title: Id-Direttiva tal-Kummissjoni 2000/33/KE tal-25 ta' April 2000 li tadatta għall-progress tekniku għas-sebgħa u għoxrin darba d-Direttiva 67/548/KEE rigward l-approssimazzjoni tal-liġijiet, tar-regolamenti u tad-disposizzjonijiet amministrattivi dwar il-klassifikazzjoni, l-imballaġġ u l-ittikkettjar ta' sustanzi perikolużi (Test b'rilevanza għaż-ŻEE)

text: 242 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta’ l-Unjoni Ewropea 13/Vol. 25 32000L0033 8. 6. 2000 IL-ĠURNAL UFFIĊJALI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ L 136/90 ID-DIRETTIVA TAL-KUMMISSJONI 2000/33/KE tal-25 ta’ April 2000 li tadatta għall-progress tekniku għas-sebgħa u għoxrin darba d-Direttiva 67/548/KEE rigward dwar l-approssimazzjoni tad-disposizzjonijiet amministrattivi tar-regolamenti tal-liġijiet, u il-klassifikazzjoni, l-imballaġġ u l-ittikkettjar ta’ sustanzi perikolużi (*) (Test b’rilevanza għaż-ŻEE) IL-KUMMISSJONI TAL-KOMUNITAJIET EWROPEJ, ADOTTAT DIN ID-DIRETTIVA: Wara li kkunsidrat it-Trattat li jistabbilixxi l-Komunità Ewropea, Artikolu 1 u Wara li kkunsidrat id-Direttiva tal-Kunsill 67/548/KEE tas-27 ta’ tar- Ġunju 1967 rigward l-approssimazzjoni regolamenti dwar il-klassifikazzjoni, l-imballaġġ u l-ittikkettjar ta’ sustanzi periko- lużi (1), kif l-aħħar emendata bid-Direttiva tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill 1999/33/KE (2), u partikolarment l-Artikolu 28 tagħha, tad-disposizzjonijiet amministrattivi tal-liġijiet, It-testi fl-Annessi I u II għal din id-Direttiva huma miżjuda mal-Parti B ta’ l-Anness V tad-Direttiva 67/548/KEE. Artikolu 2 1. L-Istati Membri għandhom idaħħlu fis-seħħ il-liġijiet, ir-regolamenti u d-disposizzjonijiet amministrattivi meħtieġa sabiex jikkonformaw ma’ din id-Direttiva mhux iktar tard mill-1 ta’ Ottubru 2001. Għandhom jgħarrfu lill-Kummissjoni b’dan minnufih. L-Anness V tad-Direttiva 67/548/KEE jippreskrivi l-metodi għad-determinazzjoni tal-propjetajiet fiżiko-kimiċi, tossi- ċità u ekotossiċità tas-sustanzi u preparazzjonijiet. Huwa meħtieġ li dak l-Anness ikun addattat għall-progress tekniku. Meta l-Istati Membri jadottaw dawn id-disposizzjonijiet, dawn għandhom ikollhom riferenza għal din id-Direttiva jew għandhom ikunu akkumpanjati b’din ir-riferenza fl-okkażjoni tal- pubblikazzjoni uffiċjali tagħhom. L-Istati Membri għandhom jis- tabbilixxu kif għandha ssir din ir-riferenza. Skond l-Artikolu 7(2) tad-Direttiva tal-Kunsill 86/609/KEE ta’ l-24 ta’ Novembru 1986 fuq l-approssimazzjoni tal- liġijiet, ir-regolamenti u d-disposizzjonijiet amministrattivi ta’ l-Istati Membri dwar il-protezzjoni ta’ annimali użati għall-finijiet sperimentali u xjentifiċi oħra (3), m’għandux isir esperiment li jinvolvi l-użu ta’ annimali jekk metodu xjentifikament sodisfaċenti ieħor biex jinkiseb ir-riżultat imfittex huwa disponibbli raġonevolment u b’mod pratti- kabbli. fi ħsieba tintroduċi Il-Kummissjoni fl-Anness V tad- Direttiva 67/548/KEE ċerti metodi ta’ testjar alternattivi li ma jinvolvux l-użu ta’ annimali, sabiex tagħmilhom dispo- nibbli għall-ittestjar ta’ kimiċi skond l-Artikolu 3(1) tad- Direttiva 67/548/KEE. Il-miżuri previsti f’din id-Direttiva huma skond l-opinjoni tal-Kumitat għall-Addattament mal-Progress Tekniku tad- Direttivi dwar it-Tneħħija ta’ l-Ostakoli Tekniċi Għall- Kummerċ f’Sustanzi u Preparazzjonijiet Perikolużi, 2. L-Istati Membri għandhom jikkomunikaw lill-Kummissjoni d-disposizzjonijiet ewlenin tal-liġi nazzjonali li huma jadottaw fil- qasam kopert b’din id-Direttiva u tabella ta’ korrelazzjoni bejn din id-Direttiva u d-disposizzjonijiet nazzjonali adottati. Artikolu 3 fis-seħħ fit-tielet jum wara Din id-Direttiva għandha tidħol l-pubblikazzjoni tagħha fil-Ġurnal Uffiċjali tal-Komunitajiet Ewropej. Din id-Direttiva hija indirizzata lill-Istati Membri. Artikolu 4 Magħmula fi Brussel, fil-25 ta’ April 2000. Għall-Kummissjoni Margot WALLSTRÖM Membru tal-Kummissjoni Billi: (1) (2) (3) (4) (*) Adottata qabel is-26 addattament. (1) ĠU C 196, tas-16. 8. 1967, pġ. 1. (2) ĠU L 199, tat-30. 7. 1999, pġ. 57. (3) ĠU L 358, tat-18. 12. 1986, pġ. 1. 13/Vol. 25 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta’ l-Unjoni Ewropea 243 ANNESS I “B. 40. KORRUŻJONI TAL-ĠILDA 1. 1. 1. METODU Introduzzjoni Żewġ provi in vitro għall-korrużività tal-ġilda, il-prova tar-resistenza transkutanea elettrika tal-ġilda tal- far u prova li tuża mudell ta’ ġilda tal-bniedem, ġew approvati bħala xjentifikament validi miċ-Ċentru Ewropew għall-Validazzjoni ta’ Metodi Alternattivi (ECVAM, Ċentru ta’ Riċerka Konġunta, Kummissjoni Ewropea) (1) (2) (3). L-istudju ta’ validazzjoni ECVAM wera li ż-żewġ provi kienu jistgħu jiddiskriminaw b’mod affidabbli bejn korrużivi tal-ġilda u dawk li m’humiex. Barra dan, il-protokoll tal-prova bbażat fuq mudell tal-ġilda tal-bniedem ippermetta distinzjoni korretta bejn gradi ta’ effetti korrużivi (korrożivi tal- ġilda severi magħrufa, R35, u korrużivi oħra tal-ġilda, R34) (2). Qed jingħataw id-deskrizzjoni u l-proċeduri għaż-żewġ provi; l-għażla ta’ liema prova tintuża tiddependi fuq ħtiġiet speċifiċi u l-preferenzi ta’ l-utent. Ara wkoll l-Introduzzjoni Ġenerali, Parti B. 1. 2. Definizzjonijiet Korrużjoni tal-ġilda: Il-produzzjoni ta’ ħsara irriversibbli fit-tessut fil-ġilda wara l-applikazzjoni ta’ materjal ta’ prova. 1. 3. Sustanzi ta’ Referenza Xejn speċifikat, imma ara l-punti 1. 5. 3. 4 u 1. 7. 2. 3. 1. 4. Prinċipju tal-metodu tal-prova – ġilda tal-far prova TER Il-materjal tal-prova huwa applikat sa 24 siegħa lill-uċuħ epidermiċi ta’ diski tal-ġilda meħuda mill-ġlud ta’ firien għadhom żgħar maqtula umanament. Materjali korrużivi huma identifikati bl-abbiltà tagħhom li jipproduċu telf ta’ funzjoni ta’ l-integrità normali ta’ l-istrat korneju u l-funzjoni protettiva, li huwa mkejjel bħala tnaqqis fit-TER inerenti taħt livell tal-limitu (5 k Ω)(4)(5). Materjali irritanti u mhux irritanti ma jnaqqsux it-TER taħt il-livell tal-limitu. Pass fejn jintrabat il-kulur jista’ jkun inkorporat fil-proċedra tal-prova għall-aġenti tensioattivi u organiċi newtri (għad-definizzjoni ara r-referenza (6)) biex jitnaqqas in-numru ta’ riżultati pożittivi foloz miksuba speċifikatament ma’ dawn it-tipi kimiċi (2) (7). 1. 5. Deskrizzjoni tal-metodu tal-prova – prova TER tal-ġilda tal-far 1. 5. 1. Annimali Firien għadhom żgħar (20-23 jum) (razza Wistar jew simili) huma meħtieġa għall-preparazzjoni ta’ diski tal-ġilda. Is-suf tad-dahar u tal-ġnub jitneħħa b’attenzjoni bi klippers ta’ l-annimali żgħar. L-annimali huma mbagħad maħsula billi jintmesħu b’attenzjoni, waqt li ż-żona titniżżel f’soluzzjoni antibiotika (li jkollha, per eżempju, streptomycin, peniċillina, chloramphenicol u amphotericin f’konċentrazzjonijiet effet- tivi biex jinibixxu li tikber il-batterja). L-annimali jerġgħu jinħaslu bl-antibiotiċi fit-tielet jew ir-raba’ jum wara l-ewwel ħasla, u jintużaw fi tlett ijiem (l-annimali m’għandhomx ikunu akbar minn 31 jum għall- preparazzjoni tal-ġilda). 1. 5. 2. Preparparazzjoni tad-diski tal-ġilda L-annimali jinqatlu umanament. Il-ġilda tad-dahar ta’ kull annimal hija mbagħad imneħħija u mnaddfa jitneħħa b’attenzjoni mill-ġilda. Il-ġilda titpoġġa fuq it-tarf ta’ tubu tal- minn xaħam żejjed billi polytetrafluoroethylene (PTFE), waqt li jkun żgurat li l-wiċċ epidermiku huwa f’kuntatt mat-tubu. ‘O’ ring tal-gomma jitpoġġa ssikkat fuq it-tarf tat-tubu biex iżomm il-ġilda fil-post u t-tessut fl-eċċess jitneħħa. Id-dimensjonijiet tat-tubu u ta’ l-‘O’ ring jidhru fil-Figura 1. L-‘O’ ring tal-gomma huwa mbagħad issiġġillat b’attenzjoni fit-taf tat-tubu PTFE b’ġeli tal-pitrolju. It-tubu jintrifed bi klipp bil-molla ġewwa kamra tar- reċipjent li jkollha soluzzjoni tas-sulfat tal-manjeżju (154 mM) (Figura 2). 