title: Directiva 2000/33/CE de la Comisión de 25 de abril de 2000 por la que se adapta por 27a vez al progreso técnico la Directiva 67/548/CEE del Consejo relativa a la aproximación de las disposiciones legales, reglamentarias y administrativas en materia de clasificación, embalaje y etiquetado de las sustancias peligrosas (Texto pertinente a efectos del EEE.)

eurovoc_concepts:
analytical chemistry
approximation of laws
chemical product
cytology
toxicology

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text: L 136/90 ES Diario Oficial de las Comunidades Europeas 8. 6. 2000 DIRECTIVA 2000/33/CE DE LA COMISI(cid:211)N de 25 de abril de 2000 por la que se adapta por 27a vez al progreso tØcnico la Directiva 67/548/CEE del Consejo relativa a la aproximaci(cid:243)n de las disposiciones legales, reglamentarias y administrativas en materia de clasificaci(cid:243)n, embalaje y etiquetado de las sustancias peligrosas (*) (Texto pertinente a efectos del EEE) LA COMISI(cid:211)N DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS, HA ADOPTADO LA PRESENTE DIRECTIVA: Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Europea, Art(cid:237)culo 1 Los textos de los anexos I y II de la presente Directiva se aæa- dirÆn a la parte B del anexo V de la Directiva 67/548/CEE. Art(cid:237)culo 2 1. Los Estados miembros adoptarÆn las disposiciones legales, reglamentarias y administrativas necesarias para cumplir la pre- sente Directiva a mÆs tardar el 1 de octubre de 2001 e infor- marÆn inmediatamente de ello a la Comisi(cid:243)n. Cuando los Estados miembros adopten dichas disposiciones, Østas harÆn referencia a la presente Directiva o irÆn acompaæa- das de dicha referencia en su publicaci(cid:243)n oficial. Los Estados miembros establecerÆn las modalidades de la mencionada refe- rencia. Los Estados miembros comunicarÆn a la Comisi(cid:243)n el 2. texto de las disposiciones bÆsicas de Derecho interno que adopten en el Æmbito regulado por la presente Directiva y un cuadro de correspondencias de las disposiciones de Derecho interno adoptadas con la presente Directiva. Art(cid:237)culo 3 La presente Directiva entrarÆ en vigor el tercer d(cid:237)a siguiente al de su publicaci(cid:243)n en el Diario Oficial de las Comunidades Euro- peas. Art(cid:237)culo 4 Los destinatarios de la presente Directiva serÆn los Estados miembros. Hecho en Bruselas, el 25 de abril de 2000. Por la Comisi(cid:243)n Margot WALLSTR(cid:214)M Miembro de la Comisi(cid:243)n Vista la Directiva 67/548/CEE del Consejo, de 27 de junio de 1967, relativa a la aproximaci(cid:243)n de las disposiciones legales, reglamentarias y administrativas en materia de clasificaci(cid:243)n, embalaje y etiquetado de las sustancias peligrosas (1), cuya œltima modificaci(cid:243)n la constituye la Directiva 1999/33/CE del Parlamento Europeo y del Consejo (2) y, en particular, su ar- t(cid:237)culo 28, Considerando lo siguiente: (1) (2) (3) (4) El anexo V de la Directiva 67/548/CEE establece los mØto- dos de determinaci(cid:243)n de las propiedades fisicoqu(cid:237)micas, la toxicidad y la ecotoxicidad de las sustancias y preparados. Es necesario adaptar dicho anexo al progreso tØcnico. El apartado 2 del art(cid:237)culo 7 de la Directiva 86/609/CEE del Consejo, de 24 de noviembre de 1986, relativa a la aproximaci(cid:243)n de las disposiciones legales, reglamentarias y administrativas de los Estados miembros respecto a la protecci(cid:243)n de los animales utilizados para experimenta- ci(cid:243)n y otros fines cient(cid:237)ficos (3), establece que «No deberÆ realizarse un experimento si se dispone de otro mØtodo razonable y factible para cient(cid:237)ficamente satisfactorio, obtener el resultado perseguido, y que no implique la uti- lizaci(cid:243)n de un animal». La Comisi(cid:243)n se propone introducir mØtodos de ensayo alternativos que no impliquen la utilizaci(cid:243)n de un animal en el anexo V de la Directiva 67/548/CEE de forma que estØn disponibles para efectuar ensayos con sustancias qu(cid:237)micas tal y como se definen en el apartado 1 del ar- t(cid:237)culo 3 de la Directiva 67/548/CEE. Las medidas adoptadas en la presente Directiva se ajustan al dictamen del ComitØ de adaptaci(cid:243)n al progreso tØcnico de las Directivas destinadas a eliminar las barreras tØcnicas al comercio de sustancias y preparados peligrosos. (*) Adoptada con auterioridad a la vigesimosexta adaptaci(cid:243)n (1) DO 196 de 16. 8. 1967, p. 1. (2) DO L 199 de 30. 7. 1999, p. 57. (3) DO L 358 de 18. 12. 1986, p. 1. 8. 6. 2000 ES Diario Oficial de las Comunidades Europeas L 136/91 ANEXO I «B. 40. CORROSI(cid:211)N CUT`NEA 1. M(cid:201)TODO 1. 1. Introducci(cid:243)n El Centro Europeo de Validaci(cid:243)n de MØtodos Alternativos (CEVMA, Centro Comœn de Investigaci(cid:243)n, Comi- si(cid:243)n Europea) ha considerado cient(cid:237)ficamente vÆlidos dos ensayos in vitro de corrosividad cutÆnea: el ensayo de resistencia elØctrica transcutÆnea en piel de rata [the rat skin transcutaneous electrical resistance (TER)] y un ensayo que emplea un modelo de piel humana (1) (2) (3). El estudio de validaci(cid:243)n del CEVMA demostr(cid:243) que ambos ensayos pod(cid:237)an discriminar de manera fiable entre agentes corrosivos y no corrosivos cutÆneos cono- cidos. AdemÆs, el protocolo del ensayo basado en un modelo de piel humana permiti(cid:243) una distinci(cid:243)n correcta entre grados de efectos corrosivos (agentes corrosivos potentes conocidos, R35, y otros agentes corrosivos cutÆneos, R34) (2). A continuaci(cid:243)n, se dan las descripciones y procedimientos de ambos ensayos, cuya elecci(cid:243)n depende de las necesidades concretas y las preferencias del usuario. VØase tambiØn la introducci(cid:243)n general de la parte B. 1. 2. Definiciones Corrosi(cid:243)n cutÆnea: producci(cid:243)n de daæos tisulares irreversibles en la piel tras la aplicaci(cid:243)n de una sustancia de ensayo. 1. 3. Sustancias de referencia No se especifica ninguna pero vØanse los puntos 1. 5. 3. 4 y 1. 7. 2. 3. 1. 4. Principio del mØtodo (cid:151) Ensayo TER en piel de rata La sustancia de ensayo se aplica durante 24 horas a las superficies epidØrmicas de discos cutÆneos tomados de la piel de ratas j(cid:243)venes sacrificadas sin causar sufrimientos. Las sustancias corrosivas se caracterizan por su capacidad de producir una pØrdida de la integridad normal de la capa c(cid:243)rnea y de la funci(cid:243)n de barrera. Esta pØrdida se mide como reducci(cid:243)n de la TER inherente por debajo de un umbral (5 kh) (4) (5). Las sus- tancias irritantes y no irritantes no reducen la TER por debajo del umbral. Para los surfactantes y las sutancias orgÆnicas neutras [vØase la definici(cid:243)n en la referencia (6)] puede incorporarse al procedimiento de ensayo un paso consistente en la fijaci(cid:243)n de un colorante con el fin de reducir el nœmero de falsos positivos que se obtienen concretamente con estos tipos qu(cid:237)micos (2) y (7). 1. 5. Descripci(cid:243)n del mØtodo (cid:151) Ensayo TER en piel de rata 1. 5. 1. Animales Para la preparaci(cid:243)n de los discos de piel se necesitan ratas j(cid:243)venes (20-23 d(cid:237)as) (Wistar o una cepa compara- ble). El pelo dorsal y de los costados se rasura con cuidado utilizando una maquinilla para animales pequeæos. A continuaci(cid:243)n se lavan los animales enjugÆndolos cuidadosamente al mismo tiempo que se sumerge la zona en una soluci(cid:243)n antibi(cid:243)tica (que contenga, por ejemplo, estreptomicina, penicilina, cloranfe- nicol y anfotericina en concentraciones que sean efectivas para inhibir el crecimiento bacteriano). Al tercer o cuarto d(cid:237)a despuØs del primer lavado se lavan otra vez los animales con antibi(cid:243)ticos y se usan dentro de los tres d(cid:237)as siguientes (los animales no pueden tener mÆs de 31 d(cid:237)as de edad para la preparaci(cid:243)n de piel). 1. 5. 2. Preparaci(cid:243)n de los discos cutÆneos Se sacrifican los animales sin sufrimientos. A continuaci(cid:243)n se retira la piel dorsal de cada animal y se le quita la grasa separÆndola de la piel cuidadosamente. Se coloca la piel en el extremo de un tubo de PTFE (politetra- fluorotileno), comprobando que la superficie epidØrmica estØ en contacto con el mismo. Se coloca a presi(cid:243)n un anillo de goma en el extremo del tubo para mantener la piel en su sitio y se recorta el tejido sobrante. En la figura 1 se dan las dimensiones del anillo y del tubo. DespuØs se sella con cuidado el anillo de goma al extremo del tubo de PTFE con vaselina. El tubo se sujeta mediante una pinza de muelle dentro de una cÆmara receptora que contiene una soluci(cid:243)n de sulfato de magnesio (154 mM) (figura 2). 1. 5. 3. Procedimiento 1. 5. 3. 