title: Richtlinie 2000/33/EG der Kommission vom 25. April 2000 zur siebenundzwanzigsten Anpassung der Richtlinie 67/548/EWG des Rates zur Angleichung der Rechts- und Verwaltungsvorschriften der Mitgliedstaaten für die Einstufung, Verpackung und Kennzeichnung gefährlicher Stoffe an den technischen Fortschritt (Text von Bedeutung für den EWR.)

eurovoc_concepts:
analytical chemistry
approximation of laws
chemical product
cytology
toxicology

text: L 136/90 DE Amtsblatt der Europ(cid:228)ischen Gemeinschaften 8. 6. 2000 RICHTLINIE 2000/33/EG DER KOMMISSION vom 25. April 2000 zur siebenundzwanzigsten Anpassung der Richtlinie 67/548/EWG des Rates zur Angleichung der Rechts- und Verwaltungsvorschriften der Mitgliedstaaten f(cid:252)r die Einstufung, Verpackung und Kennzeichnung gef(cid:228)hrlicher Stoffe an den technischen Fortschritt (*) (Text von Bedeutung f(cid:252)r den EWR) DIE KOMMISSION DER EUROP˜ISCHEN GEMEINSCHAFTEN (cid:151) HAT FOLGENDE RICHTLINIE ERLASSEN: gest(cid:252)tzt auf den Vertrag zur Gr(cid:252)ndung der Europ(cid:228)ischen Gemeinschaft, Artikel 1 Der Wortlaut in Anhang I und II dieser Richtlinie wird dem Teil B von Anhang V der Richtlinie 67/548/EWG hinzugef(cid:252)gt. Artikel 2 (1) Die Mitgliedstaaten erlassen sp(cid:228)testens bis 1. Oktober 2001 die erforderlichen Rechts- und Verwaltungsvorschriften, um dieser Richtlinie nachzukommen. Sie setzen die Kommis- sion unverz(cid:252)glich davon in Kenntnis. Wenn die Mitgliedstaaten die Vorschriften nach Absatz 1 erlas- sen, nehmen sie in diesen Vorschriften selbst oder durch einen Hinweis bei der amtlichen Ver(cid:246)ffentlichung auf diese Richtlinie Bezug. Die Mitgliedstaaten regeln die Einzelheiten dieser Bezugnahme. Die Mitgliedstaaten teilen der Kommission ihre Rechts- (2) und Verwaltungsvorschriften zur Anwendung dieser Richtlinie mit und (cid:252)bermitteln ihr eine Tabelle, aus der die (cid:220)bereinstim- mung zwischen den Anforderungen dieser Richtlinie und den erlassenen einzelstaatlichen Bestimmungen hervorgeht. Artikel 3 Diese Richtlinie tritt am dritten Tag nach ihrer Ver(cid:246)ffent- lichung im Amtsblatt der Europ(cid:228)ischen Gemeinschaften in Kraft. Artikel 4 Diese Richtlinie ist an alle Mitgliedstaaten gerichtet. Br(cid:252)ssel, den 25. April 2000 F(cid:252)r die Kommission Margot WALLSTR(cid:214)M Mitglied der Kommission gest(cid:252)tzt auf die Richtlinie 67/548/EWG des Rates vom 27. Juni 1967 zur Angleichung der Rechts- und Verwaltungsvorschrif- ten f(cid:252)r die Einstufung, Verpackung und Kennzeichnung gef(cid:228)hr- die Richtlinie licher 1999/33/EG des Europ(cid:228)ischen Parlaments und des Rates (2), insbesondere auf Artikel 28, Stoffe (1), ge(cid:228)ndert zuletzt durch in Erw(cid:228)gung nachstehender Gr(cid:252)nde: (1) In Anhang V der Richtlinie 67/548/EWG sind die Metho- den zur Bestimmung der physikalisch-chemischen Eigen- schaften, Toxizit(cid:228)t und (cid:214)kotoxizit(cid:228)t von Stoffen und Zubereitungen festgelegt. Dieser Anhang bedarf einer Anpassung an den technischen Fortschritt. (2) Gem(cid:228)(cid:223) Artikel 7 Absatz 2 der Richtlinie 86/609/EWG des Rates (3) zur Angleichung der Rechts- und Verwal- tungsvorschriften der Mitgliedstaaten zum Schutz der f(cid:252)r Versuche und andere wissenschaftliche Zwecke verwende- ten Tiere (cid:132)darf ein Versuch nicht unternommen werden, wenn zur Erreichung des angestrebten Ergebnisses eine wissenschaftlich zufriedenstellende, vertretbare und prakti- kable Alternative zur Verf(cid:252)gung steht, bei der kein Tier verwendet werden mu(cid:223)(cid:147). (3) Die Kommission beabsichtigt, Alternativ-Pr(cid:252)fmethoden in Anhang V der Richtlinie 67/548/EWG einzuf(cid:252)hren, die keine Verwendung von Tieren erfordern; damit werden diese Methoden f(cid:252)r die Pr(cid:252)fung chemischer Stoffe gem(cid:228)(cid:223) Artikel 3 Absatz 1 der Richtlinie 67/548/EWG verf(cid:252)gbar gemacht. (4) Die in dieser Richtlinie vorgesehenen Ma(cid:223)nahmen ent- sprechen der Stellungnahme des Ausschusses zur Anpas- sung der Richtlinien zur Beseitigung der technischen Han- delshemmnisse f(cid:252)r gef(cid:228)hrliche Stoffe und Zubereitungen an den technischen Fortschritt (cid:151) (*) Angenommen vor der 26. Anpassung. (1) ABl. 196 vom 16. 8. 1967, S. 1. (2) ABl. L 199 vom 30. 7. 1999, S. 57. (3) ABl. L 358 vom 18. 12. 1986, S. 1. 8. 6. 2000 DE Amtsblatt der Europ(cid:228)ischen Gemeinschaften L 136/91 ANHANG I (cid:132)B. 40. PR(cid:220)FUNG AUF HAUT˜TZENDE WIRKUNGEN 1 1. 1 METHODE Einleitung Zwei In-vitro-Tests zur Pr(cid:252)fung auf haut(cid:228)tzende Wirkung (cid:151) der TER-Test (TER = transcutaneous electrical resistance) an Rattenhaut und ein Test mit einem menschlichen Hautmodell (cid:151) wurden vom Europ(cid:228)ischen Zentrum zur Validierung von Alternativmethoden (ECVAM, Gemeinsame Forschungsstelle der Europ(cid:228)ischen Kommission) (1) (2) (3) als wissenschaftlich validierte Tests anerkannt. Die Validierungsstudie des ECVAM hat gezeigt, da(cid:223) beide Tests in der Lage sind, zuverl(cid:228)ssig zwischen haut(cid:228)tzenden Stoffen und solchen, die diese Eigenschaften nicht aufweisen, zu unterscheiden. Dar(cid:252)ber hinaus erm(cid:246)glichte der Test auf der Grundlage eines Modells der menschlichen Haut eine korrekte Klassifizierung unterschiedlicher (cid:228)tzender Wirkungsst(cid:228)rken (be- kannte Stoffe, die zu schweren Ver(cid:228)tzungen f(cid:252)hren, R35, und sonstige haut(cid:228)tzende Stoffe, R34) (2). Beide Testmethoden werden beschrieben; die Wahl des geeigneten Test h(cid:228)ngt von den spezifischen Anforderungen und Pr(cid:228)ferenzen der Anwender ab. Siehe auch (cid:130)Allgemeine Einleitung(cid:145) Teil B. 1. 2 Begriffsbestimmung Haut(cid:228)tzende Wirkung: irreversible Sch(cid:228)digung des Hautgewebes nach Anwendung eines Testmaterials. 1. 3 Referenzstoffe Nicht spezifiziert, siehe jedoch Ziffern 1. 5. 3. 4 und 1. 7. 2. 3. 1. 4 Prinzip der Testmethode (cid:151) TER-Test an Rattenhaut Die Testsubstanz wird bis zu 24 Stunden topisch auf die Epidermis von Hautst(cid:252)cken aus dem Fell von Jung- ratten appliziert, die vorher tierschutzgerecht get(cid:246)tet wurden. Haut(cid:228)tzende Stoffe werden dabei durch ihre F(cid:228)higkeit, die Unversehrtheit der Hornhaut und ihrer Schutzfunktion zu zerst(cid:246)ren, identifiziert, und zwar, indem die Verringerung des inh(cid:228)renten transkutanen Hautwiderstands (TER) unter einen Schwellenwert (5 kh) gemessen wird (4) (5). Reizende und nicht-reizende Stoffe bewirken keinen R(cid:252)ckgang des TER unter den Schwellenwert. Bei Testung von oberfl(cid:228)chenaktiven Stoffen und neutralen organischen Stoffen (Begriffsbestim- mung s. (6)) kann das Testverfahren durch einen Farbbindungsschritt erg(cid:228)nzt werden, um die Anzahl der spe- ziell mit diesen Chemikalientypen erzielten falsch positiven Ergebnisse zu reduzieren (2) (7). 1. 5 Beschreibung der Testmethode (cid:151) TER-Test an Rattenhaut 1. 5. 1 Versuchstiere F(cid:252)r die Herstellung der Hautst(cid:252)cke sind Jungratten im Alter von 20-23 Tagen (Wistar oder vergleichbarer Stamm) erforderlich. Das Fell am R(cid:252)cken und an den Flanken wird mit einem f(cid:252)r Kleintiere geeigneten Instru- ment sorgf(cid:228)ltig geschoren. Die Tiere werden dann mit vorsichtigen Wischbewegungen gewaschen, wobei diese Fl(cid:228)che in eine Antibiotikal(cid:246)sung getaucht werden (die L(cid:246)sung enth(cid:228)lt z. B. Streptomycin, Penicillin, Chlor- amphenicol und Amphotericin in Konzentrationen, die ein bakterielles Wachstum verhindern). Die Tiere werden dann am dritten oder vierten Tag nach dem ersten Waschvorgang erneut mit der Antibiotikal(cid:246)sung gewaschen und innerhalb von drei Tagen verwendet (die Tiere d(cid:252)rfen f(cid:252)r die Hauptpr(cid:228)parationen nicht (cid:228)lter als 31 Tage sein). 1. 5. 2 Herstellung der Hautst(cid:252)cke Die Versuchstiere werden tierschutzgerecht get(cid:246)tet. Sodann wird die R(cid:252)ckenhaut jedes Tieres entfernt, und von (cid:252)berm(cid:228)(cid:223)igem Fett befreit, das von der Haut sorgf(cid:228)ltig abgesch(cid:228)lt wird. Die Haut wird so (cid:252)ber das Ende eines PTFE (Polytetrafluorethylen)-Rohres gelegt, da(cid:223) die Epidermisoberfl(cid:228)che auf dem Ende des Rohres auf- liegt. Zur Fixierung des Hautst(cid:252)cks wird ein (cid:130)O(cid:145)-Ring aus Gummi straff (cid:252)ber das Rohrende gezogen, und (cid:252)ber- fl(cid:252)ssiges Hautgewebe wird abgeschnitten. Die Abmessungen des Rohrs und des (cid:130)O(cid:145)-Rings sind in Abbildung 1 angegeben. Der (cid:130)O(cid:145)-Ring wird sodann mit gereinigter Naturvaseline zum Ende des PTFE-Rohrs hin gr(cid:252)ndlich abgedichtet. Das Rohr wird durch eine Federklemme in einer Rezeptorkammer gehalten, die Magnesiumsulfat- l(cid:246)sung (154 mM) enth(cid:228)lt (Abbildung 2). 1. 5. 3 Testverfahren 1. 5. 3. 1 A u f b r i n g u n g d e r T e s t s u b s t a n z e n Fl(cid:252)ssige Testsubstanzen (150 (cid:181)l) werden auf die Epidermisoberfl(cid:228)che innerhalb des Rohrs gebracht (Abbildung 2). Zur Testung von Feststoffen wird eine ausreichende Menge auf das Hautst(cid:252)ck aufgebracht, wobei darauf zu achten ist, da(cid:223) die gesamte Oberfl(cid:228)che der Epidermis bedeckt ist. Sodann wird entionisiertes Wasser (150 (cid:181)l) auf den Feststoff gebracht und das Rohr zur Verteilung des Feststoffes leicht bewegt. Die Testsubstan- zen sollten mit der Haut optimal in Kontakt kommen. Bei einigen Feststoffen kann dies durch Erw(cid:228)rmung bis zu 30 (cid:176)C zwecks Schmelzen oder durch Zermahlen zu einem Granulat oder Pulver erreicht werden. L 136/92 DE Amtsblatt der Europ(cid:228)ischen Gemeinschaften 8. 6. 2000 F(cid:252)r jede Testsubstanz werden drei Hautst(cid:252)cke verwendet. Die Testsubstanz wird 24 Stunden lang aufgebracht (siehe auch 1. 5. 3. 4), sodann durch Waschen unter flie(cid:223)endem Wasser bei maximal 30 (cid:176)C abgewaschen und vollst(cid:228)ndig entfernt. Zur leichteren Entfernung von evt. im Rohr fest gewordenen Testsubstanzen kann ein Wasserstrahl von ca. 30 (cid:176)C eingesetzt werden. 1. 5. 3. 2 T E R - M e s s u n g e n Der TER wird mit einer Wheastonschen-Wechselstrom-Me(cid:223)br(cid:252)cke mit niedriger Spannung gemessen (z. B. AIM 401 oder 6401 oder gleichwertige Me(cid:223)br(cid:252)cke). Vor der Messung des elektrischen Widerstands wird die Oberfl(cid:228)chenspannung der Haut durch Auftrag von 70%igem ˜thanol verringert, wobei die Menge ausreichen soll, um die gesamte Epidermis zu bedecken. Nach einigen Sekunden wird das ˜thanol durch Kippen des Rohrs entfernt, und das Gewebe wird durch Hinzuf(cid:252)gen von 3 ml Magnesiumsulfatl(cid:246)sung (154 mM) befeuch- tet. Zur Messung des Widerstands in Kh/Hautst(cid:252)ck werden die Elektroden der Me(cid:223)br(cid:252)cke beidseitig des Haut- st(cid:252)cks plaziert (Abbildung 2). Die Gesamtabmessungen der Elektroden und die L(cid:228)nge der Elektroden unterhalb der Abgreifklemmen sind in Abbildung 1 angegeben. Die Abgreifklemme der inneren (dicken) Elektrode liegt w(cid:228)hrend der Widerstandsmessung oben auf dem PTFE-Rohr auf, um sicherzustellen, da(cid:223) stets eine gleichblei- bende Elektrodenl(cid:228)nge in die Magnesiumsulfatl(cid:246)sung getaucht bleibt. Die (cid:228)u(cid:223)ere (d(cid:252)nne) Elektrode befindet sich innerhalb der Rezeptorkammer an deren Boden. Der Abstand zwischen dem unteren Ende der Feder- klemme und dem unteren Ende des PTFE-Rohrs konstant (Abbildung 1), da dieser Abstand den erzielten Widerstandswert beeinflu(cid:223)t. Anmerkung: Wenn der gemessene Widerstandswert (cid:252)ber 20 kh liegt, so kann dies an einem Rest der Testsub- stanz liegen, der die Epidermisoberfl(cid:228)che des Hautst(cid:252)cks bedeckt. Zur Entfernung dieser Schicht kann ver- sucht werden, das mit einem durch Gummihandschuh gesch(cid:252)tzten Daumen verschlossene PTFE-Rohr ca. 10 Sekunden zu sch(cid:252)tteln. Die Magnesiumsulfatl(cid:246)sung wird dann verworfen, und die Widerstandsmessung wird mit frischem Magesiumsulfat wiederholt. Die TER-Ergebnisse (Mittelwerte) einer Testsubstanz werden nur angenommen, sofern die Ergebnisse der gleichzeitig getesteten Positivkontrollen und Negativkontrollen innerhalb definierter Akzeptanzgrenzen liegen. F(cid:252)r die beschriebene Methodik und Versuchsanordnung werden folgende Kontrollsubstanzen und dazuge- h(cid:246)rige TER-Akzeptanzbereiche vorgeschlagen: Kontrolle Substanz Positiv Negativ 10 M Salzs(cid:228)ure (36 %) Destilliertes Wasser Widerstandsbereich (kh) 0,5-1,0 10-25 1. 5. 3. 3 T e s t v a r i a n t e f (cid:252) r o b e r f l (cid:228) c h e n a k t i v e S t o f f e u n d n e u t r a l e o r g a n i s c h e S t o f f e Wenn die TER-Werte bei oberfl(cid:228)chenaktiven oder neutralen organischen Testsubstanzen 5 kh oder weniger betragen, kann eine Beurteilung der Penetration eines Farbstoffes an den Geweben durchgef(cid:252)hrt werden. Die- ses Verfahren zeigt an, ob die Ergebnisse falsch positiv sind (2). 1. 5. 3. 3. 1 Anwendung und Entfernung von Sulforhodamine B-Farbstoff Nach der Applikation der Testsubstanz zur Bestimmung des TER werden 150 (cid:181)l Sulforhodamin B-Farbstoff in 10%iger (w/v) Verd(cid:252)nnung in destilliertem Wasser f(cid:252)r zwei Stunden topisch auf jedes Hautst(cid:252)ck auf- gebracht. Die Hautst(cid:252)cke werden sodann unter flie(cid:223)endem Wasser von h(cid:246)chstens Raumtemperatur etwa 10 Sekunden lang mit einem Wasserstrahl gewaschen, um (cid:252)bersch(cid:252)ssige/ungebundene Farbe zu entfernen. Jedes Hautst(cid:252)ck wird sorgf(cid:228)ltig vom PTFE-Rohr entfernt und in ein geeignetes verschlie(cid:223)bares Gef(cid:228)(cid:223) (z. B. ein 20-ml-Scintillationsfl(cid:228)schchen) mit entionisiertem Wasser (8 ml) gebracht. Die Fl(cid:228)schchen werden 5 Minuten lang vorsichtig gesch(cid:252)ttelt, um (cid:252)bersch(cid:252)ssige/ungebundene Farbe zu entfernen. Nach Wiederholung des Sp(cid:252)l- vorgangs werden die Hautst(cid:252)cke in Fl(cid:228)schchen mit 5 ml 30%igem (w/v) Natriumdiodecylsufat (SDS) in destil- liertem Wasser (cid:252)berf(cid:252)hrt und (cid:252)ber Nacht bei 60 (cid:176)C im Brutschrank aufbewahrt. Nach der Inkubation wird jedes Hautst(cid:252)ck entfernt und verworfen, und die verbleibende L(cid:246)sung wird 8 Minuten lang bei 21 (cid:176)C zentrifu- giert (relative Zentrifugalkraft p 175). Eine 1-ml-Probe des oberfl(cid:228)chenaktiven Stoffs wird sodann 1:5 (v/v) [d. h. 1 ml + 4 ml] mit 30%iger (w/v) SDS-L(cid:246)sung in destilliertem Waser verd(cid:252)nnt. Die optische Dichte (OD) der L(cid:246)sung wird bei ca. 565 nm gemessen. 