title: Richtlijn 2000/33/EG van de Commissie van 25 april 2000 tot zevenentwintigste aanpassing aan de vooruitgang van de techniek van Richtlijn 67/548/EEG van de Raad betreffende de aanpassing van de wettelijke en bestuursrechtelijke bepalingen inzake de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlijke stoffen (Voor de EER relevante tekst.)

text: L 136/90 NL Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen 8. 6. 2000 RICHTLIJN 2000/33/EG VAN DE COMMISSIE van 25 april 2000 tot zevenentwintigste aanpassing aan de vooruitgang van de techniek van Richtlyn 67/548/EEG van de Raad betreffende de aanpassing van de wettelyke en bestuursrechtelyke bepalingen inzake de indeling, de verpakking en het kenmerken van gevaarlyke stoffen (*) (Voor de EER relevante tekst) DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN, HEEFT DE VOLGENDE RICHTLYN VASTGESTELD: Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeen- schap, Artikel 1 Gelet op Richtlyn 67/548/EEG van de Raad van 27 juni 1967 betreffende de aanpassing van de wettelyke en bestuursrechte- lyke bepalingen inzake de indeling, de verpakking en het ken- merken van gevaarlyke stoffen (1), laatstelyk gewyzigd by Richt- lyn 1999/33/EG van het Europees Parlement en de Raad (2), inzonderheid op artikel 28, Overwegende hetgeen volgt: (1) Bylage V by Richtlyn 67/548/EEG bevat de methoden voor de bepaling van de fysisch-chemische eigenschappen, de toxiciteit en de ecotoxiciteit van stoffen en preparaten. Die bylage dient aan de vooruitgang van de techniek te worden aangepast. (2) Artikel 7, lid 2, van Richtlyn 86/609/EEG van de Raad van 24 november 1986 inzake de onderlinge aanpassing van de wettelyke en bestuursrechtelyke bepalingen van de lidstaten betreffende de bescherming van dieren die voor experimentele en andere wetenschappelyke doeleinden worden gebruikt (3), luidt als volgt: (cid:132)Er mag geen proef worden verricht indien er een redelyke, praktische moge- lykheid bestaat het gewenste resultaat te verkrygen met behulp van een andere wetenschappelyk verantwoorde methode waarby geen proefdier wordt gebruikt. (cid:148). (3) De Commissie is voornemens alternatieve beproevings- methoden waarby geen dieren hoeven te worden gebruikt, in bylage V van Richtlyn 67/548/EEG op te nemen ten- einde deze beschikbaar te maken voor het onderzoek van chemische stoffen als bedoeld in artikel 3, lid 1, van Richtlyn 67/548/EEG. (4) De bepalingen van deze richtlyn zyn in overeenstemming met het advies van het ComitØ voor de aanpassing aan de vooruitgang van de techniek van de richtlynen met betrekking tot de opheffing van technische handelsbelem- meringen voor gevaarlyke stoffen en preparaten, De tekst van de bylagen I en II van deze richtlyn wordt aan bylage V, deel B, van Richtlyn 67/548/EEG toegevoegd. Artikel 2 1. De lidstaten doen de nodige wettelyke en bestuursrechte- lyke bepalingen in werking treden om uiterlyk op 1 oktober 2001 aan deze richtlyn te voldoen. Zy stellen de Commissie daarvan onverwyld in kennis. Wanneer de lidstaten deze bepalingen aannemen, wordt in die bepalingen naar deze richtlyn verwezen of wordt hiernaar ver- wezen by de officiºle bekendmaking van de bepalingen. De regels voor deze verwyzing worden vastgesteld door de lidsta- ten. De lidstaten doen de Commissie de tekst geworden van 2. de belangrykste bepalingen van intern recht die zy op het onder deze richtlyn vallende gebied vaststellen, alsmede een concordantietabel met betrekking tot deze richtlyn en de vast- gestelde nationale maatregelen. Artikel 3 Deze richtlyn treedt in werking op de derde dag volgende op die van haar bekendmaking in het Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen. Artikel 4 Deze richtlyn is gericht tot de lidstaten. Gedaan te Brussel, 25 april 2000. Voor de Commissie Margot WALLSTR(cid:214)M Lid van de Commissie (*) Aangenomen v(cid:243)(cid:243)r de zesentwintigste aanpassing. (1) PB 196 van 16. 8. 1967, blz. 1. (2) PB L 199 van 30. 7. 1999, blz. 57. (3) PB L 358 van 18. 12. 1986, blz. 1. 8. 6. 2000 NL Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen L 136/91 BYLAGE I (cid:132)B. 40. HUIDCORROSIE 1. METHODE 1. 1. Inleiding Twee in vitro-tests voor huidcorrosiviteit, de bepaling aan de hand van de transcutane elektrische weerstand (TEW) in rattenhuid en een test met een model van de humane huid, zyn door het Europees Centrum voor de validering van alternatieve methoden (ECVAM) van het Gemeenschappelyk Centrum voor onderzoek van de Europese Commissie als wetenschappelyk verantwoord bekrachtigd (1) (2) (3). By het valideringsonderzoek van het ECVAM is aangetoond dat met beide tests een betrouwbaar onderscheid kan worden gemaakt tussen stoffen waarvan bekend is dat ze corrosief c. q. niet-corrosief voor de huid zyn. Bovendien kon met het test- protocol op basis van het model van de humane huid een correct onderscheid worden gemaakt tussen stoffen met een meer of minder hevige corrosieve werking (stoffen waarvan bekend is dat ze ernstig corrosief voor de huid zyn, R35, en andere stoffen die corrosief voor de huid zyn, R34) (2). Voor beide tests wordt een beschry ving en een procedure vermeld; de keuze van de te gebruiken test wordt bepaald door de specifieke eisen en voorkeuren van de gebruiker. Zie ook de algemene inleiding van deel B. 1. 2. Definities Huidcorrosie: het ontstaan van onomkeerbare weefselschade in de huid na het aanbrengen van testmateriaal. 1. 3. Referentiestoffen Er worden geen referentiestoffen gespecificeerd, maar zie ook de punten 1. 5. 3. 4 en 1. 7. 2. 3. 1. 4. Principe van de testmethode (cid:151) TEW-bepaling met rattenhuid Het testmateriaal wordt gedurende maximaal 24 uur aangebracht op het oppervlak van de epidermis van huidschyfjes die uit de huid van op humane wyze gedode jonge ratten worden genomen. Corrosief materiaal wordt gekenmerkt doordat het kan leiden tot een verlies van de normale integriteit en barriŁrefunctie van het stratum corneum, dat wordt gemeten als een daling van de inherente TEW tot onder een drempelwaarde (5 kh) (4) (5). Irriterende en niet-irriterende materialen verlagen de TEW niet tot onder de drempelwaarde. Voor oppervlakteactieve stoffen en neutrale organische verbindingen (zie referentie (6) voor een definitie) kan in de testprocedure een kleurstofbindende stap worden opgenomen om te zorgen dat er specifiek met deze soorten chemische stoffen minder vals-positieve resultaten worden verkregen (2) (7). 1. 5. Beschryving van de testmethode (cid:151) TEW-bepaling met rattenhuid 1. 5. 1. Dieren Jonge (20-23 dagen) ratten (Wistar of een vergelykbare stam) zyn nodig voor het prepareren van de huid- schyfjes. Het haar op de rug en de flanken wordt met een kleine dierenschaar zorgvuldig verwyderd. De die- ren worden vervolgens gewassen door zorgvuldig te wryven terwyl het gebied wordt ondergedompeld in een antibioticaoplossing (die byvoorbeeld streptomycine, penicilline, chlooramfenicol of amfotericine bevat met een concentratie die werkzaam is voor het remmen van de groei van bacteriºn). De dieren worden op de derde of vierde dag na de eerste maal wassen opnieuw met antibiotica gewassen en binnen drie dagen gebruikt (de dieren mogen voor het prepareren van de huid niet ouder dan 31 dagen zyn). 1. 5. 2. Het prepareren van de huidschyfjes De dieren worden op humane wyze gedood. Vervolgens wordt de huid van de rug van elk dier verwyderd en van overtollig vet ontdaan door het voorzichtig van de huid los te trekken. De huid wordt over het uiteinde van een PTFE-buis (polytetrafluoretheen) gelegd, waarby ervoor wordt gezorgd dat het oppervlak van de epi- dermis in contact met de buis is. Een rubber (cid:132)O(cid:148)-ring wordt strak over het uiteinde van de buis geschoven om de huid op zyn plaats te houden en het overtollige weefsel wordt weggeknipt. In figuur 1 worden de afmetingen van de buis en de (cid:132)O(cid:148)-ring aangegeven. Vervolgens wordt de rubber (cid:132)O(cid:148)-ring zorgvuldig met vase- line aan de PTFE-buis vastgekit. De buis wordt met een klemring vastgezet in een houder die een magnesi- umsulfaatoplossing (154 mM) bevat (figuur 2). 1. 5. 3. Testprocedure 1. 5. 3. 1. A a n b r e n g e n v a n h e t t e s t m a t e r i a a l Vloeibare teststoffen (150 (cid:181)l) worden op het oppervlak van de epidermis in de buis aangebracht (figuur 2). Wanneer vast materiaal wordt getest, wordt een zodanige hoeveelheid van de vaste stof op het schyfje aange- bracht, dat het hele oppervlak van de epidermis bedekt is. Vervolgens wordt gede(cid:239)oniseerd water (150 (cid:181)l) boven op de vaste stof toegevoegd en worden de buizen voorzichtig geschud. De teststoffen moeten een maximaal contact met de huid hebben. Voor sommige vaste stoffen kan dit worden bereikt door ze te verwar- men tot 30 (cid:176)C om de stof te laten smelten of door ze fyn te malen om een korrelig materiaal of poeder te ver- krygen. L 136/92 NL Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen 8. 6. 2000 Voor elke teststof worden drie huidschyfjes gebruikt. De teststoffen worden gedurende 24 uur aangebracht (zie ook punt 1. 5. 3. 4). De teststof wordt verwyderd door te spoelen onder een straal leidingwater van maxi- maal 30 (cid:176)C tot er geen materiaal meer kan worden verwyderd. De verwydering van teststoffen die in de buis gestold zyn, kan worden vergemakkelykt door te spoelen onder een straal warm water van ongeveer 30 (cid:176)C. 1. 5. 3. 2. T E W - m e t i n g e n De TEW wordt gemeten met een wisselstroommeetbrug voor zwakstroom (bv. AIM 401 of 6401 of gely kwaardig). Alvorens de elektrische weerstand te meten wordt de oppervlaktespanning van de huid verlaagd door zoveel 70 %-ethanol toe te voegen dat de epidermis bedekt is. Na enkele seconden wordt de ethanol ver- wyderd door de buis om te keren en wordt het weefsel gehydrateerd door 3 ml magnesiumsulfaatoplossing (154 mM) toe te voegen. De elektroden van de meetbrug worden aan weerszyden van het huidschyfje geplaatst om de weerstand in kh te meten (zie figuur 2). De afmetingen van de elektrode en de lengte van het stuk elektrode dat onder de krokodillenklem uitkomt, zyn vermeld in figuur 1. De klem van de binnenste (dikke) elektrode rust tydens de weerstandsmeting op de bovenkant van de PTFE-buis om ervoor te zorgen dat steeds een even lang stuk van de elektrode in de magnesiumsulfaatoplossing steekt. De buitenste (dunne) elektrode wordt zodanig in de houder aangebracht dat deze op de bodem rust. De afstand tussen de onder- kant van de klemring en de onderkant van de PTFE-buis wordt constant gehouden (zie figuur 1), aangezien deze afstand de gemeten weerstand be(cid:239)nvloedt. Als de gemeten weerstand hoger is dan 20 kh, kan dit worden veroorzaakt doordat het oppervlak van de epi- dermis van het huidschyfje met een laag teststof bedekt is. Deze laag kan men trachten te verwyderen door byvoorbeeld de PTFE-buis met de duim (met handschoen) dicht te houden en gedurende ongeveer 10 secon- den te schudden. De magnesiumsulfaatoplossing wordt weggegooid en de weerstandsmeting wordt met verse magnesiumsulfaatoplossing herhaald. De gemiddelde TEW-resultaten worden geaccepteerd, mits de tegelykertyd gemeten positieve en negatieve controlewaarden binnen de voor de methode aanvaardbare marges vallen. Als controlestoffen en aanvaardbare weerstandsintervallen voor de beschreven methodologie en apparatuur worden voorgesteld: Controle Stof Positief Negatief 10 M zoutzuur (36 %) Gedestilleerd water Weerstandsinterval (kh) 0,5-1,0 10-25 1. 5. 3. 3. G e w y z i g d e p r o c e d u r e v o o r o p p e r v l a k t e a c t i e v e s t o f f e n e n n e u t r a l e o r g a n i s c h e v e r - b i n d i n g e n Als de TEW van teststoffen die oppervlakteactieve stoffen of neutrale organische verbindingen zyn, lager is dan of gelyk is aan 5 kh, kan op de weefsels een bepaling van de kleurstofpenetratie worden uitgevoerd. Via deze procedure wordt bepaald of de resultaten vals-positief zyn (2). 1. 5. 3. 3. 1. Aanbrenging en verwydering van de kleurstof sulforhodamine B Na de eerste behandeling met de teststof wordt 150 (cid:181)l van een 10 %-verdunning (g/v) van de kleurstof sulfor- hodamine B in gedestilleerd water gedurende twee uur aangebracht op het oppervlak van de epidermis van elk huidschyfje. De huidschyfjes worden vervolgens gedurende ongeveer 10 seconden onder een straal leiding- water van ten hoogste kamertemperatuur gespoeld om een eventuele overmaat of ongebonden kleurstof te verwyderen. Elk huidschyfje wordt voorzichtig van de PTFE-buis verwyderd en in een flesje (bv. een glazen scintillatieflesje van 20 ml) met gede(cid:239)oniseerd water (8 ml) gelegd. De flesjes worden gedurende 5 minuten zachtjes geschud om eventueel nog resterende overmaat of ongebonden kleurstof te verwyderen. Daarna wordt deze spoelprocedure herhaald en vervolgens worden de huidschyfjes in flesjes met 5 ml 30 % (g/v) natriumdodecylsulfaat (SDS) in gedestilleerd water gelegd en een nacht by 60 (cid:176)C ge(cid:239)ncubeerd. Na incubatie wordt elk huidschyfje verwyderd en weggegooid en wordt de resterende oplossing gedurende 8 minuten by 21 (cid:176)C gecentrifugeerd (relatieve centrifugale kracht p 175). Vervolgens wordt 1 ml van het supernatans 1:5 (v/v) (d. w. z. 1 ml + 4 ml) verdund met 30 % (g/v) SDS in gedestilleerd water. De optische dichtheid (OD) van de oplossing wordt by ongeveer 565 nm gemeten. 