1. A p l i c a c i (cid:243) n d e l m a t e r i a l d e e n s a y o Dentro del tubo se aplican a la superficie epidØrmica sustancias l(cid:237)quidas de ensayo (150 (cid:181)l) (figura 2). Cuando se prueban materias s(cid:243)lidas se aplica al disco una cantidad suficiente del s(cid:243)lido de tal manera que quede cubierta toda la superficie de epidermis. A continuaci(cid:243)n se vierte encima del s(cid:243)lido agua desionizada (150 (cid:181)l) y se agitan suavemente los tubos. Las sustancias de ensayo deben tener el mÆximo contacto posible con la piel. Para algunos s(cid:243)lidos este contacto mÆximo puede conseguirse calentando hasta 30 (cid:176)C para fundir la sus- tancia de ensayo o moliØndola para producir un polvo o un granulado. L 136/92 ES Diario Oficial de las Comunidades Europeas 8. 6. 2000 Para cada sustancia de ensayo se utilizan tres discos cutÆneos. La sustancia de ensayo se aplica durante 24 horas (vØase tambiØn el punto 1. 5. 3. 4) y se elimina lavando bajo el chorro de agua del grifo a 30 (cid:176)C hasta que no pueda eliminarse mÆs materia. La eliminaci(cid:243)n de sustancias de ensayo que se hayan solidificado en el tubo puede facilitarse mediante un lavado a chorro con agua caliente a aproximadamente 30 (cid:176)C. 1. 5. 3. 2. M e d i c i o n e s d e l a T E R La TER se mide mediante un puente de corriente alterna y baja tensi(cid:243)n (por ejemplo, AIM 401 o 6401, o equivalente). Antes de medir la resistencia elØctrica, se reduce la tensi(cid:243)n superficial de la piel aæadiendo la cantidad suficiente de etanol al 70 % para cubrir la epidermis. DespuØs de unos segundos se quita el etanol dando la vuelta al tubo y entonces se hidrata el tejido aplicando 3 ml de una soluci(cid:243)n de sulfato de magnesio (154 mM). Los electrodos del puente se colocan a ambos lados del disco cutÆneo para medir la resistencia en kh/disco (figura 2). En la figura 1 se dan las dimensiones de los electrodos y la longitud del electrodo expuesta por debajo de las pinzas de cocodrilo. La pinza que sujeta el electrodo interior (grueso) se coloca encima del tubo de PTFE durante la medici(cid:243)n de la resistencia para asegurarse de que la longitud del elec- trodo que queda surmergida en la soluci(cid:243)n de sulfato de magnesio es constante. El electrodo exterior (del- gado) se coloca dentro de la cÆmara receptora de manera que estØ en contacto con el fondo de la misma. La distancia entre el fondo de la pinza de muelle y el fondo del tubo de PTFE se mantendrÆ constante (figura 1), ya que esta distancia afecta al valor de la resistencia obtenido. TØngase en cuenta que si el valor de la resistencia medido es superior a 20 kh, puede deberse a la sustancia de ensayo que recubre la superficie epidØrmica del disco cutÆneo. Puede intentarse la eliminaci(cid:243)n de este recubrimiento, por ejemplo, sellando el tubo de PTFE con el pulgar cubierto de un guante y agitÆndolo aproximadamente diez segundos; se tira la soluci(cid:243)n de sulfato de magnesio y se repite la medici(cid:243)n de la resis- tencia con otra soluci(cid:243)n de sulfato de magnesio. Los resultados medios de la TER se aceptan a condici(cid:243)n de que los valores de control positivos y negativos en paralelo queden dentro de intervalos aceptables para el mØtodo. A continuaci(cid:243)n se dan las sustancias de control propuestas y sus intervalos de resistencia aceptables para la metodolog(cid:237)a y el instrumental: Control Sustancia Positivo Negativo 10 M de Æcido clorh(cid:237)drico (36 %) Agua destilada Intervalo de resistencia (kh) 0,5-1,0 10-25 1. 5. 3. 3. P r o c e d i m i e n t o m o d i f i c a d o p a r a s u r f a c t a n t e s y s u s t a n c i a s o r g Æ n i c a s n e u t r a s Si los valores TER de las sustancias de ensayo que sean surfactantes o sustancias orgÆnicas neutras son infe- riores o iguales a 5 kh, puede hacerse en los tejidos una evaluaci(cid:243)n de la penetraci(cid:243)n del colorante. Este pro- cedimiento determinarÆ si los resultados son falsos positivos (2). 1. 5. 3. 3. 1. Aplicaci(cid:243)n y eliminaci(cid:243)n del colorante sulforodamina B DespuØs del tratamiento inicial con la sustancia de ensayo, se aplicarÆn 150 ml de una diluci(cid:243)n al 10 % (p/v) de colorante sulforodamina B en agua destilada sobre la superficie epidØrmica de cada disco cutÆneo durante dos horas. A continuaci(cid:243)n, los discos se lavan a chorro con agua del grifo a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 segundos para eliminar el colorante excedente o sin fijar. Cada disco cutÆneo se retira cuidadosamente del tubo de PTFE y se coloca en un frasco (por ejemplo, un frasco de cristal de centelleo de 20 ml) que contenga agua desionizada (8 ml). Los frascos se agitan suavemente durante cinco minutos para eliminar el colorante excedente o sin fijar que haya quedado. Este procedimiento de aclarado se repite a con- tinuaci(cid:243)n, despuØs de lo cual se retiran los discos cutÆneos y se colocan en frascos que contengan 5 ml de dodecilsulfato s(cid:243)dico (SDS) al 30 % (p/v) en agua destilada y se dejan incubar una noche a 60 (cid:176)C. DespuØs de la incubaci(cid:243)n, se retira y desecha cada disco cutÆneo y la soluci(cid:243)n restante se centrifuga 8 minutos a 21 (cid:176)C (fuerza centr(cid:237)fuga relativa p 175). Luego, se diluye 1 a 5 (v/v) [es decir, 1 ml + 4 ml] una muestra de 1 ml del sobrenadante con dodecilsulfato s(cid:243)dico al 30 % (p/v) en agua destilada. La densidad (cid:243)ptica (DO) de la soluci(cid:243)n se mide a aproximadamente 565 nm. 1. 5. 3. 3. 2. CÆlculo del contenido en colorante El contenido en colorante sulfordamina B por disco se calcula a partir de los valores DO (coeficiente de extin- ci(cid:243)n molar del colorante sulforodamina B a 565 nm = 8,7 (cid:215) 104; peso molecular = 580). El contenido en colorante sulforodamina B se determina para cada disco cutÆneo y luego se calcula un contenido medio de colorante para los ensayos repetidos. Los resultados medios de fijaci(cid:243)n del colorante se aceptan a condici(cid:243)n de que los valores de control en paralelo queden dentro de intervalos aceptables para el mØtodo. A continua- ci(cid:243)n se dan los intervalos de contenido en colorante aceptables que se proponen para las sustancias de con- trol y para la metodolog(cid:237)a y el instrumental: 8. 6. 2000 ES Diario Oficial de las Comunidades Europeas L 136/93 Control Sustancia Positivo Negativo 10 M de Æcido clorh(cid:237)drico (36 %) Agua destilada Intervalo del contenido en colorante ((cid:181)g/disco) 40-100 15-35 1. 5. 3. 4. I n f o r m a c i (cid:243) n c o m p l e m e n t a r i a Pueden aplicarse tambiØn sustancias de ensayo a los discos cutÆneos durante per(cid:237)odos mÆs cortos (por ejem- plo, 2 horas) para identificar aquelllos materiales que sean fuertemente corrosivos. Sin embargo, en el estudio de validaci(cid:243)n, se hall(cid:243) que el ensayo TER sobrestimaba el potencial corrosivo de varias sustancias qu(cid:237)micas de ensayo despuØs de su aplicaci(cid:243)n a los discos cutÆneos durante 2 horas (2), aunque permit(cid:237)a la correcta identificaci(cid:243)n de sustancias corrosivas y no corrosivas despuØs de una aplicaci(cid:243)n de 24 horas. Las propiedades y dimensiones del instrumental de ensayo y el procedimiento experimental utilizado pueden influir en los valores TER obtenidos. El umbral de corrosi(cid:243)n de 5 kh se determin(cid:243) a partir de datos obteni- dos con el instrumental y el procedimiento concretos descritos en este mØtodo. Si las condiciones de ensayo se modifican de manera significativa, pueden aplicarse diferentes umbrales y valores de control. Por tanto, se recomienda que la metodolog(cid:237)a y el umbral de resistencia se calibren probando una serie de sustancias de referencia elegidas entre los productos qu(cid:237)micos utilizados en el estudio de validaci(cid:243)n (3). 1. 6. Principio del mØtodo (cid:151) Ensayo con modelo de piel humana El material de ensayo se aplica t(cid:243)picamente durante 4 horas a un modelo tridimensional de piel humana que comprende una epidermis reconstruida con una capa c(cid:243)rnea funcional. Los materiales corrosivos se caracteri- zan por su capacidad de producir una disminuci(cid:243)n de la viabilidad celular (determinada, por ejemplo, utili- zando el ensayo de reducci(cid:243)n del MTT) por debajo de determinados umbrales en per(cid:237)odos de exposici(cid:243)n especificados. El principio del ensayo parte de la hip(cid:243)tesis de que los productos qu(cid:237)micos corrosivos son los que pueden penetrar la capa c(cid:243)rnea (por difusi(cid:243)n o erosi(cid:243)n) y son suficientemente citot(cid:243)xicos para provocar la muerte de las cØlulas en las capas celulares subyacentes. 1. 7. Descripci(cid:243)n del mØtodo (cid:151) Ensayo con modelo de piel humana 1. 7. 