1. 5. 3. 3. 2 Berechnung des Farbgehalts Der Gehalt an Sulforhodamin B-Farbstoff je Hautst(cid:252)ck wird mittels der OD-Werte berechnet (molarer Extinti- onskoeffizient von Sulforhodamin B bei 565 nm = 8,7 (cid:215) 104, Molekulargewicht = 580). Der Gehalt an Sulfor- hodamin B wird f(cid:252)r jedes der drei Hautst(cid:252)cke bestimmt und dann der Mittelwert berechnet. Die erhaltenen Mittelwerte der Farbbindung einer Testsubstanz werden nur angenommen, sofern die Ergebnisse der gleichzei- tig getesteten Kontrollen innerhalb definierter Akzeptanzgrenzen liegen. F(cid:252)r die beschriebene Methodik und Versuchsanordnung werden folgende Akzeptanzbereiche vorgeschlagen: 8. 6. 2000 DE Amtsblatt der Europ(cid:228)ischen Gemeinschaften L 136/93 Kontrolle Substanz Positiv Negativ 10 M Salzs(cid:228)ure (36 %) Destilliertes Wasser Farbgehaltsbereich ((cid:181)g/Hautst(cid:252)ck) 40-100 15-35 1. 5. 3. 4 Z u s a t z i n f o r m a t i o n Testsubstanzen k(cid:246)nnen auf die Hautst(cid:252)cke auch f(cid:252)r k(cid:252)rzere Zeitr(cid:228)ume (z. B. 2 Stunden) aufgebracht werden, um Materialien zu identifizieren, die hochgradig (cid:228)tzend sind. In der Validierungsstudie zeigte sich jedoch, da(cid:223) der TER-Test das (cid:228)tzende Potential mehrerer Testchemikalien nach zweist(cid:252)ndiger Einwirkung auf die Haut- st(cid:252)cke (2) (cid:252)berbewertet, wenngleich er eine korrekte Identifizierung (cid:228)tzender und nicht (cid:228)tzender Stoffe nach 24st(cid:252)ndiger Einwirkung gestattet. Die Eigenschaften und Abmessungen der Versuchsanlage und die angewandte Testmethode k(cid:246)nnen die TER- Werte beeinflussen. Der Schwellenwert von 5 kh zur Vorhersage haut(cid:228)tzender Eigenschaften eines Stoffes wurde aufgrund von Daten ermittelt, die mit den hier beschriebenen spezifischen Ger(cid:228)ten und Verfahren erzielt wurden. Im Falle einer signifikanten ˜nderung der Testbedingungen k(cid:246)nnen andere Schwellen- und Kontrollwerte gelten. In diesem Fall empfiehlt es sich, die Methodik und die Widerstandsschwellenwerte durch Austestung einer Reihe von Referenzstandards zu kalibrieren, die aus den in der Validierungsstudie (3) ver- wendeten Chemikalien auszuw(cid:228)hlen sind. 1. 6 Prinzip der Testmethode (cid:151) Test mit menschlichem Hautmodell Die Testsubstanz wird bis zu 4 Stunden topisch auf ein dreidimensionales Modell menschlicher Haut auf- gebracht, das eine rekonstruierte Epidermis mit funktionaler Hornhaut besitzt. ˜tzende Materialien werden aufgrund ihrer F(cid:228)higkeit identifiziert, eine Abnahme der Viabilit(cid:228)t (Lebensf(cid:228)higkeit) der Zellen (dies kann bei- spielsweise durch Anwendung des MTT-Reduktionstests festgestellt werden) unter festgelegte Schwellenwerte bei einer spezifischen Expositionsdauer zu bewirken. Dieses Testprinzip basiert auf der Hypothese, da(cid:223) (cid:228)tzende Chemikalien in der Lage sind, (durch Diffusion oder Erosion) die Hornhaut zu durchdringen und dar- (cid:252)ber hinaus ausreichend zytotoxisch sind, um in den darunterliegenden Zellschichten das Absterben von Zel- len zu bewirken. 1. 7 Beschreibung der Testmethode (cid:151) Test mit menschlichem Hautmodell 1. 7. 1 Modelle menschlicher Haut Modelle rekonstruierter menschlicher Haut k(cid:246)nnen aus unterschiedlichen Quellen stammen, m(cid:252)ssen jedoch bestimmten Kriterien gen(cid:252)gen. Das Modell mu(cid:223) eine funktionale Hornhaut mit einer darunter liegenden Schicht lebender Zellen aufweisen. Die Barrierefunktion der Hornhaut mu(cid:223) angemessen sein. Dies kann durch Nachweis der Widerstandsf(cid:228)higkeit des Modells gegen(cid:252)ber Substanzen aufgezeigt werden, von denen bekannt ist, da(cid:223) sie Zellen gegen(cid:252)ber toxisch sind, jedoch normalerweise die Hornhaut nicht durchdringen. Bei Einhal- tung definierter Versuchsbedingungen mu(cid:223) das Modell nachweislich reproduzierbare Ergebnisse erbringen. Die Viabilit(cid:228)t der vitalen Zellen des Hautmodells mu(cid:223) hinreichend gro(cid:223) sein, um gut zwischen Positivkontrol- len und Negativkontrollen unterscheiden zu k(cid:246)nnen. Die Viabilit(cid:228)t der Zellen (z. B. bestimmt durch MTT-Re- duktion und gemessen als OD-Wert) nach Exposition mit der Negativkontrolle mu(cid:223) innerhalb der f(cid:252)r das jeweilige Modell definierten Akzeptanzgrenzen liegen. Ebenso m(cid:252)ssen die Viabilit(cid:228)tswerte nach Exposition mit der Positivkontrolle (ausgedr(cid:252)ckt in % der Viabilit(cid:228)t der Negativkontrolle) innerhalb der definierten Akzep- tanzgrenzen liegen. Es ist unbedingt erforderlich, da(cid:223) das eingesetzte Modell zur Vorhersage haut(cid:228)tzender Eigenschaften (Pr(cid:228)diktionsmodell) internationalen Validierungsstandards entspricht (2). 1. 7. 2 Testverfahren 1. 7. 2. 1 A n w e n d u n g d e r T e s t s u b s t a n z e n Bei fl(cid:252)ssigen Materialien mu(cid:223) gen(cid:252)gend Testsubstanz appliziert werden, damit die Hautoberfl(cid:228)che ganz bedeckt ist (mindestes 25 (cid:181)l/cm2). Bei der Pr(cid:252)fung von Feststoffen mu(cid:223) soviel Testsubstanz aufgebracht wer- den, da(cid:223) die Haut ganz bedeckt ist. Diese sind dann anzufeuchten, damit ein guter Kontakt mit der Haut gew(cid:228)hrleistet ist. Falls erforderlich sollten Feststoffe vor der Anwendung zu Pulver zermahlen werden. Die Methodik der Applikation mu(cid:223) nachweislich auf ein breites Spektrum unterschiedlicher Chemikalientypen (2) anwendbar sein. Zum Ende der Expositionszeit mu(cid:223) das Testmaterial sorgf(cid:228)ltig mit einer gepufferten isoto- nischen Salzl(cid:246)sung von der Hautoberfl(cid:228)che abgewaschen werden. 1. 7. 2. 2 M e s s u n g d e r Z e l l v i a b i l i t (cid:228) t Jede validierte quantitative Methode kann zur Messung der Zellviabilit(cid:228)t angewendet werden. Die am h(cid:228)ufig- sten angewandte Methode ist die MTT-Reduktion, die nachweislich in verschiedenen Laboratorien genaue und reproduzierbare Ergebnisse erbracht hat (2). Das Hautst(cid:252)ck wird 3 Stunden lang in eine MTT-L(cid:246)sung von 0,3 mg/ml bei 20-28 (cid:176)C gelegt. Der blaue Formazan-Niederschlag wird sodann extrahiert (L(cid:246)semittelextrak- tion), und die Formazankonzentration wird durch Bestimmung des OD-Werts bei einer Wellenl(cid:228)nge zwischen 545 und 595 nm gemessen. L 136/94 DE Amtsblatt der Europ(cid:228)ischen Gemeinschaften 8. 6. 2000 1. 7. 2. 3 Z u s a t z i n f o r m a t i o n Das verwendete Hautmodell und das genaue Protokoll der Expositionszeit, der Waschverfahren usw. haben einen gro(cid:223)en Einflu(cid:223) auf die erzielten Ergebnisse der Zellviabilit(cid:228)t. Es wird daher empfohlen, Methodik und Modell zur Vorhersage haut(cid:228)tzender Eigenschaften durch Austestung einer Reihe von Referenzstandards zu kalibrieren, die aus den in der ECVAM-Validierungsstudie (3) verwendeten Chemikalien auszuw(cid:228)hlen sind. Es ist von entscheidender Bedeutung, da(cid:223) sich die angewandte Methodik nachweislich reproduzierbar zeigt, d. h. f(cid:252)r ein breites Spektrum von Chemikalien sowohl innerhalb eines Laboratoriums, als auch zwischen verschie- denen Laboratorien im Einklang mit internationalen Standards vergleichbare Ergebnisse liefert. Die Methode sollte mindestens den bereits publizierten Kriterien f(cid:252)r die wissenschaftliche Validit(cid:228)t (2) entsprechen, und die Ergebnisse einer solchen Validierungsstudie m(cid:252)ssen in einer unabh(cid:228)ngig referierten wissenschaftlichen Zeit- schrift ver(cid:246)ffentlicht werden. 2 DATEN 2. 1 Darlegung der Ergebnisse 2. 1. 1 TER-Test an Rattenhaut Die Widerstandswerte (kh) f(cid:252)r die Testsubstanz, Positivkontrolle, Negativkontrolle sowie alle Standard-Refe- renzchemikalien, einschlie(cid:223)lich der Einzeldaten von Mehrfachbestimmungen und Wiederholungstests, der Mit- telwerte und der davon abgeleiteten Klassifizierung, sollten in Tabellenform aufgef(cid:252)hrt werden. 2. 1. 2 Test mit menschlichem Hautmodell Die OD-Werte und die relativen Werte der Zellviabilit(cid:228)t f(cid:252)r die Testsubstanz, die Positivkontrolle und die Negativkontrolle sowie f(cid:252)r alle Standard-Referenzchemikalien, einschlie(cid:223)lich der Einzeldaten von Mehrfach- bestimmungen und Wiederholungstests, der Mittelwerte und der davon abgeleiteten Klassifizierung, sollten in Tabellenform aufgef(cid:252)hrt werden. 2. 2 Bewertung und Interpretation der Ergebnisse 2. 2. 1 TER-Test an Rattenhaut Wenn der f(cid:252)r die Testsubstanz erzielte mittlere TER-Wert (cid:252)ber 5 kh liegt, ist die Substanz nicht (cid:228)tzend. Betr(cid:228)gt der TER-Wert jedoch 5 kh oder weniger, und handelt es sich bei der Testsubstanz nicht um einen oberfl(cid:228)chenaktiven oder einen neutralen organischen Stoff, so ist die Testsubstanz (cid:228)tzend. Bei oberfl(cid:228)chenaktiven oder neutralen organischen Stoffen, die TER-Werte von (cid:252)ber 5 kh oder weniger erge- ben, kann ein Test auf Farbstoffpenetration durchgef(cid:252)hrt werden. Ist der mittlere Farbgehalt des Hautst(cid:252)cks gleich gro(cid:223) oder gr(cid:246)(cid:223)er als der gleichzeitig bestimmte mittlere Farbgehalt des Hautst(cid:252)cks der 36%igen HCl- Positiv-Kontrolle, so ist die Testsubstanz falsch positiv und daher nicht (cid:228)tzend. 2. 2. 2 Test mit menschlichem Hautmodell Der gemessene OD-Wert der Negativkontrolle wird mit einer 100%igen Zellviabilit(cid:228)t gleichgesetzt. Folglich k(cid:246)nnen die f(cid:252)r jede Testprobe erzielten OD-Werte zur Berechnung einer prozentualen Zellviabilit(cid:228)t im Ver- gleich zur Negativkontrolle herangezogen werden. Der Schwellenwert der prozentualen Zellviabilit(cid:228)t, der zur Unterscheidung zwischen (cid:228)tzenden und nicht (cid:228)tzenden Testsubstanzen verwendet wird (oder die Schwellen- werte zur Differenzierung des (cid:228)tzenden Potentials in weitere Unterklassen), m(cid:252)ssen in einem Pr(cid:228)diktions- modell vor der Validierung der Methode klar definiert sein, und die anschlie(cid:223)ende Validierungsstudie mu(cid:223) die Richtigkeit dieser Werte best(cid:228)tigen (2). 3 BERICHTERSTATTUNG Test-Bericht Der Pr(cid:252)fbericht mu(cid:223) mindestens folgende Informationen enthalten: Testsubstanz: (cid:151) Kenndaten, physikalische Eigenschaften und gegebenenfalls physikalisch-chemische Eigenschaften. ˜hnli- che Informationen sollten f(cid:252)r Referenzsubstanzen vorgelegt werden, sofern sie verwendet werden. Testbedingungen: (cid:151) Einzelheiten der angewandten Testmethode; (cid:151) Beschreibung und Begr(cid:252)ndung jeglicher ˜nderungen. 8. 6. 2000 DE Amtsblatt der Europ(cid:228)ischen Gemeinschaften L 136/95 Ergebnisse: (cid:151) Tabellarische Anordnung der Widerstandswerte (TER-Test) oder der prozentualen Zellviabilit(cid:228)t (Test mit menschlichem Hautmodell) f(cid:252)r die Testsubstanz, die Positivkontrollen und Negativkontrollen sowie f(cid:252)r alle Standard-Referenzchemikalien, einschlie(cid:223)lich der Einzeldaten von Mehrfachbestimmungen und Wie- derholungsversuchen sowie deren Mittelwerte; (cid:151) Beschreibung aller sonstigen beobachteten Wirkungen. Diskussion der Ergebnisse. Schlu(cid:223)folgerungen. 4 LITERATUR (1) ECVAM (1998), ECVAM News & Views, ATLA 26, S. 275-280. (2) Fentem, J. H. , Archer, G. E. B. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. , Holzhutter, H-G. & Liebsch, M. 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J. & Liebsch, M. (1998), An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion, ATLA 26, S. 709-720. (7) Botham, P. A. , Chamberlain, M. , Barratt, M. D. , Curren, R. D. , Esdaile, D. J. , Gardner, J. R. , Gordon, V. C. , Hil- debrand, B. , Lewis, R. W. , Liebsch, M. , Logemann, P. , Osborne, R. , Ponec, M. , Regnier, J. F. , Steiling, W. , Walker, A. P. & Balls, M. (1995), A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM workshop 6, ATLA 23, S. 219-255. L 136/96 DE Amtsblatt der Europ(cid:228)ischen Gemeinschaften 8. 6. 2000 Abbildung 1 8. 6. 2000 DE Amtsblatt der Europ(cid:228)ischen Gemeinschaften L 136/97 Abbildung 2 L 136/98 DE Amtsblatt der Europ(cid:228)ischen Gemeinschaften 8. 6. 2000 ANHANG II (cid:132)B. 41. PHOTOTOXIZIT˜T (cid:151) IN-VITRO-3T3-NRU-PHOTOTOXIZIT˜TSTEST 1 METHODE 1. 1 Einleitung Phototoxizit(cid:228)t wird als toxische Reaktion definiert, die nach der ersten Exposition der Haut mit bestimmten Chemikalien bei nachfolgender Lichtexposition entsteht oder auf (cid:228)hnliche Weise durch Bestrahlung der Haut nach systemischer Verabreichung eines chemischen Stoffes induziert wird. Die aus dem In-vitro-3T3-NRU-Phototoxizit(cid:228)tstest gewonnenen Informationen dienen der Erfassung des photo- toxischen Potentials einer Testsubstanz, d. h. des Vorhandenseins bzw. Nicht-Vorhandenseins m(cid:246)glicher Gefahren durch eine Testsubstanz in Verbindung mit einer Exposition mit UV- und sichtbarem Licht. Da der toxikologische Endpunkt des In-vitro-Tests die Bestimmung der durch die kombinierte Wirkung eines chemischen Stoffs und von Licht induzierten Photozytotoxizit(cid:228)t ist, k(cid:246)nnen sowohl Verbindungen, die nach systemischer Verabreichung und Aufbringung auf die Haut in vivo phototoxisch sind, als auch Verbindungen, die nach topischer Anwendung auf der Haut phototoxische Wirkung (Photoirritation) zeigen, durch den Test erfa(cid:223)t werden. Der In-vitro-3T3-NRU-Phototoxizit(cid:228)tstest wurde im Zeitraum 1992-1997 (1) (2) (3) in einem gemeinsamen EU/COLIPA-Projekt entwickelt und validiert, um eine valide In-vitro-Alternative zu den verschiedenen gebr(cid:228)uchlichen In-vivo-Tests zu etablieren. 