title: Direttiva 2000/33/CE della Commissione, del 25 aprile 2000, recante ventisettesimo adeguamento al progresso tecnico della direttiva 67/548/CEE del Consiglio concernente il ravvicinamento delle disposizioni legislative, regolamentari e amministrative relative alla classificazione, all'imballaggio e all'etichettatura delle sostanze pericolose (Testo rilevante ai fini del SEE.)

text: L 136/90 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:224) europee 8. 6. 2000 DIRETTIVA 2000/33/CE DELLA COMMISSIONE del 25 aprile 2000 recante ventisettesimo adeguamento al progresso tecnico della direttiva 67/548/CEE del Consiglio legislative, regolamentari e amministrative concernente il ravvicinamento delle disposizioni relative alla classificazione, all’imballaggio e all’etichettatura delle sostanze pericolose (*) (Testo rilevante ai fini del SEE) LA COMMISSIONE DELLE COMUNIT(cid:192) EUROPEE, HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA: visto il trattato che istituisce la Comunit(cid:224) europea, Articolo 1 vista la direttiva 67/548/CEE del Consiglio, del 27 giugno 1967, concernente il ravvicinamento delle disposizioni legisla- tive, regolamentari e amministrative relative alla classificazione, all’imballaggio e all’etichettatura delle sostanze pericolose (1), modificata da ultimo dalla direttiva 1999/33/CE (2) del Parla- mento europeo e del Consiglio, in particolare l’articolo 28, considerando quanto segue: (1) (2) (3) (4) L’allegato V della direttiva 67/548/CEE definisce i metodi di determinazione delle propriet(cid:224) fisico-chimiche, della tossicit(cid:224) ed ecotossicit(cid:224) di sostanze e preparati. ¨ necessa- rio adeguare al progresso tecnico tale allegato. L’articolo 7, paragrafo 2, della direttiva 86/609/CEE (3) concernente il ravvicinamento delle disposizioni legisla- tive, regolamentari e amministrative degli Stati membri relative alla protezione degli animali utilizzati a fini speri- mentali o ad altri fini scientifici stabilisce che si eviter(cid:224) di eseguire un esperimento qualora per ottenere il risultato ricercato sia ragionevolmente e praticamente applicabile un altro metodo, scientificamente valido, che non implichi l’impiego di animali. La Commissione intende introdurre all’allegato V della direttiva 67/548/CEE metodi di prova alternativi che non comportino l’impiego di animali per la sperimentazione di sostanze chimiche ai sensi dell’articolo 3, paragrafo 1, della direttiva 67/548/CEE. Il disposto della presente direttiva Ł conforme al parere del comitato per l’adeguamento al progresso tecnico delle direttive volte all’eliminazione degli ostacoli tecnici agli scambi nel settore delle sostanze e dei preparati perico- losi, I testi degli allegati I e II della presente direttiva sono aggiunti all’allegato V, parte B, della direttiva 67/548/CEE. Articolo 2 1. Gli Stati membri attuano le disposizioni legislative, rego- lamentari e amministrative necessarie per conformarsi alla pre- sente direttiva entro il 1o ottobre 2001. Essi ne informano immediatamente la Commissione. Quando gli Stati membri adottano tali disposizioni, queste con- tengono un riferimento alla presente direttiva o sono corredate di un siffatto riferimento all’atto della pubblicazione ufficiale. Le modalit(cid:224) del riferimento sono decise dagli Stati membri. 2. Gli Stati membri informano la Commissione delle princi- pali disposizioni nazionali che essi adottano nel settore discipli- nato dalla presente direttiva e trasmettono una tabella che indi- chi le correlazioni tra la presente direttiva e tali disposizioni. Articolo 3 La presente direttiva entra in vigore il terzo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:224) europee. Articolo 4 Gli Stati membri sono destinatari della presente direttiva. Fatto a Bruxelles, il 25 aprile 2000. Per la Commissione Margot WALLSTR(cid:214)M Membro della Commissione (*) Adottata prima del ventiseiesimo adeguamento. (1) GU 196 del 16. 8. 1967, pag. 1. (2) GU L 199 del 30. 7. 1999, pag. 57. (3) GU L 358 del 18. 12. 1986, pag. 1. 8. 6. 2000 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:224) europee L 136/91 ALLEGATO I «B. 40. CORROSIONE CUTANEA 1. METODO 1. 1. Introduzione Il Centro europeo per la convalida dei metodi alternativi (CECMA) del Centro comune di ricerca della Com- missione europea ha confermato la validit(cid:224) scientifica di due saggi in vitro per determinare la corrosivit(cid:224) cutanea di determinate sostanze. Trattasi del saggio di resistenza elettrica transcutanea della pelle di ratto (TER, transcutaneous electrical resistance) e di un saggio che utilizza un modello di cute umana (1) (2) (3). Lo studio di convalida del CECMA ha dimostrato che entrambi i metodi consentono di distinguere adeguata- mente le sostanze che notoriamente sono corrosive per la pelle da quelle non corrosive. Inoltre, il protocollo del saggio che utilizza un modello di cute umana consente di distinguere i diversi gradi degli effetti corrosivi (agenti noti per essere estremamente corrosivi, R35 e altri agenti corrosivi, R34) (2). Di entrambi i saggi sono fornite la descrizione e le procedure. La scelta del saggio da utilizzare Ł dettata dai requisiti specifici e dalle preferenze dell’utilizzatore. Cfr. anche la parte B nell’introduzione generale. 1. 2. Definizioni corrosione cutanea: produzione di danni irreversibili al tessuto cutaneo a seguito dell’applicazione di un mate- riale da saggiare. 1. 3. Sostanze di riferimento Nessuna specifica, ma cfr. i punti 1. 5. 3. 4 e 1. 7. 2. 3. 1. 4. Principio del metodo di saggio (cid:151) Saggio di resistenza elettrica transcutanea della pelle di ratto Il materiale di saggio Ł applicato per un massimo di 24 ore alle superfici epidermiche di lembi di cute di forma circolare (dischi) ottenuti dal mantello di giovani ratti sacrificati in maniera non cruenta. I materiali corrosivi sono identificati in base alla loro capacit(cid:224) di intaccare la normale integrit(cid:224) dello strato corneo e della sua funzione protettiva in termini di riduzione della normale resistenza elettrica transcutanea (TER) al di sotto di un determinato livello soglia (5 kh) (4) (5). I materiali irritanti e non irritanti non riducono la TER al di sotto del livello soglia. Il saggio pu(cid:242) comprendere anche una valutazione della capacit(cid:224) di legame con colorante per saggiare i surfactanti e le sostanze organiche neutre [per una definizione cfr. la voce bibliogra- fica (6)] allo scopo di ridurre il numero dei risultati di falso positivo ottenuti specificatamente con questi tipi di sostanze chimiche (2) (7). 1. 5. Descrizione del metodo di saggio (cid:151) Saggio di resistenza elettrica transcutanea della pelle di ratto 1. 5. 1. Animali Per la preparazione dei dischi cutanei vengono utilizzati giovani ratti (ratti Wistar o un ceppo equivalente di 20-23 giorni). Con un’apposita tosatrice viene rimosso il pelo della parte dorsale e laterale dell’animale. L’ani- male viene quindi accuratamente strofinato e lavato lungo il dorso e i fianchi tenendo la parte tosata immersa in una soluzione antibiotica (contenente per esempio streptomicina, penicillina, cloramfenicolo e anfotericina in concentrazioni tali da inibire la proliferazione dei batteri). Dopo 3-4 giorni si procede ad un ulteriore lavaggio con antibiotici. Gli animali cos(cid:236) trattati devono essere utilizzati entro tre giorni al massimo (per la produzione dei preparati cutanei gli animali non devono aver superato il 31o giorno di vita). 1. 5. 2. Preparazione dei lembi cutanei Gli animali vengono sacrificati con un metodo non cruento. Si procede quindi alla rimozione della parte dor- sale della cute e all’accurata eliminazione di tutto il grasso in eccesso. Il lembo cutaneo cos(cid:236) ottenuto viene posizionato sull’estremit(cid:224) di una provetta in PTFE (politetrafluoroetilene) in modo che la superficie epider- mica sia a contatto con la provetta, viene quindi fissato all’estremit(cid:224) della provetta mediante una ghiera inse- rita a pressione ed infine vengono eliminati gli orli di pelle debordante. La figura 1 indica le dimensioni della provetta e della ghiera. Infine la ghiera viene accuratamente saldata all’estremit(cid:224) della provetta mediante gela- tina di petrolio. La provetta viene fissata mediante una pinza a molla e quindi introdotta in un recipiente contenente una soluzione di magnesio solfato (154mM) (figura 2). 1. 5. 