1. Modelos de piel humana Los modelos de piel humana pueden tener diferentes or(cid:237)genes pero tienen que cumplir determinados crite- rios. El modelo debe tener una capa c(cid:243)rnea funcional con una capa subyacente de cØlulas vivas. La funci(cid:243)n de barrera de la capa c(cid:243)rnea debe ser adecuada, lo cual puede ponerse de manifiesto demostrando la resisten- cia del modelo a la citotoxicidad tras la aplicaci(cid:243)n de sustancias conocidas como citot(cid:243)xicas pero que nor- malmente no atraviesan la capa c(cid:243)rnea. Debe mostrarse que el modelo da resultados reproducibles en condi- ciones experimentales definidas. La viabilidad de las cØlulas vivas del modelo debe ser suficientemente alta para discriminar bien entre las sus- tancias de controles positivos y negativos. La viabilidad celular (por ejemplo, medida por la reducci(cid:243)n del MTT, es decir, un valor DO) tras la exposici(cid:243)n a la sustancia del control negativo debe quedar dentro de l(cid:237)mi- tes aceptables para el modelo en cuesti(cid:243)n. De la misma manera, los valores de viabilidad celular con la sus- tancia del control positivo (en relaci(cid:243)n con los del control negativo) deben quedar dentro de l(cid:237)mites especifi- cados y, lo que es mÆs importante, hay que demostrar que el modelo de predicci(cid:243)n utilizado cumple normas de validaci(cid:243)n internacionales (2). 1. 7. 2. Procedimiento 1. 7. 2. 1. A p l i c a c i (cid:243) n d e l a s u s t a n c i a d e e n s a y o Para materiales l(cid:237)quidos, debe aplicarse una cantidad de sustancia de ensayo suficiente para cubrir la superfi- cie cutÆnea (un m(cid:237)nimo de 25 (cid:181)l/cm2). Para los materiales s(cid:243)lidos, tiene que aplicarse suficiente cantidad de sustancia para cubrir la piel y, a continuaci(cid:243)n, debe humedecerse para asegurar un buen contacto con la piel; cuando convenga, deberÆn molerse los s(cid:243)lidos para transformarlos en polvo antes de su aplicaci(cid:243)n. Debe mostrarse que el mØtodo de aplicaci(cid:243)n es adecuado para una amplia gama de tipos qu(cid:237)micos (2). Al final del per(cid:237)odo de exposici(cid:243)n, el material de ensayo debe lavarse cuidadosamente de la superficie de la piel con una soluci(cid:243)n salina. 1. 7. 2. 2. M e d i c i (cid:243) n d e l a v i a b i l i d a d c e l u l a r Para medir la viabilidad celular puede emplearse cualquier mØtodo cuantitativo validado. El ensayo utilizado mÆs frecuentemente es la reducci(cid:243)n del MTT, que se ha comprobado que da resultados exactos y reproduci- bles en diferentes laboratorios (2). El disco cutÆneo se coloca en una soluci(cid:243)n de MTT de 0,3 mg/ml a 20-28 (cid:176)C durante 3 horas. A continuaci(cid:243)n se extrae el formazano azul precipitado (extracci(cid:243)n del disolvente) y se mide la concentraci(cid:243)n de formazano determinando la DO a una longitud de onda entre 545 y 595 nm. L 136/94 ES Diario Oficial de las Comunidades Europeas 8. 6. 2000 1. 7. 2. 3. I n f o r m a c i (cid:243) n c o m p l e m e n t a r i a El modelo de piel utilizado y el protocolo exacto del tiempo de exposici(cid:243)n y los procedimientos de lavado, etc. , tendrÆn un efecto importante en los resultados de la viabilidad celular. Se recomienda que la metodolo- g(cid:237)a y el modelo de predicci(cid:243)n se calibren probando una serie de sustancias de referencia elegidas entre los productos qu(cid:237)micos utilizados en el estudio de validaci(cid:243)n del CEVMA (3). Es crucial haber comprobado que el mØtodo utilizado es reproducible dentro y entre laboratorios para una amplia gama de productos qu(cid:237)micos con arreglo a normas internacionales. Como m(cid:237)nimo, el mØtodo debe cumplir los criterios de validez cient(cid:237)- fica definidos previamente (2) y los resultados de este estudio de validaci(cid:243)n deben publicarse en una revista cient(cid:237)fica que los someta a una revisi(cid:243)n inter pares. 2. RESULTADOS 2. 1. Tratamiento de los resultados 2. 1. 1. Ensayo TER en piel de rata Los valores de resistencia (kh) para la sustancia de ensayo, los controles positivos y negativos y los posibles productos qu(cid:237)micos de referencia deben darse en forma de tabla, incluyendo los datos de los experimentos repetidos, los valores medios y la clasificaci(cid:243)n derivada. 2. 1. 2. Ensayo con modelo de piel humana Los valores DO y los datos sobre viabilidad celular calculados en porcentaje para la sustancia de ensayo, los controles positivos y negativos y los posibles productos qu(cid:237)micos de referencia deben darse en forma de tabla, incluyendo los datos de los experimentos repetidos, los valores medios y la clasificaci(cid:243)n derivada. 2. 2. Evaluaci(cid:243)n e interpretaci(cid:243)n de los resultados 2. 2. 1. Ensayo TER sobre piel de rata Si el valor medio TER obtenido para la sustancia de ensayo es superior a 5 kh, la sustancia no es corrosiva. Si el valor TER es inferior o igual a 5 kh, y la sustancia de ensayo no es un surfactante ni una sustancia orgÆnica neutra, la sustancia es corrosiva. Para los surfactantes o sustancias orgÆnicas neutras que den valores TER inferiores o iguales a 5 kh, puede evaluarse la penetraci(cid:243)n de un colorante. Si el contenido medio de colorante en el disco es superior o igual al contenido medio de colorante en el disco del control positivo de HCl al 36 % obtenido en paralelo, la sus- tancia de ensayo es un positivo verdadero y, por tanto, es corrosiva. Si el contenido medio de colorante en el disco es inferior al contenido medio de colorante en el disco del control positivo de HCl al 36 % obtenido en paralelo, la sustancia de ensayo da un falso positivo y, por tanto, no es corrosiva. 2. 2. 2. Ensayo con modelo de piel humana El valor DO del control negativo representa el 100 % de viabilidad celular; de ah(cid:237) que los valores DO obteni- dos para cada muestra de ensayo puedan utilizarse para calcular un porcentaje de viabilidad respecto al con- trol negativo. El porcentaje de viabilidad celular que permite distinguir entre sustancias de ensayo corrosivas y no corrosivas (o discriminar entre diferentes tipos de sustancias corrosivas) tiene que definirse claramente en el modelo de predicci(cid:243)n antes de validar el mØtodo y el posterior estudio de validaci(cid:243)n debe demostrar que el valor que se utiliza para separar es adecuado (2). 3. INFORME Informe del ensayo El informe del ensayo debe dar, como m(cid:237)nimo, la informaci(cid:243)n siguiente: Sustancia de ensayo: (cid:151) datos de identificaci(cid:243)n, naturaleza f(cid:237)sica y, si procede, propiedades fisicoqu(cid:237)micas; tambiØn debe darse informaci(cid:243)n semejante para las sustancias de referencia, si se utilizan. Condiciones del ensayo: (cid:151) particularidades del procedimiento de ensayo empleado, (cid:151) descripci(cid:243)n y justificaci(cid:243)n de posibles modificaciones. 8. 6. 2000 ES Diario Oficial de las Comunidades Europeas L 136/95 Resultados: (cid:151) tabulaci(cid:243)n de los valores de resistencia (ensayo TER) o porcentajes de viabilidad celular (ensayo con modelo de piel humana) del material de ensayo, controles positivos y negativos y posibles productos qu(cid:237)- micos de referencia, incluyendo datos sobre experimentos repetidos y valores medios, (cid:151) descripci(cid:243)n de otros efectos observados. Discusi(cid:243)n de los resultados. Conclusiones. 4. BIBLIOGRAF˝A (1) ECVAM (1998), ECVAM News & Views, ATLA 26, pp. 275-280. (2) Fentem, J. H. , Archer, G. E. B. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. , Holzhutter, H-G. & Liebsch, M. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosi- vity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524. (3) Barratt, M. D. , Brantom, P. G. , Fentem, J. H. , Gerner, I. , Walker, A. P. & Worth, A. P. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals, Toxicology in Vitro 12, pp. 471-482. (4) Oliver, G. J. A. , Pemberton, M. A. & Rhodes, C. (1986), An in vitro skin corrosivity test (cid:151) modifications and validation, Food & Chemical Toxicology 24, pp. 507-512. (5) Botham, P. A. , Hall, T. J. , Dennett, R. , McCall, J. C. , Basketter, D. A. , Whittle, E. , Cheeseman, M. , Esdaile, D. J. & Gardner, J. (1992), The skin corrosivity test in vitro: results of an interlaboratory trial, Toxicology in Vitro 6, pp. 191-194. (6) Worth, A. P. , Fentem, J. H. , Balls, M. , Botham, P. A. , Curren, R. D. , Earl, L. K. , Esdaile, D. J. & Liebsch, M. the proposed OECD testing strategy for skin corrosion, ATLA 26, pp. (1998), An evaluation of 709-720. (7) Botham, P. A. , Chamberlain, M. , Barratt, M. D. , Curren, R. D. , Esdaile, D. J. , Gardner, J. R. , Gordon, V. C. , Hil- debrand, B. , Lewis, R. W. , Liebsch, M. , Logemann, P. , Osborne, R. , Ponec, M. , Regnier, J. F. , Steiling, W. , Walker, A. P. & Balls, M. (1995), A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM workshop 6, ATLA 23, pp. 219-255. L 136/96 ES Diario Oficial de las Comunidades Europeas 8. 6. 2000 Figura 1 8. 6. 2000 ES Diario Oficial de las Comunidades Europeas L 136/97 Figura 2 L 136/98 ES Diario Oficial de las Comunidades Europeas 8. 6. 2000 ANEXO II «B. 41. FOTOTOXICIDAD (cid:151) ENSAYO DE FOTOTOXICIDAD IN VITRO 3T3 NRU 1. M(cid:201)TODO 1. 