title: Kommissionens direktiv 2000/33/EG av den 25 april 2000 om anpassning till tekniska framsteg för tjugosjunde gången av rådets direktiv 67/548/EEG om tillnärmning av lagar och andra författningar om klassificering, förpackning och märkning av farliga ämnen (Text av betydelse för EES.)

eurovoc_concepts:
analytical chemistry
approximation of laws
chemical product
cytology
toxicology

text: L 136/90 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning 8. 6. 2000 KOMMISSIONENS DIREKTIV 2000/33/EG av den 25 april 2000 om anpassning till tekniska framsteg f(cid:246)r tjugosjunde g(cid:229)ngen av r(cid:229)dets direktiv 67/548/EEG om tilln(cid:228)rmning av lagar och andra f(cid:246)rfattningar om klassificering, f(cid:246)rpackning och m(cid:228)rkning av farliga (cid:228)mnen (*) (Text av betydelse f(cid:246)r EES) EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIV H˜RIGENOM F(cid:214)RESKRIVS F(cid:214)LJANDE. Artikel 1 med beaktande av F(cid:246)rdraget om uppr(cid:228)ttandet av Europeiska gemenskapen, Texten i bilagorna 1 och 2 till detta direktiv skall l(cid:228)ggas till i avsnitt B i bilaga V till direktiv 67/548/EEG. med beaktande av r(cid:229)dets direktiv 67/548/EEG av den 27 juni 1967 om tilln(cid:228)rmning av lagar och andra f(cid:246)rfattningar om klassificering, f(cid:246)rpackning och m(cid:228)rkning av farliga (cid:228)mnen (1), senast (cid:228)ndrat genom Europaparlamentets och r(cid:229)dets direktiv 1999/33/EG (2), s(cid:228)rskilt artikel 28 i detta, och av f(cid:246)ljande sk(cid:228)l: (1) (2) I bilaga V till direktiv 67/548/EEG fastst(cid:228)lls metoderna f(cid:246)r best(cid:228)mning av (cid:228)mnens och preparats fysikalisk-kemiska egenskaper, toxicitet och ekotoxicitet. Denna bilaga m(cid:229)ste anpassas till tekniska framsteg. I artikel 7. 2 i direktiv 86/609/EEG (3) om tilln(cid:228)rmning av medlemsstaternas lagar och andra f(cid:246)rfattningar om skydd av djur som anv(cid:228)nds f(cid:246)r f(cid:246)rs(cid:246)k och andra vetenskapliga (cid:228)ndam(cid:229)l f(cid:246)reskrivs f(cid:246)ljande: (cid:148)Ett f(cid:246)rs(cid:246)k skall inte genom- f(cid:246)ras om det avsedda syftet kan uppn(cid:229)s med hj(cid:228)lp av n(cid:229)gon annan vetenskapligt tillfredsst(cid:228)llande metod som inte inbegriper anv(cid:228)ndning av djur men ter sig rimlig och praktiskt genomf(cid:246)rbar. (cid:148) (3) Kommissionen har f(cid:246)r avsikt att i bilaga V till direktiv 67/548/EEG inf(cid:246)ra alternativa testmetoder som inte inbe- griper anv(cid:228)ndning av djur f(cid:246)r att dessa metoder skall kunna anv(cid:228)ndas f(cid:246)r att testa kemiska (cid:228)mnen. (4) De (cid:229)tg(cid:228)rder som f(cid:246)reskrivs i detta direktiv (cid:228)r f(cid:246)renliga med yttrandet fr(cid:229)n KommittØn f(cid:246)r anpassning till teknisk utveckling av direktiven om avskaffandet av tekniska han- delshinder f(cid:246)r farliga (cid:228)mnen och preparat. Artikel 2 1. Medlemsstaterna skall s(cid:228)tta i kraft de lagar och andra f(cid:246)r- fattningar som (cid:228)r n(cid:246)dv(cid:228)ndiga f(cid:246)r att f(cid:246)lja detta direktiv senast den 1 oktober 2001 och skall genast underr(cid:228)tta kommissionen om detta. N(cid:228)r en medlemsstat antar dessa best(cid:228)mmelser skall de inneh(cid:229)lla en h(cid:228)nvisning till detta direktiv eller (cid:229)tf(cid:246)ljas av en s(cid:229)dan h(cid:228)n- visning n(cid:228)r de offentligg(cid:246)rs. N(cid:228)rmare f(cid:246)reskrifter om hur h(cid:228)n- visningen skall g(cid:246)ras skall varje medlemsstat sj(cid:228)lv utf(cid:228)rda. 2. Medlemsstaterna skall till kommissionen (cid:246)verl(cid:228)mna tex- terna till de centrala best(cid:228)mmelser i nationell lagstiftning som de antar inom det omr(cid:229)de som omfattas av detta direktiv och en tabell d(cid:228)r detta direktiv j(cid:228)mf(cid:246)rs med de nationella best(cid:228)m- melser som antagits. Artikel 3 Detta direktiv tr(cid:228)der i kraft den tredje dagen efter det att det har offentliggjorts i Europeiska gemenskapernas officiella tidning. Artikel 4 Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna. Utf(cid:228)rdat i Bryssel den 25 april 2000. P(cid:229) kommissionens v(cid:228)gnar Margot WALLSTR(cid:214)M Ledamot av kommissionen (*) Antagen f(cid:246)re den tyugosj(cid:228)tte anpassningen. (1) EGT 196, 16. 8. 1967, s. 1. (2) EGT L 199, 30. 7. 1999, s. 57. (3) EGT L 358, 18. 12. 1986, s. 1. 8. 6. 2000 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning L 136/91 BILAGA I (cid:148)B. 40. HUDKORROSIVITET 1 METOD 1. 1 Inledning Europeiska centret f(cid:246)r validering av alternativa provningsmetoder (ECVAM, Gemensamma forskningscentret, Europeiska kommissionen) har bed(cid:246)mt tv(cid:229) in vitro-test f(cid:246)r hudkorrosivitet (cid:150) best(cid:228)mning av transkutant elektriskt motst(cid:229)nd i r(cid:229)tthud (TER) och ett test d(cid:228)r en modell av human hud anv(cid:228)nds (cid:150) som vetenskapligt validerade (1) (2) (3). Vid ECVAM-valideringsstudien p(cid:229)visades att b(cid:229)da testerna gav tillf(cid:246)rlitliga resultat n(cid:228)r det g(cid:228)llde att skilja mellan k(cid:228)nda korrosiva och icke-korrosiva (cid:228)mnen. Med f(cid:246)rs(cid:246)ksprotokollet baserat p(cid:229) modell av human hud kunde man dessutom framg(cid:229)ngsrikt skilja mellan olika grader av korrosivitet (k(cid:228)nda starkt korrosiva (cid:228)mnen, R35 och andra korrosiva (cid:228)mnen, R34) (2). F(cid:246)religgande dokument inneh(cid:229)ller beskriv- ningar och f(cid:246)rfaranden f(cid:246)r b(cid:229)da testerna. Valet av test f(cid:246)r ett visst (cid:228)ndam(cid:229)l beror p(cid:229) anv(cid:228)ndarens specifika krav och preferenser. Se (cid:228)ven Allm(cid:228)n inledning, del B. 1. 2 Definitioner HUDKORROSIVITET: f(cid:246)rm(cid:229)gan hos ett test(cid:228)mne som har applicerats p(cid:229) huden att framkalla irreversibla v(cid:228)v- nadsskador. 1. 3 Referens(cid:228)mnen Inga referens(cid:228)mnen har specificerats. Se dock punkterna 1. 5. 3. 4 och 1. 7. 2. 3. 1. 4 Princip f(cid:246)r testmetoden (cid:150) Best(cid:228)mning av TER i r(cid:229)tthud Test(cid:228)mnet appliceras och f(cid:229)r verka upp till 24 timmar p(cid:229) ytan av hudbitar fr(cid:229)n humant avlivade unga r(cid:229)ttor. Korrosiva (cid:228)mnen identifieras genom sin f(cid:246)rm(cid:229)ga att framkalla skador p(cid:229) hudens hornlager och st(cid:246)rningar i den normala barri(cid:228)rfunktionen, vilket kan fastst(cid:228)llas som en s(cid:228)nkning av hudens transkutana elektriska mot- st(cid:229)nd (TER) under ett tr(cid:246)skelv(cid:228)rde (5 kh) (4) (5). Irriterande och icke-irriterande material framkallar ingen s(cid:228)nkning av TER under tr(cid:246)skelv(cid:228)rdet. F(cid:246)r surfaktanter och neutrala organiska (cid:228)mnen kan testf(cid:246)rfarandet kom- pletteras med ett f(cid:228)rg(cid:228)mnesbindningssteg (f(cid:246)r definition, se h(cid:228)nvisning (6)) i syfte att minska antalet falska positiva resultat som ofta f(cid:229)s med dessa kemikalietyper (2) (7). 1. 5 Beskrivning av testmetoden (cid:150) best(cid:228)mning av TER i r(cid:229)tthud 1. 5. 1 Djur F(cid:246)r beredningen av hudbitar beh(cid:246)vs unga r(cid:229)ttor (20(cid:150)23 dagar, Wistar eller motsvarande stam). R(cid:229)ttornas rygg- och flankh(cid:229)r avl(cid:228)gsnas omsorgsfullt med en liten p(cid:228)lsklippningsmaskin. Djuren tv(cid:228)ttas genom omsorgs- full avtorkning och det h(cid:229)rl(cid:246)sa omr(cid:229)det dr(cid:228)nks med antibiotikal(cid:246)sning (som kan inneh(cid:229)lla t. ex. streptomycin, penicillin, kloramfenikol eller amfotericin i tillr(cid:228)cklig koncentration f(cid:246)r att hindra bakterietillv(cid:228)xt). Djuren tv(cid:228)ttas p(cid:229) nytt med antibiotika tre eller fyra dagar efter den f(cid:246)rsta tv(cid:228)tten och m(cid:229)ste d(cid:228)refter anv(cid:228)ndas inom 3 dagar (djur som anv(cid:228)nds f(cid:246)r beredning av hudbitar f(cid:229)r inte vara (cid:228)ldre (cid:228)n 31 dagar). 1. 5. 2 Beredning av hudbitar Djuren avlivas p(cid:229) humant s(cid:228)tt. Rygghuden fr(cid:229)n varje djur tas tillvara och allt (cid:246)verskottsfett avl(cid:228)gsnas omsorgsfullt. Huden placeras (cid:246)ver (cid:228)ndan av ett r(cid:246)r av PTFE (polytetrafluoroetylen) med epidermisytan mot r(cid:246)ret. En O-ring av gummi trycks (cid:246)ver r(cid:246)rets (cid:228)nda f(cid:246)r att h(cid:229)lla hudbiten p(cid:229) plats och (cid:246)verskottshud trimmas bort. R(cid:246)rets och O-ringens m(cid:229)tt framg(cid:229)r av figur 1. D(cid:228)refter f(cid:246)rseglas O-ringen omsorgsfullt till PTFE-r(cid:246)ret med paraffin. R(cid:246)ret st(cid:246)ds av en fj(cid:228)derkl(cid:228)mma innanf(cid:246)r en receptorkammare som inneh(cid:229)ller magnesiumsulfat- l(cid:246)sning (154 mM) (figur 2). 1. 5. 3 Testf(cid:246)rfarande 1. 5. 3. 1 A p p l i c e r i n g a v t e s t (cid:228) m n e Test(cid:228)mnen i v(cid:228)tskeform (150 (cid:181)l) appliceras p(cid:229) epidermisytan inuti r(cid:246)ret (figur 2). Vid testning av (cid:228)mnen i fast form appliceras en tillr(cid:228)cklig m(cid:228)ngd f(cid:246)r att s(cid:228)kerst(cid:228)lla att hela epidermisytan t(cid:228)cks. D(cid:228)refter tillf(cid:246)rs avjoniserat vatten (150 (cid:181)l) p(cid:229) det fasta (cid:228)mnet och r(cid:246)ret omskakas varsamt. Test(cid:228)mnet b(cid:246)r ha maximal kontakt med huden. F(cid:246)r vissa fasta (cid:228)mnen kan detta uppn(cid:229)s genom uppv(cid:228)rmning till 30 (cid:176)C s(cid:229) att test(cid:228)mnet sm(cid:228)lter. Alter- nativt kan (cid:228)mnet finf(cid:246)rdelas till granulat eller pulver. L 136/92 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning 8. 6. 2000 Varje test(cid:228)mne appliceras p(cid:229) tre hudbitar. Test(cid:228)mnet f(cid:229)r verka 24 timmar (se (cid:228)ven 1. 5. 3. 4) och avl(cid:228)gsnas d(cid:228)r- efter genom sk(cid:246)ljning med kranvattenstr(cid:229)le (upp till 30 (cid:176)C). Sk(cid:246)ljningen b(cid:246)r p(cid:229)g(cid:229) till dess att inget (cid:228)mne l(cid:228)ngre f(cid:229)s bort. Test(cid:228)mne som har fastnat i r(cid:246)ret kan sk(cid:246)ljas bort med varmt vatten (cirka 30 (cid:176)C). 1. 5. 3. 2 T E R - m (cid:228) t n i n g a r F(cid:246)r TER-m(cid:228)tningen anv(cid:228)nds en LCR-m(cid:228)tare f(cid:246)r l(cid:229)gsp(cid:228)nning och v(cid:228)xelstr(cid:246)m (t. ex. AIM 401, AIM 6401 eller motsvarande). F(cid:246)r att s(cid:228)nka hudens ytsp(cid:228)nning f(cid:246)re motst(cid:229)ndsm(cid:228)tningen tillf(cid:246)rs etanol (70 %) i tillr(cid:228)cklig m(cid:228)ngd f(cid:246)r att t(cid:228)cka epidermisytan. Etanolen f(cid:229)r verka i n(cid:229)gra sekunder och h(cid:228)lls sedan ur r(cid:246)ret. D(cid:228)refter behandlas v(cid:228)vnaden med 3 ml magnesiumsulfatl(cid:246)sning (154 mM). F(cid:246)r motst(cid:229)ndsm(cid:228)tningen (kh/hudbit) pla- ceras m(cid:228)tutrustningens elektroder p(cid:229) hudbitens motst(cid:229)ende b(cid:229)da ytor (figur 2). Elektrodernas m(cid:229)tt och elek- trodl(cid:228)ngden under krokodilkl(cid:228)mman framg(cid:229)r av figur 1. Den inre (tjocka) elektrodkl(cid:228)mman h(cid:229)lls uppe p(cid:229) PTFE-r(cid:246)ret under motst(cid:229)ndsm(cid:228)tningen f(cid:246)r att s(cid:228)kerst(cid:228)lla att elektrodl(cid:228)ngden inne i magnesiumsulfatl(cid:246)sningen h(cid:229)lls konstant. Den yttre (tunna) elektroden placeras innanf(cid:246)r receptorkammaren s(cid:229) att elektroden ligger mot kammarens botten. Avst(cid:229)ndet mellan fj(cid:228)derkl(cid:228)mman och PTFE-r(cid:246)rets botten skall h(cid:229)llas konstant (figur 1) eftersom avst(cid:229)ndet p(cid:229)verkar det erh(cid:229)llna motst(cid:229)ndsv(cid:228)rdet. Observera att om det uppm(cid:228)tta motst(cid:229)ndsv(cid:228)rdet (cid:246)verstiger ett s(cid:229) h(cid:246)gt v(cid:228)rde som 20 kh kan detta bero p(cid:229) att hudbitens epidermisyta (cid:228)r t(cid:228)ckt av test(cid:228)mne. F(cid:246)r att f(cid:229) bort (cid:228)mnet kan man t. ex. sluta till PTFE-r(cid:246)ret med tummen (som b(cid:246)r skyddas med handske) och skaka om r(cid:246)ret i cirka 10 sekunder, h(cid:228)lla ut magnesiumsulfat- l(cid:246)sningen och upprepa m(cid:228)tningen med ny magnesiumsulfatl(cid:246)sning. De resulterande medelv(cid:228)rdena (cid:228)r godtagbara om samtidiga positiva och negativa kontrollv(cid:228)rden faller inom det godk(cid:228)nda omr(cid:229)det f(cid:246)r metoden. I tabellen nedan anges f(cid:246)rslag till kontroll(cid:228)mnen samt motsvarande god- k(cid:228)nda motst(cid:229)ndsintervall f(cid:246)r den beskrivna metoden och utrustningen. Kontroll ˜mne Positiv Negativ 10 M saltsyra (36 %) Destillerat vatten Motst(cid:229)ndsintervall (kh) 0,5-1,0 10-25 1. 