title: A Bizottság 2000/33/EK irányelve (2000. április 25.) a veszélyes anyagok osztályozására, csomagolására és címkézésére vonatkozó törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezések közelítéséről szóló 67/548/EGK tanácsi irányelvnek a műszaki fejlődéshez történő huszonhetedik hozzáigazításárólEGT vonatkozású szöveg.

text: 242 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/25. kötet 32000L0033 2000. 6. 8. AZ EURÓPAI KÖZÖSSÉGEK HIVATALOS LAPJA L 136/90 A BIZOTTSÁG 2000/33/EK IRÁNYELVE (2000. április 25. ) a veszélyes anyagok osztályozására, csomagolására és címkézésére vonatkozó törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezések közelítéséről szóló 67/548/EGK tanácsi irányelvnek a műszaki fejlődéshez történő huszonhetedik hozzáigazításáról (*) (EGT vonatkozású szöveg) AZ EURÓPAI KÖZÖSSÉGEK BIZOTTSÁGA, ELFOGADTA EZT AZ IRÁNYELVET: tekintettel az Európai Közösséget létrehozó szerződésre, tekintettel a legutóbb az 1999/33/EK európai parlamenti és taná- csi irányelvvel (1) módosított, a veszélyes anyagok osztályozására, csomagolására és címkézésére vonatkozó törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezések közelítéséről szóló, 1967. június 27-i 67/548/EGK tanácsi irányelvre (2) és különösen annak 28. cik- kére, A 67/548/EGK irányelv V. melléklete megállapítja a veszé- lyes anyagok és készítmények fizikai-kémiai tulajdonsá- gainak, toxicitásának és ökotoxicitásának meghatározásá- hoz szükséges módszereket. E mellékletet hozzá kell igazítani a műszaki fejlődéshez. rendelkezések A tagállamok a kísérleti és egyéb tudományos célokra fel- használt állatok védelmére vonatkozó törvényi, rendeleti és közigazgatási szóló, 86/609/EGK tanácsi irányelv (3) 7. cikke (2) bekezdésének megfelelően az állatok felhasználásával járó kísérletet nem hajtanak végre, ha ésszerűen és megvalósíthatóan rendel- kezésre áll más, tudományosan kielégítő módszer a kívánt eredmény elérésére. közelítéséről 1. cikk A 67/548/EGK irányelv V. mellékletének B. része ezen irányelvnek az I. és II. mellékletében közölt szövegekkel egészül ki. 2. cikk (1) A tagállamok hatályba léptetik azokat a törvényi, rendeleti és közigazgatási rendelkezéseket, amelyek szükségesek ahhoz, hogy ennek az irányelvnek legkésőbb 2001. október 1-jéig megfelelje- nek. Erről haladéktalanul tájékoztatják a Bizottságot. Amikor a tagállamok elfogadják ezeket az intézkedéseket, azok- ban hivatkozni kell erre az irányelvre, vagy azokhoz hivatalos kihirdetésük alkalmával ilyen hivatkozást kell fűzni. A hivatkozás módját a tagállamok határozzák meg. (2) A tagállamok közlik a Bizottsággal nemzeti joguknak azokat a főbb rendelkezéseit, amelyeket az ezen irányelv által szabályo- zott területen fogadnak el, valamint a Bizottság számára megkül- denek egy táblázatot ezen irányelv rendelkezései és az általuk kibocsátott nemzeti rendelkezések közötti megfelelésről. 3. cikk Ez az irányelv az Európai Közösségek Hivatalos Lapjában való kihirdetését követő harmadik napon lép hatályba. A Bizottság szándékozik olyan alternatív vizsgálati mód- szerekkel kiegészíteni a 67/548/EGK irányelv V. mellékle- tét, amelyek nem járnak állatok felhasználásával, azért hogy ezen alternatív módszereket a kémiai anyagok vizs- gálatához rendelkezésre bocsássák a 64/548/EGK irányelv 3. cikke (1) bekezdésének megfelelően. Ezen irányelv rendelkezései összhangban vannak a veszé- lyes anyagok és készítmények kereskedelme technikai aka- dályainak felszámolásáról szóló irányelveknek a műszaki fejlődéshez történő hozzáigazításával foglalkozó bizottság véleményével, Ennek az irányelvnek a tagállamok a címzettjei. 4. cikk Kelt Brüsszelben, 2000. április 25-én. a Bizottság részéről Margot WALLSTRÖM a Bizottság tagja mivel: (1) (2) (3) (4) (*) A 26. átdolgozás előtt került elfogadásra. (1) HL L 199. , 1999. 7. 30. , 57. o. (2) HL 196. , 1967. 8. 16. , 1. o. (3) HL 358. , 1986. 12. 18. , 1. o. 13/25. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 243 I. MELLÉKLET „B. 40. BŐRKORRÓZIÓ 1. 1. 1. MÓDSZER Bevezetés Az Európai Bizottság Egyesült Kutató Központja (1) (2) (3), az Alternatív Módszerek Validálására alakult Európai Központ (European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM) a bőrkorrózió vizsgálatára két in vitro módszert, traszkután elektromos rezisztencia (transcuteneous electrical resistance, TER) vizsgálatot patkány bőrön és egy emberi bőrt modellanyagként alkalmazó vizsgálatot hagyott jóvá tudományosan igazoltnak. Az ECVAM hitelességét vizsgáló tanulmány kimutatta, hogy mindkét vizsgá- lat megbízhatóan különbséget tudott tenni az ismert bőrkorróziót kiváltó és a nem korrozív anyagok között. Továbbá az emberi bőrmodellen alapuló vizsgálati jelentés alapján megfelelően megkülönböz- tethetők a korrozív hatások mértékei (ismert, kifejezett bőrkorrozív anyagok, R35, és más, bőrkorróziót okozó anyagok, R34) (2). Adott mindkét vizsgálat leírása és eljárási folyamata; annak eldöntése, hogy melyik vizsgálatot kell alkalmazni az adott követelményektől, és attól függ, hogy melyiket részesíti előny- ben a felhasználó. Lásd még az Általános bevezetés B. részét is. 1. 2. Fogalommeghatározások Bőrkorrózió: A vizsgálati anyag alkalmazását követően a bőr szöveteinek irreverzibilis károsodását okozó hatás. 1. 3. Referenciaanyagok Nincs meghatározva, de lásd az 1. 5. 3. 4. és 1. 7. 2. 3. pontot. 1. 4. A vizsgálati módszer elve – TER próba a patkánybőrön A vizsgált anyagot a humánusan megölt fiatal patkányok bőréből vett bőrkorongok epidermális felüle- tén legfeljebb 24 óra időtartamban alkalmazzák. Azokat az anyagokat nevezik korrozívnak, amelyek a stratum korneum integritásának és barrier funkciójának elvesztését okozzák, ez egy bizonyos határérték alatt (5 kΩ) az inherens TER módszerrel mérhető (4) (5). Az irritatív és a nem irritatív anyagok nem csök- kentik a TER-t a határérték alá. Felületaktív és semleges szerves anyagok esetén a vizsgálati eljárásba beé- píthető egy festékmegkötést biztosító lépés [a fogalommeghatározást lásd a (6) szakirodalomban] a kife- jezetten az ilyen vegyi anyagokkal kapcsolatban kapott hamis pozitív eredmények számának csökkentése érdekében (2) (7). 1. 5. A vizsgálati módszer leírása – TER próba a patkánybőrön 1. 5. 1. Kísérleti állatok Fiatal (20-23 napos) patkányok (Wistar vagy ehhez hasonló törzs) szükségesek a bőrkorongok elkészí- téséhez. Kisméretű állatokhoz használt ollóval gondosan eltávolítják a háton és törzsön a szőrt. Az álla- tokat ezt követően óvatosan törölgetve megmossák, miközben a vizsgálatra kerülő felületet belemerítik az antibiotikumot tartalmazó oldatba (amely például sztreptomicint, penicillint, klóramfenikolt és amfo- tericint, baktériumok növekedését gátló koncentrációban). Az első mosást követő harmadik vagy negye- dik napon újra megmossák az állatokat antibiotikummal, és 3 napon belül felhasználják azokat (az álla- toknak nem szabad 31 naposnál idősebbeknek lenniük a bőr előkészítésénél). 1. 5. 2. A bőrkorongok elkészítése Az állatokat kíméletes módszerrel megölik. Ezután eltávolítják az állat hátán a bőrét és lefejtik a felesle- ges zsírt, óvatosan elválasztva a bőrtől. A bőrt egy politetrafluoretilén (PTFE) cső vége fölé helyezik, biz- tosítva, hogy az epidermális felület érintkezzen a csővel. Egy gumi »O« – gyűrűt helyeznek el a csőre, hogy a bőrt szorosan a helyén tartsa, és levágják a felesleges bőrszövetet. A cső és az »O« – gyűrű méretei az 1. ábrán láthatók. Ezután vazelinnal gondosan tömítik a gumi »O« – gyűrűt a PTFE cső végéhez. A csövet egy rugós csipesz tartja a magnézium-szulfát oldatot (154 mM) tartalmazó befogadó kamra belsejében (2. ábra). 1. 5. 3. Vizsgálati eljárás 1. 5. 3. 1. A v i z s g á l t a n y a g a l k a l m a z á s a Folyékony vizsgált anyagokat (150 μl) az epidermális felületre helyeznek a csőben (2. ábra). Szilárd anya- gok vizsgálatakor megfelelő mennyiségű szilárd anyagot kell a bőrdarabra helyezni annak érdekében, hogy biztosítva legyen a bőrszövet teljes felületének befedése. Ezután deionizált vizet (155 μl) öntenek a szilárd anyagra, és óvatosan felrázzák a csöveket. A vizsgálati anyagnak a lehető legjobban érintkeznie kell a bőrrel. Néhány szilárd anyagnál ez a 30 °C-ra való melegítés révén az olvadással, vagy az anyag őrlésével, porításával érhető el. 244 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/25. kötet Három bőrkorongot használnak minden egyes vizsgált anyaghoz. A vizsgált anyagokat 24 órán át alkal- mazzák (lásd még az 1. 5. 3. 