1. 5. 3. 3. 2. Berekening van het kleurstofgehalte Het gehalte aan de kleurstof sulforhodamine B wordt berekend uit de OD-waarde (de molaire extinctie- coºfficiºnt van de kleurstof sulforhodamine B by 565 nm = 8,7 (cid:215) 104 en het molecuulgewicht = 580). Het gehalte aan de kleurstof sulforhodamine B wordt voor elk huidschyfje bepaald en vervolgens wordt voor de duplo’s het gemiddelde kleurstofgehalte berekend. De gemiddelde resultaten voor de kleurstofbinding worden geaccepteerd, mits de tegelykertyd gemeten controlewaarden binnen de voor de methode aanvaardbare mar- ges vallen. Als aanvaardbare intervallen voor het kleurstofgehalte by de controlestoffen en de beschreven methodologie en apparatuur worden voorgesteld: 8. 6. 2000 NL Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen L 136/93 Controle Stof Positief Negatief 10 M Zoutzuur (36 %) Gedestilleerd water Interval kleurstofgehalte ((cid:181)g/schyfje) 40-100 15-35 1. 5. 3. 4. A a n v u l l e n d e i n f o r m a t i e De teststoffen kunnen ook gedurende een kortere periode (bv. 2 uur) op de huidschyfjes worden aangebracht om te bepalen of het materiaal sterk corrosief is. By het valideringsonderzoek is echter gebleken dat by de TEW-bepaling voor verschillende teststoffen een te hoge corrosieve werking werd gevonden nadat ze gedu- rende 2 uur op de huidschyfjes waren aangebracht (2), terwyl na aanbrengen gedurende 24 uur op correcte wyze onderscheid kon worden gemaakt tussen corrosief en niet-corrosief. De eigenschappen en afmetingen van de gebruikte testapparatuur en -procedure kunnen de gevonden TEW- waarden be(cid:239)nvloeden. De corrosiedrempelwaarde van 5 kh is bepaald op grond van gegevens die met de spe- cifieke hier beschreven apparatuur en procedure zyn verkregen. Het is mogelyk dat er by significant gewy zigde testomstandigheden ook andere drempel- en controlewaarden van toepassing zyn. Daarom wordt aan- bevolen de methodologie en de drempelwaarde voor de weerstand te kalibreren door een aantal referentie- standaards te testen die worden gekozen uit de chemische stoffen die by het valideringsonderzoek zyn gebruikt (3). 1. 6. Principe van de testmethode (cid:151) Bepaling met een model van de humane huid Het testmateriaal wordt gedurende maximaal 4 uur plaatselyk aangebracht op een driedimensionaal model voor de humane huid, bestaande uit een gereconstrueerde epidermis met een functioneel stratum corneum. Corrosief materiaal wordt gekenmerkt doordat het by gespecificeerde blootstellingsperioden kan leiden tot een daling van de levensvatbaarheid van de cellen (die byvoorbeeld wordt bepaald door de reductie van MTT te meten) tot onder gedefinieerde drempelwaarden. Het principe van de bepaling is gebaseerd op de hypothese dat stoffen corrosief zyn wanneer ze (door diffusie of erosie) het stratum corneum kunnen penetreren en vol- doende cytotoxisch zyn om in de daaronder liggende cellagen celdood te veroorzaken. 1. 7. Beschryving van de testmethode (cid:151) Bepaling met een model van de humane huid 1. 7. 1. Modellen van de humane huid Modellen van de humane huid kunnen van verschillende bronnen afkomstig zyn, maar ze moeten aan bepaalde criteria voldoen. Het model moet een functioneel stratum corneum hebben met daaronder een laag levende cellen. De barriŁrefunctie van het stratum corneum moet afdoende zyn. Dit kan worden aangetoond door te demonstreren dat het model bestand is tegen cytotoxiciteit na de toediening van stoffen waarvan bekend is dat ze cytotoxisch zyn voor cellen maar die normaal gesproken het stratum corneum niet kunnen passeren. Er moet worden aangetoond dat het model onder gedefinieerde experimentele omstandigheden reproduceerbare resultaten oplevert. De levensvatbaarheid van de levende cellen in het model moet zo hoog zyn dat er duidelyk onderscheid kan worden gemaakt tussen de positieve en negatieve controlestoffen. De levensvatbaarheid van de cellen (zoals die byvoorbeeld wordt gemeten aan de hand van de reductie van MTT, d. w. z. een OD-waarde) na blootstelling aan de negatieve controlestof moet binnen aanvaardbare grenzen voor het specifieke model vallen. Evenzo moeten de waarden voor de levensvatbaarheid van de cellen met de positieve controlestof (in vergelyking met die voor de negatieve controle) binnen gespecificeerde grenzen liggen. Het belangrykst is dat moet zyn aange- toond dat het gebruikte voorspellingsmodel aan internationale valideringsnormen voldoet (2). 1. 7. 2. Testprocedure 1. 7. 2. 1. A a n b r e n g e n v a n h e t t e s t m a t e r i a a l Voor vloeibaar materiaal moet zoveel teststof worden aangebracht dat het huidoppervlak bedekt is (minimaal 25 (cid:181)l/cm2). Voor vast materiaal moet zoveel teststof worden aangebracht dat het huidoppervlak bedekt is en moet dit vervolgens worden bevochtigd om te zorgen voor een goed contact met de huid; indien nodig moe- ten vaste stoffen tot een poeder worden vermalen voordat ze worden aangebracht. Van de wyze van aanbren- gen moet worden aangetoond dat deze voor een breed scala van chemische stoffen geschikt is (2). Aan het eind van de blootstellingsperiode moet het testmateriaal met een fysiologisch zoutoplossing zorgvuldig van het huidoppervlak worden gewassen. 1. 7. 2. 2. M e t i n g v a n d e l e v e n s v a t b a a r h e i d v a n d e c e l l e n Voor de meting van de levensvatbaarheid van de cellen kan een willekeurige kwantitatieve gevalideerde methode worden gebruikt. De meest gebruikte bepaling is de reductie van MTT, waarvan is aangetoond dat deze in verschillende laboratoria nauwkeurige en reproduceerbare resultaten oplevert (2). Het huidschyfje wordt gedurende 3 uur by 20-28 (cid:176)C in een MTT-oplossing van 0,3 mg/ml gelegd. Er ontstaat een blauw for- mazan-neerslag dat vervolgens wordt geºxtraheerd (vloeistofextractie) en de formazanconcentratie wordt gemeten door de OD by een golflengte tussen 545 en 595 nm te bepalen. L 136/94 NL Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen 8. 6. 2000 1. 7. 2. 3. A a n v u l l e n d e i n f o r m a t i e Het gebruikte huidmodel en het exacte protocol voor de blootstellingstyd, de spoelprocedures enz. hebben een grote invloed op de resultaten van de bepaling van de levensvatbaarheid van de cellen. Daarom wordt aanbevolen de methodologie en het voorspellingsmodel te kalibreren door een aantal referentiestandaards te testen die worden gekozen uit de chemische stoffen die by het valideringsonderzoek van het ECVAM zyn gebruikt (3). Het is van fundamenteel belang dat wordt aangetoond dat de gebruikte methode voor een breed scala van chemische stoffen zowel binnen ØØn laboratorium als voor verschillende laboratoria overeenkomstig de internationale normen reproduceerbaar is. De methode moet minimaal voldoen aan de reeds eerder vast- gestelde criteria voor wetenschappelyk verantwoorde tests (2) en de resultaten van een dergelyk validerings- onderzoek moeten in een wetenschappelyk tydschrift met intercollegiale toetsing ((cid:132)peer review(cid:148)) worden gepubliceerd. 2. GEGEVENS 2. 1. Behandeling van de resultaten 2. 1. 1. TEW-bepaling met rattenhuid De weerstand (in kh) voor het testmateriaal, de positieve en negatieve controles en eventuele standaard- referentiestoffen moeten in tabelvorm worden gerapporteerd, met vermelding van gegevens over duplobepa- lingen, herhaalde bepalingen, gemiddelden en de daaruit afgeleide indeling. 2. 1. 2. Bepaling met een model van de humane huid De OD-waarden en de berekende procentuele levensvatbaarheid van de cellen voor het testmateriaal, de posi- tieve en negatieve controles en eventuele standaardreferentiestoffen moeten in tabelvorm worden gerappor- teerd, met vermelding van gegevens over duplobepalingen, herhaalde bepalingen, gemiddelden en de daaruit afgeleide indeling. 2. 2. Evaluatie en interpretatie van de resultaten 2. 2. 1. TEW-bepaling met rattenhuid Als de gemiddelde TEW voor de teststof hoger is dan 5 kh, is de stof niet corrosief. Als de TEW-waarde 5 kh of lager is en de teststof geen oppervlakteactieve stof of neutrale organische verbinding is, is de stof wel cor- rosief. Voor oppervlakteactieve stoffen of neutrale organische verbindingen die een TEW van 5 kh of lager opleve- ren, kan een bepaling van de kleurstofpenetratie worden uitgevoerd. Als het gemiddelde kleurstofgehalte van het schyfje hoger is dan of gelyk is aan het tegelykertyd bepaalde gemiddelde kleurstofgehalte van het schyfje met de positieve controle (36 % HCl), is de teststof echt positief en derhalve corrosief. Als het gemiddelde kleurstofgehalte van het schyfje lager is dan het tegelykertyd bepaalde gemiddelde kleurstofgehalte van het schyfje met de positieve controle (36 % HCl), is de teststof vals-positief en derhalve niet corrosief. 2. 2. 2. Bepaling met een model van de humane huid De OD-waarde van de negatieve controle komt overeen met een levensvatbaarheid van de cellen van 100 %, zodat de voor elk testmonster bepaalde OD-waarden kunnen worden gebruikt voor de berekening van een procentuele levensvatbaarheid in vergelyking met de negatieve controle. De grenswaarde van de procentuele levensvatbaarheid van de cellen die als scheiding tussen corrosieve en niet-corrosieve materialen (of tussen verschillende klassen van corrosiviteit) fungeert, moet in het voorspellingsmodel duidelyk worden gespecifi- ceerd alvorens de methode wordt gevalideerd en vervolgens moet in het valideringsonderzoek worden aange- toond dat deze grenswaarde correct is (2). 3. RAPPORTAGE Testverslag In het testverslag moet ten minste de volgende informatie worden opgenomen: Teststof: (cid:151) gegevens over identificatie, fysisch karakter en indien van toepassing fysisch-chemische eigenschappen. Indien referentiestoffen worden gebruikt, moet ook daarover dergelyke informatie worden verstrekt. Testomstandigheden: (cid:151) gedetailleerde informatie over de gebruikte testprocedure; (cid:151) een beschryving en motivering van eventuele wyzigingen. 8. 6. 2000 NL Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen L 136/95 Resultaten: (cid:151) een tabel met de waarden voor de weerstand (TEW-bepaling) of de procentuele levensvatbaarheid van de cellen (bepaling met een model van de humane huid) voor het testmateriaal, de positieve en negatieve controles en eventuele standaardreferentiestoffen, met vermelding van gegevens over duplobepalingen, herhaalde bepalingen en gemiddelden; (cid:151) een beschryving van eventuele andere waargenomen effecten. Bespreking van de resultaten. Conclusies. 4. REFERENTIES (1) ECVAM (1998), ECVAM News & Views, ATLA 26, blz. 275-280. (2) Fentem, J. H. , Archer, G. E. B. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. , Holzhutter, H-G. & Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivi- ty. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in Vitro 12, blz. 483-524. (3) Barratt, M. D. , Brantom, P. G. , Fentem, J. H. , Gerner, I. , Walker, A. P. & Worth, A. P. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals, Toxicology in Vitro 12, blz. 471-482. (4) Oliver, G. J. A. , Pemberton, M. A. & Rhodes, C. (1986), An in vitro skin corrosivity test (cid:151) modifications and validation, Food & Chemical Toxicology 24, blz. 507-512. (5) Botham, P. A. , Hall, T. J. , Dennett, R. , McCall, J. C. , Basketter, D. A. , Whittle, E. , Cheeseman, M. , Esdaile, D. J. & Gardner, J. (1992), The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial, Toxicology in Vitro 6, blz. 191-194. (6) Worth, A. P. , Fentem, J. H. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. & Liebsch, M. (1998), An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion, ATLA 26, blz. 709-720. (7) Botham, P. A. , Chamberlain, M. , Barratt, M. D. , Curren, R. D. , Esdaile, D. J. , Gardner, J. R. , Gordon, V. C. , Hil- debrand, B. , Lewis, R. W. , Liebsch, M. , Logemann, P. , Osborne, R. , Ponec, M. , Regnier, J. F. , Steiling, W. , Walker, A. P. & Balls, M. (1995), A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM workshop 6, ATLA 23, blz. 219-255. L 136/96 NL Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen 8. 6. 2000 Figuur 1 8. 6. 2000 NL Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen L 136/97 Figuur 2 L 136/98 NL Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen 8. 6. 2000 BYLAGE II (cid:132)B. 41. FOTOTOXICITEIT (cid:151) IN VITRO 3T3 NRU FOTOTOXICITEITSTEST 1. METHODE 1. 