1. Introducci(cid:243)n La fototoxicidad es una reacci(cid:243)n t(cid:243)xica que se produce tras la exposici(cid:243)n de la piel a determinadas sustancias qu(cid:237)micas y su posterior exposici(cid:243)n a la luz, o por irradiaci(cid:243)n de la piel tras la administraci(cid:243)n sistØmica de una sustancia qu(cid:237)mica. La informaci(cid:243)n que proporciona el ensayo de fototoxicidad in vitro 3T3 NRU sirve para determinar el poten- cial fotot(cid:243)xico de una sustancia de ensayo, es decir, para saber si puede entraæar peligros o no en caso de exposici(cid:243)n a las radiaciones UV y de luz visible. Dado que el parÆmetro toxicol(cid:243)gico que se pone de manifiesto con el ensayo in vitro es la fotocitotoxicidad, provocada por la acci(cid:243)n combinada de una sustancia y de la luz, el ensayo permite determinar compuestos que resultan fotot(cid:243)xicos in vivo tras su administraci(cid:243)n sistØmica y difusi(cid:243)n a la piel, as(cid:237) como compuestos que resultan fotoirritantes tras su aplicaci(cid:243)n t(cid:243)pica en la piel. El ensayo de fototoxicidad in vitro 3T3 NRU ha sido elaborado y validado en el marco de un proyecto con- junto UE/COLIPA entre 1992 y 1997 (1) (2) (3), con el fin de establecer un mØtodo in vitro vÆlido para susti- tuir a los diversos ensayos in vivo empleados. En 1996 se recomend(cid:243) en un taller de la OCDE un enfoque secuencial de ensayo in vitro para evaluar la fototoxicidad (4). Los resultados del ensayo de fototoxicidad in vitro 3T3 NRU se han comparado con los efectos de fototoxici- dad/fotoirritaci(cid:243)n aguda in vivo en animales y seres humanos, lo cual ha puesto de manifiesto que el ensayo proporciona una excelente predictividad de dichos efectos. El ensayo no estÆ diseæado para detectar otros efectos adversos de la acci(cid:243)n combinada de las sustancias qu(cid:237)micas y la luz, como pueden ser la fotogenotoxi- cidad, la fotoalergia y la fotocarcinogenicidad, si bien muchas sustancias qu(cid:237)micas que presentan esas propie- dades darÆn un resultado positivo en el ensayo de fototoxicidad in vitro 3T3 NRU. AdemÆs de ello, el ensayo tampoco permite evaluar la potencia fotot(cid:243)xica. El apØndice recoge un enfoque secuencial de ensayo de la fototoxicidad de sustancias qu(cid:237)micas. 1. 2. Definiciones Irradiancia: intensidad de radiaci(cid:243)n ultravioleta (UV) o visible que incide en una superficie, medida en W/m2 o mW/cm2. Dosis de luz: cantidad (= intensidad (cid:215) tiempo) de radiaci(cid:243)n ultravioleta (UV) o visible que incide en una superfi- cie, expresada en julios (= W (cid:215) s) por unidad de superficie, por ejemplo J/m2 o J/cm2. Longitud de onda de la luz UV: UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) y UVC ( 100-280 nm) [designaciones recomendadas por la CIE (Commission Internationale de L’Eclairage)]. TambiØn se emplean otras designacio- nes: la separaci(cid:243)n entre UVB y UVA suele situarse a 320 nm y las radiaciones UVA pueden subdividirse en UV-A1 y UV-A2, con una separaci(cid:243)n a 340 nm aproximadamente. Viabilidad celular: parÆmetro que mide la actividad total de una poblaci(cid:243)n celular (por ejemplo, captaci(cid:243)n del colorante vital rojo neutro por los lisosomas celulares), que, segœn el efecto que se mida y el tipo de ensayo realizado, corresponde al nœmero total y/o la viabilidad de las cØlulas. Viabilidad celular relativa: viabilidad celular respecto a la de los controles negativos (disolvente) que se toman a lo largo de todo el procedimiento de ensayo (+ UV o ﬂ UV), pero no se tratan con la sustancia de ensayo. Modelo de predicci(cid:243)n: algoritmo utilizado para transformar los resultados de un ensayo de toxicidad en una pre- dicci(cid:243)n de potencial t(cid:243)xico. En las presentes directrices de ensayo, pueden utilizarse el PIF y el MPE para transformar los resultados del ensayo de fototoxicidad in vitro 3T3 NRU en una predicci(cid:243)n del potencial foto- t(cid:243)xico. PIF (Photo Irritation Factor-Factor de fotoirritaci(cid:243)n): factor que se obtiene comparando dos concentraciones cito- t(cid:243)xicas igualmente eficaces (EC50) de la sustancia de ensayo en ausencia (ﬂ UV) y en presencia (+ UV) de una irradiaci(cid:243)n no citot(cid:243)xica con UVA/luz visible. MPE (Mean Photo Effect-Fotoefecto medio): nueva medida derivada de un anÆlisis matemÆtico del trazado com- pleto de dos curvas de concentraci(cid:243)n-respuesta obtenidas en ausencia (ﬂ UV) y en presencia (+ UV) de una irradiaci(cid:243)n no citot(cid:243)xica con UVA/luz visible. 8. 6. 2000 ES Diario Oficial de las Comunidades Europeas L 136/99 Fototoxicidad: reacci(cid:243)n t(cid:243)xica aguda que se produce tras la primera exposici(cid:243)n de la piel a determinadas sus- tancias qu(cid:237)micas y su posterior exposici(cid:243)n a la luz, o por irradiaci(cid:243)n de la piel tras la administraci(cid:243)n sistØmica de una sustancia qu(cid:237)mica. Fotoirritaci(cid:243)n: subcategor(cid:237)a del tØrmino (cid:147)fototoxicidad(cid:148), empleada para describir œnicamente las reacciones fotot(cid:243)xicas que se producen en la piel tras la exposici(cid:243)n (aplicaci(cid:243)n t(cid:243)pica o administraci(cid:243)n oral) a sustancias qu(cid:237)micas. Dichas reacciones fotot(cid:243)xicas provocan siempre daæos celulares inespec(cid:237)ficos (del tipo eritema solar). Fotoalergia: reactividad inmunol(cid:243)gica adquirida, que no se produce tras la primera exposici(cid:243)n a la sustancia qu(cid:237)mica y a la luz, y que requiere un per(cid:237)odo de inducci(cid:243)n de una o dos semanas antes de que se manifieste la reactividad cutÆnea. Fotogenotoxicidad: reacci(cid:243)n genot(cid:243)xica observada para un parÆmetro genØtico, que se produce tras la exposi- ci(cid:243)n de las cØlulas a una dosis no genot(cid:243)xica de luz UV/visible y a una sustancia qu(cid:237)mica no genot(cid:243)xica. Fotocarcinogenicidad: carcinogenicidad inducida por la exposici(cid:243)n repetida a la luz y a una sustancia qu(cid:237)mica. Se emplea el tØrmino (cid:147)fotococarcinogØnesis(cid:148) cuando el efecto carcin(cid:243)geno de las radiaciones UV se ve acre- centado por la exposici(cid:243)n a una sustancia qu(cid:237)mica. 1. 3. Sustancias de referencia AdemÆs de la clorpromacina empleada para el control positivo, que ha de someterse a ensayo en paralelo en cada caso, se recomienda utilizar como sustancias de referencia para el ensayo de fototoxicidad 3T3 NRU un subconjunto de las sustancias qu(cid:237)micas empleadas para dicho ensayo en las pruebas interlaboratorios (1) (3) (13). 1. 4. Consideraciones iniciales Se ha seæalado que numerosos tipos de sustancias qu(cid:237)micas producen efectos fotot(cid:243)xicos (5) (6) (7) (8). Su œnica caracter(cid:237)stica en comœn es la capacidad de absorber la energ(cid:237)a luminosa de la luz solar. Con arreglo a la primera ley de la fotoqu(cid:237)mica (ley de Grotthaus-Draper), para que se produzca fotorreacci(cid:243)n, es necesaria la absorci(cid:243)n de una cantidad suficiente de quanta de luz. Por tanto, antes de plantearse realizar un ensayo biol(cid:243)- gico conforme a las presentes directrices, debe determinarse el espectro de absorci(cid:243)n de rayos UV/luz visible de la sustancia de ensayo (por ejemplo segœn las directrices de ensayo 101 de la OCDE). Si el coeficiente de extinci(cid:243)n/absorci(cid:243)n molar es inferior a 10 litro (cid:215) molﬂ1 (cid:215) cmﬂ1, la sustancia carece de potencial fotorreactivo y no es preciso someterla al ensayo de fototoxicidad in vitro 3T3 NRU ni a ningœn otro ensayo biol(cid:243)gico de efectos fotoqu(cid:237)micos adversos (apØndice I). 1. 5. Principio del mØtodo Se han descrito cuatro mecanismos mediante los cuales la absorci(cid:243)n de luz por un crom(cid:243)foro (qu(cid:237)mico) puede dar lugar a una reacci(cid:243)n fotot(cid:243)xica (7) y todos ellos provocan daæos celulares. As(cid:237) pues, el ensayo de fototoxicidad in vitro 3T3 NRU se basa en la comparaci(cid:243)n de la citotoxicidad de una sustancia cuando se somete a ensayo exponiØndola a una dosis no citot(cid:243)xica de radiaci(cid:243)n UVA/luz visible y sin exponerla. La cito- toxicidad en este ensayo se expresa como la disminuci(cid:243)n, ligada a la concentraci(cid:243)n, de la captaci(cid:243)n del colo- rante vital rojo neutro (Neutral Red - NR (9)) 24 horas despuØs de la administraci(cid:243)n de la sustancia de ensayo y la irradiaci(cid:243)n. Se mantienen en cultivo cØlulas Balb/c 3T3 durante 24 horas hasta que se formen monocapas. Por cada sus- tancia de ensayo se preincuban durante 1 hora dos placas de 96 pocillos con ocho concentraciones distintas de la sustancia de ensayo. A continuaci(cid:243)n, una de las placas se expone a una dosis no citot(cid:243)xica de radiaci(cid:243)n UVA/luz visible de 5 J/cm2 UVA (experimento + UV) y la otra se mantiene en la oscuridad (experimento ﬂ UV). El medio de tratamiento se sustituye despuØs por un medio de cultivo en las dos placas y, tras otras 24 horas de incubaci(cid:243)n, se determina la viabilidad celular mediante el anÆlisis de captaci(cid:243)n del rojo neutro (Neu- tral Red Uptake - NRU) durante 3 horas. Se calcula, para cada una de las ocho concentraciones de ensayo, la viabilidad celular relativa, expresada en porcentaje de los controles negativos no tratados. Para predecir el potencial fotot(cid:243)xico, se comparan las reacciones a las distintas concentraciones obtenidas en presencia (+ UV) y en ausencia (ﬂ UV) de irradiaci(cid:243)n, por lo general al nivel EC50, es decir, la concentraci(cid:243)n que inhibe la viabi- lidad celular en un 50 % respecto a los controles sin tratar. 