title: Directive 2000/33/CE de la Commission du 25 avril 2000 portant vingt-septième adaptation au progrès technique de la directive 67/548/CEE du Conseil concernant le rapprochement des dispositions législatives, réglementaires et administratives relatives à la classification, l'emballage et l'étiquetage des substances dangereuses (Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE.)

eurovoc_concepts:
analytical chemistry
approximation of laws
chemical product
cytology
toxicology

text: L 136/90 FR Journal officiel des CommunautØs europØennes 8. 6. 2000 DIRECTIVE 2000/33/CE DE LA COMMISSION du 25 avril 2000 portant vingt-septiŁme adaptation au progrŁs technique de la directive 67/548/CEE du Conseil le rapprochement des dispositions lØgislatives, rØglementaires et administratives concernant relatives (cid:224) la classification, l’emballage et l’Øtiquetage des substances dangereuses (*) (Texte prØsentant de l’intØrŒt pour l’EEE) LA COMMISSION DES COMMUNAUT(cid:201)S EUROP(cid:201)ENNES, A ARR˚T(cid:201) LA PR(cid:201)SENTE DIRECTIVE: vu le traitØ instituant la CommunautØ europØenne, Article premier vu la directive 67/548/CEE du Conseil du 27 juin 1967 concernant lØgislatives, le rapprochement des dispositions rØglementaires et administratives relatives (cid:224) la classification, l’emballage et l’Øtiquetage des substances dangereuses (1), modi- fiØe en dernier lieu par la directive 1999/33/CE du Parlement europØen et du Conseil (2), et notamment son article 28, considØrant ce qui suit: (1) (2) (3) (4) L’annexe V de la directive 67/548/CEE dØfinit les mØtho- des permettant de dØterminer les propriØtØs physico-chi- miques, la toxicitØ et l’ØcotoxicitØ des substances et prØpa- rations. L’adaptation au progrŁs technique de cette annexe est nØcessaire. L’article 7, paragraphe 2, de la directive 86/609/CEE du Conseil concernant le rapprochement des dispositions lØgislatives, rØglementaires et administratives des (cid:201)tats membres relatives (cid:224) la protection des animaux utilisØs (cid:224) des fins expØrimentales ou (cid:224) d’autres fins scientifiques (3) dispose «qu’il ne sera pas effectuØ d’expØrience s’il existe une possibilitØ raisonnable et pratique d’avoir recours (cid:224) une autre mØthode scientifiquement acceptable et n’impli- quant pas l’utilisation d’un animal pour obtenir le rØsultat recherchØ». La Commission entend introduire (cid:224) l’annexe V de la direc- tive 67/548/CEE des mØthodes d’essais de remplacement qui ne nØcessitent pas d’utiliser un animal afin que ces mØthodes soient disponibles pour tester les substances chimiques aux termes de l’article 3, paragraphe 1, de la directive 67/548/CEE. Les mesures prØvues par la prØsente directive sont confor- mes (cid:224) l’avis du comitØ pour l’adaptation au progrŁs tech- nique des directives visant (cid:224) l’Ølimination des entraves techniques aux Øchanges dans le secteur des substances et prØparations dangereuses, Les textes des annexes I et II de la prØsente directive sont ajou- tØs (cid:224) la partie B de l’annexe V de la directive 67/548/CEE. Article 2 1. Les (cid:201)tats membres mettent en vigueur les dispositions lØgislatives, rØglementaires et administratives nØcessaires pour se conformer (cid:224) la prØsente directive au plus tard le 1er octobre 2001. Ils en informent immØdiatement la Commission. Lorsque les (cid:201)tats membres adoptent ces dispositions, celles-ci contiennent une rØfØrence (cid:224) la prØsente directive ou sont accompagnØes d’une telle rØfØrence lors de leur publication officielle. Les modalitØs de cette rØfØrence sont adoptØes par les (cid:201)tats membres. Les (cid:201)tats membres communiquent (cid:224) la Commission les 2. principales dispositions lØgislatives de droit national qu’ils adoptent dans le domaine concernØ par la prØsente directive et un tableau de correspondance entre la prØsente directive et les dispositions nationales adoptØes. Article 3 La prØsente directive entre en vigueur le troisiŁme jour suivant celui de sa publication au Journal officiel des CommunautØs euro- pØennes. Article 4 Les (cid:201)tats membres sont destinataires de la prØsente directive. Fait (cid:224) Bruxelles, le 25 avril 2000. Par la Commission Margot WALLSTR(cid:214)M Membre de la Commission (*) AdoptØe avant la vingt sixiŁme adaptation. (1) JO 196 du 16. 8. 1967, p. 1. (2) JO L 199 du 30. 7. 1999, p. 57. (3) JO L 358 du 18. 12. 1986, p. 1. 8. 6. 2000 FR Journal officiel des CommunautØs europØennes L 136/91 ANNEXE I «B. 40. CORROSION CUTAN(cid:201)E 1. M(cid:201)THODE 1. 1. Introduction Le Centre europØen pour la validation de mØthodes alternatives (CEVMA ou ECVAM) du Centre commun de recherche de la Commission europØenne a reconnu la validitØ scientifique de deux essais in vitro de corrosi- vitØ cutanØe, l’essai de rØsistance Ølectrique transcutanØe (RET) sur peau de rat et un essai utilisant un modŁle de peau humaine (1) (2) (3). L’Øtude de validation du CEVMA a montrØ que les deux essais permettent de faire la distinction de maniŁre fiable entre substances corrosives et non corrosives pour la peau. En outre, le protocole d’essai basØ sur un modŁle de peau humaine a permis de faire une distinction correcte entre les dif- fØrents degrØs de corrosivitØ (effet corrosif sØvŁre pour la peau, R35, et effet corrosif pour la peau, R34) (2). La description et le mode opØratoire sont prØsentØs pour chacun des deux essais; le choix de l’essai dØpend des exigences et prØfØrences de l’utilisateur. Voir aussi l’introduction gØnØrale de la partie B. 1. 2. DØfinitions Corrosion cutanØe: la survenue de lØsions irrØversibles de la peau aprŁs l’application d’un matØriel d’essai. 1. 3. Substances de rØfØrence Aucune substance de rØfØrence n’est spØcifiØe, mais voir les points 1. 5. 3. 4 et 1. 7. 2. 3. 1. 4. Principe de la mØthode d’essai (cid:151) Essai RET sur peau de rat Le matØriel d’essai est appliquØ pour une durØe n’excØdant pas 24 heures sur la surface Øpidermique de dis- ques de peau prØlevØs sur la peau de jeunes rats humainement sacrifiØs. Les matiŁres corrosives sont identi- fiØes sur la base de leur capacitØ de provoquer la perte de l’intØgritØ du stratum corneum normal et de la fonc- tion de barriŁre, cette perte Øtant mesurØe comme une diminution de la RET de base jusqu’(cid:224) un niveau situØ en dessous d’une valeur seuil (5 kh) (4) (5). Les substances irritantes ou non irritantes ne font pas baisser la RET en dessous de ce seuil. Pour les substances tensio-actives et les substances organiques neutres, une Øtape de fixation d’un colorant peut Œtre incluse dans la procØdure d’essai [pour la dØfinition, voir la rØfØrence (6)] afin de rØduire le nombre de faux positifs obtenus spØcifiquement avec ces types de substances chimiques (2) (7). 1. 5. Description de la mØthode d’essai (cid:151) Essai RET sur peau de rat 1. 5. 1. Animaux Il est nØcessaire d’utiliser de jeunes (20-23 jours) rats (Wistar ou souche comparable) pour la prØparation des disques de peau. Les poils du dos et des flancs sont coupØs soigneusement (cid:224) l’aide d’une tondeuse pour petits animaux. Les animaux sont ensuite nettoyØs soigneusement avec un linge humide, la zone tondue Øtant plon- gØe dans une solution antibiotique (contenant, par exemple, de la streptomycine, de la pØnicilline, du chlo- ramphØnicol et de l’amphotØricine (cid:224) des concentrations efficaces pour inhiber la croissance bactØrienne). Les animaux sont lavØs une nouvelle fois avec des antibiotiques le troisiŁme et le quatriŁme jour aprŁs le premier lavage, et doivent ensuite Œtre utilisØs dans un dØlai de 3 jours (pour la prØparation de la peau, les animaux ne doivent pas Œtre (cid:226)gØs de plus de 31 jours). 1. 5. 2. PrØparation des disques cutanØs Les animaux sont sacrifiØs humainement. On prØlŁve la peau dorsale de chaque animal et on la dØbarrasse soigneusement du tissu adipeux en excŁs. La peau est placØe sur l’extrØmitØ d’un tube PTFE (polytØtrafluoroØ- thylŁne) en veillant (cid:224) ce que la surface Øpidermique soit en contact avec le tube. AprŁs avoir montØ (cid:224) force un joint torique en caoutchouc sur l’extrØmitØ du tube pour maintenir la peau en place, on coupe le tissu excØdentaire. Les dimensions du tube et du joint torique sont indiquØes (cid:224) la figure 1. Le joint torique en caoutchouc est ensuite soigneusement fixØ de maniŁre Øtanche (cid:224) l’extrØmitØ du tube PTFE (cid:224) l’aide de vaseline. Le tube est introduit dans une chambre rØceptrice contenant une solution de sulfate de magnØsium (154 mM) dans lequel il est maintenu par une pince (cid:224) ressort (figure 2). 1. 5. 3. Mode opØratoire 1. 5. 3. 1. A p p l i c a t i o n d u m a t Ø r i e l d ’ e s s a i Des substances d’essai liquides (150 (cid:181)l) sont appliquØes sur la surface Øpidermique (cid:224) l’intØrieur du tube (figure 2). Pour l’essai de substance solides, une quantitØ suffisante du solide est appliquØe sur le disque de peau pour que la totalitØ de la surface de l’Øpiderme soit couverte. AprŁs avoir ajoutØ de l’eau dØsionisØe (150 (cid:181)l), on agite le tube doucement. Le contact entre les substances d’essai et la peau doit Œtre maximal. Dans le cas de certains solides, ceci peut Œtre obtenu en chauffant (cid:224) 30 (cid:176)C pour dissoudre la substance d’essai ou en la broyant pour obtenir des grains ou une poudre. L 136/92 FR Journal officiel des CommunautØs europØennes 8. 