4. pontot is). A vizsgált anyagot legfeljebb 30 °C hőmérsékletű, csapvíz sugár- ral mosva eltávolítják, amíg további anyag már nem távolítható el. A csőben megszilárdult vizsgált anyag eltávolítását megkönnyítheti a körülbelül 30 °C hőmérsékletű meleg vízsugárral való mosás. 1. 5. 3. 2. T E R m é r é s e k A TER-t kisfeszültségű, váltakozó áramú mérőeszköz (például AIM 401 vagy 6401 vagy ezzel egyenér- tékű) segítségével mérik. Az elektromos ellenállás mérése előtt csökkentik a bőr felületi feszültségét a bőrszövet befedéséhez elegendő mennyiségű 70 %-os etilalkohollal. Néhány perc után eltávolítják az eti- lalkoholt a cső megfordításával, és ezután hidratálják a szövetet 3 ml magnézium-szulfát oldat (154 mM) hozzáadásával. Ezt követően elhelyezik az ellenállást mérő eszköz elektródáit a bőrkorong mindkét olda- lán az ellenállás (kΩ/bőrdarab) mérésének elvégzésére (2. ábra). Az elektróda méretei és a krokodilcsipe- szek alatti elektródaszakasz hosszúsága az 1. ábrán láthatók. A belső (vastag) elektródacsipesz a PTFE cső tetején található az ellenállás-mérés során, annak érdekében, hogy állandó hosszúságú elektródaszakasz legyen a magnézium-szulfát oldatban. A külső (vékony) elektródát úgy helyezik el a befogó kamra bel- sejében, hogy az a kamra aljáig érjen. A rugós csipesz alja és a PTFE cső alja közötti távolságot állandó értéken tartják (1. ábra), mivel ez a távolság hatással van a kapott rezisztencia értékre. Figyelni kell arra, amennyiben a mért rezisztenciaérték nagyobb, mint 20 kΩ, ezt a bőrkorong epider- mális felületét beborító vizsgált anyag okozhatja. Ennek a bevonatnak az eltávolítása megkísérelhető pél- dául úgy, hogy kesztyűs hüvelykujjal befogják a PTFE csövet és körülbelül 10 másodpercen át rázogatják; a magnéziumszulfát-oldatot eltávolítják és megismétlik a rezisztenciamérést friss magnézium-szulfáttal. Az átlagos TER eredmények elfogadásának feltétele, hogy az egyidejű pozitív és negatív kontrollértékek a módszer elfogadható tartományába essenek. Az itt leírt módszerhez és készülékhez javasolt kontrol- lanyagok és a hozzájuk tartozó, elfogadható ellenállás-tartományok az alábbiak: Kontroll Anyag Pozitív Negatív 10 M sósav (36 %) Desztillált víz Ellenállás-tartomány (kΩ) 0,5-1,0 10-25 1. 5. 3. 3. M ó d o s í t o t t e l j á r á s f e l ü l e t a k t í v é s s e m l e g e s s z e r v e s a n y a g o k v i z s g á l a t á r a Amennyiben a vizsgált anyagok felületaktív anyagok vagy semleges szerves anyagok és TER-értékei leg- feljebb 5 kΩ, festékpenetrációs vizsgálat hajtható végre a szöveteken. Az eljárással eldönthető, hogy az eredmények hamis pozitívak-e (2). 1. 5. 3. 3. 1. Szulforodamin B festék alkalmazása és eltávolítása A vizsgált anyaggal végzett első kezelést követően desztillált vízzel készített 150 μl, 10 tömegszázalékos hígítású szulforodamin B festéket alkalmaznak minden egyes bőrkorong epidermális felületén két órán át. A bőrkorongokat ezután csapvízsugárral, legfeljebb szobahőmérsékleten mossák körülbelül 10 másodpercen át, a felesleges/meg nem tapadt festék eltávolítása érdekében. Minden egyes bőrdarabot gondosan eltávolítanak a PTFE csőről és egy, deionizált vizet (8 ml) tartalmazó ampullába (például, egy 20 ml-es üveg szcintillációs ampulla) helyezik. Az ampullákat óvatosan, 5 percen át rázogatják minden további felesleges/meg nem tapadt festék eltávolítása érdekében. Ezt az öblítési eljárást ezután megismét- lik, majd eltávolítják a bőrkorongokat, és desztillált vízben lévő 5 ml 30 tömegszázalékos nátrium- dodecil-szulfátot (sodium dodecyl sulphate, SDS) tartalmazó ampullába helyezik, és egy éjszakán át 60 °C hőmérsékleten inkubálják. Inkubálást követően valamennyi bőrkorongot eltávolítják, és kidobják azokat, majd a megmaradó oldatot 8 percen át 21 °C hőmérsékleten centrifugálják (relatív centrifugális erő ˜175). A felülúszó 1 ml-ét ezután 1:5 arányban (térfogat/térfogat) (azaz 1 ml + 4 ml) hígítják, desztillált vízzel készített 30 tömegszázalékos SDS-sel. Megmérik az oldat optikai sűrűségét (optical density, OD) körül- belül 565 nm-nél. 1. 5. 3. 3. 2. Festéktartalom kiszámítása Az OD-értékekből kiszámítják a szulforodamin B festéktartalmat korongonként (szulforodamin B festék moláris extinciós együtthatója 565 nm = 8,7 × 104; molekulasúly = 580). Meghatározzák minden egyes bőrkorong szulforodamin B festéktartalmát, és ezután kiszámítják a megismételt mérésekhez szükséges átlagos festéktartalmat. Az átlagos festékmegkötési eredmények abban az esetben fogadhatók el, ha a pár- huzamos kontrollértékek a módszer esetében elfogadható tartományban vannak. Az itt leírt módszer és készülék esetében a kontrollanyagokhoz a javasolt elfogadható festéktartalom-tartományok a következők: 13/25. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 245 Kontroll Anyag Pozitív Negatív 10 M sósav (36 %) Desztillált víz 1. 5. 3. 4. T o v á b b i i n f o r m á c i ó Festéktartalom- tartomány (μg/bőrdarab) 40-100 15-35 A vizsgált anyagok rövidebb időtartamban (például 2 órás időtartamban) is alkalmazhatók a bőrdara- boknál az erősen korrozív anyagok azonosítására. Azonban a hitelesítési vizsgálat szerint a TER- vizsgálatról megállapították, hogy túlbecsülhető több vizsgált vegyi anyag korrozív képessége a bőrda- rabokon való kétórás alkalmazást követően, (2), ugyanakkor, a 24 órás alkalmazás már lehetővé teszi a korrozív és nem korrozív anyagok pontos elkülönítését. Az alkalmazott vizsgálati berendezés sajátosságai és méretei valamint az eljárás módja befolyásolhatják a kapott TER-értékeket. Az 5 kΩ-os korrozív határértéket ezen módszerben leírt különleges készülékkel és eljárással kapott adatokból határozták meg. Ettől eltérő határ- és kontrollértékeket akkor lehet alkal- mazni, ha a vizsgálati körülményeket jelentős mértékben megváltoztatják. Ezért ajánlatos a módszert és az ellenállás határértékét a hitelesítési vizsgálatban használt kémiai anyagokból kiválasztott referenciastandard-anyagok sorozatának vizsgálatával meghatározni (3). 1. 6. A vizsgálati módszer elve – humán bőrpróba A vizsgált anyagot legfeljebb 4 órán át egy háromdimenziós emberi bőr modellre helyezik, amely funkci- onális stratum corneummal rendelkező rekonstruált epidermiszből áll. A korrozív anyagokat azon képes- ségük alapján azonosítják, hogy az előírt expozíciós idő alatt a sejtéletképességet meghatározott határ- érték alá csökkentik (amelyet például MTT- csökkenésvizsgálat segítségével határoznak meg). A vizsgálat alapelve megegyezik azzal a feltételezéssel, hogy azok az anyagok korrozívak, amelyek képesek áthatolni a stratum corneumon (diffúzióval vagy erózió útján), és elegendően citotoxikusak ahhoz, hogy sejtelha- lást okozzanak az alatta lévő sejtrétegekben. 1. 7. A vizsgálati módszer leírása – humán bőrpróba 1. 7. 1. Humán bőrmodellek A humán bőrmodellek különböző forrásokból származhatnak, de meg kell felelniük bizonyos követel- ményeknek. A modellnek rendelkeznie kell működő stratum corneummal, valamint egy alatta lévő élő sejtréteggel. A stratum corneum barrier funkciójának megfelelőnek kell lennie. Ez a modellnek a citoto- xicitással szembeni ellenállásának bizonyításával mutatható be olyan anyagok alkalmazását követően, amelyekről ismert, hogy a sejtek számára citotoxikusak, de amelyek rendes körülmények között nem hatolnak át a stratum corneumon. A meghatározott kísérleti körülmények között a modellnek reprodu- kálható eredményeket kell adnia. A modellben lévő élő sejtek életképességének megfelelően nagynak kell lennie ahhoz, hogy jól megkülön- böztethető legyen a pozitív és negatív kontrollanyag. A negatív kontrollanyagnak való expozíciót köve- tően, a sejtéletképességnek (például az MTT redukcióval, azaz egy OD-értékkel mérve) az adott modell- hez tartozó elfogadható határokon belül kell maradnia. Ehhez hasonlóan, a pozitív kontrollanyagokkal kapott sejtéletképesség-értékeknek (a negatív kontrollanyagokhoz kapott értékekhez viszonyítva) a meg- adott határokon belül kell maradniuk. A legfontosabb, hogy az alkalmazott modell megfeleljen a nemzet- közileg hitelesített szabványnak (2). 1. 7. 2. Vizsgálati eljárás 1. 7. 2. 1. A v i z s g á l t a n y a g a l k a l m a z á s a Folyékony anyagok esetében elegendő vizsgált anyagot kell használni ahhoz, hogy az befedje a bőrfel- ületet (minimum 25 μl/cm2). Szilárd anyagok esetében elegendő anyagot kell felvinni a bőr befedéséhez, és ezután azt meg kell nedvesíteni a bőrrel való megfelelő érintkezés biztosítására; adott esetben a szilárd anyagokat porrá kell őrölni alkalmazásuk előtt. Az alkalmazási módszer legyen megfelelő a legtöbb vegyianyag-típusnál (2). Az expozíciós időszak végén a vizsgált anyagot sóoldattal gondosan le kell mosni a bőr felületéről. 