSS tai PBS). Solut: (cid:151) solujen tyyppi ja l(cid:228)hde, (cid:151) onko soluissa mykoplasmaa, (cid:151) solujen siirrostusj(cid:228)rjestysluku, jos se tiedet(cid:228)(cid:228)n, (cid:151) solujen herkkyys UVA:lle m(cid:228)(cid:228)ritettyn(cid:228) sill(cid:228) s(cid:228)teilytyslaitteella, jota k(cid:228)ytet(cid:228)(cid:228)n in vitro 3T3 NRU -valomyr- kyllisyystestiss(cid:228). Testiolosuhteet a) (cid:151) inkubointi ennen k(cid:228)sittely(cid:228) ja sen j(cid:228)lkeen: (cid:151) viljelynesteen tyyppi ja koostumus, (cid:151) inkubaatio-olosuhteet (CO2-pitoisuus, l(cid:228)mp(cid:246)tila, kosteus), (cid:151) inkubaatioaika (esik(cid:228)sittely, j(cid:228)lkik(cid:228)sittely). 8. 6. 2000 FI Euroopan yhteis(cid:246)jen virallinen lehti L 136/105 Testiolosuhteet b) (cid:151) k(cid:228)sittely kemikaalilla: (cid:151) perustelut testikemikaalin pitoisuuksien valintaan k(cid:228)ytett(cid:228)v(cid:228)ksi sek(cid:228) UV-valon/n(cid:228)kyv(cid:228)n valon kanssa ett(cid:228) ilman sit(cid:228), (cid:151) jos testikemikaali on huonoliukoinen eik(cid:228) osoita solumyrkyllisyytt(cid:228), perustelut suurimmalle testatulle pitoisuudelle, (cid:151) k(cid:228)sittelynesteen tyyppi ja koostumus (puskuroitu suolaliuos), (cid:151) kemikaalik(cid:228)sittelyn kesto. Testiolosuhteet c) (cid:151) s(cid:228)teilytys: (cid:151) perustelut k(cid:228)ytetyn valol(cid:228)hteen valinnalle, (cid:151) valol(cid:228)hteen s(cid:228)teilyspektrin ominaisuudet, (cid:151) k(cid:228)ytetyn suotimen (k(cid:228)ytettyjen suotimien) transmissio- ja absorptio-ominaisuudet, (cid:151) s(cid:228)teilymittarin ominaisuudet ja sen kalibrointi yksityiskohtaisesti, (cid:151) valol(cid:228)hteen et(cid:228)isyys testij(cid:228)rjestelm(cid:228)st(cid:228), (cid:151) UVA-s(cid:228)teilyn voimakkuus kyseisell(cid:228) et(cid:228)isyydell(cid:228), mW/cm2, (cid:151) UV-altistuksen tai n(cid:228)kyv(cid:228)lle valolle altistuksen kesto, (cid:151) UVA-annos (s(cid:228)teilyvoimakkuus (cid:215) aika), ilmaistuna laatuna J/cm2, (cid:151) soluviljelmien l(cid:228)mp(cid:246)tila s(cid:228)teilytyksen aikana ja samanaikaisesti pime(cid:228)ss(cid:228) pidettyjen soluviljelmien l(cid:228)mp(cid:246)- tila. Testiolosuhteet d) (cid:151) NRU testi: (cid:151) NR-nesteen koostumus, (cid:151) NR-inkubaation kesto, (cid:151) inkubaatio-olosuhteet (CO2-pitoisuus, l(cid:228)mp(cid:246)tila, kosteus), (cid:151) NR-uutto-olosuhteet (uuttoaine, kesto), (cid:151) aallonpituus, jolla NR:n optinen tiheys luettiin spektrofotometrill(cid:228), (cid:151) toinen (vertailu-) aallonpituus, jos sellaista k(cid:228)ytettiin, (cid:151) spektrofotometrin mahdollisen nollaliuoksen sis(cid:228)lt(cid:246). Tulokset: (cid:151) solujen elinkykyisyys, joka on saatu kullekin testikemikaalin pitoisuudelle, ilmaistuna prosentteina kontrollien keskim(cid:228)(cid:228)r(cid:228)isest(cid:228) elinkykyisyydest(cid:228), (cid:151) pitoisuus-vastekuvaajat (testikemikaalin pitoisuus vs. suhteellinen solujen elinkykyisyys), joka on saatu samanaikaisesti tehdyiss(cid:228) (+ UVA)- ja (ﬂ UVA)-kokeissa, (cid:151) pitoisuus-vastekuvaajien tietojen analyysi; jos mahdollista, lasketaan EC50 (+ UVA) ja EC50 (ﬂ UVA) (cid:151) niiden kahden pitoisuus-vastekuvaajan vertailu, jotka on saatu UVA-valon tai n(cid:228)kyv(cid:228)n valon kanssa ja