6. 2000 On utilise trois disques de peau pour chaque substance d’essai. Celle-ci est appliquØe pendant 24 heures (voir aussi le point 1. 5. 3. 4), puis ØliminØe par lavage avec un jet d’eau courante (cid:224) 30 (cid:176)C. L’Ølimination des substan- ces d’essai qui se sont solidifiØes dans le tube peut Œtre facilitØe par un lavage avec un jet d’eau tiŁde (cid:224) 30 (cid:176)C. 1. 5. 3. 2. M e s u r e s d e l a R E T La RET est mesurØe (cid:224) l’aide d’un pont de mesure en courant alternatif basse tension (par exemple AIM 401 ou 6401, ou Øquivalent). Avant la mesure de la rØsistance Ølectrique, on rØduit la tension de surface de la peau en ajoutant un volume suffisant d’Øthanol (cid:224) 70 % pour couvrir l’Øpiderme. AprŁs quelques secondes, on enlŁve l’Øthanol en renversant le tube, puis on hydrate le tissu par l’addition de 3 ml d’une solution de sulfate de magnØsium (154 mM). Les Ølectrodes du pont de mesure sont placØes de part et d’autre du disque cutanØ pour prendre la mesure de la rØsistance en kh/disque cutanØ (figure 2). Les dimensions des Ølectrodes et la longueur d’Ølectrode en dessous des pinces crocodiles sont indiquØes (cid:224) la figure 1. La pince maintenant l’Ølec- trode intØrieure (Øpaisse) repose sur la partie supØrieure du tube PTFE pendant la mesure de la rØsistance, afin que la longueur d’Ølectrode immergØe dans la solution de sulfate de magnØsium reste constante. L’Ølectrode extØrieure (fine) est introduite dans la chambre rØceptrice de telle maniŁre qu’elle repose sur le fond de celle- ci. La distance entre la partie infØrieure de la pince (cid:224) ressort et la partie infØrieure du tube PTFE est mainte- nue constante (figure 1), cette distance influen(cid:231)ant la valeur de rØsistance obtenue. Il convient de noter que si la valeur de rØsistance mesurØe est supØrieure (cid:224) 20 kh, ceci peut Œtre dß au fait que de la substance d’essai recouvre la surface ØpidØrmique du disque de peau. On peut essayer d’y remØdier, par exemple en fermant de fa(cid:231)on Øtanche le tube PTFE avec le pouce revŒtu d’un gant et en l’agitant pendant 10 secondes environ; on Ølimine ensuite la solution de sulfate de magnØsium et on rØpŁte la mesure de la rØsistance avec une nouvelle solution de sulfate de magnØsium. Les valeurs moyennes de la RET sont acceptØes (cid:224) condition que les valeurs des contr(cid:244)les positifs et nØgatifs effectuØs parallŁlement se situent dans les fourchettes acceptables pour la mØthode. Les substances de contr(cid:244)le proposØes et leur fourchette acceptable pour la mØthodologie et l’appareillage dØcrits sont les suivantes: Contr(cid:244)le Substance Positif NØgatif 10 M acide chlorhydrique (36 %) Eau distillØe RØsistance (kh) 0,5-1,0 10-25 1. 5. 3. 3. M o d e o p Ø r a t o i r e m o d i f i Ø p o u r s u b s t a n c e s t e n s i o - a c t i v e s e t s u b s t a n c e s o r g a n i q u e s n e u t r e s Si les valeurs RET de substances d’essai qui sont des substances tensio-actives ou des substances organiques neutres sont infØrieures ou Øgales (cid:224) 5 kh, on peut Øvaluer la pØnØtration d’un colorant dans les tissus. Cette procØdure dØterminera si les rØsultats sont des faux positifs (2). 1. 5. 3. 3. 1. Application et Ølimination du colorant sulforhodamine B AprŁs traitement initial avec la substance d’essai, 150 (cid:181)l d’une dilution (cid:224) 10 % (p/v) de sulforhodamine B dans de l’eau distillØe sont appliquØs sur la surface Øpidermique de chaque disque de peau pendant 2 heures. Les disques de peau sont lavØs ensuite avec un jet d’eau courante (cid:224) la tempØrature ambiante pendant environ 10 secondes pour Øliminer le colorant excØdentaire/non fixØ. Chaque disque de peau est soigneusement enlevØ du tube PTFE et placØ dans un flacon (par exemple un flacon (cid:224) scintillation en verre de 20 ml) contenant de l’eau dØsionisØe (8 ml). Les flacons sont agitØs doucement pendant 5 minutes pour Øliminer complŁtement tout colorant excØdentaire/non fixØ. AprŁs avoir rØpØtØ cette opØration de rin(cid:231)age, on enlŁve les disques de peau et on les place dans des flacons contenant 5 ml de dodØcylsulfate de sodium (SDS) (cid:224) 30 % (p/v) dans de l’eau distillØe, puis on les incube pendant une nuit (cid:224) 60 (cid:176)C. AprŁs incubation, chaque disque de peau est enlevØ et jetØ et la solution restante est centrifugØe pendant 8 minutes (cid:224) 21 (cid:176)C (force centrifuge relative p 175). Un Øchantillon de 1 ml de surnageant est ensuite diluØ dans un rapport de 1 (cid:224) 5 (v/v) [soit 1 ml + 4 ml] avec du SDS (cid:224) 30 % (p/v) dans de l’eau distillØe. La densitØ optique (DO) de la solution est mesurØe (cid:224) environ 565 nm. 1. 5. 3. 3. 2. Calcul de la teneur en colorant La teneur de chaque disque en sulforhodamine B est calculØe sur la base des valeurs de DO (coefficient d’ex- tinction molaire de la sulforhodamine B (cid:224) 565 nm = 8,7 (cid:215) 104; poids molØculaire = 580). La teneur en sulfor- hodamine B est dØterminØe pour chaque disque de peau et on calcule ensuite une teneur moyenne en colo- rant pour les essais rØpØtØs. Les valeurs moyennes de la fixation du colorant sont acceptØes (cid:224) condition que les valeurs des contr(cid:244)les effectuØs parallŁlement se situent dans la fourchette acceptable pour la mØthode. Les fourchettes acceptables de teneur en colorant pour les substances de contr(cid:244)le proposØes pour la mØthodolo- gie et l’appareillage dØcrits sont les suivantes: 8. 6. 2000 FR Journal officiel des CommunautØs europØennes L 136/93 Contr(cid:244)le Substance Positif NØgatif 10 M acide chorhydrique (36 %) Eau distillØe RØsistance ((cid:181)g/disque) 40-100 15-35 1. 5. 3. 4. I n f o r m a t i o n s c o m p l Ø m e n t a i r e s Les substances d’essai peuvent aussi Œtre appliquØes sur les disques cutanØs pendant des durØes plus courtes (2 heures, par exemple) pour identifier les substances fortement corrosives. Cependant, dans l’Øtude de valida- tion, on a constatØ que l’essai RET surestimait le potentiel corrosif de plusieurs substances chimiques aprŁs leur application pendant 2 heures (2), alors qu’il assurait une identification correcte des substances corrosives et non corrosives aprŁs une application de 24 heures. Les propriØtØs et les dimensions de l’appareillage et le mode opØratoire utilisØs peuvent influencer les valeurs de la RET obtenues. Le seuil de corrosivitØ a ØtØ fixØ (cid:224) 5 kh sur la base de donnØes obtenues avec l’appareil- lage et le mode opØratoire spØcifiques dØcrits dans cette mØthode. Des valeurs de seuil et de contr(cid:244)le diffØren- tes seront Øventuellement nØcessaires en cas de changement important des conditions d’essai. Par consØquent, il est recommandØ d’Øtalonner la mØthodologie et la valeur seuil de rØsistance en testant une sØrie de substan- ces standard de refØrence choisies parmi les substances chimiques utilisØes dans l’Øtude de validation (3). 1. 6. Principe de la mØthode d’essai (cid:151) Essai sur modŁle de peau humaine Le matØriel d’essai est appliquØ localement pendant 4 heures sur un modŁle tridimensionnel de peau humaine comprenant un Øpiderme reconstituØ avec un stratum corneum fonctionnel. Les matiŁres corrosives sont identi- fiØes sur la base de leur aptitude (cid:224) rØduire la viabilitØ cellulaire [dØterminØe, par exemple, (cid:224) l’aide de l’essai de rØduction du MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl) tetrazolium bromide] en dessous de valeurs seuils dØfinies pour des pØriodes d’exposition dØterminØes. Le principe de l’essai concorde avec l’hypothŁse selon laquelle les substances chimiques corrosives sont capables de pØnØtrer dans le stratum corneum (par dif- fusion ou Ørosion) et sont suffisamment cytotoxiques pour provoquer la mort cellulaire dans les couches cel- lulaires sous-jacentes. 1. 7. Description de la mØthode d’essai (cid:151) Essai sur modŁle de peau humaine 1. 7. 1. ModŁles de peau humaine Les modŁles de peau humaine peuvent provenir de diverses sources mais doivent remplir certains critŁres. Le modŁle doit avoir un stratum corneum fonctionnel avec une couche sous-jacente de cellules vivantes. La fonc- tion de barriŁre du stratum corneum doit Œtre suffisante, ce qui peut Œtre mis en Øvidence en dØmontrant la rØsistance du modŁle (cid:224) la cytotoxicitØ aprŁs l’application de substances connues pour leur cytotoxicitØ cellu- laire mais qui ne traversent normalement pas le stratum corneum. Le modŁle doit donner des rØsultats repro- ductibles dans des conditions expØrimentales dØfinies. La viabilitØ des cellules vivantes dans le modŁle doit Œtre suffisante pour qu’il soit possible de faire la distinc- tion entre les substances de contr(cid:244)le positives et nØgatives. La viabilitØ cellulaire (par exemple, mesurØe par le niveau de rØduction du MTT, c’est-(cid:224)-dire une valeur de DO) aprŁs l’exposition (cid:224) la substance de contr(cid:244)le nØgative doit se situer dans des limites acceptables pour le modŁle en question. De mŒme, les valeurs de via- bilitØ cellulaire avec la substance de contr(cid:244)le positive (par rapport (cid:224) celles du contr(cid:244)le nØgatif) doivent se situer dans des limites dØterminØes. Le plus important est que le modŁle prØdictif utilisØ doit Œtre conforme aux normes de validation internationales (2). 1. 7. 2. Mode opØratoire 1. 7. 