1996 empfahl ein OECD-Workshop ein In-vitro-Stufen-Testkonzept f(cid:252)r die Beurteilung der Phototoxizit(cid:228)t (4). Die Ergebnisse des In-vitro-3T3-NR-Phototoxizit(cid:228)tstests wurden mit akuten Phototoxizit(cid:228)ts-/Photoirritations- wirkungen in vivo bei Tieren und Menschen verglichen, und es zeigte sich, da(cid:223) der Test in bezug auf diese Wirkungen ausgezeichnete Vorhersagen macht. Der Test ist nicht dazu bestimmt, sonstige negative Wirkun- gen vorherzusagen, die sich aus der kombinierten Wirkung von Licht und einem chemischen Stoff ergeben k(cid:246)nnen, wie Photogenotoxizit(cid:228)t, Photoallergie und Photokarzinogenit(cid:228)t, wenngleich viele chemische Stoffe, die diese spezifischen Eigenschaften aufweisen, in dem In-vitro-3T3NRU-Phototoxizit(cid:228)tstest positiv reagieren wer- den. Ftmer ist der Test nicht f(cid:252)r die Beurteilung der phototoxischen Potenz bestimmt. Eine sequentielle Pr(cid:252)fstrategie zur Phototoxizit(cid:228)tstestung mit Chemikalien ist in Anlage 1 enthalten. 1. 2 Begriffsbestimmungen Bestrahlungsst(cid:228)rke: die Intensit(cid:228)t des auf eine Oberfl(cid:228)che auftreffenden ultravioletten (UV) oder sichtbaren Lichts, gemessen in W/m2 oder mW/cm2. Lichtdosis: die Menge (= Intensit(cid:228)t (cid:215) Zeit) der auf eine Oberfl(cid:228)che auftreffenden ultravioletten (UV) oder sicht- baren Strahlung, ausgedr(cid:252)ckt in Joules (= W (cid:215) s) je Oberfl(cid:228)chenbereich, z. B. J/m2 ider J/cm2. UV Licht, Bandbreiten: Die von der Internationalen Beleuchtungskommission (CIE) empfohlenen Bezeichnungen sind: UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) und UVC (100-280 nm). Andere Bezeichnungen werden eben- falls verwendet: die Trennung zwischen UVB und UVA erfolgt oft bei 320 nm; UVA kann in UV-A1 und UV-A2 unterteilt werden, wobei die Trennung bei ca. 340 nm liegt. Zell-Viabilit(cid:228)t: Parameter zur Messung der Gesamtaktivit(cid:228)t einer Zellpopulation (z. B. Aufnahme des Vitalfarb- stoffs (cid:130)Neutralrot(cid:145) in Zell-Lysosomen), die je nach dem gemessenen Endpunkt und der angewandten Versuchs- auslegung mit der Gesamtzahl und/oder der Vitalit(cid:228)t der Zellen korreliert. Relative Zell-Viabilit(cid:228)t: ausgedr(cid:252)ckt in Relation zu Negativkontrollen (L(cid:246)semittel), die das gesamte Testverfah- ren (entweder + UV oder ﬂ UV) durchlaufen, jedoch nicht mit einer Testchemikalie behandelt wurden. Pr(cid:228)diktionsmodell: Ein zur Umwandlung der Ergebnisse eines Toxizit(cid:228)tstests in eine Vorhersage des toxischen Potentials angewandter Algorythmus. Im vorliegenden Test k(cid:246)nnen PIF und MPE f(cid:252)r die Umwandlung der Ergebnisse des In-vitro-3T3-NRU-Phototoxizit(cid:228)tstests in eine Vorhersage des phototoxischen Potentials verwen- det werden. PIF (Photoirritationsfaktor): ein Faktor, der durch Vergleich von zwei gleich wirksamen zytotoxischen Konzen- trationen (EC50) der chemischen Testsubstanz in Abwesenheit (ﬂ UV) und in Anwesenheit (+ UV) nicht-zyto- toxischer Strahlung mit UVA/vis-Licht erlangt wird. MPE (Mean Photo Effect): eine neuartige Me(cid:223)gr(cid:246)(cid:223)e, die von einer mathematischen Analyse der kompletten Form von zwei Konzentrations-Wirkungskurven hergeleitet wurde, die in Abwesenheit (ﬂ UV) und in Anwe- senheit (+ UV) nicht-zytotoxischer Strahlung mit UVA/vis-Licht erzielt wurden. 8. 6. 2000 DE Amtsblatt der Europ(cid:228)ischen Gemeinschaften L 136/99 Phototoxizit(cid:228)t: eine akute toxische Reaktion, die nach der ersten Exposition der Haut mit bestimmten che- mischen Stoffen bei anschlie(cid:223)ender Lichtexposition entsteht oder die auf (cid:228)hnliche Weise durch Bestrahlung der Haut nach systemischer Verabreichung eines chemischen Stoffs induziert wird. Photoirritation: ein Unterbegriff von (cid:130)Phototoxizit(cid:228)t(cid:145), der verwendet wird, um nur jene phototoxischen Reaktio- nen zu beschreiben, die auf der Haut nach Exposition mit chemischen Stoffen (topische oder orale Verabrei- chung) auftreten. Diese phototoxischen Reaktionen f(cid:252)hren stets zu nicht-spezifischen Zellsch(cid:228)den (sonnen- brand(cid:228)hnliche Reaktionen). Photoallergie: eine erworbene immunologische Reaktion, die nicht bei der ersten Behandlung mit chemischen Stoffen und Licht auftritt und eine Induktionszeit von einer oder zwei Wochen ben(cid:246)tigt, bevor eine Hautreak- tion nachgewiesen werden kann. Photogenotoxizit(cid:228)t: eine bei einem genetischen Endpunkt beobachtete genotoxische Reaktion, die nach der Exposition von Zellen mit einer nicht-genotoxischen Dosis von UV/sichtbarem Licht und einem nichtgenoto- xischen chemischen Stoff auftritt. Photokarzinogenit(cid:228)t: durch wiederholte Anwendung von Licht und chemischen Stoffen induzierte Karzinogeni- t(cid:228)t. Der Begriff (cid:130)Photo-Co-Karzinogenese(cid:145) wird verwendet, wenn UV-induzierte Tumorigenese durch einen che- mischen Stoff verst(cid:228)rkt wird. 1. 3 Referenzsubstanzen Abgesehen von der Positivkontroll-Chemikalie Chlorpromazin, die in jedem Test gleichzeitig mitgetestet werden sollte, wird f(cid:252)r die Neuetablierung des 3T3-NRU-Phototoxizit(cid:228)tstests empfohlen, als Referenzchemikalien einige Vertreter der bei diesem Test in den Ringversuchen benutzten Chemikalien zu verwenden (1) (3) (13). 1. 4 Vorbemerkungen Bei vielen Klassen von Chemikalien wurde festgestellt, da(cid:223) sie phototoxische Wirkungen induzieren (5) (6) (7) (8). Ihr einziges gemeinsames Merkmal ist ihre F(cid:228)higkeit, Lichtenergie im Sonnenlichtbereich zu absorbieren. Gem(cid:228)(cid:223) dem ersten photochemischen Gesetz (dem Grotthaus-Draperschen Gesetz), erfordert die Photoreaktion ausreichende Lichtquantenabsorption. Folglich sollte, bevor eine biologische Testung gem(cid:228)(cid:223) der vorliegenden Pr(cid:252)frichtlinie in Betracht gezogen wird, ein UV/vis-Absorptionsspektrum der Testchemikalie bestimmt werden (z. B. gem(cid:228)(cid:223) der OECD-Test Guideline 101). Sofern der molare Extinktions-/Absorptionskoeffizient unter 10 Liter (cid:215) molﬂ1 (cid:215) cmﬂ1 liegt, besitzt der chemische Stoff kein photoreaktives Potential und braucht nicht im In-vi- tro-3T3-NRU-Phototoxizit(cid:228)tstest oder einem anderen biologischen Test auf sch(cid:228)dliche photochemische Wir- kungen (Anlage 1) getestet zu werden. 1. 5 Prinzip der Testmethode Vier Mechanismen wurden identifiziert, durch die Lichtabsorption mittels eines (chemischen) Chromophors zu einer phototoxischen Reaktion f(cid:252)hren kann (7). Sie alle haben Zellsch(cid:228)digung zur Folge. Daher basiert der In-vitro-3T3-NRU-Phototoxizit(cid:228)tstest auf einem Vergleich der Zytotoxizit(cid:228)t eines chemischen Stoffs, die er mit Exposition und ohne Exposition einer nicht-zytotoxischen Dosis UVA/vis-Licht aufweist. Zytotoxizit(cid:228)t in die- sem Test wird ausgedr(cid:252)ckt als konzentrationsabh(cid:228)ngige Reduzierung der Aufnahme des Vitalfarbstoffs Neu- tralrot (NR, (9)) 24 Stunden nach der Bestrahlung und Behandlung mit der Testchemikalie. Balb/c-3T3-Zellen werden zwecks Bildung eines Monolagers 24 Stunden kultiviert. Zwei (cid:130)96-well(cid:145)-Platten je Testchemikalie werden sodann mit acht verschiedenen Konzentrationen der Chemikalie eine Stunde lang vor- inkubiert. Daraufhin wird eine der zwei Platten mit einer nicht-toxischen UVA/vis-Lichtdosis von 5 J/cm2 UVA (+ UV-Versuch) bestrahlt, w(cid:228)hrend die andere Platte im Dunkeln aufbewahrt wird (ﬂ UV-Versuch). In beiden Platten wird dann das Behandlungsmedium durch ein Kulturmedium ersetzt, und nach weiteren 24 Stunden Inkubation wird die Zellviabilit(cid:228)t durch Neutralrot-Aufnahme ((cid:130)Neutral Red Uptake(cid:145), NRU) drei Stun- den lang bestimmt. Die relative Zellviabilit(cid:228)t, ausgedr(cid:252)ckt als Prozentsatz unbehandelter Negativkontrollen, wird f(cid:252)r jede der acht Testkonzentrationen berechnet. Um das phototoxische Potential vorherzusagen, wird in der Regel der EC50-Wert (d. h. die Konzentration, die die Zellviabilit(cid:228)t gegen(cid:252)ber unbehandelten Kontrollen um 50 % vermindert) der, mit (+ UV) und ohne (ﬂ UV) Strahlung erzielten Konzentrations-Wirkungskurve ver- glichen. 1. 6 Qualit(cid:228)tskriterien UVA-Sensitivit(cid:228)t der Zellen, historische Daten: Die Zellen sollten regelm(cid:228)(cid:223)ig auf ihre Empfindlichkeit gegen(cid:252)ber UVA gepr(cid:252)ft werdet. Die Zellen werden in der im In-vitro-3T3-NRU-Phototoxizit(cid:228)tstest angewandten Dichte ausges(cid:228)t, am darauffolgenden Tag mit UVA-Dosen von 1-9 J/cm2 bestrahlt, und die Zell-Viabilit(cid:228)t wird einen Tag sp(cid:228)ter im NRU-Test bestimmt. Die Zellen entsprechen den Qualit(cid:228)tskriterien, sofern ihre Viabilit(cid:228)t nach Bestrahlung mit 5 J/cm2 UVA nicht weniger als 80 % der Viabilit(cid:228)t der Dunkelkontrollen betr(cid:228)gt. Bei der h(cid:246)chsten UVA-Dosis von 9 J/cm2 sollte die Viabilit(cid:228)t nicht weniger als 50 % der Dunkelkontrollen betragen. Diese Pr(cid:252)fung sollte ca. bei jeder zehnten Passage der Zellen wiederholt werden. UVA-Sensitivit(cid:228)t der Negativkontroll-Zellen, im einzelnen Test: Der Test entspricht den Qualit(cid:228)tskriterien, wenn Negativkontrollen (Zellen in EBSS (Earl’s Balanced Salt Solution)) mit oder ohne 1 % Dimethylsulfid (DMSO) oder 1 % Ethanol (EtOH)) in dem + UVA-Versuch eine Viabilit(cid:228)t von weniger als 80 % der Viabilit(cid:228)t nicht-be- strahlter Zellen in demselben L(cid:246)semittel des gleichzeitig durchgef(cid:252)hrten Dunkelversuchs (ﬂ UVA) aufzeigen. L 136/100 DE Amtsblatt der Europ(cid:228)ischen Gemeinschaften 8. 6. 2000 Viabilit(cid:228)t von Negativkontrollen: Die absolute optische Dichte (OD540 NRU), gemessen im NR-Extrakt der Negativ- kontrollen zeigt, ob die 1 (cid:215) 104 Zellen die je (cid:130)well(cid:145) ausges(cid:228)t wurden, bei normaler Verdopplungszeit w(cid:228)hrend der zwei Tage des Tests gut gewachsen sind. Ein Test entspricht den Akzeptanzkriterien, wenn die mittlere OD540 NRU unbehandelter Kontrollen ¯ 0,2 betr(cid:228)gt. Positivkontrolle: Ein bekannter phototoxischer chemischer Stoff soll gleichzeitig mit jedem In-vitro-3T3-NRU- Phototoxizit(cid:228)tstest getestet werden. Chlorpromazin (CPZ) wurde als Positivkontrolle in der EU/COLIPA-Vali- dierungsstudie verwendet und wird daher empfohlen. F(cid:252)r mit dem Standardprotokoll im In-vitro-3T3-NRU- Phototoxizit(cid:228)tstest getestetes CPZ wurden folgende Test-Akzeptanzkriterien festgelegt: bestrahltes CPZ (+ UVA): EC50 = 0,1 bis 2,0 (cid:181)g/ml, nicht-bestrahltes CPZ (ﬂ UVA): EC50 = 7,0 bis 90,0 (cid:181)g/ml. Der Photoirritationsfaktor (PIF), d. h. die Verschiebung der EC50 sollte mindestens 6 betragen. Andere bekannte, f(cid:252)r die Chemikalienklasse oder L(cid:246)slichkeitsmerkmale der bewerteten Testchemikalie geeig- nete phototoxische Chemikalien, k(cid:246)nnen an Stelle von CPZ als gleichzeitige Positivkontrollen verwendet wer- den. In diesem Fall sollten die Bereiche der EC50-Werte sowie PIF oder MPE auf der Grundlage von histori- schen Daten in angemessener Form als Akzeptanzkriterien f(cid:252)r den Test festgelegt 1. 7 Beschreibung der Testmethode 1. 7. 1 Zubereitungen 1. 7. 1. 1 Z e l l e n Eine permanente M(cid:228)use-Fibroblastenzellinie (cid:151) Balb/c 3T3, Klon 31 (cid:151) entweder von ATCC oder ECACC (cid:151) wurde in der Validierungsstudie verwendet und wird daher empfohlen. Andere Zellen oder Zellinien k(cid:246)nnen erfolgreich mit demselben Testprotokoll verwendet werden, wenn die Kulturbedingungen den spezifischen Bed(cid:252)rfnissen der Zellen angepa(cid:223)t werden, jedoch mu(cid:223) die gleichwertige Eignung der Zellen nachgewiesen werden. Zellen sollten regelm(cid:228)(cid:223)ig auf die Abwesenheit von Mykoplasma-Kontamination hin gepr(cid:252)ft und nur verwen- det werden, sofern die Ergebnisse solcher Pr(cid:252)fungen zufriedenstellend sind. Da die UVA-Sensitivit(cid:228)t von Zellen mit der erreichbaren Passagenzahl zunehmen kann, sollten Balb/c 3T3-Zellen der niedrigsten Passagenzahl, vorzugsweise weniger als 100, verwendet werden. Es ist wichtig, daB die UVA-Sensitivit(cid:228)t der Balb/c-3T3-Zellen regelm(cid:228)(cid:223)ig entsprechend dem in der vorliegenden Pr(cid:252)frichtlinie beschriebenen Qualit(cid:228)tskontrollverfahren gepr(cid:252)ft wird. 1. 7. 1. 2 M e d i e n u n d K u l t u r b e d i n g u n g e n F(cid:252)r Routine-Zellpassagen und w(cid:228)hrend des Testverfahrens sollten geeignete Kulturmedien und Inkubations- bedingungen angewendet werden. F(cid:252)r Balb/c-3T3-Zellen sind dies DMEM mit einem Zusatz von 10 % Serum neugeborener K(cid:228)lber, 4 mM Glutamin, Penicillin und Streptomycin sowie Feuchtinkubation bei 37 (cid:176)C/7,5 % CO2. Es ist dabei besonders wichtig, da(cid:223) die Zell-Kulturbedingungen eine Zellzyklus-Zeit innerhalb des nor- malen historischen Bereichs der verwendeten Zellen oder Zellinien sicherstellen. 1. 7. 1. 3 Z u b e r e i t u n g v o n K u l t u r e n Zellen aus der Tiefk(cid:252)hllagerung werden in einem Kulturmedium in angemessener Dichte ausges(cid:228)t und minde- stens einmal vor ihrer Verwendung im In-vitro-3T3-NRU-Phototoxizit(cid:228)tstest passagiert. F(cid:252)r den Phototoxizit(cid:228)tstest werden Zellen in einem Kulturmedium in einer Dichte ausges(cid:228)t, die sicherstellt, da(cid:223) die Kulturen zum Ende des Tests, d. h. wenn die Zellviabilit(cid:228)t 48 Stunden nach dem Auss(cid:228)en der Zellen bestimmt wird, ihre maximale Dichte (Konfluenz) noch nicht erreicht haben. F(cid:252)r Balb/c-3T3-Zellen, die in (cid:130)96-well(cid:145)-Platten kultiviert werden, betr(cid:228)gt die empfohlene Zelldichte 1 (cid:215) 104 Zellen je (cid:130)well(cid:145). F(cid:252)r jede Testchemikalie werden Zellen identisch in zwei separate (cid:130)96-well(cid:145)-Platten ges(cid:228)t, die sodann gleichzei- tig w(cid:228)hrend des gesamten Testverfahrens unter identischen Kulturbedingungen behandelt werden, abgesehen von dem Zeitraum, in dem eine der Platten (+ UVA/vis) bestrahlt und die andere im Dunkeln (ﬂ UVA/vis) auf- bewahrt wird. 1. 