ilman sit(cid:228), joko laskemalla valo(cid:228)rsytt(cid:228)vyystekij(cid:228) (PIF) tai laskemalla keskim(cid:228)(cid:228)r(cid:228)inen valovaikutus (MPE), (cid:151) valomyrkyllisyyspotentiaalin luokitus, (cid:151) testin hyv(cid:228)ksytt(cid:228)vyyskriteerit a) (cid:151) samanaikainen negatiivinen kontrolli: (cid:151) s(cid:228)teilytettyjen ja s(cid:228)teilytt(cid:228)m(cid:228)tt(cid:246)mien solujen absoluuttinen el(cid:228)vyys (NR-uutteen optinen tiheys), (cid:151) negatiivista kontrollia koskevat aiemmat tiedot, keskiarvo ja vakiopoikkeama, testin hyv(cid:228)ksytt(cid:228)vyyskriteerit b) (cid:151) samanaikainen positiivinen kontrolli: (cid:151) positiivisen kontrollikemikaalin EC50(+ UVA) ja EC50(ﬂ UVA) ja PIF, (cid:151) positiivista kontrollikemikaalia koskevat aiemmat tiedot: EC50(+ UVA) ja EC50(ﬂ UVA) ja PIF, keskiarvo ja vakiopoikkeama. Tulosten tarkastelu. P(cid:228)(cid:228)telm(cid:228)t. L 136/106 FI Euroopan yhteis(cid:246)jen virallinen lehti 8. 6. 2000 4 KIRJALLISUUSVIITTEET (1) Spielmann, H. , Balls, M. , D(cid:246)ring, B. , Holzh(cid:252)tter, H. G. , Kalweit, S. , Klecak, G. , L’Eplattenier, H. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Moldenhauer, F. , Moore, L. , Pape, W. , Pfannbecker, U. , Potthast, J. , De Sil- va, O. , Steiling, W. and Willshaw, A. ( 1994), EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay, Toxicology in Vitro 8, s. 793-796. (2) Anon (1998), Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxi- city), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA 26, s. 7-8. (3) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. W. , Pechovitch, G. , De Silva, O. , Holzh(cid:252)tter, H. G. , Clot- hier, R. , Desolle, P. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Pfannenbecker, U. , Potthast, J. M. , Csato, M. , Sladowski, D. , Steiling, W. and Brantom, P. (1998), EU/COLIPA (cid:146)In vitro phototoxicity(cid:146) validation study, results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test, Toxicology in Vitro 12, s. 305-327. (4) OECD Test Guidelines Programme, ENV/MC/CHEM/TG(96)9: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria of Alternative Toxicological Test Methods, OECD Publications Office, Paris, 1996. (5) Lovell, W. W. (1993), A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential, Toxico- logy in Vitro 7, s. 95-102. (6) Santamaria, L. and Prino, G. (1972), List of the photodynamic substances, Research progress in organic, biological and medicinal chemistry Vol. 3 Part 1, North Holland Publishing Co, Amsterdam, s. XI-XXXV. (7) Spielmann, H. , Lovell, W. W. , H(cid:246)lzle, E. , Johnson, B. E. , Maurer, T. , Miranda, M. A. , Pape, W. J. W. , Sapora, O. and Sladowski, D. (1994), In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM workshop 2, ATLA 22, s. 314-348. (8) Spikes, J. D. (1989), Photosensitization, The science of photobiology, edited by KC Smith, Plenum Press, New York, 2nd edition, s. 79-110. (9) Borenfreund, E. and Puerner, J. A. (1985), Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption, Toxicology Letters 24, s. 119-124. (10) Lambert L. A, Warner W. G. and Kornhauser A. (1996), Animal models for phototoxicity testing, Derma- totoxicology, edited by FN Marzulli and HI Maibach, published by Taylor & Francis, Washington DC, 5th Edition, s. 