1. 7. 2. 2. A s e j t e k é l e t k é p e s s é g é n e k v i z s g á l a t a Bármilyen kvantitatív, hitelesített módszer használható a sejtek életképességének vizsgálatához. A leg- gyakrabban az MTT-redukciót alkalmazzák, amely bizonyíthatóan pontos és reprodukálható eredmé- nyeket ad a különböző laboratóriumokban (2). A bőrkorongot 0,3 mg/ml-es, 20-28 °C hőmérsékletű MTT oldatba helyezik 3 órás időtartamra. Ezután eltávolítják a kicsapódott kék formazán terméket (oldó- szeres extrahálás), és az OD meghatározása útján megmérik a formazán koncentrációját 545 és 595 nm hullámhossz között. 246 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/25. kötet 1. 7. 2. 3. T o v á b b i i n f o r m á c i ó Az alkalmazott bőrmodell, az expozíciós idő és mosási eljárások, stb. nagymértékben befolyásolják a sejt életképességét. Ajánlott a módszer és az előrejelző modell kalibrálása az ECVAM hitelesítési vizsgálatban használt vegyi anyagokból kiválasztott referenciastandard-anyagok vizsgálatával (3). Döntő fontosságú, hogy az alkalmazott módszer a nemzetközi szabványoknak megfelelően laboratóriumokon belül és labo- ratóriumok között a vegyi anyagok széles körében reprodukálható legyen. Minimális követelményként a módszer feleljen meg a korábban meghatározott tudományos hitelességnek (2), továbbá az ilyen hitel- ességi vizsgálat eredményei egy tudományos folyóiratban jelenjenek meg. 2. ADATOK 2. 1. Eredmények feldolgozása 2. 1. 1. TER-vizsgálat patkánybőrön A vizsgált anyaghoz, pozitív és negatív kontrollokhoz és minden standard referencia vegyi anyaghoz megállapított a párhuzamos/megismételt kísérleteknél kapott adatokat, átlagértékeket és a megállapított osztályozást is. ellenállásértékeket kell megadni, formájában beleértve táblázat (kΩ) 2. 1. 2. Vizsgálat humán bőrmodellen A vizsgált anyaghoz, pozitív és negatív kontrollokhoz és minden standard referencia-vegyianyaghoz kapott OD-értékeket és a számított, százalékos sejtéletképesség-adatokat táblázat formájában kell meg- adni, beleértve a párhuzamos/megismételt kísérleteknél kapott adatokat, átlagértékeket és a megállapí- tott osztályozást. 2. 2. Eredmények értékelése és értelmezése 2. 2. 1. TER-vizsgálat patkánybőrön Amennyiben a vizsgált anyag esetében a mért TER-átlagérték nagyobb, mint 5 kΩ, akkor az anyag nem korrozív hatású. Amennyiben a TER-érték kisebb, mint 5 kΩ, vagy ezzel egyenlő és a vizsgált anyag nem felületaktív, vagy semleges szerves anyag, akkor az korrozív hatású anyag. Azon felületaktív vagy semleges szerves anyagok esetében, amelyek 5 kΩ-nál kisebb vagy ezzel egyenlő TER-értékeket adnak, elvégezhető a festékpenetrációs vizsgálat. Amennyiben a bőrkorong átlagos fes- téktartalma nagyobb vagy egyenlő az ezzel egyidejűleg 36 %-os HCl pozitív kontrollnál megállapított átlagos bőrkorong-festéktartalommal, akkor a vizsgált anyag valódi pozitív, és ebből következően kor- rozív. Amennyiben a bőrkorong átlagos festéktartalma kisebb az ezzel egyidejűleg 36 %-os HCl pozitív kontrollnál mért átlagos bőrdarab-festéktartalomnál, a vizsgált anyag hamis pozitív, és ebből követke- zően nem korrozív az anyag. 2. 2. 2. V i z s g á l a t e m b e r i b ő r m o d e l l e n A negatív kontroll OD-értéke a 100 %-os sejtéletképességet jelenti; ebből következően, az egyes vizsgá- lati mintáknál kapott OD-értékek használhatók a negatív kontrollhoz viszonyított százalékos életképes- ség kiszámításához. A korrozív vizsgált anyagokat a nem korrozív vizsgált anyagoktól megkülönböz- tető (vagy a különböző korrozív anyag osztályokat megkülönböztető), százalékban megállapított sejtéletképesség határértéket egyértelműen meg kell határozni az előrejelző modellben a módszer hite- lesítése előtt, és az azt követő hitelesítési vizsgálatnak igazolnia kell, hogy az érték megfelelő (2). 3. VIZSGÁLATI JELENTÉS Vizsgálati jelentés A vizsgálati jelentésnek legalább az alábbi információkat kell tartalmaznia: Vizsgált anyag: – azonosító adatok, fizikai sajátosság, és adott esetben, a fizikai, kémiai tulajdonságok. Adott esetben hasonló információkat kell megadni a referenciaanyagokról is. Vizsgálati körülmények: – az alkalmazott vizsgálati eljárás részletei, – minden módosítás leírása és indoklása. 13/25. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 247 Eredmények: – a vizsgált anyaghoz, pozitív és negatív kontrollhoz és minden standard referencia-vegyianyaghoz kapott ellenállás-értékek (TER-vizsgálat) vagy százalékban meghatározott sejtéletképesség-értékek (vizsgálat emberi bőrmodellen), beleértve a párhuzamos/megismételt kísérletek során kapott adatokat és a átlagértékeket is, az adatok táblázatba történő összefoglalása, – minden más megfigyelt hatás leírása. Eredmények értékelése. Következtetések. 4. SZAKIRODALOM 1. ECVAM (1998), ECVAM News & Views, ATLA 26, 275-280. oldal. 2. Fentem, J. H. , Archer, G. E. B. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. , Holz- hutter, H-G. & Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in Vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in Vitro, 12, pp. 483-524. oldal. 3. Barratt, M. D. , Brantom, P. G. , Fentem, J. H. , Gerner, I. , Walker, A. P. & Worth, A. P. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. I. Selection and distribu- tion of the test chemicals, Toxocology in Vitro, 12. pp. 471-482. (Barratt, M. D. , Brantom, P. G. , Fen- tem, J. H. , Gerner, I. , Walker, A. P. és Worth, A. P. (1998). 4. Oliver, G. J. A. , Pemberton, M. A. & Rhodes, C. (1986). An in vitro skin corrosivity test – modifications and validation, Food & Chemical Toxicology 24, 507-512. oldal. 5. Botham, P. A. , Hall, T. J. , Dennett, R. , McCall, J. C. , Basketter, D. A. , Whittle, E. , Cheeseman, M. , Esdai- le, D. J. & Garder, J. (1992). The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial, Toxi- cology in Vitro, 6, 191-194. oldal. 6. Worth, A. P. , Fentem, J. H. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. & Liebsch, M. (1998). An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion, ATLA 26, 709- 720. oldal. 7. Botham, P. A. , Chamberlain, M. , Barratt, M. D. , Curren, R. D. , Esdaile, D. J. , Gardner, J. R. , Gordon, V. C. , Hildebrand, B. , Lewis, R. W. , Liebsch, M. , Logemann, P. , Osborne, R. , Ponec, M. , Regnier, J. F. , Steiling, W. , Walker, A. P. & Balls, M. (1995). A prevalidation sudy on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM workshop 6, ATLA 23, 219-255. oldal. 248 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/25. kötet 1. ábra 13/25. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 249 2. ábra ” 250 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/25. kötet II. MELLÉKLET „B. 41. FOTOTOXICITÁS – IN VITRO 3T3 NRU FOTOTOXICITÁS VIZSGÁLAT 1. MÓDSZER 1. 1. Bevezetés A fototoxicitás a bőrnek először bizonyos vegyi anyagok hatásának, majd ezt követően fény hatásának való expozíciója után megállapított, vagy ehhez hasonlóan valamely vegyi anyag szisztematikus alkalmazása után a bőr besugárzásával előidézett toxikus reagálás. Az in vitro 3T3 NRU fototoxicitás vizsgálatból megállapított információk valamely vizsgált anyag poten- ciális fototoxikusságának, azaz azoknak a lehetséges veszélyeknek a létezésének, vagy hiányának megha- tározására szolgálnak, amelyek valamely vizsgált anyagból valamint az ibolyántúli és látható fény hatásá- nak való expozíciójából származhatnak. mivel az in vitro vizsgálat toxikológiai végpontja a kémiai anyag és a fény együttes hatása által előidézett fototoxicitás meghatározása, a vizsgálat azonosíthatja azokat az összetevőket, amelyek in vivo fototoxikusak a szisztematikus alkalmazás és a bőrrel való érintkezés után, valamint azokat az összetevőket, amelyek fotoirritánsokként hatnak a bőrön való helyi alkalmazás után. A in vitro 3T3 NRU fototoxicitás vizsgálatot egy közös EU/COLIPA projekt fejlesztette ki és érvényesítette 1992-től 1997-ig (1), (2), (3) a használatban lévő különböző in vivo vizsgálatok valamilyen hiteles in vitro alternatívájának bevezetésével. 