1. 6. Criterios de calidad Sensibilidad de las cØlulas a las radiaciones UVA-Datos de referencia: debe comprobarse peri(cid:243)dicamente la sensibili- dad de las cØlulas a las radiaciones UVA. Se siembran las cØlulas a la densidad empleada en el ensayo de foto- toxicidad in vitro 3T3 NRU y al d(cid:237)a siguiente se irradian con dosis de 1 a 9 J/cm2 de radiaci(cid:243)n UVA. Un d(cid:237)a despuØs, se determina la viabilidad celular mediante el ensayo NRU. Las cØlulas cumplen los criterios de cali- dad si, tras la irradiaci(cid:243)n con 5 J/cm2 UVA, su viabilidad es superior o igual al 80 % de la viabilidad de los controles mantenidos en la oscuridad. Con la dosis superior de radiaci(cid:243)n UVA (9 J/cm2), la viabilidad debe ser, al menos, igual al 50 % de la de los controles mantenidos en la oscuridad. Esta comprobaci(cid:243)n debe repe- tirse aproximadamente cada 10 pasos celulares. Sensibilidad de las cØlulas de los controles negativos a las radiaciones UVA-Ensayo en curso: el ensayo cumple los cri- terios de calidad si los controles negativos [cØlulas en una soluci(cid:243)n salina equilibrada de Earl (Earl’s Balanced Salt Solution-EBSS) con o sin 1 % de dimetilsulf(cid:243)xido (DMSO) o 1 % de etanol (EtOH)] en el experimento + UVA presentan una viabilidad superior o igual al 80 % de la de las cØlulas no irradiadas en el mismo disol- vente del experimento realizado en paralelo en la oscuridad (ﬂ UVA). L 136/100 ES Diario Oficial de las Comunidades Europeas 8. 6. 2000 Viabilidad de los controles negativos: la densidad (cid:243)ptica absoluta (OD540 NRU) medida en el extracto NR de los controles negativos indica si las 1 (cid:215) 104 cØlulas sembradas por pocillo han crecido en un tiempo de generaci(cid:243)n normal durante los dos d(cid:237)as del ensayo. (cid:201)ste se ajusta a los criterios de aceptaci(cid:243)n si la densidad (cid:243)ptica media (OD540 NRU) de los controles no tratados es ¯ 0,2. Control positivo: por cada ensayo de fototoxicidad in vitro 3T3 NRU, debe someterse a ensayo en paralelo una sustancia fotot(cid:243)xica conocida. Se recomienda utilizar la clorpromacina (CPZ) como control positivo, pues es la sustancia que se ha empleado en el estudio de validaci(cid:243)n EU/COLIPA. Se han definido los criterios de acep- taci(cid:243)n siguientes para el uso de CPZ conforme al protocolo normalizado en el ensayo de fototoxicidad in vitro 3T3 NRU: CPZ irradiada (+ UVA), EC50 = 0,1 a 2,0 (cid:181)g/ml; CPZ no irradiada (ﬂ UVA), EC50 = 7,0 a 90,0 (cid:181)g/ml. El factor de fotoirritaci(cid:243)n (PIF), es decir, la variaci(cid:243)n de la EC50 ha de ser, al menos, de 6. En lugar de la CPZ, pueden emplearse para los controles positivos en paralelo otras sustancias fotot(cid:243)xicas conocidas adecuadas a la naturaleza qu(cid:237)mica o a las caracter(cid:237)sticas de solubilidad de la sustancia de ensayo. En ese caso y sobre la base de los datos de referencia, deben definirse debidamente como criterios de acepta- ci(cid:243)n para el ensayo los intervalos de los valores de la EC50 y el PIF o el MPE. 1. 7. Descripci(cid:243)n del mØtodo 1. 7. 1. Preparaci(cid:243)n 1. 7. 1. 1. C Ø l u l a s Se recomienda el uso de una l(cid:237)nea celular permanente de fibroblastos de rat(cid:243)n (cid:151)Balb/c 3T3, clon 31(cid:151)proce- dente del ATCC o ECACC, pues es la que se ha empleado en el estudio de validaci(cid:243)n. TambiØn pueden obte- nerse buenos resultados utilizando otras cØlulas o l(cid:237)neas celulares segœn el mismo protocolo de ensayo, siem- pre y cuando las condiciones de cultivo estØn adaptadas a las necesidades particulares de las cØlulas, si bien en tal caso debe demostrarse la equivalencia. Debe comprobarse peri(cid:243)dicamente que las cØlulas no estÆn contaminadas por micoplasmas y s(cid:243)lo se utiliza- rÆn si los resultados de las comprobaciones son satisfactorios. Dado que la sensibilidad de las cØlulas a las radiaciones UVA puede aumentar con el nœmero de pasos, deben emplearse cØlulas Balb/c 3T3 sometidas al menor nœmero posible de pasos, preferiblemente menos de 100. Es importante comprobar peri(cid:243)dicamente la sensibilidad de las cØlulas Balb/c 3T3 a las radiaciones UVA con- forme al procedimiento de control de calidad descrito en las presentes directrices. 1. 7. 1. 2. M e d i o s y c o n d i c i o n e s d e c u l t i v o Deben emplearse medios de cultivo y condiciones de incubaci(cid:243)n apropiados para los pasos celulares sistemÆti- cos y durante el procedimiento de ensayo. En el caso de las cØlulas Balb/c 3T3, el medio de cultivo es DMEM enriquecido con un 10 % de suero de ternera reciØn nacida, 4 mM de glutamina, penicilina y estreptomicina, y han de incubarse en atm(cid:243)sfera humidificada, a 37 (cid:176)C/7,5 % CO2. Es particularmente importante que las con- diciones de cultivo celular permitan mantener la duraci(cid:243)n del ciclo celular dentro de los l(cid:237)mites normales de la l(cid:237)nea celular o las cØlulas utilizadas. 1. 7. 1. 3. P r e p a r a c i (cid:243) n d e l o s c u l t i v o s Se siembran cØlulas procedentes de cultivos stock congelados en un medio de cultivo a una densidad apro- piada y se subcultivan al menos una vez antes de utilizarlas en el ensayo de fototoxicidad in vitro 3T3 NRU. Para el ensayo de fototoxicidad, las cØlulas se siembran en el medio a una densidad que impida que los culti- vos confluyan antes de que finalice el ensayo, es decir, cuando se determine la viabilidad celular 48 horas des- puØs de la siembra celular. Para las cØlulas Balb/c 3T3 cultivadas en placas de 96 pocillos, se recomienda una densidad de 1 (cid:215) 104 cØlulas por pocillo. Para cada sustancia de ensayo se siembran las cØlulas de igual modo en dos placas distintas de 96 pocillos, que se mantendrÆn en condiciones de cultivo idØnticas a lo largo de todo el procedimiento de ensayo, excepto durante el tiempo en que una de ellas se irradia (+ UVA/luz visible) y la otra se mantiene en la oscuridad (ﬂ UVA/luz visible). 1. 7. 1. 4. A c t i v a c i (cid:243) n m e t a b (cid:243) l i c a Si bien es necesario utilizar sistemas de activaci(cid:243)n metab(cid:243)lica para todos los ensayos in vitro de predicci(cid:243)n del potencial genot(cid:243)xico o carcinogØnico, en el caso de la fototoxicolog(cid:237)a no se conoce hasta la fecha ninguna sustancia qu(cid:237)mica que requiera una transformaci(cid:243)n metab(cid:243)lica para actuar como fototoxina in vivo o in vitro. Por consiguiente, no resulta necesario ni estÆ fundado cient(cid:237)ficamente realizar el presente ensayo con un sis- tema de activaci(cid:243)n metab(cid:243)lica. 8. 6. 2000 ES Diario Oficial de las Comunidades Europeas L 136/101 1. 7. 1. 5. S u s t a n c i a d e e n s a y o - P r e p a r a c i (cid:243) n Las sustancias de ensayo deben prepararse justo antes de emplearlas, salvo que los datos de estabilidad demuestren que pueden conservarse. Puede ser necesario prepararlas bajo luz roja si es probable que se pro- duzca una fotodegradaci(cid:243)n rÆpida. Las sustancias de ensayo se disuelven en soluciones tamp(cid:243)n salinas, como la soluci(cid:243)n salina equilibrada de Earl (EBSS) o la soluci(cid:243)n tamp(cid:243)n fosfato (Phosphate Buffered Saline-PBS), que no deben contener componentes proteicos ni colorantes indicadores de pH que absorban la luz, con el fin de evitar interferencias durante la irradiaci(cid:243)n. Las sustancias de ensayo poco solubles en agua han de disolverse en disolventes apropiados a 100 veces la concentraci(cid:243)n final deseada y a continuaci(cid:243)n diluirse a 1:100 con la soluci(cid:243)n tamp(cid:243)n salina. Si se emplea un disolvente, debe hacerse a un volumen constante del 1 % (v/v) y en todos los cultivos, es decir, en los contro- les negativos y en todas las concentraciones de la sustancia de ensayo. Se recomienda el uso de los disolventes dimetilsulf(cid:243)xido (DMSO) y etanol (EtOH). Pueden emplearse otros disolventes de baja citotoxicidad (por ejemplo acetona), pero deben evaluarse detenidamente sus propiedades particulares (capacidad de reaccionar con la sustancia de ensayo, de atenuar el efecto fotot(cid:243)xico, de captar radicales). Si es preciso, puede emplearse un agitador mecÆnico, la sonicaci(cid:243)n o el calentamiento a 37 (cid:176)C para facilitar la disoluci(cid:243)n. 1. 7. 1. 