1. Inleiding Fototoxiciteit is gedefinieerd als een toxische respons die wordt opgewekt door de blootstelling van de huid aan bepaalde stoffen gevolgd door de blootstelling aan licht dan wel op vergelykbare wyze wordt ge(cid:239)nduceerd door bestraling van de huid na systemische toediening van een stof. Informatie die wordt verkregen met de in vitro 3T3 NRU fototoxiciteitstest, wordt gebruikt om het fototoxi- sche potentieel van een onderzochte stof te bepalen, d. w. z. het al dan niet aanwezig zyn van mogelyke risico’s die zyn verbonden aan een onderzochte stof in combinatie met de blootstelling aan UV en zichtbaar licht. Aangezien het toxicologische eindpunt van de in vitro-test wordt gevormd door de bepaling van de fototoxici- teit die wordt ge(cid:239)nduceerd door de gecombineerde werking van een stof en licht, kunnen verbindingen die in vivo fototoxisch zyn na systemische aanbrenging en verdeling op de huid en verbindingen die na topische aanbrenging op de huid een foto-irriterend effect hebben, als zodanig worden herkend. De in vitro 3T3 NRU fototoxiciteitstest is van 1992-1997 ontwikkeld en gevalideerd in een gezamenlyk EU/ Colipa-project (1) (2) (3) om een valide in vitro-alternatief te bieden voor de verschillende in vivo tests die wer- den gebruikt. In 1996 werd door een OESO-workshop aanbevolen om voor de bepaling van de fototoxiciteit een stapsgewyze in vitro-testprocedure te volgen (4). Resultaten van de in vitro 3T3 NRU fototoxiciteitstest zyn vergeleken met acute fototoxiciteits- en foto-irrita- tie-effecten in vivo by dieren en mensen, waarby is gebleken dat de test deze effecten uitstekend voorspelt. De test is niet ontworpen om andere nadelige effecten te voorspellen die kunnen optreden by de gecombineerde blootstelling aan een stof en licht, d. w. z. fotogenotoxiciteit, fotoallergie en fotocarcinogeniciteit, hoewel veel stoffen die deze specifieke eigenschappen hebben by de in vitro 3T3 RU fototoxiciteitstest een positieve reactie zullen opleveren. Evenmin is de test bedoeld om de fototoxische potentie te kwantificeren. Een stapsgewyze procedure voor de uitvoering van fototoxiciteitstests is in het aanhangsel geschetst. 1. 2. Definities Bestralingssterkte: de intensiteit van het ultraviolette (UV) of zichtbare licht dat op een oppervlak valt, uit- gedrukt in W/m2 of mW/cm2. Lichtdosis: de hoeveelheid (= intensiteit (cid:215) tyd) ultraviolette (UV) of zichtbare straling die op een oppervlak valt, uitgedrukt in joules (= W (cid:215) s) per oppervlakte-eenheid, d. w. z. J/m2 of J/cm2. UV-golflengtebanden: de door de CIE (Commission Internationale de L’(cid:201)clairage) aanbevolen indeling is: UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) en UVC (100-280 nm). Er worden ook andere indelingen gehanteerd: de grens tussen UVB en UVA wordt vaak op 320 nm gelegd en UVA wordt soms onderverdeeld in UV-A1 en UV-A2, waarby de grens ligt op ongeveer 340 nm. Levensvatbaarheid van cellen: parameter waarmee de totale activiteit van een celpopulatie wordt aangegeven (d. w. z. opname van de vitale kleurstof neutraalrood in cellulaire lysosomen) die, afhankelyk van het gemeten eindpunt en de opzet van de test, is gecorreleerd met het totale aantal en/of de vitaliteit van de cellen. Relatieve levensvatbaarheid van cellen: levensvatbaarheid van cellen uitgedrukt in verhouding tot negatievecontro- lecellen (oplosmiddel) die tydens de gehele testprocedure worden meegenomen, al dan niet met UV bestraald, maar niet met een onderzochte stof behandeld. Voorspellend model: een algoritme om de resultaten van een toxiciteitstest om te zetten in een voorspelling van het toxische potentieel. In de hier beschreven test kunnen PIF en MPE worden gebruikt om de resultaten van de in vitro 3T3 NRU fototoxiciteitstest om te zetten in een voorspelling van het fototoxische potentieel. PIF (foto-irritatiefactor): een factor die wordt verkregen door twee even effectieve cytotoxische concentraties (EC50) van de onderzochte stof te vergelyken die zyn bepaald zonder (ﬂ UV) en met (+ UV) een niet-cytotoxi- sche bestraling met UVA/zichtbaar licht. MPE (gemiddeld foto-effect): een nieuwe parameter die wordt bepaald aan de hand van een wiskundige analyse van de volledige vorm van twee concentratieresponskrommen die zyn verkregen zonder (ﬂ UV) en met (+ UV) een niet-cytotoxische bestraling met UVA/zichtbaar licht. 8. 6. 2000 NL Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen L 136/99 Fototoxiciteit: een acute toxische respons die wordt opgewekt door de blootstelling van de huid aan bepaalde stoffen gevolgd door de blootstelling aan licht of op vergelykbare wyze wordt ge(cid:239)nduceerd door bestraling van de huid na systemische toediening van een stof. Foto-irritatie: een begrip dat deel uitmaakt van de term (cid:132)fototoxiciteit(cid:148) en dat wordt gebruikt om alleen die fototoxische reacties te beschryven die de huid vertoont na de blootstelling aan stoffen (topisch of oraal). Deze fototoxische reacties leiden altyd tot aspecifieke celbeschadiging (zonnebrandachtige reacties). Fotoallergie: een verworven immunologische reactie die niet optreedt by een eerste blootstelling aan een stof en licht, maar een inductieperiode van ØØn of twee weken nodig heeft voordat een reactie van de huid kan worden aangetoond. Fotogenotoxiciteit: een genotoxische respons die wordt waargenomen op een genetisch eindpunt en wordt opgewekt door de blootstelling van cellen aan een niet-genotoxische dosis UV/zichtbaar licht en een niet-ge- notoxische stof. Fotocarcinogeniteit: carcinogeniteit die wordt ge(cid:239)nduceerd door herhaalde blootstelling aan licht en een che- mische stof. De term (cid:132)foto-cocarcinogenese(cid:148) wordt gebruikt als door UV ge(cid:239)nduceerde tumorvorming wordt versterkt door een chemische stof. 1. 3. Referentiestoffen Behalve de positieve controlestof chloorpromazine, die in elke proef parallel moet worden getest, wordt aan- bevolen voor het opzetten van de 3T3 NRU fototoxiciteitstest als refentiestoffen gebruik te maken van een aantal van de stoffen die by deze test in interlaboratoriumproeven zyn gebruikt (1) (3) (13). 1. 4. Achtergrond Van veel typen stoffen zyn fototoxische effecten gemeld (5) (6) (7) (8). De enige gemeenschappelyke eigen- schap is hun vermogen om lichtenergie te absorberen in het zonlichtgebied. Volgens de eerste wet van de fotochemie (wet van Grotthaus-Draper) is de voorwaarde voor het optreden van een fotoreactie dat er vol- doende lichtkwanta worden geabsorbeerd. Voordat wordt overwogen een biologische test volgens de onder- havige methode uit te voeren, moet dan ook een absorptiespectrum van de te onderzoeken stof in het UV/ zichtbare licht worden bepaald (bv. volgens OESO-testrichtlyn 101). Als de molaire extinctabsorptiecoºfficiºnt minder is dan 10 liter (cid:215) molﬂ1 (cid:215) cmﬂ1, heeft de stof geen fotoreactief potentieel en hoeft deze niet volgens de in vitro 3T3 NRU fototoxiciteitstest of een andere biologische test te worden getest op nadelige fotochemische effecten (aanhangsel). 1. 5. Principe van de testmethode Er zyn vier mechanismen bekend voor een fototoxische respons als gevolg van de absorptie van licht door een (chemische) chromofoor (7). Deze kunnen alle leiden tot celbeschadiging. Daarom is de in vitro 3T3 NRU fototoxiciteitstest gebaseerd op een vergelyking van de cytotoxiciteit van een stof met en zonder de blootstel- ling aan een niet-cytotoxische dosis UVA/zichtbaar licht. De cytotoxiciteit wordt in deze test uitgedrukt als de concentratieafhankelyke verlaging van de opname van de vitale kleurstof neutraalrood (NR) (9) 24 uur na de behandeling met de te onderzoeken stof en bestraling. Balb/c 3T3 cellen worden gedurende 24 uur in cultuur gehouden zodat zich een monocellulaire laag vormt. Vervolgens worden voor elke te onderzoeken stof twee 96-wells-platen gedurende ØØn uur gepre(cid:239)ncubeerd met acht verschillende concentraties van de stof. Daarna wordt ØØn van de twee platen blootgesteld aan een niet-cytotoxische dosis UVA/zichtbaar licht van 5 J/cm2 UVA (+ UV-experiment) terwyl de andere plaat in het donker wordt bewaard (ﬂ UV-experiment). In beide platen wordt het behandelingsmedium vervolgens vervan- gen door cultuurmedium en na nog eens 24 uur incubatie wordt de levensvatbaarheid van de cellen bepaald aan de hand van de opname van neutraalrood (NRU (cid:151) neutral red uptake) gedurende drie uur. De relatieve levensvatbaarheid van de cellen, uitgedrukt als percentage van de levensvatbaarheid van onbehandelde nega- tieve controles, wordt voor elk van de acht testconcentraties berekend. Om een uitspraak te doen over het fototoxische potentieel worden de concentratieresponsen die zyn verkregen met (+ UV) en zonder (ﬂ UV) bestraling vergeleken, gewoonlyk op het EC50 niveau, d. w. z. de concentratie die de levensvatbaarheid van de cellen met 50 % vermindert ten opzichte van onbehandelde controles. 1. 6. Kwaliteitscriteria UVA-gevoeligheid van de cellen, historische gegevens: de cellen moeten regelmatig worden gecontroleerd op gevoe- ligheid voor UVA. Cellen worden overgeºnt met de dichtheid die wordt gebruikt in de in vitro 3T3 NRU foto- toxiciteitstest, de volgende dag bestraald met UVA-doses van 1-9 J/cm2 en de levensvatbaarheid van de cellen wordt ØØn dag later bepaald door middel van de NRU-test. Cellen voldoen aan de kwaliteitscriteria als hun levensvatbaarheid na bestraling met 5 J/cm2 UVA ten minste 80 % bedraagt van de levensvatbaarheid van de niet-belichte controles. By de hoogste UVA-dosis van 9 J/cm2 mag de levensvatbaarheid niet minder zyn dan 50 % van die van de niet-belichte controles. Deze controle dient ongeveer om de tien celpassages te worden herhaald. UVA-gevoeligheid van de negatievecontrolecellen, lopende test: de test voldoet aan de kwaliteitscriteria als negatieve controles (cellen in EBSS (Earl’s balanced salt solution) met of zonder 1 % dimethylsulfoxide (DMSO) of 1 % ethanol (EtOH)) in het + UVA-experiment een levensvatbaarheid vertonen van ten minste 80 % van die van niet-bestraalde cellen in hetzelfde oplosmiddel in het parallel uitgevoerde niet-belichte experiment (ﬂ UVA). L 136/100 NL Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen 8. 6. 2000 Levensvatbaarheid van negatievecontrolecellen: de absolute optische dichtheid (OD540 NRU) die wordt gemeten in het NR-extract van de negatieve controles laat zien of de 1 (cid:215) 104 cellen die per well zyn overgeºnt tydens de twee dagen van de test met de normale verdubbelingstyd zyn gegroeid. Een test voldoet aan de goedkeurings- criteria als de gemiddelde OD540 NRU van onbehandelde controles ¯ 0,2 is. Positieve controle: parallel aan elke in vitro 3T3 NRU fototoxiciteitstest moet een bekende fototoxische stof wor- den getest. Chloorpromazine (CPZ) is als positieve controle gebruikt in de EU/Colipa-valideringsstudie en wordt daarom aanbevolen. Voor CPZ dat wordt getest volgens het standaardprotocol in de in vitro 3T3 NRU fototoxiciteitstest, zyn de volgende goedkeuringcriteria gedefinieerd: CPZ bestraald (+ UVA): EC50 = 0,1 tot 2,0 (cid:181)g/ml, CPZ niet-bestraald (ﬂ UVA): EC50 = 7,0 tot 90,0 (cid:181)g/ml. De foto-irritatiefactor (PIF), d. w. z. de ver- schuiving van EC50 moet ten minste 6 zyn. In plaats van CPZ kunnen ook andere bekende fototoxische stoffen die geschikt zyn wat betreft de chemica- liºnklasse of de oplosbaarheideigenschappen van de onderzochte stof, als parallelle positieve controle worden gebruikt. In dit geval dienen de bereiken van de EC50 waarden en PIF of MPE (gemiddeld foto-effect) uitgaande van historische gegevens op adequate wyze gedefinieerd te zyn als aanvaardbaarheidscriteria voor de test. 1. 7. Beschryving van de testmethode 1. 7. 1. Voorbereidingen 1. 7. 1. 1. C e l l e n In de valideringsstudie is een permanente fibroblastcellyn van muizen (cid:151) Balb/c 3T3, kloon 31 (cid:151) van ATCC of ECACC gebruikt. Deze wordt daarom aanbevolen. Andere cellen of cellynen kunnen met succes volgens hetzelfde testprotocol worden gebruikt als de cultuuromstandigheden worden aangepast aan de specifieke behoeften van de cellen, maar de gelykwaardigheid moet worden aangetoond. De cellen moeten regelmatig worden gecontroleerd op de afwezigheid van mycoplasmabesmetting en mogen alleen worden gebruikt als de resultaten van die controle bevredigend zyn. Aangezien de UVA-gevoeligheid van cellen kan toenemen met het aantal passages, moeten Balb/c 3T3 cellen met het laagste verkrygbare passagegetal worden gebruikt, by voorkeur lager dan 100. Het is belangryk dat de UVA-gevoeligheid van de Balb/c 3T3 cellen regelmatig wordt gecontroleerd volgens de kwaliteitscontro- leprocedure die in dit document is beschreven. 1. 7. 1. 2. M e d i a e n c u l t u u r o m s t a n d i g h e d e n Voor routinematige passage van de cellen en tydens de testprocedure moeten geschikte cultuurmedia en incu- batieomstandigheden worden gebruikt. Voor Balb/c 3T3 cellen zyn dit DMEM gesupplementeerd met 10 % serum van pasgeboren kalveren, 4 mM glutamine, penicilline en streptomycine en incubatie onder vochtige omstandigheden by 37 (cid:176)C/7,5 % CO2. Het is vooral belangryk dat de cultuuromstandigheden zo zyn dat de celcyclustyd binnen het normale gedocumenteerde bereik van de gebruikte cellen of cellyn ligt. 1. 