515-530. (11) Tyrrell R. M. and Pidoux M (1987), Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytoto- xicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocy- tes, Cancer Research 47, s. 1825-1829. (12) ZEBET/ECVAM/COLIPA, Standard Operating Procedure: Balb/c 3T3 NRU Phototoxicity Test, drafted 23 December 1997 by M. Liebsch and approved 6 March 1998 by the Management Team of the EU/ COLIPA project (cid:146)In Vitro Photoirritation(cid:146). (13) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. W. , De Silva, O. , Holzh(cid:252)tter, H. G. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. and Pfannenbecker (1998), A Study on the Phototoxic Potential of UV Filter Chemicals from Annex VII of the EU Directive 76/768/EEC in the 3T3 NRU In Vitro Phototoxicity Test, ATLA 26, s. 679-708. (14) Holzh(cid:252)tter, H. G. and Quedenau, J. (1995), Mathematical modelling of cellular responses to external sig- nals, Journal of Biological Systems 3, s. 127-138. (15) Holzh(cid:252)tter, H. G. (1997), A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals, ATLA 25, s. 445-462. 8. 6. 2000 FI Euroopan yhteis(cid:246)jen virallinen lehti L 136/107 Lis(cid:228)ys


title: Rozhodnutie Komisie z 25. apríla 2000, ktorým sa mení a dopĺňa rozhodnutie 1999/813/ES ustanovujúce osobitné podmienky dovozu produktov rybolovu s pôvodom vo Vietnamskej socialistickej republike (oznámené pod číslom dokumentu C(2000) 1050)Text s významom pre EHP

eurovoc_concepts:
Vietnam
fishery product
health certificate
import
originating product
veterinary inspection

formats: html pdf print

text: 03/zv. 29 SK Úradný vestník Európskej únie 95 32000D0331 13. 5. 2000 ÚRADNÝ VESTNÍK EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV L 114/39 ROZHODNUTIE KOMISIE z 25. apríla 2000, ktorým sa mení a dopĺňa rozhodnutie 1999/813/ES ustanovujúce osobitné podmienky dovozu produktov rybolovu s pôvodom vo Vietnamskej socialistickej republike (oznámené pod číslom dokumentu C(2000) 1050) (Text s významom pre EHP) (2000/331/ES) KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV, PRIJALA TOTO ROZHODNUTIE: so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spoločenstva, Článok 1 so zreteľom na smernicu Rady 91/493/EHS z 22. júla 1991 ustanovujúcu veterinárne podmienky produkcie a uvádzania produktov rybolovu na trh (1), naposledy zmenenú a doplnenú smernicou 97/79/ES (2), najmä na jej článok 11 ods. 1, sprevádzajúce Zdravotné osvedčenie ustanovené v prílohe A k rozhodnutiu rybolovu 1999/813/ES s pôvodom vo Vietnamskej socialistickej republike alebo dová- žané z Vietnamskej socialistickej republiky sa mení a dopĺňa takto: zásielky produktov 1. Časť IV sa dopĺňa o tento bod: keďže: (1) (2) (3) (4) (5) Rozhodnutím Komisie 1999/813/ES zo 16. novembra 1999 sa ustanovujú osobitné podmienky dovozu produktov rybolovu s pôvodom vo Vietnamskej socia- listickej republike (3). Komisia prijala rozhodnutie 2000/333/ES, ktorým sa ustanovujú osobitné podmienky dovozu dvojchlopňo- vých lastúrnikov, ostnokožcov, plášťovcov a morských socialistickej ulitníkov republike (4). s pôvodom vo Vietnamskej vyjadrila republika socialistická Vietnamská želanie vyvážať do spoločenstva mrazené alebo spracované dvoj- chlopňové lastúrniky, ostnokožce, plášťovce a morské ulitníky, ktoré boli sterilizované alebo tepelne ošetrené v súlade