6. I r r a d i a c i (cid:243) n U V - P r e p a r a c i (cid:243) n Fuente de luz: la elecci(cid:243)n de una fuente de luz y un filtrado apropiados es el factor determinante de los ensayos de fototoxicidad. Las porciones de radiaci(cid:243)n UVA y de luz visible suelen asociarse a la fotosensibilizaci(cid:243)n (7) (10), mientras que las de UVB revisten menor importancia, son directamente muy citot(cid:243)xicas y su citotoxici- dad se multiplica por 1000 entre 313 y 280 nm (11). Uno de los principales criterios para elegir una fuente de luz adecuada es que Østa emita longitudes de onda absorbidas por la sustancia de ensayo y que la dosis de luz (que pueda obtenerse en un tiempo razonable) sea suficiente para detectar los fotosensibilizadores conoci- dos. AdemÆs de ello, las longitudes de onda y las dosis empleadas no han de ser innecesariamente nocivas para el sistema de ensayo, teniendo en cuenta la emisi(cid:243)n de calor (porci(cid:243)n de infrarrojos). La mejor fuente de luz es la de los simuladores de radiaci(cid:243)n solar, en los que se emplean tanto arcos de xen(cid:243)n como arcos de mercurio (dopado) con haluro de metal. Estos œltimos presentan la ventaja de emitir menos calor y de ser mÆs econ(cid:243)micos, pero no reproducen exactamente la luz solar. Dado que todos los simuladores de radiaci(cid:243)n solar emiten cantidades importantes de rayos UVB, deben emplearse los filtros ade- cuados para atenuar sus longitudes de onda altamente citot(cid:243)xicas. Para el ensayo de fototoxicidad in vitro 3T3 NRU debe usarse un espectro de irradiancia prÆcticamente exento de UVB (UVA:UVB p 1:20). Se ha publicado un ejemplo de la distribuci(cid:243)n de la irradiancia espectral del simulador de la radiaci(cid:243)n solar filtrada utilizado en el estudio de validaci(cid:243)n del ensayo de fototoxicidad in vitro 3T3 NRU (3). Dosimetr(cid:237)a: debe comprobarse con regularidad la intensidad de luz (irradiancia) antes de cada ensayo de foto- toxicidad con un medidor de UV de banda ancha adecuado y previamente calibrado en funci(cid:243)n de la fuente de luz. Ha de comprobarse, asimismo, el correcto funcionamiento de dicho aparato, para lo cual se reco- mienda utilizar otro medidor de UV de referencia del mismo tipo y calibrado de igual manera. Lo ideal ser(cid:237)a emplear, a intervalos mayores, un espectrorradi(cid:243)metro para medir la irradiancia espectral de la fuente de luz filtrada y comprobar el calibrado del medidor de UV de banda ancha, si bien es cierto que para manejar esos instrumentos se precisa personal debidamente cualificado. En el estudio de validaci(cid:243)n se determin(cid:243) que la dosis de 5 J/cm2 (UVA) no resulta citot(cid:243)xica para las cØlulas Balb/c 3T3 y que es suficientemente potente para activar incluso las sustancias qu(cid:237)micas debilmente fotot(cid:243)xi- cas. Para obtener 5 J/cm2 en un plazo de 50 minutos, la irradiancia ha de ajustarse a 1,666 mW/cm2. Si se emplea otra l(cid:237)nea celular u otra fuente de luz, puede ser preciso adaptar ligeramente la dosis de rayos UVA de manera que no daæe las cØlulas y sea suficiente para detectar fototoxinas de referencia. La duraci(cid:243)n de la exposici(cid:243)n a la luz se calcula de la manera siguiente: 1. 7. 2. Condiciones de ensayo La concentraci(cid:243)n mÆxima de la sustancia de ensayo no debe superar los 100 (cid:181)g/ml, pues todas las sustancias fotot(cid:243)xicas han sido detectadas con concentraciones inferiores y, ademÆs, con concentraciones superiores aumenta la incidencia de falsos positivos (sobrepredicci(cid:243)n) (13). El pH de la concentraci(cid:243)n mÆs alta de sustan- cia de ensayo ha de ser satisfactorio (pH entre 6,5 y 7,8). L 136/102 ES Diario Oficial de las Comunidades Europeas 8. 6. 2000 Los rangos de las concentraciones de la sustancia de ensayo en presencia (+ UVA) y en ausencia (ﬂ UVA) de luz deben determinarse de forma adecuada mediante experimentos previos (range-finder experiments). El rango y el intervalo de una serie de concentraciones debe ajustarse de manera que las curvas de concentraci(cid:243)n-res- puesta estØn suficientemente confirmadas por los datos experimentales. Debe utilizarse una progresi(cid:243)n geomØ- trica de concentraciones (con un factor de diluci(cid:243)n constante). 1. 7. 3. Procedimiento (1) 1. 7. 3. 1. P r i m e r d (cid:237) a Se prepara una suspensi(cid:243)n de 1 (cid:215) 105 cØlulas/ml en el medio de cultivo y se vierten 100 (cid:181)l de medio de cul- tivo s(cid:243)lo en los pocillos perifØricos de una microplaca de cultivo tisular de 96 pocillos (= ensayos en blanco). En los demÆs pocillos se vierten 100 (cid:181)l de una suspensi(cid:243)n de 1 (cid:215) 105 cØlulas/ml (= 1 (cid:215) 104 cØlulas/pocillo). Se preparan dos placas con cada sustancia de ensayo: una para determinar la citotoxicidad (ﬂ UVA) y la otra para determinar la fotocitotoxicidad (+ UVA). Se incuban las cØlulas durante 24 horas (7,5 % CO2, 37 (cid:176)C) hasta que formen una monocapa semiconfluyente. Este per(cid:237)odo de incubaci(cid:243)n permite la recuperaci(cid:243)n, la adherencia y el crecimiento exponencial de las cØlulas. 1. 7. 3. 2. S e g u n d o d (cid:237) a Tras la incubaci(cid:243)n, se decanta el medio de cultivo de las cØlulas y se efectœan dos lavados con 150 (cid:181)l de EBSS/PBS por pocillo. Se aæaden 100 (cid:181)l de EBSS/PBS que contengan la concentraci(cid:243)n adecuada de la sustan- cia de ensayo o s(cid:243)lo disolvente (control negativo). Se aæaden 8 concentraciones distintas de la sustancia de ensayo. Se incuban las cØlulas con la sustancia de ensayo durante 60 minutos en la oscuridad (7,5 % CO2, 37 (cid:176)C). Para realizar la parte (+ UVA) del ensayo se irradian las cØlulas a temperatura ambiente durante 50 minutos a travØs de la tapa de la placa de 96 pocillos con una dosis de 1,7 mW/cm2 UVA (= 5 J/cm2). Se airea con un ventilador para evitar la condensaci(cid:243)n de H2O bajo la tapa. Se mantienen las placas que no se van a irradiar (ﬂ UVA) a temperatura ambiente durante 50 minutos (= tiempo de exposici(cid:243)n a los rayos UVA) en la oscuri- dad. Se decanta la soluci(cid:243)n de ensayo y se lava dos veces con 150 (cid:181)l de EBSS/PBS. Se sustituye la EBSS/PBS por el medio de cultivo y se incuba (7,5 % CO2, 37 (cid:176)C) hasta el d(cid:237)a siguiente (18-22 horas). 1. 7. 3. 3. T e r c e r d (cid:237) a Evaluaci(cid:243)n microsc(cid:243)pica Se examinan las cØlulas en un microscopio con dispositivo para contraste de fase. Se registran los cambios morfol(cid:243)gicos de las cØlulas debidos a los efectos citot(cid:243)xicos de la sustancia de ensayo. Se recomienda efectuar esta comprobaci(cid:243)n para excluir los errores experimentales, si bien las observaciones no se emplean para eva- luar la citotoxicidad ni la fototoxicidad. Ensayo de captaci(cid:243)n del rojo neutro Se lavan las cØlulas con 150 (cid:181)l de EBSS/PBS precalentada. Se elimina la soluci(cid:243)n de lavado con unos golpeci- tos suaves. Se aæaden 100 (cid:181)l de medio con NR y se incuba durante 3 horas a 37 (cid:176)C, en atm(cid:243)sfera humidifi- cada con 7,5 % CO2. Tras la incubaci(cid:243)n, se elimina el medio con NR y se lavan las cØlulas con 150 (cid:181)l de EBSS/PBS. Se decanta y se absorbe completamente la EBSS/PBS (Facultativo: centrifugado de la placa invertida). Se aæaden exactamente 150 (cid:181)l de soluci(cid:243)n de desorci(cid:243)n del NR (soluci(cid:243)n de etanol/Æcido acØtico reciØn pre- parada). Se agita rÆpidamente la placa en un agitador de microplacas durante 10 minutos, hasta que el NR se extraiga de las cØlulas y forme una soluci(cid:243)n homogØnea. Se mide la densidad (cid:243)ptica del extracto de NR a 540 nm en un espectrofot(cid:243)metro y se utilizan los ensayos en blanco como referencia. Se guardan los datos en un formato de fichero apropiado (por ejemplo ASCII) para su posterior anÆlisis. (1) La referencia 12 de la biobliograf(cid:237)a contiene mayor informaci(cid:243)n. 8. 6. 2000 ES Diario Oficial de las Comunidades Europeas L 136/103 2. RESULTADOS 2. 1. Calidad y cantidad de los resultados Los datos deben permitir un anÆlisis significativo de las respuestas obtenidas con cada concentraci(cid:243)n, en pre- sencia y en ausencia de radiaci(cid:243)n UVA/luz visible. Si se comprueba que hay fototoxicidad, tanto el rango de concentraciones como el intervalo entre cada concentraci(cid:243)n deben establecerse de manera que los datos expe- rimentales puedan representarse en una curva. Dado que una sustancia de ensayo puede no producir efectos citot(cid:243)xicos con la concentraci(cid:243)n l(cid:237)mite definida de 100 (cid:181)g/ml en el experimento realizado en la oscuridad (ﬂ UVA), pero puede resultar muy citot(cid:243)xica en el experimento irradiado (+ UVA), puede ser necesario emplear rangos de concentraciones de (cid:243)rdenes de magnitud distintos en las dos partes del experimento para obtener resultados de calidad adecuada. Si no se comprueba citotoxicidad en ninguna de las dos partes del experi- mento (ﬂ UVA y + UVA), es suficiente realizar el ensayo con concentraciones separadas por un gran intervalo hasta alcanzar la concentraci(cid:243)n mÆxima. No es preciso comprobar un resultado claramente positivo repitiendo el experimento. Los resultados clara- mente negativos tampoco han de comprobarse, siempre y cuando la sustancia se haya sometido a ensayo a concentraciones suficientemente altas. En esos casos, basta realizar un experimento principal y uno o varios experimentos previos para determinar los rangos de concentraciones. Los ensayos que den resultados l(cid:237)mite, pr(cid:243)ximos a la l(cid:237)nea de corte del modelo de predicci(cid:243)n, deben compro- barse repitiendo el experimento. Si se considera necesario repetir el ensayo, puede ser importante modificar las condiciones experimentales para obtener un resultado inequ(cid:237)voco. En este ensayo, la preparaci(cid:243)n de las soluciones de la sustancia pro- blema constituye una variable fundamental. Por consiguiente, al repetir el ensayo puede ser esencial modificar dichas condiciones (codisolvente, trituraci(cid:243)n, sonicaci(cid:243)n, etc. ). TambiØn puede plantearse modificar la dura- ci(cid:243)n de la incubaci(cid:243)n previa a la irradiaci(cid:243)n. En el caso de las sustancias inestables en el agua puede ser con- veniente reducir dicha duraci(cid:243)n. 2. 