7. 1. 3. P r e p a r e r e n v a n d e c u l t u r e n Cellen uit ingevroren voorraadculturen worden met een geschikte dichtheid overgeºnt in cultuurmedium en ten minste ØØn maal in subcultuur gebracht voordat zy in de in vitro 3T3 NRU fototoxiciteitstest worden gebruikt. Voor de fototoxiciteitstest worden testcellen overgeºnt in een cultuurmedium, waarby de dichtheid zo is dat de culturen geen confluentie bereiken voor het einde van de test, d. w. z. wanneer de levensvatbaarheid van de cellen wordt bepaald 48 uur na het overenten van de cellen. Voor Balb/c 3T3 die worden gekweekt in 96-wells-platen, wordt een celdichtheid van 1 (cid:215) 104 cellen per well aanbevolen. Voor elke te onderzoeken stof worden cellen op identieke wyze overgeºnt op twee afzonderlyke 96-wells-pla- ten die vervolgens parallel de gehele testprocedure onder identieke cultuuromstandigheden doorlopen, met uitzondering van de tyd gedurende welke een van de platen wordt bestraald (+ UVA/zichtbaar licht) en de andere in het donker wordt bewaard (ﬂ UVA/zichtbaar licht). 1. 7. 1. 4. M e t a b o l i s c h e a c t i v e r i n g Hoewel het gebruik van metaboliserende systemen een algemene voorwaarde is voor alle in vitro tests voor de voorspelling van genotoxisch en carcinogeen potentieel, is tot dusverre voor fototoxicologie geen stof bekend die pas na metabolische transformatie in vivo of in vitro als fototoxine werkt. Het wordt dan ook niet nodig geacht, en evenmin zyn er wetenschappelyke gronden, om de huidige test uit te voeren met een metabolisch activeringssysteem. 8. 6. 2000 NL Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen L 136/101 1. 7. 1. 5. T e o n d e r z o e k e n s t o f / p r e p a r a t i e Te onderzoeken stoffen moeten vlak voor het gebruik vers worden geprepareerd, tenzy uit stabiliteitsgegevens blykt dat opslag aanvaardbaar is. Prepareren onder rood licht kan nodig zyn als het waarschynlyk is dat snelle fotodegradatie optreedt. Te onderzoeken stoffen moeten worden opgelost in gebufferde zoutoplossingen, byvoorbeeld Earl’s balanced salt solution (EBSS) of fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), die om interferentie tydens de bestraling te voor- komen, vry moeten zyn van prote(cid:239)necomponenten en lichtabsorberende pH-indicatorkleurstoffen. Te onderzoeken stoffen met een beperkte oplosbaarheid in water moeten in geschikte oplosmiddelen worden opgelost met een concentratie die 100-maal de gewenste eindconcentratie is en vervolgens met de gebufferde zoutoplossing een factor 100 worden verdund. Als er een oplosmiddel wordt gebruikt, moet dit in alle cultu- ren met een constant volumegehalte van 1 % (v/v) aanwezig zyn, d. w. z. zowel in de negatieve controles als in alle concentraties van de te onderzoeken stof. De aanbevolen oplosmiddelen zyn dimethylsulfoxide (DMSO) en ethanol (EtOH). Andere oplosmiddelen met een lage cytotoxiciteit (bv. aceton) kunnen in aanmerking komen, maar zy moeten zorgvuldig worden onder- zocht op specifieke eigenschappen, byvoorbeeld reactie met de te onderzoeken stof, onderdrukking van het fototoxische effect, vermogen om radicalen te binden. Om het oplossen te bevorderen kan gebruik worden gemaakt van vortex-menging en/of sonificatie en/of ver- warming tot 37 (cid:176)C. 1. 7. 1. 6. U V b e s t r a l i n g / p r e p a r a t i e Lichtbron: de keuze van een geschikte lichtbron en geschikte filtering is de meest cruciale factor by fototoxici- teitstests. UVA en zichtbaar licht worden gewoonlyk geassocieerd met fotosensibilisatie (7) (10), terwyl UVB van minder belang is en rechtstreeks hoogcytotoxisch is waarby de cytotoxiciteit van 313 nm tot 280 nm een factor 1000 toeneemt (11). By de keuze van een geschikte lichtbron geldt de essentiºle eis dat de licht- bron golflengten uitzendt die door de te onderzoeken stof worden geabsorbeerd en dat de lichtdosis (die bin- nen een redelyke tyd kan worden bereikt) voldoende is om bekende fotosensitizers te detecteren. Bovendien mogen de gebruikte golflengtes en doses, met inbegrip van de emissie van warmte (infrarood), geen ontoelaat- bare schade berokkenen aan het testsysteem. Simulatie van zonlicht met zonnesimulatoren wordt als de optimale lichtbron beschouwd. In zonnesimulato- ren worden xenonbooglampen en (gedoteerde) kwik-metaalhalidebooglampen gebruikt. Laatstgenoemde heb- ben het voordeel dat zy minder warmte afgeven en goedkoper zyn, maar de overeenstemming met het zon- licht is niet volmaakt. Aangezien alle zonnesimulatoren significante hoeveelheden UVB uitstralen, moeten er filters worden toegepast om de hoogcytotoxische UVB-golflengtes te verzwakken. Voor de in vitro 3T3 NRU fototoxiciteitstest moet een bestralingspectrum worden gebruikt dat vrywel geen UVB bevat (UVA:UVB p 1:20). Er is een voorbeeld gepubliceerd van de spectrale stralingsverdeling van de gefilterde zonnesimulator die is gebruikt in de valideringsstudie van de in vitro 3T3 NRU fototoxiciteitstest (3). Dosimetrie: de intensiteit van het licht (bestralingssterkte) moet regelmatig voor elke fototoxiciteitstest worden gecontroleerd met een geschikte breedband-UV-meter. De UV-meter moet op de bron zyn gekalibreerd. De werking van de UV-meter moet worden gecontroleerd en daarvoor wordt het gebruik van een tweede referen- tie-UV-meter van hetzelfde type en met dezelfde kalibratie aanbevolen. Idealiter moet met grotere intervallen een spectroradiometer worden gebruikt om de spectrale stralingssterkte van de gefilterde lichtbron te meten en de kalibratie van de breedband-UV-meter te controleren, maar dergelyke instrumenten vereisen speciaal opgeleid personeel. In de valideringsstudie is vastgesteld dat een dosis van 5 J/cm2 (UVA) niet-cytotoxisch is voor Balb/c 3T3 cel- len maar toch voldoende sterk om zelfs zwak fototoxische stoffen te exciteren. Om in 50 minuten een bestra- lingsdosis van 5 J/cm2 te bereiken, moet de bestralingssterkte worden afgesteld op 1,666 mW/cm2. Als een andere cellyn of een andere lichtbron wordt gebruikt, kan het nodig zyn de UVA-dosis enigszins aan te pas- sen rekening houdend met het criterium dat de straling de cellen geen schade mag berokkenen en krachtig genoeg moet zyn om standaardfototoxines te detecteren. De duur van de blootstelling aan het licht wordt als volgt berekend: 1. 7. 2. Testomstandigheden De maximale concentratie van een te onderzoeken stof mag niet hoger zyn dan 100 (cid:181)g/ml, aangezien alle fototoxische stoffen zyn gedetecteerd by lagere concentraties, terwyl by hogere concentraties de incidentie van fout-positieve resultaten toeneemt (13). De pH van de hoogste concentratie van de te onderzoeken stof moet een aanvaardbare waarde hebben (pH tussen 6,5 en 7,8). L 136/102 NL Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen 8. 6. 2000 Het bereik waarbinnen de concentraties van een met (+ UVA) en zonder (ﬂ UVA) licht onderzochte stof moe- ten liggen, moet in voorbereidende experimenten worden bepaald. Het bereik en de intervallen van een con- centratiereeks moeten zo worden gekozen dat de experimentele gegevens de concentratieresponskrommen voldoende onderbouwen. Er moeten geometrische concentratiereeksen (met een constante verdunningsfactor) worden gebruikt. 1. 7. 3. Testprocedure (1) 1. 7. 3. 1. 1. E e r s t e d a g Bereid een celsuspensie van 1 (cid:215) 105 cellen/ml in een cultuurmedium en breng uitsluitend in de buitenste wells van een 96-wells microtiterplaat voor weefselkweek 100 (cid:181)l cultuurmedium aan (= blanco’s). Breng in de ove- rige wells 100 (cid:181)l celsuspensie van 1 (cid:215) 105 cellen/ml (= 1 (cid:215) 104 cellen/well) aan. Prepareer voor elke te onder- zoeken stof twee platen: ØØn voor de bepaling van de cytotoxiciteit (ﬂ UVA), en de ander voor de bepaling van de fotocytotoxiciteit (+ UVA). Incubeer de cellen gedurende 24 uur (7,5 % CO2, 37 (cid:176)C) totdat zy een halfconfluente monocellulaire laag vor- men. Deze incubatieperiode is lang genoeg voor het herstel en de hechting van de cellen en voor exponentiºle groei. 1. 7. 3. 2. T w e e d e d a g Na incubatie het cultuurmedium van de cellen decanteren en tweemaal spoelen met 150 (cid:181)l EBSS/PBS per well. Voeg 100 (cid:181)l EBSS/PBS met de gewenste concentratie te onderzoeken stof dan wel enkel oplosmiddel (negatieve controle) toe. Breng 8 verschillende concentraties van de te onderzoeken stof aan. Incubeer de cel- len met de te onderzoeken stof in het donker gedurende 60 minuten (7,5 % CO2, 37 (cid:176)C). Voor het (+ UVA) deel van de test de cellen gedurende 50 minuten by kamertemperatuur door het deksel van de 96-wells-plaat bestralen met 1,7 mW/cm2 UVA (= 5 J/cm2). Ventileer met een ventilator om condensatie van H2O onder het deksel te voorkomen. Bewaar de duplicaatplaten (ﬂ UVA) by kamertemperatuur gedurende 50 minuten (= UVA-blootstellingstyd) in een donkere kast. Decanteer de testoplossing en spoel tweemaal met 150 (cid:181)l EBSS/PBS. Vervang EBSS/PBS door cultuurmedium en incubeer tot de volgende dag (18-22 h) (7,5 % CO2, 37 (cid:176)C). 1. 7. 3. 3. D e r d e d a g Microscopisch onderzoek Onderzoek de cellen onder een fasecontrastmicroscoop. Leg de morfologische veranderingen van de cellen als gevolg van de cytotoxische effecten van de onderzochte stof vast. Deze controle wordt aanbevolen om experi- mentele fouten uit te sluiten, maar deze gegevens worden niet gebruikt voor de beoordeling van de cytotoxi- citeit of fototoxiciteit. Opname van neutraalrood Spoel de cellen met 150 (cid:181)l voorverwarmde EBSS/PBS. Verwyder de spoeloplossing door voorzichtig af te tap- pen. Voeg 100 (cid:181)l NR medium toe en incubeer gedurende 3 uur op 37 (cid:176)C, in een gehumidificeerde atmosfeer met 7,5 % CO2. Na incubatie het NR-medium verwyderen en de cellen spoelen met 150 (cid:181)l EBSS/PBS. Decanteren en EBSS/PBS volledig met vloeipapier verwyderen. (Andere mogelykheid: omgekeerde plaat centrifugeren). Voeg precies 150 (cid:181)l NR-desorptieoplossing (vers bereid ethanol/azynzuur) toe. Schud de microtiterplaat gedurende 10 minuten snel op een microtiterplaatschudder totdat het NR uit de cel- len is geºxtraheerd en zich een homogene oplossing heeft gevormd. Meet de optische dichtheid van het NR-extract by 540 nm in een spectrofotometer, waarby de blanco’s als referentie worden gebruikt. Sla de gegevens in een geschikt bestandsformaat (bv. ASCII) op voor verdere ana- lyse. (1) Nadere gegevens zyn te vinden in referentie 12. 8. 6. 2000 NL Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen L 136/103 2. GEGEVENS 2. 1. Kwaliteit van de gegevens en aantal gegevens De gegevens moeten een zinvolle analyse van de met en zonder UVA/zichtbaar licht verkregen concentratie- responskrommen mogelyk maken. Als cytotoxiciteit wordt geconstateerd, moeten het concentratiebereik en de intervallen tussen de verschillende concentraties zo worden gekozen dat er een kromme aan de experimen- tele gegevens kan worden gefit. Aangezien het mogelyk is dat een onderzochte stof niet cytotoxisch is bene- den de voorgeschreven maximumconcentratie van 100 (cid:181)g/ml in het niet-belichte experiment (ﬂ UVA), maar zeer cytotoxisch by bestraling (+ UVA), kan het nodig zyn dat de concentratiebereiken die in beide onderdelen van het experiment moeten worden onderzocht, grootteordes verschillen om de vereiste kwaliteit van de gegevens te bereiken. Als in geen van beide onderdelen van het experiment (ﬂ UVA en + UVA), cytotoxiciteit wordt aangetroffen, volstaat een test met grote intervallen tussen de opeenvolgende doses tot aan de maxi- male concentratie. Een duidelyk positief resultaat hoeft niet in een herhalingsexperiment te worden geverifieerd. Evenmin hoeven duidelyk negatieve resultaten te worden geverifieerd, op voorwaarde dat de onderzochte stof by voldoende hoge concentraties was getest. In dergelyke gevallen volstaat ØØn groot experiment voorafgegaan door ØØn of meer voorbereidende experimenten om het concentratiebereik vast te stellen. Tests met onduidelyke resultaten in de nabyheid van de grenswaarde van het voorspellingsmodel moeten ter verificatie worden herhaald. Als herhaald testen nodig wordt geacht, kan het van belang zyn dat de experimentele omstandigheden wor- den gevarieerd om een duidelyk resultaat te bereiken. Een belangryke variabele in deze test is het bereiden van oplossingen van de onderzochte stof. By de herhaling van een test kan het dan ook essentieel zyn dat deze omstandigheden (co-solvent, verpulvering, sonificeren) worden gevarieerd. Een andere mogelykheid is de incubatietyd voor de bestraling te variºren. Een kortere tyd kan zinvol zyn voor stoffen die onstabiel zyn in water. 2. 