7. 1. 4 S t o f f w e c h s e l a k t i v i e r u n g W(cid:228)hrend die Verwendung metabolisierender Systeme eine allgemeine Voraussetzung f(cid:252)r alle In-vitro-Tests f(cid:252)r die Vorhersage von genotoxischem und karzinogenem Potential ist, ist bisher im Falle der Phototoxikologie kein chemischer Stoff bekannt, f(cid:252)r den eine metabolische Umwandlung erforderlich ist, um in vivo oder in vitro phototoxische Wirkung zu zeigen. Somit wird es weder als notwendig noch als wissenschaftlich gerecht- fertigt erachtet, da(cid:223) dieser Test mit einem Stoffwechselaktivierungssystem durchgef(cid:252)hrt wird. 8. 6. 2000 DE Amtsblatt der Europ(cid:228)ischen Gemeinschaften L 136/101 1. 7. 1. 5 T e s t s u b s t a n z / Z u b e r e i t u n g Testchemikalien m(cid:252)ssen unmittelbar vor ihrer Verwendung frisch zubereitet werden, es sei denn, Haltbarkeits- daten rechtfertigen eine Lagerung der Pr(cid:228)paration. Eine Zubereitung unter Rotlicht kann erforderlich sein, wenn mit einer raschen Photodegradation zu rechnen ist. Die Testchemikalien sollten in einer gepufferten Salzl(cid:246)sung, z. B. EBSS oder PBS (phosphatgepufferte Salzl(cid:246)- sung), gel(cid:246)st werden, die, um Interferenzen w(cid:228)hrend der Bestrahlung zu vermeiden, frei sein mu(cid:223) von Pro- teinbestandteilen und lichtabsorbierenden pH-Indikationsfarben. Testchemikalien mit eingeschr(cid:228)nkter Wasserl(cid:246)slichkeit sollten in geeigneten L(cid:246)semitteln in einem Hundert- fachen der gew(cid:252)nschten Endkonzentration gel(cid:246)st und dann 1:100 mit der gepufferten Salzl(cid:246)sung verd(cid:252)nnt werden. Wenn ein L(cid:246)semittel verwendet wird, mu(cid:223) es mit einem konstanten Volumen von 1 % (v/v) in allen Kulturen anwesend sein, d. h. sowohl in den Negativkontrollen als auch in allen Konzentrationen der Testche- mikalie. Dimethylsulphoxid (DMSO) und Ethanol (EtOH) sind die empfohlenen L(cid:246)semittel. Andere L(cid:246)semittel von geringer Zytotoxizit(cid:228)t (z. B. Aceton) k(cid:246)nnen angemessen sein, doch sollten sie sorgf(cid:228)ltig auf spezifische Eigen- schaften, wie Reaktion mit der Testchemikalie, Ausl(cid:246)schen der phototoxischen Wirkung, Einfangen von Radi- kalen, gepr(cid:252)ft werden. Wirbelmischung (Vortex) und/oder Anwendung von Ultraschall und/oder Erw(cid:228)rmung auf 37 (cid:176)C k(cid:246)nnen, sofern erforderlich, verwendet werden, um die L(cid:246)slichkeit zu f(cid:246)rdern. 1. 7. 1. 6 U V - B e s t r a h l u n g Lichtquelle: Die Wahl der geeigneten Lichtquelle und geeigneter Filter ist der kritischste Faktor bei der Phototo- xizit(cid:228)tstestung. F(cid:252)r Photosensibilisierung sind in der Regel UVA und sichtbare Bereiche verantwortlich (7) (10), w(cid:228)hrend UVB weniger relevant und selbst hochgradig zytotoxisch ist, da es seine Zytotoxizit(cid:228)t um ein Tau- sendfaches zwischen 313 und 280 nm erh(cid:246)ht (11). Kriterien f(cid:252)r die Wahl einer geeigneten Lichtquelle sollten die wesentliche Voraussetzung haben, da(cid:223) die Lichtquelle Wellenl(cid:228)ngen aussendet, die von der chemischen Testsubstanz absorbiert werden und da(cid:223) die (in einer akzeptablen Zeit erreichbare) Lichtdosis f(cid:252)r den Nach- weis bekannter Photosensibilisatoren ausreicht Dar(cid:252)ber hinaus sollten die jeweils verwendeten Wellenl(cid:228)ngen und Dosen, einschlie(cid:223)lich der W(cid:228)rmeemission (lnfrarotbereich), f(cid:252)r das Testsystem nicht unn(cid:246)tig sch(cid:228)dlich sein. Die Simulierung von Sonnenlicht mit Solarsimulatoren wird als optimale Lichtquelle betrachtet. Sowohl Xenon-Lichtbogenlampen als auch (dotierte) Quecksilber-Metallhalogenid-Lichtbogenlampen werden in Solar- simulatoren verwendet. Letztere haben den Vorteil, da(cid:223) sie weniger W(cid:228)rme emittieren und preiswerter sind, doch ist die (cid:220)bereinstimmung mit dem Sonnenlicht nicht perfekt. Da alle Solarsimulatoren signifikante Men- gen UVB aussenden, sollten sie angemessen gefiltert sein, um die hoch zytotoxischen UVB-Wellenl(cid:228)ngen zu mindern. F(cid:252)r den In-vitro-3T3-NRU-Phototoxizit(cid:228)tstest sollte ein Strahlungsspektrum verwendet werden, das praktisch frei von UVB ist (UVA:UVB p 1:20). Die spektrale Energieverteilung des in der Validierungsstudie zum In-vi- tro-3T3-NRU-Phototoxizit(cid:228)tstest verwendeten gefilterten Solarsimulators wurde als Beispiel ver(cid:246)ffentlicht (3). Dosimetrie: Die Lichtintensit(cid:228)t (Bestrahlungsst(cid:228)rke) sollte regelm(cid:228)(cid:223)ig vor jedem Phototoxizit(cid:228)tstest unter Ver- wendung eines geeigneten Breitband-UV-Meters gepr(cid:252)ft werden. Das UV-Meter mu(cid:223) f(cid:252)r die Lichtquelle kali- briert sein. Die Leistungsf(cid:228)higkeit des UV-Meters ist sicherzustellen. Zu diesem Zweck wird die Verwendung eines zweiten Referenz-UV-Meters des gleichen Typs und dergleichen Kalibrierung empfohlen. Im Idealfall sollte in gr(cid:246)(cid:223)eren Abst(cid:228)nden ein Spektroradiometer zur Messung der spektralen Energieverteilung der gefilter- ten Lichtquelle und zur Pr(cid:252)fung der Kalibrierung des Breitband-UV-Meters verwendet werden, doch erfordern solche Instrumente fachkundige Bedienung durch entsprechend geschultes Personal. Eine Dosis von 5 J/cm2 (UVA) wurde in der Validierungsstudie als nicht-zytotoxisch gegen(cid:252)ber Balb/ c-3T3-Zellen und als ausreichend stark ermittelt, um selbst schwach phototoxische Chemikalien zu erkennen. Um innerhalb von 50 Minuten 5 J/cm2 zu erreichen, mu(cid:223) die Bestrahlungsst(cid:228)rke auf 1666 mW/cm2 einge- stellt werden. Wenn eine andere Zellinie oder eine unterschiedliche Lichtquelle verwendet werden, kann die UVA-Dosis bei Ber(cid:252)cksichtigung der Kriterien der Unsch(cid:228)dlichkeit gegen(cid:252)ber Zellen und der ausreichenden St(cid:228)rke zur Erkennung von Standardphototoxinen geringf(cid:252)gig angepa(cid:223)t werden. Die Zeit der Lichtexposition wird auf folgendem Wege berechnet: 1. 7. 2 Testbedingungen Die maximale Konzentration einer Testchemikalie sollte 100 (cid:181)g/ml nicht (cid:252)berschreiten, da alle phototoxi- schen Chemikalien bei niedrigeren Konzentrationen erfa(cid:223)t vurden, w(cid:228)hrend die Inzidenz von falsch positiven Werten bei h(cid:246)heren Konzentrationen zunimmt (13). Der pH der h(cid:246)chsten Konzentration der Testchemikalie sollte zufriedenstellend sein (pH-Bereich: 6,5-7,8). Die in Anwesenheit (+ UVA) und in Abwesenheit (ﬂ UVA) von Licht zu testenden Konzentrationsbereiche eines chemischen Stoffs sollten angemessen in vorangehenden Vorversuchen ermittelt werden. Bereich und Abstand einer Konzentrationsreihe m(cid:252)ssen so gew(cid:228)hlt werden, da(cid:223) Konzentrations-Wirkungskurven ausrei- L 136/102 DE Amtsblatt der Europ(cid:228)ischen Gemeinschaften 8. 6. 2000 chend durch experimentelle Daten gest(cid:252)tzt werden. Dazu wird die Verwendung von geometrischen Konzen- trationsreihen (mit einem konstanten Verd(cid:252)nnungsfaktor) empfohlen. 1. 7. 3 Testverfahren (1) 1. 7. 3. 1 1. T a g Eine Zellsuspension von 1 (cid:215) 105 Zellen/ml wird in einem Kulturmedium zubereitet, und 100 (cid:181)L. Kulturme- dium werden nur in die periph(cid:228)ren (cid:130)wells(cid:145) einer (cid:130)96-well(cid:145)-Gewebskultur Mikrotiterplatte gegeben (= Blindpro- ben). In die (cid:252)brigen (cid:130)wells(cid:145) werden 100 (cid:181)L der Zellsuspension von 1 (cid:215) 105 Zellen/ml (= 1 (cid:215) 104 Zellen/well) pipettiert. F(cid:252)r jede Testchemikalie werden zwei Platten zubereitet: eine zur Bestimmung von Zytotoxizit(cid:228)t (ﬂ UVA) und die andere zur Bestimmung von Photozytotoxizit(cid:228)t (+ UVA). Die Zellen werden 24 Stunden lang (7,5 % CO2, 37 (cid:176)C) inkubiert, bis sie einen halbkonfluenten Monolayer bil- den. Diese Inkubationszeit stellt die Erholung der Zellen, das Anheften und ein exponentielles Wachstum sicher. 1. 7. 3. 2 2. T a g Nach der Inkubation wird das Kulturmedium abgesaugt. Darauf folgen zwei Waschg(cid:228)nge mit 150 (cid:181)L EBSS/ PBS je (cid:130)well(cid:145), und 100 (cid:181)l EBSS/PBS, die die geeignete Konzentration der Testchemikalie oder einfach nur L(cid:246)se- mittel (Negativkontrolle) enth(cid:228)lt, werden hinzugef(cid:252)gt. Es sind 8 verschiedene Konzentrationen der Testche- mikalie zu verwenden. Die Zellen werden mit der Testchemikalie im Dunkeln 60 Minuten lang inkubiert (7,5 % CO2, 37 (cid:176)C). Zur Durchf(cid:252)hrung des (+ UVA)-Teils des Tests werden die Zellen bei Raumtemperatur 50 Minuten lang durch den Deckel der (cid:130)96-well(cid:145)-Platte mit 1,7 mW/cm2 UVA (= 5 J/cm2) bestrahlt. Zur Vermeidung von H2O-Kon- densierung unter dem Deckel wird ein Ventilator eingesetzt. Duplikatplatten (ﬂ UVA) werden 50 Minuten lang (= UVA-Expositionszeit) bei Raumtemperatur in einem dunklen Kasten gehalten. Die Testfl(cid:252)ssigkeit wird abgesaugt. Es folgen zwei Waschg(cid:228)nge mit 150 (cid:181)L EBSS/PBS wird durch ein Kultur- medium ersetzt und (cid:252)ber Nacht (18-22 h) inkubiert (7,5 % CO2, 37 (cid:176)C). 1. 7. 3. 3 3. T a g Mikroskopische Bewertung Die Zellen werden unter einem Phasen-Kontrast-Mikroskop untersucht. Eventuelle morphologische Ver(cid:228)nde- rungen der Zelle durch zytotoxische Wirkungen der Testchemikalie werden aufgezeichnet. Diese Pr(cid:252)fung wird empfohlen, um Versuchsirrt(cid:252)mer auszuschalten, doch werden diese Aufzeichnungen nicht f(cid:252)r die Bewertung der Zytotoxizit(cid:228)t oder Phototoxizit(cid:228)t verwendet. Neutralrot-Aufnahme-Test Die Zellen werden mit 150 (cid:181)l vorgew(cid:228)rmter EBSS/PBS gewaschen. Die Waschl(cid:246)sung wird durch vorsichtiges Absaugen entfernt. 100 (cid:181)l des NR-Mediums werden hinzugef(cid:252)gt und bei 37 (cid:176)C, in feuchter Atmosph(cid:228)re von 7,5 % CO2, 3 Stunden lang inkubiert. Nach der Inkubation wird das NR-Medium entfernt, und die Zellen werden mit 150 (cid:181)l EBSS/PBS gewaschen. Die EBSS/PBS wird vollkommen abgesaugt, und die 96-well-Platten umgekehrt auf (cid:130)blotting paper(cid:145) getrocknet. (Wahlweise kann die Platte umgekehrt (d. h. mit den wells nach au(cid:223)en) zentrifugiert werden. ) Es werden genau 150 (cid:181)l NR Desorptionsl(cid:246)sung (frisch zubereitete Ethanol/Essigs(cid:228)ure) hinzugef(cid:252)gt. Die Mikrotiter-Platte wird 10 Minuten lang auf einem Mikrotiter-Platten-Sch(cid:252)ttler rasch gesch(cid:252)ttelt, bis das NR aus den Zellen extrahiert ist und eine homogene L(cid:246)sung bildet. Die optische Dichte der NR-Extrakte wird bei 540 nm in einem Spektralphotometer gemessen, wobei die Blindproben als Referenz verwendet werden. Die Daten sind in angemessenem Format (z. B. ASCII) f(cid:252)r sp(cid:228)tere Analysen aufzuzeichnen. (1) F(cid:252)r weitere Einzelheiten siehe Literaturverzeichnis (12). 8. 6. 2000 DE Amtsblatt der Europ(cid:228)ischen Gemeinschaften L 136/103 2 DATEN 2. 1 Qualit(cid:228)t und Quantit(cid:228)t von Daten Die Daten sollten eine sinnvolle Analyse der in Anwesenheit und in Abwesenheit von UVA/vis-Strahlung erhaltenen Konzentrations-Wirkungsreaktionen gestatten. Sofern Zytotoxizit(cid:228)t ermittelt wird, sollten sowohl der Konzentrationsbereich als auch der Abstand einzelner Konzentrationen so gew(cid:228)hlt sein, dass die experi- mentellen Daten in einer Kurve dargestellt werden k(cid:246)nnen. Da eine Testchemikalie bis zu der festgelegten Konzentrationsgrenze von 100 (cid:181)g/ml im Dunkelversuch (ﬂ UVA) nicht zytotoxisch, bei Bestrahlung (+ UVA) jedoch hochgradig zytotoxisch sein k(cid:246)nnte, ist es m(cid:246)glich, daB die zu pr(cid:252)fenden Konzentrationsbereiche in beiden Teilen des Versuchs einen unterschiedlichen Bereich abdecken m(cid:252)ssen, um den Anforderungen zufrie- denstellender Datenqualit(cid:228)t zu entsprechen. Wenn in beiden Versuchsteilen (ﬂ UVA und + UVA) keine Zyto- toxizit(cid:228)t ermittelt werden kann, ist jedoch ein gro(cid:223)er Abstand zwischen den einzelnen Konzentrationen bis zur h(cid:246)chsten Konzentration ausreichend. (cid:220)blicherweise ist die Verifizierung eines klar positiven Ergebnisses durch eine Versuchswiederholung nicht erforderlich. Dar(cid:252)ber hinaus m(cid:252)ssen klar negative Ergebnisse ebenfalls nicht verifiziert werden, vorausgesetzt, da(cid:223) die Testchemikalie in gen(cid:252)gend hohen Konzentrationen getestet wurde. In solchen F(cid:228)llen ist ein Haupt- versuch zusammen mit einem oder mehreren Vorversuchen ausreichend. Tests mit Grenzergebissen nahe der Klassifizierungsgrenze des Pr(cid:228)diktionsmodells sollten zur (cid:220)berpr(cid:252)fung wiederholt werden. Wenn Wiederholungstests f(cid:252)r erforderlich gehalten werden, k(cid:246)nnen Variationen der Versuchsbedingungen wichtig sein, um zu einem klaren Ergebnis zu gelangen. Eine Schl(cid:252)sselrolle hat dabei die Zubereitung von L(cid:246)sungen der Testchemikalie. Folglich k(cid:246)nnen Variationen dieser Bedingungen (zweites L(cid:246)semittel, Sch(cid:252)tteln, Anwendung von Ultraschall) bei der Wiederholung eines Tests (cid:228)u(cid:223)erst relevant sein. Als Alternative kann auch eine ˜nderung der Inkubationszeit vor der Bestrahlung in Betracht gezogen werden, wie z. B. k(cid:252)rzere Zeit f(cid:252)r in Wasser instabile Chemikalien. 2. 