2. Tratamiento de los resultados Si es posible, conviene determinar la concentraci(cid:243)n de sustancia de ensayo que da lugar a una inhibici(cid:243)n del 50 % de la captaci(cid:243)n celular de rojo neutro (EC50). Puede hacerse aplicando cualquier mØtodo de regresi(cid:243)n no lineal adecuado (preferiblemente una funci(cid:243)n de Hill o una regresi(cid:243)n log(cid:237)stica) a los resultados de respuesta a las concentraciones o mediante otros mØtodos de ajuste (14). Antes de emplear una EC50 para los cÆlculos posteriores, ha de comprobarse debidamente la calidad del ajuste. TambiØn pueden utilizarse mØtodos de ajuste grÆfico para calcular la EC50. En tal caso, se recomienda usar papel probabil(cid:237)stico (eje x: log, eje y: probit), pues en numerosas ocasiones la funci(cid:243)n concentraci(cid:243)n-respuesta pasa a ser prÆcticamente lineal despuØs de esa transformaci(cid:243)n. 2. 3. Evaluaci(cid:243)n de los resultados (modelos de predicci(cid:243)n) 2. 3. 1. Modelo de predicci(cid:243)n-versi(cid:243)n 1: factor de fotoirritaci(cid:243)n (PIF) Si, tanto en presencia (+ UVA) como en ausencia (ﬂ UVA) de luz, se obtienen curvas completas de concentra- ci(cid:243)n-respuesta, se calcula el factor de fotoirritaci(cid:243)n (PIF) mediante la f(cid:243)rmula siguiente: Un PIF < 5 predice la ausencia de potencial fotot(cid:243)xico, mientras que un PIF ¯ 5 predice la existencia de potencial fotot(cid:243)xico. Si una sustancia es citot(cid:243)xica en presencia de luz (+ UVA) y no lo es en ausencia de luz (ﬂ UVA), no puede calcularse el PIF, si bien ese resultado indica la existencia de potencial fotot(cid:243)xico. En tales casos, puede calcu- larse un (cid:147)> PIF(cid:148) si el ensayo de citotoxicidad (ﬂ UV) se ha realizado hasta la concentraci(cid:243)n de ensayo mÆxima (CmÆx), pues Øste es el valor que se emplea para el cÆlculo del (cid:147)> PIF(cid:148): Si œnicamente puede obtenerse un (cid:147)> PIF(cid:148), todo valor > 1 predice un potencial fotot(cid:243)xico. Si no puede calcularse ni la EC50 (ﬂ UV) ni la EC50 (+ UV) porque la sustancia no produce efectos citot(cid:243)xicos ni a la concentraci(cid:243)n de ensayo mÆxima, significa que Østa carece de potencial fotot(cid:243)xico. En tal caso, se uti- liza un (cid:147)PIF = * 1(cid:148) te(cid:243)rico para caracterizar el resultado. L 136/104 ES Diario Oficial de las Comunidades Europeas 8. 6. 2000 Si œnicamente puede obtenerse un (cid:147)PIF = * 1(cid:148), el ensayo predice la ausencia de potencial fotot(cid:243)xico. En los casos b) y c), a la hora de predecir el potencial fotot(cid:243)xico deben tomarse detenidamente en considera- ci(cid:243)n las concentraciones alcanzadas en el ensayo de fototoxicidad in vitro 3T3 NRU. 2. 3. 2. Modelo de predicci(cid:243)n-versi(cid:243)n 2: fotoefecto medio (MPE) Puede aplicarse como variante una nueva versi(cid:243)n del modelo de predicci(cid:243)n del potencial fotot(cid:243)xico, que se ha elaborado sobre la base de los datos del estudio de validaci(cid:243)n EU/COLIPA (15) y se ha probado en ciego en un estudio posterior relativo a la fototoxicidad in vitro de sustancias empleadas como de UV (13). Este modelo permite superar la limitaci(cid:243)n del modelo basado en el PIF en los casos en que no puede obtenerse una EC50. El modelo utiliza el fotoefecto medio (MPE), que es una medida basada en la comparaci(cid:243)n de las curvas completas de concentraci(cid:243)n-respuesta. Para aplicar el modelo MPE, la Universidad Humboldt (Berl(cid:237)n, Alemania) ha elaborado un programa informÆtico especial, que puede obtenerse de forma gratuita. 2. 4. Interpretaci(cid:243)n de los resultados Un resultado positivo en el ensayo de fototoxicidad in vitro 3T3 NRU (PIF ¯ 5 o MPE ¯ 0,1) indica que la sus- tancia de ensayo presenta un potencial fotot(cid:243)xico. Si dicho resultado se ha producido con concentraciones inferiores a 10 (cid:181)g/ml, es probable que la sustancia de ensayo tambiØn tenga efectos fotot(cid:243)xicos en diversas condiciones de exposici(cid:243)n in vivo. Si el resultado es positivo œnicamente con la concentraci(cid:243)n de ensayo mÆxima de 100 (cid:181)g/mL, para evaluar el peligro o el poder fotot(cid:243)xico puede ser necesario tomar en considera- ci(cid:243)n otros aspectos como la penetraci(cid:243)n y la absorci(cid:243)n cutÆneas y la posible acumulaci(cid:243)n de la sustancia en la piel, o someter la sustancia a otro tipo de ensayo para confirmar los resultados empleando, por ejemplo, un modelo de piel humana in vitro. Un resultado negativo en el ensayo de fototoxicidad in vitro 3T3 NRU (PIF < 5 o MPE < 0,1) indica que la sus- tancia de ensayo no tiene efectos fotot(cid:243)xicos en las cØlulas cultivadas de mam(cid:237)fero en las condiciones aplica- das. Si la sustancia se ha podido someter a ensayo hasta la concentraci(cid:243)n mÆxima de 100 (cid:181)g/ml, un resultado negativo indica que la sustancia carece de potencial fotot(cid:243)xico y es improbable que produzca efectos fotot(cid:243)xi- cos in vivo. Si se obtienen reacciones t(cid:243)xicas idØnticas (EC50 + UV y EC50 ﬂ UV) con concentraciones inferiores, los datos han de interpretarse del mismo modo. Sin embargo, si no se ha producido toxicidad (+ UV y ﬂ UV) y la solubilidad de la sustancia de ensayo en el agua ha limitado las concentraciones a menos de 100 (cid:181)g/ml, cabe dudar de la compatibilidad de la sustancia con el mØtodo de ensayo y debe plantearse la realizaci(cid:243)n de un ensayo de confirmaci(cid:243)n (por ejemplo, con un modelo de piel in vitro o ex vivo, o bien un ensayo in vivo). 3. INFORME Informe del ensayo El informe del ensayo debe incluir la informaci(cid:243)n siguiente: Sustancia de ensayo: (cid:151) datos de identificaci(cid:243)n y no CAS, si se conoce, (cid:151) naturaleza f(cid:237)sica y pureza, (cid:151) propiedades fisicoqu(cid:237)micas importantes para la realizaci(cid:243)n del estudio, (cid:151) estabilidad y fotoestabilidad, si se conocen. Disolvente: (cid:151) justificaci(cid:243)n de la elecci(cid:243)n del disolvente, (cid:151) solubilidad de la sustancia de ensayo en el disolvente, (cid:151) porcentaje de disolvente presente en el medio de tratamiento (EBSS o PBS). CØlulas: (cid:151) tipo y procedencia de las cØlulas, (cid:151) ausencia de micoplasma, (cid:151) nœmero de pasos celulares, si se conoce, (cid:151) sensibilidad de las cØlulas a la radiaci(cid:243)n UVA, determinada con el equipo de irradiaci(cid:243)n utilizado en el ensayo de fototoxicidad in vitro 3T3 NRU. Condiciones de ensayo (a)-Incubaci(cid:243)n antes y despuØs del tratamiento: (cid:151) tipo y composici(cid:243)n del medio de cultivo, (cid:151) condiciones de incubaci(cid:243)n (concentraci(cid:243)n de CO2, temperatura y humedad), (cid:151) duraci(cid:243)n de la incubaci(cid:243)n (tratamiento previo y posterior). 8. 6. 2000 ES Diario Oficial de las Comunidades Europeas L 136/105 Condiciones de ensayo (b)-Tratamiento con la sustancia: (cid:151) fundamento de la elecci(cid:243)n de concentraciones de la sustancia de ensayo empleadas en presencia y en ausencia de radiaci(cid:243)n UV/luz visible, (cid:151) en caso de que la sustancia de ensayo sea escasamente soluble y no sea citot(cid:243)xica, fundamento de la elec- ci(cid:243)n de la mayor concentraci(cid:243)n empleada, (cid:151) tipo y composici(cid:243)n del medio de tratamiento (soluci(cid:243)n salina tamp(cid:243)n), (cid:151) duraci(cid:243)n del tratamiento qu(cid:237)mico. Condiciones de ensayo (c)-Irradiaci(cid:243)n: (cid:151) fundamento de la elecci(cid:243)n de la fuente de luz empleada, (cid:151) caracter(cid:237)sticas de la irradiancia espectral de la fuente de luz, (cid:151) caracter(cid:237)sticas de transmisi(cid:243)n/absorci(cid:243)n del filtro o filtros utilizados, (cid:151) caracter(cid:237)sticas del radi(cid:243)metro y condiciones de calibrado, (cid:151) distancia entre la fuente de luz y el sistema de ensayo, (cid:151) irradiancia UVA a esa distancia, expresada en mW/cm2, (cid:151) duraci(cid:243)n de la exposici(cid:243)n a la radiaci(cid:243)n UV/luz visible, (cid:151) dosis de radiaci(cid:243)n UVA (irradiancia (cid:215) tiempo), expresada en J/cm2, (cid:151) temperatura aplicada a los cultivos celulares durante la irradiaci(cid:243)n y a los mantenidos en la oscuridad en paralelo. Condiciones de ensayo (d)-Ensayo NRU: (cid:151) composici(cid:243)n del medio NR, (cid:151) duraci(cid:243)n de la incubaci(cid:243)n en NR, (cid:151) condiciones de incubaci(cid:243)n (concentraci(cid:243)n de