1. 5. 3. Proċedura tal-prova 1. 5. 3. 1. A p p l i k a z z j o n i t a l - m a t e r j a l t a l - p r o v a Sustanzi tal-prova likwidi (150 μl) jiġu applikati lill-wiċċ epidermiku ġewwa t-tubu (Figura 2). Meta jkunu ppruvati materjali solidi, jiġi applikat ammont biżżejjed tas-solidu lid-diska biex ikun żgurat li l-wiċċ sħiħ ta’ l-epidermidi jitgħatta. Ilma dejonizzat (150 μl) huwa mbagħad miżjud fuq is-solidu u t-tubi huma mċa- qalqa bil-mod. Is-sustanzi tal-prova għandhom ikollhom il-kuntatt massimu mal-ġilda. Għal xi solidi dan jista’ jintlaħaq bit-tisħin sa 30°Ċ biex tinħall is-sustanza tal-prova, jew bit-tħin biex ikun prodott materjal granulari jew trab. 244 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta’ l-Unjoni Ewropea 13/Vol. 25 Tliet diski tal-ġilda jintużaw għal kull sustanza tal-prova. Is-sustanzi tal-prova huma applikati għall-24 siegħa (ara ukoll 1. 5. 3. 4). Is-sustanza tal-prova hija mneħħija bil-ħasil b’ġett ta’ ilma mill-vit sa 30°Ċ sakemm ma jkunx jista’ jitneħħa materjal ieħor. It-tneħħija ta’ sustanzi tal-prova li ssolidifikaw fit-tubu tista’ tkun faċilitata bil-ħasil b’ġett tal-misħun bejn wieħed u ieħor 30°Ċ. 1. 5. 3. 2. M i ż u r i T E R It-TER huwa mkejjel bl-użu ta’ vultaġġ baxx, databridge ta’ kurrent alternat (eż AIM 401 jew 6401, jew ekwivalenti). Qabel ma titkejjel ir-resistenza elettrika, it-tensjoni tal-wiċċ tal-ġilda titnaqqas billi jiżdied volum biżżejjed ta’ 70 % etanol biex ikopri l-epidermidi. Wara ftit sekondi l-etanol huwa mneħħi billi jinqaleb it-tubu, u mbagħad it-tessut huwa idradat biż-żieda ta’ 3ml soluzzjoni tas-sulfat tal-manjeżju (154 mM). L-elettrodi tad-databridge jitqiegħdu f’kull ġenb tad-diska tal-ġilda biex jittieħed il-kejl tar- resistenza kΩ/disk tal-ġilda (Figura 2). Id-dimensjonijiet ta’ l-elettrodu u t-tul ta’ l-elettrodu espost taħt il-crocodile clips jidhru fil-Figura 1. Il-klipp ta’ ġewwa (oħxon) ta’ l-elettrodu jitqiegħed fuq il-wiċċ tat-tubu PTFE matul il-kejl tar-resistenza, biex ikun żgurat li tul konsistenti ta’ l-elettrodu huwa mdaħħal fis- soluzzjoni tas-sulfat tal-manjeżju. L-elettrodu ta’ barra (irqiq) huwa mqiegħed ġewwa l-kamra riċeventi biex isserraħ fuq il-qiegħ. Id-distanza bejn il-qiegħ tal-klipp bil-molla u l-qiegħ tat-tubu PTFE jinżamm bħala kostanti (Figura 1), billi din id-distanza taffettwa l-valur tar-resistenza miksuba. Innota li jekk il-valur tar-resistenza mkejla huwa akbar minn 20 kΩ dan jista’ jkun minħabba li s-sustanza tal-prova tiksi l-wiċċ epidermiku tad-diska tal-ġilda. It-tneħħija ta’ din il-kisja tista’ tkun ippruvata, per eżempju, bl-issiġillar tat-tubu PTFE b’behem gwantat imċaqlaq għal madwar 10 sekondi; is-soluzzjoni tas- sulfat tal-manjeżju titneħħa u l-kejl tar-resistenza tiġi ripetuta b’sulfat tal-manjeżju ġdid. Ir-riżultati TER medji huma aċċettati bil-kondizzjoni li valuri tal-kontroll pożittivi u negattivi jaqgħu fil- meded aċċettabbli għall-metodu. Is-sustanzi tal-kontroll issuġġeriti u l-meded ta’ resistenża assoċjati aċċet- tabbli għall-metodoloġija u l-apparat deskritt huma: Kontroll Sustanza Pożittiv Negattiv 10 M aċtu idrokloriku (36 %) Ilma distillat Medda ta’ resistenza (KΩ) 0,5-1,0 10-25 1. 5. 3. 3. P r o ċ e d u r a m o d i f i k a t a g ħ a l l - a g e n t i t e n s i o a t t i v i u o r g a n i ċ i n e w t r i Jekk il-valuri TER tas-sustanzi tal-prova li huma jew aġenti tensioattivi u organiċi newtri huma anqas minn jew daqs 5 kΩ tista’ ssir valutazzjoni ta’ kemm ippenetra l-kulur fuq it-tessuti. Din il-proċedura għandha tiddetermina jekk ir-riżultati huma pożittivi foloz (2). 1. 5. 3. 3. 1. Applikazzjoni tal-kulur Sulforhodamine B u tneħħija Wara t-trattament tal-bidu bis-sustanza tal-prova, 150 μl ta 10 % (w/v) hija applikata dilwizzjoni ta’ kulur sulforhodamine B f’ilma distillat lill-wiċċ epidermiku ta’ kull diska tal-ġilda għal sagħtejn. Id-diski tal-ġilda huma mbagħad maħsula b’ġett ta’ l-ilma sat-temperatura ambjentali għal madwar 10 sekondi biex jit- neħħa l-kulur fl-eċċess/li ma jkunx qabad. Kull diska tal-ġilda titneħħa b’attenzjoni mit-tubu PTFE u tit- poġġa f’kunjett (eż kunjett tal-ħġieġ xintillanti) li jkollu ilma dejonizzat (8 ml). Il-kunjetti jitħawdu bil- mod għall-5 minuti biex jitneħħa l-kulur fl-eċċess/li ma jkunx qabad. Il-proċedura tat-tlaħliħ hija mbagħad imtennija, u wara dan id-diski tal-ġilda jitneħħew u jitpoġġew f’kunjetti li jkollhom 5 ml ta’ 30 (w/v) sulfat tas-sodju dodecyl (SDS) fl-ilma distillat u huma inkubati mal-lejl f’60° Ċ. Wara l-inkubazzjoni, kull diska tal-ġilda titneħħa u titwarrab u s-soluzzjoni li jifdal hija ċentrifugata għal 8 minuti f’21° Ċ (forza ċentrifuga ġsim ħ 175). Kampjun ta’ 1 ml tas-supernatant huwa mbagħad mħallat 1 f’5 (v/v) (jiġifieri 1 ml + 4 ml) ma’ 30 % (w/v) SDS f’ilma distillat. Id-densità ottika (OD) tas-soluzzjoni hija mkejla f’madwar 565 nm), 1. 5. 3. 3. 2. Kalkolu tal-kontenut tal-kulur Il-kontenut tal-kulur sulforhodamine B kull diska huwa kkalkolat mill-valuri OD (koeffiċjent molari kulur sulforhodamine B f’565 nm = 8,7 7 × 104; piż molekolari = 580). Il-kontentut tal-kulur sulforhodamine B huwa ddeterminat għal kull diska tal-ġilda u kontenut tal-kulur medju huwa mbagħad ikkalkolat għar- replikati. Ir-riżultati tal-kulur medji huma aċċettati bil-kondizzjoni li valuri tal-kontroll konkorrenti jaqgħu fil-meded aċċettabbli għall-metodu. Il-meded tal-kontenut tal-kulur suġġeriti aċċettabbli għas- sustanzi ta’ kontroll għall-metodoloġija u l-apparat deskritt huma: 13/Vol. 25 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta’ l-Unjoni Ewropea 245 Kontroll Sustanza Pożittiv Negattiv 10 M aċtu idrokloriku (36 %) Ilma distillat 1. 5. 3. 4. I n f o r m a z z j o n i a d d i z z j o n a l i Medda tal-kontenut tal-kulur (μg/diska) 40-100 15-35 Sustanzi tal-prova jistgħu jkunu applikati wkoll lid-diski tal-ġilda għall-perjodi aqsar (eż sagħtejn) biex ikunu identifikati dawk il-materjali li huma korrużivi severament. Iżda, fl-istudju ta’ validazzjoni, il-prova TER instabet li stmat iżżejjed il-potenzjal korrużiv ta’ diversi kimiċi tal-prova wara l-applikazzjoni tagħ- hom lid-diski tal-ġilda għal sagħtejn (2), għalkemm ippermettiet l-identifikazzjoni korretta tal-korrużivi u dawk li m’humiex wara applikazzjoni ta’ 24 siegħa. ta’ l-apparat Il-proprjetajiet u d-dimensjonijiet tal-prova u l-proċedura sperimentali użata tista’ tinfluwenza l-valuri TER miksuba. Il-limitu korrużiv 5 k Ω kien żviluppat minn data miksuba b’apparat speċifiku u l-proċedura deskitta f’dan il-metodu. Valuri differenti tal-limitu u tal-kontroll jistgħu jappli- kaw jekk il-kondizzjonijiet tal-prova jitbiddlu b’mod sinifikanti. Għalhekk, huwa rakkomandat li l-metodoloġija u l-valur tal-limitu tr-resistenza huma kalibrati billi jkunu pruvati serje ta’ standards magħ- żula mill-kimiċi użati fl-istudju tal-validazzjoni (3). 1. 6. Prinċipju tal-metodu tal-prova – prova tal-mudell tal-ġilda tal-bniedem Il-materjal ta’ prova huwa applikat topikament sa mhux iżjed minn 4 siegħat lill-mudell tal-ġilda tri- dimensjonali, li jikkomprendi epidermini rikostruwita bi strat korneju funzjonali. Materjali korrużivi huma identifikati bl-abbiltà tagħhom li jipproduċu tnaqqis fil-vitalità taċ-ċellula (kif determinat, per eżempju, bl-użu tal-prova ta’ tnaqqis MTT) taħt il-livelli tal-limitu definiti f’perjodi speċifikati ta’ espożizzjoni. Il-prinċipju tal-prova huwa skond l-ipotesi li kimiċi li huma korrużivi huma dawk li jistgħu jippenetraw l-istrat korneju (bid-diffużjoni jew l-erożjoni) u huma biżżejjed ċitotossiċi biex jikkawżaw il-mewt taċ-ċelloli fis-saffi taċ-ċelloli ta’ taħt. 1. 