1996-ban egy OECD munkabizottság lépcsőzetes in vitro vizsgálatot java- solt a fototoxicitás értékeléséhez (4). A in vitro 3T3 NRU fototoxicitás vizsgálatból kapott eredményeket összehasonlították az állatokon és embereken kapott in vivo végzett fototoxicitás/fotoirritálás hatásaival, és a vizsgálatról bebizonyosodott, hogy az kiváló előrejelzést ad ezekről a hatásokról. A vizsgálatot nem arra tervezték, hogy előre jelezzen vegyi anyag és a fény együttes hatásából származó káros hatásokat, ilyenek például a fotogenotoxicitás, fotoallergia és fotokarcinogenitás, annak ellenére, hogy számos ilyen hatással rendelkező vegyi anyag pozi- tívan reagál az in vitro 3T3 NRU fototoxicitás vizsgálatban. A vizsgálat nem használható a fototoxicitás erősségének meghatározására. A vegyi anyagok fototoxikus hatásának vizsgálatának egymást követő lépéseit a függelék ismerteti. 1. 2. Fogalommeghatározások Irradiáció: valamely felületre eső ibolyántúli (ultraviolet, UV) vagy látható fény intenzitása W/m2 – ben vagy mW/cm2 – ben mérve. Fénydózis: valamely felületre eső ibolyántúli (UV) vagy látható fénysugárzás mennyisége (= intenzitás × idő) Joul (= W × s) per felület, például J/m2 vagy J/cm2. Ibolyántúli fény hullámsávok: a CIE (Commission Internationale de L’Eclairage) által javasolt megjelölések: UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) és UVC (100-280 nm). Más megjelöléseket is használnak: az UVB és UVA elválasztását gyakran 320 nm-re teszik, és az UVA felosztható UV-A1-re és UV-A2-re az elválás 340 nm-re esik. Sejtéletképesség: valamely sejtpopuláció teljes aktivitását (például a neutrálvörös vitális festék felvételét a sejt lizoszómákba) mérő paraméter, amely a mért végponttól és a használt vizsgálati tervtől függően, korrelá- cióban van a sejtek számával és/vagy életképességével. Relatív sejtéletképesség: a sejt életképessége a teljes vizsgálati eljáráson (vagy + UV vagy -UV) keresztül alkal- mazott, de a vizsgált anyaggal nem kezelt negatív (oldószer) kontrollokkal összefüggésben kifejezve. Előrejelzési modell: valamely toxicitási vizsgálat eredményeinek a toxicitási potenciál előrejelzéssé történő átalakításához használt algoritmus. Ebben a vizsgálati iránymutatóban PIF és MPE használható az in vitro 3T3 NRU fototoxicitás vizsgálat eredményeinek a fototoxicitási potenciál előrejelzéssé történő átalakítá- sához. PIF (photo irritation factor, fotoirritációs tényező): a vizsgált vegyi anyagnak nem citotoxikus UVA/látható fén- nyel való besugárzása hiányában (-UV) és jelenlétében (+ UV) kapott két egyenlően hatékony citotoxikus koncentrációja (EC50) összehasonlításával meghatározott tényező. MPE (mean photo effect, átlagos fényhatás): nem citotoxikus UVA/látható fénnyel való besugárzás hiányában (-UV) és jelenlétében (+ UV) kapott két koncentrációválasz-görbe teljes alakjának matematikai elemzéséből levezetett újszerű mérési eredmény. 13/25. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 251 Fototoxicitás: a bőrnek először bizonyos vegyi anyagok hatásának és ezt követően fény hatásának való expo- zíció után megállapított vagy ehhez hasonlóan, valamely vegyi anyag szisztematikus alkalmazása után a bőr besugárzásával előidézett akut toxikus reagálás. Fotoirritáció: a »fototoxicitás« kifejezésnek egy alfogalma, amely csak azokra a fototoxikus reakciókra vonat- kozik, amelyeket a vegyi anyagok (helyileg vagy orálisan) váltanak ki. Ezek a fototoxikus reakciók mindig nem specifikus sejtkárosodáshoz (nap okozta leégésszerű reakciók) vezetnek. Fotoallergia: szerzett immunológiai válaszkészség, amely a vegyi anyaggal és a fénnyel való első kezeléskor nem jelentkezik, és a bőrreakció egy vagy két hetes indukciós időtartam után mutatható ki. Fotogenotoxicitás: valamilyen genetikai végponttal megfigyelt genotoxikus válasz, amelyet a sejteknek nem genotoxikus ibolyántúli/látható fény dózisnak és nem genotoxikus vegyi anyagnak való expozíció után álla- pítanak meg. Fotókarcinogenitás: fény és vegyi anyag ismételt alkalmazása által előidézett karcinogén hatás. A »foto-ko- karcinogenezis« kifejezést használják, amennyiben valamely vegyi anyag növeli az ibolyántúli fény által elő- idézett tumorképződést. 1. 3. Referenciaanyagok Amellett, hogy klórpromazint minden meghatározáshoz pozitív kontrollként kell használni, egy újonnan kialakított vizsgálat esetén, mint amilyen a 3T3 NRU fototoxicitás próba, ajánlott, hogy olyan referenciaanyag-csoportot használjanak, amelyet a laboratórium közötti mérések összehasonlításakor hasz- nálnak. (1), (3), (13). 1. 4. Kezdeti megfontolások Számos vegyi anyagról megállapították, hogy fototoxikus hatással rendelkeznek (5), (6), (7), (8). Ezek egyet- len közös jellemzőjük az a képesség, hogy a napfény hullámhosszának tartományában képesek fényener- giát abszorbeálni. A fotokémia első törvénye (Grotthaus-Draper törvény) szerint a fotoreakcióhoz megfe- lelő fénymennyiség abszorpciójára van szükség. Ezért ezen vizsgálati iránymutatásnak megfelelő biológiai vizsgálat elvégzése előtt meg kell határozni a vizsgált vegyi anyag UV/látható fény abszorpció spektrumát (például iránymutatásnak megfelelően). Amennyiben a moláris extinkció/abszorpció együttható kisebb, mint 10 liter × mol-1 × cm-1, a vegyi anyagnak nincs fotoreaktív potenciálja, és a káros fotokémiai hatások kiderítéséhez nem szükséges az in vitro 3T3 NRU fototoxicitás, vagy valamilyen más biológiai vizsgálat elvégzése (függelék). az OECD 101 vizsgálati 1. 5. A vizsgálati módszer elve Négy olyan mechanizmust határoztak meg, amellyel valamely (kémiai) kromofór fényabszorpciója foto- toxikus választ eredményezhet (7). Ezek közül mindegyik sejtkárosodást eredményez. Ezért az in vitro 3T3 NRU fototoxicitás vizsgálat a nem citotoxikus UVA/látható fény dózisának való expozíció jelenlétében és hiányában vizsgált valamely vegyi anyag citotoxicitásának összehasonlításán alapul. E vizsgálatban a cito- toxicitást 24 órával a vizsgált vegyi anyaggal kezelés és besugárzás után a vitális neutrálvörös (neutral red, NR) festék felvételének koncentrációfüggő csökkentéseként (9) határozzák meg. Balb/c 3T3 sejteket tenyésztenek 24 órán át egy sejtréteg kialakulásáig. Ezután vizsgált vegyi anyagonként két, 96 lyukú tenyésztőlemezt preinkubálnak 1 órán át, a vegyi anyag 8 különböző koncentrációjával. Ezt követően a két lemez közül az egyiket 5 J/cm2 UVA, nem citotoxikus UVA/látható fénydózis hatásának teszik ki (+ UV kísérlet), míg a másik lemezt sötétben tartják (-UV kísérlet). Ezután mindkét lemezen a kezelő médiumot tápoldatra cserélik ki, és 24 órás inkubálást követően meghatározzák a sejt életképes- ségét 3 órás neutrálvörös felvétel segítségével (neutral red uptake, NRU). Mind a 8 vizsgált koncentráció esetében kiszámítják a relatív sejtéletképességet, a kezeletlen negatív kontrollok százalékaként kifejezve. A fototoxicitási potenciál meghatározása érdekében összehasonlítják a besugárzás jelenlétében (+ UV) és annak hiányában (-UV) kapott koncentrációtól függő válaszokat, rendszerint az EC50 szinten, azaz annál a koncentrációnál, amely kezeletlen kontrollok 50 %-ánál gátolja a sejtéletképességet. 1. 6. Minőségi követelmény Sejtek érzékenysége UVA sugárzásra, történelmi adatok: a sejteket rendszeresen ellenőrizni kell UVA sugarakkal szembeni érzékenység szempontjából. A sejteket az in vitro 3T3 NRU fototoxicitás vizsgálatban használt sejtkoncentrációban a tenyésztőedényekre ráoltják, másnap besugározzák 1-9 J/cm2 közötti UVA dózi- sokkal, és egy nappal később meghatározzák a sejtéletképességet az NRU vizsgálat segítségével. A sejtek abban az esetben felelnek meg a minőségi követelményeknek, ha 5 J/cm2 UVA-val való besugárzás után az életképességük nem kisebb, mint a sötétben tartott kontrollok életképességének 80 %-a. A 9 J/cm2 – es, legnagyobb UVA dózis alkalmazásakor az életképességnek nem szabad kisebbnek lennie a sötétben tartott kontrolloknál meghatározott életképesség 50 %-ánál. Ezt az ellenőrzést körülbelül minden 10. sejtpasszá- lásakor (passage) meg kell ismételni. A negatív kontroll sejtek UVA sugárzással szembeni érzékenysége egyes vizsgálatok esetében: a vizsgálat megfelel a minőségi követelményeknek, ha a + UVA kísérletben 1 % dimetil-szulfoxid (DMSO) vagy 1 % etanol (EtOH) tartalmú vagy ezeket nem tartalmazó negatív kontrollok Earl-féle kiegyensúlyozott sóoldatban (EBSS) lévő sejtjei, a párhuzamos sötét kísérletben (-UVA) vizsgált, az ugyanolyan oldószerben lévő nem besugárzott sejtek életképességének legalább 80 %-át érik el. 252 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/25. kötet Negatív kontrollok életképessége: a negatív kontrollok NR kivonatában mért abszolút optikai sűrűség (OD540 NRU) jelzi, hogy a tenyésztőlemez lyukaiban elhelyezett 1 × 104 sejt a megduplázódott-e a vizsgálat 2 napja során. A vizsgálat kielégíti az elfogadhatósági követelményt, amennyiben a nem kezelt kontroll sejtek átla- gos OD540 NRU értéke ≥ 0,2. Pozitív kontroll: valamely ismert fototoxikus anyagot párhuzamosan vizsgálnak minden in vitro 3T3 NRU fototoxicitás vizsgálattal. Klórpromazint (CPZ) használtak pozitív kontrollként az EU/COLIPA hitelesítés során, és ezért ez a javasolt anyag. Az in vitro 3T3 NRU fototoxicitás vizsgálatban a standard eljárással vizsgált CPZ-hez az alábbi követelményt határozták meg: CPZ besugárzott (+ UVA): EC50 = 0,1- 2,0 μg/ml, CPZ nem besugárzott (-UVA): EC50 = 7,0- 90,0 μg/ml. A fotoirritáció tényezőnek (photo irritation factor, PIF), azaz az EC50 eltolódásnak legalább 6-nak kell lennie. A CPZ helyett párhuzamos pozitív kontrollokként használhatók más olyan ismert fototoxikus vegyi anya- gok is, amelyek megfelelnek a vizsgált, értékelés alatti vegyi anyag kémiai osztályának vagy oldhatósági jel- lemzőinek. Ebben az esetben, a történelmi adatok alapján, az EC50 – értékek tartományát és a PIF vagy MPE (mean photo effect, átlagos fényhatás) értékeket megfelelően kell meghatározni a vizsgálat elfogadási köve- telményeként. 