2. 1. A p p l i c a t i o n d u m a t Ø r i e l d ’ e s s a i Pour les substances liquides, il faut appliquer une quantitØ suffisante de substance d’essai pour couvrir la sur- face cutanØe (25 (cid:181)l/cm2 au minimum). Pour les substances solides, il faut appliquer une quantitØ suffisante de substance d’essai pour couvrir la peau et ensuite l’humidifier pour assurer un bon contact avec la peau; si nØcessaire, les substances solides doivent Œtre rØduites en poudre avant leur application. La mØthode d’appli- cation doit convenir (cid:224) un large Øventail de substances chimiques (2). (cid:192) la fin de la pØriode d’exposition, le matØriel d’essai doit Œtre enlevØ soigneusement de la surface cutanØe avec une solution saline. 1. 7. 2. 2. M e s u r e s d e l a v i a b i l i t Ø c e l l u l a i r e La viabilitØ des cellules peut Œtre mesurØe (cid:224) l’aide de toute mØthode quantitative validØe. La mØthode la plus frØquemment utilisØe est la rØduction du MTT, dont on a constatØ l’exactitude et la reproductibilitØ des rØsul- tats dans diffØrents laboratoires (2). Le disque de peau est placØ dans une solution de MTT de 0,3 mg/ml (cid:224) 20-28 (cid:176)C pendant 3 heures. AprŁs extraction du prØcipitØ bleu de formazan (extraction par solvant), on mesure la concentration de formazan en dØterminant la DO (cid:224) une longueur d’onde de 545 (cid:224) 595 nm. L 136/94 FR Journal officiel des CommunautØs europØennes 8. 6. 2000 1. 7. 2. 3. I n f o r m a t i o n s c o m p l Ø m e n t a i r e s Le modŁle de peau utilisØ ainsi que le protocole exact de la durØe d’exposition et des procØdures de lavage, etc. auront une grande influence sur les rØsultats des mesures de la viabilitØ cellulaire. Il est recommandØ d’Øtalonner la mØthodologie et le modŁle prØdictif en testant une sØrie de substances standard de rØfØrence choisies parmi les substances chimiques utilisØes dans l’Øtude de validation du CEVMA ou ECVAM (3). Il est essentiel de dØmontrer que la mØthode utilisØe est reproductible dans un mŒme laboratoire et entre laboratoi- res pour un large Øventail de substances chimiques, conformØment aux normes internationales. La mØthode doit au moins satisfaire aux critŁres de validitØ scientifique dØfinis prØcØdemment (2) et les rØsultats de cette Øtude de validation doivent Œtre publiØs dans une revue scientifique faisant appel (cid:224) l’Øvaluation par des experts (peer-reviewed). 2. DONN(cid:201)ES 2. 1. Traitement des rØsultats 2. 1. 1. Essai de RET sur peau de rat Les valeurs de rØsistance (kh) pour le matØriel d’essai, les contr(cid:244)les positifs et nØgatifs ainsi que toute subs- tance chimique standard de rØfØrence sont prØsentØes sous forme de tableau, y compris les donnØes des essais rØpØtØs/rØpliquØs, les valeurs moyennes et la classification qui en dØcoule. 2. 1. 2. Essai sur modŁle de peau humaine Les valeurs de DO et les pourcentages calculØs de viabilitØ cellulaire pour le matØriel d’essai, les contr(cid:244)les positifs et nØgatifs ainsi que toute substance chimique standard de rØfØrence sont prØsentØs sous forme de tableau, y compris les donnØes des essais rØpØtØs, les valeurs moyennes et la classification qui en est dØduite. 2. 2. (cid:201)valuation et interprØtation des rØsultats 2. 2. 1. Essai de RET sur peau de rat Si la valeur moyenne de la RET obtenue pour la substance d’essai est supØrieure (cid:224) 5 kh, cette substance n’est pas corrosive. Si la valeur RET est infØrieure ou Øgale (cid:224) 5 kh et la substance d’essai n’est pas une substance tensio-active ou une substance organique neutre, cette substance est corrosive. Dans le cas des substances tensio-actives ou des substances organiques neutres dont la valeur de la RET est infØrieure ou Øgale (cid:224) 5 kh, on peut Øvaluer la pØnØtration d’un colorant. Si la teneur moyenne en colorant du disque est supØrieure ou Øgale (cid:224) la teneur moyenne en colorant du disque du contr(cid:244)le positif (HCl (cid:224) 36 %) obtenue parallŁlement, la substance d’essai est un vrai positif et est donc corrosive. Si la teneur moyenne en colorant du disque est infØrieure (cid:224) la teneur moyenne en colorant du disque du contr(cid:244)le positif (HCl (cid:224) 36 %) obtenue parallŁlement, la substance d’essai est un faux positif et donc non corrosive. 2. 2. 2. Essai sur modŁle de peau humaine La valeur de la DO du contr(cid:244)le nØgatif reprØsente une viabilitØ cellulaire de 100 %; par consØquent, la valeur de la DO obtenue pour chaque Øchantillon d’essai peut Œtre utilisØe pour calculer un pourcentage de viabilitØ par rapport au contr(cid:244)le nØgatif. La valeur seuil du pourcentage de viabilitØ cellulaire qui Øtablit la distinction entre les matiŁres corrosives et les matiŁres non corrosives (ou entre diffØrentes classes de substances corrosi- ves) doit Œtre clairement dØfinie dans le modŁle prØdictif avant la validation de la mØthode et l’Øtude de vali- dation doit ensuite montrer que la valeur seuil est appropriØe (2). 3. RAPPORTS Rapport d’essai Le rapport d’essai doit contenir au moins les informations suivantes: Substance d’essai: (cid:151) donnØes d’identification, nature physique et, si nØcessaire, propriØtØs physicochimiques. Le cas ØchØant, des informations analogues doivent Œtre fournies pour les substances de rØfØrence. Conditions d’essai: (cid:151) dØtails du mode opØratoire, (cid:151) description et justification de toute modification. 8. 6. 2000 FR Journal officiel des CommunautØs europØennes L 136/95 RØsultats: (cid:151) prØsentation sous forme de tableau des valeurs des rØsistances (essai de RET) ou des pourcentages de viabilitØ cellulaire (essai sur modŁle de peau humaine) pour le matØriel d’essai, les contr(cid:244)les positifs et nØgatifs ainsi que toute substance chimique standard de rØfØrence, y compris les donnØes des essais rØpØtØs/rØpliquØs et les valeurs moyennes, (cid:151) description de tout autre effet observØ. Discussion des rØsultats Conclusions 4. R(cid:201)F(cid:201)RENCES BIBLIOGRAPHIQUES (1) ECVAM (1998), ECVAM News & Views, ATLA 26, S. 275-280. (2) Fentem, J. H. , Archer, G. E. B. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. , Holzhutter, H-G. & Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosi- vity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in Vitro 12, S. 483-524. (3) Barratt, M. D. , Brantom, P. G. , Fentem, J. H. , Gerner, I. , Walker, A. P. & Worth, A. P. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals, Toxicology in Vitro 12, p. 471-482. (4) Oliver, G. J. A. , Pemberton, M. A. & Rhodes, C. (1986), An in vitro skin corrosivity test (cid:151) modifications and validation, Food & Chemical Toxicology 24, p. 507-512. (5) Botham, P. A. , Hall, T. J. , Dennett, R. , McCall, J. C. , Basketter, D. A. , Whittle, E. , Cheeseman, M. , Esdaile, D. J. & Gardner, J. (1992), The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial, Toxicology in Vitro 6, p. 191-194. (6) Worth, A. P. , Fentem, J. H. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. & Liebsch, M. (1998), An evaluation of the proposed OECD testing strategy for skin corrosion, ATLA 26, p. 709-720. (7) Botham, P. A. , Chamberlain, M. , Barratt, M. D. , Curren, R. D. , Esdaile, D. J. , Gardner, J. R. , Gordon, V. C. , Hil- debrand, B. , Lewis, R. W. , Liebsch, M. , Logemann, P. , Osborne, R. , Ponec, M. , Regnier, J. F. , Steiling, W. , Walker, A. P. & Balls, M. (1995), A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM workshop 6, ATLA 23, p. 219-255. L 136/96 FR Journal officiel des CommunautØs europØennes 8. 6. 2000 Figure 1 8. 6. 2000 FR Journal officiel des CommunautØs europØennes L 136/97 Figure 2 L 136/98 FR Journal officiel des CommunautØs europØennes 8. 6. 2000 ANNEXE II «B. 41. PHOTOTOXICIT(cid:201) (cid:151) ESSAI DE PHOTOTOXICIT(cid:201) IN VITRO 3T3 NRU 1. M(cid:201)THODE 1. 1. Introduction La phototoxicitØ est dØfinie comme une rØaction toxique dØclenchØe par une premiŁre exposition de la peau (cid:224) certains produits chimiques, suivie d’une exposition (cid:224) la lumiŁre, ou bien par l’irradiation de la peau aprŁs administration d’un produit chimique par voie systØmique. Les informations fournies par le test de phototoxicitØ in vitro 3T3 NRU permettent de dØterminer le potentiel phototoxique d’une substance d’essai, c’est-(cid:224)-dire les dangers qu’elle est susceptible de prØsenter (ou son absence de dangers) en cas d’exposition au rayonnement UV et (cid:224) la lumiŁre visible. Dans la mesure oø la finalitØ toxicologique du test in vitro est de dØterminer la photocytotoxicitØ induite par l’action combinØe d’un produit chimique et de la lumiŁre, les composØs qui se rØvŁlent phototoxiques in vivo aprŁs administration systØmique et diffusion dans la peau, ainsi que les composØs qui ont une action photo- irritante aprŁs application topique sur la peau peuvent Œtre dØtectØs par ce test. Le test de phototoxicitØ in vitro 3T3 NRU a ØtØ ØlaborØ et validØ dans le cadre d’un projet conjoint UE/COLIPA entre 1992 et 1997 (1) (2) (3), visant (cid:224) trouver une mØthode in vitro valable pour remplacer les divers tests in vivo utilisØs. En 1996, l’OCDE avait recommandØ, (cid:224) l’issue d’un groupe de travail, une approche sØquentielle in vitro pour l’Øvaluation de la toxicitØ (4). Les rØsultats du test de phototoxicitØ in vitro 3T3 NRU ont ØtØ comparØs aux effets de phototoxicitØ/photo- irritation aiguº in vivo chez les animaux et chez les humains, et le test s’est rØvØlØ extrŒmement fiable pour la prØvision de ces effets. Le test n’est pas con(cid:231)u pour prØvoir d’autres effets nocifs susceptibles de rØsulter de l’action combinØe d’un produit chimique et de la lumiŁre, tels que la photogØnotoxicitØ, la photo-allergie, et la photocancØrogØnicitØ, mais de nombreux produits chimiques qui possŁdent des propriØtØs spØcifiques donne- ront des rØsultats positifs au test de phototoxicitØ in vitro 3T3 NRU. Par ailleurs, le test ne permet pas non plus d’Øvaluer le pouvoir phototoxique. L’appendice propose une approche sØquentielle pour les essais visant (cid:224) dØterminer la phototoxicitØ des pro- duits chimiques. 