3. Procedura 1. 5. 3. 1. A p p l i c a z i o n e d e l m a t e r i a l e d i s a g g i o Le sostanze da saggiare in forma liquida (150(cid:181)l) vengono applicate alla superficie epidermica all’interno della provetta (figura 2). Per il saggio di materiali solidi la sostanza Ł applicata in quantit(cid:224) sufficiente al disco cuta- neo in modo da coprire l’intera superficie dell’epidermide. Si aggiunge acqua deionizzata (150(cid:181)l) sulla parte superiore del materiale solido ed infine si agita lievemente la provetta. Le sostanze da saggiare dovrebbero entrare in contatto con la cute il piø possibile. A tale scopo, nel caso di alcuni materiali solidi occorre proce- dere a fusione della sostanza da saggiare innalzando la temperatura ad un massimo di 30 (cid:176)C, oppure maci- nando la sostanza fino a produrne un granulato o una polvere. L 136/92 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:224) europee 8. 6. 2000 Per ciascuna sostanza da saggiare vengono utilizzati tre dischi cutanei. L’applicazione dura 24 ore (cfr. anche 1. 5. 3. 4). La sostanza viene quindi completamente rimossa mediante lavaggio sotto un getto di acqua corrente ad una temperatura di 30 (cid:176)C al massimo. Per facilitare l’eliminazione delle sostanze da saggiare che si sono solidificate all’interno della provetta si procede a lavaggio sotto acqua corrente a 30 (cid:176)C circa. 1. 5. 3. 2. M i s u r a z i o n e d e l l a T E R La TER viene misurata utilizzando un ponte dati a corrente alternata a basso voltaggio (ad esempio AIM 401 oppure 6401 o equivalente). Prima di misurare la resistenza elettrica viene ridotta la tensione di superficie della cute aggiungendo etanolo al 70 % in quantit(cid:224) tale da coprire l’intera epidermide. Dopo alcuni secondi si procede alla rimozione dell’etanolo mediante inversione della provetta e in seguito all’idratazione del tessuto per mezzo di una soluzione di 3ml di magnesio solfato (154mM). Per misurare la resistenza in kh/disco si posizionano gli elettrodi del ponte dati su entrambi i lati del disco (figura 2). La figura 1 mostra le dimen- sioni degli elettrodi e la lunghezza della parte dell’elettrodo che rimane al di sotto delle pinze a coccodrillo. Nel corso della misurazione la molletta di fissaggio dell’elettrodo interno (il piø spesso) viene collocata sul- l’estremit(cid:224) superiore della provetta affinchØ una buona parte dell’elettrodo rimanga immersa nella soluzione di magnesio solfato. L’elettrodo esterno (piø sottile) Ł collocato all’interno del recipiente in modo tale che rimanga sul fondo. La distanza tra il lato inferiore della molletta di fissaggio e il fondo della provetta deve essere mantenuta costante (figura 1) poichØ influisce sui valori della resistenza elettrica. Va osservato che qualora il valore di resistenza superi i 20 kh, ci(cid:242) potrebbe dipendere dal fatto che la sostanza ha formato un manto di rivestimento sulla superficie epidermica del disco cutaneo. Il rivestimento pu(cid:242) essere rimosso ad esempio sigillando la provetta col pollice rivestito da un guanto e scuotendola per circa 10 secondi. Si procede dunque all’eliminazione della soluzione di magnesio solfato e si ripete la misura- zione della resistenza con una nuova soluzione. La media dei risultati dei valori riferiti alla TER viene accettata a condizione che i valori concomitanti positivi e negativi rientrino nel margine (range) accettabile per il metodo. Le sostanze di controllo da saggiare e i rela- tivi valori minimi e massimi di resistenza accettabili per il metodo e le apparecchiature descritte sono i seguenti: Controllo Sostanza Positivo Negativo 10 M acido cloridrico (36 %) Acqua distillata Range delle resistenze (kh) 0,5-1,0 10-25 1. 5. 3. 3. P r o c e d u r a s p e c i f i c a p e r t e n s i o a t t i v i e s o s t a n z e o r g a n i c h e n e u t r e Se i valori della TER di sostanze di saggio che rientrano nelle categorie dei tensioattivi o delle sostanze orga- niche neutre sono inferiori o pari a 5 kh, si pu(cid:242) procedere ad una valutazione della penetrazione del colo- rante nel tessuto. Tale procedura consente di stabilire se si tratta di risultati falso positivi (2). 1. 5. 3. 3. 1. Applicazione e rimozione del colorante solforodamina B Dopo il trattamento iniziale con la sostanza di saggio viene applicata alla superficie dell’epidermide di ciascun disco cutaneo una soluzione di 150 (cid:181)l al 10 % (p/v) di solforodamina B diluita in acqua distillata per un periodo di 2 ore. I dischi cutanei vengono quindi lavati sotto un getto di acqua corrente a temperatura ambiente per circa 10 secondi al fine di eliminare completamente il colorante. Ogni disco cutaneo viene quindi rimosso cautamente dalla provetta e collocato in una fiala (ad esempio una fiala di scintillazione in vetro da 20 ml) contenente acqua deionizzata (8 ml). Le fiale vengono poi agitate leggermente per 5 minuti per eliminare completamente il colorante. Questa procedura di risciacquo viene ripetuta per procedere quindi alla rimozione dei dischi cutanei che vengono successivamente collocati in fiale contenenti 5 ml di una sostanza al 30 % (p/v) di sodio dodecil solfato (SDS) diluita in acqua distillata. Le fiale vengono quindi incu- bate per tutta la notte ad una temperatura di 60 (cid:176)C. Dopo il periodo di incubazione ogni singolo disco cuta- neo viene rimosso ed eliminato e la soluzione rimanente viene quindi centrifugata per 8 minuti ad una tem- peratura di 21 (cid:176)C (forza centrifuga relativa p 175). Si preleva quindi un campione di 1 ml del supernatante che viene diluito in parte 1 a 5 (p/v) [ovvero 1 ml + 4 ml] in una soluzione di SDS al 30 % (p/v) in acqua distillata. La densit(cid:224) ottica (DO) della soluzione viene misurata a circa 565 nm. 1. 5. 3. 3. 2. Calcolo del tenore del colorante Per ogni disco cutaneo si calcola il tenore del colorante solforodamina B in base ai valori della DO (coeffi- ciente di estinzione molare della solforodamina B a 565 nm = 8,7 (cid:215) 104; peso molecolare = 580). Per cia- scun disco cutaneo si stabilisce il tenore del colorante e si calcola la media del tenore per i replicati. I valori medi della colorazione sono accettati a condizione che i valori di controllo concomitanti rientrino nel range accettabile per il metodo. Il range del tenore del colorante ritenuto accettabile per le sostanze di controllo in base alla metodologia e alle apparecchiature descritte sono: 8. 6. 2000 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:224) europee L 136/93 Controllo Sostanza Positivo Negativo 10 M Acido cloridrico (36 %) Acqua distillata Range del colorante ((cid:181)g/disco) 40-100 15-35 1. 5. 3. 4. U l t e r i o r i d a t i Le sostanze da saggiare possono essere applicate ai dischi cutanei anche per periodi piø brevi (ad esempio 2 ore) per identificare i materiali che sono estremamente corrosivi. Tuttavia nello studio di convalida Ł emerso che il saggio TER stimava in eccesso il potenziale corrosivo di una serie di sostanze chimiche da saggiare applicate ai dischi cutanei per 2 ore (2), sebbene consentisse di identificare correttamente le sostanze corro- sive e quelle non corrosive dopo un’applicazione di 24 ore. Le propriet(cid:224) e le dimensioni delle apparecchiature e della procedura sperimentale utilizzata possono influire sui valori TER. La soglia di corrosivit(cid:224) di 5 kh Ł stata stabilita sulla base di dati ottenuti con le apparecchia- ture specifiche e le procedure descritte nel presente metodo. Se le condizioni di saggio vengono modificate in maniera significativa Ł probabile che si debbano applicare soglie e valori di controllo diversi. Di conseguenza si raccomanda di calibrare la metodologia e i valori soglia di resistenza saggiando una serie di sostanze stan- dard di riferimento scelte tra quelle utilizzate nel primo studio di convalida (3). 1. 6. Principio del metodo di saggio (cid:151) Saggio del modello di cute umana Il materiale da saggiare viene applicato localmente ad un modello tridimensionale di cute umana per un mas- simo di 4 ore; tale modello comprende uno strato epidermico ricostruito in cui Ł presente anche uno strato corneo funzionale. I materiali corrosivi vengono identificati in base alla loro capacit(cid:224) di ridurre la vitalit(cid:224) delle cellule (ad esempio come nel caso del saggio di riduzione MTT) al di sotto di determinati livelli soglia per periodi di esposizione specifici. Il principio del saggio Ł basato sull’ipotesi che le sostanze chimiche cor- rosive sono in grado di penetrare lo strato corneo (per diffusione o erosione) e che la loro citotossicit(cid:224) Ł tale da provocare la necrosi degli strati cellulari sottostanti. 