1. 7. A vizsgálati módszer leírása 1. 7. 1. Előkészületek 1. 7. 1. 1. S e j t e k Állandó egér fibroblast sejtsort – Balb/c 3T3, 31-es klón –ATCC-ből vagy ECACC-ből, használtak a hitel- esítési vizsgálat során és ezért ez az ajánlott. Más sejtek vagy sejtsorok is használhatók sikeresen ugyanez- zel a vizsgálati eljárással, amennyiben a tenyésztési körülményeket a sejtek sajátos igényeihez igazítják, de az egyenértékűséget bizonyítani kell. Ellenőrizni kell, hogy a sejtek mikoplazmával nem szennyeződtek-e és csak akkor szabad használni, amennyiben kielégítő az eredménye. mivel a sejtek UVA érzékenysége növekedhet a passzázsok számával, az elérhető legkisebb passzázsszámú – lehetőleg kevesebb, mint 100 – Balb/c 3T3 sejteket kell használni. Fontos a Balb/c 3T3 sejtek UVA érzé- kenységének rendszeres ellenőrzése az ebben az irányelvben leírt minőségellenőrzési eljárásnak megfele- lően. 1. 7. 1. 2. T e n y é s z t ő o l d a t o k é s t e n y é s z t é s i k ö r ü l m é n y e k Megfelelő tápoldatot és inkubálási körülményeket kell alkalmazni a rutin sejtpasszázs és a vizsgálat során. Balb/c 3T3 sejtek esetében ezek 10 %-os újszülött borjúszérummal, 4 mM glutaminnal, penicillinnel és sztreptomicinnel kiegészített DMEM; és 37 °C hőmérsékleten/7,5 %-os CO2 mellett végzett nedvesített inkubálás. Különösen fontos, hogy a sejttenyésztési körülmények a használt sejtekre vagy törzsre történ- elmileg jellemző időtartamot biztosítsanak. 1. 7. 1. 3. T e n y é s z e t e k e l k é s z í t é s e Fagyasztott sejtkultúra állományból vett sejteket megfelelő sűrűséggel ráoltanak a tápoldatra, és másodla- gos tenyészetet hoznak létre legalább egyszer, mielőtt az in vitro 3T3 NRU fototoxicitás vizsgálatban hasz- nálnák őket. A fototoxicitás vizsgálat esetében a sejteket olyan sűrűséggel oltják rá a tenyésztőfolyadékra, hogy a tenyé- szetek ne folyjanak egybe a vizsgálat végén, azaz akkor, amikor a sejt életképességét meghatározzák a sej- tek ráoltása után 48 órával. A 96 lyukú edényekben tenyésztett Balb/c 3T3 sejtek esetében 1 × 104 sejt/lyuk a javasolt sejtsűrűség. Minden egyes vizsgált vegyi anyag esetében a sejtek ráoltása azonosan történik a két, különálló, 96 lyukú lemezen, amelyeket ezután egyidejűleg visznek végig a teljes vizsgálati eljáráson azonos tenyésztési körülmények között, azon időtartam kivételével, amely alatt az edény közül az egyiket besugározzák (+ UVA/vis), a másikat sötétben tartják (-UVA/látható fény). 1. 7. 1. 4. M e t a b o l i k u s a k t i v á l á s mivel egészen a mai napig a metabolizáló rendszerek használata általános követelmény minden in vitro vizs- gálatnál a genotoxikus és karcinogén hatás előrejelzéséhez, nem ismert olyan vegyi anyag, amelyhez meta- bolikus transzformációra lett volna szükség a kémiai anyag in vivo vagy in vitro fototoxin jellegének kimu- tatásához. Így tehát nem tekinthető sem szükségesnek, sem pedig tudományosan indokoltnak, hogy e vizsgálat elvégzéséhez metabolikus rendszert alkalmazzanak. 13/25. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 253 1. 7. 1. 5. V i z s g á l t v e g y i a n y a g / e l ő k é s z í t é s A vizsgált vegyi anyagokat közvetlenül a felhasználás előtt kell előkészíteni, kivéve ha a stabilitási adatok bizonyítják a tárolás elfogadhatóságát. Vörös fény alatti előkészítésre lehet szükség, amikor a gyors foto- degradációval kell számolni. A vizsgált vegyi anyagokat pufferolt sóoldatokban, például Earl-féle kiegyensúlyozott sóoldatban (EBSS) vagy foszfát-pufferes sóoldatban (PBS) kell feloldani, amelyeknek a besugárzás alatti interferencia elkerü- lése érdekében protein komponensektől és fényelnyelő pH-indikátoroktól menteseknek kell lenniük. A vízben rosszul oldható kémiai anyagokat megfelelő oldószerekben kell feloldani a kívánt végleges kon- centráció 100-szorosának megfelelő koncentrációban, majd 1:100-ra kell hígítani a pufferolt sóoldattal. Amennyiben oldószert használnak, annak egy térfogat-százalékos koncentrációjának jelen kell lennie min- den kultúrában, azaz a negatív kontrollokban, valamint a vizsgált vegyi anyag minden koncentrációjában is. A javasolt oldószerek a Dimetil-szulfoxid (DMSO) és etanol (EtOH). Megfelelőek lehetnek más kevéssé cito- xikus oldószerek (például aceton), azonban sajátos tulajdonságaik megállapítása érdekében ezeket gondo- san meg kell vizsgálni, ilyen például a reakciókészség a vizsgált vegyi anyaggal, a fototoxikus hatás elfoj- tása, gyökfogó tulajdonságok. Vortex keverőt és/vagy szonikálást és/vagy 37 °C-ig történő melegítés használható, amennyiben szüksé- ges, az oldódás elősegítésére. 1. 7. 1. 6. U V b e s u g á r z á s / e l ő k é s z í t é s Fényforrás: megfelelő fényforrás és megfelelő szűrő kiválasztása a legfontosabb tényező a fototoxicitás vizs- gálatban. Az UVA és látható fénytartományok rendszerint fotoszenzibilizációt váltanak ki (7), (10) míg az UVB kisebb jelentőségű és közvetlenül nagymértékben citotoxikus, ami 313-tól 280 nm-ig 1 000-szeresére nő. A megfelelő fényforrás kiválasztása követelményeinek magában kell foglalnia azt a lényeges követel- ményt, hogy a fényforrás a vizsgált anyag által abszorbeált hullámhosszúságú fényt bocsássa ki, továbbá hogy az (elfogadható időn belül elérhető) fénydózisnak elegendőnek kell lennie az ismert fotoszenzibiláló anyagok kimutatására. Ezen kívül az alkalmazott hullámhosszúság és dózis nem lehet indokolatlanul káros a vizsgálati rendszerre, amely magában foglalja a hőkibocsátást (infravörös tartomány). A napfény szimulálását szoláris szimulátorokkal optimális fényforrásnak tekintik. A szoláris szimuláto- rokban Xenon ívfényeket és (dotált) higany-fém-halogén ívfényeket használnak. Az utóbbinak megvan az az előnye, hogy kevesebb hőt bocsát ki és olcsóbb, de nem felel meg tökéletesen a napfénynek. Mivel min- den napszimulátor jelentős mennyiségű UVB-t bocsát ki, ezeket megfelelő módon szűrni kell a nagymér- tékben citotoxikus UVB hullámhosszúságok csökkentése érdekében. Az in vitro 3T3 NRU fototoxicitás vizsgálathoz gyakorlatilag UVB-mentes sugárzási spektrumot kell hasz- nálni (UVA:UVB ˜ 1:20). Az in vitro 3T3 NRU fototoxicitás vizsgálat hitelesítésénél használt szűrt szoláris szimulátor spektrális sugárzási eloszlására már közöltek példát (3). Dozimetria: minden egyes fototoxicitás vizsgálat előtt rendszeresen ellenőrizni kell a fény (besugárzás) inten- zitását az erre alkalmas szélessávú UV-mérő segítségével. Az UV-mérőt a fényforráshoz kell kalibrálni. Ellenőrizni kell az UV-mérő teljesítőképességét, és erre a célra egy azonos típusú és kalibrálású második UV-mérő használata ajánlott. Ideális esetben, nagyobb időközönként, egy spektro-radiométert kell hasz- nálni a szűrt fényforrás spektrális sugárzásának mérésére és a szélessávú UV-mérő kalibrációjának ellen- őrzésére, de az ilyen műszerek szakszerű működtetéséhez megfelelően képzett személyekre van szükség. A hitelesítési vizsgálat az 5 J/cm2 (UVA) dózisról megállapította, hogy az nem citotoxikus a Balb/c 3T3 sej- tek számára, és elegendően hatékony ahhoz, hogy még a gyengén fototoxikus kémiai anyagokat is akti- válja. 