2. Verwerking van de resultaten Waar mogelyk wordt bepaald by welke concentratie van een onderzochte stof 50 % inhibitie van de cellulaire NRU (EC50) optreedt. Dit kan worden gedaan door een geschikte niet-lineaire regressiemethode (by voorkeur een Hillfunctie of logistische regressie) toe te passen op de concentratieresponsgegevens of door andere fit- technieken toe te passen (14). Voordat een EC50-waarde voor verdere berekeningen wordt gebruikt, moet de kwaliteit van de fit worden gecontroleerd. Een andere mogelykheid is de EC50-waarde te bepalen met grafische fittechnieken. In dit geval wordt aanbevolen waarschynlykheidspapier (x-schaal: logaritmisch, y-schaal: probit) te gebruiken, aangezien de concentratie-responsfunctie na deze transformatie in veel gevallen nagenoeg lineair zal zyn. 2. 3. Beoordeling van de resultaten (voorspellende modellen) 2. 3. 1. Voorspellend model versie 1: foto-irritatiefactor (PIF) Als zowel met (+ UVA) als zonder (ﬂ UVA) licht volledige concentratieresponskrommen zyn verkregen, wordt een foto-irritatiefactor van (PIF) berekend met de volgende formule: PIF < 5, wyst erop dat er geen fototoxisch potentieel is, PIF ¯ 5 wyst erop dat er fototoxisch potentieel is. Als een stof alleen + UVA cytotoxisch is en ﬂ UVA getest geen cytotoxiciteit vertoont, kan de PIF niet worden berekend, hoewel het resultaat wyst op fototoxisch potentieel. In dergelyke gevallen kan een (cid:132)> PIF(cid:148) waarde worden berekend als de (ﬂ UV) cytotoxiciteitstest wordt uitgevoerd tot de hoogste testconcentratie (Cmax) en deze waarde wordt gebruikt om de (cid:132)> PIF(cid:148) waarde te berekenen. Als alleen een (cid:132)> PIF(cid:148) waarde kan worden verkregen, wyst elke waarde > 1 erop dat er fototoxisch potentieel is. Als er geen EC50 (ﬂ UV) en EC50 (+ UV) kunnen worden berekend omdat de stof zelfs by de hoogste testcon- centratie geen cytotoxiciteit vertoont, wyst dit erop dat er geen fototoxisch potentieel is. In dergelyke gevallen wordt een formele waarde (cid:132)PIF = *1(cid:148) gebruikt om het resultaat weer te geven: L 136/104 NL Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen 8. 6. 2000 Als alleen een (cid:132)PIF = *1(cid:148) kan worden verkregen, wyst dit erop dat er geen fototoxisch potentieel is. In de gevallen (b) en (c) moet by de voorspelling van het fototoxisch potentieel zorgvuldig rekening worden gehouden met de by de in vitro 3T3 NRU fototoxiciteitstest bereikte concentraties. 2. 3. 2. Voorspellend model versie 2: gemiddeld foto-effect (MPE) Een andere mogelykheid is om een nieuwe versie van het model voor de voorspelling van het fototoxische potentieel toe te passen, die is ontwikkeld door gebruik te maken van gegevens van de EU/Colipa-validerings- studie (15) en die in een latere studie van de in vitro fototoxiciteit van chemicaliºn voor UV-filters blind is getest (13). Dit model heeft geen last van de beperking van het PIF-model in gevallen waarin geen EC50 waarde kan worden verkregen. In dit model wordt het (cid:132)gemiddelde-foto-effect(cid:148) (MPE) gebruikt, een maat die is gebaseerd op de vergelyking van de volledige concentratieresponskrommen. Voor de toepassing van het MPE-model is speciale computersoftware ontwikkeld aan de Humboldt Universiteit (Berlyn), die kosteloos kan worden verkregen. 2. 4. Interpretatie van de resultaten Een positief resultaat van de in vitro 3T3 NRU fototoxiciteitstest (PIF ¯ 5 of MPE ¯ 0,1) wyst erop dat de onderzochte stof fototoxisch potentieel heeft. Als dit resultaat wordt verkregen by concentraties lager dan 10 (cid:181)g/ml, is het waarschynlyk dat de onderzochte stof ook onder verschillende blootstellingsomstandigheden in vivo fototoxisch is. Als alleen een positief resultaat wordt verkregen by de hoogste testconcentratie van 100 (cid:181)g/ml, kan het nodig zyn verder onderzoek te doen om het gevaar of de fototoxische potentie te bepa- len. Dit kan betekenen dat gegevens nodig zyn over penetratie, absorptie en eventuele accumulatie van de stof in de huid, of dat ter bevestiging een andere test op de stof moet worden uitgevoerd, byvoorbeeld met een humaan in vitro huidmodel. Een negatief resultaat van de in vitro 3T3 NRU fototoxiciteitstest (PIF < 5 of MPE < 0,1) wyst erop dat de onderzochte stof onder de toegepaste omstandigheden niet fototoxisch was voor de zoogdiercellen in de cul- tuur. In gevallen waarin de stof kon worden getest tot de hoogste concentratie van 100 (cid:181)g/ml, wyst een nega- tief resultaat erop dat de stof geen fototoxisch potentieel heeft en dat in vivo fototoxiciteit onwaarschynlyk mag worden geacht. In gevallen waarin by lagere concentraties identieke concentratietoxiciteitsresponsen (EC50 + UV en EC50 ﬂ UV) werden verkregen, kunnen de gegevens op dezelfde wyze worden ge(cid:239)nterpreteerd. Als echter geen toxiciteit is aangetoond (+ UV en ﬂ UV) en de concentraties als gevolg van de beperkte oplos- baarheid in water beperkt waren tot waarden lager dan 100 (cid:181)g/ml, valt te betwyfelen of de test geschikt is voor de betreffende stof en moet worden overwogen ter bevestiging een andere test uit te voeren (bv. met een in vitro huidmodel of een ex vivo huidmodel of een in vivo test). 3. RAPPORTAGE Testrapport Het testrapport moet de volgende informatie bevatten: Onderzochte stof: (cid:151) identificatiegegevens en CAS-nummer, indien bekend, (cid:151) fysische toestand en zuiverheid, (cid:151) fysisch-chemische eigenschappen die voor de test van belang zyn, (cid:151) stabiliteit en fotostabiliteit, indien bekend. Oplosmiddel: (cid:151) motivering van de keuze van het oplosmiddel, (cid:151) oplosbaarheid van de onderzochte stof in dit oplosmiddel, (cid:151) percentage oplosmiddel aanwezig in het behandelingsmedium (EBSS of PBS). Cellen: (cid:151) type en bron van de cellen, (cid:151) afwezigheid van mycoplasma’s, (cid:151) aantal celpassages indien bekend, (cid:151) UVA-gevoeligheid van de cellen, bepaald met de bestralingsapparatuur die in de in vitro 3T3 NRU foto- toxiciteitstest wordt gebruikt. Testomstandigheden (a) (cid:151) incubatie v(cid:243)(cid:243)r en na behandeling: (cid:151) type en samenstelling van het cultuurmedium, (cid:151) incubatieomstandigheden (CO2-concentratie, temperatuur, vochtigheid), (cid:151) incubatieduur (voorbehandeling, nabehandeling). 8. 6. 2000 NL Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen L 136/105 Testomstandigheden (b) (cid:151) behandeling met de stof: (cid:151) motivering van de keuze van de concentraties van de onderzochte stof die met en zonder bestraling met UV/zichtbaar licht zyn gebruikt, (cid:151) in geval van beperkte oplosbaarheid van de onderzochte stof en afwezigheid van cytotoxiciteit: moti- vering van de hoogste geteste concentratie, (cid:151) samenstelling van het behandelingsmedium (gebufferde zoutoplossing), (cid:151) duur van de chemische behandeling. Testomstandigheden (c) (cid:151) bestraling: (cid:151) motivering van de keuze van de lichtbron, (cid:151) spectrale bestralingskarakteristieken van de lichtbron, (cid:151) transmissie/absorptiekarakteristieken van de filters, (cid:151) karakteristieken van de radiometer en gegevens over de kalibratie ervan, (cid:151) afstand van de lichtbron tot het testsysteem, (cid:151) UVA-bestralingssterkte op deze afstand uitgedrukt in mW/cm2, (cid:151) duur van de blootstelling aan UV/zichtbaar licht, (cid:151) UVA-dosis (bestralingssterkte (cid:215) tyd), uitgedrukt in J/cm2, (cid:151) temperatuur waarby de celculturen tydens bestraling respectievelyk in het donker werden bewaard. Testomstandigheden (d) (cid:151) NRU test: (cid:151) samenstelling van NR-medium, (cid:151) duur van NR-incubatie, (cid:151) incubatieomstandigheden (CO2-concentratie, temperatuur, vochtigheid), (cid:151) NR-extractieomstandigheden (extractiemiddel, duur), (cid:151) golflengte voor spectrofotometrische bepaling van NR optische dichtheid, (cid:151) tweede golflengte (referentie) indien gebruikt, (cid:151) inhoud van de blancocuvetten van de spectrofotometer indien van toepassing. Resultaten: (cid:151) levensvatbaarheid van cellen bepaald by elke concentratie van de onderzochte stof, uitgedrukt in gemid- delde procentuele levensvatbaarheid ten opzichte van de controles, (cid:151) concentratieresponskrommen (concentratie onderzochte stof vs. relatieve levensvatbaarheid van cellen) verkregen in parallelle + UVA en ﬂ UVA-experimenten, (cid:151) gegevensanalyse van de concentratieresponskrommen: zo mogelyk berekening van EC50 (+ UVA) en EC50 (ﬂ UVA), (cid:151) vergelyking van de twee concentratieresponskrommen die zyn verkregen met respectievelyk zonder bestraling met UVA/zichtbaar licht, hetzy door berekening van de foto-irritatiefactor (PIF), hetzy door berekening van het gemiddelde foto-effect (MPE), (cid:151) classificatie van het fototoxische potentieel, (cid:151) criteria voor acceptatie van de test (a) (cid:151) parallelle negatieve controle: (cid:151) absolute levensvatbaarheid (optische dichtheid van NR-extract) bestraalde en niet-bestraalde cellen, (cid:151) bestaande gegevens m. b. t. negatieve controle: gemiddelde en standaarddeviatie, (cid:151) criteria voor acceptatie van de test (b) (cid:151) parallelle positieve controle: (cid:151) EC50(+ UVA) en EC50(ﬂ UVA) en PIF van voor positieve controle gebruikte stof, (cid:151) bestaande gegevens m. b. t. voor positieve controle gebruikte stof: EC50(+ UVA) and EC50(ﬂ UVA) en PIF: gemiddelde en standaarddeviatie. Bespreking van de resultaten. Conclusies. L 136/106 NL Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen 8. 6. 2000 4. REFERENTIES (1) Spielmann, H. , Balls, M. , D(cid:246)ring, B. , Holzh(cid:252)tter, H. G. , Kalweit, S. , Klecak, G. , L’Eplattenier, H. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Moldenhauer, F. , Moore, L. , Pape, W. , Pfannbecker, U. , Potthast, J. , De Sil- va, O. , Steiling, W. and Willshaw, A. ( 1994), EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay, Toxicology in Vitro 8, blz. 793-796. (2) Anon (1998), Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxi- city), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA 26, blz. 7-8. (3) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. W. , Pechovitch, G. , De Silva, O. , Holzh(cid:252)tter, H. G. , Clot- hier, R. , Desolle, P. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Pfannenbecker, U. , Potthast, J. M. , Csato, M. , Sladowski, D. , Steiling, W. and Brantom, P. (1998), EU/COLIPA (cid:132)In vitro phototoxicity(cid:148) validation study, results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test, Toxicology in Vitro 12, blz. 305-327. (4) OECD Test Guidelines Programme, ENV/MC/CHEM/TG(96)9: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria of Alternative Toxicological Test Methods, OECD Publications Office, Paris, 1996. (5) Lovell, W. W. (1993), A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential, Toxico- logy in Vitro 7, blz. 95-102. (6) Santamaria, L. and Prino, G. (1972), List of the photodynamic substances, Research progress in organic, biological and medicinal chemistry Vol. 3 Part 1, North Holland Publishing Co, Amsterdam, blz. XI-XXXV. (7) Spielmann, H. , Lovell, W. W. , H(cid:246)lzle, E. , Johnson, B. E. , Maurer, T. , Miranda, M. A. , Pape, W. J. W. , Sapora, O. and Sladowski, D. (1994), In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM workshop 2, ATLA 22, blz. 314-348. (8) Spikes, J. D. (1989), Photosensitization, The science of photobiology, edited by KC Smith, Plenum Press, New York, 2nd edition, blz. 79-110. (9) Borenfreund, E. and Puerner, J. A. (1985), Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption, Toxicology Letters 24, blz. 119-124. (10) Lambert L. A, Warner W. G. and Kornhauser A. (1996), Animal models for phototoxicity testing, Derma- totoxicology, edited by FN Marzulli and HI Maibach, published by Taylor & Francis, Washington DC, 5th Edition, blz. 515-530. (11) Tyrrell R. M. and Pidoux M (1987), Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cyto- toxicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocy- tes, Cancer Research 47, blz. 1825-1829. (12) ZEBET/ECVAM/COLIPA, Standard Operating Procedure: Balb/c 3T3 NRU Phototoxicity Test, drafted 23 December 1997 by M. Liebsch and approved 6 March 1998 by the Management Team of the EU/ COLIPA project (cid:132)In Vitro Photoirritation(cid:148). (13) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. W. , De Silva, O. , Holzh(cid:252)tter, H. G. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. and Pfannenbecker (1998), A Study on the Phototoxic Potential of UV Filter Chemicals from Annex VII of the EU Directive 76/768/EEC in the 3T3 NRU In Vitro Phototoxicity Test, ATLA 26, blz. 679-708. (14) Holzh(cid:252)tter, H. G. and Quedenau, J. (1995), Mathematical modelling of cellular responses to external sig- nals, Journal of Biological Systems 3, blz. 127-138. (15) Holzh(cid:252)tter, H. G. (1997), A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals, ATLA 25, blz. 445-462. 8. 6. 2000 NL Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen L 136/107 Aanhangsel