7. Deskrizzjoni tal-metodu tal-prova – prova tal-mudell tal-ġilda tal-bniedem 1. 7. 1. Mudelli tal-ġilda tal-bniedem Il-mudelli tal-ġilda tal-bniedem jistgħu jiġu minn diversi sorsi, imma għandhom iħarsu ċerti kriterji. Il-mudell għandu jkollu strat korneju funzjonali b’saff taħt ta’ ċelloli ħajjin. Il-funzjoni protettiva ta’ l-istrat korneju għandha tkun adegwata. Dan jista’ jintwera billi tkun spjegata r-resistenza tal-mudell għaċ- ċitotossiċità wara l-applikazzjoni tas-sustanzi li huma magħrufa li huma ċitotossiċi għaċ-ċelloli, imma li normalment jgħaddu mill-istrat korneju. Il-mudell għandu jintwera li jagħti riżultati riproduċibbli taħt kondizzjonijiet sperimentali definiti. Il-vitalità ta’ ċelloli ħajjin fil-mudell għandha tkun għolja biżżejjed li tiddiskrimina sewwa bejn is-sustanzi ta’ kontroll pożittivi u negattivi. Il-vitalità taċ-ċellula (per eżempju, kif imkejla bl-ammont ta’ tnaqqis MTT, jiġifieri valur OD) wara l-espożizzjoni għal sustanzi ta’ kontroll negattivi għandhom jaqgħu f’limiti aċċet- tabbli għall-mudell partikolari. Similment, il-valuri tal-vitalità taċ-ċellola mas-sustanza tal-kontroll pożit- tiv (fir-rigward ta’ dawk għall-kontroll negattiv) għandhom jaqgħu fil-limiti speċifiċi. Aktar importanti, il-mudell ta’ tbassir użat għandu jintwera li jħares l-istandard ta’ validazzjoni internazzjonali (2). 1. 7. 2. Proċedura tal-prova 1. 7. 2. 1. A p p l i k a z z j o n i t a l - m a t e r j a l t a l - p r o v a Għall-materjali likwidi, għandha tkun applikata sustanza tal-prova suffiċjenti biex tgħatti l-wiċċ tal-ġilda (minimu ta’ 25 μl/ċm2). Għall-materjali solidi, għandha tkun applikata sustanza tal-prova suffiċjenti mal- ġilda, imbagħad għandha tixxarrab biex tiżgura kuntatt tajjeb mal-ġilda; fejn xieraq, is-solidi għandhom jintaħnu fi trab qabel l-applikazzjoni. Il-metodu ta’ applikazzjoni għandu jintwera li jkun biżżejjed għal firxa kbira ta’ tipi kimiċi (2). Fit-tmiem tal-perjodu ta’ l-espożizzjoni, il-materjal tal-prova għandu jkun maħsul b’attenzjoni mill-wiċċ tal-ġilda b’soluzzjoni salina. 1. 7. 2. 2. K e j l t a l - v i t a l i t à t a ċ - ċ e l l u l a Kull metodu kwantitattiv, validat jista’ jintuża biex ikejjel il-vitalità taċ-ċellula. Il-prova użata l-aktar spiss hija tnaqqis MTT, li ntweriet li tagħti riżultati preċiżi u riproduċibbli f’diversi laboratorji (2). Id-diska tal- ġilda hija mpoġġija f’soluzzjoni MTT ta’ 0,3 mg/ml f’20-28°Ċ għal tliet siegħat Il-prodott preċipitat ikħal formazan huwa mbagħad estratt (estrazzjoni tas-solvent) u l-konċentrazzjoni tal-formazan hija mkejla bid-determinazzjoni ta’ l-OD f’wavelength bejn 545 u 595 nm. 246 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta’ l-Unjoni Ewropea 13/Vol. 25 1. 7. 2. 3. I n f o r m a z z j o n i a d d i z z j o n a l i Il-mudell tal-ġilda użat, u l-protokoll eżatt tal-ħin ta’ l-espożizzjoni u l-proċeduri ta’ ħasil, eċċ. għandhom ikollhom impatt maġġuri fuq ir-riżultati tal-vitalità taċ-ċellola. Huwa rakkomandat li l-metodoloġija u l-mudell ta’ tbassir huma kalibrati bil-prova ta’ serje ta’ standards ta’ referenza magħżula mill-kimiċi użati fl-istadju tal-validazzjoni tal-ECVAM (3). Huwa kritiku li l-metodu użat intwera li huwa riproduċibbli ġewwa u bejn laboratorji għal firxa kbira ta’ kimiċi, skond l-istandards internazzjonali. Bħala minimu, il-metodu għandu jħares il-kriterji għall-validità xjentifika definiti qabel (2), u r-riżultati ta’ dan l-istudju ta’ validazzjoni għandu jkun ippubblikat f’ġurnal xjentifiku rivedut qalb pari. 2. DATA 2. 1. Trattament tar-riżultati 2. 1. 1. Prova TER fuq il-ġilda tal-far Valuri ta’ resistenza (kΩ) għall-materjal tal-prova, kontrolli pożittivi u negattivi, u kull kimika standard ta’ referenza għandhom ikunu rapportati f’forma tabulata, inkluż data għall-esperimenti replikati/ripetuti, valuri medji u l-klassifikazzjoni derivata. 2. 1. 2. Mudelli tal-ġilda tal-bniedem Valuri OD u data tal-perċentwal kalkolat fuq il-vitalità taċ-ċellula għall-materjal tal-prova, kontrolli pożit- tivi u negattivi, u kull kimika standard ta’ referenza għandhom ikunu rapportati f’forma tabulata, inkluż data għall-esperimenti replikati/ripeturi, valuri medji u l-klassifikazzjoni derivata. 2. 2. Valutazzjoni u interpretazzjoni tar-riżultati 2. 2. 1. Prova TER fuq il-ġilda tal-far Jekk il-valur medju TER miksub għas-sustanza tal-prova huwa akbar minn 5 kΩ mela mhux korrużiva. Jekk il-valur TER huwa anqas minn jew ugwali għal 5 kΩ u s-sustanza tal-prova mhux surfactant jew organiku newtru, mela hija korrużiva. li Għas-surfactants jew organiċi newtri jagħtu valuri TER anqas minn jew daqs 5 kΩ tista’ ssir il-penetrazzjoni tal-kulur. Jekk il-kontenut tal-kulur medju tad-diska huwa akbar minn jew daqs il-kontenut medju tad-diska tas-36 % HCI kontroll pożittiv miksub konkorrentement, mela s-sustanza tal-prova hija pożittiva vera u għalhekk korrużiva. Jekk il-kontenut medju tal-kulur tad-diska huwa anqas mill-kontenut medju tad-diska tas-36 % HCI kontroll pożittiv miksub konkorrentement, mela s-sustanza tal-prova hija pożittiva falza u għalhekk mhux korrużiva. 2. 2. 2. P r o v a t a l - m u d e l l t a l - ġ i l d a t a l - b n i e d e m Il-valur OD ta’ kontroll negattiv jirrappreżenta 100 % tal-vitalità taċ-ċellola; għalhekk, il-valuri OD mik- suba għal kull kampjun tal-prova jista’ jintuża biex ikun kalkolat il-perċentwal tal-vitalità relattiva għall- kontroll negattiv. Il-perċentwal kritiku tal-valur tal-vitalità taċ-ċellola jiddistingwi materjali tal-prova kor- rużivi minn dawk li m’humiex (jew jiddiskrimina bejn klassijiet differenti korrużivi) għandu jkun definit b’mod ċar fil-mudell ta’ tbassir qabel ma l-metodu ikun validat, u l-istudju ta’ validazzjoni sussegwenti għandu juri li l-valur kritiku huwa xieraq (2). 3. RAPPORTAĠĠ Rapport tal-prova Ir-rapport tal-prova għandu mill-inqas ikollha t-tagħrif li ġej: Sustanza tal-prova: — data ta’ identifikazzjoni, natura fiżika u, meta rilevanti, propjetajiet fizikokimiċi. Informazzjoni simili għandha tkun ipprovduta għall-sustanzi ta’ referenza, jekk użati. Kondizzjonijiet tal-prova: — dettalji tal-proċedura tal-prova użata, — deskrizzjoni u ġustifikazzjoni ta’ kull modifika. 13/Vol. 25 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta’ l-Unjoni Ewropea 247 Riżultati: — tabulazzjoni ta’ valuri ta’ resistenza (prova TER) jew valuri tal-perċentwal tal-vitalità taċ-ċellola (prova tal-mudell tal-ġilda tal-bniedem) għall-materjal tal-prova, kontrolli pożittivi u negattivi u kull kimika ta’ riferenza standard, inkluż data għal sperimenti replikati/ripetuti u valuri medji, — deskrizzjoni ta’ kull effett ieħor osservat. Diskussjoni tar-riżultati: Konklużjonijiet. 4. RIFERENZI (1) ECVAM (1998), ECVAM News & Views, ATLA 26, pp. 275-280. (2) Fentem, J. H. , Archer, G. E. B. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. , Holzhutter, H-G. & Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in Vitro 12, pp. 483- 524. (3) Barratt, M. D. , Brantom, P. G. , Fentem, J. H. , Gerner, I. , Walker, A. P. & Worth, A. P. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals, Toxicology in Vitro 12, pp. 471-482. (4) Oliver, G. J. A. , Pemberton, M. A. & Rhodes, C. (1986), An in vitro skin corrosivity test - modifications and validation, Food & Chemical Toxicology 24, pp. 507-512. (5) Botham, P. A. , Hall, T. J. , Dennett, R. , McCall, J. C. , Basketter, D. A. , Whittle, E. , Cheeseman, M. , Esdaile, D. J. & Gardner, J. (1992), The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial, Toxicology in Vitro 6, pp. 191-194. (6) Worth, A. P. , Fentem, J. H. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. & Liebsch, M. (1998), An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion, ATLA 26, pp. 709- 720. (7) Botham, P. A. , Chamberlain, M. , Barratt, M. D. , Curren, R. D. , Esdaile, D. J. , Gardner, J. R. , Gordon, V. C. , Hildebrand, B. , Lewis, R. W. , Liebsch, M. , Logemann, P. , Osborne, R. , Ponec, M. , Regnier, J. F. , Steiling, W. , Walker, A. P. & Balls, M. (1995), A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. Ir-rapport u r-rakkomandazzjonijiet tal-workshop ECVAM 6, ATLA 23, pp. 219-255. 248 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta’ l-Unjoni Ewropea 13/Vol. 25 Figure 1 13/Vol. 25 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta’ l-Unjoni Ewropea 249 Figure 2 ” 250 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta’ l-Unjoni Ewropea 13/Vol. 25 ANNESS II “B. 41. FOTOTOSSIĊITÀ – PROVA IN VITRO 3T3 NRU TAL PROVA TAT-TOSSIĊITÀ 1. METODU 1. 1. Introduzzjoni Il-fototossiċità hija definita bħala rispons tossiku li jiġi wara l-ewwel espożizzjoni tal-ġilda ma’ ċerti kimiċi jew hija indotta similment bl-irradjazzjoni tal-ġilda wara u l-espożizzjoni sussegwenti għad-dawl, l-amministrazzjoni sistemika ta’ kimika. Informazzjoni miġjuba mill-prova ta’ tossiċità in vitro 3T3 NRU isservi biex tidentifika l-potenzjal fototossiku ta’ sustanza tal-prova, li x’aktarx jinqalgħu minn sustanza ta’ prova flimkien ma’ l-espożizzjoni għall-UV u dawl visibbli. l-eżistenza jew in-nuqqas ta’ perikoli possibbli jiġifieri Billi l-punt finali tossikoloġiku tal-prova in vitro hija d-determinazzjoni tal-fototossiċità, indotta bl-azzjoni kombinata ta’ kimika u d-dawl, komposti li huma fototossiċi in vivo wara l-applikazzjoni sistemika u d-distribuzzjoni mal-ġilda, kif ukoll komposti li jaġixxu bħala fotoirritanti wara applikazzjoni topika mal- ġilda, jista’ jkun identifikat bil-prova. Il-prova in vitro 3T3 NRU kienet żviluppata u validata f’proġett konġunt EU/COLIPA mill-1992-1997 (1) (2) (3), biex tkun stabbilita alternattiva valida in vitro għad-diversi provi in vivo użati. Fl-1996 workshop ta’ l-OECD irrakkomanda prova sekwenzjali in vitro għall-valutazzjoni tal-fototossiċità (4). Riżultati mill-prova ta’ fototossiċità in vitro 3T3 NRU meta paragunati ma’ effetti akuti in vivo ta’ fototossiċità/fotoirritazzjoni fl-annimali u l-bnedmin, u l-prova ntweriet li tagħti tbassir eċċellenti għal dawn l-effetti. Il-prova mhux imfassla li tbassar effetti oħra ħżiena li jistgħu jinqalgħu mill-azzjoni maqgħuda ta’ kimika u dawl, eż fotoġenotossiċità, fotoallerġija, u fotokanċeroġeniċità, għalkemm ħafna kimiki li juru dawn il-proprjetajiet speċifiċi għandhom jirreaġixxu pożittivament fil-prova ta’ fototossiċità 3T3 NRU in vitro. Barra dan, il-prova mhix iddisinjata biex tippermetti stima tal-qawwa fototossika. Approċċ sekwenzjali għall-prova fototossika tal-kimiċi huwa provdut fl-Appendiċi. 1. 2. Definizzjonijiet Irradjament: l-intensità ta’ dawl ultravjola (UV) jew visibbli li jaqa’ fuq wiċċ, imkejjel f’W/m2 jew mW/cm2. Doża ta’ dawl: il-kwantità (= intensità ħin) ta’ radjazzjoni ultravjola (UV) jew viżibbli li jaqa’ fuq wiċċ, espress f’Joules (= Wx s) kull erja tal-wiċċ, eż UJ/m2 jew Jċm2. Wavebands tad-dawl UV: l-indikazzjonijiet rakkomandati mill-CIE (Commission Internationale de L’Eclairage) huma: UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) u UVC (100-280 nm). Indikazzjonijiet oħra huma użati wkoll: id-diviżjoni bejn UVB u UVA titpoġġa ta’ spiss f’320nm, u l-UVA tista’ tiqasam f’UV-A1 u UV-A2 b’diviżjoni magħmula f’320 nm. Vitalità taċ-ċellola parametru li jkejjel l-attività totali ta’ popolazzjoni taċ-ċelloli (eż. teħid tal-kulur vitali aħmar newtru fil-lisożomi ċellulari) li, waqt li jiddependi fuq il-punt tat-tmiem mkejjel u d-disinn tal-prova użata, jikkorrelata man-numru totali u/jew il-vitalità taċ-ċelloli. Vitalità relattiva taċ-ċellola vitalità espressa fir-rigward ta’ kontrolli negattivi (solventi) li għaddew matul il-proċedura sħiħa tal-prova (jew + UV jew – UV), imma mhux trattati b’kimika ta’ prova. Mudell ta’ tbassir: algoritmu użat biex ikunu trasformati r-riżultati tal-prova tat-tossiċità f’tbassir tal- potenzjal tossiku. Fil-linja ta’ gwida preżenti tal-prova, PIF u MPE jistgħu jintużaw għat-trasformazzjoni tar- riżultati tal-prova ta’ fototossiċità in vitro 3T3 NRU fi tbassir ta’ potenzjal fototossiku. PIF (fattur ta’ irritazzjoni tad-dawl) fattur ġenerat billi jkunu paragonati żewġ konċentrazzjonijiet ċitotossiċi ugwalment effettivi (EC50) tal-prova kimika miksuba fin-nuqqas (-UV) u fil-presenza (+ UV) ta’ irradjaz- zjoni mhux ċitotossika bid-dawl UVA/vis. MPE (effett medju tad-dawl) miżura ġdida misluta minn analiżi matematika tal-forma kompleta ta’ żewġ kurvi ta’ risposta ta’ konċentrazzjoni miksuba fin-nuqqas (-UV) u fil-preżenza (+ UV) ta’ irradjazzjoni mhux ċitotossika bid-dawl UVA/vis. 13/Vol. 25 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta’ l-Unjoni Ewropea 251 Fototossiċità: Il-fototossiċità hija definita bħala rispons tossiku li jiġi wara l-ewwel espożizzjoni tal-ġilda għal ċerti kimiċi u l-espożizzjoni sussegwenti għad-dawl, jew hija indotta similment bl-irradjazzjoni tal- ġilda wara l-amministrazzjoni sistemika ta’ kimika. Fotoirritazzjoni subspeċi tal-kelma ‘fototossiċità’, li hija użata biex tiddeskrivi biss dawk ir-reazzjonijiet fototossiċi li huma prodotti fil-ġilda wara l-espożizzjoni għall-kimiċi (topikament jew oralment). Dawn ir-reazzjonijiet fototossiċi jwasslu għall-ħsara mhux speċifika taċ-ċellola (reazzjonijiet bħal ħruq mix-xemx). Fotoallerġija: reattività immunoloġika miksuba, li ma sseħħx fl-ewwel trattament bil-kimika u d-dawl, u għandha bżonn ta’ perjodu ta’ induzzjoni ta’ ġimgħa jew ġimgħatejn qabel ma tidher ir-reattività tal-ġilda. Fotoġenotossiċità: risposta ġenotossika osservata b’punt finali ġenetiku, li tiġri wara l-espożizzjoni taċ- ċelloli għal doża mhux ġenotossika ta’ dawl UV/viżibbli u kimika mhux ġenotossika. Fotokanċerinoġeniċità: kanċeroġeniċità indotta bl-applikazzjoni ripetuta ta’ dawl u kimika. Il-kliem ‘foto ko-kanċeroġeniċità’, huwa użat jekk it-tumoriġenesi indotta bl-UV tiżdied b’kimika. 1. 3. Sustanzi ta’ riferenza Minbarra l-kimika ta’ kontroll pożittiv chlorpromazine li għandha tkun ipprovata konkorrentement f’kull prova, biex tkun stabbilita l-prova ta’ fototossiċità 3T3 NRU huwa rakkomandat li jintużaw bħala kimiċi ta’ referenza subsett mill-kimiċi użati fil-provi tal-laboratorju bil-prova preżenti (1) (3) (13). 1. 4. Konsiderazzjonijiet inizjali Ħafna tipi ta’ kimiċi ġew irrapportati li jinduċu effetti fototossiċi (5) (6) (7) (8). L-unika karatteristika komuni hija l-abbiltà tagħhom li jassorbu l-enerġija fir-reġjun tad-dawl tax-xemx. Skond l-ewwel liġi tal- fotokimika (liġi Grotthaus-Draper) il-fotoreazzjoni teħtieġ assorbiment biżżejjed ta’ kwanta tad-dawl. Għal- hekk, qabel ma tkun kkunsidrata l-prova bijoloġika skond il-linja ta’ gwida preżenti tal-prova, għandu jkun determinat l-ispettru ta’ l-assorbiment UV/vis tal-kimika tal-prova (eż. skond il-Prova Linja ta’ Gwida OECD 101). Jekk il-koeffiċjent ta’ l-estinzjoni/assorbiment huwa anqas minn 10 litri × mol-1 × ċm-1, il-kimika ma għandha l-ebda potenzjal fotoreattiv u m’għandhiex għalfejn tkun provata fil-prova tal-fototossiċità in vitro 3T3 NRU jew kull prova bijoloġika oħra għall-effetti ħżiena fotokimiċi (Appendiċi). 