1. 7. Descrizione del metodo di saggio (cid:151) Saggio del modello di cute umana 1. 7. 1. Modelli di cute umana I modelli di cute umana possono provenire da varie fonti, ma devono comunque soddisfare determinati cri- teri. Il modello di cute deve avere uno strato corneo funzionale e uno strato sottostante di cellule viventi. Lo strato corneo deve essere in grado di svolgere la sua funzione di barriera in modo adeguato. La sua funziona- lit(cid:224) pu(cid:242) essere appurata dimostrando la capacit(cid:224) di resistenza del modello di cute alla citotossicit(cid:224) mediante applicazione di sostanze notoriamente citotossiche per le cellule ma normalmente non in grado di attraver- sare la barriera dello strato corneo. Il modello deve poter fornire risultati riproducibili in condizioni speri- mentali ben definite. La vitalit(cid:224) delle cellule viventi nel modello cutaneo deve esser tale da consentire un’adeguata discriminazione tra le sostanze di controllo positive e negative. La vitalit(cid:224) cellulare (ad esempio misurata mediante la quantit(cid:224) di riduzione MTT, ovvero un valore della DO) dopo esposizione ad una sostanza di controllo negativa deve rientrare in limiti accettabili per il modello specificatamente utilizzato. Analogamente i valori della vitalit(cid:224) cellulare in riferimento alla sostanza di controllo positiva (correlati a quelli della sostanza di controllo nega- tiva) devono rientrare in limiti specifici. ¨ essenziale che il modello predittivo utilizzato rispetti gli standard di convalida internazionali (2). 1. 7. 2. Procedura 1. 7. 2. 1. A p p l i c a z i o n e d e l m a t e r i a l e d i s a g g i o Nei saggi di materiali liquidi occorre applicare la sostanza da saggiare in quantit(cid:224) tale da coprire la superficie cutanea (almeno 25 (cid:181)l/cm2). Nei saggi di materiali solidi si applica la sostanza da saggiare in quantit(cid:224) suffi- ciente da coprire la cute, quindi la si inumidisce per garantire un contatto ottimale con la cute. Eventual- mente le sostanze solide devono essere polverizzate prima dell’applicazione. Il metodo di applicazione deve risultare adeguato per un’ampia gamma di tipi di sostanze chimiche (2). Al termine del periodo di esposi- zione il materiale da saggiare deve essere accuratamente rimosso dalla superficie cutanea mediante una solu- zione salina. 1. 7. 2. 2. M i s u r a z i o n e d e l l a v i t a l i t (cid:224) c e l l u l a r e Per misurare la vitalit(cid:224) cellulare Ł possibile utilizzare qualsiasi metodo quantitativo convalidato. Il saggio generalmente piø utilizzato Ł la riduzione MTT che in numerosi laboratori ha fornito risultati accurati e riproducibili (2). Il disco di cute viene collocato in una soluzione MTT di 0,3 mg/ml ad una temperatura di 20-28 (cid:176)C per 3 ore. Viene quindi estratto il prodotto precipitato blu formazan (estrazione per solvente) e misurata la concentrazione del formazan determinando la DO ad una lunghezza d’onda compresa fra 545 e 595 nm. L 136/94 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:224) europee 8. 6. 2000 1. 7. 2. 3. U l t e r i o r i d a t i Il modello cutaneo utilizzato e il protocollo preciso dei tempi di esposizione e delle procedure di lavaggio, ecc. incidono notevolmente sui dati della vitalit(cid:224) cellulare. Si raccomanda pertanto di calibrare la metodologia e il modello predittivo mediante analisi di una serie di standard scelti tra una gamma di sostanze chimiche utilizzate nello studio di convalida del CECMA (3). Il metodo utilizzato deve risultare riproducibile sia all’in- terno di un laboratorio che tra laboratori per numerose sostanze chimiche in base a standard internazionali. Come minimo il metodo dovrebbe soddisfare il criterio della validit(cid:224) scientifica definito in precedenza (2) e i risultati dello studio di convalida devono essere stati pubblicati in una rivista scientifica dotata di comitato di revisione. 2. DATI 2. 1. Elaborazione dei risultati 2. 1. 1. Saggio TER della pelle di ratto I valori della resistenza (kh) del materiale di saggio, i controlli positivi e negativi e tutte le sostanze chimiche standard di riferimento dovrebbero essere riportati in una tabella contenente i dati relativi agli esperimenti di replicazione/ripetizione, i valori medi e le classificazioni ottenute. 2. 1. 2. Saggio del modello di cute umana I valori della DO e i dati sulla vitalit(cid:224) cellulare calcolati in percentuale e relativi al materiale di saggio, i con- trolli positivi e negativi e tutte le sostanze chimiche standard di riferimento dovrebbero essere riportati in una tabella contenente i dati relativi agli esperimenti di replicazione/ripetizione, i valori medi e le classifica- zioni ottenute. 2. 2. Valutazione e interpretazione dei risultati 2. 2. 1. Saggio TER della pelle di ratto Se il valore medio della TER ottenuto per la sostanza di saggio supera i 5 kh, la sostanza non Ł corrosiva. Se tale valore Ł inferiore o pari a 5 kh e la sostanza da saggiare non Ł un surfactante o un organico neutro allora Ł corrosiva. Per i surfactanti o le sostanze organiche neutre i cui valori TER sono inferiori o pari a 5 kh Ł possibile pro- cedere ad una valutazione della penetrazione del colorante. Se il tenore medio del colorante sul disco cutaneo Ł superiore o pari al valore medio del tenore del colorante riferito alla sostanza di controllo positiva al 36 % di HCl ottenuto in concomitanza, allora la sostanza di saggio Ł un vero positivo ed Ł dunque corrosiva. Se il tenore medio Ł inferiore al tenore medio della sostanza di controllo positiva al 36 % di HCl ottenuta in con- comitanza, allora la sostanza di saggio Ł un falso positivo e non Ł corrosiva. 2. 2. 2. Saggio del modello di cute umana Il valore della DO del controllo negativo rappresenta il 100 % della vitalit(cid:224) cellulare, di conseguenza i valori DO ottenuti per ciascun campione da saggiare possono essere utilizzati per calcolare una percentuale di vita- lit(cid:224) del controllo negativo. La percentuale critica della vitalit(cid:224) cellulare che differenzia i materiali di saggio corrosivi da quelli non corrosivi (o che distingue tra diverse classi di corrosivit(cid:224)) deve essere chiaramente defi- nita nel modello predittivo prima della convalida del metodo e il successivo studio di convalida deve dimo- strare che tale valore critico Ł adeguato (cfr. riferimento bibliografico 2). 3. RELAZIONE Relazione sul saggio La relazione concernente l’intero saggio deve contenere almeno le seguenti informazioni: Sostanza di saggio: (cid:151) dati inerenti l’identificazione, la natura fisica ed eventualmente le propriet(cid:224) fisico-chimiche. Questi dati dovrebbero essere forniti anche per le sostanze di riferimento, se utilizzate. Condizioni di saggio: (cid:151) descrizione dettagliata della procedura utilizzata; (cid:151) descrizione e motivazione di eventuali modifiche. 8. 6. 2000 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:224) europee L 136/95 Risultati: (cid:151) presentazione in forma tabulare dei valori della resistenza (saggio TER) o dei valori della vitalit(cid:224) cellulare (saggio del modello di cute umana) espressi in percentuale per il materiale di saggio, i controlli positivi e negativi e qualsiasi altra sostanza chimica standard di riferimento, inclusi i dati relativi agli esperimenti di replicazione/ripetizione e le medie; (cid:151) descrizione di qualunque altro effetto osservato. Discussione dei risultati Conclusioni 4. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI (1) ECVAM (1998), ECVAM News & Views, ATLA 26, pagg. 275-280. (2) Fentem, J. H. , Archer, G. E. B. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. , Holzhutter, H-G. & Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosi- vity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in Vitro 12, pagg. 483-524. (3) Barratt, M. D. , Brantom, P. G. , Fentem, J. H. , Gerner, I. , Walker, A. P. & Worth, A. P. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals, Toxicology in Vitro 12, pagg. 471-482. (4) Oliver, G. J. A. , Pemberton, M. A. & Rhodes, C. (1986), An in vitro skin corrosivity test (cid:151) modifications and validation, Food & Chemical Toxicology 24, pagg. 507-512. (5) Botham, P. A. , Hall, T. J. , Dennett, R. , McCall, J. C. , Basketter, D. A. , Whittle, E. , Cheeseman, M. , Esdaile, D. J. & Gardner, J. (1992), The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial, Toxicology in Vitro 6, pagg. 191-194. (6) Worth, A. P. , Fentem, J. H. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. & Liebsch, M. (1998), An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion, ATLA 26, pagg. 709-720. (7) Botham, P. A. , Chamberlain, M. , Barratt, M. D. , Curren, R. D. , Esdaile, D. J. , Gardner, J. R. , Gordon, V. C. , Hil- debrand, B. , Lewis, R. W. , Liebsch, M. , Logemann, P. , Osborne, R. , Ponec, M. , Regnier, J. F. , Steiling, W. , Walker, A. P. & Balls, M. (1995), A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM workshop 6, ATLA 23, pagg. 219-255. L 136/96 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:224) europee 8. 6. 2000 Figura 1 8. 6. 2000 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:224) europee L 136/97 Figura 2 L 136/98 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:224) europee 8. 6. 2000 ALLEGATO II «B. 41. FOTOTOSSICIT(cid:192) (cid:151) SAGGIO DI FOTOTOSSICIT(cid:192) IN VITRO 3T3 NRU 1. METODO 1. 1. Introduzione Per fototossicit(cid:224) si intende la risposta tossica che si manifesta dopo esposizione primaria della cute ad alcune sostanze chimiche e successiva esposizione alla luce, o che Ł indotta analogamente da irradiazione della cute dopo somministrazione sistemica di una sostanza chimica. I dati ottenuti mediante il saggio di fototossicit(cid:224) in vitro 3T3 NRU consentono di identificare il potenziale fototossico di una sostanza di prova, e cioŁ la presenza o l’assenza di eventuali rischi connessi alla sostanza di prova in associazione ad esposizione ai raggi UV e alla luce visibile. PoichØ l’(cid:147)endpoint(cid:148) tossicologico del saggio in vitro Ł la determinazione della fotocitotossicit(cid:224) indotta dal- l’azione combinata di una sostanza chimica e della luce, il saggio permette di identificare i composti che sono fototossici in vivo dopo applicazione sistemica e distribuzione sulla cute e i composti con effetto fotoirritante dopo applicazione locale alla cute. Il saggio di fototossicit(cid:224) in vitro 3T3 NRU Ł stato sviluppato e validato nell’ambito di un progetto congiunto UE/COLIPA durante il periodo 1992-1997 (1) (2) (3), allo scopo di definire una valida alternativa in vitro ai vari saggi in vivo normalmente utilizzati. Nel 1996 un workshop dell’OCSE ha raccomandato l’uso di saggio sequenziali in vitro per la valutazione della fototossicit(cid:224) (4). I risultati del saggio di fototossicit(cid:224) in vitro 3T3 NRU sono stati confrontati con gli effetti di fototossicit(cid:224) acuta/fotoirritazione in vivo in animali e soggetti umani, dimostrando cos(cid:236) l’eccellente predittivit(cid:224) del saggio per tali effetti. Il saggio non Ł progettato per prevedere altri effetti indesiderati che potrebbero derivare dal- l’azione combinata di una sostanza chimica e della luce, come ad esempio la fotogenotossicit(cid:224), la fotoallergia e la fotocarcinogenicit(cid:224), sebbene molte sostanze chimiche che presentano queste specifiche propriet(cid:224) reagi- scano positivamente al saggio di fototossicit(cid:224) in vitro 3T3 NRU. Inoltre, il saggio non Ł progettato per con- sentire una valutazione del potere fototossico. Nell’appendice Ł descritto un sistema sequenziale per l’esecuzione di prove di fototossicit(cid:224) su sostanze chimi- che. 1. 2. Definizioni Irradiamento: l’intensit(cid:224) della luce ultravioletta (UV) o visibile incidente su una superficie, misurata in W/m2 o mW/cm2. Dose di luce: la quantit(cid:224) (= intensit(cid:224) (cid:215) tempo) di radiazione ultravioletta (UV) o visibile incidente su una superfi- cie, espressa in joule (= W (cid:215) s) per area di superficie, ovvero J/m2 o J/cm2. Bande di frequenza d’onda della luce UV: i valori raccomandati dalla CIE (Commission Internationale de l’(cid:201)clai- rage) sono: UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) e UVC (100-280 nm). Sono in uso, inoltre, altri valori: spesso la distinzione fra UVB e UVA viene posta a 320 nm e gli UVA possono essere suddivisi in UV-A1 e UV-A2, con una distinzione posta a circa 340 nm. Vitalit(cid:224) cellulare: parametro che misura l’attivit(cid:224) totale di una popolazione di cellule (ad esempio la captazione del colorante vitale rosso neutro nei lisosomi cellulari) che, in funzione dell’(cid:147)endpoint(cid:148) misurato e del tipo di saggio impiegato, Ł correlato al numero totale e/o alla vitalit(cid:224) delle cellule. Vitalit(cid:224) cellulare relativa: vitalit(cid:224) cellulare espressa in relazione a controlli negativi (solventi) che sono stati sotto- posti al saggio completo (+ UV o ﬂ UV) senza trattamento con una sostanza chimica di prova. Modello di predittivit(cid:224): algoritmo impiegato per trasformare i risultati di un saggio di tossicit(cid:224) in dati predittivi del potenziale tossico. In base alle linee guida per l’esecuzione del saggio Ł possibile utilizzare il PIF e l’MPE per la trasformazione dei risultati del saggio di fototossicit(cid:224) in vitro 3T3 NRU in dati predittivi del potenziale fototossico. PIF (Photo Irritation Factor): fattore ottenuto paragonando due concentrazioni di pari citotossicit(cid:224) (EC50) della sostanza chimica di prova in assenza (ﬂ UV) e in presenza (+ UV) di una irradiazione non citotossica con luce UVA/visibile. MPE (Mean Photo Effect): recente misura derivata dall’analisi matematica della forma completa di due curve di concentrazione-risposta ottenuta in assenza (ﬂ UV) e in presenza (+ UV) di una irradiazione non citotossica con luce UVA/visibile. 8. 6. 2000 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:224) europee L 136/99 Fototossicit(cid:224): risposta tossica acuta che si manifesta dopo esposizione primaria della cute ad alcune sostanze chimiche e successiva esposizione alla luce, o che Ł indotta analogamente da irradiazione della cute dopo somministrazione sistemica di una sostanza chimica. Fotoirritazione: sottospecie del termine (cid:147)fototossicit(cid:224)(cid:148) impiegato per descrivere solo le reazioni fototossiche prodotte sulla cute dopo esposizione a sostanze chimiche (somministrate per via topica o orale). Tali reazioni fototossiche causano sempre danni cellulari non specifici (reazioni analoghe all’eritema solare). Fotoallergia: reattivit(cid:224) immunologica acquisita che non si verifica al primo trattamento con una sostanza chi- mica e successiva esposizione alla luce, ma che necessita di un periodo di induzione di una o due settimane prima che sia possibile dimostrare la reattivit(cid:224) cutanea. Fotogenotossicit(cid:224): risposta genotossica osservata con un (cid:147)endpoint(cid:148) genetico, che si manifesta dopo esposizione delle cellule a una dose di luce UV/visibile e a una sostanza chimica non genotossica. Fotocarcinogenicit(cid:224): carcinogenicit(cid:224) indotta dalla ripetuta applicazione di luce e di una sostanza chimica. Si uti- lizza il termine (cid:147)foto-co-carcinogenesi(cid:148) quando la cancerogenesi indotta dagli UV viene aumentata da una sostanza chimica. 1. 3. Sostanze di riferimento Oltre alla sostanza chimica di controllo positivo clorpromazina, che andrebbe saggiata simultaneamente in tutti i saggi, per effettuare il saggio di fototossicit(cid:224) 3T3 NRU si raccomanda di impiegare come sostanze chi- miche di riferimento un sottogruppo delle sostanze utilizzate nelle analisi interlaboratorio per il presente sag- gio (1) (3) (13). 1. 4. Considerazioni iniziali ¨ noto che molti tipi di sostanze chimiche inducono effetti fototossici (5) (6) (7) (8). L’unica caratteristica che hanno in comune Ł la capacit(cid:224) di assorbire l’energia luminosa nello spettro della luce solare. In base alla prima legge della fotochimica (legge di Grotthaus-Draper), la fotoreazione richiede un assorbimento sufficiente di quanti di luce. Pertanto, prima di effettuare la prova biologica in base alle linee guida qui descritte, Ł neces- sario determinare uno spettro di assorbimento della luce UV/visibile per la sostanza chimica di prova (ad esempio, in base alle linee guida dell’OCSE: OECD Test Guideline 101). Se il coefficiente di estinzione/assorbi- mento molare Ł inferiore a 10 litri (cid:215) molﬂ1 (cid:215) cmﬂ1, la sostanza chimica non ha alcun potenziale fotoreattivo e non occorre sottoporla al saggio di fototossicit(cid:224) in vitro 3T3 NRU, nØ ad altre prove biologiche atte a deter- minare effetti fotochimici indesiderati (appendice). 