Komisie 93/25/EHS (5), v znení rozhodnutia 97/275/ES (6). s požiadavkami rozhodnutia „7. okrem toho, ak sú produkty rybolovu zmrazené alebo spracované dvojchlopňové lastúrniky: lastúrniky boli získané zo schválených produkčných oblastí ustanove- ných prílohou k rozhodnutiu Komisie 2000/333/ES (*), ktorým sa ustanovujú osobitné podmienky dovozu dvoj- chlopňových plášťovcov a morských ulitníkov s pôvodom vo Vietnamskej socia- listickej republike, ktoré boli sterilizované alebo tepelne rozhodnutia Komisie ošetrené 93/25/ES. ostnokožcov, požiadaviek lastúrnikov, podľa (*) Ú. v. ES L 114, 13. 5. 2000, s. 42. “ 2. Posledná zarážka časti IV sa nahrádza týmto textom: „— podpísaný úradný inšpektor týmto vyhlasuje, že je oboznámený s ustanoveniami smernice 91/492/EHS, smernice 91/493/EHS, smernice 92/48/EHS, rozhod- nutia 93/25/ES, rozhodnutia 1999/813/ES a rozhod- nutia 2000/333/ES. “ Toto rozhodnutie je adresované členským štátom. Článok 2 Preto je potrebné zmeniť a doplniť zdravotné osvedčenie ustanovené v prílohe A k rozhodnutiu 1999/813/ES. V Bruseli 25. apríla 2000 Opatrenia stanovené v tomto rozhodnutí sú v súlade so stanoviskom Stáleho veterinárneho výboru, Za Komisiu David BYRNE člen Komisie (1) Ú. v. ES L 268, 24. 9. 1991, s. 15. (2) Ú. v. ES L 24, 30. 1. 1998, s. 31. (3) Ú. v. ES L 315, 9. 12. 1999, s. 39. (4) Ú. v. ES L 114, 13. 5. 2000, s. 42. (5) Ú. v. ES L 16, 25. 1. 1993, s. 22. (6) Ú. v. ES L 108, 25. 4. 1997, s. 2


title: 2000/333/CE: Decisione della Commissione, del 25 aprile 2000, che stabilisce le condizioni particolari d'importazione di molluschi bivalvi, echinodermi, tunicati e gasteropodi marini originari della Repubblica socialista del Vietnam [notificata con il numero C(2000) 1054] (Testo rilevante ai fini del SEE)

eurovoc_concepts:
Vietnam
health control
import
mollusc
originating product

text: L 114/42 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee 13. 5. 2000 DECISIONE DELLA COMMISSIONE del 25 aprile 2000 che stabilisce le condizioni particolari d'importazione di molluschi bivalvi, echinodermi, tunicati e gasteropodi marini originari della Repubblica socialista del Vietnam [notificata con il numero C(2000) 1054] (Testo rilevante ai fini del SEE) (2000/333/CE) LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE, visto il trattato che istituisce la Comunità europea, vista la direttiva 91/492/CEE del Consiglio, del 15 luglio 1991, che stabilisce le norme sanitarie applicabili alla produzione e alla commercializzazione dei molluschi bivalvi (1), modificata da ultimo dalla direttiva 97/79/CE (2), in particolare l'articolo 9, paragrafo 3, lettera b), considerando quanto segue: (1) (2) (3) (4) (5) Un esperto della Commissione ha effettuato un'ispezione nella Repubblica socialista del Vietnam per verificare le condizioni di produzione, di magazzinaggio e di spedi- zione dei prodotti della pesca destinati alla Comunità. Le disposizioni della legislazione della Repubblica socia- lista del Vietnam attribuiscono al «National Fisheries Inspection and Quality Assurance Center (NAFIQACEN)» il compito di effettuare l'ispezione sanitaria dei mollu- schi bivalvi, degli echinodermi, dei tunicati e dei gastero- podi marini, nonché di sorvegliare le condizioni di igiene e di salubrità della loro produzione. Le suddette disposizioni conferiscono al NAFIQACEN