2 Behandlung der Ergebnisse Sofern m(cid:246)glich, wird die Konzentration einer Testchemikalie bestimmt, die eine 50%ige Hemmung der zellu- l(cid:228)ren Neutral-Rot-Aufnahme (EC50) repr(cid:228)sentiert. Dies kann durch Anwendung geeigneter nichtlinearer Regressionsverfahren (vorzugsweise einer Hill-Funktion oder einer logistischen Regression) auf die Konzentra- tions-Wirkungsdaten oder durch Anwendung sonstiger Fitting-Verfahren (14) erfolgen. Vor Verwendung eines EC50-Wertes f(cid:252)r weitere Berechnungen sollte die Qualit(cid:228)t der Kurvenanpassung angemessen gepr(cid:252)ft werden. Als Alternative k(cid:246)nnen graphische Fitting-Methoden zur Berechnung des EC50 angewendet werden. In diesem Fall wird die Verwendung von Wahrscheinlichkeitspapier (x-Achse: log, y-Achse: probit) empfohlen, da in vie- len F(cid:228)llen die Konzentrations-Wirkungsfunktion nach dieser Umwandlung nahezu linear wird. 2. 3 Ergebnisbewertung (Pr(cid:228)diktionsmodelle) 2. 3. 1 Pr(cid:228)diktionsmodell-Version 1: Photo-Irritationsfaktor (PIF) Wenn sowohl in Anwesenheit (+ UVA) als auch in Abwesenheit (ﬂ UVA) von Licht komplette Konzentrati- ons-Wirkungskurven erzielt werden, wird ein Photoirritationsfaktor (PIF) durch folgende Formel berechnet: Ein PIF < 5, sagt kein phototoxisches Potential voraus. w(cid:228)hrend ein PIF ¯ 5 ein phototoxisches Potential vor- aussagt. Stellt sich ein chemischer Stoff in einem Test nur als zytotoxisch + UVA und als nicht-zytotoxisch ﬂ UVA heraus, kann der PIF nicht berechnet werden, auch wenn dies ein Ergebnis darstellt, das auf ein phototoxi- sches Potential hindeutet. In derartigen F(cid:228)llen kann ein (cid:130)> PIF(cid:145) berechnet werden, wenn der (ﬂ UV) Zytotoxizi- t(cid:228)tstest bis zur h(cid:246)chsten Testkonzentration (Cmax) durchgef(cid:252)hrt und dieser Wert f(cid:252)r die Berechnung des (cid:130)> PIF(cid:145) verwendet wird: Wenn nur ein (cid:130)> PIF(cid:145) erzielt werden kann, sagt jeglicher Wert > 1 ein phototoxisches Potential voraus. Wenn sowohl die EC50 (ﬂ UV) als auch die EC50 (+ UV) nicht berechnet werden k(cid:246)nnen, weil ein chemischer Stoff bis zur h(cid:246)chsten Testkonzentration keine Zytotoxizit(cid:228)t aufweist, deutet dies darauf hin, da(cid:223) kein photo- toxisches Potential vorliegt. In derartigen F(cid:228)llen wird ein formaler (cid:130)PIF = *1(cid:145) zur Charakterisierung des Ergeb- nisses des Ergebnisses angewandt: L 136/104 DE Amtsblatt der Europ(cid:228)ischen Gemeinschaften 8. 6. 2000 Wenn nur ein (cid:130)PIF = *1(cid:145) erzielt werden kann, sagt dies voraus, da(cid:223) kein phototoxisches Potential vorliegt In den F(cid:228)llen b) und c), sollten die im In-vitro-3T3-NRU-Phototoxizit(cid:228)tstest maximal erreichten Konzentratio- nen der Testchemikalie bei der Vorhersage des phototoxischen Potentials sorgf(cid:228)ltig in Betracht gezogen wer- den. 2. 3. 2 Pr(cid:228)diktionsmodell-Version 2: Mean-Photo-Effect (MPE) Als Alternative kann eine neue Version des Modells zur Vorhersage eines phototoxischen Potentials ange- wandt werden, das mit den Daten der EU/COLIPA-Validierungsstudie (15) entwickelt und unter blinden Bedin- gungen in einer anschlie(cid:223)enden Studie (cid:252)ber die In-vitro-Phototoxizit(cid:228)t von UV-Filter-Chemikalien getestet wurde (13). Dieses Modell hat nicht die Beschr(cid:228)nkungen des PIF-Modells in den F(cid:228)llen, in denen kein EC50 erzielt werden kann. Das Modell wendet den (cid:130)Mean Photo Effect(cid:145) (MPE) an, einen Me(cid:223)wert, der auf einem Ver- gleich der kompletten Konzentrations-Wirkungskurven basiert. F(cid:252)r die Anwendung des MPE-Modells wurde eine spezielle Computer-Software an der Humboldt-Universit(cid:228)t (Berlin, D. ) entwickelt die kostenlos bezogen werden kann. 2. 4 Interpretation der Ergebnisse Ein positives Ergebnis im In-vitro-3T3-NRU-Phototoxizit(cid:228)tstest (PIF ¯ 5 oder MPE ¯ 0,1) deutet darauf hin, da(cid:223) die Testsubstanz ein phototoxisches Potential aufweist. Wenn dieses Ergebnis bei Konzentrationen unter 10 (cid:181)g/ml erzielt wurde, ist zu vermuten, da(cid:223) die Testchemikalie auch unter verschiedenen Expositionsbedin- gungen in vivo phototoxisch wirkt. Wenn ein positives Ergebnis nur bei der h(cid:246)chsten Testkonzentration von 100 (cid:181)g/mL erzielt wird, k(cid:246)nnen weitere (cid:220)berlegungen f(cid:252)r die Beurteilung der Gef(cid:228)hrlichkeit oder der photo- toxischen Potenz erforderlich sein. Dies k(cid:246)nnen Daten (cid:252)ber die Penetration, Absorption und m(cid:246)gliche Akku- mulation des chemischen Stoffs in der Haut oder die Testung des chemischen Stoffs in einem konfirmativen Alternativtest, wie dem In-vitro-Test mit einem menschlichen Hautmodell, sein. Ein negatives Ergebnis im In-vitro-3T3-NRU-Phototoxizit(cid:228)tstest (PIF < 5 oder MPE < 0,1) bedeutet, da(cid:223) die Testsubstanz f(cid:252)r kultivierte S(cid:228)ugerzellen unter den angewandten Versuchsbedingungen nicht phototoxisch war. In F(cid:228)llen, in denen der chemische Stoff bis zur h(cid:246)chsten Konzentration von 100 (cid:181)g/ml getestet werden konnte, deutet ein negatives Ergebnis an, da(cid:223) der chemische Stoff kein phototoxisches Potential besitzt und da(cid:223) Phototoxizit(cid:228)t in vivo als unwahrscheinlich gelten kann. In F(cid:228)llen, in denen identische Konzentrations-To- xizit(cid:228)tsreaktionen (EC50 + UV und EC50ﬂ UV) bei niedrigeren Konzentrationen erhalten wurden, w(cid:228)re die Interpretation der Daten dieselbe. Wenn dagegen + UV und ﬂ UV keinerlei Toxizit(cid:228)t nachgewiesen wurde und gleichzeitig die Konzentrationswerte auf weniger als 100 (cid:181)g/ml durch eine eingeschr(cid:228)nkte L(cid:246)slichkeit in w(cid:228)ss- rigen Systemen beschr(cid:228)nkt waren, sollte die Eignung des Tests f(cid:252)r die Testsubstanz in Frage gestellt und ein Best(cid:228)tigungstest erwogen werden (z. B. Verwendung eines In-vitro-Hautmodells oder eines Ex-vivo-Hautmodells oder eines In-vivo-Tests). 3 BERICHTERSTATTUNG Test-Bericht Der Test-Bericht mu(cid:223) folgende Informationen enthalten: Testchemikalie: (cid:151) Kenndaten und CAS-Nr. , sofern bekannt, (cid:151) physikalische Eigenschaften und Reinheit, (cid:151) physikalisch-chemische Eigenschaften, die f(cid:252)r die Durchf(cid:252)hrung der Studie relevant sind, (cid:151) Stabilit(cid:228)t und Photostabilit(cid:228)t, sofern bekannt. L(cid:246)semittel: (cid:151) Begr(cid:252)ndung der Wahl des L(cid:246)semittels, (cid:151) L(cid:246)slichkeit der Testchemikalie in diesem L(cid:246)semittel, (cid:151) Prozentsatz des in dem Behandlungsmedium (EBSS oder PBS) vorhandenen L(cid:246)semittels. Zellen: (cid:151) Art und Quelle der Zellen, (cid:151) Abwesenheit von Mykoplasma, (cid:151) Zahl der Zellpassagen, sofern bekannt, (cid:151) UVA-Sensitivit(cid:228)t von Zellen, bestimmt mit dem im In-vitro-3T3-NRU-Phototoxizit(cid:228)tstest verwendeten Bestrahlungsger(cid:228)t. Testbedingungen a); Inkubation vor und nach der Behandlung: (cid:151) Art und Zusammensetzung des Kulturmediums, (cid:151) Inkubationsbedingungen (CO2-Konzentration, Temperatur, Feuchtigkeit), (cid:151) Inkubationsdauer (Vorbehandlung, Nachbehandlung). 8. 6. 2000 DE Amtsblatt der Europ(cid:228)ischen Gemeinschaften L 136/105 Testbedingungen b); Behandlung mit der Chemikalie: (cid:151) Begr(cid:252)ndung der Wahl der in Anwesenheit und in Abwesenheit von UV/vis-Strahlung verwendeten Kon- zentrationen der Testchemikalie, (cid:151) im Falle beschr(cid:228)nkter L(cid:246)slichkeit der Testchemikalie und bei Abwesenheit von Zytotoxizit(cid:228)t Begr(cid:252)ndung der h(cid:246)chsten getesteten Konzentration, (cid:151) Art und Zusammensetzung des Behandlungsmediums (gepufferte Salzl(cid:246)sung), (cid:151) Dauer der chemischen Behandlung. Testbedingungen c); Bestrahlung: (cid:151) Begr(cid:252)ndung der Wahl der verwendeten Lichtquelle, (cid:151) Charakterisierung der spektralen Energieverteilung der Lichtquelle, (cid:151) Durchlass-/Absorptionsmerkmale des bzw. der verwendeten Filter, (cid:151) Merkmale des Strahlenmessger(cid:228)ts und Einzelheiten der Kalibrierung, (cid:151) Abstand der Lichtquelle vom Testsystem, (cid:151) UVA-Strahlung bei dieser Entfernung, ausgedr(cid:252)ckt in mW/cm2, (cid:151) Dauer der UV/vis-Lichtexposition, (cid:151) UVA-Dosis (Strahlung (cid:215) Zeit), ausgedr(cid:252)ckt in J/cm2, (cid:151) Temperatur der Zeltkulturen w(cid:228)hrend der Bestrahlung und der gleichzeitig im Dunkeln gehaltenen Zell- kulturen. Testbedingungen d); NRU-Test: (cid:151) Zusammensetzung des NR-Mediums, (cid:151) Dauer der NR-Inkubation, (cid:151) Inkubationsbedingungen (CO2-Konzentration, Temperatur, Feuchtigkeit), (cid:151) NR-Extraktionsbedingungen (Extraktionsmittel, Dauer), (cid:151) Wellenl(cid:228)nge, die f(cid:252)r die photometrische Messung der optischen Dichte von NR verwendet wurde, (cid:151) zweite Referenzwellenl(cid:228)nge, sofern verwendet, (cid:151) Inhalt der photometrischen Referenz (Blindprobe), sofern verwendet. Ergebnisse: (cid:151) bei jeder Konzentration der Testchemikalie erhaltene Zell-Viabilit(cid:228)t, ausgedr(cid:252)ckt als Prozentsatz der mitt- leren Viabilit(cid:228)t der Kontrollen, (cid:151) Konzentrations-Wirkungskurven (Konzentration der Testchemikalie vs. relative Zell-Viabilit(cid:228)t), der gleich- zeitig durchgef(cid:252)hrten + UVA- und ﬂ UVA-Versuche, (cid:151) Analyse der Konzentrations-Wirkungskurven: sofern m(cid:246)glich, Angabe der EC50 (+ UVA)- und EC50 (ﬂ UVA)-Werte (berechnet mit Computer oder durch anderweitige Verfahren), (cid:151) Vergleich der zwei in Anwesenheit und in Abwesenheit von UVA/vis-Bestrahlung erhaltenen Konzentrati- ons-Wirkungskurven entweder durch Berechnung des Photo-Irritationsfaktors (PIF) oder durch Berech- nung des Mean Photo Effects (MPE), (cid:151) Klassifizierung des phototoxischen Potentials, (cid:151) Testakzeptanzkriterien (a), Negativkontrolle des Tests: (cid:151) absolute Viabilit(cid:228)t (optische Dichte des NR-Extrakts) von bestrahlten und nicht bestrahlten Zellen, (cid:151) historische Daten zur Negativkontrolle, Mittelwerte und Standardabweichungen Testakzeptanzkriterien (b), Positivkontrolle des Tests: (cid:151) EC50 (+ UVA) und EC50 (ﬂ UVA) und PIF der Positivkontroll-Chemikalie, (cid:151) historische Daten zur Positivkontroll-Chemikalie: EC50 (+ UVA) und EC50 (ﬂ UVA) und PIF, Mittel- werte und Standardabweichungen Diskussion der Ergebnisse Schlu(cid:223)folgerungen L 136/106 DE Amtsblatt der Europ(cid:228)ischen Gemeinschaften 8. 6. 2000 4 LITERATURVERZEICHNIS (1) Spielmann, H. , Balls, M. , D(cid:246)ring, B. , Holzh(cid:252)tter, H. G. , Kalweit, S. , Klecak, G. , L’Eplattenier, H. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Moldenhauer, F. , Moore, L. , Pape, W. , Pfannbecker, U. , Potthast, J. , De Silva, O. , Steiling, W. and Willshaw, A. ( 1994), EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay, Toxicology in Vitro 8, S. 793-796. (2) Anon (1998), Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxi- city), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA 26, S. 7-8. (3) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. W. , Pechovitch, G. , De Silva, O. , Holzh(cid:252)tter, H. G. , Clot- hier, R. , Desolle, P. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Pfannenbecker, U. , Potthast, J. M. , Csato, M. , Sladowski, D. , Steiling, W. and Brantom, P. (1998), EU/COLIPA (cid:130)In vitro phototoxicity(cid:145) validation study, results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test, Toxicology in Vitro 12, S. 305-327. (4) OECD Test Guidelines Programme, ENV/MC/CHEM/TG(96)9: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria of Alternative Toxicological Test Methods, OECD Publications Office, Paris, 1996. (5) Lovell, W. W. (1993), A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential, Toxico- logy in Vitro 7, S. 95-102. (6) Santamaria, L. and Prino, G. (1972), List of the photodynamic substances, Research progress in organic, biological and medicinal chemistry Vol. 3 Part 1, North Holland Publishing Co, Amsterdam, S. XI-XXXV. (7) Spielmann, H. , Lovell, W. W. , H(cid:246)lzle, E. , Johnson, B. E. , Maurer, T. , Miranda, M. A. , Pape, W. J. W. , Sapora, O. and Sladowski, D. (1994), In vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM workshop 2, ATLA 22, S. 314-348. (8) Spikes, J. D. (1989), Photosensitization, The science of photobiology, edited by KC Smith, Plenum Press, New York, 2nd edition, S. 79-110. (9) Borenfreund, E. and Puerner, J. A. (1985), Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption, Toxicology Letters 24, S. 119-124. (10) Lambert L. A, Warner W. G. and Kornhauser A. (1996), Animal models for phototoxicity testing, Derma- totoxicology, edited by FN Marzulli and HI Maibach, published by Taylor & Francis, Washington DC, 5th Edition, S. 515-530. (11) Tyrrell R. M. and Pidoux M (1987), Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytoto- xicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocy- tes, Cancer Research 47, S. 1825-1829. (12) ZEBET/ECVAM/COLIPA, Standard Operating Procedure: Balb/c 3T3 NRU Phototoxicity Test, drafted 23 December 1997 by M. Liebsch and approved 6 March 1998 by the Management Team of the EU/ COLIPA project (cid:130)In Vitro Photoirritation(cid:145). (13) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. W. , De Silva, O. , Holzh(cid:252)tter, H. G. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. and Pfannenbecker (1998), A Study on the Phototoxic Potential of UV Filter Chemicals from Annex VII of the EU Directive 76/768/EEC in the 3T3 NRU In Vitro Phototoxicity Test, ATLA 26, S. 679-708. (14) Holzh(cid:252)tter, H. G. and Quedenau, J. (1995), Mathematical modelling of cellular responses to external signals, Journal of Biological Systems 3, S. 127-138. (15) Holzh(cid:252)tter, H. G. (1997), A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose-response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals, ATLA 25, S. 445-462. 8. 6. 2000 DE Amtsblatt der Europ(cid:228)ischen Gemeinschaften L 136/107 Anlage