1. 5. Principio del metodo utilizzato Sono stati identificati quattro meccanismi in base ai quali l’assorbimento della luce da parte di un cromoforo (chimico) pu(cid:242) provocare una risposta fototossica (7). Tutti e quattro i meccanismi provocano lesioni cellulari. Pertanto, il saggio di fototossicit(cid:224) in vitro 3T3 NRU Ł basato sul confronto della citotossicit(cid:224) di una sostanza chimica saggiata con e senza esposizione a una dose non citotossica di luce UVA/visibile. In questo saggio, la citotossicit(cid:224) viene espressa come riduzione, dipendente dalla concentrazione, della captazione del colorante vitale rosso neutro [NR, (9)] 24 ore dopo il trattamento con la sostanza chimica di prova e l’irradiazione. Dapprima si preparano cellule Balb/c 3T3 che vengono mantenute in coltura per 24 ore per permettere la formazione di monostrati. Quindi, per ogni sostanza chimica di prova, vengono preincubate due piastre a 96 pozzetti con otto diverse concentrazioni della sostanza chimica per 1 ora. Una delle due piastre viene poi esposta a una dose non citotossica di luce UVA/visibile di 5 J/cm2 UVA (esperimento + UV), mentre l’altra pia- stra viene mantenuta nell’oscurit(cid:224) (esperimento ﬂ UV). In entrambe le piastre, il terreno di trattamento viene poi sostituito con il terreno di coltura e, dopo altre 24 ore di incubazione, si determina la vitalit(cid:224) cellulare tra- mite captazione del rosso neutro (Neutral Red Uptake, NRU) per 3 ore. Per ognuna delle otto concentrazioni di prova viene dunque calcolata la vitalit(cid:224) cellulare relativa, espressa come percentuale dei controlli negativi non trattati. Per prevedere il potenziale fototossico vengono confrontate le risposte di concentrazione ottenute in presenza (+ UV) e in assenza (ﬂ UV) di irradiazione, generalmente al livello EC50, cioŁ alla concentrazione che inibisce la vitalit(cid:224) cellulare del 50 % rispetto ai controlli non trattati. 1. 6. Criteri di qualit(cid:224) Sensibilit(cid:224) delle cellule agli UVA; dati storici: Ad intervalli regolari occorre controllare la sensibilit(cid:224) delle cellule agli UVA. Le cellule vengono seminate alla stessa densit(cid:224) utilizzata nel saggio di fototossicit(cid:224) in vitro 3T3 NRU; il giorno successivo vengono irradiate con dosi di UVA da 1 a 9 J/cm2, e il giorno ancora successivo si determina la vitalit(cid:224) cellulare tramite saggio di NRU. Le cellule soddisfano i requisiti di qualit(cid:224) se la loro vita- lit(cid:224), dopo irradiazione con 5 J/cm2 di UVA, non Ł inferiore all’80 % della vitalit(cid:224) dei controlli mantenuti nel- l’oscurit(cid:224). Alla dose massima di UVA (9 J/cm2), la vitalit(cid:224) non deve essere inferiore al 50 % rispetto a quella dei controlli mantenuti nell’oscurit(cid:224). Questo controllo va ripetuto all’incirca ogni dieci passaggi di cellule. Sensibilit(cid:224) agli UVA delle cellule di controllo negativo; saggio in oggetto: Il saggio soddisfa i criteri di qualit(cid:224) se i controlli negativi [cellule in soluzione salina isotonica di Earl (EBSS) con o senza l’1 % di dimetilsolfossido (DMSO) o l’1 % di etanolo (EtOH) nell’esperimento + UVA] mostrano una vitalit(cid:224) non inferiore all’80 % di quella delle cellule non irradiate nello stesso solvente del corrispondente esperimento in oscurit(cid:224) (ﬂ UVA). L 136/100 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:224) europee 8. 6. 2000 Vitalit(cid:224) dei controlli negativi: La densit(cid:224) ottica assoluta (OD540 NRU) misurata nell’estratto di rosso neutro dei controlli negativi indica se le cellule (1 (cid:215) 104) seminate in ogni pozzetto siano cresciute con un tempo di rad- doppiamento normale durante i due giorni della prova. Il saggio soddisfa i criteri di accettazione se la OD540 NRU media dei controlli non trattati Ł ¯ 0,2. Controllo positivo: Contemporaneamente al saggio di fototossicit(cid:224) in vitro 3T3 NRU, si saggia una sostanza chi- mica notoriamente fototossica. Si raccomanda l’uso di clorpromazina (CPZ), poichØ tale sostanza Ł stata impiegata come controllo positivo nello studio di validazione UE/COLIPA. Per la CPZ saggiata con il proto- collo standard nel saggio di fototossicit(cid:224) in vitro 3T3 NRU, sono stati definiti i seguenti criteri di accettazione: CPZ irradiata (+ UVA): EC50 = da 0,1 a 2,0 (cid:181)g/ml; CPZ non irradiata (ﬂ UVA): EC50 = da 7,0 a 90,0 (cid:181)g/ml. Il PIF, cioŁ lo spostamento di EC50, deve essere almeno pari a 6. Come controlli positivi concomitanti, al posto della CPZ possono essere impiegate altre sostanze chimiche notoriamente fototossiche, corrispondenti alla classe chimica o alle caratteristiche di solubilit(cid:224) della sostanza chimica di prova. In questo caso, sulla base dei dati storici, occorre definire adeguatamente l’intervallo di EC50 e del PIF o MPE come criterio di accettazione del saggio. 1. 7. Descrizione del metodo utilizzato 1. 7. 1. Preparazioni 1. 7. 1. 1. C e l l u l e Nello studio di validazione Ł stata usata una linea cellulare permanente di fibroblasti di topo (cid:151) Balb/c 3T3, clone 31 (cid:151) proveniente dall’ATCC o dall’ECACC. Se ne raccomanda pertanto l’uso in ogni saggio. Appli- cando lo stesso protocollo, si possono utilizzare con eguale efficacia anche altre cellule o linee cellulari se le condizioni della coltura vengono adattate alle esigenze specifiche delle cellule; tuttavia, Ł necessario dimostrare l’equivalenza. ¨ necessario verificare con regolarit(cid:224) che le cellule non siano contaminate da micoplasmi; le cellule vanno uti- lizzate solo se i risultati dei controlli sono soddisfacenti. PoichØ la sensibilit(cid:224) delle cellule agli UVA pu(cid:242) aumentare con il numero di passaggi, vanno impiegate cellule Balb/c 3T3 del numero piø basso ottenibile di passaggi, preferibilmente inferiore a 100. ¨ importante che la sensibilit(cid:224) delle cellule Balb/c 3T3 agli UVA venga controllata regolarmente seguendo la procedura di con- trollo della qualit(cid:224) descritta in queste linee guida. 1. 7. 1. 2. C o n d i z i o n i d e i m e z z i e d e l l a c o l t u r a Per il passaggio di routine delle cellule e durante il saggio Ł necessario utilizzare mezzi di coltura e condizioni di incubazione adeguati. Nel caso delle cellule Balb/c 3T3, occorre integrarle con DMEM al 10 % di siero di vitello neonato, 4 mM di glutamina, penicillina e streptomicina, nonchØ incubazione umidificata a 37 (cid:176)C /7,5 % di CO2. ¨ particolarmente importante che le condizioni della coltura cellulare assicurino un tempo di ciclo cellulare compreso nel normale range storico delle cellule o della linea cellulare utilizzate. 1. 7. 1. 3. P r e p a r a z i o n e d e l l e c o l t u r e Le cellule ottenute da colture base congelate vengono seminate nel terreno di coltura alla densit(cid:224) adeguata e poste in sottocoltura almeno una volta prima di essere utilizzate per il saggio di fototossicit(cid:224) in vitro 3T3 NRU. Per il saggio di fototossicit(cid:224) occorre seminare le cellule nel terreno di coltura ad una densit(cid:224) tale che impedi- sca alle colture di raggiungere la confluenza prima della fine, cioŁ quando viene determinata la vitalit(cid:224) cellu- lare 48 ore dopo la semina. Per le cellule Balb/c 3T3 coltivate in piastre a 96 pozzetti la densit(cid:224) raccomandata Ł di 1 (cid:215) 104 cellule per pozzetto. Per ogni sostanza chimica di prova si seminano cellule in maniera identica in due diverse piastre a 96 poz- zetti, che vengono poi sottoposte simultaneamente all’intera procedura in condizioni colturali identiche, salvo il periodo di tempo in cui una delle piastre viene irradiata (+ UVA/visibile) mentre l’altra viene tenuta nel- l’oscurit(cid:224) (ﬂ UVA/visibile). 1. 7. 1. 4. A t t i v a z i o n e m e t a b o l i c a Mentre l’uso di sistemi metabolizzanti Ł un requisito generale di tutte le prove in vitro per la previsione della genotossicit(cid:224) e del potenziale carcinogenico, finora, nel caso della fototossicologia, non si conosce alcuna sostanza chimica che necessita della trasformazione metabolica per agire da fototossina in vivo o in vitro. Per- tanto non si ritiene necessario, nØ scientificamente giustificato, svolgere questo saggio con un sistema di atti- vazione metabolica. 