5. 3. 3 M o d i f i e r a t f (cid:246) r f a r a n d e f (cid:246) r s u r f a k t a n t e r o c h n e u t r a l a o r g a n i s k a (cid:228) m n e n Om test(cid:228)mnet (cid:228)r en surfaktant eller neutralt organiskt (cid:228)mne och TER-v(cid:228)rdet (cid:228)r l(cid:228)gre eller lika med 5 kh kan falska positiva resultat s(cid:229)llas ut genom best(cid:228)mning av f(cid:228)rg(cid:228)mnespenetrationen i v(cid:228)vnaderna (2). 1. 5. 3. 3. 1 Applicering och avl(cid:228)gsnande av f(cid:228)rg(cid:228)mne (Sulforhodamine B) l(cid:246)sning av Efter den f(cid:246)rsta behandlingen med test(cid:228)mne appliceras 150 (cid:181)l 10-procentig (vikt f(cid:228)rg(cid:228)mnet i destillerat vatten p(cid:229) epidermisytan av alla hudbitar. L(cid:246)sningen f(cid:229)r verka i 2 timmar. D(cid:228)refter avl(cid:228)gsnas (cid:246)verskott (obundet f(cid:228)rg(cid:228)mne) genom tv(cid:228)ttning av hudbitarna med kranvattenstr(cid:229)le under cirka 10 sekunder. Hudbitarna tas f(cid:246)rsiktigt bort fr(cid:229)n PTFE-r(cid:246)ren och varje hudbit placeras i en burk (t. ex. en 20 ml scintillationsburk i glas) som inneh(cid:229)ller avjoniserat vatten (8 ml). Burkarna omskakas varsamt under 5 minu- ter f(cid:246)r att avl(cid:228)gsna ytterligare (cid:246)verskott (obundet f(cid:228)rg(cid:228)mne). D(cid:228)refter upprepas sk(cid:246)ljningen. Hudbitarna tas bort, placeras i burkar som inneh(cid:229)ller 5 ml 30-procentigt (vikt i volym) natriumdodekylsulfat (SDS) i destille- rat vatten och inkuberas (cid:246)ver natten vid 60 (cid:176)C. Efter inkubationen avl(cid:228)gsnas hudbitarna och sl(cid:228)ngs. Den kvar- varande l(cid:246)sningen centrifugeras under 8 minuter vid 21 (cid:176)C (relativ centrifugalkraft p 175). Ett 1 ml prov av supernatanten sp(cid:228)ds ut i volymf(cid:246)rh(cid:229)llandet 1:5 (t. ex. 1 ml + 4 ml) med 30-procentigt (vikt i volym) SDS i destillerat vatten. L(cid:246)sningens optiska densitet (OD) m(cid:228)tes vid cirka 565 nm. i volym) 1. 5. 3. 3. 2 Ber(cid:228)kning av f(cid:228)rg(cid:228)mneshalten F(cid:228)rg(cid:228)mneshalten per hudbit ber(cid:228)knas utifr(cid:229)n OD-v(cid:228)rdena (f(cid:228)rg(cid:228)mnets mol(cid:228)ra extinktionskoefficient vid 565 nm = 8,7 (cid:215) 104; molekylvikt = 580). F(cid:228)rg(cid:228)mneshalten best(cid:228)ms f(cid:246)r varje hudbit och d(cid:228)refter ber(cid:228)knas en medelhalt f(cid:246)r alla hudbitarna. Resultaten (cid:228)r godtagbara om samtidiga kontrollv(cid:228)rden faller inom de godk(cid:228)nda intervallen f(cid:246)r metoden. I tabellen nedan ges f(cid:246)rslag p(cid:229) godtagbara intervall f(cid:246)r kontroll(cid:228)mnenas f(cid:228)rg(cid:228)mnes- halt f(cid:246)r den beskrivna metoden och utrustningen. 8. 6. 2000 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning L 136/93 Kontroll ˜mne Positiv Negativ 10 M saltsyra (36 %) Destillerat vatten Intervall f(cid:246)r f(cid:228)rg(cid:228)mneshalten ((cid:181)g/bit) 40-100 15-35 1. 5. 3. 4 T i l l (cid:228) g g s i n f o r m a t i o n Det (cid:228)r ocks(cid:229) m(cid:246)jligt att l(cid:229)ta test(cid:228)mnena verka p(cid:229) hudbitarna under kortare tid (t. ex. 2 timmar) i syfte att iden- tifiera (cid:228)mnen som (cid:228)r starkt korrosiva. Det visade sig dock vid valideringsstudien att TER-best(cid:228)mning efter 2 timmars kemikaliep(cid:229)verkan gav (cid:246)verdrivna resultat avseende flera kemikaliers korrosivitetspotential (2), trots att en korrekt identifiering av korrosiva och icke-korrosiva kemikalier kunde g(cid:246)ras efter 24 timmars verk- ningstid. Testutrustningens egenskaper och m(cid:229)tt samt det anv(cid:228)nda testf(cid:246)rfarandet kan p(cid:229)verka de uppm(cid:228)tta TER-v(cid:228)r- dena. Korrosivitetstr(cid:246)skeln p(cid:229) 5 kh h(cid:228)rleddes fr(cid:229)n data som erh(cid:229)llits med den specifika utrustning och det specifika f(cid:246)rfarande som beskrivs f(cid:246)r denna metod. Om f(cid:246)rs(cid:246)ket utf(cid:246)rs under betydligt annorlunda f(cid:246)rh(cid:229)llan- den kan avvikande tr(cid:246)skel- och kontrollv(cid:228)rden erh(cid:229)llas. Det rekommenderas d(cid:228)rf(cid:246)r att metoden och motst(cid:229)n- dets tr(cid:246)skelv(cid:228)rde kalibreras genom testning av en serie referensstandarder som valts ut bland de kemikalier som anv(cid:228)nts i valideringsstudien (3). 1. 6 Princip f(cid:246)r testmetoden (cid:150) best(cid:228)mning med modell av human hud Test(cid:228)mnet appliceras och f(cid:229)r verka upp till 4 timmar p(cid:229) ytan av en tredimensionell modell av human hud som best(cid:229)r av rekonstruerad epidermis med funktionellt hornlager. Korrosiva (cid:228)mnen identifieras genom sin f(cid:246)rm(cid:229)ga att efter fastst(cid:228)llda exponeringsperioder framkalla en s(cid:228)nkning av cellernas viabilitet (vilket kan fast- st(cid:228)llas t. ex. med MTT-reduktionsbest(cid:228)mning) under definierade tr(cid:246)skelv(cid:228)rden. Principen f(cid:246)r best(cid:228)mningen f(cid:246)l- jer hypotesen om att kemikalier (cid:228)r korrosiva om de kan penetrera hornlagret (genom diffusion eller erosion) och (cid:228)r tillr(cid:228)ckligt cytotoxiska f(cid:246)r att orsaka celld(cid:246)d i underliggande cellskikt. 1. 7 Beskrivning av testmetoden (cid:150) best(cid:228)mning med modell av human hud 1. 7. 1 Modeller av human hud Modeller av human hud kan h(cid:228)rr(cid:246)ra fr(cid:229)n olika k(cid:228)llor men m(cid:229)ste uppfylla vissa kriterier. Modellen m(cid:229)ste ha ett funktionellt hornlager med ett underliggande lager levande celler och hornlagrets barri(cid:228)rfunktion m(cid:229)ste vara tillr(cid:228)cklig. Tillr(cid:228)cklig barri(cid:228)rfunktion kan p(cid:229)visas genom demonstration av hudmodellens best(cid:228)ndighet vad g(cid:228)ller cytotoxicitet. Detta g(cid:246)rs genom att applicera (cid:228)mnen som veterligen (cid:228)r cytotoxiska f(cid:246)r celler men som normalt inte passerar hornlagret. Man m(cid:229)ste kunna p(cid:229)visa att hudmodellen ger reproducerbara resultat under definierade f(cid:246)rs(cid:246)ksf(cid:246)rh(cid:229)llanden. Hudmodellens levande celler m(cid:229)ste ha tillr(cid:228)cklig viabilitet f(cid:246)r att det skall uppst(cid:229) en skillnad mellan resultatet f(cid:246)r positivt och negativt kontroll(cid:228)mne. Cellernas viabilitet (t. ex. uppm(cid:228)tt genom MTT-reduktion, dvs. ett OD- v(cid:228)rde) efter exponering f(cid:246)r det negativa kontroll(cid:228)mnet m(cid:229)ste falla inom godtagbara gr(cid:228)nser f(cid:246)r den ber(cid:246)rda modellen. Likas(cid:229) m(cid:229)ste cellernas viabilitetsv(cid:228)rden f(cid:246)r det positiva kontroll(cid:228)mnet (i f(cid:246)rh(cid:229)llande till v(cid:228)rdena f(cid:246)r det negativa kontroll(cid:228)mnet) falla inom fastst(cid:228)llda gr(cid:228)nser. Det viktigaste kriteriet (cid:228)r att den f(cid:246)ruts(cid:228)gbarhets- modell som anv(cid:228)nds m(cid:229)ste ha p(cid:229)visats uppfylla internationella valideringsstandarder (2). 1. 7. 2 Testf(cid:246)rfarande 1. 7. 2. 1 A p p l i c e r i n g a v t e s t (cid:228) m n e ˜mnen i v(cid:228)tskeform m(cid:229)ste appliceras i tillr(cid:228)cklig m(cid:228)ngd f(cid:246)r att t(cid:228)cka hudens yta (minst 25 (cid:181)l/cm2). ˜mnen i fast form m(cid:229)ste appliceras i tillr(cid:228)cklig m(cid:228)ngd f(cid:246)r att t(cid:228)cka huden och d(cid:228)refter m(cid:229)ste (cid:228)mnet fuktas f(cid:246)r att s(cid:228)kerst(cid:228)lla god kontakt med huden. I vissa fall m(cid:229)ste (cid:228)mnen i fast form pulveriseras f(cid:246)re appliceringen. Appli- ceringsmetoden m(cid:229)ste bevisligen vara l(cid:228)mplig f(cid:246)r ett stort antal olika kemikalietyper (2). I slutet av expone- ringsperioden skall test(cid:228)mnet omsorgsfullt tv(cid:228)ttas bort fr(cid:229)n hudytan med saltl(cid:246)sning. 1. 7. 2. 2 M (cid:228) t n i n g a v c e l l e r n a s v i a b i l i t e t Cellernas viabilitet kan m(cid:228)tas med valfri validerad metod. Den oftast anv(cid:228)nda best(cid:228)mningsmetoden (cid:228)r MTT-re- duktion, som har visat sig ge exakta och reproducerbara resultat i olika laboratorier (2). Hudbitarna f(cid:229)r ligga 3 timmar i en MTT-l(cid:246)sning (0,3 mg/ml) vid 20(cid:150)28 (cid:176)C. Den utf(cid:228)llda bl(cid:229) formazanprodukten extraheras med l(cid:246)sningsmedel och formazanhalten m(cid:228)ts genom OD-best(cid:228)mning vid en v(cid:229)gl(cid:228)ngd mellan 545 och 595 nm. L 136/94 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning 8. 6. 2000 1. 7. 2. 3 T i l l (cid:228) g g s i n f o r m a t i o n Den hudmodell som anv(cid:228)nds och det exakta protokollet f(cid:246)r exponeringstid, tv(cid:228)ttningsf(cid:246)rfaranden och dylika faktorer har stor inverkan p(cid:229) resultaten avseende cellernas viabilitet. Det rekommenderas att metoden och f(cid:246)r- uts(cid:228)gbarhetsmodellen kalibreras genom testning av en serie referensstandarder som v(cid:228)ljs ut bland de kemika- lier som anv(cid:228)ndes i ECVAM-valideringsstudien (3). Ett avg(cid:246)rande kriterium (cid:228)r att metoden bevisligen (cid:228)r repro- ducerbar inom och mellan laboratorier f(cid:246)r ett stort antal olika kemikalier, i enlighet med internationella stan- darder. Metoden b(cid:246)r minst uppfylla de fastst(cid:228)llda kriterierna f(cid:246)r vetenskaplig validitet (2) och resultaten fr(cid:229)n en s(cid:229)dan valideringsstudie m(cid:229)ste publiceras i en kollegialt granskad vetenskaplig tidskrift. 2 DATA 2. 1 Hantering av resultaten 2. 1. 1 TER i r(cid:229)tthud Motst(cid:229)ndsv(cid:228)rden (kh) f(cid:246)r test(cid:228)mnet, positiva och negativa kontroll(cid:228)mnen samt eventuella standardreferens- kemikalier skall rapporteras i tabellform, inbegripet data f(cid:246)r replikat och upprepade f(cid:246)rs(cid:246)k, medelv(cid:228)rden och den resulterande klassificeringen. 2. 1. 2 Best(cid:228)mning med modell av human hud OD-v(cid:228)rden och ber(cid:228)knade v(cid:228)rden f(cid:246)r cellernas procentuella viabilitet f(cid:246)r test(cid:228)mnet, positiva och negativa kon- troll(cid:228)mnen samt eventuella standardreferenskemikalier skall rapporteras i tabellform, inbegripet data f(cid:246)r repli- kat och upprepade f(cid:246)rs(cid:246)k, medelv(cid:228)rden och den resulterande klassificeringen. 2. 2 Utv(cid:228)rdering och tolkning av resultaten 2. 2. 1 TER i r(cid:229)tthud Om TER-medelv(cid:228)rdet som f(cid:229)s f(cid:246)r test(cid:228)mnet (cid:228)r h(cid:246)gre (cid:228)n 5 kh (cid:228)r test(cid:228)mnet icke-korrosivt. Om TER-v(cid:228)rdet (cid:228)r l(cid:228)gre eller lika med 5 kh (och det inte g(cid:228)ller en surfaktant eller neutralt organiskt (cid:228)mne) (cid:228)r test(cid:228)mnet korro- sivt. F(cid:246)r surfaktanter eller neutrala organiska (cid:228)mnen som ger TER-v(cid:228)rden l(cid:228)gre eller lika med 5 kh kan testf(cid:246)r- farandet kompletteras med f(cid:228)rg(cid:228)mnespenetrering. Om medelv(cid:228)rdet f(cid:246)r hudbitarnas f(cid:228)rg(cid:228)mneshalt (cid:228)r st(cid:246)rre eller lika med motsvarande v(cid:228)rde i den positiva kontroll som samtidigt utf(cid:246)rs med 36 % HCI (cid:228)r test(cid:228)mnet sant positivt och d(cid:228)rmed (cid:228)ven korrosivt. Om medelv(cid:228)rdet f(cid:246)r hudbitarnas f(cid:228)rg(cid:228)mneshalt (cid:228)r l(cid:228)gre (cid:228)n motsvarande v(cid:228)rde i den positiva kontrollen (cid:228)r test(cid:228)mnet falskt positivt och d(cid:228)rmed icke-korrosivt. 