50 perces időtartamon belül 5 J/cm2 elérése érdekében a besugárzást 1,666 mW/cm2-re kell állítani. Más sejtsor vagy más fényforrás használatakor előfordulhat, hogy kissé adaptálni kell az UVA dózist azzal a feltétellel, hogy az új dózis ne legyen káros a sejtekre, és elegendő legyen a standard fototoxinok észle- lésére. A fény hatásának való expozíció időtartama a következő módon számítható ki: 1. 7. 2. Vizsgálati körülmények A vizsgált kémiai anyag legnagyobb koncentrációja nem haladhatja meg a 100 μg/ml értéket, mivel minden fototoxikus kémiai anyagot regisztráltak ennél kisebb koncentrációk mellett, míg nagyobb koncentráció- knál megnövekszik a hamis pozitívok (túlbecslések) előfordulása (13). A vizsgált anyag pH-jának kielégí- tőnek kell lennie a legnagyobb koncentrációban is. (pH tartomány: 6,5-7,8). 254 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/25. kötet A fény jelenlétében (+ UVA) és hiányában (-UVA) vizsgált kémiai anyag koncentráció-tartományait meg- felelően kell meghatározni az előzetes, tartományt megállapító kísérletekben. Valamely koncentrációsor tartományát és léptékét úgy kell beállítani, hogy a kísérleti adatok megfelelően alátámasszák a koncentrá- ció–válasz görbéket. Mértani koncentrációsorozatot (konstans hígítási tényezővel) kell használni. 1. 7. 3. Vizsgálati eljárás (1) 1. 7. 3. 1. E l s ő n a p A tápoldatban 1 × 105 sejt/ml sejtszuszpenziót kell elkészíteni és csak 100 μl tápoldatot kell adagolni egy 96-lyukú mikrotiter tenyésztőlemez perifériás helyeire (= blankok). A többi lyukba 100 μl 1 × 105 sejt/ml-es sejtszuszpenziót (= 1 × 104 sejt/üreg) kell adagolni. Minden egyes vizsgált anyaghoz két lemezt kell készí- teni: egyet a citotoxicitás meghatározásához (-UVA) és egyet a foto-citotoxicitás meghatározásához (+ UVA). A sejteket 24 órán át kell inkubálni (7,5 % CO2, 37 °C), amíg félig egybefolyó egyréteget nem alkotnak. Ez az inkubálási időtartam lehetővé teszi a sejtfelépülést és adhéziót, valamint az exponenciális szaporodást. 1. 7. 3. 2. M á s o d i k n a p Inkubálást követően el kell távolítani a tápoldatot a sejtekről, és kétszer, üregenként 150 μl EBSS/PBS-sel kell lemosni. A vizsgált anyagot megfelelő koncentrációban tartalmazó vagy csak oldószert (negatív kont- roll) tartalmazó 100 μl EBSS/PBS-t kell használni. A vizsgált vegyi anyag 8 különböző koncentrációját kell használni. A sejteket a vizsgált anyaggal sötétben, 60 percig kell inkubálni (7,5 % CO2. 37 °C). A vizsgálat + UVA részének elvégzéséhez a sejteket szobahőmérsékleten 50 percen át a 96 lyukú lemez fedelén keresztül 1,7 mW/cm2 UVA-val (= 5 J/cm2) kell sugározni. A H2O kondenzálódás megakadályozása érdekében ventillátorral kell szellőztetni. A párhuzamosan vizsgált lemezeket szobahőmérsékleten, egy sötét dobozban 50 percig (= UVA expozíciós idő) kell tartani. A vizsgált oldatot el kell távolítani, és kétszer meg kell mosni 150 μl EBSS/PBS-vel. Az EBSS-t/PBS-t tápol- datra kell kicserélni, és (7,5 % CO2, 37 °C) egy éjszakán át kell inkubálni (18-22 óra). 1. 7. 3. 3. H a r m a d i k n a p Mikroszkópos értékelés A sejteket egy fáziskontraszt-mikroszkóp alatt kell megvizsgálni. A vizsgált anyag citotoxikus hatásai miatt a sejtek morfológiájában bekövetkezett változásokat fel kell jegyezni. Ez az ellenőrzés a kísérleti hibák kizá- rására ajánlott, de ezek a feljegyzések nem használhatók a citotoxicitás és fotoxicitás értékeléséhez. Neutrálvörös felvétel A sejteket 150 μl előmelegített EBSS/PBS-vel kell megmosni. A mosó oldatot óvatos ütögetéssel kell eltá- volítani. 100 μl NR tápoldatot kell hozzáadni, és 37 °C hőmérsékleten inkubálni, 7,5 %-os CO2 párás lég- körében, 3 órán keresztül. Inkubálás után az NR tápoldatot el kell távolítani, és a sejteket 150 μl EBSS/PBS-sel kell megmosni. Az EBSS/PBS-t teljesen le kell önteni, és fel kell itatni. (Másik választható lehetőség: a megfordított lemezt cent- rifugálni kell). Pontosan 150 μl NR deszorbciós oldatot kell hozzáadni (frissen elkészített etanolt/ecetsavat). A mikrotiter lemezt egy mikrotiter lemezrázó készülékben 10 percen át gyorsan kell rázni, amíg az NR homogén oldatot képezve ki nem válik a sejtekből. Az NR kivonat optikai sűrűségét 540 nm-nél egy spektro-fotométerrel kell megmérni, referenciaként blan- kokat használva. Az adatokat megfelelő fájl formátumban (például ASCII) a későbbi elemzéshez el kell menteni. 13/25. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 255 2. 2. 1. ADATOK Adatok minősége és mennyisége Az adatoknak lehetővé kell tenniük az UVA/látható fény jelenlétében illetve hiányában kapott koncentrá- ció–válasz elemzését. Amennyiben citotoxikus hatás jelentkezik, mind a koncentrációtartományt, mind az egyes koncentrációk megállapítását úgy kell elvégezni, hogy lehetővé váljon egy görbe illesztése a kísérleti adatokhoz. Tekintettel arra, hogy a vizsgált anyag a sötét kísérletben esetleg nem lesz citotoxikus (-UVA) egészen a 100 μg/ml-ben meghatározott koncentrációhatárig, de erősen citotoxikussá válik besugárzás hatására (+ UVA), ezért a kísérlet mindkét részében a koncentráció-tartományoknak nagyságrendekkel el kellene térniük egymástól, a megfelelő adatminőség követelményének kielégítése érdekében. Amennyiben nem volt citotoxicitásra utaló jel a kísérlet egyik részében sem (-UVA és + UVA), elegendő az egyes vizsgált koncentrációk közötti nagy különbség, egészen a legnagyobb koncentrációig. Nem követelmény, hogy az egyértelműen pozitív eredmény igazolására a kísérlet megismétlése. Továbbá a nyilvánvaló negatív eredményeket sem kell ellenőrizni, feltéve, hogy a vegyi anyagot megfelelően nagy koncentrációban vizsgálták. Ilyen esetekben elegendő egyetlen fővizsgálat, amit egy vagy több koncentrá- ció tartománymérő előzetes kísérlet támaszt alá. A predikciós modell határhatárértékéhez közeli eredményeket adó vizsgálatokat meg kell ismételni ellen- őrzési céllal. Amennyiben ismételt vizsgálat szükséges, fontos lehet a kísérleti körülmények megváltoztatása egyértelmű eredmény elérése érdekében. Ebben a vizsgálatban kulcskérdés a vizsgált vegyi anyag oldatainak elkészí- tése. Ezért e feltételek megváltoztatása (segédoldószer, őrlés, szonikálás) lehet a leglényegesebb valamely vizsgálat megismétlésében. Más megoldásként megfontolható a sugárzás előtti inkubációs idő változta- tása. Vízzel instabil vegyi anyagok esetében lényeges lehet a rövidebb idő alkalmazása. 2. 2. Az eredmények feldolgozása Amennyiben lehetséges, meghatározzák a vizsgált vegyi anyagnak, a sejtek NRU-felvételét 50 %-ban gátló, (EC50) koncentrációját. Ez a koncentráció-válasz adatokhoz megfelelő nem-lineáris regressziós eljárás (lehe- tőleg Hill függvény vagy logisztikus regresszió) alkalmazásával vagy más illesztési eljárások használatával tehető meg (14). Az EC50 – értéknek a további számításokhoz való felhasználása előtt megfelelően ellen- őrizni kell az illesztés minőségét. Más lehetőségként az EC50 kiszámításához grafikus illesztési módszer használható. Ebben az esetben valószínűségi diagram papír használata ajánlott (x-tengely: log, y-tengely: probit), mivel sok esetben ez után a transzformáció után a koncentráció-válasz összefüggést leíró függ- vény majdnem lineárissá fog transzformálódni. 2. 3. Az eredmények értékelése (Predikciós modellek) 2. 3. 1. Predikciós modell, 1. változat: fotoirritációs-tényező (photo-irritation-factor, PIF) A fény jelenlétében (+ UVA), illetve annak hiányában (-UVA) kapott teljes koncentráció-válasz görbék isme- retében az alábbi képlet segítségével számítható ki a fotóirritációs tényező (PIF): A PIF < 5 azt jelzi, hogy nincs fototoxikus potenciál, míg a PIF ≥ 5 fototoxikus potenciált jelez. Amennyiben valamely vegyi anyag csak + UVA mellett citotoxikus és nem citotoxikus -UVA mellett, a PIF nem számítható ki, annak ellenére, hogy ez egy olyan eredmény, amely fototoxikus potenciált jelez. Ilyen esetekben kiszámítható egy »> PIF«, amennyiben elvégezték a (-UV) citotoxicitás vizsgálatot egészen a leg- nagyobb vizsgálati koncentrációig (Cmax) és ezt az értéket használják az »> PIF« kiszámításához. Amennyiben csak »>PIF« számítható, akkor bármilyen egynél nagyobb érték fototoxikus potenciált jelez. Amennyiben sem a (-UV) sem a (+ UV) melletti EC50 nem számítható ki, mert a vegyi anyag semmilyen citotoxicitást nem mutat egészen a legnagyobb vizsgált koncentrációig, ez azt jelzi, hogy nincs fototoxikus potenciál. Ilyen esetben egy formális »PIF = *1« – et használnak az eredmény jellemzésére: 256 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/25. kötet Amennyiben csak »PIF = *1« számítható, ez azt jelzi, hogy nincs fototoxikus hatás. A b) és c) esetekben az in vitro 3T3 NRU fototoxicitás vizsgálatban elért koncentrációkat gondosan kell figyelembe venni a fototoxicitási potenciál előrejelzésénél. 