title: Komisjoni otsus, 25. aprill 2000, millega muudetakse otsust 1999/813/EÜ, milles sätestatakse Vietnami Sotsialistlikust Vabariigist pärit kalatoodete impordi eritingimused (teatavaks tehtud numbri K(2000) 1050 all)EMPs kohaldatav tekst

eurovoc_concepts:
Vietnam
fishery product
health certificate
import
originating product
veterinary inspection

formats: html pdf print

text: 03/29. kd ET Euroopa Liidu Teataja 95 32000D0331 13. 5. 2000 EUROOPA ÜHENDUSTE TEATAJA L 114/39 KOMISJONI OTSUS, 25. aprill 2000, millega muudetakse otsust 1999/813/EÜ, milles sätestatakse Vietnami Sotsialistlikust Vabariigist pärit kalatoodete impordi eritingimused (teatavaks tehtud numbri K(2000) 1050 all) (EMPs kohaldatav tekst) (2000/331/EÜ) EUROOPA ÜHENDUSTE KOMISJON, ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA OTSUSE: võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut, Artikkel 1 arvesse nõukogu 22. võttes aasta direktiivi 91/493/EMÜ, milles sätestatakse kalatoodete tootmise ja turule- tervishoiunõuded, (1) viimati muudetud direktiiviga viimise 97/79/EÜ, (2) eriti selle artikli 11 lõiget 1, juuli 1991. ning arvestades järgmist: 16. Komisjoni 1999/813/EÜ (3) Vabariigist pärit kalatoodete impordi eritingimused. otsusega novembri sätestatakse Vietnami Sotsialistlikust 1999. aasta Otsuse 1999/813/EÜ A lisas sätestatud veterinaartõendit, mis lisatakse Vietnami Sotsialistlikust Vabariigist pärit või sealt toodavate kalatoodete partiidele, muudetakse järgmiselt. 1. IV punkti täiendatakse järgmise punktiga: (milles “7. kui tegemist on külmutatud või töödeldud kahepoolme- liste karploomadega, on karploomad püütud komisjoni otsuse 2000/333/EÜ (*) sätestatakse impordi eritingimused nende Vietnami Sotsialistlikust Vabariigist pärit okasnahksete, mantelloomade ja meritigude suhtes, mida on sterilisee- ritud või kuumtöödeldud vastavalt komisjoni otsuse 93/25/EMÜ nõuetele) sätestatud heakskiidetud püügipiirkondadest. kahepoolmeliste karploomade, lisas Komisjon on vastu võtnud otsuse 2000/333/EÜ, (4) milles sätestatakse Vietnami Sotsialistlikust Vabariigist pärit okasnahksete, mantelloomade ja meritigude importimise eritingimused. kahepoolmeliste karploomade, Vietnami Sotsialistlik Vabariik soovib eksportida ühen- dusse selliseid külmutatud või töödeldud kahepoolmelisi karploomi, okasnahkseid, mantelloomi ja meritigusid, mida on steriliseeritud või kuumtöödeldud vastavalt komisjoni otsuse 93/25/EMÜ (5) (muudetud otsusega 97/275/EÜ (6)) nõuetele. (*) EÜT L 114, 13. 5. 2000, lk 42. ” 2. IV punkti viimane taane asendatakse järgmisega: “— allakirjutanud ametlik inspektor teatab, et on tutvunud direktiivide 91/492/EMÜ, 91/493/EMÜ, 92/48/EMÜ ja otsuste 93/25/EMÜ, 1999/813/EÜ ja 2000/333/EÜ sätetega. ” Käesolev otsus on adresseeritud liikmesriikidele. Artikkel 2 Seetõttu on vaja muuta otsuse 1999/813/EÜ A lisas sätestatud sanitaarsertifikaati. Brüssel, 25. aprill 2000 Käesoleva otsusega ettenähtud meetmed on kooskõlas alalise veterinaarkomitee arvamusega, Komisjoni nimel komisjoni liige David BYRNE (1) (2) (3) (4) (5) (1) EÜT L 268, 24. 9. 1991, lk 15. (2) EÜT L 24, 30. 1. 1998, lk 31. (3) EÜT L 315, 9. 12. 1999, lk 39. (4) EÜT L 114, 13. 5. 2000, lk 42. (5) EÜT L 16, 25. 1. 1993, lk 22. (6) EÜT L 108, 25. 4. 1997, lk 2


title: Komisijas Lēmums (2000. gada 25. aprīlis), ar ko nosaka īpašus nosacījumus, kas reglamentē tādu dzīvu gliemeņu, adatādaiņu, tunikātu un jūras gliemežu ievešanu, kuru izcelsme ir Vjetnamas Sociālistiskā Republika (izziņots ar dokumenta numuru C (2000) 1054)dokuments attiecas uz EEZ

eurovoc_concepts:
Vietnam
health control
import
mollusc
originating product

text: 96 LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 03/29. sēj. 32000D0333 L 114/42 EIROPAS KOPIENU OFICIĀLAIS VĒSTNESIS 13. 5. 2000. KOMISIJAS LĒMUMS (2000. gada 25. aprīlis), ar ko nosaka īpašus nosacījumus, kas reglamentē tādu dzīvu gliemeņu, adatādaiņu, tunikātu un jūras gliemežu ievešanu, kuru izcelsme ir Vjetnamas Sociālistiskā Republika (izziņots ar dokumenta numuru C (2000) 1054) (dokuments attiecas uz EEZ) (2000/333/EK) EIROPAS KOPIENU KOMISIJA, ņemot vērā Eiropas Kopienas dibināšanas līgumu, vērā Padomes 1991. gada ņemot jūlija Direktīvu 91/492/EEK, ar ko nosaka veselības nosacījumus dzīvu glie- meņu ražošanai un laišanai tirgū (1), kurā jaunākie grozījumi izdarīti ar Direktīvu 97/79/EK (2) un jo īpaši tās 9. panta 3. punkta b) apakšpunktu, 15. Komisijas eksperts ir veicis pārbaudes vizīti Vjetnamas Sociālistiskajā Republikā, lai pārbaudītu apstākļus, kādos zvejniecības produkti tiek ražoti, uzglabāti un nosūtīti uz Kopienu. Vjetnamas Sociālistiskās Republikas tiesību akti paredz, ka Valsts zvejniecības pārbaudes un kvalitātes nodroši- nāšanas centrs (Nafiqacen) ir atbildīgs par dzīvu glie- meņu, adatādaiņu, tunikātu un jūras gliemežu veterināro ekspertīzi un par ražošanas higiēnas un sanitāro apstākļu uzraudzību. Minētie tiesību akti pilnvaro Nafiqacen atļaut un aizliegt dzīvu gliemeņu, adatādaiņu, tunikātu un jūras gliemežu ievākšanu no dažām zonām. (6) (7) (8) un izplatīšanas zonām, nosūtīšanas apstiprināšanu un attīrīšanas centriem, un tautas veselības aizsardzību un ražošanas uzraudzību. Vjetnamas Sociālistiskā Republika atbilst iekļaušanai to trešo valstu sarakstā, kuras ievēro līdzvērtīgus nosacī- jumus, kas minēti Direktīvas 91/492/EEK 9. panta 3. punkta a) apakšpunktā. vēlas Sociālistiskā Republika Vjetnamas izvest uz Kopienu saldētas vai pārstrādātas gliemenes, adatādaiņus, tunikātus un jūras gliemežus, kuri sterilizēti vai termiski ar Komisijas Lēmumu 93/25/EEK (3), kas grozīts ar Lēmumu 97/275/EK (4). Šim nolūkam jāizraugās ražošanas apgabali, no kuriem var ievākt gliemenes, adatādaiņus, tunikātus un jūras gliemežus un izvest uz Kopienu. apstrādāti saskaņā ir Īpašie ievešanas nosacījumi piemērojami, neierobežojot lēmumus, kas pieņemti saskaņā ar Padomes 1991. gada 28. janvāra Direktīvu 91/67/EEK par veterinārsanitā- rajām prasībām, kas reglamentē akvakultūras dzīvnieku un produktu laišanu tirgū (5), kurā jaunākie grozījumi izdarīti ar Direktīvu 95/22/EEK (6). (9) Šajā lēmumā paredzētie pasākumi vīgās veterinārijas komitejas atzinumu, ir saskaņā ar Pastā- Nafiqacen un tā laboratorijas ir tiesīgas efektīvi novērtēt Vjetnamas Sociālistiskajā Republikā spēkā esošo likumu piemērošanu. IR PIEŅĒMUSI ŠO LĒMUMU. Vjetnamas Sociālistiskās Republikas kompetentās iestādes ir uzņēmušās regulāri un ātri paziņot Komisijai datus par toksīnus saturoša planktona klātbūtni ievākšanas zonās. 1. pants Vjetnamas Sociālistiskās Republikas kompetentās iestādes ir nodrošinājušas oficiālus apstiprinājumus par atbilstību Direktīvas 91/492/EEK pielikuma V nodaļā minētajiem noteikumiem un prasībām, kas līdzvērtīgas šajā direktīvā minētajām prasībām attiecībā uz produkcijas klasifikāciju (1) OV L 268, 24. 9. 1991. , 1. (2) OV L 24, 30. 1. 1998. , 31. lpp. lpp. Zivsaimniecības ministrijas Valsts zvejniecības pārbaudes un kvalitātes nodrošināšanas centrs (Nafiqacen) ir kompetentā Vjet- namas Sociālistiskās Republikas iestāde dzīvu gliemeņu, adat- ādaiņu, tunikātu un jūras gliemežu pārbaudei un sertifikācijai atbilstoši Direktīvas 91/492/EEK prasībām. (3) OV L 16, 25. 1. 1993. , 22. (4) OV L 108, 25. 4. 1997. , 52. (5) OV L 46, 19. 2. 1991. , 1. (6) OV L 243, 11. 10. 1995. , 1. lpp. lpp. lpp. lpp. tā kā: (1) (2) (3) (4) (5) 03/29. sēj. LV Eiropas Savienības Oficiālais Vēstnesis 97 Gliemenēm, adatādaiņiem, tunikātiem un jūras gliemežiem, kuru izcelsme ir Vjetnamas Sociālistiskajā Republikā un, kas paredzēti lietošanai pārtikā, jābūt no apstiprinātiem ražošanas apgabaliem, kuri minēti sarakstā šā lēmuma pielikumā. 2. pants 3. pants Šis lēmums ir adresēts dalībvalstīm. Briselē, 2000. gada 25. aprīlī Komisijas vārdā — Komisijas loceklis David BYRNE PIELIKUMS Numurs Nosaukums 01 02 03 04 05 TAN THANH BINH DAI BA MUM AN THUY CON TRAU


title: 2000/324/EG: Beschluß der Kommission vom 25. April 2000 über die Änderung des Beschlusses 1999/215/EG zur Annahme von Verpflichtungsangeboten im Zusammenhang mit den Antidumpingverfahren betreffend die Einfuhren von Binde- oder Pressengarnen aus Polypropylen mit Ursprung in Polen, der Tschechischen Republik und Ungarn und zur Einstellung des Verfahrens gegenüber solchen Einfuhren mit Ursprung in Saudi-Arabien (Bekanntgegeben unter Aktenzeichen K(2000) 1058)

eurovoc_concepts:
anti-dumping duty
import
manufactured goods
originating product
plastics
third country

text: 11. 5. 2000 DE Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften L 112/65 II (Nicht veröffentlichungsbedürftige Rechtsakte) KOMMISSION BESCHLUSS DER KOMMISSION vom 25. April 2000 über die Änderung des Beschlusses 1999/215/EG zur Annahme von Verpflichtungsangeboten im Zusammenhang mit den Antidumpingverfahren betreffend die Einfuhren von Binde- oder Pressen- garnen aus Polypropylen mit Ursprung in Polen, der Tschechischen Republik und Ungarn und zur Einstellung des Verfahrens gegenüber solchen Einfuhren mit Ursprung in Saudi-Arabien (Bekanntgegeben unter Aktenzeichen K(2000) 1058) (2000/324/EG) DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN — gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Gemeinschaft, gestützt auf die Verordnung (EG) Nr. 384/96 des Rates vom 22. Dezember 1995 über den Schutz gegen gedumpte Einfuhren aus nicht zur Europäischen Gemeinschaft gehörenden Ländern (1), zuletzt geändert durch die Verordnung (EG) Nr. 905/98 (2), insbesondere auf Artikel 8 Absatz 9, nach Konsultationen im Beratenden Ausschuß, in Erwägung nachstehender Gründe: A. VORAUSGEGANGENES VERFAHREN (1) (2) Im Rahmen eines Verfahrens, das durch die Veröffentlichung einer entsprechenden Bekanntmachung im Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften (3) eingeleitet wurde, führte der Rat mit der Verordnung (EG) Nr. 603/1999 (4) endgültige Antidumpingzölle auf die Einfuhren von Binde- oder Pressengarnen aus Polypropylen mit Ursprung in Polen, der Tschechischen Republik und Ungarn ein. Im Rahmen dieses Verfahrens nahm außerdem die Kommission mit dem Beschluß 1999/215/EG vom 16. März 1999 (5) eine unter anderem von dem polnischen Unternehmen WKI Isoliertechnik Spolka z. o. o (nachstehend „Unternehmen“ genannt) angebotene Preisverpflichtung an. B. RÜCKNAHME DER VERPFLICHTUNG (3) Das Unternehmen nahm jedoch diese Verpflichtung jetzt wegen Schwierigkeiten bei der Erfüllung bestimmter darin festgelegter Auflagen zurück. (1) ABl. L 56 vom 6. 3. 1996, S. 1. (2) ABl. L 128 vom 30. 4. 1998, S. 18. (3) ABl. C 1 vom 3. 1. 1998, S. 10. (4) ABl. L 75 vom 20. 3. 1999, S. 1. (5) ABl. L 75 vom 20. 3. 1999, S. 34. L 112/66 DE Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften 11. 5. 2000 (4) (5) Deswegen sollte der Beschluß 1999/215/EG geändert und der Name des Unternehmens von der Liste der Unternehmen, von denen in diesem Verfahren Verpflichtungen angenommen wurden, gestrichen werden. Parallel zu diesem Beschluß hat der Rat mit der Verordnung (EG) Nr. 968/2000 (1) die diesem Unternehmen gewährte Befreiung von den Antidumpingzöllen aufgehoben und einen endgültigen Antidumpingzoll eingeführt — BESCHLIESST: Artikel 1 Artikel 1 Absatz 1 von Beschluß 1999/215/EG erhält folgende Fassung: „(1) Die Verpflichtungsangebote der nachstehend genannten Hersteller im Rahmen der Antidumping- verfahren betreffend die Einfuhren von Binde- oder Pressengarnen aus Polypropylen mit Ursprung in Polen, der Tschechischen Republik und Ungarn in die Gemeinschaft werden angenommen. Land Unternehmen Taric-Zusatzcode Tschechische Republik Ungarn Juta a. s. Lanex a. s. Partium (cid:1)70 Rt Tiszai Vegyi Kombinat Rt Elso Magyar Kenderfono Rt Artikel 2 8596 8580 8581 8582 8583“ Dieser Beschluß tritt am Tag nach seiner Veröffentlichung im Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften in Kraft. Brüssel, den 25. April 2000 Für die Kommission Pascal LAMY Mitglied der Kommission (1) Siehe Seite 1 dieses Amtsblatts


title: 2000/332/CE: Decisione della Commissione, del 25 aprile 2000, recante modifica della decisione 97/20/CE che fissa l'elenco dei paesi terzi che soddisfano le condizioni di equivalenza delle norme di produzione e di commercializzazione dei molluschi bivalvi, degli echinodermi, dei tunicati e dei gasteropodi marini [notificata con il numero C(2000) 1052] (Testo rilevante ai fini del SEE)