2. 2. 2 Best(cid:228)mning med modell av human hud Ett negativt OD-kontrollv(cid:228)rde betyder 100 % viabilitet f(cid:246)r cellerna och d(cid:228)rf(cid:246)r kan de OD-v(cid:228)rden som f(cid:229)s f(cid:246)r vart och ett prov anv(cid:228)ndas f(cid:246)r att ber(cid:228)kna en procentuell viabilitet i f(cid:246)rh(cid:229)llande till den negativa kontrollen. Innan metoden kan valideras m(cid:229)ste det viabilitetsgr(cid:228)nsv(cid:228)rde som skiljer korrosiva test(cid:228)mnen fr(cid:229)n icke-korro- siva (eller som skiljer mellan olika grader av korrosivitet) definieras p(cid:229) ett klart s(cid:228)tt i f(cid:246)ruts(cid:228)gbarhetsmodellen, och vid p(cid:229)f(cid:246)ljande valideringsstudie m(cid:229)ste p(cid:229)visas att gr(cid:228)nsv(cid:228)rdet (cid:228)r l(cid:228)mpligt (2). 3 RAPPORTERING Testrapport Testrapporten m(cid:229)ste inneh(cid:229)lla minst f(cid:246)ljande information: Test(cid:228)mne (cid:151) identifierande data, fysikalisk natur och i till(cid:228)mpliga fall fysikalkemiska egenskaper. Motsvarande infor- mation b(cid:246)r l(cid:228)mnas f(cid:246)r eventuella referens(cid:228)mnen. F(cid:246)rs(cid:246)ksf(cid:246)rh(cid:229)llanden (cid:151) Detaljerade uppgifter om det testf(cid:246)rfarande som har anv(cid:228)nts. (cid:151) Beskrivning av och motivering f(cid:246)r eventuella modifieringar. 8. 6. 2000 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning L 136/95 Resultat (cid:151) Tabelluppst(cid:228)llning med test(cid:228)mnets motst(cid:229)ndsv(cid:228)rden (TER-best(cid:228)mning) eller cellernas procentuella viabili- tet (best(cid:228)mning med modell av human hud), positiva och negativa kontroller och eventuella standardrefe- renskemikalier, inbegripet data f(cid:246)r replikat eller upprepade f(cid:246)rs(cid:246)k och medelv(cid:228)rden. (cid:151) Beskrivning av eventuella andra observerade verkningar. Diskussion om resultaten Slutsatser 4 H˜NVISNINGAR (1) ECVAM (1998), ECVAM News & Views, ATLA 26, s. 275(cid:150)280. (2) Fentem, J. H. , Archer, G. E. B. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. , Holzhutter, H-G. & Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosi- vity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in Vitro 12, s. 483(cid:150)524. (3) Barratt, M. D. , Brantom, P. G. , Fentem, J. H. , Gerner, I. , Walker, A. P. & Worth, A. P. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals, Toxicology in Vitro 12, s. 471(cid:150)482. (4) Oliver, G. J. A. , Pemberton, M. A. & Rhodes, C. (1986), An in vitro skin corrosivity test (cid:150) modifications and validation, Food & Chemical Toxicology 24, s. 507(cid:150)512. (5) Botham, P. A. , Hall, T. J. , Dennett, R. , McCall, J. C. , Basketter, D. A. , Whittle, E. , Cheeseman, M. , Esdaile, D. J. & Gardner, J. (1992), The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial, Toxicology in Vitro 6, s. 191(cid:150)194. (6) Worth, A. P. , Fentem, J. H. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. & Liebsch, M. (1998), An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion, ATLA 26, s. 709(cid:150)720. (7) Botham, P. A. , Chamberlain, M. , Barratt, M. D. , Curren, R. D. , Esdaile, D. J. , Gardner, J. R. , Gordon, V. C. , Hil- debrand, B. , Lewis, R. W. , Liebsch, M. , Logemann, P. , Osborne, R. , Ponec, M. , Regnier, J. F. , Steiling, W. , Walker, A. P. & Balls, M. (1995), A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM workshop 6, ATLA 23, s. 219(cid:150)255. L 136/96 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning 8. 6. 2000 Figur 1 8. 6. 2000 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning L 136/97 Figur 2 L 136/98 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning 8. 6. 2000 BILAGA II (cid:148)B. 41. FOTOTOXICITET (cid:150) 3T3 NRU-FOTOTOXICITETSTEST IN VITRO 1. METOD 1. 1 Inledning Fototoxicitet definieras s(cid:229)som toxisk respons som framkallas n(cid:228)r huden f(cid:246)rst exponeras f(cid:246)r vissa kemikalier och d(cid:228)refter f(cid:246)r ljus, eller som framkallas p(cid:229) liknande s(cid:228)tt genom hudbestr(cid:229)lning efter administrering av en kemikalie till organismen. Den information som erh(cid:229)llits fr(cid:229)n 3T3 NRU-fototoxicitetstestet in vitro kan anv(cid:228)ndas f(cid:246)r att identifiera den fototoxiska potentialen hos ett test(cid:228)mne, dvs. huruvida test(cid:228)mnet kan ge upphov till skador eller inte i kom- bination med exponering f(cid:246)r UV-str(cid:229)lning och synligt ljus. Den toxikologiska slutpunkten f(cid:246)r in vitro-testet best(cid:229)r av fastst(cid:228)llandet av fototoxicitet som framkallas genom kombinerad verkan av en kemikalie och ljus, och d(cid:228)rf(cid:246)r kan testet anv(cid:228)ndas f(cid:246)r att identifiera b(cid:229)de f(cid:246)reningar som (cid:228)r fototoxiska in vivo efter systemisk applicering och f(cid:246)rdelning p(cid:229) huden, och f(cid:246)reningar som har fotoir- riterande egenskaper efter applicering p(cid:229) hudens yta. 3T3 NRU-fototoxicitetstestet in vitro utvecklades och validerades inom ramen f(cid:246)r ett gemensamt EU/COLIPA- projekt 1992(cid:150)1997 (1) (2) (3) i syfte att f(cid:229) fram ett adekvat in vitro-alternativ till de olika in vivo-tester som var i bruk. Ett OECD-arbetsm(cid:246)te l(cid:228)mnade 1996 rekommendationer om en sekventiell in vitro-testmetod f(cid:246)r bed(cid:246)mning av fototoxicitet (4). Resultaten fr(cid:229)n 3T3 NRU-fototoxicitetstestet in vitro j(cid:228)mf(cid:246)rdes med akuta fototoxicitets- och fotoirritations- verkningar in vivo hos djur och m(cid:228)nniskor, och testet har visat sig ge utm(cid:228)rkt f(cid:246)ruts(cid:228)gbarhet vad g(cid:228)ller dessa verkningar. Avsikten med testet (cid:228)r inte att f(cid:246)ruts(cid:228)ga andra skadliga verkningar som kan uppst(cid:229) genom kom- binerad verkan av en kemikalie och ljus, t. ex. fotogenotoxicitet, fotoallergi och fotokarcinogenitet, (cid:228)ven om m(cid:229)nga kemikalier med s(cid:229)dana specifika egenskaper reagerar positivt vid 3T3 NRU-fototoxicitetstestet in vitro. Testet (cid:228)r inte heller avsett att anv(cid:228)ndas f(cid:246)r bed(cid:246)mning av fototoxisk potential. En sekventiell metod f(cid:246)r testning av kemikaliers fototoxicitet presenteras i till(cid:228)gget. 1. 2 Definitioner Str(cid:229)lning: Intensiteten hos ultraviolett (UV) eller synligt ljus som n(cid:229)r en yta, uttryckt i W/m2 eller mW/cm2. Ljusdos: Den m(cid:228)ngd (= intensitet (cid:215) tid) ultraviolett (UV) eller synlig str(cid:229)lning som n(cid:229)r en yta, uttryckt i Joule (= W (cid:215) s) per ytenhet, t. ex. J/m2 eller J/cm2. UV-ljusets v(cid:229)gl(cid:228)ngdsomr(cid:229)den: CIE (Commission Internationale de L’(cid:201)clairage) rekommenderar f(cid:246)ljande uppdel- ning: UVA (315(cid:150)400 nm), UVB (280(cid:150)315 nm) och UVC (100(cid:150)280 nm). ˜ven andra uppdelningar f(cid:246)rekom- mer (cid:150) gr(cid:228)nsen mellan UVB och UVA s(cid:228)tts ofta vid 320 nm och UVA kan uppdelas i UV-A1 och UV-A2 med en gr(cid:228)ns vid cirka 340 nm. Cellviabilitet: En parameter f(cid:246)r att m(cid:228)ta en cellpopulations totala aktivitet (t. ex. upptag av det vitala f(cid:228)rg(cid:228)mnet neutralr(cid:246)tt i cellernas lysosomer). Denna aktivitet korrelerar, beroende p(cid:229) den slutpunkt som uppm(cid:228)ts och den testutformning som anv(cid:228)nds, med det totala antalet celler och deras vitalitet. Relativ cellviabilitet: Cellviabiliteten uttryckt i f(cid:246)rh(cid:229)llande till negativa kontroller (med l(cid:246)sningsmedel) som har tagits fortl(cid:246)pande under hela testf(cid:246)rfarandet (+ UV eller (cid:150) UV), utan behandling med testkemikalie. F(cid:246)ruts(cid:228)gbarhetsmodell: En algoritm som anv(cid:228)nds f(cid:246)r att omvandla resultaten fr(cid:229)n ett toxicitetstest till f(cid:246)ruts(cid:228)- gelse av toxisk potential. I f(cid:246)religgande testriktlinjer kan PIF och MPE anv(cid:228)ndas f(cid:246)r att omvandla resultaten fr(cid:229)n 3T3 NRU-fototoxicitetstestet in vitro till en f(cid:246)ruts(cid:228)gelse av fototoxisk potential. PIF (fotoirritationsfaktor): En faktor som f(cid:229)s genom att j(cid:228)mf(cid:246)ra tv(cid:229) cytotoxiska koncentrationer (EC50) av test- kemikalien som ger samma effekt i fr(cid:229)nvaro (ﬂ UV) respektive n(cid:228)rvaro (+ UV) av icke-cytotoxisk bestr(cid:229)lning med UVA/synligt ljus. MPE (Mean Photo Effect): Ett nytt m(cid:229)tt som har h(cid:228)rletts fr(cid:229)n matematisk analys av den fullst(cid:228)ndiga formen hos tv(cid:229) koncentrations-responskurvor som erh(cid:229)llits i fr(cid:229)nvaro (ﬂ UV) respektive n(cid:228)rvaro (+ UV) av icke-cytotoxisk bestr(cid:229)lning med UVA/synligt ljus. 8. 6. 2000 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning L 136/99 Fototoxicitet: Akut toxisk respons som framkallas n(cid:228)r huden f(cid:246)rst exponeras f(cid:246)r vissa kemikalier och d(cid:228)refter f(cid:246)r ljus, eller som framkallas p(cid:229) liknande s(cid:228)tt genom hudbestr(cid:229)lning efter administrering av en kemikalie till organismen. Fotoirritation: Ett underbegrepp av termen (cid:146)fototoxicitet(cid:146). Begreppet anv(cid:228)nds endast f(cid:246)r att beskriva s(cid:229)dana fototoxiska reaktioner som uppst(cid:229)r i huden efter kemikalieexponering (p(cid:229) huden eller oralt) och som alltid leder till icke-specifika cellskador (reaktioner av typen solbr(cid:228)nnskador). Fotoallergi: En f(cid:246)rv(cid:228)rvad immunologisk reaktivitet som inte uppkommer vid en f(cid:246)rsta behandling med kemika- lie och ljus, och som beh(cid:246)ver en induktionsperiod p(cid:229) en eller tv(cid:229) veckor innan hudens reaktionsben(cid:228)genhet kan p(cid:229)visas. Fotogenotoxicitet: Genotoxisk respons som observeras med en genetisk slutpunkt. Denna framkallas efter att cellerna har exponerats f(cid:246)r en icke-genotoxisk dos av UV/synligt ljus och en icke-genotoxisk kemikalie. Fotokarcinogenitet: Karcinogenitet som induceras genom upprepad behandling med ljus och kemikalie. Termen (cid:146)foto-co-karcinogenes(cid:146) st(cid:229)r f(cid:246)r att en kemikalie f(cid:246)rst(cid:228)rker UV-inducerad tumorigenes. 1. 3 Referens(cid:228)mnen F(cid:246)r uppr(cid:228)ttandet av 3T3 NRU-fototoxicitetstest rekommenderas, ut(cid:246)ver anv(cid:228)ndning av den positiva kontroll- kemikalien klorpromazin som vid varje best(cid:228)mning b(cid:246)r testas parallellt, att referenskemikalierna v(cid:228)ljs ut ur den upps(cid:228)ttning kemikalier som anv(cid:228)ndes i de laboratorier som deltog i provningarna f(cid:246)r det aktuella testet (1) (3) (13). 1. 4 Bakgrund M(cid:229)nga typer av kemikalier har rapporterats orsaka fototoxiska verkningar (5) (6) (7) (8). Dessa kemikaliers enda gemensamma egenskap (cid:228)r f(cid:246)rm(cid:229)gan att absorbera ljusenergi inom solljusets v(cid:229)gl(cid:228)ngdsomr(cid:229)de. Enligt fotokemins f(cid:246)rsta lag (Grotthaus-Drapers lag) (cid:228)r tillr(cid:228)cklig absorption av ljuskvanta f(cid:246)ruts(cid:228)ttningen f(cid:246)r en fotoreaktion. Innan man planerar biologisk testning av en kemikalie enligt de aktuella testriktlinjerna b(cid:246)r man d(cid:228)rf(cid:246)r fastst(cid:228)lla den ber(cid:246)rda kemikaliens absorptionsspektrum avseende UV/synligt ljus (t. ex. enligt OECD:s testriktlinjer 101). Om den mol(cid:228)ra extinktions- eller absorptionskoefficienten ligger under 10 liter (cid:215) molﬂ1 (cid:215) cmﬂ1 har kemikalien ingen fotoreaktiv potential och beh(cid:246)ver inte testas med 3T3 NRU-fototox- icitetstest in vitro eller annat biologiskt test av skadliga fotokemiska effekter (bilaga 1). 1. 