1. 5. Prinċipju tal-metodu tal-prova Erba’ mekkaniżmi ġew identifikati li bihom l-assorbiment tad-dawl b’kromofor (kimiku) jista’ jirriżulta il-prova ta’ f’risposta fototossika (7). Kollha kemm huma jirriżultaw fi ħsara fiċ-ċellola. Għalhekk, fototossiċità in vitro 3T3 NRU hija bbażata fuq paragun ta’ ċitotossiċità ta’ kimika meta ppruvata fil- presenza u fl-assenza ta’ espożizzjoni għal doża mhux ċitotossika ta’ dawl UVA/vis. Iċ-ċitotossiċità ta’ din il-prova hija espressa bħala konċentrazzjoni li tiddependi fuq it-tnaqqis ta’ l-assorbiment tal-kulur vitali aħmar newtrali (NR) (9) 24 siegħa wara t-trattament mal-kimika tal-prova u l-irradjazzjoni. Ċelloli Balb/c 3T3 huma mantenuti fil-kultura għall 24 siegħa għall-formazzjoni tal-monostrati Żewġ 96-well plates kull test kimiku huwa mbagħad preinkubat b’tmien konċentrazzjonijiet differenti għal kimika għal 1 s. Imbagħad waħda miż-żewġ pjanċi hija esposta għal doża ta’ dawl UVA/vis mhix ċitotossika ta’ 5 J/ċm2 UVA (speriment + UV), waqt li l-pjanċa l-oħra tinżamm fid-dlam (speriment -UV). Fiż-żewġ pjanċi, il-mezz ta’ trattament huwa mbagħad mibdul b’mezz ta’ kultura u wara 24 s oħra ta’ inkubazzjoni, tkun determinta l-vitalità taċ-ċellola bl-uptake newtrali ta’ l-aħmar (NRU) għal 3 s. Il-vitalità relattiva taċ-ċellola, espressa bħala perċentwal tal-kontrolli negattivi mhux trattati, hija kkalkolata għal kull wieħed mit-tmien konċentrazzjonijiet tal-prova. Biex jitbassar il-potenzjal fototossiku, ir-risposti tal-konċentrazzjoni mik- suba fil-preżenza ta’ (+ UV) u fin-nuqqas (-UV) ta’ irradjazzjoni huma paragunati, is-soltu fil-livell EC50, jiġifieri fil-konċentrazzjoni ta’ l-inibizzjoni tal-vitalità taċ-ċellola b’50 % cf ta’ kontrolli mhux trattati. 1. 6. Kriterji ta’ kwalità Sensittività UVA taċ-ċelloli, data storika: ċelloli għandhom ikunu verifikati regolarment għas-sensittività ta’ l-UVA. Iċ-ċelloli huma miżrugħa fid-densità użata fil-prova tal-fototossiċità in vitro 3T3 NRU, irradjata l-ġurnata ta’ wara b’dożi UVA minn 1-9 J/cm2, u l-vitalità taċ-ċellola hija ddeterminata jum wara bl-użu tal-prova NRU. Iċ-ċelloli jilħqu l-kriterju tal-kwalità, jekk il-vitalità tagħhom wara l-irradjazzjoni b’5 J/cm2 UVA mhux anqas minn 80 % tal-vitalità tal-kontrolli fid-dlam. Fl-ogħla doża UVA ta’ 9J/cm2, il-vitalità m’għandhiex tkun anqas minn 50 % ta’ dak ta’ kontrolli fid-dlam. Din il-verifika għandha tkun ripetuta ma’ kull għaxar (10) passaġġi taċ-ċelloli. Sensittività UVA taċ-ċelloli ta’ kontroll negattiv, prova kurrenti: il-prova tissodisfa l-kriterji ta’ kwalità jekk il-kontrolli negattivi (ċelloli fis-soluzjoni bilanċjata Earl (EBSS) b’1 % dimethylsulfoxide (DMSO) jew min- għajrha jew 1 % etanol (EtOH)) fl-esperiment + UVA juru vitalità ta’ mhux anqas minn 80 % ta’ dak ta’ ċel- loli mhux irradjati fl-istess solvent ta’ l-esperiment konkorrenti fid-dlam (-UVA). 252 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta’ l-Unjoni Ewropea 13/Vol. 25 Vitalità ta’ kontrolli negattivi: id-densità assoluta ottika (OD540 NRU) mkejla fl-estratt NR tal-kontrolli negattivi tindika jekk il-1 × 104 ċelloli miżrugħa kull bir ikunu kibru biż-żmien normali irduppjat matul il-jumejn ta’ prova. Prova tilħaq il-kriterji ta’ aċċettazzjoni jekk il-medja OD540 NRU ta’ kontrolli mhux trattati hi > = 0,2. Kontroll pożittiv: kimika magħrufa fototossika għandha tkun pruvata flimkien ma kull prova ta’ fototossiċità in vitro 3T3 NRU. Il-chlorpromazine (CPZ) intużat bħala kontroll pożittiv fl-istudju ta’ validaz- zjoni EU/COLIPA u għalhekk hija rakkomandata. Għal CPZ eżaminata bil-protokoll standard fil-prova ta’ fototossiċità in vitro 3T3 NRU, kienu definiti l-kriterji ta’ l-aċċettazzjoni tal-prova li ġejjin: CPZ irradjata (+ UVA): EC50 = 0,1 to 2,0 μg/ml, CPZ mhux irradjata (- UVA): EC50 = 7,0 to 90,0 μg/ml. Il-fattur ta’ foto irradjazzjoni (PIF), jiġifieri l-ispostament ta’ EC50 għandu jkun ta’ l-anqas 6. Kimiki oħra fototossiċi magħrufa, xierqa għall-klassi kimika jew karatteristiċi ta’ solubbilità tal-kimika tal- prova li qed tkun valutata, jistgħu jintużaw bħala l-kontrolli pożittivi konkorrenti, minflok CPZ. F’dan il-każ, ibbażat fuq id-data storiċi, il-meded tal-valuri EC50 u PIF jew MPE (effett tad-dawl medju) għandhom ikunu definiti b’mod xieraq bħala kriterji ta’ aċċettazzjoni għall-prova. 1. 7. Deskrizzjoni tal-metodu tal-prova 1. 7. 1. Preparazzjonijiet 1. 7. 1. 1. Ċ e l l o l i Linja permanenti ta’ ċelloli fibroblastiċi tal-ġurdien - Balb/c 3T3, klonu 31 – jew minn ATCC jew minn ECACC intużat fl-istudju ta’ validazzjoni, u huwa għalhekk rakkomandat. Ċelloli oħra jew linji taċ-ċelloli jistgħu jintużaw b’suċċess ma’ l-istess protokoll tal-prova, jekk il-kondizzjonijiet tal-kultura huma addat- tati għall-bżonnijiet speċifiċi taċ-ċelloli, imma trid tintwera l-ekwivalenza. Iċ-ċelloli għandhom ikunu vverifikati regolarment għan-nuqqas ta’ kontaminazzjoni mikroplasma u għandha tintuża biss jekk ir-riżultati ta’ din il-verifika kienu sodisfaċenti. Billi s-sensittività UVA taċ-ċelloli tista’ tiżdied b’numru ta’ passaġġi, celloli Balb/c 3T3 ta’ l-iżgħar numru li jista’ jinkiseb ta’ passaġġ għandhom jintużaw, l-aħjar anqas minn 100. Huwa importanti li s-sensittività UVA taċ-ċelloli Balb/c 33T3 hija vverifikata regolarment skond il-proċedura tal-kontroll ta’ kwalità desk- ritta f’din il-gwida. 1. 7. 1. 2. K o n d i z z j o n i j i e t t a l - m e z z i u t a l - k u l t u r a Għandhom jintużaw għall-passaġġ taċ-ċellola ta’ rutina u l-proċedura tal-prova kondizzjonijiet xierqa tal- mezzi tal-kultura u ta’ inkubazzjoni. Għal ċelloli BalB/c 3T3, dawn huma miżjuda b’DMEM b’10 % ta’ seru ta’ għoġol għadu jitwieled, 4nM glutamina, peniċillina u steptomycin; u inkubazzjoni umidifikata f’37 °C/7,5 % CO2. Huwa partikolarment importanti li l-kondizzjonijiet tal-kultura taċ-ċelloli jiżguraw żmien taċ-ċiklu taċ-ċellola fil-medda normali storika taċ-ċelloli jew linja ta’ ċelloli użati. 1. 7. 1. 3. P r e p a r a z z j o n i j i e t t a l - k u l t u r i Ċelloli minn kulturi ta’ stokk iffriżat huma miżrugħa fil-mezz tal-kultura fid-densità xierqa u subkoltivati ta’ l-anqas darba qabel ma jintużaw fil-prova in vitro 3T3 NRU ta’ fototossiċità. Għall-prova ta’ fototossiċità jinżergħu ċelloli fil-mezz tal-kultura f’densità tali li l-kulturi ma jilħqux il-konfluwenza fi tmiem il-prova, jiġifieri meta l-vitalità taċ-ċellola hija determinata 48 s wara li jinżergħu ċ-ċelloli. Għal ċelloli Balb/c 3T3 imkabbra f’96-well plates, 1 × 104 ċellola kull bir hija d-densità rakkoman- data taċ-ċellola. Għal kull kimika ta’ prova, ċelloli miżrugħa identikament f’żewġ 96-well plates separati, li huma mbagħad meħuda konkorrentement fil-proċedura sħiħa tal-prova taħt kondizzjonijiet tal-kultura identiċi, ħlief għall- perjodu taż-żmien meta waħda mill-pjanċi hija irradjata (+ UVA/vis) u l-oħra tinżamm fid-dlam (-UVA/vis). 1. 7. 1. 4. A t t i v a z z j o n i m e t a b o l i k a Billi l-użu ta’ sistemi metabolizzanti hija ħtieġa ġenerali għall-provi kollha in vitro għat-tbassir tal-potenzjal ġenotossiku u karċinoġeniku, s’issa, fil-każ ta fototossikoloġija, l-ebda kimika m’hija magħrufa li għaliha tenħtieġ it-trasformazzjoni metabolika għall-kimika biex taġixxi bħala fototossina in vivo jew in vitro. Għal- hekk, mhux mitqies la meħtieġ u lanqas xjentifikament ġustifikat għall-prova preżenti li ssir b’sistema meta- bolika ta’ attivazzjoni. 13/Vol. 25 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta’ l-Unjoni Ewropea 253 1. 