8. 6. 2000 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:224) europee L 136/101 1. 7. 1. 5. S o s t a n z a c h i m i c a d i p r o v a / P r e p a r a z i o n e Le sostanze chimiche di prova devono essere preparate di fresco immediatamente prima dell’uso, a meno che la conservazione risulti accettabile in base ai dati relativi alla stabilit(cid:224). Quando Ł probabile che si verifichi una rapida fotodegradazione, pu(cid:242) essere necessaria la preparazione sotto luce rossa. Le sostanze chimiche di prova vanno dissolte in soluzioni saline tampone, come la soluzione isotonica di Earl (EBSS) o la soluzione salina tampone fosfato (PBS) che, per evitare interferenze durante l’irradiazione, devono essere prive di componenti proteiche e colori indicatori di pH che assorbono la luce. Le sostanze chimiche di prova scarsamente solubili in acqua devono essere dissolte in solventi adeguati, ad una concentrazione pari a 100 volte la concentrazione finale desiderata e poi diluite in 1:100 con la solu- zione tampone. Eventuali solventi devono essere presenti a un volume costante dell’1 % (v/v) in tutte le col- ture, e cioŁ sia nei controlli negativi che in tutte le concentrazioni della sostanza chimica di prova. I solventi raccomandati sono il dimetilsolfossido (DMSO) e l’etanolo (EtOH). Possono essere adatti anche altri solventi a bassa citotossicit(cid:224) (come l’acetone), ma Ł necessario valutarne attentamente le propriet(cid:224) specifiche, quali la reazione con la sostanza chimica di prova, l’estinzione dell’effetto fototossico, le propriet(cid:224) di cattura dei radicali. Se necessario, si pu(cid:242) procedere a miscelazione tramite vortex e/o sonicazione e/o riscaldamento fino a 37 (cid:176)C per favorire la solubilizzazione. 1. 7. 1. 6. I r r a d i a z i o n e U V / P r e p a r a z i o n e Fonte di luce: la scelta di una fonte di luce e di un filtro adeguati Ł il fattore piø importante ai fini di un cor- retto saggio della fototossicit(cid:224). Gli spettri di UVA e della luce visibile si associano generalmente a fotosensibi- lizzazione (7) (10), mentre gli UVB sono meno rilevanti perchØ fortemente citotossici in via diretta, visto che la loro citotossicit(cid:224) aumenta di 1000 volte da 313 a 280 nm (11). Per scegliere una fonte luminosa adeguata valgono, tra l’altro, i seguenti criteri essenziali: la fonte di luce deve emettere lunghezze d’onda assorbite dalla sostanza chimica di prova e la dose di luce (ottenibile in tempi ragionevoli) deve essere sufficiente per indivi- duare i fotosensibilizzanti noti. Inoltre, le lunghezze d’onda e le dosi utilizzate non devono essere eccessiva- mente nocive per il sistema, che comporta anche emissione di calore (regione dell’infrarosso). La fonte di luce ottimale Ł la simulazione della luce del sole con simulatori solari. Nei simulatori solari si usano sia gli archi allo xeno che gli archi di mercurio e ad alogenuri metallici (drogati). Questi ultimi presen- tano il vantaggio di emettere meno calore e di essere meno costosi, ma la loro corrispondenza con la luce solare non Ł perfetta. PoichØ tutti i simulatori solari emettono quantit(cid:224) significative di UVB, vanno muniti di filtri adeguati per attenuare le lunghezze d’onda UVB altamente citotossiche. Per il saggio di fototossicit(cid:224) in vitro 3T3 NRU Ł necessario usare uno spettro di irradiamento praticamente privo di UVB (UVA:UVB p 1:20). ¨ stato pubblicato un esempio della distribuzione dell’irradiamento spettrale del simulatore solare con filtro impiegato nello studio di validazione del saggio di fototossicit(cid:224) in vitro 3T3 NRU (3). Dosimetria: Prima di effettuare il saggio di fototossicit(cid:224) occorre controllare regolarmente l’intensit(cid:224) della luce (irradiamento) mediante opportuno misuratore UV a banda larga. Il misuratore UV deve essere stato calibrato sulla fonte. ¨ necessario controllare la funzionalit(cid:224) del misuratore UV e, a tale scopo, si raccomanda di impie- gare un secondo misuratore UV di riferimento, dello stesso tipo e con identica calibrazione. L’ideale sarebbe che, a intervalli di tempo piø lunghi, con uno spettroradiometro si misurasse l’irradiamento spettrale della fonte di luce filtrata e si controllasse la calibrazione del misuratore UV a banda larga; tali strumenti richiedono tuttavia l’intervento di personale specializzato. Lo studio di validazione ha stabilito che una dose di 5 J/cm2 (UVA) non Ł citotossica per le cellule Balb/c 3T3 ed Ł sufficientemente potente per eccitare anche le sostanze chimiche a bassa fototossicit(cid:224). Allo scopo di otte- nere una dose di 5 J/cm2 entro 50 minuti, l’irradiamento deve essere regolato a 1,666 mW/cm2. Se si utiliz- zano un’altra linea cellulare o una diversa fonte di luce, potrebbe essere necessario adattare leggermente la dose di UVA, a condizione che non sia nociva per le cellule e che sia sufficiente per individuare le fototossine standard. Il tempo di esposizione alla luce si calcola come segue: 1. 7. 2. Condizioni di esecuzione del saggio La concentrazione massima della sostanza chimica di prova non deve superare i 100 (cid:181)g/ml, poichØ la fototos- sicit(cid:224) di tutte le sostanze chimiche Ł stata rilevata a concentrazioni inferiori, mentre a concentrazioni mag- giori aumenta l’incidenza dei falsi positivi (previsioni sovrastimate) (13). Il pH della concentrazione piø alta della sostanza chimica di prova deve essere soddisfacente (range del pH: 6,5-7,8). L 136/102 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:224) europee 8. 6. 2000 Gli intervalli delle concentrazioni di una sostanza chimica sottoposta a prova in presenza (+ UVA) e in assenza (ﬂ UVA) di luce vanno determinati in modo adeguato in precedenti esperimenti espressamente effettuati a tale scopo. Occorre adeguare l’intervallo e l’intercetta di una serie di concentrazioni in modo che le curve concen- trazione-risposta siano sufficientemente corroborate da dati sperimentali. ¨ necessario utilizzare le serie di concentrazioni geometriche (con un fattore di diluizione costante). 1. 7. 3. Procedura del saggio (1) 1. 7. 3. 1. P r i m o g i o r n o Preparare una sospensione di cellule di 1 (cid:215) 105 cellule/ml nel terreno di coltura e versare 100 (cid:181)L di terreno di coltura solo nei pozzetti periferici di una piastra per microtitolazione di coltura tissutale a 96 pozzetti (= bianchi). Nei restanti pozzetti versare 100 (cid:181)L di una sospensione cellulare di 1 (cid:215) 105 cellule/ml (= 1 (cid:215) 104 cellule/pozzetto). Per ciascuna sostanza chimica di prova preparare due piastre: una per determinare la cito- tossicit(cid:224) (ﬂ UVA) e l’altra per determinare la fotocitotossicit(cid:224) (+ UVA). Incubare le cellule per 24 ore (7,5 % di CO2, 37 (cid:176)C) finchØ formano un monostrato semiconfluente. Questo periodo di incubazione tiene conto del recupero e dell’aderenza delle cellule, nonchØ della crescita esponenziale. 1. 7. 3. 2. S e c o n d o g i o r n o Dopo l’incubazione, far decantare il terreno di coltura dalle cellule e lavare due volte con 150 (cid:181)L di EBSS/PBS per pozzetto. Aggiungere 100 (cid:181)L di EBSS/PBS contenente la concentrazione corretta della sostanza chimica di prova o solo solvente (controllo negativo). Utilizzare 8 diverse concentrazioni della sostanza chimica di prova. Incubare le cellule con la sostanza chimica di prova nell’oscurit(cid:224) per 60 minuti (7,5 % di CO2, 37 (cid:176)C). Per eseguire la parte + UVA del saggio, irradiare le cellule a temperatura ambiente per 50 minuti attraverso il coperchio della piastra con 1,7 mW/cm2 di UVA (= 5 J/cm2). Ventilare con una ventola per evitare la conden- sazione di H2O sotto il coperchio. Mantenere le altre piastre (ﬂ UVA) a temperatura ambiente in una scatola scura per 50 minuti (= tempo di esposizione agli UVA). Far decantare la soluzione di prova e lavare due volte con 150 (cid:181)L di EBSS/PBS. Sostituire l’EBSS/PBS con ter- reno di coltura e incubare (7,5 % di CO2, 37 (cid:176)C) per una notte (18-22 ore). 1. 7. 3. 