title: 2000/331/EC: Commission Decision of 25 April 2000 amending Decision 1999/813/EC laying down special conditions governing imports of fishery products originating in the Socialist Republic of Vietnam (notified under document number C(2000) 1050) (Text with EEA relevance)

eurovoc_concepts:
Vietnam
fishery product
health certificate
import
originating product
veterinary inspection

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text: 13. 5. 2000 EN Official Journal of the European Communities L 114/39 COMMISSION DECISION of 25 April 2000 amending Decision 1999/813/EC laying down special conditions governing imports of fishery products originating in the Socialist Republic of Vietnam (notified under document number C(2000) 1050) (Text with EEA relevance) (2000/331/EC) THE COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES, of Vietnam is amended as follows: 1. Point IV is completed by the following point: ‘7. in addition, where the fishery products are frozen or processed bivalve molluscs: the molluscs were obtained from approved production areas laid down by the Annex to Commission Decision 2000/333/EC (*) laying down special conditions for the import of bivalve molluscs, echinoderms, tunicates and marine gastropods originating in the Socialist Republic of Vietnam and which have been sterilised or heat-trated according to the requirements of Commission Decision 93/25/EC. (*) OJ L 114, 13. 5. 2000, p. 42. ’ 2. The last indent of Point IV is replaced by the following text: is aware of ‘— the undersigned official inspector hereby declares that the provisions of Directive 91/ he 492/EEC, Directive 91/493/EEC, Directive 92/48/EEC, Decision 1999/813/EC and Decision 2000/333/EC. ’ 93/25/EC, Decision Article 2 This Decision is addressed to the Member States. Done at Brussels, 25 April 2000. For the Commission David BYRNE Member of the Commission Having regard to the Treaty establishing the European Community, Having regard to Council Directive 91/493/EEC of 22 July 1991 laying down the health conditions for the production and the placing on the market of fishery products (1), as last amended by Directive 97/79/EC (2), and in particular Article 11(1) thereof, Whereas: (1) (2) (3) (4) (5) Commission Decision 1999/813/EC of 16 November 1999 lays down special conditions governing imports of fishery products originating in the Socialist Republic of Vietnam (3). The Commission has adopted Decision 2000/333/EC laying down special conditions for the import of bivalve molluscs, echinoderms, tunicates and marine gastropods originating in the Socialist Republic of Vietnam (4). The Socialist Republic of Vietnam wishes to export to the Community frozen or processed bivalve molluscs, echinoderms, tunicates and marine gastropods which have been sterilised or heat-treated in accordance with the requirements of Commission Decision 93/25/EEC (5), as amended by Decision 97/275/EC (6). It is therefore necessary to amend the health certification laid down in Annex A to Decision 1999/813/EC. The measures provided for in this Decision are in accordance with the opinion of the Standing Veterinary Committee, HAS ADOPTED THIS DECISION: Article 1 The health certificate laid down in Annex A to the Decision 1999/813/EC and accompanying the consignments of fishery products originating or proceeding from the Socialist Republic (1) OJ L 268, 24. 9. 1991, p. 15. (2) OJ L 24, 30. 1. 1998, p. 31. (3) OJ L 315, 9. 12. 1999, p. 39. (4) See page 42 of this Official Journal. (5) OJ L 16, 25. 1. 1993, p. 22. (6) OJ L 108, 25. 4. 1997, p. 2