7. 1. 5. K i m i k a t a l - p r o v a / p r e p a r a z z j o n i Kimiki tal-prova għandhom ikunu ppreparati friski minnufih qabel l-użu, sakemm id-data ta’ stabbiltà turi l-aċċettabbiltà tal-ħażna. Il-preparazzjoni taħt dawl aħmar jista’ jenħtieġ meta x’aktar tista’ tiġri malajr il-fotodegradazzjoni. Il-kimiki tal-prova għandhom jiddewbu f’soluzzjonijiet tal-melħ buffered, eż soluzzjoni bilanċjata Earl, (EBSS) jew phosphate buffered saline (PBS), li, biex ma jkunx hemm interferenza waqt l-irradjazzjoni, għandha tkun ħielsa minn komponenti tal-proteina u kuluri ta’ indikatur ph li jassorbu d-dawl. Kimiki tal-prova ta’ solubbiltà limitata fl-ilma għandhom jiddewbu f’solventi xierqa fil-konċentrazzjoni finali mixtieqa għal 100 darba u mbagħad dilwita 1:100 bis-soluzzjoni tal-melħ buffered. Jekk jintuża solvent għandu jkun preżenti f’volum kostanti ta’ 1 % (v/v) fil-kulturi kollha, jiġifieri fil-kontrolli negattivi kif ukoll fil-konċentrazzjonijiet kollha tal-kimika tal-prova. Id-dimethylsulphoxide (DMSO) u l-etanol (EtOH) huma s-solventi rakkomandati. Jistgħu jkunu xierqa sol- venti oħra ta’ tossiċità baxxa (eż acetone), imma għandhom ikunu valutati bir-reqqa għal proprjetajiet spe- ċifiċi, eż reazzjoni mal-kimika tal-prova, l-estinzjoni ta’ l-effett fototossiku, u l-proprjetajiet tal-qabda tar- radikali. Jistgħu jintużaw taħlit tal-vortex u/jew sonikazzjoni u/jew tisħin sa 37 °Ċ, jekk meħtieġ, biex tgħin is-solubilizzazzjoni. 1. 7. 1. 6. I r r a d j a z z j o n i / P r e p r a z z j o n i U V Sors tad-dawl: l-għażla ta’ sors tad-dawl xieraq u filtru xieraq huwa l-aktar fattur xieraq fil-prova ta’ tossi- ċità. Reġjuni UVA u visibbli huma solitament assoċjati mal-fotosensitizzazzjoni (7) (10), waqt li UVB hija ta’ anqas rilevanza u hija direttament ċitotossika ħafna, u żżid iċ-ċitotossiċità tagħha 1 000 darba minn 313 sa 280 nm (11). Il-kriterji għall-għazla ta’ sors ta’ dawl xieraq għandhom jinkludu l-ħtieġa essenzjali li s-sors tad-dawl jemetti wavelengths assorbiti mit-test kimiku u li d-doża tad-dawl (li tista’ tintlaħaq fi żmien raġo- nevoli) għandha tkun biżżejjed għal kxif ta’ fotosensibilizzanti magħrufa. Barra dan, il-wavelengths u d-dożi użati m’għandhomx ikunu ta’ ħsara żejda għas-sistema tal-prova, li tinkludi l-emissjoni ta’ sħana (reġjun infra aħmar). Is-simulazzjoni tad-dawl tax-xemx b’simulaturi solari hija kkunsidrata l-aħjar sors tad-dawl. Kemm Xenon arcs u (doped) mercury-metal halide huma użati fis-simulaturi solari. Ta’ l-aħħar għandhom il-vantaġġ li jemettu anqas sħana u li huma orħos, imma t-tqabbil tagħhom mad-dawl tax-xemx mhux perfett. Billi s-simulaturi kollha solari jemettu kwantitajiet sinifikanti ta’ UVB, għandhom ikunu ffiltrati kif xieraq biex itaffu il-wavelengths UVB ċitotossiċi ħafna. Għandu jintuża għall-prova ta’ fototossiċità in vitro 3T3 NRU spettru ta’ irradjazzjoni prattikament battal minn UVB (UVA:UVB ġsim ħ 1:20). Kien ippubblikat eżempju tat-tqassim ta’ l-irradjazzjoni spettrali tas- simulatur solari ffiltrat użat fl-istudju ta’ validazzjoni tal-prova tal-fototossiċità in vitro 3T3 NRU (3). Dożimetrija: l-intensità tad-dawl (l-irradjazzjoni) għandha tkun ivverifikata regolarment qabel kull prova ta’ fotossiċità, bl-użu ta’ meter broadband UV xieraq. Il-UV meter għandu jkun ikkalibrat mas-sors. Il-funzjonament tal-UV-meter għandu jkun ivverifikat, u għal dan l-iskop, huwa rakkomandat l-użu tat- tieni UV meter f’intervalli akbar, spettroradjometru għandu jintuża biex ikejjel l-irradjazzjoni spettrali tas-sors ta’ dawl filtrat u biex tkun ivverifikata l-kalibrazzjoni tal-broadband UV-meter, imma dawn l-istrumenti jeħtieġu l-intervent ta’ persuni speċjalizzati. l-istess tip u l-istess kalibratura. referenza ta’ Idealment, ta’ Doża ta’ 5 J/cm2(UVA) kienet stabbilita fl-istudju ta’ validazzjoni li mhux ċitotossika għaċ-ċelloli Balb/c 3T3 u biżżejjed qawwija biex teċita anki kimiċi fototossiċi dgħajfin. Biex jintlaħaq 5J/cm2 f’perjodu ta’ 50 min, l-irradjazzjoni għandha tkun aġġustata sa 1, 666 mW/cm2. Jekk jintużaw linja ta’ ċelloli jew sors ta’ dawl differenti, id-doża UVA jista’ jkollha bżonn ta’ adattament ħafif, bl-użu tal-kriterji li m’humiex ta’ ħsara għaċ-ċelloli u biżżejjed biex jikxfu fototossini standard. Iż-żmien ta’ l-espożizzjoni tad-dawl huwa kkalko- lat b’dan il-mod: 1. 7. 2. Kondizzjonijiet tal-prova Il-konċentrazzjoni massima ta’ kimika tal-prova m’għandhiex taqbeż 100μg/ml, billi l-kimiċi fototossiċi kienu rilevati f’konċentrazzjonijiet aktar baxxi, billi f’konċentrazzjonijiet ogħla tiżdied l-inċidenza ta’ pożit- tivi foloz (tbassir żejjed). Il-pH ta’ l-ogħla konċentrazzjoni tal-kimika tal-prova għandu jkun il-medda ph sodisfaċenti: 6,5 - 7,8). 254 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta’ l-Unjoni Ewropea 13/Vol. 25 Il-meded ta’ konċentrazzjonijiet ta’ kimika eżaminata fil-preżenza (+ UVA) u fin-nuqqas ta’ (- UVA) ta’ dawl għandhom ikunu stabbiliti b’mod adegwat f’esperimenti ta’ qabel magħmula apposta għalhekk. Il-medda u l-interċett ta’ serje ta’ konċentrazzjoni għandhom ikunu aġġustati b’tali mod li l-kurvi ta’ konċentrazzjoni- rispons huma mseddqa biżżejjed bid-data sperimentali. Jeħtieġ li jintużaw serje ta’ konċentrazzjoni ġeo- metrika (b’fattur kostanti ta’ dilwizzjoni). 1. 7. 3. Proċedura tal-prova (1) 1. 7. 3. 1. L - e w w e l ġ u r n a t a Ipprepara sospensjoni ta’ ċellola ta’ 1 × 1055 ċelloli/ml f’mezz ta’ kultura u u ferra’ 100 μl tal-mezz tal- kultura biss fil-bjar żgħar periferiċi ta’ pjanċa ta’ 96-well għall-mikrotitolazzjoni tal-kultura tat-tessut (= vojta). Fil-bjar żgħar li jifdal, ferra’ 100 μl ta’ sospensjoni ta’ ċellola ta’ 1 × 105 ċelloli/ml (= 1 × 104 ċelloli/bir). Għal kull kimika tal-prova, ipprepara żewġ pjanċi: waħda biex tistabbilixxi ċ-ċitotossiċità (-UVA), u l-oħra biex tkun stabbilita l-fototossiċità (+ UVA). Inkuba ċ-ċelloli għal 24 s (7,5 % CO2, 37 °Ċ) sakemm jiffurmaw monostrat semikonfluwenti. Dan il-perjodu ta’ inkubazzjoni jippermetti għall-irkupru taċ-ċelloli u l-aderenza, għat-tkabbir esponenzjali. 1. 7. 3. 2. I t - t i e n i j u m Wara l-inkubazzjoni, ferra’ l-mezz tal-kultura miċ-ċelloli u aħsel darbtejn 150 μl EBSS/PBS kull bir. Żid 100 μl ta’ EBSS/PBS li jkollhom konċentrazzjoni xierqa tal-kimika tal-prova jew solvent biss (kontroll negat- tiv). Applika 8 konċentrazzjonijiet differenti tal-kimika tal-prova. Inkuba ċ-ċelloli b’kimika tal-prova fid- dlam għal 60 minuta (7,5 % CO2, 37 °C). Biex issir il-parti (+ UVA) tal-prova, irradja ċ-ċelloli f’temperatura ambjentali ta’ 50 minuta permezz ta’ l-għatu tal-pjanċa 96-well b’1,7 mW/ċm2 UVA (= 5 J/ċm2). tħallix il-kondensazzjoni taħt l-għatu. Żomm platti dduplikati (-UVA) f’temperatura ta’ l-ambjent f’kaxxa mud- lama għal 50 minuta (= UVA ħin ta’ espożizzjoni). Ivventila b’fann biex ma’ Ferra’ s-soluzzjoni tal-prova u aħsel darbtejn b’150 μl EBSS/PBS. Ibdel EBSS/PBS b’mezz ta’ kultura u inkuba (7,5 % CO2, 37 °C) matul il-lejl (18-22 h). 1. 7. 3. 