2. 3. 2. Predikciós modell, 2. változat: átlagos fényhatás (mean-photo effect, MPE) Más lehetőségként a fototoxikus hatás előrejelzésére szolgáló modellnek egy újszerű változata alkalmaz- ható, amelyet az EU/COLIPA hitelesítési vizsgálatának adatait felhasználva fejlesztettek ki, és amit »vakon« vizsgáltak, amikor egy későbbi vizsgálatban az UV-szűrők vegyi anyagainak az in vitro fototoxicitásá tanul- mányozták (13). Ez a modell meghaladja a PIF modell korlátját azokban az esetekben, ahol nem állapít- ható meg az EC50. A modell a »átlagos fényhatást« (MPE) használja, amely a teljes koncentráció-válasz gör- bék összehasonlításán alapuló mérték. Az MPE modell alkalmazásához egy speciális számítógép szoftvert fejlesztettek ki a Humboldt Egyetemen (Berlin), ami ingyen beszerezhetők. 2. 4. Az eredmények értelmezése Az in vitro 3T3 NRU fototoxicitás vizsgálat pozitív eredménye (PIF ≥ 5 vagy MPE ≥ 0,1) azt jelzi, hogy a vizsgált anyag fototoxikus hatással rendelkezik. Amennyiben ez az eredmény 10 μg/ml alatti koncentrá- cióknál jelentkezik, a vizsgált vegyi anyag valószínűleg fototoxinként is viselkedik különböző in vivo expo- zíciós körülmények között. Amennyiben pozitív eredményt csak a 100 μg/ml-es legnagyobb vizsgált kon- centráció alkalmazásával kapnak, további megfontolásokra lehet szükség a veszély vagy fototoxikus hatás értékeléséhez. Ezek közé tartozhatnak a vegyi anyagnak a bőrbe való behatolásával, abszorpciójával és eset- leges felhalmozódásával kapcsolatos adatok vagy a vegyi anyag vizsgálata egy ellenőrző alternatív vizsgá- latban, például in vitro emberi bőrmodell használatával. Az in vitro 3T3 NRU fototoxicitási vizsgálat negatív eredménye (PIF < 5 vagy MPE < 0,1) azt jelzi, hogy a vizsgált anyag az alkalmazott körülmények között nem volt fototoxikus az emlős sejtkultúrákban. Azok- ban az esetekben, ahol a kémiai anyag a 100 μg/ml-es legnagyobb koncentrációig volt vizsgálható a nega- tív eredmény azt jelzi, hogy a kémiai anyagnak nincs fototoxikus potenciálja, és in vivo fototoxikus. Azok- ban az esetekben, ahol azonos koncentráció-válasz eredményeket (EC50 +UV és EC50 -UV) kaptak alacsonyabb koncentrációk mellett, az adatok értelmezése azonos lehet. Ezzel ellentétben, ha a vizsgálat nem bizonyított semmilyen toxicitást (+ UV és -UV), és ha a vízben oldhatóság 100μg/ml-nél kisebb érté- kekre korlátozta a koncentrációkat, megkérdőjelezhető a vizsgált anyag összeférhetősége a vizsgálattal, és meg kell fontolni további – meggyőző eredményt hozó – vizsgálat alkalmazását (például egy in vitro bőr- modell, ex vivo bőrmodell vagy in vivo vizsgálat alkalmazásával). 3. VIZSGÁLATI JELENTÉS Vizsgálati jelentés A vizsgálati jelentésnek az alábbi információkat kell tartalmaznia: Vizsgált anyag: – – – – jellemző adatok és CAS szám, amennyiben ismert, fizikai tulajdonságok és tisztaság, a vizsgálat végrehajtása szempontjából lényeges fizikai-kémiai tulajdonságok, stabilitás és fotostabilitás, amennyiben ismert. Oldószer: – – – az oldószer kiválasztásának indoklása, a vizsgált vegyi anyag oldhatósága ezen oldószerben, a kezeléshez használt tápoldat (EBSS vagy PBS) százalékos oldószertartalma. Sejtek: – sejtek típusa és származása, – mikoplazma hiánya, – – sejtpasszázsok száma, amennyiben ismert, sejtek UVA-érzékenysége az in vitro 3T3 NRU fotótoxicitás vizsgálatban használt sugárzó berendezés- sel meghatározva. Vizsgálati körülmények (a) – inkubálás kezelés előtt és után: – – – tápoldat típusa és összetétele, inkubációs körülmények (CO2 – koncentráció, hőmérséklet, páratartalom), inkubálás időtartama (előkezelés, utókezelés). 13/25. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 257 Vizsgálati körülmények (b) – kezelés a vegyi anyaggal: – mind az UV/látható fény jelenlétében, mind annak hiányában használt koncentrációk kiválasztásának ésszerű magyarázata, – – – a vizsgált vegyi anyag korlátozott oldhatóságának és a citotoxicitás hiánya esetében a legnagyobb vizs- gált koncentráció indoklása, kezelő oldat (pufferelt sóoldat) típusa és összetétele, vegyi anyag kezelésének időtartama. Vizsgálati körülmények (c) – besugárzás: – – – – – a használt fényforrás kiválasztásának indoklása, a fényforrás spektrális sugárzási jellemzői, a használt szűrő(k) transzmissziós/abszorpciós jellemzője (jellemzői), a radióméter jellemzői és kalibráció részletei, a fényforrás távolsága a vizsgálati rendszertől, – UVA besugárzás értéke ennél a távolságnál, mW/cm2 – ben kifejezve, – UV/látható fény hatásának való expozíció időtartama, – UVA dózis (besugárzás × idő), J/cm2 – ben kifejezve, – a besugárzás során a sejtkultúrákhoz és az ezzel egyidejűleg sötétben tartott sejtkultúrákhoz alkalma- zott hőmérséklet, Vizsgálati körülmények (d) – NRU vizsgálat: – az NR tápoldat összetétele, – NR inkubáció időtartama, – inkubálási feltételek (CO2 koncentráció, hőmérséklet, páratartalom) – NR extrakció körülményei (extrahálószer, időtartam), – NR optikai denzitásának spektrofotometriás leolvasásához használt hullámhosszúság, – második hullámhosszúság (referencia), amennyiben használtak ilyet, – spektrofotométer blank térfogata, amennyiben használtak ilyet, Eredmények: – – – – – – a vizsgált anyag minden egyes koncentrációjánál kapott sejtéletképesség, a kontrollok átlag életképes- ségének százalékában kifejezve, a párhuzamos + UVA és -UVA kísérletekben kapott koncentráció–válasz görbék (vizsgált anyag koncentrációja a relatív sejtéletképesség függvényében), a koncentráció – válasz görbék adatainak elemzése: amennyiben lehetséges, az EC50 (+ UVA) és EC50 (-UVA) számítógéppel/egyéb módon történő kiszámítása, az UVA/látható fény besugárzás mellett vagy hiányában, a fotóirritáció tényező (PIF), vagy a átlagos fényhatás (MPE) kiszámításával kapott két koncentráció – válasz görbe összehasonlítása, fototoxikus hatás osztályozása, vizsgálat elfogadhatóságának követelménye (a) – párhuzamos negatív kontroll: – besugárzott és nem besugárzott sejtek abszolút életképessége (NR kivonat optikai sűrűsége), – negatív kontroll történelmi adatai, átlagérték és standard deviancia, – vizsgálat elfogadásának követelményei (b) – párhuzamos pozitív kontroll: – pozitív kontroll anyag EC50 (+ UVA) és EC50 (-UVA) és PIF értékei, – pozitív kontroll anyag történelmi adatai: EC50 (+ UVA) és EC50 (-UVA) és PIF, átlagérték és standard deviáció. Az eredmények értékelése. Következtetések. 258 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 13/25. kötet 4. SZAKIRODALOM (1) Spielmann, H. , Balls, M. , Döring, B. , Holzhütter, H. G. , Kalweit, S. , Klecak, G. , L’Eplattenier, H. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Moldenhauer, F. , Moore, L. , Pape, W. , Pfannbecker, U. , Potthast, J. , De Silva, O. , Steiling, W. and Willshaw, A. (1994), EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay, Toxicology In Vitro 8, 793-796. oldal (2) Anon (1998), Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for photo- toxicity), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November, 1997, ATI. A 26, 7- 8. oldal (3) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. W. , Pechovitch, G. , De Silva, O. , Holzhütter, H. G. , Clothier, R. , Desolle, P. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Pfannenbecker, U. , Pot- thast, J. M. , Csato, M. , Sladowski, D. , Steiling, W. and Brantom, P. (1998). EU/COLIPA »In Vitro pho- totoxicity« validation study, results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test, Toxicology In Vitro 12, 305-327. oldal (4) OECD Test Guidelines Programme, ENV/MC/CHEM/TG(96)9: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria of Alternative Toxicological Test Methods, OECD Publications Office, Paris, 1996 (5) (6) (7) Lovell W. W. (1993), A scheme for in vitro screening of substanccs for photoallergenic potential, Toxi- cology in Vitro 7, 95-102. oldal Santamaria, L. and Prino, G. (1972), I. ist of the photodynamic substances, Research progress in organic, biological and medicinal chemistry Vol. 3 Part 1, North Holland Publishing Co, Amsterdam, XI-XXXV. oldal Spielmann, H. , Lovell, W. W. , Hölzle, E. , Johnson, B. E. , Maurer, T. , Miranda, M. A. , Pape, W. J. W. , Sapora, O. and Sladowski, D. (1994), In Vitro phototoxicity testing: The report and recommendations of ECVAM workshop 2, ATLA 22, 314-348. oldal (8) Spikes, J. D. (1989), Photosensitization, The sciencc of photobiology, edited by KC Smith, Plenum Press, New York, 2. kiadás, 79-110. oldal (9) Borenfreund, E. and Puerner, J. A. (1985), Toxicity determination in vitro by morphological alterations and neutral red absorption, Toxicology Letters 24, 119-124. oldal (10) Lambert L. A, Warner W. G. and Kornhauser A. (1996), Animal models for phototoxicity testing, Dermatotoxicology, edited by FN Marzulli and HI Maibach, published by Taylor & Francis, Washington DC, 5. kiadás, 515-530. oldal (11) Tyrrell R. M. and Pidoux M (1987), Action spectra for human skin cells: estimates of the relative cytotoxicity of the middle ultraviolet, near ultraviolet and violet regions of sunlight on epidermal keratinocytes, Cancer Research 47, 1825-1829. oldal (12) ZEBET/ECVAM/COLIPA, Standard Operating Procedure: Balb/c 3T3 NRU Phototoxicity Test, drafted 23 December 1997 by M. Liebsch and approved 6 March 1998 by the Management Team of the EU/COLIPA project »In Vitro Photoirritation«. (13) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Papc, W. J. W. , De Silva, O. , Holzhütter, H. G. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. and Pfannenbecker (1998), A Study on the Phototoxic Potential of UV Filter Chemicals from Annex VII of the EU Directive 76/768/EEC in the 3T3 NRU In Vitro Phototo- xicity Test, ATLA 26, 679-708. oldal (14) Holzhütter, H. G. and Quedenau, J. (1995), Mathematical modelling of cellular responses to external signals, Journal of Biological Systems 3, 127-138. oldal (15) Holzhütter, H. G. (1997), A general measure of in vitro phototoxicity derived from pairs of dose- response curves and its use for predicting the in vivo phototoxicity of chemicals, ATLA 25, 445-462. oldal 13/25. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 259 Függelék (1) További részletek a 12. szakirodalomban találhatók. ”


title: Proposta di regolamento del Consiglio che modifica il regolamento (CE) n. 603/1999 del Consiglio, che istituisce un dazio antidumping definitivo sulle importazioni di spago per legare, di polipropilene, originario della Polonia, della Repubblica ceca e dell'Ungheria e che sancisce la riscossione definitiva del dazio provvisorio istituito

eurovoc_concepts:
anti-dumping duty
import
manufactured goods
originating product
plastics

formats: html pdf

text: COMMISSIONE DELLE COMUNITÀ EUROPEE Bruxelles, 25. 04. 2000 COM(2000) 235 definitivo Proposta di REGOLAMENTO DEL CONSIGLIO che modifica il regolamento (CE) n. 603/1999 del Consiglio, che istituisce un dazio antidumping definitivo sulle importazioni di spago per legare, di polipropilene, originario della Polonia, della Repubblica ceca e dell'Ungheria e che sancisce la riscossione definitiva del dazio provvisorio istituito (presentata dalla Commissione) RELAZIONE 1. 2. 3. 4. Con regolamento (CE) n. 603/1999, il Consiglio ha istituito dazi antidumping definitivi sulle importazioni di spago per legare, di polipropilene, originarie tranne quando il prodotto venga fabbricato e tra l'altro della Polonia, direttamente esportato e fatturato a una società importatrice della Comunità dalla WKI Isoliertechnik Spolka z. o. o, il cui impegno sui prezzi è stato accettato dalla Commissione con decisione 1999/215/CE. Ora, tuttavia, la società ha revocato il proprio impegno avendo difficoltà ad osservare alcune condizioni stabilite nel medesimp. Il regolamento accluso alla presente contiene pertanto una proposta volta a revocare l'esenzione dai dazi antidumping concessa a tale società. Parallelamente al presente documento, viene presentata una proposta di decisione che modifica l'elenco delle parti i cui impegni sono stati accettati nell'ambito del suddetto procedimento. 2 Proposta di REGOLAMENTO DEL CONSIGLIO che modifica il regolamento (CE) n. 603/1999 del Consiglio, che istituisce un dazio antidumping definitivo sulle importazioni di spago per legare, di polipropilene, originario della Polonia, della Repubblica ceca e dell'Ungheria e che sancisce la riscossione definitiva del dazio provvisorio istituito IL CONSIGLIO DELL'UNIONE EUROPEA, visto il trattato che istituisce la Comunità europea, visto il regolamento (CE) n. 384/96 del Consiglio, del 22 dicembre 1995, relativo alla difesa contro le importazioni oggetto di dumping da parte di paesi non membri della Comunità europea1, modificato da ultimo dal regolamento (CE) n. 905/98 del 27 aprile 19982, in particolare l'articolo 8, paragrafo 9 e l'articolo 9, vista la proposta presentata dalla Commissione dopo aver sentito il comitato consultivo, considerando quanto segue: A. PROCEDIMENTO PRECEDENTE (1) (2) A seguito di un'inchiesta avviata attraverso un avviso pubblicato sulla Gazzetta ufficiale delle Comunità europee3, il Consiglio, con regolamento (CE) n. 603/19994, ha istituito un dazio antidumping definitivo sulle importazioni di spago per legare, di polipropilene, originario della Polonia, della Repubblica ceca e dell'Ungheria. Nell'ambito della medesima inchiesta, la Commissione, con decisione 1999/215/CE, del 16 marzo 19995, ha accettato un impegno sui prezzi offerto, tra l'altro, dalla società polacca WKI Isoliertechnik Spolka z. o. o (in appresso denominata "la società"). B. REVOCA DELL'IMPEGNO (3) Ora, tuttavia, osservare alcune condizioni stabilite nel medesimo. la società ha revocato il suo impegno avendo difficoltà ad 1 2 3 4 5 GU L 56 del 6. 3. 1996, pag. 1. GU L 128 del 30. 4. 1998, pag. 18. GU C 1 del 3. 1. 1998, pag. 10. GU L 75 del 20. 3. 1999, pag. 1 GU L 75 del 20. 3. 1999, pag. 34 3 (4) (5) (6) (7) (8) tale revoca, occorre pertanto revocare l'esenzione dai dazi Alla luce di antidumping concessa a tale società e istituire dazi definitivi ai sensi dell'articolo 8, paragrafo 9 e dell'articolo 9 del regolamento (CE) n. 384/96. C. DAZI DEFINITIVI L'inchiesta nel cui ambito è stato accettato l'impegno si è conclusa con l'accertamento definitivo del dumping e del pregiudizio con regolamento (CE) n. 603/1999. In conformità dell'articolo 8, paragrafo 9 del regolamento (CE) n. 384/96, l'aliquota del dazio antidumping da istituire nei confronti della società deve basarsi sui fatti accertati nel corso dell'inchiesta nel cui ambito è stato accettato l'impegno. A questo proposito, tenuto conto dei considerandi 15, 71 e 75 del regolamento (CE) n. 603/1999, si ritiene opportuno fissare l'aliquota del dazio antidumping definitivo a 15,7% ad valorem. D. MODIFICA DEL REGOLAMENTO (CE) n. 603/1999 regolamento (CE) Alla luce di quanto precede, occorre modificare il n. 603/1999 per eliminare il nome della società dall'elenco delle società che beneficiano di un'esenzione dai dazi antidumping sulle importazioni di spago per legare di polipropilene, originarie, tra l'altro, della Polonia, ed istituire un dazio antidumping del 15,7% nei confronti di tale società. Parallelamente al presente regolamento, con decisione 2000/. /CE6, la Commissione ha modificato la decisione 1999/215/CE, eliminando il nome della società dall'elenco delle parti i cui impegni erano stati accettati, HA ADOTTATO IL PRESENTE REGOLAMENTO: Articolo 1 L'articolo 1, paragrafo 2 del regolamento (CE) n. 603/1999 è sostituito dal testo seguente: 2. Le aliquote dei dazi antidumping applicabili ai prezzi netti, franco frontiera comunitaria, dazio non corrisposto, dei prodotti fabbricati dalle imprese sotto elencate sono le seguenti: Paese Società Polonia BZLP Bezalin PAT Defalin s. a. Aliquota del dazio % Codice addizionale TARIC 17,2 16,3 8450 8569 6 GU L. del. , pag. 4 Industrial Chemistry Research Institute Terplast sp z. o. o. WKI Isoliertechnik Spolka z. o. o. Tutte le altre società Repubblica ceca Tutte le società Ungheria Tutte le società 12,8 6,1 15,7 20,3 24,8 32,9 8578 8579 A091 8900 8900 8900 Articolo 2 L'articolo 2, paragrafo 2 del regolamento (CE) n. 603/1999, è sostituito dal testo seguente: Le importazioni effettuate nell'ambito degli 2. vengono dichiarate nei seguenti codici addizionali TARIC: impegni offerti e accettati Paese Società Repubblica ceca Juta a. s. Lanex a. s. Ungheria Partium ’70 Rt Tiszai Vegyi Kombinat Rt Elso Magyar Kenderfono Rt Articolo 3 Codice addizionale TARIC 8596 8580 8581 8582 8583 Il presente regolamento entra in vigore il giorno successivo alla pubblicazione sulla Gazzetta ufficiale delle Comunità europee. Il presente regolamento è obbligatorio in tutti i suoi elementi e direttamente applicabile in ciascuno degli Stati membri. Fatto a Bruxelles, Per il Consiglio Il presidente 5