1. 2. DØfinitions Irradiance: l’intensitØ du rayonnement ultraviolet (UV) ou visible incident sur une surface, mesurØe en W/m2 ou en mW/cm2. Dose de lumiŁre: la quantitØ (= intensitØ (cid:215) temps) de rayonnement ultraviolet (UV) ou visible incident sur une surface, exprimØe en Joules (= W (cid:215) s) par unitØ de surface, par exemple, J/m2 ou J/cm2. Bandes de longueurs d’ondes de la lumiŁre UV: Les dØsignations recommandØes par la CIE (Commission inter- nationale de l’Øclairage) sont: UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) et UVC (100-280 nm). D’autres dØsi- gnations sont Øgalement utilisØes: la limite entre UVB et UVA est souvent placØe (cid:224) 320 nm, et les UVA peu- vent Œtre subdivisØs en UV-A1 et UV-A2 avec une limite (cid:224) environ 340 nm. ViabilitØ cellulaire: paramŁtre mesurant l’activitØ totale d’une population cellulaire (par exemple, absorption du colorant vital rouge neutre dans les lysosomes cellulaires), qui, en fonction de l’effet mesurØ et du type de test utilisØ, correspond au nombre total et/ou (cid:224) la vitalitØ des cellules. ViabilitØ cellulaire relative: viabilitØ cellulaire exprimØe par rapport aux tØmoins nØgatifs (solvant) qui ont ØtØ prØlevØs tout ou long de la procØdure (soit + UV soit (cid:150) UV), mais non traitØs par un produit chimique. ModŁle prØdictif: algorithme utilisØ pour transformer les rØsultats d’un test de toxicitØ en une prØvision du potentiel toxique. Dans les prØsentes lignes directrices d’essai, le PIF et le MPE peuvent Œtre utilisØs pour trans- former les rØsultats du test de phototoxicitØ in vitro 3T3 NRU en une prØvision du potentiel phototoxique. PIF (Photo Irritation Factor (cid:151) Facteur de photo-irritation): facteur obtenu en comparant deux concentrations cytotoxiques efficaces (EC50) de la substance chimique d’essai, obtenues en prØsence (+ UV) et en absence ((cid:150) UV) d’une irradiation non cytotoxique par un rayonnement UVA/visible. MPE (Mean Photo Effect (cid:151) Photo-effet moyen): nouvelle mesure dØrivØe d’une analyse mathØmatique du tracØ complet de deux courbes concentration-rØponse obtenues avec (+ UV) ou sans ((cid:150) UV) irradiation non cytotoxi- que par un rayonnement UVA/visible. 8. 6. 2000 FR Journal officiel des CommunautØs europØennes L 136/99 PhototoxicitØ: rØaction toxique aiguº apparaissant aprŁs une premiŁre exposition de la peau (cid:224) certains produits chimiques et exposition subsØquente (cid:224) la lumiŁre, ou dØclenchØe par l’irradiation de la peau aprŁs administra- tion systØmique d’un produit chimique. Photo-irritation: terme dØsignant une sous-catØgorie de (cid:147)phototoxicitØ(cid:148), utilisØ pour dØcrire uniquement les rØactions phototoxiques qui se manifestent au niveau de la peau aprŁs exposition (par voie topique ou orale) (cid:224) des produits chimiques. Ces rØactions phototoxiques entra(cid:238)nent toujours des dommages cellulaires non spØ- cifiques (rØactions de type coup de soleil). Photo-allergie: rØactivitØ immunologique acquise qui ne se manifeste pas lors de la premiŁre exposition (cid:224) la lumiŁre et au produit chimique et nØcessite une pØriode d’induction d’une ou de deux semaines avant que la rØactivitØ cutanØe puisse Œtre mise en Øvidence. PhotogØnotoxicitØ: rØaction gØnotoxique observØe pour un paramŁtre gØnØtique, qui appara(cid:238)t aprŁs exposition des cellules (cid:224) une dose non gØnotoxique de lumiŁre UV/visible et (cid:224) un produit chimique non gØnotoxique. PhotocancØrogØnicitØ: cancØrogØnicitØ induite par une exposition rØpØtØe (cid:224) la lumiŁre et (cid:224) un produit chimique. Le terme (cid:147)photococancØrogØnicitØ(cid:148) s’emploie lorsque l’effet tumorigŁne induit par les UV est accentuØ par l’ex- position (cid:224) un produit chimique. 1. 3. Substances de rØfØrence Outre la substance chimique chlorpromazine servant de tØmoin positif qui doit Œtre testØe concurremment dans chaque cas, il est recommandØ d’utiliser comme substances de rØfØrence pour le test de phototoxicitØ 3T3 NRU un sous-ensemble des produits chimiques utilisØs pour ce test lors des essais interlaboratoires (1) (3) (13). 1. 4. Remarques initiales Des effets phototoxiques ont ØtØ signalØs pour de nombreux types de produits chimiques (5) (6) (7) (8). Le seul point commun entre ces derniers est leur capacitØ (cid:224) absorber l’Ønergie lumineuse dans le domaine de la lumiŁre solaire. D’aprŁs la premiŁre loi de photochimie (loi de Grotthaus-Draper) la photorØaction nØcessite l’absorption d’un nombre suffisant de quanta de lumiŁre. Aussi convient-il, avant d’envisager un essai biologi- que selon les prØsentes lignes directrices, de dØterminer le spectre d’absorption UV/lumiŁre visible du produit chimique (cid:224) tester (par exemple, suivant les lignes directrices d’essai 101 de l’OCDE). Si le coefficient d’extinc- tion/d’absorbance molaire est infØrieur (cid:224) 10 litre (cid:215) mol-1 (cid:215) cm-1, le produit chimique n’a pas de potentiel photo- rØactif et il est inutile de le soumettre au test de phototoxicitØ in vitro 3T3 NRU ou (cid:224) tout autre test biologique visant (cid:224) dØtecter des effets photochimiques indØsirables (appendice). 1. 5. Principe de la mØthode d’essai Quatre mØcanismes ont ØtØ mis en Øvidence pour expliquer comment l’absorption de lumiŁre par un chromo- phore (chimique) peut entra(cid:238)ner une rØaction phototoxique (7). Tous ces mØcanismes entra(cid:238)nent des domma- ges cellulaires. Par consØquent, le test de phototoxicitØ in vitro 3T3 NRU repose sur la comparaison de la cyto- toxicitØ d’un produit chimique avec et sans exposition (cid:224) une dose non cytotoxique d’UVA/lumiŁre visible. Dans ce test, la cytotoxicitØ est exprimØe comme la diminution, en fonction de la concentration, de la fixation du colorant vital rouge neutre [Neutral Red (cid:151) NR (9)] 24 heures aprŁs traitement par le produit chimique (cid:224) tester et irradiation. Des cellules Balb/c 3T3 sont maintenues en culture pendant 24 h jusqu’(cid:224) obtention de monocouches. Pour chaque produit chimique (cid:224) tester, deux plaques (cid:224) 96 puits sont alors prØincubØes pendant 1 h avec huit concentrations distinctes du produit chimique. Ensuite, l’une des deux plaques est exposØe (cid:224) une dose d’UVA/ lumiŁre visible non cytotoxique de 5 J/cm2 UVA (expØrience + UV), tandis que l’autre plaque est maintenue (cid:224) l’obscuritØ (expØrience (cid:150) UV). Dans les deux plaques, le milieu de traitement est ensuite remplacØ par un milieu de culture et, aprŁs une nouvelle pØriode d’incubation de 24 h, la viabilitØ cellulaire est dØterminØe par le test de fixation du rouge neutre (Neutral Red Uptake (cid:151) NRU) pendant 3 h. La viabilitØ cellulaire relative, exprimØe sous forme d’un pourcentage des tØmoins nØgatifs non traitØs, est calculØe pour chacune des huit concentrations d’essai. Afin de prØvoir le potentiel phototoxique, les rØponses aux concentrations obtenues en prØsence (+ UV) et en absence ((cid:150) UV) d’irradiation sont comparØes, gØnØralement au niveau EC50, c’est-(cid:224)-dire la concentration inhibant la viabilitØ cellulaire de 50 % par rapport aux tØmoins non traitØs. 1. 6. CritŁres de qualitØ SensibilitØ des cellules aux UVA, donnØes historiques: la sensibilitØ des cellules aux UVA doit Œtre rØguliŁrement contr(cid:244)lØe. Les cellules sont mises en culture (cid:224) la densitØ utilisØe dans le test de phototoxicitØ in vitro 3T3 NRU; elles sont irradiØes le jour suivant par des doses d’UVA allant de 1 (cid:224) 9 J/cm2, et la viabilitØ cellulaire est dØter- minØe un jour plus tard (cid:224) l’aide du test NRU. Les cellules rØpondent aux critŁres de qualitØ si leur viabilitØ aprŁs irradiation par 5 J/cm2 UVA est supØrieure ou Øgale (cid:224) 80 % de la viabilitØ des tØmoins maintenus (cid:224) l’obs- curitØ. (cid:192) la dose la plus forte de 9 J/cm2 UVA, la viabilitØ doit Œtre au moins Øgale (cid:224) 50 % de celle des tØmoins conservØs (cid:224) l’obscuritØ. Ce contr(cid:244)le doit Œtre rØpØtØ tous les 10 passages de cellules environ. SensibilitØ aux UVA des cellules constituant les tØmoins nØgatifs, dans le test en cours: le test rØpond aux critŁres de qualitØ si les tØmoins nØgatifs [cellules dans une solution saline ØquilibrØe de Earl (cid:151) Earl’s Balanced Salt Solu- tion (EBSS)] avec ou sans 1 % de dimØthylsulfoxyde (DMSO) ou 1 % d’Øthanol (EtOH) dans l’expØrience + UVA ont une viabilitØ supØrieure ou Øgale (cid:224) 80 % de celle des cellules non irradiØes dans le mŒme solvant dans l’ex- pØrience menØe en parallŁle dans l’obscuritØ ((cid:150) UVA). L 136/100 FR Journal officiel des CommunautØs europØennes 8. 