il potere di autorizzare o vietare la raccolta di molluschi bivalvi, echinodermi, tunicati e gasteropodi marini in determi- nate zone. Nella Repubblica socialista del Vietnam il NAFIQACEN e i suoi laboratori sono in grado di vigilare sull'effettiva applicazione della legislazione in vigore. Le competenti autorità della Repubblica socialista del Vietnam si sono impegnate a comunicare regolarmente e celermente alla Commissione informazioni sull'eventuale presenza di plancton contenente tossine nelle zone di raccolta. Le competenti autorità della Repubblica socialista del Vietnam hanno fornito garanzie ufficiali riguardo all'os- servanza delle disposizioni del capitolo V dell'allegato della direttiva 91/492/CE, nonché al rispetto di condi- zioni equivalenti a quelle prescritte dalla suddetta diret- tiva per la classificazione delle zone di produzione e di (1) GU L 268 del 24. 9. 1991, pag. 1. (2) GU L 24 del 30. 1. 1998, pag. 31. (6) (7) (8) stabulazione, il riconoscimento dei centri di spedizione e di depurazione, i controlli sanitari e la sorveglianza della produzione. La Repubblica socialista del Vietnam può figurare nell'e- lenco dei paesi terzi che soddisfano le condizioni di equivalenza di cui all'articolo 9, paragrafo 3, lettera a), della direttiva 91/492/CEE. La Repubblica socialista del Vietnam desidera esportare nella Comunità molluschi bivalvi, echinodermi, tunicati e gasteropodi marini congelati o trasformati, che sono stati sterilizzati o sottoposti a trattamento termico secondo le disposizioni della decisione 93/25/CEE della 97/ Commissione (3), modificata 275/CE (4). A tal fine è necessario designare le zone di produzione nelle quali i molluschi bivalvi, gli echino- dermi, i tunicati e i gasteropodi marini possono essere raccolti e dalle quali possono essere esportati nella Comunità. decisione dalla Le condizioni particolari d'importazione si applicano salve restando le decisioni adottate in applicazione della direttiva 91/67/CEE del Consiglio, del 28 gennaio 1991, che stabilisce le norme di polizia sanitaria per la commercializzazione di animali e prodotti d'acquacol- tura (5), modificata da ultimo dalla direttiva 95/22/CE (6). (9) Le misure previste dalla presente decisione sono conformi al parere del comitato veterinario permanente, HA ADOTTATO LA PRESENTE DECISIONE: Articolo 1 Il «National Fisheries Inspection and Quality Assurance Center (NAFIQACEN) of the Ministry of Fisheries» è l'autorità compe- tente nella Repubblica socialista del Vietnam per la verifica e la certificazione della conformità dei molluschi bivalvi, degli echi- nodermi, dei tunicati e dei gasteropodi marini con le disposi- zioni della direttiva 91/492/CEE. (3) GU L 16 del 25. 1. 1993, pag. 22. (4) GU L 108 del 25. 4. 1997, pag. 52. (5) GU L 46 del 19. 2. 1991, pag. 1. (6) GU L 243 dell'11. 10. 1995, pag. 1. 13. 5. 2000 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee L 114/43 I molluschi bivalvi, gli echinodermi, i tunicati e i gasteropodi marini originari della Repubblica socialista del Vietnam e destinati al consumo umano devono provenire dalle zone di produzione autorizzate elencate nell'allegato della presente decisione. Articolo 2 Gli Stati membri sono destinatari della presente decisione. Articolo 3 Fatto a Bruxelles, il 25 aprile 2000. Per la Commissione David BYRNE Membro della Commissione ALLEGATO Numero di riconoscimento Nome 01 02 03 04 05 TAN THANH BINH DAI BA MUM AN THUY CON TRAU