5 Princip f(cid:246)r testmetoden Man har identifierat fyra mekanismer som kan resultera i fototoxisk respons genom att ljus absorberas av en (kemisk) kromofor (7). Alla fyra mekanismer leder till cellskador. D(cid:228)rf(cid:246)r bygger 3T3 NRU-fototoxicitetstestet in vitro p(cid:229) en j(cid:228)mf(cid:246)relse av cytotoxiciteten hos en kemikalie n(cid:228)r den testas exponerad respektive icke-expone- rad f(cid:246)r en icke-cytotoxisk dos av UVA/synligt ljus. Cytotoxiciteten uttrycks d(cid:229) som en koncentrationsberoende minskning av upptaget av det vitala f(cid:228)rg(cid:228)mnet neutralr(cid:246)tt (NR) (9) 24 timmar efter behandling med testkemi- kalien och p(cid:229)f(cid:246)ljande bestr(cid:229)lning. Balb/c 3T3-celler h(cid:229)lls i kultur under 24 timmar f(cid:246)r monolayerbildning. Tv(cid:229) 96-h(cid:229)lsplattor per testkemikalie f(cid:246)rinkuberas i en timme med (cid:229)tta olika koncentrationer av kemikalien. D(cid:228)refter exponeras den ena av de tv(cid:229) plattorna f(cid:246)r en icke-cytotoxisk dos (5 J/cm2 UVA) av UVA/synligt ljus (+ UV-provning) medan den andra plattan h(cid:229)lls i m(cid:246)rker (ﬂ UV-provning). Sedan byter man ut b(cid:229)da plattornas behandlingsmedium mot kultur- medium (n(cid:228)ringsl(cid:246)sning) och efter ytterligare 24 timmars inkubering best(cid:228)ms cellviabiliteten med neutralr(cid:246)tt- upptag (NRU) i 3 timmar. Den relativa cellviabiliteten, uttryckt som en procentandel j(cid:228)mf(cid:246)rt med obehand- lade negativa kontrollprov, ber(cid:228)knas f(cid:246)r envar av de (cid:229)tta testkoncentrationerna. D(cid:228)refter uppskattas den foto- toxiska potentialen genom j(cid:228)mf(cid:246)relse av den koncentrationsrespons som erh(cid:229)lls i n(cid:228)rvaro (+ UV) och i fr(cid:229)n- varo (ﬂ UV) av str(cid:229)lning, i regel p(cid:229) niv(cid:229)n EC50, dvs. den koncentration som minskar cellviabiliteten med 50 % j(cid:228)mf(cid:246)rt med de obehandlade kontrollproverna. 1. 6 Kvalitetskriterier Cellernas UVA-k(cid:228)nslighet, historiska data: Cellerna skall regelbundet kontrolleras avseende UVA-k(cid:228)nslighet. Cellerna s(cid:229)s ut med samma t(cid:228)thet som i 3T3 NRU-fototoxicitetstestet in vitro, bestr(cid:229)las f(cid:246)ljande dag med UVA-doser p(cid:229) 1(cid:150)9 J/cm2 och en dag senare best(cid:228)ms cellernas viabilitet med NRU-metoden. Cellerna uppfyller kvalitetskriterierna om deras viabilitet efter bestr(cid:229)lning med 5 J/cm2 UVA (cid:228)r minst 80 % av viabiliteten hos obestr(cid:229)lade kontrollceller. Vid den h(cid:246)gsta UVA-dosen p(cid:229) 9 J/cm2 b(cid:246)r viabiliteten vara minst 50 % av viabilite- ten hos obestr(cid:229)lade kontrollceller. Kontrollen b(cid:246)r upprepas cirka var tionde cellpassage. Negativkontrollcellernas UVA-k(cid:228)nslighet, aktuellt test: Testet uppfyller kvalitetskriterierna om + UVA-f(cid:246)rs(cid:246)kets negativkontrollceller (celler i EBSS (cid:150) Earl’s Balanced Salt Solution) med eller utan 1 % dimetylsulfoxid (DMSO) eller 1 % etanol (EtOH) har en viabilitet som (cid:228)r minst 80 % av viabiliteten hos obestr(cid:229)lade celler i likadan l(cid:246)s- ning i det parallella m(cid:246)rkerexperimentet (ﬂ UVA). L 136/100 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning 8. 6. 2000 Negativkontrollcellernas viabilitet: Den absoluta optiska densiteten (OD540 NRU) uppm(cid:228)tt f(cid:246)r negativkontrollceller- nas NR-extrakt indikerar om de 1 (cid:215) 104 celler som har s(cid:229)tts ut per h(cid:229)l har vuxit med normal dubbleringstid under de tv(cid:229) dagar best(cid:228)mningen p(cid:229)g(cid:229)r. Ett test uppfyller kriterierna f(cid:246)r godk(cid:228)nnande om medelv(cid:228)rdet f(cid:246)r OD540 NRU hos obehandlade kontrollceller (cid:228)r ¯ 0,2. Positivkontroll(cid:228)mne: Varje 3T3 NRU-fototoxicitetstest in vitro skall (cid:229)tf(cid:246)ljas av parallelltest av en k(cid:228)nd fototoxisk kemikalie. Vid EU/COLIPA-valideringsstudien anv(cid:228)ndes klotpromazin (CPZ) som positivkontroll(cid:228)mne och denna kemikalie kan d(cid:228)rf(cid:246)r rekommenderas. F(cid:246)r CPZ som hade testats enligt standardprotokollet i 3T3 NRU- fototoxicitetstestet (+ UVA): EC50= 0,1(cid:150)2,0 (cid:181)g/ml, CPZ obestr(cid:229)lat (ﬂ UVA): EC50 = 7,0(cid:150)90,0 (cid:181)g/ml. Fotoirritationsfaktorn (PIF), dvs. bryt- punkten f(cid:246)r EC50, b(cid:246)r vara minst 6. f(cid:246)r godk(cid:228)nnande: CPZ bestr(cid:229)lat in vitro definierades f(cid:246)ljande kriterier I st(cid:228)llet f(cid:246)r CPZ kan (cid:228)ven andra k(cid:228)nda fototoxiska kemikalier, l(cid:228)mpliga f(cid:246)r den kemiska klass eller de l(cid:246)slig- hetsegenskaper som g(cid:228)ller f(cid:246)r testkemikalien, anv(cid:228)ndas vid de parallella positivkontrollerna. I s(cid:229)dant fall skall historiska data anv(cid:228)ndas som hj(cid:228)lp f(cid:246)r att definiera de v(cid:228)rdeomr(cid:229)den f(cid:246)r EC50 och f(cid:246)r PIF eller MPE som anv(cid:228)nds som kriterier f(cid:246)r godk(cid:228)nnande. 1. 7 Beskrivning av testmetoden 1. 7. 1 F(cid:246)rberedelser 1. 7. 1. 1 C e l l e r F(cid:246)r valideringsstudien anv(cid:228)ndes en etablerad musfibroblastcellinje (cid:150) Balb/c 3T3, klon 31 (cid:150) antingen fr(cid:229)n ATCC eller fr(cid:229)n ECACC, som d(cid:228)rf(cid:246)r kan rekommenderas. Andra celler eller cellinjer kan med framg(cid:229)ng anv(cid:228)ndas med samma testprotokoll, f(cid:246)rutsatt att odlingsbetingelserna anpassas till cellernas specifika behov. Motsvarigheten m(cid:229)ste demonstreras. Cellerna skall regelbundet kontrolleras med avseende p(cid:229) mykoplasmaf(cid:246)rorening och f(cid:229)r endast anv(cid:228)ndas n(cid:228)r resultatet fr(cid:229)n en s(cid:229)dan kontroll (cid:228)r godtagbart. Eftersom cellernas UVA-k(cid:228)nslighet kan (cid:246)ka med antalet passager skall Balb/c 3T3-celler med l(cid:228)gsta m(cid:246)jliga passagenummer anv(cid:228)ndas, helst under 100. Det (cid:228)r viktigt att Balb/c 3T3-cellernas UVA-k(cid:228)nslighet kontrolle- ras enligt det kvalitetskontrollf(cid:246)rfarande som beskrivs i dessa riktlinjer. 1. 7. 1. 2 M e d i a o c h o d l i n g s b e t i n g e l s e r L(cid:228)mpliga n(cid:228)ringsl(cid:246)sningar och inkuberingsbetingelser b(cid:246)r anv(cid:228)ndas f(cid:246)r vanliga cellpassager och under testf(cid:246)r- farandet. Balb/c 3T3-celler DMEM-kompletteras med 10 % serum fr(cid:229)n nyf(cid:246)dd kalv, 4 mM glutamin, penicillin och streptomycin samt inkubering i fuktig atmosf(cid:228)r vid 37 (cid:176)C och 7,5 % CO2. Det (cid:228)r s(cid:228)rskilt viktigt att man med cellodlingsbetingelserna kan s(cid:228)kerst(cid:228)lla en cellcykeltid inom det normala historiska intervallet f(cid:246)r de cel- ler eller den cellinje som anv(cid:228)nds. 1. 7. 1. 3 B e r e d n i n g a v k u l t u r e r Celler fr(cid:229)n djupfrysta stamkulturer s(cid:229)s ut i n(cid:228)ringsl(cid:246)sningen i l(cid:228)mplig t(cid:228)thet och subkultiveras minst en g(cid:229)ng innan de anv(cid:228)nds i 3T3 NRU-fototoxicitetstestet in vitro. F(cid:246)r fototoxicitetstestet s(cid:229)s testcellerna ut i n(cid:228)ringsl(cid:246)sningen med s(cid:229)dan t(cid:228)thet att odlingarna inte v(cid:228)xer sam- man f(cid:246)re avslutat test, dvs. n(cid:228)r cellviabiliteten best(cid:228)ms 48 timmar efter uts(cid:229)dden. F(cid:246)r Balb/c 3T3-celler som odlas p(cid:229) 96-h(cid:229)lsplattor rekommenderas t(cid:228)theten 1 (cid:215) 104 celler per h(cid:229)l. F(cid:246)r varje testkemikalie s(cid:229)s celler ut p(cid:229) samma s(cid:228)tt p(cid:229) tv(cid:229) separata 96-h(cid:229)lsplattor som d(cid:228)refter parallellt anv(cid:228)nds genom hela testf(cid:246)rfarandet under identiska odlingsf(cid:246)rh(cid:229)llanden, med undantag av den tidsperiod d(cid:229) den ena plattan bestr(cid:229)las (+ UVA/synligt ljus) och den andra h(cid:229)lls i m(cid:246)rker (ﬂ UVA/synligt ljus). 1. 7. 1. 4 M e t a b o l i s k a k t i v e r i n g Metaboliserande system (cid:228)r ett allm(cid:228)nt krav f(cid:246)r alla in vitro-test som anv(cid:228)nds f(cid:246)r f(cid:246)ruts(cid:228)gelse av genotoxisk och karcinogen potential, men n(cid:228)r det g(cid:228)ller fototoxicitet k(cid:228)nner man (cid:228)n s(cid:229) l(cid:228)nge inte till n(cid:229)gon kemikalie d(cid:228)r metabolisk omvandling kr(cid:228)vs f(cid:246)r att kemikalien skall fungera fototoxiskt in vivo eller in vitro. Det (cid:228)r d(cid:228)rf(cid:246)r varken n(cid:246)dv(cid:228)ndigt eller vetenskapligt motiverat att det aktuella testet genomf(cid:246)rs med ett system som har metabolisk aktivering. 8. 6. 2000 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning L 136/101 1. 7. 1. 5 T e s t k e m i k a l i e (cid:150) b e r e d n i n g Testkemikalierna m(cid:229)ste ha beretts omedelbart f(cid:246)re anv(cid:228)ndningen, om man inte med st(cid:246)d av stabilitetsdata kan visa att kemikalierna (cid:228)r lagringsbest(cid:228)ndiga. Om det (cid:228)r sannolikt att kemikalien har h(cid:246)g s(cid:246)nderfallshastig- het under inverkan av ljus m(cid:229)ste beredningen genomf(cid:246)ras under r(cid:246)tt ljus. Testkemikalierna skall l(cid:246)sas upp i buffrade saltl(cid:246)sningar, t. ex. EBSS (Earl’s Balanced Salt Solution) eller PBS (fosfatbuffrad saltl(cid:246)sning). Saltl(cid:246)sningarna f(cid:229)r inte inneh(cid:229)lla proteinkomponenter eller ljusabsorberande pH-in- dikatorf(cid:228)rger som kan st(cid:246)ra bestr(cid:229)lningsresultatet. Testkemikalier med begr(cid:228)nsad vattenl(cid:246)slighet skall l(cid:246)sas upp i l(cid:228)mpligt l(cid:246)sningsmedel i en koncentration som (cid:228)r 100 g(cid:229)nger h(cid:246)gre (cid:228)n den (cid:246)nskade och d(cid:228)refter sp(cid:228)das ut i f(cid:246)rh(cid:229)llandet 1:100 med den buffrade saltl(cid:246)s- ningen. Om l(cid:246)sningsmedel anv(cid:228)nds m(cid:229)ste detta f(cid:246)rekomma i en konstant volymkoncentration p(cid:229) 1 % i alla odlingar, dvs. b(cid:229)de i de negativa kontrollerna och i alla koncentrationer av testkemikalien. Som l(cid:246)sningsmedel rekommenderas dimetylsulfoxid (DMSO) och etanol (EtOH). Andra l(cid:246)sningsmedel med l(cid:229)g cytotoxicitet (t. ex. aceton) kan vara l(cid:228)mpliga men m(cid:229)ste utv(cid:228)rderas omsorgsfullt med avseende p(cid:229) specifika egenskaper, t. ex. reaktionsben(cid:228)genhet med testkemikalien, d(cid:228)mpning av den fototoxiska verkan eller ben(cid:228)gen- het att f(cid:229)nga upp radikaler. Vid behov kan man anv(cid:228)nda Vortex-blandning, ultraljudsbehandling eller uppv(cid:228)rmning till 37 (cid:176)C f(cid:246)r att underl(cid:228)tta uppl(cid:246)sningen. 1. 7. 1. 6 U V - b e s t r (cid:229) l n i n g (cid:150) b e r e d n i n g Ljusk(cid:228)lla: L(cid:228)mplig ljusk(cid:228)lla i kombination med l(cid:228)mplig filtrening (cid:228)r den viktigaste faktorn vid testning av foto- toxicitet. I regel f(cid:246)rknippas UVA och de synliga v(cid:229)gl(cid:228)ngdsomr(cid:229)dena med fotosensibilisering (7) (10), medan UVB har mindre relevans och (cid:228)r direkt mycket cytotoxisk (cid:150) cytotoxiciteten (cid:246)kar 1000-faldigt n(cid:228)r v(cid:229)gl(cid:228)ngden minskar fr(cid:229)n 313 till 280 nm (11). Kriterierna f(cid:246)r valet av l(cid:228)mplig ljusk(cid:228)lla b(cid:246)r inbegripa det grundl(cid:228)ggande kravet om att ljusk(cid:228)llan emitterar v(cid:229)gl(cid:228)ngder som absorberas av testkemikalien och att ljusdosen (den dos som uppn(cid:229)s inom sk(cid:228)lig tid) (cid:228)r tillr(cid:228)cklig f(cid:246)r detektering av k(cid:228)nda fotosensibilisatorer. Dessutom f(cid:229)r de v(cid:229)g- l(cid:228)ngder och doser som anv(cid:228)nds inte vara otillb(cid:246)rligt skadliga f(cid:246)r testsystemet, vilket inbegriper v(cid:228)rmeemission (infrar(cid:246)da omr(cid:229)det). Det optimala (cid:228)r att anv(cid:228)nda simulerat solljus fr(cid:229)n en solsimulator. I solsimulatorer anv(cid:228)nds b(cid:229)de xenonb(cid:229)g- lampor och (dopade) kvicksilver-metallhalidb(cid:229)glampor. F(cid:246)rdelen med de senare (cid:228)r att de emitterar mindre v(cid:228)rme och (cid:228)r billigare, men ljusets likhet med solljus (cid:228)r inte perfekt. Alla solsimulatorer emitterar betydande m(cid:228)ngder UVB och b(cid:246)r d(cid:228)rf(cid:246)r f(cid:246)rses med l(cid:228)mpliga filter f(cid:246)r att d(cid:228)mpa de mycket cytotoxiska UVB-v(cid:229)gl(cid:228)ng- derna. Det str(cid:229)lningsspektrum som anv(cid:228)nds f(cid:246)r 