title: Decyzja Komisji z dnia 25 kwietnia 2000 r. zmieniająca decyzję 1999/813/WE ustanawiającą specjalne warunki regulujące przywóz produktów rybołówstwa pochodzących z Socjalistycznej Republiki Wietnamu (notyfikowana jako dokument numer C(2000) 1050)Tekst mający znaczenie dla EOG

text: 03/t. 29 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 95 32000D0331 13. 5. 2000 DZIENNIK URZĘDOWY WSPÓLNOT EUROPEJSKICH L 114/39 DECYZJA KOMISJI z dnia 25 kwietnia 2000 r. zmieniająca decyzję 1999/813/WE ustanawiającą specjalne warunki regulujące przywóz produktów rybołówstwa pochodzących z Socjalistycznej Republiki Wietnamu (notyfikowana jako dokument numer C(2000) 1050) (Tekst mający znaczenie dla EOG) (2000/331/WE) KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH, PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DECYZJĘ: uwzględniając Traktat ustanawiający Wspólnotę Europejską, Artykuł 1 Świadectwo zdrowia określone w załączniku A odnośnie do partiom produktów towarzyszące decyzji 1999/813/WE rybołówstwa pochodzących z Socjalistycznej Republiki Wiet- namu lub przemieszczających się przez Socjalistyczną Repu- blikę Wietnamu zmienia się następująco: 1. Punkt IV zostaje uzupełniony przez następujący punkt: „7. dodatkowo, tam gdzie produkty rybołówstwa zostały zamrożone lub przetworzone małże: małże pochodzą z zatwierdzonych obszarów produkcji określonych w Załączniku do decyzji Komisji 2000/333/WE (*) okreś- lającej specjalne warunki przywozu małży, szkarłupni, osłonic i ślimaków morskich pochodzących z Socjalis- tycznej Republiki Wietnamu oraz zostały poddane stery- lizacji lub obróbce cieplnej zgodnie z wymaganiami decyzji Komisji 93/25/WE. ” 2. Ostatnie tiret punktu IV zostaje zastąpione następującym tekstem: „— podpisany poniżej inspektor urzędowy oświadcza, że świadom przepisów dyrektywy 91/492/EWG, jest dyrektywy 92/48/EWG, decyzji 93/25/WE, decyzji 1999/813/WE oraz decyzji 2000/333/WE. ” 91/493/EWG, dyrektywy Niniejsza decyzja jest skierowana do Państw Członkowskich. Artykuł 2 uwzględniając dyrektywę Rady 91/493/EWG z dnia 22 lipca 1991 r. ustanawiającą warunki zdrowotne dotyczące produkcji i wprowadzania do obrotu produktów rybołówstwa (1), ostatnio zmienioną dyrektywą Rady 97/79/WE (2), w szczególności jej art. 11 ust. 1, a także mając na uwadze, co następuje: Decyzja Komisji 1999/813/WE z dnia 16 listopada 1999 r. ustanawia specjalne warunki regulujące przywóz produktów rybołówstwa pochodzących z Socjalistycznej Republiki Wietnamu (3). Komisja przyjęła decyzję 2000/333/WE ustanawiającą specjalne warunki przywozu małży, dotyczące szkarłupni, osłonic i ślimaków morskich pochodzących z Socjalistycznej Republiki Wietnamu (4). Socjalistyczna Republika Wietnamu pragnie eksportować do Wspólnoty mrożone lub przetworzone małże, szkarłupnie, osłonice i ślimaki morskie, które zostały poddane sterylizacji lub obróbce cieplnej zgodnie z wymaganiami decyzji Komisji 93/25/EWG (5), zmie- nionej decyzją 97/275/WE (6). (1) (2) (3) (4) (5) Dlatego też konieczna jest zmiana świadectwa zdrowia określonego w załączniku A do decyzji 1999/813/WE. Sporządzono w Brukseli, 25 kwietnia 2000 r. Środki przewidziane w niniejszej decyzji są zgodne z opinią Stałego Komitetu ds. Weterynaryjnych; W imieniu Komisji David BYRNE Członek Komisji (1) Dz. U. L 268 z 24. 9. 1991, str. 15. (2) Dz. U. L 24 z 30. 1. 1998, str. 31. (3) Dz. U. L 315 z 9. 12. 1999, str. 39. (4) Dz. U. L 114 z 13. 5. 2000, str. 42. (5) Dz. U. L 16 z 25. 1. 1993, str. 22. (6) Dz. U. L 108 z 25. 4. 1997, str. 2. (*) Dz. U. L 114 z 13. 5. 2000, str. 42


title: Reglamento (CE) n° 830/2000 de la Comisión, de 25 de abril de 2000, por el que se modifican los precios representativos y los derechos adicionales de importación de determinados productos del sector del azúcar

eurovoc_concepts:
CCT duties
import
representative price
sugar
sugar product

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text: 26. 4. 2000 ES Diario Oficial de las Comunidades Europeas L 101/29 REGLAMENTO (CE) No 830/2000 DE LA COMISIÓN de 25 de abril de 2000 por el que se modifican los precios representativos y los derechos adicionales de importación de determinados productos del sector del azúcar LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS, Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Europea, Visto el Reglamento (CEE) no 2038/1999 del Consejo, de 13 de septiembre de 1999, por el que se establece la organización común de mercados en el sector del azúcar (1), Visto el Reglamento (CE) no 1423/95 de la Comisión, de 23 de junio de 1995, por el que se establecen las disposiciones de aplicación de los productos del sector del azúcar distintos de la melaza (2), modificado en último lugar por el Reglamento (CE) no 624/98 (3), y, en particular, el párrafo segundo del apartado 2 de su artículo 1 y el apartado 1 de su artículo 3, Considerando lo siguiente: (1) En el Reglamento (CE) no 1441/1999 de la Comisión (4), cuya última modificación la constituye el Reglamento (CE) no 806/2000 (5), se establecen los importes de los precios representativos y los derechos adicionales aplica- bles a la importación de azúcar blanco, azúcar bruto y ciertos jarabes. (2) La aplicación de las normas y modalidades recogidas en el Reglamento (CE) no 1423/95, a los datos de que dispone actualmente la Comisión conduce a modificar con arreglo al anexo del presente Reglamento los importes actualmente vigentes. HA ADOPTADO EL PRESENTE REGLAMENTO: Artículo 1 Los precios representativos y los derechos adicionales aplica- bles a la importación de los productos mencionados en el artículo 1 del Reglamento (CE) no 1423/95 quedarán fijados según se indica en el anexo. El presente Reglamento entrará en vigor el 26 de abril de 2000. Artículo 2 El presente Reglamento será obligatorio en todos sus elementos y directamente aplicable en cada Estado miembro. Hecho en Bruselas, el 25 de abril de 2000. Por la Comisión Franz FISCHLER Miembro de la Comisión (1) DO L 252 de 25. 9. 1999, p. 1. (2) DO L 141 de 24. 6. 1995, p. 16. (3) DO L 85 de 20. 3. 1998, p. 5. (4) DO L 166 de 1. 7. 1999, p. 77. (5) DO L 96 de 18. 4. 2000, p. 42. L 101/30 ES Diario Oficial de las Comunidades Europeas 26. 4. 2000 del Reglamento de la Comisión, de 25 de abril de 2000, por el que se modifican los precios representativos y los derechos adicionales de importación de determinados productos del sector del azúcar blanco, del azúcar bruto y de algunos productos del Código NC 1702 90 99 ANEXO Código NC 1701 11 10 (1) 1701 11 90 (1) 1701 12 10 (1) 1701 12 90 (1) 1701 91 00 (2) 1701 99 10 (2) 1701 99 90 (2) 1702 90 99 (3) Importe del precio representativo por cada 100 kg netos del producto Importe del derecho adicional por cada 100 kg netos del producto (en EUR) 16,46 16,46 16,46 16,46 20,37 20,37 20,37 0,20 8,12 14,42 7,89 13,91 16,15 10,70 10,70 0,44 (1) Importe fijado para la calidad tipo que se define en el artículo 1 del Reglamento (CEE) no 431/68 del Consejo (DO L 89 de 10. 4. 1968, p. 3), modificado. (2) Importe fijado para la calidad tipo que se define en el artículo 1 del Reglamento (CEE) no 793/72 del Consejo (DO L 94 de 21. 4. 1972, p. 1). (3) Importe fijado por cada 1 % de contenido en sacarosa


title: Förslag till rådets förordning om ändring av rådets förordning (EG) nr 603/1999 om införande av en slutgiltig antidumpningstull på import av skördegarn av polypropen med ursprung i Polen, Tjeckiska republiken och Ungern, och om slutgiltigt uttag av den preliminära tullen

eurovoc_concepts:
anti-dumping duty
import
manufactured goods
originating product
plastics