title: Verordening (EG) nr. 829/2000 van de Commissie van 25 april 2000 tot wijziging van de invoerrechten in de sector granen

eurovoc_concepts:
CCT duties
cereals
import

formats: pdf print

text: L 101/26 NL Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen 26. 4. 2000 VERORDENING (EG) Nr. 829/2000 VAN DE COMMISSIE van 25 april 2000 tot wĳziging van de invoerrechten in de sector granen DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN, (2) Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeen- schap, Gelet op Verordening (EEG) nr. 1766/92 van de Raad van 30 juni 1992 houdende een gemeenschappelĳke ordening der markten in de sector granen (1), laatstelĳk gewĳzigd bĳ Veror- dening (EG) nr. 1253/1999 (2), Gelet op Verordening (EG) nr. 1249/96 van de Commissie van 28 juni 1996 tot vaststelling van uitvoeringsbepalingen van Verordening (EEG) nr. 1766/92 van de Raad ten aanzien van de invoerrechten in de sector granen (3), laatstelĳk gewĳzigd bĳ Verordening (EG) nr. 2519/98 (4), en met name op artikel 2, lid 1, Overwegende hetgeen volgt: (1) De invoerrechten in de sector granen zĳn vastgesteld bĳ Verordening (EG) nr. 792/2000 van de Commissie (5). In artikel 2, lid 1, van Verordening (EG) nr. 1249/96 is bepaald dat, indien in de loop van een toepassingspe- riode het berekende gemiddelde van de invoerrechten 5 EUR per ton verschilt van het vastgestelde recht, een overeenkomstige aanpassing wordt uitgevoerd. Dit verschil heeft zich voorgedaan. In Verordening (EG) nr. 792/2000 vastgestelde invoerrechten moeten derhalve worden aangepast, HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING VASTGESTELD: Artikel 1 De bĳlagen I en II bĳ Verordening (EG) nr. 792/2000 worden vervangen door de bĳlagen I en II bĳ deze verordening. Deze verordening treedt in werking op 26 april 2000. Artikel 2 Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks toepasselĳk in elke lidstaat. Gedaan te Brussel, 25 april 2000. Voor de Commissie Franz FISCHLER Lid van de Commissie (1) PB L 181 van 1. 7. 1992, blz. 21. (2) PB L 160 van 26. 6. 1999, blz. 18. (3) PB L 161 van 29. 6. 1996, blz. 125. (4) PB L 315 van 25. 11. 1998, blz. 7. (5) PB L 95 van 15. 4. 2000, blz. 31. 26. 4. 2000 NL Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen L 101/27 BĲLAGE I „BĲLAGE I Invoerrechten voor de in artikel 10, lid 2, van Verordening (EEG) nr. 1766/92 genoemde producten GN-code Omschrĳving 1001 10 00 Harde tarwe: — van hoge kwaliteit Harde tarwe: — van gemiddelde kwaliteit (1) 1001 90 91 Zachte tarwe, zaaigoed 1001 90 99 Zachte tarwe van hoge kwaliteit, bestemd voor zaaidoel- einden (3) van gemiddelde kwaliteit van lage kwaliteit 1002 00 00 Rogge 1003 00 10 Gerst, zaaigoed 1003 00 90 Gerst, niet bestemd voor zaaidoeleinden (3) 1005 10 90 Maïs, zaaigoed, andere dan hybriden 1005 90 00 Maïs, andere dan zaaigoed (3) 1007 00 90 Graansorgho, andere dan hybriden bestemd voor zaaidoel- einden Invoerrecht bĳ invoer over land, langs de binnenwateren of over zee vanuit havens aan de Middellandse Zee, de Zwarte Zee of de Oostzee (in EUR/t) Invoerrecht bĳ invoer door de lucht of over zee vanuit andere havens (2) (in EUR/t) 13,47 23,47 23,01 23,01 72,62 84,47 71,91 71,91 71,91 