eurovoc_concepts:
Vietnam
health control
import
marketing
mollusc
third country

text: L 114/40 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee 13. 5. 2000 DECISIONE DELLA COMMISSIONE del 25 aprile 2000 recante modifica della decisione 97/20/CE che fissa l'elenco dei paesi terzi che soddisfano le condizioni di equivalenza delle norme di produzione e di commercializzazione dei molluschi bivalvi, degli echinodermi, dei tunicati e dei gasteropodi marini [notificata con il numero C(2000) 1052] (Testo rilevante ai fini del SEE) (2000/332/CE) LA COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE, visto il trattato che istituisce la Comunità europea, vista la direttiva 91/492/CEE del Consiglio, del 15 luglio 1991, che stabilisce le norme sanitarie applicabili alla produzione e alla commercializzazione dei molluschi bivalvi vivi (1), modifi- cata da ultimo dalla direttiva 97/79/CE (2), in particolare l'arti- colo 9, punto 3, lettera b), considerando quanto segue: (1) (2) La decisione 97/20/CE della Commissione (3), modificata da ultimo dalla decisione 98/571/CE (4), fissa l'elenco dei paesi terzi dai quali è autorizzata l'importazione per il consumo umano di molluschi bivalvi, echinodermi, tuni- cati e gasteropodi marini sotto qualsiasi forma. La decisione 2000/333/CE della Commissione (5) stabi- lisce le condizioni particolari d'importazione di mollu- schi bivalvi, echinodermi, tunicati e gasteropodi marini socialista del Vietnam. originari della Repubblica Occorre pertanto modificare la decisione 97/20/CE, includendo la Repubblica socialista del Vietnam nella parte I dell'elenco. (3) sono Le misure previste dalla presente decisione conformi al parere del comitato veterinario permanente, HA ADOTTATO LA PRESENTE DECISIONE: Articolo 1 L'allegato della decisione 97/20/CE è sostituito dall'allegato della presente decisione. Articolo 2 Gli Stati membri sono destinatari della presente decisione. Fatto a Bruxelles, il 25 aprile 2000. Per la Commissione David BYRNE Membro della Commissione (1) GU L 268 del 24. 9. 1991, pag. 1. (2) GU L 24 del 30. 1. 1998, pag. 31. (3) GU L 6 del 10. 1. 1997, pag. 46. (4) GU L 277 del 14. 10. 1998, pag. 42. (5) Vedi pagina 42 della presente Gazzetta ufficiale. 13. 5. 2000 IT Gazzetta ufficiale delle Comunità europee L 114/41 ALLEGATO Elenco dei paesi terzi da cui è autorizzata l'importazione di molluschi bivalvi, echinodermi, tunicati e gastero- podi marini sotto qualsiasi forma e destinati all'alimentazione umana I. Paesi terzi oggetto di una decisione specifica in base alla direttiva 91/492/CEE del Consiglio AU CL Australia Cile MA Marocco PE VN KR TN TR Perù Repubblica socialista del Vietnam Corea del Sud Tunisia Turchia II. Paesi terzi che possono essere oggetto di una decisione provvisoria in base alla decisione 95/408/CE del Consiglio CA FO GL NZ TH Canada Isole Færoer Groenlandia Nuova Zelanda Thailandia (solamente per i prodotti sterilizzati o sottoposti a trattamento termico secondo le condizioni stabilite dalla decisione 93/25/CEE della Commissione) US Stati Uniti d'America


title: Verordnung (EG) Nr. 836/2000 der Kommission vom 25. April 2000 zur Festsetzung von Durchschnittswerten je Einheit für die Ermittlung des Zollwerts bestimmter verderblicher Waren

eurovoc_concepts:
customs valuation
fruit
perishable goods
vegetable

text: 27. 4. 2000 DE Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften L 102/9 VERORDNUNG (EG) Nr. 836/2000 DER KOMMISSION vom 25. April 2000 zur Festsetzung von Durchschnittswerten je Einheit für die Ermittlung des Zollwerts bestimmter verderblicher Waren DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN — gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Gemeinschaft, (2) gestützt auf die Verordnung (EWG) Nr. 2913/92 des Rates vom 12. Oktober 1992 zur Festlegung des Zollkodex der Gemein- schaften (1), zuletzt geändert durch die Verordnung (EG) Nr. 955/1999 des Europäischen Parlaments und des Rates (2), gestützt auf die Verordnung (EWG) Nr. 2454/93 der Kommis- sion vom 2. Juli 1993 mit Durchführungsvorschriften zu der Verordnung (EWG) Nr. 2913/92 zur Festlegung des Zollkodex der Gemeinschaften (3), zuletzt geändert durch die Verordnung (EG) Nr. 1662/1999 (4), insbesondere auf Artikel 173 Absatz 1, in Erwägung nachstehender Gründe: Klasseneinteilung gemäß Anhang Nr. 26 dieser Verord- nung festsetzt. Die Anwendung der in den obengenannten Artikeln fest- gelegten Regeln und Kriterien auf die der Kommission nach Artikel 173 Absatz 2 der genannten Verordnung mitgeteilten Angaben führt zu den im Anhang zur vorliegenden Verordnung festgesetzten Durchschnitts- werten je Einheit — HAT FOLGENDE VERORDNUNG ERLASSEN: Artikel 1 Die in Artikel 173 Absatz 1 der Verordnung (EWG) Nr. 2454/ 93 vorgesehenen Durchschnittswerte je Einheit werden wie im Anhang angegeben festgesetzt. (1) Die Artikel 173 bis 177 der Verordnung (EWG) Nr. 2454/93 sehen vor, daß die Kommission periodische Durchschnittswerte je Einheit für die Waren nach der Diese Verordnung tritt am 28. April 2000 in Kraft. Artikel 2 Diese Verordnung ist in allen ihren Teilen verbindlich und gilt unmittelbar in jedem Mitglied- staat. Brüssel, den 25. April 2000 Für die Kommission Erkki LIIKANEN Mitglied der Kommission (1) ABl. L 302 vom 19. 10. 1992, S. 1. (2) ABl. L 119 vom 7. 5. 1999, S. 1. (3) ABl. L 253 vom 11. 10. 1993, S. 1. (4) ABl. L 197 vom 29. 7. 1999, S. 25. L 102/10 DE Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften 27. 4. 2000 ANHANG Warenbezeichnung Durchschnittswerte je Einheit (Betrag)/100 kg netto Rubrik 1. 10 Ware, Art, KN-Code Frühkartoffeln/Erdäpfel 0701 90 50 1. 30 Speisezwiebeln (andere als Steckzwiebeln) 0703 10 19 1. 40 Knoblauch 0703 20 00 1. 50 Porree ex 0703 90 00 1. 60 1. 70 1. 80 1. 90 Blumenkohl/Karfiol 0704 10 00 Rosenkohl/Kohlsprossen 0704 20 00 Weißkohl und Rotkohl 0704 90 10 Brokkoli oder Spargelkohl (Brassica oleracea L. convar. italica Plenck) (L. ) Alef botrytis var. ex 0704 90 90 1. 100 Chinakohl ex 0704 90 90 1. 110 Kopfsalat 0705 11 10 1. 120 Endivien ex 0705 29 00 1. 130 Karotten und Speisemöhren ex 0706 10 00 1. 140 Radieschen ex 0706 90 90 1. 160 Erbsen (Pisum sativum) 0708 10 00 a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) EUR FIM SEK ATS FRF BEF/LUF DEM IEP GBP DKK ITL GRD NLG ESP PTE 45,79 272,24 377,49 30,90 183,71 254,73 630,06 300,35 1 847,10 425,16 202,68 1 246,42 126,64 752,96 1 044,04 1 742,59 830,70 5 108,62 45,99 273,47 379,18 55,28 328,68 455,74 59,69 354,90 492,10 37,17 221,01 306,45 105,95 629,95 873,47 63,11 375,22 520,27 632,89 301,70 1 855,39 760,67 362,61 2 229,99 821,35 391,54 2 407,89 511,49 243,83 1 499,49 1 457,90 694,99 4 274,01 868,38 413,96 2 545,75 152,67 907,73 1 258,64 2 100,79 1 001,45 6 158,69 21,82 129,74 179,89 43,48 258,49 358,42 300,25 143,13 880,22 598,23 285,18 1 753,78 129,01 767,08 1 063,62 1 775,28 846,28 5 204,42 406,91 2 419,37 3 354,64 5 599,19 2 669,15 16 414,68 89,55 36,06 27,17 60,43 24,33 18,33 247,68 99,74 75,15 89,96 36,22 27,29 108,12 43,54 32,80 116,74 47,01 35,42 72,70 29,27 22,06 207,22 83,44 62,87 123,43 49,70 37,45 298,60 120,24 90,59 42,68 17,18 12,95 85,03 34,24 25,80 252,33 101,61 76,56 795,85 320,47 241,46 341,31 88 658,51 15 357,40 100,90 7 618,53 9 179,73 230,32 59 826,68 10 363,16 68,09 5 140,98 6 194,47 943,98 245 207,88 42 474,82 279,08 21 071,01 25 388,90 342,84 89 056,61 15 426,35 101,36 7 652,74 9 220,95 412,06 107 037,01 18 540,91 121,82 9 197,82 11 082,64 444,94 115 575,96 20 020,03 131,54 9 931,58 11 966,77 277,08 71 973,67 12 467,25 81,91 6 184,78 7 452,18 789,76 205 147,81 35 535,63 233,48 17 628,60 21 241,07 470,41 122 193,16 21 166,26 139,07 10 500,20 12 651,92 1 138,02 295 610,34 51 205,52 336,44 25 402,15 30 607,59 162,65 42 249,41 7 318,43 48,08 3 630,54 4 374,52 324,07 84 179,53 14 581,55 95,81 7 233,65 8 715,97 961,69 249 806,52 43 271,40 284,31 21 466,17 25 865,04 3 033,14 136 477,38 896,71 787 886,27 67 704,01 81 577,99 27. 4. 2000 DE Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften L 102/11 Warenbezeichnung Durchschnittswerte je Einheit (Betrag)/100 kg netto Rubrik Ware, Art, KN-Code 1. 170 Bohnen: 1. 170. 1 Bohnen (Vigna-Arten, Phaseolus-Arten) ex 0708 20 00 1. 170. 2 Bohnen (Phaseolus Ssp, vulgaris var. Com- pressus Savi) ex 0708 20 00 1. 180 Dicke Bohnen ex 0708 90 00 1. 190 Artischocken 0709 10 00 1. 200 Spargel: 1. 200. 1 — grüner ex 0709 20 00 1. 200. 2 — anderer ex 0709 20 00 1. 210 Auberginen/Melanzani 0709 30 00 1. 220 Bleichsellerie, genannt (Apium graveolens L. , var. Dulce (Mill. ) Pers. ) auch Stangensellerie ex 0709 40 00 1. 230 Pfifferlinge/Eierschwammerl 0709 51 30 1. 240 Gemüsepaprika oder Paprika ohne brennenden Geschmack 0709 60 10 1. 250 Fenchel 0709 90 50 1. 270 Süße Kartoffeln, ganz, chen Verzehr bestimmt) 0714 20 10 frisch (zum menschli- 2. 10 Eßkastanien (Castanea-Arten), frisch ex 0802 40 00 2. 30 Ananas, frisch ex 0804 30 00 a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) EUR FIM SEK ATS FRF BEF/LUF DEM IEP GBP DKK ITL GRD NLG ESP PTE 142,45 847,00 1 174,42 1 960,22 934,44 5 746,60 139,06 826,81 1 146,44 1 913,51 912,17 5 609,67 157,74 937,88 1 300,44 2 170,55 1 034,71 6 363,22 — — — — — — 424,03 2 521,18 3 495,81 469,06 2 788,90 3 867,02 5 834,81 2 781,47 17 105,43 6 454,40 3 076,83 18 921,80 159,41 947,79 1 314,18 2 193,49 1 045,64 6 430,47 278,62 112,19 84,53 271,98 109,52 82,52 308,51 124,23 93,60 — — — 829,34 333,95 251,62 917,40 369,41 278,34 311,77 125,54 94,59 1 061,87 275 830,37 47 779,24 313,93 23 702,43 28 559,56 1 036,57 269 257,71 46 640,72 306,45 23 137,64 27 879,03 1 175,81 305 427,23 52 906,00 347,61 26 245,73 31 624,03 — — — — — — 3 160,78 142 220,50 934,44 821 041,41 70 553,07 85 010,88 3 496,41 157 322,46 1 033,67 908 225,26 78 044,88 94 037,93 1 188,24 308 655,19 53 465,14 351,29 26 523,11 31 958,25 50,02 297,40 412,37 688,28 328,10 2 017,76 97,83 39,39 29,68 372,85 96 850,10 16 776,34 110,23 8 322,44 10 027,89 1 699,80 10 106,55 14 013,49 23 389,76 11 149,96 68 569,76 3 324,52 1 338,70 1 008,66 12 670,48 570 112,92 282 822,92 3 745,87 340 779,30 3 291 271,75 225,26 1 339,35 1 857,11 3 099,68 1 477,63 9 087,07 73,55 437,31 606,36 1 012,07 482,46 2 967,00 53,79 319,81 443,44 740,15 352,83 2 169,83 176,48 1 049,30 1 454,94 2 428,42 1 157,63 7 119,19 66,58 395,84 548,86 916,10 436,71 2 685,64 440,58 177,41 133,67 143,85 57,93 43,64 105,20 42,36 31,92 345,16 138,99 104,72 130,21 52,43 39,51 1 679,13 436 169,41 75 553,11 496,41 37 480,56 45 161,12 548,25 142 412,66 24 668,67 162,08 12 237,69 14 745,45 400,95 104 149,25 18 040,70 118,53 8 949,67 10 783,65 1 315,50 341 712,93 59 191,39 388,91 29 363,80 35 381,06 496,26 128 907,95 22 329,39 146,71 11 077,21 13 347,17 L 102/12 DE Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften 27. 4. 2000 Warenbezeichnung Durchschnittswerte je Einheit (Betrag)/100 kg netto Rubrik 2. 40 Ware, Art, KN-Code Avocadofrüchte, frisch ex 0804 40 00 2. 50 Mangofrüchte und Guaven, frisch ex 0804 50 00 2. 60 Süßorangen, frisch: 2. 60. 1 — Blut- und Halbblutorangen 0805 10 10 2. 60. 2 — Navels, Navelines, Navelates, Salustianas, Vernas, Valencia lates, Maltaises, Shamoutis, Ovalis, Trovita, Hamlins 0805 10 30 2. 60. 3 — andere 0805 10 50 2. 70 Mandarinen (einschließlich Tangerinen und Satsumas), Clementinen, Wilkings und ähnliche Kreuzungen von Zitrusfrüchten, frisch: frisch; 2. 70. 1 — Clementinen 0805 20 10 2. 70. 2 — Monreales und Satsumas 0805 20 30 2. 70. 3 — Mandarinen und Wilkings 0805 20 50 2. 70. 4 — Tangerinen und andere ex 0805 20 70 ex 0805 20 90 2. 85 Limetten (Citrus aurantifolia), frisch ex 0805 30 90 2. 90 Pampelmusen und Grapefruits, frisch: 2. 90. 1 — weiß ex 0805 40 00 2. 90. 2 — rosa ex 0805 40 00 2. 100 Tafeltrauben ex 0806 10 10 a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) EUR FIM SEK ATS FRF BEF/LUF DEM IEP GBP DKK ITL GRD NLG ESP PTE 127,03 755,31 1 047,29 1 748,02 833,29 5 124,53 132,26 786,36 1 090,35 1 819,89 867,55 5 335,23 248,46 100,05 75,38 258,67 104,16 78,48 946,92 245 971,54 42 607,10 279,95 21 136,63 25 467,97 985,86 256 084,87 44 358,93 291,46 22 005,68 26 515,11 — — — — — — — — — — — — — — — — — — 42,76 254,21 352,48 67,30 400,15 554,84 43,57 259,04 359,18 67,84 403,34 559,27 588,32 280,46 1 724,74 926,08 441,46 2 714,91 599,49 285,78 1 757,49 933,47 444,99 2 736,56 144,61 859,79 1 192,16 1 989,83 948,56 5 833,41 53,03 315,32 437,22 55,89 332,30 460,76 729,76 347,88 2 139,37 769,05 366,61 2 254,56 135,33 804,65 1 115,71 1 862,22 887,72 5 459,30 — — — — — — — — — 83,62 33,67 25,37 131,63 53,00 39,94 85,21 34,31 25,85 132,68 53,43 40,25 282,83 113,89 85,81 103,72 41,77 31,47 109,31 44,02 33,16 264,69 106,58 80,31 — — — — — — — — — — — — — — — — — — 318,70 82 785,61 14 340,09 94,22 7 113,87 8 571,65 501,67 130 312,71 22 572,72 148,31 11 197,93 13 492,62 324,75 84 357,48 14 612,37 96,01 7 248,94 8 734,40 505,67 131 351,91 22 752,73 149,49 11 287,23 13 600,22 1 077,91 279 997,03 48 500,99 318,67 24 060,48 28 990,98 395,32 102 687,18 17 787,44 116,87 8 824,03 10 632,26 416,60 108 216,58 18 745,24 123,16 9 299,18 11 204,78 1 008,78 262 040,45 45 390,55 298,23 22 517,45 27 131,75 27. 4. 2000 DE Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften L 102/13 Warenbezeichnung Durchschnittswerte je Einheit (Betrag)/100 kg netto Rubrik Ware, Art, KN-Code 2. 110 Wassermelonen 0807 11 00 2. 120 andere Melonen: 2. 120. 1 — Amarillo, Cuper, Honey Dew (einschließlich Cantalene), Onteniente, Sapo (einschließlich Verde Liso), Rochet, Tendral, Futuro ex 0807 19 00 Piel de 2. 120. 2 — andere ex 0807 19 00 2. 140 Birnen 2. 140. 1 Birnen — Nashi (Pyrus pyrifolia) ex 0808 20 50 2. 140. 2 Andere ex 0808 20 50 2. 150 Aprikosen/Marillen ex 0809 10 00 2. 160 Kirschen 0809 20 95 0809 20 05 2. 170 Pfirsiche 0809 30 90 2. 180 Nektarinen ex 0809 30 10 2. 190 Pflaumen 0809 40 05 2. 200 Erdbeeren 0810 10 00 2. 205 Himbeeren 0810 20 10 2. 210 Heidelbeeren der Art Vaccinium myrtillus 0810 40 30 2. 220 Kiwifrüchte (Actinidia chinensis Planch. ) 0810 50 00 a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) EUR FIM SEK ATS FRF BEF/LUF DEM IEP GBP DKK ITL GRD NLG ESP PTE 93,14 553,78 767,85 1 281,61 610,95 3 757,20 182,16 73,35 55,27 694,26 180 341,28 31 238,65 205,25 15 496,94 18 672,59 70,10 416,80 577,92 151,51 900,83 1 249,07 964,60 459,83 2 827,84 2 084,80 993,83 6 111,83 235,00 1 397,25 1 937,39 77,79 462,51 641,31 3 233,67 1 541,50 9 479,88 1 070,40 510,26 3 138,01 495,26 2 944,68 4 083,02 6 814,93 3 248,69 19 978,74 377,09 2 242,08 3 108,81 5 188,87 2 473,55 15 211,77 172,80 1 027,42 1 424,59 2 377,77 1 133,49 6 970,71 180,52 1 073,31 1 488,22 2 483,97 1 184,11 7 282,04 191,38 1 137,89 1 577,77 2 633,44 1 255,37 7 720,24 335,93 1 997,34 2 769,46 4 622,48 2 203,55 13 551,32 137,10 55,21 41,60 296,32 119,32 89,91 459,62 185,08 139,45 152,14 61,26 46,16 968,64 390,05 293,89 737,52 296,98 223,77 337,97 136,09 102,54 353,06 142,17 107,12 374,31 150,72 113,56 657,02 264,57 199,34 522,54 135 733,30 23 511,67 154,48 11 663,73 14 053,87 1 129,36 293 361,17 50 815,92 333,88 25 208,88 30 374,71 1 751,71 455 023,45 78 819,00 517,87 39 100,71 47 113,27 579,85 150 620,89 26 090,50 171,42 12 943,03 15 595,33 3 691,72 166 110,20 1 091,41 958 957,08 82 404,33 99 290,72 2 810,87 126 475,99 831,00 730 148,05 62 742,50 75 599,76 1 288,06 334 586,29 57 956,92 380,80 28 751,40 34 643,17 1 345,59 349 529,85 60 545,44 397,81 30 035,52 36 190,43 1 426,56 370 562,97 64 188,78 421,75 31 842,92 38 368,21 2 504,04 112 670,42 740,29 650 448,28 55 893,80 67 347,62 750,86 4 464,41 6 190,24 10 332,06 4 925,32 30 289,62 1 468,55 591,35 445,56 5 596,99 251 838,44 124 932,59 1 654,68 150 533,91 1 453 867,69 1 822,37 10 835,32 15 023,98 25 076,36 11 953,96 73 514,22 3 564,25 1 435,23 1 081,39 13 584,13 611 222,90 303 216,85 4 015,97 365 352,38 3 528 600,36 108,32 644,03 892,99 1 490,48 710,51 4 369,51 211,85 85,31 64,28 807,41 209 731,54 36 329,62 238,70 18 022,48 21 715,67 L 102/14 DE Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften 27. 4. 2000 Warenbezeichnung Durchschnittswerte je Einheit (Betrag)/100 kg netto Rubrik Ware, Art, KN-Code 2. 230 Granatäpfel ex 0810 90 85 2. 240 Kakis (einschließlich Sharon) ex 0810 90 85 2. 250 Litschi-Pflaumen ex 0810 90 30 a) b) c) a) b) c) a) b) c) a) b) c) EUR FIM SEK ATS FRF BEF/LUF DEM IEP GBP DKK ITL GRD NLG ESP PTE 347,17 2 064,18 2 862,14 4 777,16 2 277,29 14 004,80 310,96 1 848,87 2 563,59 4 278,87 2 039,75 12 543,99 453,05 2 693,70 3 735,02 6 234,08 2 971,80 18 275,92 679,01 273,42 206,01 608,18 244,90 184,52 886,09 356,80 268,84 2 587,84 116 440,82 765,06 672 214,86 57 764,23 69 601,34 2 317,91 104 295,11 685,26 602 097,48 51 738,96 62 341,36 3 377,07 151 952,37 998,39 877 223,64 75 380,88 90 828,01