3. T e r z o g i o r n o Esame al microscopio Esaminare le cellule con un microscopio a contrasto di fase. Registrare i cambiamenti morfologici delle cellule dovuti agli effetti citotossici della sostanza chimica di prova. Si raccomanda questo controllo per escludere errori sperimentali, sebbene questi dati non vengano utilizzati per la valutazione della citotossicit(cid:224) o della fototossicit(cid:224). Prova della captazione del rosso neutro Lavare le cellule con 150 uL di EBSS/PBS preriscaldata. Rimuovere la soluzione di lavaggio con lievi colpetti. Aggiungere 100 (cid:181)l di terreno al rosso neutro e incubare a 37 (cid:176)C in atmosfera umidificata al 7,5 % di CO2 per 3 ore. Dopo l’incubazione, rimuovere il terreno al rosso neutro e lavare le cellule con 150 (cid:181)L di EBSS/PBS. Far decantare e asciugare totalmente l’EBSS/PBS. (Centrifugare a piastra rovesciata Ł opzionale). Aggiungere esattamente 150 (cid:181)L di soluzione di estinzione di rosso neutro (etanolo/acido acetico preparati di fresco). Scuotere rapidamente la piastra di microtitolazione con un agitatore per 10 minuti fino ad estrazione del rosso neutro dalle cellule e formazione di una soluzione omogenea. Misurare la densit(cid:224) ottica dell’estratto di rosso neutro a 540 nm con uno spettrofotometro, utilizzando i bian- chi come riferimento. Salvare i dati nel formato di file adeguato (ad esempio ASCII) per le analisi successive. (1) Per ulteriori dettagli, cfr. il riferimento bibliografico (12). 8. 6. 2000 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:224) europee L 136/103 2. DATI 2. 1. Qualit(cid:224) e quantit(cid:224) dei dati I dati devono permettere un’analisi significativa della concentrazione-risposta ottenuta in presenza e in assenza di irradiazione UVA/visibile. Se si rileva citotossicit(cid:224), Ł necessario fissare sia il range della concentra- zione che l’intervallo delle singole concentrazioni in modo da adattare una curva ai dati sperimentali. PoichØ una sostanza chimica di prova potrebbe non essere citotossica fino alla concentrazione limite definita di 100 (cid:181)g/ml nell’esperimento in oscurit(cid:224) (ﬂ UVA), ma altamente citotossica in caso di irradiazione (+ UVA), potrebbe essere necessario che i range della concentrazione da saggiare differiscano per ordine di grandezza per garantire un’adeguata qualit(cid:224) dei dati. Se non si rileva citotossicit(cid:224) in nessuna delle due parti dell’esperi- mento (ﬂ UVA e + UVA), Ł sufficiente effettuare il saggio con un maggiore intervallo fra dosi singole fino alla concentrazione piø elevata. Non occorre verificare i risultati chiaramente positivi ripetendo l’esperimento. Non occorre neppure verificare i risultati chiaramente negativi, purchØ la sostanza chimica di prova sia stata saggiata a concentrazioni suffi- cientemente alte. In tali casi Ł sufficiente un esperimento principale, sostenuto da uno o piø esperimenti preli- minari di definizione dei range. I saggi che hanno dato risultati borderline vicini alla linea di demarcazione del modello di predittivit(cid:224) vanno ripetuti per verifica. Se si ritiene necessario ripetere il saggio, potrebbe essere importante variare le condizioni sperimentali allo scopo di ottenere un risultato chiaro. Una variabile fondamentale di questo saggio Ł la preparazione delle soluzioni della sostanza chimica di prova. Pertanto, la variazione di tali condizioni (co-solvente, triturazione, sonicazione) pu(cid:242) essere di enorme importanza nel saggio di ripetizione. Alternativamente si pu(cid:242) prendere in considerazione l’ipotesi di variare il tempo di incubazione pre-irradiazione. Un tempo piø breve pu(cid:242) essere determinante per le sostanze chimiche instabili in acqua. 2. 2. Trattamento dei risultati Ove possibile, si determina la concentrazione di una sostanza chimica di prova che riflette una inibizione del 50 % dell’NRU cellulare (EC50). A tale scopo si applica una qualunque procedura di regressione non lineare (preferibilmente una funzione di Hill o la regressione logistica) ai dati concentrazione-risposta, oppure si uti- lizzano altre procedure di adeguamento (14). Prima di utilizzare una EC50 per ulteriori calcoli occorre control- lare in modo adeguato la qualit(cid:224) dell’adattamento alla rappresentazione grafica. Alternativamente possono essere impiegati metodi di adattamento alla rappresentazione grafica per calcolare l’EC50. In questo caso si rac- comanda l’uso di carte di probabilit(cid:224) (scala x: log, scala y: probit), poichØ in molti casi la funzione concentra- zione-risposta diventer(cid:224) quasi lineare dopo questa trasformazione. 2. 3. Valutazione dei risultati (modelli di predittivit(cid:224)) 2. 3. 1. Modello di predittivit(cid:224) versione 1: PIF Se si ottengono curve concentrazione-risposta complete sia in presenza (+ UVA) che in assenza (ﬂ UVA) di luce, il fattore di fotoirritazione (PIF) si calcola tramite la formula seguente: Un PIF < 5 non predice alcun potenziale fototossico, mentre un PIF ¯ 5 predice un potenziale fototossico. Se una sostanza chimica Ł citotossica solo + UVA e non Ł citotossica al saggio ﬂ UVA, non Ł possibile calco- lare il PIF, sebbene si tratti di un risultato che indica un potenziale fototossico. In tali casi Ł possibile calcolare un (cid:147)> PIF(cid:148) se il saggio di citotossicit(cid:224) (ﬂ UV) viene eseguito fino alla concentrazione di prova piø elevata (Cmax) e tale valore viene usato per calcolare il (cid:147)> PIF(cid:148): Se Ł possibile ottenere solo un (cid:147)> PIF(cid:148), qualunque valore > 1 predice un potenziale fototossico. Se non Ł possibile calcolare nØ l’EC50 (ﬂ UV) nØ l’EC50 (+ UV) a causa del fatto che una sostanza chimica non risulta essere citotossica fino alla piø alta concentrazione di prova, questo indica l’assenza di potenziale foto- tossico. In tali casi per caratterizzare il risultato si utilizza un formale (cid:147)PIF = *1(cid:148) L 136/104 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:224) europee 8. 6. 2000 Se Ł possibile ottenere solo un (cid:147)PIF = *1(cid:148), ci(cid:242) non predice alcun potenziale fototossico. Nei casi (b) e (c), ai fini della predittivit(cid:224) del potenziale fototossico Ł necessario tenere in debita considera- zione le concentrazioni ottenute al saggio di fototossicit(cid:224) in vitro 3T3 NRU. 2. 3. 2. Modello di predittivit(cid:224) versione 2: MPE Alternativamente Ł possibile applicare una nuova versione del modello per prevedere il potenziale fototossico, sviluppata in base ai dati dello studio di validazione UE/COLIPA (15) e saggiata in cieco in un successivo stu- dio sulla fototossicit(cid:224) in vitro delle sostanze chimiche a filtro UV (13). Tale modello sopperisce ai limiti del modello PIF nei casi in cui Ł impossibile ottenere un’EC50. Il modello utilizza il (cid:147)Mean Photo Effect(cid:148) (MPE), una misura basata sul confronto delle curve complete concentrazione-risposta. Per l’applicazione del modello MPE la Humboldt Universit(cid:228)t di Berlino ha sviluppato un software disponibile gratuitamente. 2. 4. Interpretazione dei risultati Un risultato positivo al saggio di fototossicit(cid:224) in vitro 3T3 NRU (PIF ¯ 5 o MPE ¯ 0,1) indica che la sostanza di prova ha un potenziale fototossico. Se si ottiene tale risultato a concentrazioni inferiori a 10 (cid:181)g/ml, Ł altres(cid:236) probabile che la sostanza chimica di prova si comporti da fototossina in varie condizioni di esposizione in vivo. Se si ottiene un risultato positivo solo alla concentrazione di prova piø elevata (100 (cid:181)g/mL), possono essere necessarie ulteriori considerazioni per la valutazione del rischio o del potere fototossico, quali dati sulla penetrazione, l’assorbimento e il possibile accumulo della sostanza chimica nella cute, oppure l’analisi della sostanza in un saggio alternativo di conferma, ad esempio impiegando un modello di cute umana in vitro. Un risultato negativo al saggio di fototossicit(cid:224) in vitro 3T3 NRU (PIF < 5 o MPE < 0,1) indica che la sostanza di prova non Ł fototossica per le cellule di mammifero in coltura nelle condizioni di saggio. Nei casi in cui Ł stato possibile provare la sostanza chimica fino alla concentrazione piø elevata (100 (cid:181)g/ml) un risultato nega- tivo indica che tale sostanza non ha potenziale fototossico e la fototossicit(cid:224) in vivo pu(cid:242) essere considerata improbabile. Nei casi in cui si ottengano identiche risposte tossicit(cid:224)-concentrazione (EC50 + UV e EC50 ﬂ UV) a concentrazioni inferiori, l’interpretazione dei dati sarebbe la stessa. Diversamente, se non viene dimostrata tos- sicit(cid:224) (+ UV e ﬂ UV) e se la solubilit(cid:224) in acqua limita le concentrazioni a valori inferiori a 100 (cid:181)g/ml, allora pu(cid:242) essere messa in dubbio la compatibilit(cid:224) della sostanza di prova con il saggio e va presa in considerazione l’idea di eseguire prove di conferma (ad esempio usando un modello di cute in vitro o un modello di cute ex vivo o un saggio in vivo). 