3T3 NRU-fototoxicitetstest in vitro m(cid:229)ste vara praktiskt taget fritt fr(cid:229)n UVB (UVA:UVB p 1:20). Man har offentliggjort ett exempel p(cid:229) den spektrala str(cid:229)lningsdistributionen fr(cid:229)n den filtrerade solsimulator som anv(cid:228)ndes i valideringsstudien f(cid:246)r 3T3 NRU-fototoxicitetstestet in vitro (3). Dosimetri: Ljusets (str(cid:229)lningens) intensitet skall f(cid:246)re varje fototoxicitetstest rutinm(cid:228)ssigt kontrolleras med hj(cid:228)lp av en bredbands UV-m(cid:228)tare. UV-m(cid:228)taren m(cid:229)ste ha kalibrerats mot k(cid:228)llan och dess prestanda b(cid:246)r kontrolleras. F(cid:246)r detta (cid:228)ndam(cid:229)l rekommenderas anv(cid:228)ndning av en referensm(cid:228)tare, dvs. en annan, identiskt kalibrerad UV- m(cid:228)tare av samma typ. Helst skall man (cid:228)ven d(cid:229) och d(cid:229) anv(cid:228)nda en spektroradiometer f(cid:246)r att m(cid:228)ta den spektrala str(cid:229)lningen fr(cid:229)n den filtrerade ljusk(cid:228)llan och f(cid:246)r att kontrollera UV-m(cid:228)tarnas kalibrering. Anv(cid:228)nd- ningen av s(cid:229)dana instrument (cid:228)r dock mycket kr(cid:228)vande och f(cid:246)ruts(cid:228)tter tillb(cid:246)rligt utbildad personal. I valideringsstudien konstaterades att en dos p(cid:229) 5 J/cm2 (UVA) inte var cytotoxisk f(cid:246)r Balb/c 3T3-celler men (cid:228)nd(cid:229) tillr(cid:228)ckligt stark f(cid:246)r att excitera (cid:228)ven svagt fototoxiska kemikalier. F(cid:246)r att uppn(cid:229) 5 J/cm2 inom en tids- period p(cid:229) 50 minuter m(cid:229)ste str(cid:229)lningen st(cid:228)llas in p(cid:229) 1,666 mW/cm2. Om en annan cellinje eller en annan ljusk(cid:228)lla anv(cid:228)nds m(cid:229)ste UVA-dosen eventuellt justeras i n(cid:229)gon m(cid:229)n. Som kriterium skall d(cid:229) g(cid:228)lla att str(cid:229)l- ningen inte f(cid:229)r vara skadlig f(cid:246)r cellerna men tillr(cid:228)cklig f(cid:246)r detektering av vanliga fototoxiska (cid:228)mnen. Tiden f(cid:246)r ljusexponeringen ber(cid:228)knas p(cid:229) f(cid:246)ljande s(cid:228)tt: 1. 7. 2 F(cid:246)rs(cid:246)ksf(cid:246)rh(cid:229)llanden Testkemikaliens maximikoncentration f(cid:229)r inte (cid:246)verskrida 100 (cid:181)g/ml, eftersom alla fototoxiska kemikalier detekterades vid l(cid:228)gre koncentrationer. Vid h(cid:246)gre koncentrationer (cid:246)kar (cid:229)terigen f(cid:246)rekomsten av falska positiva utslag (13). Den h(cid:246)gsta koncentrationen av testkemikalien b(cid:246)r ha ett tillfredsst(cid:228)llande pH-v(cid:228)rde (pH-omr(cid:229)de: 6,5(cid:150)7,8). L 136/102 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning 8. 6. 2000 Koncentrationsomr(cid:229)dena f(cid:246)r en kemikalie som skall testas i n(cid:228)rvaro (+ UVA) respektive i fr(cid:229)nvaro (ﬂ UVA) av ljus skall f(cid:246)rst fastst(cid:228)llas p(cid:229) l(cid:228)mpligt s(cid:228)tt i f(cid:246)rberedande f(cid:246)rs(cid:246)k. Koncentrationsseriens omr(cid:229)de och intervall skall justeras p(cid:229) s(cid:229)dant s(cid:228)tt att f(cid:246)rs(cid:246)ksdata ger tillr(cid:228)ckligt underlag f(cid:246)r koncentrations-responskurvorna. Kon- centrationsserierna skall vara geometriska (dvs. ha konstant utsp(cid:228)dningsfaktor). 1. 7. 3 Testf(cid:246)rfarande (1) 1. 7. 3. 1 D a g 1 Bered en cellsuspension p(cid:229) 1 (cid:215) 105 celler/ml i n(cid:228)ringsl(cid:246)sning och dosera 100 (cid:181)l ren n(cid:228)ringsl(cid:246)sning i de peri- fera h(cid:229)len av en 96-h(cid:229)ls TC-mikroplatta (= blindprov). Dosera 100 (cid:181)l cellsuspension med 1 (cid:215) 105 celler/ml i de (cid:229)terst(cid:229)ende h(cid:229)len (= 1 (cid:215) 104 celler/h(cid:229)l). Det beh(cid:246)vs tv(cid:229) plattor per kemikalie: en f(cid:246)r best(cid:228)mning av cytoto- xicitet (ﬂ UVA) och en f(cid:246)r best(cid:228)mning av fotocytotoxicitet (+ UVA). Inkubera cellerna i 24 timmar (7,5 % CO2, 37 (cid:176)C) f(cid:246)r att f(cid:229) bildning av halvkonfluent monolayer. Denna inku- beringsperiod (cid:228)r tillr(cid:228)cklig f(cid:246)r cellernas (cid:229)terh(cid:228)mtning och vidh(cid:228)ftning samt exponentiell tillv(cid:228)xt. 1. 7. 3. 2 D a g 2 Dekantera n(cid:228)ringsl(cid:246)sningen fr(cid:229)n cellerna efter inkuberingen och tv(cid:228)tta tv(cid:229) g(cid:229)nger med 150 (cid:181)l EBSS/PBS per h(cid:229)l. Tills(cid:228)tt 100 (cid:181)l EBSS/PBS som inneh(cid:229)ller l(cid:228)mplig koncentration av testkemikalien eller rent l(cid:246)sningsmedel (negativ kontroll). Anv(cid:228)nd 8 olika koncentrationer av testkemikalien. Inkubera cellerna med testkemikalie i m(cid:246)rker i 60 minuter (7,5 % CO2, 37 (cid:176)C). Utf(cid:246)r best(cid:228)mningens + UVA-del genom att bestr(cid:229)la cellerna vid rumstemperatur i 50 minuter genom 96-h(cid:229)lsplattans lock med 1,7 mW/cm2 UVA (= 5 J/cm2). Ventilera med en fl(cid:228)kt f(cid:246)r att f(cid:246)rebygga kondensbild- ning under locket. H(cid:229)ll parallellplattorna (ﬂ UVA) vid rumstemperatur i en m(cid:246)rk l(cid:229)da i 50 minuter (= UVA-ex- poneringstiden). Dekantera testl(cid:246)sningen och tv(cid:228)tta tv(cid:229) g(cid:229)nger med 150 (cid:181)l EBSS/PBS. Ers(cid:228)tt EBSS/PBS med n(cid:228)ringsl(cid:246)sning och inkubera (7,5 % CO2, 37 (cid:176)C) (cid:246)ver natten (18(cid:150)22 timmar). 1. 7. 3. 3 D a g 3 Utv(cid:228)rdering med mikroskop Unders(cid:246)k cellerna i faskontrastmikroskop. Notera alla (cid:228)ndringar i cellernas morfologi till f(cid:246)ljd av cytologiska verkningar av testkemikalien. Denna unders(cid:246)kning rekommenderas som kontroll i syfte att utesluta experi- mentella fel men resultatet anv(cid:228)nds inte f(cid:246)r utv(cid:228)rdering av cytotoxicitet eller fototoxicitet. Test med upptagning av neutralr(cid:246)tt Tv(cid:228)tta cellerna med 150 (cid:181)l f(cid:246)ruppv(cid:228)rmd EBSS/PBS. Avl(cid:228)gsna tv(cid:228)ttl(cid:246)sningen genom att klappa f(cid:246)rsiktigt. Till- s(cid:228)tt 100 (cid:181)l NR-medium och inkubera vid 37 (cid:176)C, i fuktig atmosf(cid:228)r med 7,5 % CO2 i 3 timmar. Avl(cid:228)gsna NR-mediet efter inkuberingen och tv(cid:228)tta cellerna med 150 (cid:181)l EBSS/PBS. Dekantera och absorbera EBSS/PBS helt och h(cid:229)llet. (Alternativt: centrifugera omv(cid:228)nd platta. ) Tills(cid:228)tt exakt 150 (cid:181)l NR-desorptionsl(cid:246)sning (f(cid:228)rsk l(cid:246)sning av etanol och (cid:228)ttiksyra). Skaka plattan snabbt i en skakmaskin i 10 minuter f(cid:246)r att extrahera NR ur cellerna och f(cid:229) ett homogent NR- extrakt. M(cid:228)t NR-extraktets optiska densitet vid 540 nm i en spektrofotometer och anv(cid:228)nd blindproven som referens. Spara data i l(cid:228)mpligt filformat (t. ex. ASCII) f(cid:246)r efterf(cid:246)ljande analys. (1) N(cid:228)rmare detaljer finns i h(cid:228)nvisning 12. 8. 6. 2000 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning L 136/103 2. DATA 2. 1 Kvalitet och kvantitet hos data Erh(cid:229)llna data b(cid:246)r ge m(cid:246)jlighet till meningsfull analys av den koncentrationsberoende respons som konstate- rats i n(cid:228)rvaro och i fr(cid:229)nvaro av bestr(cid:229)lning med UVA/synligt ljus. Om cytotoxicitet detekteras skall b(cid:229)de kon- centrationsomr(cid:229)det och intervallet f(cid:246)r enskilda koncentrationer anpassas s(cid:229) att f(cid:246)rs(cid:246)ksdata kan sammanst(cid:228)llas till en kurva. Eftersom en testkemikalie kan vara icke-cytotoxisk upp till den definierade gr(cid:228)nskoncentrationen p(cid:229) 100 (cid:181)g/ml i m(cid:246)rkerf(cid:246)rs(cid:246)ket (ﬂ UVA) men mycket cytotoxisk n(cid:228)r den bestr(cid:229)las (+ UVA), m(cid:229)ste man eventu- ellt anv(cid:228)nda koncentrationsomr(cid:229)den av olika storleksordningar f(cid:246)r de tv(cid:229) delarna av f(cid:246)rs(cid:246)ket i syfte att f(cid:229) ade- kvat kvalitet p(cid:229) data. Om kemikalien inte uppvisar cytotoxicitet i n(cid:229)gondera f(cid:246)rs(cid:246)ksdelen (ﬂ UVA och + UVA) (cid:228)r det tillr(cid:228)ckligt att testa med stort intervall mellan enskilda doser upp till den h(cid:246)gsta koncentrationen. Klart positiva resultat beh(cid:246)ver inte verifieras genom upprepade f(cid:246)rs(cid:246)k. Dessutom beh(cid:246)ver klart negativa resul- tat inte verifieras f(cid:246)rutsatt att testkemikalien har testats vid tillr(cid:228)ckligt h(cid:246)ga koncentrationer. I s(cid:229)dana fall (cid:228)r det tillr(cid:228)ckligt med ett huvudf(cid:246)rs(cid:246)k som st(cid:246)ds av ett eller flera prelimin(cid:228)ra f(cid:246)rs(cid:246)k f(cid:246)r best(cid:228)mning av omr(cid:229)de. Om man f(cid:229)r testresultat som kommer n(cid:228)ra f(cid:246)ruts(cid:228)gbarhetsmodellens gr(cid:228)ns m(cid:229)ste resultaten verifieras genom upprepat test. Om upprepat test beh(cid:246)vs kan det vara viktigt att variera f(cid:246)rs(cid:246)ksf(cid:246)rh(cid:229)llandena f(cid:246)r att f(cid:229) ett tydligt resultat. En nyckelvariabel (cid:228)r d(cid:229) beredningen av testkemikaliel(cid:246)sningarna. D(cid:228)rf(cid:246)r kan variationer i beredningen (hj(cid:228)lpl(cid:246)s- ningsmedel, s(cid:246)nderdelning, ultraljudsbehandling) ha mycket stor relevans vid en upprepning. Alternativt kan man (cid:246)verv(cid:228)ga variation av inkuberingstiden f(cid:246)re bestr(cid:229)lningen. En kortare bestr(cid:229)lningstid kan ha betydelse n(cid:228)r det g(cid:228)ller kemikalier som inte (cid:228)r stabila i vatten. 2. 2 Hantering av resultaten N(cid:228)r detta (cid:228)r m(cid:246)jligt fastst(cid:228)lls den koncentration av testkemikalien som motsvarar en minskning p(cid:229) 50 % av cellernas NR-upptag (EC50). Detta kan genomf(cid:246)ras med hj(cid:228)lp av valfri icke-linj(cid:228)r regressionsprocedur (helst en Hill-funktion eller logistisk regressionsanalys) f(cid:246)r koncentrations-responsdata, eller med hj(cid:228)lp av andra anpass- ningsprocedurer (14). Innan ett EC50-v(cid:228)rde anv(cid:228)nds f(cid:246)r ytterligare ber(cid:228)kningar skall anpassningens kvalitet kontrolleras p(cid:229) tillb(cid:246)rligt s(cid:228)tt. Alternativt kan man anv(cid:228)nda grafiska anpassningsmetoder f(cid:246)r ber(cid:228)kning av EC50. I s(cid:229)dant fall rekommenderas anv(cid:228)ndning av sannolikhetspapper (x-skala: log, y-skala: probit) eftersom funktionen f(cid:246)r koncentrationsrespons efter denna omvandling i m(cid:229)nga fall blir n(cid:228)stan linj(cid:228)r. 2. 3 Utv(cid:228)rdering av resultaten (f(cid:246)ruts(cid:228)gbarhetsmodeller) 2. 3. 1 F(cid:246)ruts(cid:228)gbarhetsmodell version 1: Fotoirritationsfaktor (PIF) Om man som resultat f(cid:229)r fullst(cid:228)ndiga koncentrations-responskurvor b(cid:229)de i n(cid:228)rvaro (+ UVA) och i fr(cid:229)nvaro (ﬂ UVA) av ljus, kan en fotoirritationsfaktor (PIF) ber(cid:228)knas med hj(cid:228)lp av f(cid:246)ljande formel: En PIF-faktor under 5 tyder p(cid:229) att kemikalien inte har fototoxisk potential, medan en PIF-faktor ¯ 5 tyder p(cid:229) fototoxisk potential. Om en kemikalie endast (cid:228)r cytotoxisk n(cid:228)r den testas med + UVA men inte (cid:228)r cytotoxisk n(cid:228)r den testas med ﬂ UVA kan PIF inte ber(cid:228)knas, (cid:228)ven om detta (cid:228)r ett resultat som tyder p(cid:229) fototoxisk potential. I ett s(cid:229)dant fall kan man ber(cid:228)kna ett (cid:146)> PIF(cid:146)-v(cid:228)rde om (ﬂ UV)-cytotoxicitetstestet genomf(cid:246)rs upp till den h(cid:246)gsta testkoncentra- tionen (Cmax) och detta v(cid:228)rde anv(cid:228)nds f(cid:246)r ber(cid:228)kning av (cid:146)> PIF(cid:146): Om endast (cid:146)> PIF(cid:146) kan erh(cid:229)llas tyder varje v(cid:228)rde st(cid:246)rre (cid:228)n 1 p(cid:229) fototoxisk potential. Om varken EC50 (ﬂ UV) eller EC50 (+ UV) kan ber(cid:228)knas p(cid:229) grund av att en kemikalie inte uppvisar n(cid:229)gon cyto- toxicitet upp till den h(cid:246)gsta testkoncentrationen, tyder detta p(cid:229) avsaknad av fototoxisk potential. I s(cid:229)dana fall anv(cid:228)nds ett formellt v(cid:228)rde (cid:146)PIF = *1(cid:146) f(cid:246)r att karakterisera resultatet: L 136/104 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning 8. 