title: Komission asetus (EY) N:o 828/2000, annettu 25 päivänä huhtikuuta 2000, siipikarjanliha-alan vientitukien muuttamisesta

eurovoc_concepts:
export refund
poultrymeat

formats: pdf print

text: L 101/24 FI Euroopan yhteisöjen virallinen lehti 26. 4. 2000 KOMISSION ASETUS (EY) N:o 828/2000, annettu 25 päivänä huhtikuuta 2000, siipikarjanliha-alan vientitukien muuttamisesta EUROOPAN YHTEISÖJEN KOMISSIO, joka ottaa huomioon Euroopan yhteisön perustamissopimuksen, ottaa huomioon siipikarjanliha-alan yhteisestä markkinajärjeste- lystä 29 päivänä lokakuuta 1975 annetun neuvoston asetuksen (ETY) N:o 2777/75 (1), sellaisena kuin se on viimeksi muutet- tuna komission asetuksella (EY) N:o 2916/95 (2), ja erityisesti sen 8 artiklan 3 kohdan, sekä katsoo seuraavaa: (1) (2) Siipikarjanliha-alan vahvistetaan komission asetuksessa 2000 (3). vientiin sovellettavat tuet (EY) N:o 553/ Asetuksen (ETY) N:o 2777/75 8 artiklassa mainittujen perusteiden käytettävissä oleviin tietoihin seuraa, että nykyisin voimassa olevat soveltamisesta komission vientituet olisi muutettava tämän asetuksen liitteen mukaisesti, ON ANTANUT TÄMÄN ASETUKSEN: 1 artikla Muutetaan asetuksen (ETY) N:o 2777/75 1 artiklan 1 kohdassa tarkoitettujen tuotteiden asetuksen (EY) N:o 553/2000, sellai- sena kuin se on muutettuna, liitteessä vahvistetut vientituet tämän asetuksen liitteen mukaisesti. 2 artikla Tämä asetus tulee voimaan 26 päivänä huhtikuuta 2000. Tämä asetus on kaikilta osiltaan velvoittava, ja sitä sovelletaan sellaisenaan kaikissa jäsenval- tioissa. Tehty Brysselissä 25 päivänä huhtikuuta 2000. Komission puolesta Franz FISCHLER Komission jäsen (1) EYVL L 282, 1. 11. 1975, s. 77. (2) EYVL L 305, 19. 12. 1995, s. 49. (3) EYVL L 67, 15. 3. 2000, s. 32. 26. 4. 2000 FI Euroopan yhteisöjen virallinen lehti L 101/25 siipikarjanliha-alan vientitukien muuttamisesta 25 päivänä huhtikuuta 2000 annettuun komission asetukseen LIITE Tuotekoodi Tuen määräpaikka (1) 0207 12 10 9900 0207 12 90 9190 0207 12 90 9990 02 03 02 03 02 03 Tuen määrä EUR/100 kg 28,00 25,00 28,00 25,00 28,00 25,00 (1) Määräpaikat ovat: 02 Angola, Saudi-Arabia, Kuwait, Bahrain, Qatar, Oman, Arabiemiirikunnat, Jordania, Jemen, Libanon, Irak ja Iran, 03 Armenia, Azerbaidžan, Valko-Venäjä, Georgia, Kazakstan, Kirgisia, Moldova, Venäjä, Tadžikistan, Turkmenistan, Uzbekistan ja Ukraina. Huom: Tuotekoodit ja alaviitteet määritellään komission asetuksessa (ETY) N:o 3846/87, sellaisena kuin se on muutettuna


title: Commission Regulation (EC) No 830/2000 of 25 April 2000 amending representative prices and additional duties for the import of certain products in the sugar sector

eurovoc_concepts:
CCT duties
import
representative price
sugar
sugar product

text: 26. 4. 2000 EN Official Journal of the European Communities L 101/29 COMMISSION REGULATION (EC) No 830/2000 of 25 April 2000 amending representative prices and additional duties for the import of certain products in the sugar sector THE COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES, Having regard to the Treaty establishing the European Community, (2) Having regard to Council Regulation (EC) No 2038/1999 of 13 September 1999 on the common organization of the markets in the sugar sector (1), Having regard to Commission Regulation (EC) No 1423/95 of 23 June 1995 laying down detailed implementing rules for the import of products in the sugar sector other than molasses (2), as last amended by Regulation (EC) No 624/98 (3), and in particular the second subparagraph of Article 1(2), and Article 3(1) thereof, Whereas: (EC) No 1441/1999 (4), as last amended by Regulation (EC) No 806/2000 (5). It follows from applying the general and detailed fixing rules contained in Regulation (EC) No 1423/95 to the information known to the Commission that the repres- entative prices and additional duties at present in force should be altered to the amounts set out in the Annex hereto, HAS ADOPTED THIS REGULATION: Article 1 The representative prices and additional duties on imports of the products referred to in Article 1 of Regulation (EC) No 1423/95 shall be as set out in the Annex hereto. (1) The amounts of the representative prices and additional duties applicable to the import of white sugar, raw sugar and certain syrups are fixed by Commission Regulation This Regulation shall enter into force on 26 April 2000. Article 2 This Regulation shall be binding in its entirety and directly applicable in all Member States. Done at Brussels, 25 April 2000. For the Commission Franz FISCHLER Member of the Commission (1) OJ L 252, 25. 9. 1999, p. 1. (2) OJ L 141, 24. 6. 1995, p. 16. (3) OJ L 85, 20. 3. 1998, p. 5. (4) OJ L 166, 1. 7. 1999, p. 77. (5) OJ L 96, 18. 4. 2000, p. 42. L 101/30 EN Official Journal of the European Communities 26. 4. 2000 to the Commission Regulation of 25 April 2000 amending representative prices and the amounts of additional duties applicable to imports of white sugar, raw sugar and products covered by CN code 1702 90 99 ANNEX CN code 1701 11 10 (1) 1701 11 90 (1) 1701 12 10 (1) 1701 12 90 (1) 1701 91 00 (2) 1701 99 10 (2) 1701 99 90 (2) 1702 90 99 (3) Amount of representative prices per 100 kg net of product concerned Amount of additional duty per 100 kg net of product concerned (EUR) 16,46 16,46 16,46 16,46 20,37 20,37 20,37 0,20 8,12 14,42 7,89 13,91 16,15 10,70 10,70 0,44 (1) For the standard quality as defined in Article 1 of amended Council Regulation (EEC) No 431/68 (OJ L 89, 10. 4. 1968, p. 3). (2) For the standard quality as defined in Article 1 of Council Regulation (EEC) No 793/72 (OJ L 94, 21. 4. 1972, p. 1). (3) By 1 % sucrose content