CO2, temperatura y humedad), (cid:151) condiciones de extracci(cid:243)n del NR (agente de extracci(cid:243)n, duraci(cid:243)n), (cid:151) longitud de onda empleada para la lectura espectrofotomØtrica de la densidad (cid:243)ptica del NR, (cid:151) segunda longitud de onda (referencia), si procede, (cid:151) contenido del ensayo en blanco del espectrofot(cid:243)metro, si procede. Resultados: (cid:151) viabilidad celular obtenida con cada concentraci(cid:243)n de la sustancia de ensayo, expresada en % de la viabili- dad media de los controles, (cid:151) curvas de concentraci(cid:243)n-respuesta (concentraci(cid:243)n de la sustancia de ensayo (cid:151) viabilidad celular relativa), obtenidas en los experimentos + UVA y ﬂ UVA realizados en paralelo, (cid:151) anÆlisis de los datos derivados de las curvas de concentraci(cid:243)n-respuesta: si es posible, computaci(cid:243)n/cÆl- culo de la EC50 (+ UVA) y EC50 (ﬂ UVA), (cid:151) comparaci(cid:243)n de las dos curvas de concentraci(cid:243)n-respuesta obtenidas en presencia y en ausencia de irra- diaci(cid:243)n UVA/luz visible, calculando el factor de fotoirritaci(cid:243)n (PIF) o el fotoefecto medio (MPE), (cid:151) clasificaci(cid:243)n del potencial fotot(cid:243)xico, (cid:151) criterios de aceptaci(cid:243)n del ensayo (a)-Control negativo en paralelo: (cid:151) viabilidad absoluta (densidad (cid:243)ptica del extracto de NR) de las cØlulas irradiadas y las no irradiadas, (cid:151) datos de referencia del control negativo, media y desviaci(cid:243)n estÆndar, (cid:151) criterios de aceptaci(cid:243)n del ensayo (b)-Control positivo en paralelo: (cid:151) EC50 (+ UVA), EC50 (ﬂ UVA) y PIF de la sustancia del control positivo, (cid:151) datos de referencia de la sustancia del control positivo: EC50 (+ UVA), EC50 (ﬂ UVA) y PIF, media y desviaci(cid:243)n estÆndar. Discusi(cid:243)n de los resultados. Conclusiones. L 136/106 ES Diario Oficial de las Comunidades Europeas 8. 6. 2000 4. BIBLIOGRAF˝A (1) Spielmann, H. , Balls, M. , D(cid:246)ring, B. , Holzh(cid:252)tter, H. G. , Kalweit, S. , Klecak, G. , L’Eplattenier, H. , Liebsch, M. , Lovell, W. W. , Maurer, T. , Moldenhauer, F. , Moore, L. , Pape, W. , Pfannbecker, U. , Potthast, J. , De Silva, O. , Steiling, W. and Willshaw, A. ( 1994), EEC/COLIPA project on in vitro phototoxicity testing: First results obtained with a Balb/c 3T3 cell phototoxicity assay, Toxicology in Vitro 8, pp. 793-796. (2) Anon (1998), Statement on the scientific validity of the 3T3 NRU PT test (an in vitro test for phototoxi- city), European Commission, Joint Research Centre: ECVAM and DGXI/E/2, 3 November 1997, ATLA 26, pp. 7-8. (3) Spielmann, H. , Balls, M. , Dupuis, J. , Pape, W. J. W. , Pechovitch, G. , De Silva, O. , Holzh(cid:252)tter, H. G. , Clot- hier, R. , Desolle, P. , Gerberick, F. , Liebsch, M. , Lovell, W. 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title: Directive 2000/21/CE de la Commission, du 25 avril 2000, concernant la liste des actes communautaires mentionnée à l'article 13, paragraphe 1, cinquième tiret, de la directive 67/548/CEE du Conseil (Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE)

eurovoc_concepts:
application of EU law
dangerous substance
exchange of information
labelling
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national implementing measure

text: L 103/70 FR Journal officiel des Communautés européennes 28. 4. 2000 DIRECTIVE 2000/21/CE DE LA COMMISSION du 25 avril 2000 concernant la liste des actes communautaires mentionnée à l'article 13, paragraphe 1, cinquième tiret, de la directive 67/548/CEE du Conseil (Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE) LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES, (3) vu le traité instituant la Communauté européenne, vu la directive 67/548/CEE du Conseil du 27 juin 1967 concer- nant le rapprochement des dispositions législatives, réglemen- taires et administratives relatives à la classification, l'emballage l'étiquetage des substances dangereuses (1), modifiée en et dernier lieu par la directive 1999/33/CE du Parlement européen et du Conseil (2), et notamment son article 13, paragraphe 1, considérant ce qui suit: (1) (2) L'article 13, paragraphe 1, de la directive 67/548/CEE prévoit que certaines substances sont exemptées des dispositions des articles 7, 8, 14 et 15 de ladite directive en ce qui concerne la notification. Plus particulièrement, l'article 13, paragraphe 1, cinquième tiret, prévoit que sont exemptées de ces dispositions les substances utili- sées exclusivement pour d'autres catégories de produits pour lesquelles existent des procédures communautaires de notification ou d'homologation et pour lesquelles les exigences relatives aux informations à présenter sont égales à celles prévues par la directive 67/548/CEE. La Commission doit par conséquent établir une liste des actes communautaires contenant ce type de procédures de notification ou d'homologation. Cette liste fera l'objet d'un examen périodique et, au besoin, sera révisée. La directive 91/414/CEE du Conseil du 15 juillet 1991 concernant la mise sur le marché des produits phyto- pharmaceutiques (3), modifiée en dernier lieu par la directive 1999/80/CE de la Commission (4), prévoit que figurer à les substances actives d'un produit doivent l'annexe I de ladite directive pour que l'autorisation préalable à la mise sur le marché du produit puisse être délivrée. La directive 93/90/CEE de la Commission du 29 octobre 1993 concernant la liste des substances visées à l'article 13, paragraphe 1, cinquième tiret, de la directive 67/548/CEE du Conseil (5) ne couvre que les substances actives qui doivent figurer à l'annexe I de la directive 91/414/CEE concernant la mise sur le marché. substances actives qui peuvent être utilisées à Les d'autres fins, telles que la recherche et le développement, conformément à l'article 22 de la directive 91/414/CEE, doivent également être couvertes afin que toutes les procédures d'autorisation relatives à ces substances soient prévues uniquement par la directive 91/414/CEE. (1) JO 196 du 16. 8. 1967, p. 1. (2) JO L 199 du 30. 7. 1999, p. 57. (3) JO L 230 du 19. 8. 1991, p. 1. (4) JO L 210 du 10. 8. 1999, p. 13. (5) JO L 277 du 10. 11. 1993, p. 33. substances exclusivement utilisées en tant que Les substances actives dans des produits biocides au sens de la directive 98/8/CE du Parlement européen et du Conseil du 16 février 1998 concernant la mise sur le marché des produits biocides (6) entrent dans le champ d'application de l'article 13, paragraphe 1, cinquième tiret, de la directive 67/548/CEE et doivent donc bénéfi- cier d'une exemption, notamment en ce qui concerne la recherche et le développement, afin que toutes les procé- dures d'autorisation relatives à ces substances soient prévues uniquement par la directive 98/8/CE. (4) (5) La directive 93/90/CEE doit être abrogée. Les dispositions de la présente directive sont conformes à l'avis du comité pour l'adaptation au progrès technique des directives visant à l'élimination des entraves tech- niques aux échanges dans le secteur des substances et préparations dangereuses, A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DIRECTIVE: Article premier La liste des actes communautaires relatifs aux catégories de produits pour lesquelles existent des procédures communau- taires de notification ou d'homologation et pour lesquelles les exigences relatives aux informations à présenter pour les caté- gories de substances identifiées dans la liste sont égales à celles prévues par la directive 67/548/CEE figure à l'annexe de la présente directive. Article 2 La directive 93/90/CEE est abrogée. Article 3 1. Les États membres adoptent et publient les dispositions nécessaires pour se conformer à la présente directive au plus tard le 1er avril 2001. la Commission. Ils en informent immédiatement 2. Lorsque les États membres adoptent ces dispositions, celles-ci contiennent une référence à la présente directive ou sont accompagnées d'une telle référence lors de leur publica- tion officielle. Les modalités de cette référence sont arrêtées par les États membres. (6) JO L 123 du 24. 4. 1998, p. 1. 28. 4. 2000 FR Journal officiel des Communautés européennes L 103/71 Les États membres sont destinataires de la présente directive. Article 4 Fait à Bruxelles, le 25 avril 2000. Par la Commission Margot WALLSTRÖM Membre de la Commission ANNEXE Actes communautaires relatifs à des catégories de produits pour lesquelles existent des procédures communau- taires de notification ou d'homologation et pour lesquelles les exigences relatives aux informations à présenter sont égales à celles prévues par les articles 7, 8, 14 et 15 de la directive 67/548/CEE 1. Directive 91/414/CEE du Conseil du 15 juillet 1991 concernant la mise sur le marché des produits phytopharmaceu- tiques. 2. Directive 98/8/CE du Parlement européen et du Conseil du 16 février 1998 concernant la mise sur le marché des produits biocides. Pour les substances exclusivement destinées à être utilisées comme substances actives dans les produits phytopharmaceu- tiques et/ou les produits biocides