6. 2000 ViabilitØ des tØmoins nØgatifs: la densitØ optique absolue (OD540 NRU), mesurØe dans l’extrait NR des tØmoins nØgatifs indique si les 1 (cid:215) 104 cellules mises en culture par puits se sont dØveloppØes avec un temps de double- ment normal pendant les deux jours d’essai. Un test rØpond aux critŁres d’acceptation si la densitØ optique moyenne OD540 NRU des tØmoins non traitØs est ¯ 0,2. TØmoin positif: pour chaque test de phototoxicitØ in vitro 3T3 NRU rØalisØ, un produit chimique phototoxique connu doit Œtre testØ concurremment. La chlorpromazine (CPZ) a ØtØ utilisØe comme tØmoin positif dans l’Øtude de validation UE/COLIPA et est donc recommandØe. Dans le cas de la CPZ testØe selon le protocole standard dans le test in vitro 3T3 NRU, les critŁres d’acceptation suivants ont ØtØ dØfinis: CPZ irradiØe (+ UVA): EC50 = 0,1 (cid:224) 2,0 (cid:181)g/ml, CPZ non irradiØe (ﬂ UVA): EC50 = 7,0 (cid:224) 90,0 (cid:181)g/ml. Le facteur de photo-irritation (PIF), c’est-(cid:224)-dire la variation de l’EC50 doit Œtre d’au moins 6. (cid:192) la place de la CPZ, d’autres produits chimiques phototoxiques connus, convenant (cid:224) la classe chimique ou aux caractØristiques de solubilitØ du produit chimique (cid:224) tester, peuvent aussi Œtre utilisØs en tant que tØmoins positifs parallŁles. Dans ce cas, en fonction des donnØes historiques, les intervalles de valeurs de la EC50 et le PIF ou le MPE (Mean Photo Effect (cid:151) photo-effet moyen) doivent Œtre correctement dØfinis en tant que critŁres d’acceptation du test. 1. 7. Description de la mØthode d’essai 1. 7. 1. PrØparations 1. 7. 1. 1. C e l l u l e s Une lignØe permanente de cellules de fibroblaste de souris (cid:151) Balb/c 3T3, clone 31 (cid:151) provenant de ATCC (American Type Culture Collection) ou de ECACC (European Collection of Cell Cultures) a ØtØ utilisØe dans l’Øtude de validation et est donc recommandØe. D’autres cellules ou lignØes cellulaires peuvent aussi donner de bons rØsultats avec le mŒme protocole d’essai si les conditions de culture sont adaptØes aux besoins spØcifi- ques des cellules; il convient toutefois d’en dØmontrer l’Øquivalence. Les cellules doivent Œtre rØguliŁrement controlØes pour vØrifier l’absence de contamination par des mycoplas- mes, et ne doivent Œtre utilisØes que si les rØsultats du contr(cid:244)le sont satisfaisants. Dans la mesure oø la sensibilitØ aux UVA des cellules peut augmenter avec le nombre de passages, il convient d’utiliser des cellules Balb/c 3T3 ayant subi le moins de passages possibles, de prØfØrence moins de 100. Il importe de contr(cid:244)ler rØguliŁrement la sensibilitØ aux UVA des cellules Balb/c 3T3 selon la procØdure de contr(cid:244)le de la qualitØ dØcrite dans les prØsentes lignes directrices. 1. 7. 1. 2. M i l i e u x e t c o n d i t i o n s d e c u l t u r e Des milieux de culture et des conditions d’incubation appropriØs doivent Œtre utilisØs pour le passage systØma- tique des cellules et pendant la procØdure d’essai. Pour les cellules Balb/c 3T3, le milieu de culture est du DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) enrichi avec 10 % de sØrum de veau nouveau-nØ, 4 mM de glu- tamine, de pØnicilline et de streptomycine, et incubØ (cid:224) 37 (cid:176)C en atmosphŁre humidifiØe/7,5 % CO2. Il est parti- culiŁrement important que les conditions de culture cellulaire permettent de maintenir la durØe du cycle cellu- laire dans les limites normales pour les cellules ou la lignØe cellulaire utilisØes. 1. 7. 1. 3. P r Ø p a r a t i o n d e s c u l t u r e s Des cellules provenant de cultures mŁres congelØes sont mises en culture (cid:224) une densitØ appropriØe dans le milieu de culture, et sont repiquØes au moins une fois avant d’Œtre utilisØes pour le test de phototoxicitØ in vitro 3T3 NRU. Pour le test de phototoxicitØ, le milieu de culture est ensemencØ avec une densitØ de cellules telle que les cul- tures n’arrivent pas (cid:224) confluence avant la fin de l’essai, c’est-(cid:224)-dire au moment oø la viabilitØ cellulaire est dØterminØe, 48 h aprŁs la mise en culture des cellules. Pour les cellules Balb/c 3T3 cultivØes sur des plaques (cid:224) 96 puits, la densitØ cellulaire recommandØe est de 1 (cid:215) 104 cellules par puits. Pour chaque produit chimique testØ, les cellules sont mises en culture de maniŁre identique sur deux plaques (cid:224) 96 puits distinctes, qui sont utilisØes en mŒme temps pendant toute la procØdure d’essai, dans les mŒmes conditions de culture, sauf pendant la pØriode oø l’une des plaques est irradiØe (+ UVA/lumiŁre visible) et l’au- tre maintenue (cid:224) l’obscuritØ ((cid:150) UVA/lumiŁre visible). 1. 7. 1. 4. A c t i v a t i o n m Ø t a b o l i q u e Alors que l’utilisation de systŁmes d’activation mØtabolique est nØcessaire en rŁgle gØnØrale pour tous les tests in vitro de prØdiction du potentiel gØnotoxique ou cancØrogŁne, dans le cas de la phototoxicologie, on ne conna(cid:238)t pas jusqu’(cid:224) prØsent de produit chimique qui nØcessite une transformation mØtabolique pour agir comme une phototoxine in vivo ou in vitro. Par consØquent, il ne para(cid:238)t pas utile ni scientifiquement fondØ de rØaliser le prØsent test en prØsence d’un systŁme d’activation mØtabolique. 8. 6. 2000 FR Journal officiel des CommunautØs europØennes L 136/101 1. 7. 1. 5. P r o d u i t c h i m i q u e (cid:224) t e s t e r / P r Ø p a r a t i o n Les produits chimiques (cid:224) tester doivent Œtre fra(cid:238)chement prØparØs juste avant utilisation, (cid:224) moins que les don- nØes de stabilitØ ne dØmontrent qu’ils sont conservables. Une prØparation en lumiŁre rouge peut s’avØrer nØcessaire lorsqu’une photodØgradation rapide est probable. Les produits chimiques (cid:224) tester doivent Œtre dissous dans des solutions salines tamponnØes, par exemple, solu- tion saline ØquilibrØe de Earl (Earl’s Balanced Salt Solution (cid:151) EBSS) ou solution saline tamponnØe au phos- phate (Phosphate Buffered Saline (cid:151) PBS), qui doivent Œtre exemptes de constituants protØiques et d’indica- teurs pH colorØs qui absorbent la lumiŁre, afin d’Øviter les interfØrences lors de l’irradiation. Les produits chimiques ayant une solubilitØ limitØe dans l’eau doivent Œtre dissous dans des solvants appro- priØs (cid:224) 100 fois la concentration finale souhaitØe, puis diluØs (cid:224) raison de 1:100 avec la solution saline tam- ponnØe. Si un solvant est utilisØ, il doit Œtre prØsent au volume constant de 1 % (v/v) dans toutes les cultures, c’est-(cid:224)-dire dans les tØmoins nØgatifs et dans toutes les concentrations du produit chimique (cid:224) tester. Les solvants recommandØs sont le dimØthylsulfoxyde (DMSO) et l’Øthanol (EtOH). D’autres solvants de faible cytotoxicitØ (par exemple, l’acØtone) peuvent convenir, mais leurs propriØtØs spØcifiques doivent Œtre ØvaluØes avec soin, notamment les possibilitØs de rØaction avec le produit chimique (cid:224) tester, l’attØnuation de l’effet pho- totoxique, ou les propriØtØs de fixation des radicaux. Si nØcessaire, on pourra recourir (cid:224) un mØlangeur Vortex et/ou (cid:224) la sonication et/ou (cid:224) un chauffage (cid:224) 37 (cid:176)C pour faciliter la solubilisation. 1. 7. 1. 6. I r r a d i a t i o n U V / P r Ø p a r a t i o n Source de lumiŁre: le choix d’une source de lumiŁre et d’un filtrage appropriØs est le facteur dØterminant dans les essais de phototoxicitØ. Les domaines des UVA et de la lumiŁre visible sont gØnØralement associØs (cid:224) une photosensibilisation (7) (10), tandis que les UVB sont moins importants de ce point de vue, Øtant directement trŁs cytotoxiques avec une cytotoxicitØ qui augmente d’un facteur 1 000 entre 313 et 280 nm (11). Parmi les critŁres prØsidant au choix de la source de lumiŁre appropriØe, il est essentiel que la source de lumiŁre Ømette des longueurs d’onde absorbØes par le produit chimique (cid:224) tester et que la dose de lumiŁre (pouvant Œtre obte- nue dans un dØlai raisonnable) soit suffisante pour dØtecter les substances photosensibilisantes connues. En outre, les longueurs d’onde et les doses employØes ne doivent pas trop endommager le systŁme d’essai, notam- ment en ce qui concerne l’Ømission de chaleur (domaine infrarouge). La lumiŁre solaire simulØe par les simulateurs solaires est considØrØe comme la source de lumiŁre optimale. Les simulateurs solaires utilisent des arcs au xØnon ainsi que des arcs au mercure (dopØ) ou des arcs aux halo- gØnures de mØtaux. Ces derniers ont l’avantage d’Ømettre moins de chaleur et d’Œtre moins chers, mais ils ne reproduisent pas parfaitement la lumiŁre solaire. Dans la mesure oø tous les simulateurs solaires Ømettent d’importantes quantitØs d’UVB, ils doivent Œtre ØquipØs de filtres adØquats pour attØnuer les longueurs d’onde UVB hautement cytotoxiques. Pour l’essai de phototoxicitØ in vitro 3T3 NRU, il convient d’utiliser un spectre d’irradiance pratiquement exempt d’UVB (UVA:UVB p 1:20). Un exemple de distribution de l’irradiance spectrale du simulateur solaire ØquipØ de filtres, qui a ØtØ utilisØ dans l’Øtude de validation du test in vitro 3T3 NRU, a ØtØ publiØ (3). DosimØtrie: l’intensitØ de lumiŁre (irradiance) doit Œtre rØguliŁrement contr(cid:244)lØe avant chaque test de phototoxi- citØ (cid:224) l’aide d’un radiomŁtre UV (cid:224) large bande appropriØ qui doit avoir ØtØ ØtalonnØ en fonction de la source. La performance du radiomŁtre UV doit Œtre contr(cid:244)lØe. (cid:192) cet effet, on recommande l’utilisation d’un second radiomŁtre UV de rØfØrence, du mŒme type et ØtalonnØ de la mŒme fa(cid:231)on. Dans l’idØal, (cid:224) intervalles plus grands, il conviendrait d’utiliser un spectroradiomŁtre pour mesurer l’irradiance spectrale de la source filtrØe et pour vØrifier l’Øtalonnage du radiomŁtre UV (cid:224) large bande, mais l’utilisation de tels instruments exige des opØrateurs dßment qualifiØs. L’Øtude de validation a Øtabli qu’une dose de 5 J/cm2 (UVA) Øtait non cytotoxique pour les cellules Balb/c 3T3 et suffisamment puissante pour exciter mŒme les produits chimiques faiblement phototoxiques. Pour obtenir 5 J/cm2 dans un dØlai de 50 min, l’irradiance doit Œtre rØglØe (cid:224) 1,666 mW/cm2. En cas d’utilisation d’une autre lignØe cellulaire ou d’une source de lumiŁre diffØrente, il peut s’avØrer nØcessaire d’ajuster la dose d’UVA en respectant le critŁre selon lequel cette dose ne doit pas Œtre nocive pour les cellules tout en Øtant suffisante pour dØtecter les phototoxines standard. La durØe de l’exposition (cid:224) la lumiŁre se calcule de la fa(cid:231)on suivante: 1. 