6. 2000 Om endast (cid:146)PIF = * 1(cid:146) kan erh(cid:229)llas tyder detta p(cid:229) avsaknad av fototoxisk potential. I fall (b) och fall (c) skall resultaten fr(cid:229)n 3T3 NRU-fototoxicitetstestet in vitro omsorgsfullt beaktas vid f(cid:246)ruts(cid:228)- gelse av den fototoxiska potentialen. 2. 3. 2 F(cid:246)ruts(cid:228)gbarhetsmodell version 2: MPE (Mean-Photo-Effect) Alternativt kan en ny version av modellen f(cid:246)r f(cid:246)ruts(cid:228)gbarhet av den fototoxiska potentialen till(cid:228)mpas. Denna nya version har tagits fram med hj(cid:228)lp av data fr(cid:229)n EU/COLIPA-valideringsstudien (15) och har testats under blindf(cid:246)rh(cid:229)llanden i en efterf(cid:246)ljande studie om in vitro-fototoxiciteten hos UV-filterkemikalier (13). Med st(cid:246)d av denna modell kan man (cid:246)verkomma PIF-modellens begr(cid:228)nsningar i fall d(cid:228)r EC50 inte kan erh(cid:229)llas. Modellen st(cid:246)der sig p(cid:229) MPE, ett m(cid:229)tt som grundar sig p(cid:229) j(cid:228)mf(cid:246)relse av de fullst(cid:228)ndiga koncentrations-responskurvorna. MPE-modellen till(cid:228)mpas med hj(cid:228)lp av ett datorprogram som har utvecklats speciellt f(cid:246)r (cid:228)ndam(cid:229)let vid Hum- boldt-universitetet (Berlin, Tyskland) och som kan rekvireras kostnadsfritt. 2. 4 Tolkning av resultaten Ett positivt resultat i 3T3 NRU-fototoxicitetstest in vitro (PIF ¯ 5 eller MPE ¯ 0,1) indikerar att test(cid:228)mnet har fototoxisk potential. Om resultatet f(cid:229)s med koncentrationer under 10 (cid:181)g/ml (cid:228)r det sannolikt att testkemikalien ocks(cid:229) fungerar som fototoxin under olika exponeringsf(cid:246)rh(cid:229)llanden in vivo. Om positivt resultat endast f(cid:229)s med den h(cid:246)gsta testkoncentrationen p(cid:229) 100 (cid:181)g/ml kan det vara n(cid:246)dv(cid:228)ndigt med ytterligare (cid:246)verv(cid:228)ganden f(cid:246)r bed(cid:246)mningen av risk eller fototoxisk potential. S(cid:229)dana kan inbegripa data om penetrering, absorption och m(cid:246)jlig ackumulering av kemikalien i huden, eller testning av kemikalien i ett bekr(cid:228)ftande alternativt test, t. ex. med modell av human hud in vitro. Ett negativt resultat fr(cid:229)n 3T3 NRU-fototoxicitetstest in vitro (PIF < 5 eller MPE < 0,1) indikerar att test(cid:228)mnet under g(cid:228)llande f(cid:246)rh(cid:229)llanden inte (cid:228)r fototoxiskt f(cid:246)r de odlade d(cid:228)ggdjurscellerna. I fall d(cid:228)r kemikalien kan testas upp till den h(cid:246)gsta koncentrationen p(cid:229) 100 (cid:181)g/ml indikerar ett negativt resultat att kemikalien saknar fototo- xisk potential och att fototoxicitet in vivo kan anses osannolik. I fall d(cid:228)r identisk koncentrations-toxicitets- respons (EC50+ UV och EC50ﬂ UV) f(cid:229)s vid l(cid:228)gre koncentrationer skall data tolkas p(cid:229) samma s(cid:228)tt. Om d(cid:228)remot ingen fototoxicitet kan p(cid:229)visas (+ UV och ﬂ UV) och om begr(cid:228)nsad vattenl(cid:246)slighet medf(cid:246)r att man inte kan f(cid:229) koncentrationer p(cid:229) (cid:246)ver 100 (cid:181)g/ml, m(cid:229)ste test(cid:228)mnets l(cid:228)mplighet f(cid:246)r best(cid:228)mningen ifr(cid:229)gas(cid:228)ttas och bekr(cid:228)f- tande testning b(cid:246)r (cid:246)verv(cid:228)gas (t. ex. med modell av human hud in vitro, hudmodell ex vivo eller in vivo-test). 3 RAPPORTERING Testrapport Testrapporten skall inneh(cid:229)lla f(cid:246)ljande uppgifter: Testkemikalier: (cid:151) identifieringsdata och CAS-nr (i m(cid:229)n av tillg(cid:228)nglighet), (cid:151) fysikalisk form och renhetsgrad, (cid:151) fysikalisk-kemiska egenskaper av betydelse f(cid:246)r studien, (cid:151) stabilitet och fotostabilitet (i m(cid:229)n av tillg(cid:228)nglighet). L(cid:246)sningsmedel: (cid:151) motivering f(cid:246)r valet av l(cid:246)sningsmedel, (cid:151) testkemikaliens l(cid:246)slighet i det valda l(cid:246)sningsmedlet, (cid:151) procenthalten l(cid:246)sningsmedel i behandlingsmediet (EBSS eller PBS). Celler: (cid:151) typ av celler och deras k(cid:228)lla, (cid:151) fr(cid:229)nvaron av mykoplasma, (cid:151) antalet cellpassager (i m(cid:229)n av tillg(cid:228)nglighet), (cid:151) cellernas UVA-k(cid:228)nslighet, best(cid:228)md med den bestr(cid:229)lningsutrustning som anv(cid:228)nts f(cid:246)r 3T3 NRU-fototoxici- tetstest in vitro. F(cid:246)rs(cid:246)ksf(cid:246)rh(cid:229)llanden (a) (cid:150) inkubering f(cid:246)re och efter behandlingen: (cid:151) n(cid:228)ringsl(cid:246)sningens (kulturmediets) typ och sammans(cid:228)ttning, (cid:151) inkuberingsf(cid:246)rh(cid:229)llanden (CO2-koncentration, temperatur, fuktighet), (cid:151) inkuberingens varaktighet (f(cid:246)rbehandling, efterbehandling). 8. 6. 2000 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning L 136/105 F(cid:246)rs(cid:246)ksf(cid:246)rh(cid:229)llanden (b) (cid:150) behandling med kemikalien: (cid:151) motivering f(cid:246)r valet av de koncentrationer av testkemikalien som anv(cid:228)nts i n(cid:228)rvaro och i fr(cid:229)nvaro av bestr(cid:229)lning med UV/synligt ljus, (cid:151) om testkemikalien (cid:228)r begr(cid:228)nsat l(cid:246)slig och om cytotoxicitet inte f(cid:246)religger, motivering f(cid:246)r den h(cid:246)gsta kon- centration som testats, (cid:151) typ av och sammans(cid:228)ttning hos behandlingsmediet (buffrad saltl(cid:246)sning), (cid:151) kemikaliebehandlingens varaktighet. F(cid:246)rs(cid:246)ksf(cid:246)rh(cid:229)llanden (c) (cid:150) bestr(cid:229)lning: (cid:151) motivering f(cid:246)r valet av den ljusk(cid:228)lla som anv(cid:228)nts, (cid:151) ljusk(cid:228)llans spektrala str(cid:229)lningsegenskaper, (cid:151) transmissions- och absorptionsegenskaper hos filter som anv(cid:228)nts, (cid:151) radiometerns egenskaper och n(cid:228)rmare uppgifter om kalibreringen, (cid:151) avst(cid:229)nd mellan ljusk(cid:228)lla och testsystem, (cid:151) UVA-bestr(cid:229)lning p(cid:229) detta avst(cid:229)nd, uttryckt i mW/cm2, (cid:151) varaktigheten hos bestr(cid:229)lningen med UV/synligt ljus, (cid:151) UVA-dos (bestr(cid:229)lning (cid:215) tid), uttryckt i J/cm2, (cid:151) temperatur som anv(cid:228)nts f(cid:246)r cellodlingarna under bestr(cid:229)lningen och f(cid:246)r cellodlingar som parallellt h(cid:229)llits i m(cid:246)rker. F(cid:246)rs(cid:246)ksf(cid:246)rh(cid:229)llanden (d) (cid:150) NRU test: (cid:151) sammans(cid:228)ttning hos NR-mediet, (cid:151) NR-inkuberingens varaktighet, (cid:151) inkuberingsf(cid:246)rh(cid:229)llanden (CO2-koncentration, temperatur, fuktighet), (cid:151) NR-extraktionsbetingelser (extraktionsmedel, varaktighet), (cid:151) v(cid:229)gl(cid:228)ngd som anv(cid:228)nts f(cid:246)r spektrofotometrisk avl(cid:228)sning av optisk densitet f(cid:246)r NR, (cid:151) annan v(cid:229)gl(cid:228)ngd (referens), om s(cid:229)dan har anv(cid:228)nts, (cid:151) spektrofotometerblindprovets inneh(cid:229)ll, om blindprov har anv(cid:228)nts. Resultat: (cid:151) cellviabilitet som erh(cid:229)llits vid varje koncentration av testkemikalien, uttryckt som genomsnittlig procentu- ell andel j(cid:228)mf(cid:246)rt med kontrollernas viabilitet, (cid:151) koncentrations-responskurvor (testkemikaliekoncentration i f(cid:246)rh(cid:229)llande till relativ cellviabilitet), som erh(cid:229)llits i parallella f(cid:246)rs(cid:246)k med + UVA och ﬂ UVA, (cid:151) dataanalys av koncentrations-responskurvorna: om m(cid:246)jligt ber(cid:228)kning av EC50 (+ UVA) och EC50 (ﬂ UVA), (cid:151) j(cid:228)mf(cid:246)relse av de tv(cid:229) koncentrations-responskurvorna som erh(cid:229)llits i n(cid:228)rvaro och i fr(cid:229)nvaro av bestr(cid:229)lning med UVA/synligt ljus, antingen genom ber(cid:228)kning av PIF eller genom ber(cid:228)kning av MPE, (cid:151) klassificering av fototoxisk potential, (cid:151) kriterier f(cid:246)r godk(cid:228)nnande av testet (a) (cid:150) parallell negativkontroll: (cid:151) absolut viabilitet (optisk densitet hos NR-extrakt) hos bestr(cid:229)lade och obestr(cid:229)lade celler, (cid:151) historiska data f(cid:246)r negativkontroll, medelv(cid:228)rde och standardavvikelse. kriterier f(cid:246)r godk(cid:228)nnande av test (b) (cid:150) parallell positivkontroll: (cid:151) EC50 (+ UVA) och EC50 (ﬂ UVA) och PIF f(cid:246)r positivkontrollkemikalie, (cid:151) historiska data f(cid:246)r positivkontrollkemikalie: EC50 (+ UVA) och EC50 (ﬂ UVA) och PIF, medelv(cid:228)rde och standardavvikelse Diskussion av resultaten Slutsatser L 136/106 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning 8. 6. 2000 4. H˜NVISNINGAR (1) Spielmann, H. , Balls, M. , D(cid:246)ring, B. , Holzh(cid:252)tter, H. G. , Kalweit, S. , Klecak, G. , L’Eplattenier, H. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Moldenhauer, F. , Moore, L. , Pape, W. , Pfannbecker, U. , Potthast, J. , De Silva, O. , Steiling, W. and Willshaw, A. ( 1994), EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay, Toxicology in Vitro 8, s. 793(cid:150)796. (2) Anon (1998), Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototo- xicity), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA 26, s. 7(cid:150)8. (3) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. W. , Pechovitch, G. , De Silva, O. , Holzh(cid:252)tter, H. G. , Clo- thier, R. , Desolle, P. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Pfannenbecker, U. , Potthast, J. M. , Csato, M. , Sladowski, D. , Steiling, W. and Brantom, P. (1998), EU/COLIPA (cid:146)In vitro phototoxicity(cid:146) validation study, results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test, Toxicology in Vitro 12, s. 305(cid:150)327. (4) OECD Test Guidelines Programme, ENV/MC/CHEM/TG(96)9: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria of Alternative Toxicological Test Methods, OECD Publications Office, Paris, 1996. (5) Lovell, W. W. (1993), A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential, Toxico- logy in Vitro 7, s. 95(cid:150)102. (6) Santamaria, L. and Prino, G. (1972), List of the photodynamic substances, Research progress in organic, biological and medicinal chemistry Vol. 3 Part 1, North Holland Publishing Co, Amsterdam, s. XI(cid:150)XXXV. (7) Spielmann, H. , Lovell, W. W. , H(cid:246)lzle, E. , Johnson, B. E. , Maurer, T. , Miranda, M. A. , Pape, W. J. W. , Sapora, O. and Sladowski, D. (1994), In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM workshop 2, ATLA 22, s. 314(cid:150)348. (8) Spikes, J. D. (1989), Photosensitization, The science of photobiology, edited by KC Smith, Plenum Press, New York, 2nd edition, s. 79(cid:150)110. (9) Borenfreund, E. and Puerner, J. A. (1985), Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption, Toxicology Letters 24, s. 119(cid:150)124. (10) Lambert L. A, Warner W. G. and Kornhauser A. (1996), Animal models for phototoxicity testing, Der- matotoxicology, edited by FN Marzulli and HI Maibach, published by Taylor & Francis, Washington DC, 5th Edition, s. 515(cid:150)530. (11) Tyrrell R. M. and Pidoux M (1987), Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytotox- icity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocytes, Cancer Research 47, s. 1825(cid:150)1829. (12) ZEBET/ECVAM/COLIPA, Standard Operating Procedure: Balb/c 3T3 NRU Phototoxicity Test, drafted 23 December 1997 by M. Liebsch and approved 6 March 1998 by the Management Team of the EU/ COLIPA project (cid:146)In Vitro Photoirritation(cid:146). (13) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. W. , De Silva, O. , Holzh(cid:252)tter, H. G. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. and Pfannenbecker (1998), A Study on the Phototoxic Potential of UV Filter Chemicals from Annex VII of the EU Directive 76/768/EEC in the 3T3 NRU In Vitro Phototoxicity Test, ATLA 26, s. 679(cid:150)708. (14) Holzh(cid:252)tter, H. G. and Quedenau, J. (1995), Mathematical modelling of cellular responses to external signals, Journal of Biological Systems 3, s. 127(cid:150)138. (15) Holzh(cid:252)tter, H. G. (1997), A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals, ATLA 25, s. 445(cid:150)462. 8. 6. 2000 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning L 136/107 Till(cid:228)gg