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text: EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION Bryssel den 25. 04. 2000 KOM(2000) 235 slutlig Förslag till RÅDETS FÖRORDNING om ändring av rådets förordning (EG) nr 603/1999 om införande av en slutgiltig antidumpningstull på import av skördegarn av polypropen med ursprung i Polen, Tjeckiska republiken och Ungern, och om slutgiltigt uttag av den preliminära tullen (framlagt av kommissionen) 1. 2. 3. 4. MOTIVERING nr (EG) införde genom förordning Rådet slutgiltiga antidumpningstullar på import av skördegarn av polypropen med ursprung i bland annat Polen; tullarna var emellertid inte tillämpliga på import av skördegarn som tillverkas, till ett importföretag i gemenskapen av WKI Isoliertechnik Spolka z. o. o, från vilket kommissionen, genom beslut 1999/215/EG, godtagit individuellt prisåtagande. exporteras direkt och faktureras 603/1999 ett Företaget har emellertid nu återtagit sitt åtagande till följd av svårigheter när det gäller efterlevnaden av vissa villkor som anges i åtagandet. Bifogade förordning innehåller därför ett förslag till upphävande av den befrielse från antidumpningstullen som detta företag beviljats. Parallellt med denna förordning läggs ett förslag till ett beslut fram om ändring av förteckningen över parter från vilka åtaganden godtagits inom ramen för det ovannämnda förfarandet. 2 Förslag till RÅDETS FÖRORDNING om ändring av rådets förordning (EG) nr 603/1999 om införande av en slutgiltig antidumpningstull på import av skördegarn av polypropen med ursprung i Polen, Tjeckiska republiken och Ungern, och om slutgiltigt uttag av den preliminära tullen EUROPEISKA UNIONENS RÅD HAR ANTAGIT DENNA FÖRORDNING med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen, med beaktande av rådets förordning (EG) nr 384/96 av den 22 december 1995 om i Europeiska skydd mot dumpad import gemenskapen1, senast ändrad genom förordning (EG) nr 905/982 av den 27 april 1998, särskilt artiklarna 8. 9 och 9 i denna, från länder som inte är medlemmar med beaktande av det förslag som lagts fram av kommissionen efter samråd med rådgivande kommittén, och av följande skäl: A. FÖREGÅENDE FÖRFARANDE (1) (2) Efter en undersökning som inleddes genom ett tillkännagivande i Europeiska gemenskapernas officiella tidning3 införde rådet genom förordning (EG) nr 603/19994 slutgiltiga antidumpningstullar på import av skördegarn av polypropen med ursprung i Polen, Tjeckien och Ungern. Inom ramen för denna undersökning godtog kommissionen också genom beslut 1999/215/EG av den 16 mars 19995 ett prisåtagande av bland annat det polska företaget WKI Isoliertechnik Spolka z. o. o (nedan kallat "företaget"). B. ÅTERTAGANDE AV ÅTAGANDE (3) Företaget har emellertid nu återtagit sitt åtagande till följd av svårigheter när det gäller efterlevnaden av vissa villkor som anges i åtagandet. 1 2 3 4 5 EGT L 56, 6. 3. 1996, s. 1. EGT L 128, 30. 4. 1998, s. 18. EGT C 1, 3. 1. 1998, s. 10. EGT L 75, 20. 3. 1999, s. 1. EGT L 75, 20. 3. 1999, s. 34. 3 (4) (5) (6) (7) (8) från Mot bakgrund av detta antidumpningstullen som beviljats detta företag upphävas och slutgiltiga tullar införas i enlighet med artiklarna 8. 9 och 9 i förordning (EG) nr 384/96. återtagande bör därför den befrielse C. SLUTGILTIGA TULLAR Den undersökning som ledde till företagets åtagande avslutades genom ett slutgiltigt fastställande av dumpning och skada genom förordning (EG) nr 603/1999. I enlighet med artikel 8. 9 i förordning (EG) nr 384/96 måste därför den antidumpningstullsats som nu införs för företaget baseras på de uppgifter vilka fastställdes i samband med den undersökning som ledde till åtagandet. I detta avseende anses det med hänsyn till skälen 15, 71 och 75 i förordning (EG) nr 603/1999 lämpligt att den slutgiltiga antidumpningstullsatsen fastställs till nivån 15,7 % av värdet. D. ÄNDRING AV FÖRORDNING (EG) NR 603/1999 Mot bakgrund av ovanstående bör förordning (EG) nr 603/1999 ändras så att företaget avförs från förteckningen över företag vilka omfattas av befrielse från antidumpningstullar på skördegarn av polypropen med ursprung i bland annat i Polen och en slutgiltigt antidumpningstull på 15,7 % införas för detta företag. förordning Kommissionen (cid:1)(cid:1)(cid:1) /EG6 ändrat beslut 1999/215/EG och avfört 2000/ förteckningen över parter från vilka åtaganden har godtagits. parallellt med denna har genom beslut från företaget HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE. Artikel 1 Artikel 1. 2 i förordning (EG) nr 603/1999 skall ersättas med följande: 2. För de produkter som tillverkas av de nedan förtecknade företagen skall följande satser för den slutgiltiga antidumpningstullen tillämpas på nettopriset fritt gemenskapens gräns före tull: Land Företag Tullsats Polen BZLP Bezalin PAT Defalin s. a. Industrial Chemistry Research Institute (%) 17,2 16,3 12,8 Taric- tilläggs- nummer 8450 8569 8578 6 EGT L, [nummer], [datum], s. [sida]. 4 Terplast sp z. o. o. WKI Isoliertechnik Spolka z. o. o. Tjeckien Ungern Alla övriga företag Samtliga företag Samtliga företag 6,1 15,7 20,3 24,8 32,9 8579 A091 8900 8900 8900 Artikel 2 Artikel 2. 2 i förordning (EG) nr 603/1999 skall ersättas med följande: Import inom ramen för gjorda och godtagna åtaganden skall deklareras under 2. följande Taric-tilläggsnummer: Land Företag Tjeckien Juta a. s. Lanex a. s. Ungern Partium ’70 Rt Tiszai Vegyi Kombinat Rt Elso Magyar Kenderfono Rt Artikel 3 Taric- tilläggs- nummer 8596 8580 8581 8582 8583 Denna förordning träder i kraft dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska gemenskapernas officiella tidning. Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla medlemsstater. Utfärdad i Bryssel den På rådets vägnar Ordförande 5


title: Verordening (EG) nr. 830/2000 van de Commissie van 25 april 2000 tot wijziging van de representatieve prijzen en de aanvullende invoerrechten voor bepaalde producten uit de sector suiker

text: 26. 4. 2000 NL Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen L 101/29 VERORDENING (EG) Nr. 830/2000 VAN DE COMMISSIE van 25 april 2000 tot wĳziging van de representatieve prĳzen en de aanvullende invoerrechten voor bepaalde producten uit de sector suiker DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN, Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeen- schap, (2) Gelet op Verordening (EG) nr. 2038/1999 van de Raad van 13 september 1999 houdende een gemeenschappelĳke ordening der markten in de sector suiker (1), Gelet op Verordening (EG) nr. 1423/95 van de Commissie van 23 juni 1995 tot vaststelling van de uitvoeringsbepalingen voor de invoer van producten uit de sector suiker, andere dan melasse (2), laatstelĳk gewĳzigd bĳ Verordening (EG) nr. 624/ 98 (3), en met name op artikel 1, lid 2, tweede alinea, en artikel 3, lid 1, Overwegende hetgeen volgt: 1999 van de Commissie (4), Verordening (EG) nr. 806/2000 (5). laatstelĳk gewĳzigd bĳ De toepassing van de in Verordening (EG) nr. 1423/95 bedoelde voorschriften en bepalingen op de gegevens waarover de Commissie thans beschikt, leidt ertoe de momenteel geldende bedragen te wĳzigen en vast te stellen zoals vermeld in de bĳlage bĳ deze verordening, HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING VASTGESTELD: Artikel 1 De representatieve prĳzen en de aanvullende invoerrechten voor de in artikel 1 van Verordening (EG) nr. 1423/95 bedoelde producten worden vastgesteld zoals aangegeven in de bĳlage. (1) De representatieve prĳzen en de aanvullende invoer- rechten voor witte suiker, ruwe suiker en bepaalde stropen zĳn vastgesteld bĳ Verordening (EG) nr. 1441/ Deze verordening treedt in werking op 26 april 2000. Artikel 2 Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks toepasselĳk in elke lidstaat. Gedaan te Brussel, 25 april 2000. Voor de Commissie Franz FISCHLER Lid van de Commissie (1) PB L 252 van 25. 9. 1999, blz. 1. (2) PB L 141 van 24. 6. 1995, blz. 16. (3) PB L 85 van 20. 3. 1998, blz. 5. (4) PB L 166 van 1. 7. 1999, blz. 77. (5) PB L 96 van 18. 4. 2000, blz. 42. L 101/30 NL Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen 26. 4. 2000 bĳ de verordening van de Commissie van 25 april 2000 tot wĳziging van de representatieve prĳzen en de bedragen van de aanvullende invoerrechten voor witte suiker, ruwe suiker en producten van GN-code 1702 90 99 BĲLAGE GN-code 1701 11 10 (1) 1701 11 90 (1) 1701 12 10 (1) 1701 12 90 (1) 1701 91 00 (2) 1701 99 10 (2) 1701 99 90 (2) 1702 90 99 (3) Representatieve prĳs per 100 kg netto van het betrokken product Aanvullend recht per 100 kg netto van het betrokken product (in EUR) 16,46 16,46 16,46 16,46 20,37 20,37 20,37 0,20 8,12 14,42 7,89 13,91 16,15 10,70 10,70 0,44 (1) Vaststelling voor de standaardkwaliteit als gedefinieerd in artikel 1 van de gewĳzigde Verordening (EEG) nr. 431/68 van de Raad (PB L 89 van 10. 4. 1968, blz. 3). (2) Vaststelling voor de standaardkwaliteit als gedefinieerd in artikel 1 van Verordening (EEG) nr. 793/72 van de Raad (PB L 94 van 21. 4. 1972, blz. 1). (3) Vaststelling per procent sacharose


title: 2000/331/EG: Entscheidung der Kommission vom 25. April 2000 zur Änderung der Entscheidung 1999/813/EG mit Sonderbedingungen für die Einfuhr von Fischereierzeugnissen mit Ursprung in der Sozialistischen Republik Vietnam (Bekanntgegeben unter Aktenzeichen K(2000) 1050) (Text von Bedeutung für den EWR)

text: 13. 5. 2000 DE Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften L 114/39 ENTSCHEIDUNG DER KOMMISSION vom 25. April 2000 zur Änderung der Entscheidung 1999/813/EG mit Sonderbedingungen für die Einfuhr von Fische- reierzeugnissen mit Ursprung in der Sozialistischen Republik Vietnam (Bekanntgegeben unter Aktenzeichen K(2000) 1050) (Text von Bedeutung für den EWR) (2000/331/EG) DIE KOMMISSION DER EUROPÄISCHEN GEMEINSCHAFTEN — HAT FOLGENDE ENTSCHEIDUNG ERLASSEN: Artikel 1 Die Gesundheitsbescheinigung gemäß dem Anhang der Entscheidung 1999/813/EG, welche Sendungen von Fische- reierzeugnissen mit Ursprung oder Herkunft in der Sozialisti- schen Republik Vietnam begleitet, wird wie folgt geändert: 1. Punkt IV wird wie folgt ergänzt: „7. soweit es sich um gefrorene oder verarbeitete Muscheln handelt, aus zugelassenen Erzeugungsgebieten gemäß dem Anhang der Entscheidung 2000/333/EG (*) mit Sonderbedingungen für die Einfuhr von Muscheln, Stachelhäutern, Manteltieren und Meeresschnecken mit Ursprung in der Sozialistischen Republik Vietnam stammen und nach Maßgabe der Entscheidung 93/ 25/EWG sterilisiert oder hitzebehandelt wurden. (*) ABl. L 114 vom 13. 5. 2000, S. 42. “ 2. Der letzte Gedankenstrich von Punkt IV erhält folgende Fassung: „— Der amtliche Inspektor erklärt hiermit, daß ihm die Vorschriften 91/ Richtlinien 493/EWG und 92/48/EWG sowie der Entscheidungen 93/25/EG, 1999/813/EG und 2000/333/EG bekannt sind. “ 91/492/EWG, der Diese Entscheidung ist an alle Mitgliedstaaten gerichtet. Artikel 2 Brüssel, den 25. April 2000 Für die Kommission David BYRNE Mitglied der Kommission gestützt auf den Vertrag zur Gründung der Europäischen Gemeinschaft, gestützt auf die Richtlinie 91/493/EWG des Rates vom 22. Juli 1991 zur Festlegung von Hygienevorschriften für die Erzeu- gung und die Vermarktung von Fischereierzeugnissen (1), zuletzt geändert durch die Richtlinie 97/79/EG (2), insbesondere auf Artikel 11 Absatz 1, in Erwägung nachstehender Gründe: (1) (2) (3) (4) (5) Mit der Entscheidung 1999/813/EG der Kommission vom 16. November 1999 wurden Sonderbedingungen für die Einfuhr von Fischereierzeugnissen mit Ursprung in der Sozialistischen Republik Vietnam (3) festgelegt. Die Kommission hat die Entscheidung 2000/333/EG vom 25. April 2000 mit Sonderbedingungen für die Einfuhr von Muscheln, Stachelhäutern, Manteltieren und Meeresschnecken mit Ursprung in der Sozialistischen Republik Vietnam (4) erlassen. Die Sozialistische Republik Vietnam möchte gefrorene oder verarbeitete Muscheln, Stachelhäuter, Manteltiere und Meeresschnecken in die Gemeinschaft ausführen, die gemäß den Bestimmungen der Entscheidung 93/ 25/EWG der Kommission (5), geändert durch die Entscheidung 97/275/EG (6), sterilisiert oder hitzebehan- delt worden sind. Die Gesundheitsbescheinigung in Anhang A der Entscheidung 1999/813/EG sollte daher entsprechend geändert werden. Die in dieser Entscheidung vorgesehenen Maßnahmen entsprechen der Stellungnahme des Ständigen Veterinär- ausschusses — (1) ABl. L 268 vom 24. 9. 1991, S. 15. (2) ABl. L 24 vom 30. 1. 1998, S. 31. (3) ABl. L 315 vom 9. 12. 1999, S. 39. (4) Siehe Seite 42 dieses Amtsblatts. (5) ABl. L 16 vom 25. 1. 1993, S. 22. (6) ABl. L 108 vom 25. 4. 1997, S. 2