3. I t - t i e l e t ġ u r n a t a Valutazzjoni mikroskopika Eżamina ċ-ċelloli taħt mikroskopju bil-kuntrast tal-fażi. Irrekordja bidliet fil-morfoloġija taċ-ċelloli minħabba l-effetti ċitotossiċi tal-kimika tal-prova. Din il-verifika hija rakkomandata, biex teskludi l-iżbalji sperimentali, imma dawn ir-rekords m’humiex użati għall-valutazzjoni taċ-ċitotossiċità jew tal-fototossiċità. Prova ta’ l-assorbiment ta’ l-aħmar newtrali Aħsel iċ-ċelloli b’150 μl imsaħħan minn qabel EBSS/PBS. Neħħi s-soluzzjoni tal-ħasil bit-taptip ġentili. Żid 100 μl NR mezz u inkuba f’37 °Ċ, f’atmosfera umidifikata ta’ 7,5 % CO2, għal 3 h. Wara l-inkubazzjoni, ferra’ l-mezz NR, u aħsel iċ-ċelloli b’150 μl EBSS/PBS. Ferra’ u bblottja għal kollox EBSS/PBS. iċ-ċentrifugazzjoni bil-pjanċa bil-maqlub hija fakoltattiva. Żid eżattament 150 μl NR soluzzjoni ta’ estinzjoni (etanol/aċtu aċetiku ppreparati friski) Ċaqlaq malajr il-pjanċa tal-mikrotitolazzjoni għal 10 min, sakemm l-NR ikun estratt miċ-ċelloli u ffurmat soluzzjoni omoġenea. Kejjel id-densità ottika ta’ l-estratt NR f’540 nm f’spettrofotometru, bl-użu ta’ vojt bħala riferenza. Issejvja d-data f’format tal-fajl xieraq (eż. ASCII) għall-analiżi sussegwenti. 13/Vol. 25 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta’ l-Unjoni Ewropea 255 2. 2. 1. DATA Kwalità u kwantità ta’ data Id-data għandhom jippermettu analiżi sinifikattiva tal-konċentrazzjoni-rispons miksub fil-preżenza u fin- nuqqas ta’ l-UVA/vis irradjazzjoni. Jekk tinsab iċ-ċitotossiċità, kemm il-medda ta’ konċentrazzjoni u l-interċett ta’ konċentrazzjonijiet individwali għandhom ikunu ffissati b’mod biex tippermetti li tidħol kurva għad-data sperimentali. Minħabba l-fatt li kimika ta’ prova tista’ ma tkunx ċitotossika sal-limitu definit tal- konċentrazzjoni ta’ 100 μg/ml fl-esperiment fid-dlam (- UVA), imma tossika ħafna meta rradjata (+ UVA), il-meded tal-konċentrazzjoni li għandhom ikunu ppruvati fiż-żewġ partijiet ta’ l-esperiment jistgħu jkunu differenti b’ordni ta’ kobor biex iħarsu l-ħtieġa ta’ data ta’ kwalità adegwata. Jekk ma tinstab l-ebda citotossiċità fiż-żewġ partijiet ta’ l-esperiment (-UVA u + UVA), hija biżżejjed prova b’interċett kbir bejn id-dożi singoli sa l-ogħla konċentrazzjoni. M’hemm l-ebda ħtieġa għall-verifika ta’ riżultat ċar posittiv billi l-esperment ikun ripetut. Barra dan, riżul- tati ċari pożittivi m’għandhomx għalfejn ikunu vverifikati, sakemm il-kimika tal-prova kienet ippruvata f’konċentrazzjonijiet ogħlja biżżejjed. F’dawn il-każijiet, huwa biżżejjed esperiment wieħed ewlieni, appoġġ- jat minn esperiment preliminari tad-definizzjoni tal-medda. Provi li taw riżultati li bilkemm jintgħarfu wieħed minn ieħor qrib il-linja ta’ demarkazzjoni tal-mudell ta’ tbassir għandhom ikunu ripetuti għall-verifika. Jekk jitqies meħtieġ li l-provi għandhom ikunu mtennija, għalhekk il-varjazzjoni tal-kondizzjonijiet speri- mentali jistgħu jkunu importanti biex jintlaħaq riżultat ċar. Varjabbli fundamentali f’din il-prova hija l-preparazzjoni ta’ soluzzjonijiet tal-kimika tal-prova. Għalhekk, il-varjazzjoni ta’ dawn il-kondizzjonijiet (ko-solvent, triturazzjoni u sonikazzjoni) jistgħu jkunu l-aktar rilevanti ripetizzjoni tal-prova. Alternatti- vament, tista’ tkun ikkunsidrata l-varjazzjoni taż-żmien ta’ l-inkubazzjoni ta’ qabel l-irradjazzjoni. Jista’ jkun rilevanti żmien aqsar għall-kimiċi li m’humiex stabbli fl-ilma. 2. 2. Trattament tar-riżultati Meta possibbli, tkun iddeterminata l-konċentrazzjoni ta’ kimika tal-prova li tirrifletti 50 % inibizzjoni ta’ l-NRU (EC50) ċellulari. Dan jista’ jsir billi tkun applikata kull proċedura xierqa ta’ regressjoni mhux lineari (preferibbilment funzjoni Hill jew regressjoni loġistika) lid-data ta’ konċentrazzjoni-rispons, jew bl-użu ta’ proċeduri oħra xierqa. Qabel ma tintuża EC50 għall-kalkoli oħra, hemm bżonn li tkun ivverifikata b’mod xieraq il-kwalità ta’ l-addattament. Alternattivament, jistgħu jkunu użati metodi ta’ addattament għar- rappreżentazzjoni grafika biex ikun ikkalkolat EC50. F’dan il-każ, l-użu tal-karta tal-probabbiltà huwa rak- komandat (skala-x: log, skala-y: probit), billi f’ħafna każijiet il-funzjoni tar-rispons tal-konċentrazzjoni ssir kważi lineari wara din it-trasformazzjoni. 2. 3. Valutazzjoni tar-riżultati (mudelli ta’ tbassir) 2. 3. 1. Mudell ta’ tbassir verżjoni 1: Fattur ta’ irritazzjoni tad-dawl (PIF) Jekk kemm, fil-preżenza (+ UVA) u fin-nuqqas (-UV) tad-dawl, jinkisbu kurvi ta’ rispons ta’ konċentrazzjoni kompleti, fattur ta’ irritazzjoni tad-dawl (PIF) huwa ikkalkolat permezz tal-formula li ġejja: PIF<5, ma jbassar l-ebda potenzjal fototossiku, waqt li PIF>= 5 ibassar potenzjal fototossiku. Jekk kimika hija ċitotossika biss + UVA u mhix ċitotossika meta ppruvata –UVA, il-PIF ma jistax ikun ikkal- kolat, għalkemm dan huwa r-riżultat li jindika l-potenzjal fototossiku. F’dawn il-każijiet, ‘>PIF’ jista’ jkun ikkalkolat jekk il-prova ta’ ċitotossiċità titwettaq sa l-għola konċentrazzjoni (Cmax) u dan il-valur huwa użat għall-kalkolu tal- ‘>PIF’; Jekk ‘>PIF’ jista’ jinkiseb, mela kull valur >1 ibassar il-potenzjal fototossiku. Jekk kemm EC50 (- UV) u EC50 (+ UV) ma jistgħux ikunu kkalkolati minħabba l-fatt li kimika ma turix xi ċitotossiċità sa l-ogħla konċentrazzjoni, din ma tindika l-ebda potenzjal fototossiku. F’dawn il-każijiet, ‘PIF = *1’ formali huwa użat biex jikkaratterizza r-riżultat; 256 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta’ l-Unjoni Ewropea 13/Vol. 25 Jekk ‘>PIF = *1’ biss jista’ jinkiseb, dan ma jbassar l-ebda potenzjal fototossiku. Fil-każijiet (b) u (ċ), għandhom ikunu kkunsidrati bir-reqqa l-konċentrazzjonijiet miksuba fil-prova ta’ tos- siċità in vitro 3T3 NRU meta jkun qed jitbassar il-potenzjal fototossiku. 2. 3. 2. Mudell ta’ tbassir verżjoni 2: Effett medju tad-dawl MPE Alternattivament, verżjoni ġdida tal-mudell għat-tbassir tal-potenzjal fototossiku tista’ tkun applikat, li kien żviluppat bl-użu tad-data ta’ l-istudju tal-validazzjoni EU/COLIPA(15) u ppruvat taħt kondizzjonijiet fl-għama fi studju sussegwenti fuq il-fototossicità in vitro tas-sustanzi kimiki bil-filtru UV. Dan il-mudell jegħleb il-limitazzjoni tal-mudell PIF f’kazijiet fejn EC50 ma jistax jinkiseb. Il-mudell juża ‘l-effett medju tad- dawl’ (MPE), miżura li hija bbażata fuq paragun ta’ kurvi ta’ rispons ta’ konċentrazzjoni sħiħa. Għall- applikazzjoni tal-mudell MPE, ġie żviluppat software tal-kompjuter speċjali fl-Università ta’ Humboldt (Berlin), li jista’ jinkiseb b’xejn. 2. 4. Interpretazzjoni tar-riżultati Riżultat pożittiv fil-prova ta’ tossiċità in vitro 3T3 NRU (PIF > = 5 or MPE > = 0,1) jindika li s-sustanza tal- prova għandha potenzjal fototossiku. Jekk dan ir-riżultat jinkiseb f’konċentrazzjonijiet anqas minn 10 μg/ml, il-kimika tal-prova x’aktarx taġixxi bħala fototossina wkoll taħt kondizzjonijiet varji ta’ espożizzjoni in vitro. Jekk riżultat pożittiv jinkiseb biss fl-ogħla konċentrazzjoni tal-prova ta’ 100 μg/ml, konsiderazzjonijniet oħra jistgħu jkunu meħtieġa għall-valutazzjoni tal-perikolu jew potenza fototossika. Dawn jistgħu jinkludu data fuq il-penetrazzjoni, assorbiment u akkumulu possibbli tal-kimika fil-ġilda, jew l-ittestjar tal-kimika fi prova konfermatorja alternattiva, eż, l-użu ta’ mudell tal-bniedem in vitro. Riżultat negattiv mill-prova ta’ tossiċità in vitro 3T3 NRU (PIF<5 jew MPE <0,1) jindika li s-sustanza tal- prova ma kinitx fototossika għaċ-ċelloli mammiferi kkultivati taħt il-kondizzjonijiet użati. F’każijiet meta l-kimika tista’ tkun ippruvata sa l-ogħla konċentrazzjoni ta’ 100 μg/ml, riżultat negattiv jindika li l-kimika m’għandha l-ebda potenzjal fototossiku, u l-fototossiċità in vivo tista’ tkun ikkunsidrata remota. F’każijiet meta r-rispons identiku ta’ konċentrazzjoni u tossiċità (EC50 + UV and EC50- UV) nkiseb f’konċentrazzjonijiet aktar baxxi, l-interpretazzjoni tad-data tkun l-istess. Diversament, jekk ma tintwera l-ebda tossiċità (+ UV and - UV) u jekk is-solubbiltà fl-ilma tillimita l-konċentrazzjonijiet għal valuri ta’ inqas minn 100 μg/ml, allura l-kompatibbiltà tas-sustanza tal-prova fil-prova tista’ titpoġġa fid-dubbju u għandhom ikunu kkunsidrati provi konfermatorji (eż. l-użu ta’ mudell tal-ġilda in vitro, jew mudell tal- ġilda ex vivo jew prova in vivo). 