7. 2. Conditions d’essai La concentration maximale du produit chimique (cid:224) tester ne doit pas dØpasser 100 (cid:181)g/ml, puisque tous les produits chimiques phototoxiques ont ØtØ dØtectØs (cid:224) des concentrations plus faibles, et qu’(cid:224) des concentrations plus ØlevØes, l’incidence des faux positifs augmente (surprØdiction) (13). Le pH de la plus forte concentration du produit chimique (cid:224) tester doit Œtre satisfaisant (pH entre 6,5 et 7,8). L 136/102 FR Journal officiel des CommunautØs europØennes 8. 6. 2000 Les plages de concentrations du produit chimique testØ en prØsence (+ UVA) et en absence ((cid:150) UVA) de lumiŁre doivent Œtre dØterminØes de maniŁre adØquate lors d’expØriences prØalables. La plage et les intervalles d’une sØrie de concentrations doivent Œtre ajustØes de telle fa(cid:231)on que les courbes concentration-rØponse soient suffi- samment confirmØes par les donnØes expØrimentales. Il convient de recourir (cid:224) une progression gØomØtrique des concentrations (avec un facteur de dilution constant). 1. 7. 3. Mode opØratoire (1) 1. 7. 3. 1. P r e m i e r j o u r PrØparer une suspension cellulaire de 1 (cid:215) 105 cellules/ml dans le milieu de culture, et verser 100 (cid:181)l de milieu de culture seul dans les puits pØriphØriques d’une plaque de microtitrage (cid:224) 96 puits (= essais (cid:224) blanc). Dans les puits restants, verser 100 (cid:181)l de la suspension cellulaire de 1 (cid:215) 105 cellules/ml (= 1 (cid:215) 104 cellules/puits). Pour chaque produit chimique (cid:224) tester, prØparer deux plaques: une pour la dØtermination de la cytotoxicitØ (ﬂ UVA) et l’autre, pour la dØtermination de la phototoxicitØ (+ UVA). Incuber les cellules pendant 24 h (7,5 % CO2, 37 (cid:176)C) jusqu’(cid:224) obtention d’une monocouche semi-confluente. Cette pØriode d’incubation permet la rØcupØration et l’adhØrence des cellules, et leur croissance exponentielle. 1. 7. 3. 2. D e u x i Ł m e j o u r AprŁs incubation, dØcanter le milieu de culture pour sØparer les cellules et laver deux fois avec 150 (cid:181)l de EBSS/PBS par puits. Ajouter 100 (cid:181)l de EBSS/PBS contenant la concentration appropriØe du produit chimique (cid:224) tester ou uniquement du solvant (tØmoin nØgatif). Appliquer 8 concentrations distinctes du produit chimi- que (cid:224) tester. Incuber les cellules avec le produit chimique (cid:224) tester dans l’obscuritØ pendant 60 minutes (7,5 % CO2, 37 (cid:176)C). Pour rØaliser la partie (+ UVA) de l’essai, irradier les cellules (cid:224) tempØrature ambiante pendant 50 minutes (cid:224) tra- vers le couvercle de la plaque (cid:224) 96 puits par une dose d’UVA de 1,7 mW/cm2 (= 5 J/cm2). Ventiler avec un ventilateur pour Øviter la condensation d’H2O sous le couvercle. Conserver les plaques rØpliques (ﬂ UVA) (cid:224) tempØrature ambiante dans une bo(cid:238)te sombre pendant 50 min (= durØe de l’exposition aux UVA). DØcanter la solution d’essai et laver deux fois avec 150 (cid:181)l de EBSS/PBS. Remplacer le EBSS/PBS par le milieu de culture et incuber (7,5 % CO2, 37 (cid:176)C) jusqu’au lendemain (18-22 h). 1. 7. 3. 3. T r o i s i Ł m e j o u r (cid:201)valuation microscopique Examiner les cellules au microscope (cid:224) contraste de phase. Noter les changements morphologiques des cellules dus aux effets cytotoxiques du produit chimique testØ. Ce contr(cid:244)le est recommandØ pour exclure les erreurs expØrimentales, mais les observations ne sont pas utilisØes pour l’Øvaluation de la cytotoxicitØ ou de la photo- toxicitØ. Test de fixation du rouge neutre Laver les cellules avec 150 (cid:181)l de EBSS/PBS prØchauffØ. (cid:201)liminer la solution de lavage en tapotant lØgŁrement. Ajouter 100 (cid:181)l de milieu NR et incuber (cid:224) 37 (cid:176)C en atmosphŁre humidifiØe/7,5 % CO2, pendant 3 h. AprŁs incubation, Øliminer le milieu NR et laver les cellules avec 150 (cid:181)l de EBSS/PBS. DØcanter et absorber complŁtement le EBSS/PBS (facultatif: centrifuger la plaque retournØe). Ajouter exactement 150 (cid:181)l de solution de dØsorption du NR (solution d’Øthanol/acide acØtique fra(cid:238)chement prØparØ). Passer rapidement la plaque de microtitrage (cid:224) l’agitateur pendant 10 minutes, jusqu’(cid:224) ce que le NR soit extrait des cellules et ait formØ une solution homogŁne. Mesurer la densitØ optique de l’extrait de NR (cid:224) 540 nm dans un spectrophotomŁtre en utilisant les essais (cid:224) blanc comme rØfØrence. Sauvegarder les donnØes dans un format de fichier appropriØ (par exemple, ASCII) en vue d’une analyse ultØrieure. (1) Des dØtails supplØmentaires sont donnØs par la rØfØrence (12). 8. 6. 2000 FR Journal officiel des CommunautØs europØennes L 136/103 2. DONN(cid:201)ES 2. 1. QualitØ et quantitØ des donnØes Les donnØes doivent permettre une analyse significative des courbes concentration-rØponse obtenues avec et sans irradiation UVA/lumiŁre visible. Si on constate une cytotoxicitØ, il y a lieu d’ajuster (cid:224) la fois la gamme des concentrations et l’intervalle entre chaque concentration, afin qu’il y ait concordance entre la courbe et les donnØes expØrimentales. (cid:201)tant donnØ qu’un produit chimique peut ne pas Œtre cytotoxique jusqu’(cid:224) la concen- tration limite dØfinie de 100 (cid:181)g/ml dans l’expØrience (cid:224) l’obscuritØ (ﬂ UVA), mais Œtre trŁs cytotoxique lorsqu’il est irradiØ (+ UVA), il peut s’avØrer utile de faire diffØrer de plusieurs ordres de grandeur les gammes de concentrations (cid:224) tester dans les deux parties de l’expØrience, afin de satisfaire (cid:224) l’exigence de qualitØ des don- nØes. Si aucune cytotoxicitØ n’est constatØe dans les deux parties de l’expØrience (ﬂ UVA et + UVA), il suffit de rØaliser l’essai avec un grand intervalle entre chaque dose jusqu’(cid:224) la concentration maximale. Il n’est pas nØcessaire de procØder (cid:224) une contre-expØrience pour vØrifier un rØsultat clairement positif. Il n’est pas non plus nØcessaire de vØrifier les rØsultats clairement nØgatifs, (cid:224) condition que le produit chimique ait ØtØ testØ (cid:224) des concentrations suffisamment ØlevØes. Dans de tels cas, une expØrience principale, ØtayØe par une ou plusieurs expØriences prØliminaires de dØtermination des gammes de concentrations, est suffisante. Les tests qui donnent des rØsultats limites, proches du seuil critique du modŁle prØdictif, doivent Œtre vØrifiØs par une contre-expØrience. Si une contre-expØrience s’avŁre nØcessaire, il peut Œtre utile de faire varier les conditions expØrimentales afin d’obtenir un rØsultat bien net. Une des variables clØs dans ce test est la prØparation des solutions du produit chimique (cid:224) tester. Aussi la variation de ces conditions (cosolvant, pulvØrisation, sonication) peut-elle Œtre essentielle dans la rØpØtition d’un test. Une autre possibilitØ est de faire varier le temps de prØincubation. Une rØduction de cette durØe peut prØsenter un intØrŒt pour les produits chimiques instables dans l’eau. 2. 2. Traitement des rØsultats Si possible, on cherchera (cid:224) dØterminer la concentration du produit chimique (cid:224) tester qui entra(cid:238)ne une inhibi- tion de 50 % de la fixation du rouge neutre par les cellules (EC50). Cela peut se faire en appliquant n’importe quelle mØthode de rØgression non linØaire appropriØe (de prØfØrence une fonction de Hill ou une rØgression logistique) aux donnØes de rØponse aux concentrations, ou en utilisant d’autres mØthodes d’ajustement (14). Avant d’utiliser une EC50 pour la suite des calculs, il convient de vØrifier comme il se doit la qualitØ de l’ajus- tement. Une autre solution consiste (cid:224) utiliser des mØthodes d’ajustement graphique pour calculer l’EC50. Dans ce cas, il est recommandØ d’utiliser du papier semi-logarithmique (axe des x: log, axe des y: probit) car trŁs souvent, la fonction concentration-rØponse devient pratiquement linØaire aprŁs cette transformation. 2. 3. (cid:201)valuation des rØsultats (modŁles prØdictifs) 2. 3. 