title: Commission Directive 2000/21/EC of 25 April 2000 concerning the list of Community legislation referred to in the fifth indent of Article 13(1) of Council Directive 67/548/EEC (Text with EEA relevance)

eurovoc_concepts:
application of EU law
dangerous substance
exchange of information
labelling
marketing
national implementing measure

formats: html pdf print

text: L 103/70 EN Official Journal of the European Communities 28. 4. 2000 COMMISSION DIRECTIVE 2000/21/EC of 25 April 2000 concerning the list of Community legislation referred to in the fifth indent of Article 13(1) of Council Directive 67/548/EEC (Text with EEA relevance) THE COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES, (3) Having regard to the Treaty establishing the European Community, Having regard to Council Directive 67/548/EEC of 27 June 1967 on the approximation of laws, regulations and adminis- trative provisions relating to the classification, packaging and labelling of dangerous substances (1), as last amended by Euro- pean Parliament and Council Directive 1999/33/EC (2), and in particular Article 13(1) thereof, (4) (5) Whereas: Substances exclusively used as active substances of biocidal products, according to Directive 98/8/EC of the European Parliament and of the Council of 16 February 1998 concerning the placing of biocidal products on the market (6), fall under the fifth indent of Article 13(1) of be 67/548/EEC and Directive including for the purpose of research and exempted, development, to confine the authorisation procedures for such substances solely to the scope of Directive 98/8/EC. in order therefore should Directive 93/90/EEC should be repealed. The provisions of this Directive are in accordance with the opinion of the Committee on the Adaptation to Technical Progress of the Directives for the Elimination of Technical Barriers to Trade in Dangerous Substances and Preparations, (1) (2) Article 13(1) of Directive 67/548/EEC exempts certain substances from the provisions of Articles 7, 8, 14 and 15 of the said Directive, which refer to notification. the fifth indent of Article 13(1) More specifically, exempts substances which are for exclusive use in other product sectors for which Community notification or approval procedures exist and for which the require- ments for data submission are equivalent to those laid down in Directive 67/548/EEC. Therefore, the Commis- sion is required to establish a list of those pieces of Community legislation which contain such notification or approval procedures. The list will be re-examined periodically and, as necessary, revised. Council Directive 91/414/EEC of 15 July 1991 concerning the placing of plant protection products on the market (3), as last amended by Commission Directive 1999/80/EC (4), provides for the inclusion of active substances into its Annex I as a prerequisite for author- isation of the said products prior to placing them on the market. Commission Directive 93/90/EEC of 29 October 1993 concerning the list of substances referred to in Article 13(1) fifth indent of Council Directive 67/ 548/EEC (5) only covers active substances for inclusion in Annex I of Directive 91/414/EEC, which concerns the placing on the market. Active substances to be author- ised for other purposes, including research and develop- ment according to Article 22 of Directive 91/414/EEC, should also be covered in order to confine the author- isation procedures for such substances solely to the scope of Directive 91/414/EEC. (1) OJ 196, 16. 8. 1967, p. 1. (2) OJ L 199, 30. 7. 1999, p. 57. (3) OJ L 230, 19. 8. 1991, p. 1. (4) OJ L 210, 10. 8. 1999, p. 13. (5) OJ L 277, 10. 11. 1993, p. 33. HAS ADOPTED THIS DIRECTIVE: Article 1 The list of Community legislation concerning product sectors for which Community notification or approval procedures exist, and for which the requirements for data submission for the categories of substances identified in the list are equivalent to those laid down in Directive 67/548/EEC, is contained in the Annex to this Directive. Article 2 Directive 93/90/EEC is hereby repealed. Article 3 1. Member States shall adopt and publish the provisions necessary to comply with this Directive by 1 April 2001 and shall immediately inform the Commission thereof. 2. When Member States adopt these provisions, they shall contain a reference to this Directive or be accompanied by such a reference on the occasion of their official publication. Member States shall determine how such reference is to be made. (6) OJ L 123, 24. 4. 1998, p. 1. 28. 4. 2000 EN Official Journal of the European Communities L 103/71 This Directive is addressed to the Member States. Article 4 Done at Brussels, 25 April 2000. For the Commission Margot WALLSTRÖM Member of the Commission ANNEX Community legislation concerning product sectors for which Community notification or approval procedures exist and for which the requirements for data submission for the categories of substances identified are equivalent to those laid down in Articles 7, 8, 14 and 15 of Directive 67/548/EEC 1. Council Directive 91/414/EEC of 15 July 1991 concerning the placing of plant protection products on the market. 2. Directive 98/8/EC of the European Parliament and of the Council of 16 February 1998 concerning the placing of biocidal products on the market. For substances for exclusive use as active substances of plant protection products and/or biocidal products