3. RAPPURTAĠĠ Ir-rapport tal-prova Ir-rapport tal-prova għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja: Kimika tal-prova: — data ta’ identifikazzjoni u No SAK, jekk magħruf, — natura fiżika u purezza, — proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti għall-esekuzzjoni ta’ l-istudju, — stabbiltà u fotostabbiltà, jekk magħrufa. Solvent: — ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent, — solubbiltà tal-kimika tal-prova f’dan is-solvent, — perċentwal ta’ solvent preżenti fil-mezz tat-trattament (EBSS jew PBS). Ċelloli — tip u sors taċ-ċelloli, — nuqqas ta’ mikroplasma, — numru ta’ passaġġi taċ-ċellola, jekk magħrufa, — is-sensittività UVA taċ-ċelloli, determinata bit-tagħmir ta’ irradjazzjoni, użat fil-prova ta’ tossiċità in vitro 3T3 NRU. Kondizzjonijiet tal-prova (a) – inkubazzjoni qabel u wara t-trattament: — tip u kompożizzjoni tal-mezz tal-kultura, — kondizzjonijiet ta’ inkubazzjoni (konċentrazzjoni CO2, temperatura, umidità). — tul ta’ l-inkubazzjoni (qabel it-trattament, wara t-trattament). 13/Vol. 25 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta’ l-Unjoni Ewropea 257 Kondizzjonijiet tal-prova (b) – trattament bil-kimika: — kriterji għall-għażla tal-konċentrazzjonijiet tal-kimiċi tal-prova użati kemm fil-preżenza u fin-nuqqas ta’ l-irradjazzjoni UV/vis, — fil-każ ta’ solubbiltà limitata tal-kimika tal-prova u n-nuqqas ta’ ċitotossiċità, ir-raġunijiet għall-ogħla konċentrazzjoni ppruvata, — tip u kompożizzjoni tal-mezz tat-trattament (soluzzjoni tal-melħ buffered), — tul tat-trattament kimiku. Kondizzjonijet tal-prova (ċ) – irradjazzjoni: — raġuni għall-għażla tas-sors tad-dawl użat, — karatteristiċi ta’ irradjazzjoni spettrali tas-sors tad-dawl, — karatterisitiċi ta’ trasmissjoni/assorbiment tal-filtru(i) użat, — karatteristiċi tar-radjometru u dettalji fuq il-kalibrazzjoni tiegħu, — distanza tas-sors tad-dawl mis-sistema tal-prova, — Irradjazzjoni UVA f’din id-distanza, espressa f’mW/cm2, — tul ta’ l-espożizzjoni tad-dawl UV/vis, — doża UVA (irradjazzjoni - żmien), espressa f’J/cm2, — temperatura użata għall-kulturi taċ-ċelloli matul l-irradjazzjoni, u għall-kulturi ta’ ċelloli miżmuma flimkien fid-dlam. Kondizzjonijiet tal-prova (d) – prova NRU: — kompożizzjoni tal-mezz NRU, — tul ta’ l-inkubazzjoni NR, — kondizzjonijiet ta’ inkubazzjoni (konċentrazzjoni CO2, temperatura, umdità), — kondizzjonijiet ta’ l-estrazzjoni NR (estraent, tul), — wavelength użat għall-qari spettrofotometriku tad-densità ottika NR, — it-tieni wavelength (referenza), jekk użat, — kontenut tal-vojt spettrofotometriku, jekk użat. Riżultati: — vitalità taċ-ċelloli miksuba f’kull konċentrazzjoni tal-kimika tal-prova, imfissra f’perċentwal tal-medja tal-vitalità tal-kontrolli, — kurvi ta’ konċentrazzjoni-rispons, (konċentrazzjoni kimika tal-prova u vitalità relattiva taċ-ċellola), mik- subin f’esperimenti konkorrenti + UVA u –UVA, — analiżi tad-data tal-kurvi tal-konċentrazzjoni ta’ rispons: jekk possibbli, komputazzjoni/kalkolu ta’ EC50 (+ UVA) u EC50 (-UVA), — paragun taż-żewġ kurvi ta’ konċentrazzjoni respons, miksuba fil-preżenza u fin-nuqqas ta’ l-irradjazzjoni UVA/vis, jew bil-kalkolu tal-fattur ta’ fotoirritazzjoni (PIF), jew bil-kalkolu ta’ l-effett medju tad-dawl (MPE), — klassifikazzjoni tal-potenzjal fototossiku, — kriterji(u) ta’ l-aċċettazzjoni tal-prova – kontroll negattiv konkorrenti: — vitalità assoluta (densità ottika ta’ l-estratt NR) ta’ ċelloli irradjati u mhux irradjati, — data storika ta’ kontroll negattiv, devjazzjoni medja u standard. — kriterji (b) ta’ l-aċċettazzjoni tal-prova – kontroll pożittiv konkorrenti: — EC50 (+ UVA) u EC50 (- UVA) u PIF tal-kimika ta’ kontroll pożittiv, — data storika ta’ kimika ta’ kontroll pożittiv: EC50 (+ UVA) u EC50 (- UVA) u PIF, devjazzjoni medja u standard. Diskussjoni tar-riżultati. Konklużjonijiet. 258 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta’ l-Unjoni Ewropea 13/Vol. 25 4. RIFERENZI (1) Spielmann, H. , Balls, M. , Döring, B. , Holzhütter, H. G. , Kalweit, S. , Klecak, G. , L’Eplattenier, H. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Moldenhauer, F. , Moore, L. , Pape, W. , Pfannbecker, U. , Potthast, J. , De Silva, O. , Steiling, W. and Willshaw, A. (1994), EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay, Toxicology in Vitro 8, pp. 793-796. (2) Anon (1998), Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxicity), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA 26, pp. 7-8. (3) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. W. , Pechovitch, G. , De Silva, O. , Holzhütter, H. G. , Clothier, R. , Desolle, P. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Pfannenbecker, U. , Potthast, J. M. , Csato, M. , Sladowski, D. , Steiling, W. and Brantom, P. (1998), EU/COLIPA ‘In vitro phototoxicity’ validation study, results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test, Toxicology in Vitro 12, pp. 305-327. (4) OECD Test Guidelines Programme, ENV/MC/CHEM/TG(96)9: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria of Alternative Toxicological Test Methods, OECD Publications Office, Paris, 1996. (5) (6) (7) Lovell, W. W. (1993), A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential, Toxicology in Vitro 7, pp. 95-102. Santamaria, L. and Prino, G. (1972), List of the photodynamic substances, Research progress in organic, biological and medicinal chemistry Vol. 3 Part 1, North Holland Publishing Co, Amsterdam, pp. XI-XXXV. Spielmann, H. , Lovell, W. W. , Hölzle, E. , Johnson, B. E. , Maurer, T. , Miranda, M. A. , Pape, W. J. W. , Sapora, O. and Sladowski, D. (1994), In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM workshop 2, ATLA 22, pp. 314-348. (8) Spikes, J. D. (1989), Photosensitization, The science of photobiology, edited by KC Smith, Plenum Press, New York, 2nd edition, pp. 79-110. (9) Borenfreund, E. and Puerner, J. A. (1985), Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption, Toxicology Letters 24, pp. 119-124. (10) Lambert L. A, Warner W. G. and Kornhauser A. (1996), Animal models for phototoxicity testing, Dermatotoxicology, edited by FN Marzulli and HI Maibach, published by Taylor & Francis, Washington DC, 5th Edition, pp. 515-530. (11) Tyrrell R. M. and Pidoux M (1987), Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocytes, Cancer Research 47, pp. 1825-1829. (12) ZEBET/ECVAM/COLIPA, Standard Operating Procedure: Balb/c 3T3 NRU Phototoxicity Test, drafted 23 December 1997 by M. Liebsch and approved 6 March 1998 by the Management Team of the EU/COLIPA project ‘In Vitro Photoirritation’. (13) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. W. , De Silva, O. , Holzhütter, H. G. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. and Pfannenbecker (1998), A Study on the Phototoxic Potential of UV Filter Chemicals from Annex VII of the EU Directive 76/768/EEC in the 3T3 NRU In Vitro Phototoxicity Test, ATLA 26, pp. 679-708. (14) Holzhütter, H. G. and Quedenau, J. (1995), Mathematical modelling of cellular responses to external signals, Journal of Biological Systems 3, pp. 127-138. (15) Holzhütter, H. G. (1997), A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose- response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals, ATLA 25, pp. 445- 462. 13/Vol. 25 MT Il-Ġurnal Uffiċjali ta’ l-Unjoni Ewropea 259 Appendix (1) Dettalji oħra jistgħu jinstabu fir-riferenza 12. ”