1. ModŁle prØdictif, version 1: facteur de photo-irritation (PIF) Si, tant en prØsence (+ UVA) qu’en absence (ﬂ UVA) de lumiŁre, on obtient des courbes concentration-rØponse complŁtes, on calcule un facteur de photo-irritation (PIF) (cid:224) l’aide de la formule suivante: Un PIF < 5 indique une absence de potentiel phototoxique, alors qu’un PIF ¯ 5 indique un potentiel phototoxi- que. Si un produit chimique est cytotoxique uniquement en prØsence de lumiŁre (+ UVA) et n’est pas cytotoxique dans les conditions ﬂ UVA, il n’est pas possible de calculer le PIF, bien que ce rØsultat indique un potentiel phototoxique. Dans un tel cas, on peut calculer un (cid:147)> PIF(cid:148) si le test de cytotoxicitØ ((cid:150)UV) est rØalisØ jusqu’(cid:224) la concentration d’essai la plus ØlevØe (Cmax); c’est cette derniŁre valeur qui est utilisØe pour calculer le (cid:147)> PIF(cid:148): Si l’on ne peut obtenir qu’un (cid:147)> PIF(cid:148), alors toute valeur > 1 indique un potentiel phototoxique. Si l’on ne peut calculer ni la EC50 (ﬂ UV) ni la EC50 (+ UV) parce que le produit chimique ne fait preuve d’au- cune cytotoxicitØ jusqu’(cid:224) la concentration d’essai la plus forte, cela dØmontre une absence de potentiel photo- toxique. Dans ce cas, on utilise un (cid:147)PIF = *1(cid:148) thØorique pour caractØriser ce rØsultat. L 136/104 FR Journal officiel des CommunautØs europØennes 8. 6. 2000 Si l’on ne peut obtenir qu’un (cid:147)PIF = *1(cid:148), cela signifie qu’il n’y a pas de potentiel phototoxique. Dans les cas (b) et (c), les concentrations atteintes dans le test de phototoxicitØ in vitro 3T3 NRU doivent Œtre soigneusement prises en considØration lors de la dØtermination du potentiel phototoxique. 2. 3. 2. ModŁle prØdictif, version 2: photo-effet moyen (MPE) (cid:192) titre de variante, on peut utiliser une nouvelle version du modŁle de prØdiction du potentiel phototoxique, qui a ØtØ mise au point (cid:224) partir des donnØes de l’Øtude de validation UE/COLIPA (15) et testØe en aveugle dans une Øtude subsØquente portant sur la phototoxicitØ in vitro des substances chimiques utilisØes comme filtres UV (13). Ce modŁle permet de s’affranchir des limites inhØrentes au modŁle PIF dans les cas oø l’on ne peut obtenir une EC50. Ce modŁle utilise le photo-effet moyen [(cid:147)Mean Photo Effect(cid:148) (MPE)] qui est une mesure basØe sur une comparaison des courbes concentration-rØponse complŁtes. Pour utiliser le modŁle MPE, l’uni- versitØ Humboldt (Berlin, Allemagne) a mis au point un logiciel spØcial qui peut Œtre obtenu gratuitement. 2. 4. InterprØtation des rØsultats Un rØsultat positif au test de phototoxicitØ in vitro 3T3 NRU (PIF ¯ 5 ou MPE ¯ 0,1) indique que la substance testØe a un potentiel phototoxique. Si ce rØsultat est obtenu (cid:224) des concentrations infØrieures (cid:224) 10 (cid:181)g/ml, le produit chimique est aussi susceptible d’agir comme une phototoxine dans diverses conditions d’exposition in vivo. Si un rØsultat positif n’est obtenu qu’(cid:224) la concentration d’essai maximale de 100 (cid:181)g/ml, d’autres investiga- tions peuvent s’avØrer nØcessaires pour Øvaluer les risques ou le pouvoir phototoxique. Il peut s’agir notam- ment d’Øtudier la pØnØtration et l’absorption cutanØes ou l’Øventuelle accumulation du produit chimique dans la peau, ou de soumettre le produit (cid:224) un autre type de test pour confirmer les rØsultats, en utilisant par exem- ple un modŁle de peau humaine in vitro. Un rØsultat nØgatif au test de phototoxicitØ in vitro 3T3 NRU (PIF < 5 ou MPE < 0,1) indique que la substance testØe ne s’est pas rØvØlØe phototoxique pour les cellules de mammifŁre en culture dans les conditions utilisØes. Dans les cas oø le produit chimique a pu Œtre testØ jusqu’(cid:224) la concentration maximale de 100 (cid:181)g/ml, un rØsul- tat nØgatif indique que le produit chimique n’a pas de potentiel phototoxique et qu’une phototoxicitØ in vivo peut Œtre considØrØe comme improbable. Dans les cas oø l’on a obtenu des rØponses toxiques identiques (EC50 + UV et EC50ﬂ UV) (cid:224) des concentrations plus faibles, l’interprØtation des rØsultats sera la mŒme. En revanche, si aucune toxicitØ n’a ØtØ mise en Øvidence (+ UV et ﬂ UV) et si la solubilitØ du produit dans l’eau a limitØ les concentrations (cid:224) des valeurs infØrieures (cid:224) 100 (cid:181)g/ml, il faut peut-Œtre s’interroger sur l’adØquation du systŁme d’essai pour la substance (cid:224) tester, et envisager un test de confirmation (par exemple, un test sur un modŁle de peau in vitro ou ex vivo, ou bien un test in vivo). 3. COMMUNICATION DES R(cid:201)SULTATS Rapport d’essai Le rapport d’essai doit comporter les informations suivantes: Produit chimique (cid:224) tester: (cid:151) donnØes d’identification et no CAS si connu, (cid:151) nature physique et puretØ, (cid:151) propriØtØs physicochimiques importantes pour la rØalisation de l’Øtude, (cid:151) stabilitØ et photostabilitØ si connues. Solvant: (cid:151) justification du choix du solvant, (cid:151) solubilitØ du produit chimique (cid:224) tester dans ce solvant, (cid:151) pourcentage de solvant prØsent dans le milieu de traitement (EBSS ou PBS). Cellules: (cid:151) type et provenance des cellules, (cid:151) absence de mycoplasmes, (cid:151) nombre de passages cellulaires, si connu, (cid:151) sensibilitØ des cellules aux UVA, dØterminØe avec l’Øquipement d’irradiation utilisØ dans le test de photo- toxicitØ in vitro 3T3 NRU. Conditions d’essai (a); incubation avant et aprŁs traitement: (cid:151) type et composition du milieu de culture, (cid:151) conditions d’incubation (concentration de CO2, tempØrature, humiditØ), (cid:151) durØe de l’incubation (avant traitement et aprŁs traitement). 8. 6. 2000 FR Journal officiel des CommunautØs europØennes L 136/105 Conditions d’essai (b); traitement par le produit chimique: (cid:151) justification des concentrations du produit chimique utilisØes en prØsence et en absence de rayonnement UV/lumiŁre visible, (cid:151) en cas de solubilitØ limitØe du produit chimique et d’absence de cytotoxicitØ, justification de la concentra- tion maximale utilisØe, (cid:151) type et composition du milieu de traitement (solution saline tamponnØe), (cid:151) durØe du traitement chimique. Conditions d’essai (c); irradiation: (cid:151) justification de la source de lumiŁre utilisØe, (cid:151) caractØristiques d’irradiance spectrale de la source de lumiŁre, (cid:151) caractØristiques de transmission/absorption du (des) filtre(s) utilisØ(s), (cid:151) caractØristiques du radiomŁtre et modalitØs d’Øtalonnage, (cid:151) distance entre la source de lumiŁre et le systŁme d’essai, (cid:151) irradiance UVA (cid:224) cette distance, exprimØe en mW/cm2, (cid:151) durØe de l’exposition UV/lumiŁre visible, (cid:151) dose d’UVA (irradiance (cid:215) temps), exprimØe en J/cm2, (cid:151) tempØrature appliquØe aux cultures cellulaires durant l’irradiation et aux cultures cellulaires maintenues concurremment dans l’obscuritØ. Conditions d’essai (d); test NRU: (cid:151) composition du milieu NR, (cid:151) durØe de l’incubation dans NR, (cid:151) conditions d’incubation (concentration de CO2, tempØrature, humiditØ), (cid:151) conditions d’extraction du NR (agent d’extraction, durØe), (cid:151) longueur d’ondes utilisØe pour la lecture spectrophotomØtrique de la densitØ optique du NR, (cid:151) seconde longueur d’ondes (rØfØrence), le cas ØchØant, (cid:151) contenu de l’Øchantillon destinØ (cid:224) l’essai (cid:224) blanc du spectrophotomŁtre, le cas ØchØant. RØsultats: (cid:151) viabilitØ cellulaire obtenue pour chaque concentration du produit chimique (cid:224) tester, exprimØe en % de la viabilitØ moyenne des tØmoins, (cid:151) courbes concentration-rØponse (concentration du produit chimique (cid:151) viabilitØ cellulaire relative) obte- nues dans les expØriences + UVA et ﬂ UVA parallŁles, (cid:151) analyse des donnØes fournies par les courbes concentration-rØponse: si possible, calcul/dØtermination des EC50 (+ UVA) et EC50 (ﬂ UVA), (cid:151) comparaison des deux courbes concentration-rØponse obtenues en prØsence et en absence de rayonne- ment UVA/lumiŁre visible, soit par le calcul du facteur de photo-irritation (PIF), soit par le calcul du photo-effet moyen (MPE), (cid:151) classification du potentiel phototoxique, (cid:151) critŁres d’acceptation de l’essai (a), tØmoin nØgatif simultanØ: (cid:151) viabilitØ absolue (densitØ optique de l’extrait de NR) des cellules irradiØes et des cellules non irradiØes, (cid:151) donnØes historiques sur le tØmoin nØgatif, Øcart moyen et Øcart type, critŁres d’acceptation de l’essai (b), tØmoin positif simultanØ: (cid:151) EC50 (+ UVA) et EC50 (ﬂ UVA) et PIF du produit chimique tØmoin positif, (cid:151) donnØes historiques sur le produit chimique tØmoin positif: EC50 (+ UVA) et EC50 (ﬂ UVA) et PIF, Øcart moyen et Øcart type. Discussion des rØsultats Conclusions L 136/106 FR Journal officiel des CommunautØs europØennes 8. 6. 2000 4. R(cid:201)F(cid:201)RENCES (1) Spielmann, H. , Balls, M. , D(cid:246)ring, B. , Holzh(cid:252)tter, H. G. , Kalweit, S. , Klecak, G. , L’Eplattenier, H. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Moldenhauer, F. , Moore, L. , Pape, W. , Pfannbecker, U. , Potthast, J. , De Silva, O. , Steiling, W. and Willshaw, A. ( 1994), EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay, Toxicology in Vitro 8, p. 793-796. (2) Anon (1998), Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxi- city), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA 26, p. 7-8. (3) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. W. , Pechovitch, G. , De Silva, O. , Holzh(cid:252)tter, H. G. , Clo- thier, R. , Desolle, P. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Pfannenbecker, U. , Potthast, J. M. , Csato, M. , Sladowski, D. , Steiling, W. and Brantom, P. (1998), EU/COLIPA (cid:147)In vitro phototoxicity(cid:148) validation study, results of phase II (blind trial), part 1: the 3T3 NRU phototoxicity test, Toxicology in Vitro 12, p. 305-327. (4) OECD Test Guidelines Programme, ENV/MC/CHEM/TG(96)9: Final Report of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation and Acceptance Criteria of Alternative Toxicological Test Methods, OECD Publications Office, Paris, 1996. (5) Lovell, W. W. (1993), A scheme for in vitro screening of substances for photoallergenic potential, Toxico- logy in Vitro 7, p. 95-102. (6) Santamaria, L. and Prino, G. (1972), List of the photodynamic substances, Research progress in organic, biological and medicinal chemistry Vol. 3 Part 1, North Holland Publishing Co, Amsterdam, p. XI-XXXV. (7) Spielmann, H. , Lovell, W. 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title: 2000/333/ΕΚ: Απόφαση της Επιτροπής, της 25ης Απριλίου 2000, για τον καθορισμό ειδικών όρων για την εισαγωγή δίθυρων μαλακίων, εχινοδέρμων, χιτωνοφόρων και θαλάσσιων γαστεροπόδων καταγωγής Σοσιαλιστικής Δημοκρατίας του Βιετνάμ [κοινοποιηθείσα υπό τον αριθμό Ε(2000) 1054] (Κείμενο που παρουσιάζει ενδιαφέρον για τον ΕΟΧ)

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text: L 114/42 EL Επίσηµη Εφηµερίδα των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων 13. 5. 2000 ΑΠΟΦΑΣΗ ΤΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ της 25ης Απριλίου 2000 για τον καθορισµό ειδικών όρων για την εισαγωγή δίθυρων µαλακίων, εχινοδέρµων, χιτωνοφόρων και θαλάσσιων γαστεροπόδων καταγωγής Σοσιαλιστικής ∆ηµοκρατίας του Βιετνάµ [κοινοποιηθείσα υπό τον αριθµό Ε(2000) 1054] (Κείµενο που παρουσιάζει ενδιαφέρον για τον ΕΟΧ) (2000/333/ΕΚ) Η ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΤΩΝ ΕΥΡΩΠΑΪΚΩΝ ΚΟΙΝΟΤΗΤΩΝ, Έχοντας υπόψη: τη συνθήκη για την ίδρυση της Ευρωπαϊκής Κοινότητας, την οδηγία 91/492/ΕΟΚ του Συµβουλίου, της 15ης Ιουλίου 1991, περί καθορισµού των υγειονοµικών κανόνων οι οποίοι διέ- πουν την παραγωγή και τη διάθεση στην αγορά δίθυρων µαλα- κίων (1), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από την οδηγία 97/ 79/ΕΚ (2), και ιδίως το άρθρο 9 σηµείο 3 στοιχείο β), Εκτιµώντας τα ακόλουθα: (1) (2) (3) (4) (5) Εµπειρογνώµονας της Επιτροπής πραγµατοποίησε επίσκεψη επιθεώρησης στη Σοσιαλιστική ∆ηµοκρατία του Βιετνάµ για να ελέγξει τους όρους υπό τους οποίους παράγονται, αποθηκεύονται και αποστέλλονται στην Κοινότητα τα προϊό- ντα αλιείας. Οι διατάξεις της νοµοθεσίας της Σοσιαλιστικής ∆ηµοκρα- τίας του Βιετνάµ καθιστούν το Εθνικό Κέντρο Επιθεώρησης της Αλιείας και ∆ιασφάλισης της Ποιότητας [«National Fis- heries Inspection and Quality Assurance Center (NAFI- QACEN)»] υπεύθυνο για τον υγειονοµικό έλεγχο των δίθυρων µαλακίων, των εχινοδέρµων, των χιτωνοφόρων και των θαλάσσιων γαστεροπόδων και για την παρακολούθηση της υγιεινής και των υγειονοµικών συνθηκών παραγωγής. Η ίδια νοµοθεσία εξουσιοδοτεί το NAFIQACEN να επιτρέπει ή να απαγορεύει την συλλογή δίθυρων µαλακίων, εχινο- δέρµων, χιτωνοφόρων και θαλάσσιων γαστεροπόδων από ορισµένες περιοχές. Το NAFIQACEN και τα εργαστήριά του έχουν τη δυνα- τότητα αποτελεσµατικού ελέγχου της της ισχύουσας νοµοθεσίας στη Σοσιαλιστική ∆ηµοκρατία του Βιετνάµ. εφαρµογής Οι αρµόδιες αρχές της Σοσιαλιστικής ∆ηµοκρατίας του Βιετνάµ ανέλαβαν να κοινοποιούν τακτικά και ταχέως στην Επιτροπή δεδοµένα σχετικά µε την παρουσία πλαγκτόν που περιέχει τοξίνες στις περιοχές συλλογής. Οι αρµόδιες αρχές της Σοσιαλιστικής ∆ηµοκρατίας του Βιετνάµ παρέσχον επίσηµες διασφαλίσεις σχετικά µε την τήρηση των απαιτήσεων του κεφαλαίου V του παραρτήµα- ισοδύναµων τος της οδηγίας 91/492/ΕΟΚ, καθώς και (1) ΕΕ L 268 της 24. 9. 1991, σ. 1. (2) ΕΕ L 24 της 30. 1. 1998, σ. 31. (6) (7) (8) απαιτήσεων προς εκείνες που περιγράφονται στην εν λόγω οδηγία για την ταξινόµηση των περιοχών παραγωγής και µετεγκατάστασης, την έγκριση των κέντρων αποστολής και καθαρισµού, καθώς και τον έλεγχο της δηµόσιας υγιεινής και την παρακολούθηση της παραγωγής. Η Σοσιαλιστική ∆ηµοκρατία του Βιετνάµ είναι επιλέξιµη προκειµένου να συµπεριληφθεί στον κατάλογο τρίτων χωρών που πληρούν τους όρους ισοδυναµίας που αναφέρο- νται στο άρθρο 9 σηµείο 3 στοιχείο α) της οδηγίας 91/ 492/ΕΟΚ. Η Σοσιαλιστική ∆ηµοκρατία του Βιετνάµ επιθυµεί να εξάγει στην Κοινότητα κατεψυγµένα ή µεταποιηµένα δίθυρα µαλά- κια, εχινόδερµα, χιτωνοφόρα και θαλάσσια γαστερόποδα τα οποία έχουν αποστειρωθεί ή έχουν υποστεί θερµική επεξερ- γασία σύµφωνα µε τις απαιτήσεις της απόφασης 93/25/ΕΟΚ της Επιτροπής (3), όπως τροποποιήθηκε από την απόφαση 97/275/ΕΚ (4). Για το σκοπο αυτό, θα πρέπει να καθορι- σθούν οι περιοχές παραγωγής από τις οποίες µπορούν να συλλεχθούν και να εξαχθούν στην Κοινότητα δίθυρα µαλά- κια, εχινόδερµα, χιτωνοφόρα και θαλάσσια γαστερόποδα. Οι ειδικοί όροι εισαγωγής θα πρέπει να εφαρµοσθούν µε την επιφύλαξη των αποφάσεων που λαµβάνονται σύµφωνα µε την οδηγία 91/67/ΕΟΚ του Συµβουλίου, της 28ης Ιανουα- ρίου 1991, σχετικά µε τους όρους υγειονοµικού ελέγχου που διέπουν τη διάθεση στην αγορά ζώων και προϊόντων υδατοκαλλιέργειας (5), όπως τροποποιήθηκε τελευταία από την οδηγία 95/22/ΕΚ (6). (9) Τα µέτρα που προβλέπονται στην παρούσα απόφαση είναι σύµφωνα µε τη γνώµη της µόνιµης κτηνιατρικής επιτροπής, ΕΞΕ∆ΩΣΕ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΑΠΟΦΑΣΗ: Άρθρο 1 Το Εθνικό Κέντρο Επιθεώρησης της Αλιείας και ∆ιασφάλισης της Ποιότητας (NAFIQACEN) του Υπουργείου Αλιείας είναι η αρµόδια αρχή στη Σοσιαλιστική ∆ηµοκρατία του Βιετνάµ για την εξα- κρίβωση και πιστοποίηση της τήρησης των απαιτήσεων της οδηγίας 91/492/ΕΟΚ. (3) ΕΕ L 16 της 25. 1. 1993, σ. 22. (4) ΕΕ L 108 της 25. 4. 1997, σ. 52. (5) ΕΕ L 46 της 19. 2. 1991, σ. 1. (6) ΕΕ L 243 της 11. 10. 1995, σ. 1. 13. 5. 2000 EL Επίσηµη Εφηµερίδα των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων L 114/43 Τα δίθυρα µαλάκια, εχινόδερµα, χιτωνοφόρα και θαλάσσια γαστερόποδα καταγωγής Σοσιαλιστικής ∆ηµοκρατίας του Βιετνάµ, τα οποία προορίζονται για ανθρώπινη κατανάλωση, πρέπει να προέρχονται από εγκεκριµένες εγκαταστάσεις, που εµφαίνονται στο συνηµµένο παράρτηµα. Άρθρο 2 Η παρούσα απόφαση απευθύνεται στα κράτη µέλη. Άρθρο 3 Βρυξέλλες, 25 Απριλίου 2000. Για την Επιτροπή David BYRNE Μέλος της Επιτροπής ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Αριθµός Ονοµασία 01 02 03 04 05 TAN THANH BINH DAI BA MUM AN THUY CON TRAU


title: Verordening (EG) nr. 828/2000 van de Commissie van 25 april 2000 tot wijziging van de uitvoerrestituties in de sector slachtpluimvee

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text: L 101/24 NL Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen 26. 4. 2000 VERORDENING (EG) Nr. 828/2000 VAN DE COMMISSIE van 25 april 2000 tot wĳziging van de uitvoerrestituties in de sector slachtpluimvee DE COMMISSIE VAN DE EUROPESE GEMEENSCHAPPEN, Gelet op het Verdrag tot oprichting van de Europese Gemeen- schap, Gelet op Verordening (EEG) nr. 2777/75 van de Raad van 29 oktober 1975 houdende een gemeenschappelĳke ordening der markten in de sector slachtpluimvee (1), laatstelĳk gewĳzigd bĳ Verordening (EG) nr. 2916/95 van de Commissie (2), en met name op artikel 8, lid 3, Overwegende hetgeen volgt: (1) (2) De bĳ uitvoer in de sector slachtpluimvee toe te passen restituties zĳn vastgesteld bĳ Verordening (EG) nr. 553/ 2000 van de Commissie (3). De toepassing van de in artikel 8 van Verordening (EEG) nr. 2777/75 vermelde criteria op de gegevens waarover de Commissie heden beschikt, geeft aanleiding tot wĳzi- ging van de op dit tĳdstip geldende restituties bĳ uitvoer in de zin als vermeld in de bĳlage bĳ deze verordening, HEEFT DE VOLGENDE VERORDENING VASTGESTELD: Artikel 1 De restituties bĳ uitvoer van de in artikel 1, lid 1, van Verorde- ning (EEG) nr. 2777/75 bedoelde producten, die vastgesteld zĳn in de bĳlage van de gewĳzigde Verordening (EG) nr. 553/ 2000 worden in overeenstemming met de bĳlage van deze verordening gewĳzigd. Artikel 2 Deze verordening treedt in werking op 26 april 2000. Deze verordening is verbindend in al haar onderdelen en is rechtstreeks toepasselĳk in elke lidstaat. Gedaan te Brussel, 25 april 2000. Voor de Commissie Franz FISCHLER Lid van de Commissie (1) PB L 282 van 1. 11. 1975, blz. 77. (2) PB L 305 van 19. 12. 1995, blz. 49. (3) PB L 67 van 15. 3. 2000, blz. 32. 26. 4. 2000 NL Publicatieblad van de Europese Gemeenschappen L 101/25 bĳ de verordening van de Commissie van 25 april 2000 tot wĳziging van de uitvoerrestituties in de sector slachtpluimvee BĲLAGE Productcode Bestemming (1) 0207 12 10 9900 0207 12 90 9190 0207 12 90 9990 02 03 02 03 02 03 Bedrag van de restitutie in EUR/100 kg 28,00 25,00 28,00 25,00 28,00 25,00 (1) Verklaring van de code: 02 voor de uitvoer naar Angola, Saudi-Arabië, Koeweit, Bahrein, Qatar, Oman, de Verenigde Arabische Emiraten, Jordanië, Jemen, Libanon, Irak en Iran, 03 voor de uitvoer naar Armenië, Azerbeidzjan, Wit-Rusland, Georgië, Kazachstan, Kirgizië, Moldavië, Rusland, Tadzjikistan, Turkme- nistan, Oezbekistan en Oekraïne. NB: Productcodes en voetnoten: zie de gewĳzigde Verordening (EEG) nr. 3846/87 van de Commissie