3. RELAZIONE Relazione sul saggio effettuato La relazione sul saggio deve contenere le seguenti informazioni: Sostanza chimica di prova: (cid:151) dati di identificazione e numero CAS, se noto (cid:151) caratteristiche fisiche e purezza (cid:151) propriet(cid:224) fisicochimiche rilevanti per l’esecuzione dello studio (cid:151) stabilit(cid:224) e fotostabilit(cid:224), se note Solvente: (cid:151) motivazione della scelta del solvente (cid:151) solubilit(cid:224) della sostanza chimica di prova in questo solvente (cid:151) percentuale di solvente presente nel terreno di trattamento (EBSS o PBS) Cellule: (cid:151) tipo e origine (cid:151) assenza di micoplasmi (cid:151) numero di passaggi delle cellule, se noto (cid:151) sensibilit(cid:224) delle cellule agli UVA, determinata con gli strumenti per irradiazione usati nel saggio di foto- tossicit(cid:224) in vitro 3T3 NRU Condizioni di esecuzione del saggio (a) (cid:151) incubazione prima e dopo il trattamento: (cid:151) tipo e composizione del terreno di coltura (cid:151) condizioni di incubazione (concentrazione di CO2, temperatura, umidit(cid:224)) (cid:151) durata dell’incubazione (pre-trattamento, post-trattamento) 8. 6. 2000 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:224) europee L 136/105 Condizioni di esecuzione del saggio (b) (cid:151) trattamento con la sostanza chimica: (cid:151) criteri di scelta delle concentrazioni della sostanza chimica di prova usata sia in presenza che in assenza di irradiazione UV/visibile (cid:151) in caso di solubilit(cid:224) limitata della sostanza chimica di prova e assenza di citotossicit(cid:224), motivi della scelta di una concentrazione piø elevata (cid:151) tipo e composizione del terreno di trattamento (soluzione salina tampone) (cid:151) durata del trattamento chimico Condizioni di esecuzione del saggio (c) (cid:151) irradiazione: (cid:151) motivo della scelta della fonte di luce utilizzata nel saggio (cid:151) caratteristiche di irradiamento spettrale della fonte di luce (cid:151) caratteristiche di trasmissione/assorbimento del/i filtro/i usato/i (cid:151) caratteristiche del radiometro e particolari sulla sua calibrazione (cid:151) distanza della fonte di luce dal sistema di prova (cid:151) irradiamento UVA a tale distanza, espresso in mW/cm2 (cid:151) durata dell’esposizione alla luce UV/visibile (cid:151) dose UVA (irradiamento (cid:215) tempo), espressa in J/cm2 (cid:151) temperatura delle colture cellulari durante l’irradiazione e delle colture cellulari mantenute in oscurit(cid:224) Condizioni di esecuzione del saggio (d) (cid:151) prova NRU (cid:151) composizione del terreno al rosso neutro (cid:151) durata dell’incubazione nel rosso neutro (cid:151) condizioni di incubazione (concentrazione di CO2, temperatura, umidit(cid:224)) (cid:151) condizioni di estrazione del rosso neutro (estraente, durata) (cid:151) lunghezza d’onda usata per la lettura spettrofotometrica della densit(cid:224) ottica del rosso neutro (cid:151) seconda lunghezza d’onda (riferimento), se utilizzata (cid:151) contenuto del bianco spettrofotometrico, se utilizzato Risultati (cid:151) vitalit(cid:224) cellulare ottenuta a ciascuna concentrazione della sostanza chimica di prova, espressa in vitalit(cid:224) percentuale media dei controlli (cid:151) curve concentrazione-risposta (concentrazione della sostanza chimica di prova vs. vitalit(cid:224) cellulare rela- tiva), ottenuta negli esperimenti simultanei + UVA e ﬂ UVA (cid:151) analisi dei dati delle curve concentrazione-risposta: se possibile, computo/calcolo dell’EC50 (+ UVA) e del- l’EC50 (ﬂ UVA) (cid:151) confronto delle due curve concentrazione-risposta ottenute in presenza e in assenza dell’irradiazione UVA/visibile, o tramite calcolo del PIF, o tramite calcolo dell’MPE (cid:151) classificazione del potenziale fototossico (cid:151) criteri di accettazione del saggio (a) (cid:151) controllo negativo simultaneo: (cid:151) vitalit(cid:224) assoluta (densit(cid:224) ottica dell’estratto di rosso neutro) delle cellule irradiate e non irradiate (cid:151) dati storici del controllo negativo, deviazione media e standard (cid:151) criteri di accettazione del saggio (b) (cid:151) controllo positivo simultaneo: (cid:151) EC50 (+ UVA) e EC50 (ﬂ UVA) e PIF della sostanza chimica di controllo positiva (cid:151) dati storici riguardanti la sostanza chimica di controllo positiva: EC50 (+ UVA) e EC50 (ﬂ UVA) e PIF, deviazione media e standard Discussione dei risultati Conclusioni L 136/106 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:224) europee 8. 6. 2000 4. BIBLIOGRAFIA (1) Spielmann, H. , Balls, M. , D(cid:246)ring, B. , Holzh(cid:252)tter, H. G. , Kalweit, S. , Klecak, G. , L’Eplattenier, H. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Moldenhauer, F. , Moore, L. , Pape, W. , Pfannbecker, U. , Potthast, J. , De Silva, O. , Steiling, W. and Willshaw, A. ( 1994), EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay, Toxicology in Vitro 8, pagg. 793-796. (2) Anon (1998), Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxi- city), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA 26, pagg. 7-8. (3) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. W. , Pechovitch, G. , De Silva, O. , Holzh(cid:252)tter, H. G. , Clo- thier, R. , Desolle, P. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Pfannenbecker, U. , Potthast, J. M. , Csato, M. , Sladowski, D. , Steiling, W. and Brantom, P. (1998), EU/COLIPA (cid:147)In vitro phototoxicity(cid:148) validation study, results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test, Toxicology in Vitro 12, pagg. 305-327. (4) OECD Test Guidelines Programme, ENV/MC/CHEM/TG(96)9: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria of Alternative Toxicological Test Methods, OECD Publications Office, Paris, 1996. (5) Lovell, W. W. (1993), A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential, Toxico- logy in Vitro 7, pagg. 95-102. (6) Santamaria, L. and Prino, G. (1972), List of the photodynamic substances, Research progress in organic, biological and medicinal chemistry Vol. 3 Part 1, North Holland Publishing Co, Amsterdam, pagg. XI- XXXV. (7) Spielmann, H. , Lovell, W. W. , H(cid:246)lzle, E. , Johnson, B. E. , Maurer, T. , Miranda, M. A. , Pape, W. J. W. , Sapora, O. and Sladowski, D. (1994), In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM workshop 2, ATLA 22, pagg. 314-348. (8) Spikes, J. D. (1989), Photosensitization, The science of photobiology, edited by KC Smith, Plenum Press, New York, 2nd edition, pagg. 79-110. (9) Borenfreund, E. and Puerner, J. A. (1985), Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption, Toxicology Letters 24, pagg. 119-124. (10) Lambert L. A, Warner W. G. and Kornhauser A. (1996), Animal models for phototoxicity testing, Derma- totoxicology, edited by FN Marzulli and HI Maibach, published by Taylor & Francis, Washington DC, 5th Edition, pagg. 515-530. (11) Tyrrell R. M. and Pidoux M (1987), Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytoto- xicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocy- tes, Cancer Research 47, pagg. 1825-1829. (12) ZEBET/ECVAM/COLIPA, Standard Operating Procedure: Balb/c 3T3 NRU Phototoxicity Test, drafted 23 December 1997 by M. Liebsch and approved 6 March 1998 by the Management Team of the EU/ COLIPA project (cid:147)In Vitro Photoirritation(cid:148). (13) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. W. , De Silva, O. , Holzh(cid:252)tter, H. G. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. and Pfannenbecker (1998), A Study on the Phototoxic Potential of UV Filter Chemicals from Annex VII of the EU Directive 76/768/EEC in the 3T3 NRU In Vitro Phototoxicity Test, ATLA 26, pagg. 679-708. (14) Holzh(cid:252)tter, H. G. and Quedenau, J. (1995), Mathematical modelling of cellular responses to external signals, Journal of Biological Systems 3, pagg. 127-138. (15) Holzh(cid:252)tter, H. G. (1997), A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals, ATLA 25, pagg. 445-462. 8. 6. 2000 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:224) europee L 136/107 Appendice