title: 2000/324/CE: Decisión de la Comisión, de 25 de abril de 2000, por la que se modifica la Decisión 1999/215/CE por la que se aceptan los compromisos ofrecidos con respecto a los procedimientos antidumping relativos a las importaciones de cuerdas para atadoras o gavilladoras de polipropileno originarias de Polonia, la República Checa y Hungría y por la que se da por concluido el procedimiento relativo a las importaciones de ese producto originario de Arabia Saudí [notificada con el número C(2000) 1058]

eurovoc_concepts:
anti-dumping duty
import
manufactured goods
originating product
plastics
third country

text: 11. 5. 2000 ES Diario Oficial de las Comunidades Europeas L 112/65 II (Actos cuya publicación no es una condición para su aplicabilidad) COMISIÓN DECISIÓN DE LA COMISIÓN de 25 de abril de 2000 por la que se modifica la Decisión 1999/215/CE por la que se aceptan los compromisos ofrecidos con respecto a los procedimientos antidumping relativos a las importaciones de cuerdas para atadoras o gavilladoras de polipropileno originarias de Polonia, la República Checa y Hungría y por la que se da por concluido el procedimiento relativo a las importaciones de ese producto originario de Arabia Saudí [notificada con el número C(2000) 1058] (2000/324/CE) LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS, Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Europea, Visto el Reglamento (CE) no 384/96 del Consejo, de 22 de diciembre de 1995, relativo a la defensa contra las importaciones que sean objeto de dumping por parte de países no miembros de la Comunidad Europea (1), cuya última modificación la constituye el Reglamento (CE) no 905/98 (2) y, en particular, el apartado 9 de su artículo 8, Previa consulta al Comité consultivo, Considerando lo siguiente: A. PROCEDIMIENTO PREVIO (1) (2) A raíz de una investigación abierta mediante un anuncio publicado en el Diario Oficial de las Comunidades Europeas (3), el Consejo, mediante el Reglamento (CE) no 603/1999 (4), impuso derechos antidumping definitivos sobre las importaciones de cuerdas para atadoras o gavilladoras de polipro- pileno originarias de Polonia, la República Checa y Hungría. También en el marco de esta investigación, la Comisión, mediante la Decisión 1999/215/CE, de 16 de marzo de 1999 (5), aceptó un compromiso de precios ofrecido por, inter alia, la empresa polaca WKI Isoliertechnik Spolka z. o. o (en lo sucesivo, «la empresa»). B. RETIRADA DEL COMPROMISO (3) La empresa ha retirado ahora, sin embargo, su compromiso al tener dificultades en el cumplimiento de determinadas condiciones del mismo. (1) DO L 56 de 6. 3. 1996, p. 1. (2) DO L 128 de 30. 4. 1998, p. 18. (3) DO C 1 de 3. 1. 1998, p. 10. (4) DO L 75 de 20. 3. 1999, p. 1. (5) DO L 75 de 20. 3. 1999, p. 34. L 112/66 ES Diario Oficial de las Comunidades Europeas 11. 5. 2000 (4) (5) Por consiguiente, en vista de esta retirada, debe modificarse la Decisión 1999/215/CE para suprimir el nombre de la empresa de la lista de empresas de las que se han aceptado compromisos en este procedimiento. Paralelamente a esta Decisión, la Comisión, mediante el Reglamento (CE) no 968/2000 (1), ha retirado la exención de los derechos antidumping concedida a esta empresa y le ha impuesto un derecho antidumping definitivo. HA ADOPTADO LA PRESENTE DECISIÓN: Artículo 1 El apartado 1 del artículo 1 de la Decisión 1999/215/CE se sustituirá por el texto siguiente: «1. Se aceptan los compromisos ofrecidos por los productores mencionados a continuación, en el marco de los procedimientos antidumping relativos a las importaciones de cuerdas para atadoras o gavilladoras de polipropileno originarias de Polonia, la República Checa y Hungría. República Checa Hungría País Empresa Juta a. s. Lanex a. s. Partium (cid:1)70 Rt Tiszai Vegyi Kombinat Rt Elso Magyar Kenderfono Rt Artículo 2 Código TARIC adicional 8596 8580 8581 8582 8583» La presente Decisión entrará en vigor el día siguiente al de su publicación en el Diario Oficial de las Comunidades Europeas. Hecho en Bruselas, el 25 de abril de 2000. Por la Comisión Pascal LAMY Miembro de la Comisión (1) Véase la página 1 del presente Diario Oficial


title: 2000/331/CE: Decisão da Comissão, de 25 de Abril de 2000, que altera a Decisão 1999/813/CE que estabelece as condições especiais de importação de produtos da pesca originários da República Socialista do Vietname [notificada com o número C(2000) 1050] (Texto relevante para efeitos do EEE)

eurovoc_concepts:
Vietnam
fishery product
health certificate
import
originating product
veterinary inspection

text: 13. 5. 2000 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 114/39 DECISÃO DA COMISSÃO de 25 de Abril de 2000 que altera a Decisão 1999/813/CE que estabelece as condições especiais de importação de produtos da pesca originários da República Socialista do Vietname [notificada com o número C(2000) 1050] (Texto relevante para efeitos do EEE) (2000/331/CE) A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS, Vietname é alterado do seguinte modo: 1. Ao ponto IV é aditado um ponto 7 com a seguinte redacção: «7. Caso os produtos da pesca em questão sejam moluscos bivalves congelados ou transformados: os moluscos foram obtidos nas zonas de produção aprovadas enumeradas no anexo da Decisão 2000/333/CE da Comissão (*) que estabelece condições especiais de importação de moluscos bivalves, equinodermos, tuni- cados e gastrópodes marinhos originários da República Socialista do Vietname, tendo sido esterilizados ou tratados termicamente em conformidade com as exigên- cias da Decisão 93/25/CE da Comissão. (*) JO L 114 de 13. 5. 2000, p. 42. ». 2. O último travessão do ponto IV passa a ter a seguinte redacção: «— O abaixo assinado, inspector oficial, declara ter conhecimento das disposições das Directivas 91/ /492/CEE, 91/493/CEE e 92/48/CEE e das Decisões 93/25/CE, 1999/813/CE e 2000/333/CE. ». Artigo 2. o Estados-Membros Os decisão. são os destinatários da presente Feito em Bruxelas, em 25 de Abril de 2000. Pela Comissão David BYRNE Membro da Comissão Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia, Tendo em conta a Directiva 91/493/CEE do Conselho, de 22 de Julho de 1991, que adopta as normas sanitárias relativas à produção e à colocação no mercado dos produtos da pesca (1), com a última redacção que lhe foi dada pela Directiva 97/ /79/CE (2), e, nomeadamente, o n. o 1 do seu artigo 11. o, Considerando o seguinte: (1) (2) (3) (4) (5) A Decisão 1999/813/CE da Comissão, de 16 de Novembro de 1999, estabelece as condicões especiais de importacão de produtos da pesca originários da Repú- blica Socialista do Vietname (3). A Comissão adoptou a Decisão 2000/333/CE que esta- belece condições especiais de importação de moluscos bivalves, equinodermos, tunicados e gastrópodes mari- nhos originários da República Socialista do Vietname (4). A República Socialista do Vietname pretende exportar para a Comunidade moluscos bivalves, equinodermos, tunicados e gastrópodes marinhos congelados ou trans- formados e submetidos a processos de esterilização ou tratamento térmico em conformidade com as exigências da Decisão 93/25/CEE da Comissão (5), alterada pela Decisão 97/275/CE (6). É, portanto, necessário alterar o certificado sanitário constante do anexo A da Decisão 1999/813/CE. As medidas previstas na presente decisão estão em conformidade com o parecer do Comité Veterinário Permanente, ADOPTOU A PRESENTE DECISÃO: Artigo 1. o O certificado sanitário constante do anexo A da Decisão 1999/ /813/CE que deve acompanhar as remessas de produtos da pesca originários ou procedentes da República Socialista do (1) JO L 268 de 24. 9. 1991, p. 15. (2) JO L 24 de 30. 1. 1998, p. 31. (3) JO L 315 de 9. 12. 1999, p. 39. (4) Ver página 42 do presente Jornal Oficial. (5) JO L 16 de 25. 1. 1993, p. 22. (6) JO L 108 de 25. 4. 1997, p. 2


title: Kommissionens förordning (EG) nr 830/2000 av den 25 april 2000 om ändring av de representativa priserna och tilläggsbeloppen för import av vissa sockerprodukter

eurovoc_concepts:
CCT duties
import
representative price
sugar
sugar product

formats: pdf print

text: 26. 4. 2000 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning L 101/29 KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EG) nr 830/2000 av den 25 april 2000 om ändring av de representativa priserna och tilläggsbeloppen för import av vissa sockerprodukter EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DENNA FÖRORDNING med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen, (2) med beaktande av rådets förordning (EEG) nr 2038/1999 av den 13 september 1999 om den gemensamma organisationen av marknaden för socker (1). med beaktande av kommissionens förordning (EG) nr 1423/95 av den 23 juni 1995 om tillämpningsföreskrifter för import av produkter inom sockersektorn med undantag av melass (2), senast ändrad genom förordning (EG) nr 624/98 (3), särskilt andra stycket i artikel 1. 2 och artikel 3. 1 i denna, och av följande skäl: 1441/1999 (4), senast ändrad genom förordning (EG) nr 806/2000 (5). I enlighet med de regler och villkor för fastställande som anges i förordning (EG) nr 1423/95 medför de uppgifter som kommissionen har kännedom om att de belopp som nu är i kraft bör ändras enligt bilagan till den här förordningen. HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE. Artikel 1 De representativa priserna och tilläggsbeloppen för import av de produkter som avses i artikel 1 i förordning (EG) nr 1423/ 95 skall vara de som anges i bilagan. (1) De representativa priserna och tilläggsbeloppen för import av vitsocker, råsocker och vissa sockerlösningar förordning (EG) nr fastställs genom kommissionens Denna förordning träder i kraft den 26 april 2000. Artikel 2 Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla medlemsstater. Utfärdad i Bryssel den 25 april 2000. På kommissionens vägnar Franz FISCHLER Ledamot av kommissionen (1) EGT L 252, 25. 9. 1999, s. 1. (2) EGT L 141, 24. 6. 1995, s. 16. (3) EGT L 85, 20. 3. 1998, s. 5. (4) EGT L 166, 1. 7. 1999, s. 77. (5) EGT L 96, 18. 4. 2000, s. 42. L 101/30 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning 26. 4. 2000 till kommissionens förordning av den 25 april 2000 om ändring av de representativa priser och de tilläggsbelopp som skall tillämpas för import av vitsocker, råsocker och produkter enligt KN-nummer 1702 90 99 BILAGA KN-nummer 1701 11 10 (1) 1701 11 90 (1) 1701 12 10 (1) 1701 12 90 (1) 1701 91 00 (2) 1701 99 10 (2) 1701 99 90 (2) 1702 90 99 (3) Representativt pris per 100 kg nettovikt av produkten i fråga Tilläggsbelopp per 100 kg nettovikt av produkten i fråga (EUR) 16,46 16,46 16,46 16,46 20,37 20,37 20,37 0,20 8,12 14,42 7,89 13,91 16,15 10,70 10,70 0,44 (1) Fastställande för den standardkvalitet som definieras i artikel 1 i rådets förordning (EEG) nr 431/68 (EGT L 89, 10. 4. 1968, s. 3), såsom den ändrats. (2) Fastställande för den standardkvalitet som definieras i artikel 1 i rådets förordning (EEG) nr 793/72 (EGT L 94, 21. 4. 1972, s. 1). (3) Fastställande per 1 % sackarosinnehåll