86,98 86,98 71,91 3,47 13,47 13,01 13,01 62,62 74,47 61,91 61,91 61,91 76,98 76,98 61,91 (1) Voor harde (durum)tarwe van gemiddelde kwaliteit die niet voldoet aan de in bĳlage I van Verordening (EG) nr. 1249/96 bedoelde minimumkwaliteit geldt het invoerrecht dat is vastgesteld voor zachte tarwe van lage kwaliteit. (2) Voor producten die via de Atlantische Oceaan of het Suezkanaal in de Gemeenschap worden aangevoerd (artikel 2, lid 4, van Verordening (EG) nr. 1249/96) komt de importeur in aanmerking voor een verlaging van het invoerrecht met: — 3 EUR/t, als de loshaven aan de Middellandse Zee ligt, of — 2 EUR/t, als de loshaven in Ierland, het Verenigd Koninkrĳk, Denemarken, Zweden, Finland of aan de Atlantische kust van het Iberisch Schiereiland ligt. (3) De importeur komt in aanmerking voor een forfaitaire verlaging van het invoerrecht met 14 of 8 EUR/t, als aan de in artikel 2, lid 5, van Verordening (EG) nr. 1249/96 vastgestelde voorwaarden is voldaan. ” L 101/28 NL Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen 26. 4. 2000 BĲLAGE II Berekeningselementen (periode van 14 april 2000 tot en met 24 april 2000) 1. Gemiddelden over de twee weken vóór de dag van de vaststelling: Beursnoteringen Minneapolis Kansas-City Chicago Chicago Minneapolis Minneapolis Minneapolis Product (eiwitgehalte bĳ 12 % vocht) HRS2. 14 % HRW2. 11,5 % SRW2 YC3 HAD2 US barley 2 van ge- middelde kwaliteit (*) Notering (EUR/t) 123,84 107,79 98,29 94,25 163,90 (**) 153,90 (**) 105,47 (**) Golf-premie (EUR/t) — 6,13 3,71 5,30 Grote-Merenpremie (EUR/t) 30,54 — — — (*) Een korting („discount”) van 10 EUR/t (artikel 4, (**) Fob Grote Meren. lid 1, van Verordening (EG) nr. 1249/96). — — — — — — 2. Vrachttarieven/kosten: Golf van Mexico — Rotterdam: 17,51 EUR/t; Grote Meren — Rotterdam: 26,66 EUR/t. 3. Subsidies bedoeld in artikel 4, lid 2, derde alinea, van Verordening (EG) nr. 1249/96: 0,00 EUR/t (HRW2) 0,00 EUR/t (SRW2)


title: 2000/333/EC: Commission Decision of 25 April 2000 laying down special conditions for the import of bivalve molluscs, echinoderms, tunicates and marine gastropods originating in the Socialist Republic of Vietnam (notified under document number C(2000) 1054) (Text with EEA relevance)

text: L 114/42 EN Official Journal of the European Communities 13. 5. 2000 COMMISSION DECISION of 25 April 2000 laying down special conditions for the import of bivalve molluscs, echinoderms, tunicates and marine gastropods originating in the Socialist Republic of Vietnam (notified under document number C(2000) 1054) (Text with EEA relevance) (2000/333/EC) THE COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES, Having regard to the Treaty establishing the European Community, Having regard to Council Directive 91/492/EEC of 15 July 1991 laying down the health conditions for the production and the placing on the market of bivalve molluscs (1), as last amended by Directive 97/79/EC (2), and in particular Article 9(3)(b) thereof, Whereas: (1) (2) (3) (4) (5) A Commission expert has conducted an inspection visit to the Socialist Republic of Vietnam to verify the condi- tions under which fishery products are produced, stored and dispatched to the Community. The provisions of legislation of the Socialist Republic of Vietnam make the National Fisheries Inspection and Quality Assurance Centre (Nafiqacen) responsible for inspecting the health of bivalve molluscs, echinoderms, tunicates and marine gastropods and for monitoring the hygiene and sanitary conditions of production. The same legislation empowers Nafiqacen to authorise or prohibit the harvesting of bivalve molluscs, echinoderms, tuni- cates and marine gastropods from certain zones. Nafiqacen and its laboratories are capable of effectively verifying the application of the laws in force in the Socialist Republic of Vietnam. The competent authorities of the Socialist Republic of Vietnam have undertaken to communicate regularly and quickly to the Commission data on the presence of plankton containing toxins in the harvesting zones. The competent authorities of the Socialist Republic of Vietnam have provided official assurances regarding compliance with the requirements specified in Chapter V of the Annex to Directive 91/492/EEC and with require- ments equivalent to those prescribed in that Directive for the classification of production and relaying zones, (1) OJ L 268, 24. 9. 1991, p. 1. (2) OJ L 24, 30. 1. 1998, p. 31. approval of dispatch and purification centres and public health control and production monitoring. The Socialist Republic of Vietnam is eligible for inclu- sion in the list of third countries fulfilling the conditions of equivalence referred to in Article 9(3)(a) of Directive 91/492/EEC. The Socialist Republic of Vietnam wishes to export to the Community frozen or processed bivalve molluscs, echinoderms, tunicates and marine gastropods which have been sterilised or heat-treated in accordance with the requirements of Commission Decision 93/25/EEC (3), as amended by Decision 97/275/EC (4). For this purpose, the production areas from which bivalve molluscs, echi- noderms, tunicates and marine gastropods may be harvested and exported to the Community should be designated. to decisions import conditions should apply without The special prejudice to Council taken pursuant Directive 91/67/EEC of 28 January 1991 concerning the animal health conditions governing the placing on the market of aquaculture animals and products (5), as last amended by Directive 95/22/EC (6). The measures provided for in this Decision are in accordance with the opinion of the Standing Veterinary Committee, (6) (7) (8) (9) HAS ADOPTED THIS DECISION: Article 1 The National Fisheries Inspection and Quality Assurance Centre (Nafiqacen) of the Ministry of Fisheries shall be the competent authority in the Socialist Republic of Vietnam for verifying and certifying that bivalve molluscs, echinoderms, tunicates and requirements of Directive the marine 91/492/EEC. gastropods fulfil (3) OJ L 16, 25. 1. 1993, p. 22. (4) OJ L 108, 25. 4. 1997, p. 52. (5) OJ L 46, 19. 2. 1991, p. 1. (6) OJ L 243, 11. 10. 1995, p. 1. 13. 5. 2000 EN Official Journal of the European Communities L 114/43 Bivalve molluscs, echinoderms, tunicates and marine gastropods originating in the Socialist Republic of Vietnam and intended for human consumption must originate in the authorised production areas listed in the Annex hereto. Article 2 This Decision is addressed to the Member States. Article 3 Done at Brussels, 25 April 2000. For the Commission David BYRNE Member of the Commission ANNEX Number Name 01 02 03 04 05 TAN THANH BINH DAI BA MUM AN THUY CON TRAU