title: Direttiva 1999/27/CE della Commissione, del 20 aprile 1999, che fissa i metodi di analisi comunitari per la determinazione dell'amprolium, del diclazuril e del carbadox negli alimenti per animali, che modifica le direttive 71/250/CEE e 73/46/CEE e che revoca la direttiva 74/203/CEE (Testo rilevante ai fini del SEE)

eurovoc_concepts:
analytical chemistry
animal nutrition
food additive
food inspection

text: L 118/36 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:133) europee 6. 5. 1999 DIRETTIVA 1999/27/CE DELLA COMMISSIONE del 20 aprile 1999 che fissa i metodi di analisi comunitari per la determinazione dell’amprolium, del diclazuril e del carbadox negli alimenti per animali, che modifica le direttive 71/250/CEE e 73/46/CEE e che revoca la direttiva 74/203/CEE (Testo rilevante ai fini del SEE) LA COMMISSIONE DELLE COMUNIT(cid:211) EUROPEE, visto il trattato che istituisce la Comunit(cid:133) europea, vista la direttiva 70/373/CEE del Consiglio, del 20 luglio 1970, relativa all’introduzione di modi di prelievo di campioni e di metodi di analisi comunitari per il controllo ufficiale degli alimenti per animali (1), modifi- cata da ultimo dall’atto di adesione dell’Austria, della Finlandia e della Svezia, in particolare l’articolo 2, (1) (2) (3) (4) considerando che la direttiva 70/373/CEE prevede che i controlli ufficiali degli alimenti per animali, a costatare l’osservanza delle condizioni volti legislative, prescritte in virt(cid:151) delle disposizioni regolamentari ed amministrative concernenti la qualit(cid:133) e la composizione degli alimenti per animali, siano effettuati secondo metodi comunitari di prelievo di campioni e di analisi; considerando che la direttiva 70/524/CEE del Consiglio, del 23 novembre 1970, relativa agli addi- tivi nell’alimentazione degli animali (2), modificata da ultimo dal regolamento (CE) n. 45/1999 della Commissione (3), prescrive che il contenuto di amprolium e diclazuril deve essere indicato al momento dell’etichettatura allorch(cid:130) tali sostanze sono aggiunte alle premiscele ed agli alimenti per animali; che l’autorizzazione dell’uso del carbadox come additivo nell’alimentazione animale (cid:138) stata revocata con il regolamento (CE) n. 2788/98 della Commissione, del 22 dicembre 1998, che modifica la direttiva 70/524/CEE del Consiglio, relativa agli additivi nell’alimentazione degli animali, in ordine alla revoca dell’autorizzazione di taluni fattori di crescita (4), e che (cid:138) necessaria una sorveglianza uffi- ciale sull’eventuale impiego illegale delle sostanze proibite; considerando che in vista dei necessari controlli (cid:138) necessario stabilire metodi comunitari di analisi; considerando che la prima direttiva 71/250/CEE della Commissione, del 15 giugno 1971, che fissa i metodi d’analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali (5), modificata da ultimo dalla direttiva 98/54/CE (6), stabilisce, fra l’altro, metodi di analisi per la determinazione (1) GU L 170 del 3. 8. 1970, pag. 2. (2) GU L 270 del 14. 12. 1970, pag. 1. (3) GU L 6 del 12. 1. 1999, pag. 3. (4) GU L 347 del 23. 12. 1998, pag. 31. (5) GU L 155 del 12. 7. 1971, pag. 13. (6) GU L 208 del 24. 7. 1998, pag. 49. (5) (6) dell’essenza di senape e della teobromina; che tali metodi non sono pi(cid:151) validi per i fini previsti, perch(cid:130) superati dal progresso scientifico e tecnico; che pertanto (cid:138) opportuno sopprimerli; considerando che la quarta direttiva 73/46/CEE della Commissione, del 5 dicembre 1972, che fissa i metodi d’analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per animali (7), modificata da ultimo dalla direttiva 98/54/CE, l’altro, metodi di analisi per la determinazione del retinolo (vitamina A); che tali metodi non sono pi(cid:151) validi per i fini previsti, perch(cid:130) superati dal progresso scientifico e tecnico; che pertanto (cid:138) opportuno sopprimerli; stabilisce, fra considerando che la quinta direttiva 74/203/CEE della Commissione, del 25 marzo 1974, che fissa i metodi d’analisi comunitari per i controlli ufficiali degli alimenti per gli animali (8), modificata da ultimo dalla direttiva 81/680/CE (9), stabilisce metodi di analisi per la determinazione del conte- nuto in amido e suoi prodotti di degradazione ad elevato peso molecolare negli alimenti che conten- gono fettucce, polpe, foglie o colletti essiccati di barbabietole, polpe di patate, lieviti disidratati, in inulina o ciccioli, amprolium, prodotti ricchi etopabato, dinitolmide, nicarbazina e menadione (vitamina K3); che tali metodi non sono pi(cid:151) validi per i fini previsti, perch(cid:130) superati dal progresso scientifico e tecnico; che pertanto (cid:138) opportuno revocare tale direttiva; (7) considerando che le misure previste dalla presente direttiva sono conformi al parere del comitato permanente degli alimenti per gli animali, HA ADOTTATO LA PRESENTE DIRETTIVA: Articolo 1 Gli Stati membri prescrivono che le analisi per i controlli ufficiali degli alimenti per animali e delle premiscele, per quanto riguarda il loro contenuto in amprolium, diclazuril e carbadox, siano effettuate secondo i metodi descritti nell’allegato della presente direttiva. (7) GU L 83 del 30. 3. 1973, pag. 21. (8) GU L 108 del 22. 4. 1974, pag. 7. (9) GU L 246 del 29. 8. 1981, pag. 32. 6. 5. 1999 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:133) europee L 118/37 Articolo 2 Essi applicano le misure a partire dal 1o novembre 1999. La direttiva 71/250/CEE (cid:138) modificata come segue: 1) all’articolo 1, le parole «essenza di senape» e «teobro- mina» sono soppresse; 2) i punti 8 e 13 dell’allegato sono soppressi. Quando gli Stati membri adottano dette disposizioni, queste contengono un riferimento alla presente direttiva oppure sono corredate di un siffatto riferimento all’atto della loro pubblicazione ufficiale. Le modalit(cid:133) di tale rife- rimento sono decise dagli Stati membri. Articolo 3 Articolo 6 La direttiva 73/46/CEE (cid:138) modificata come segue: 1) l’articolo 2 (cid:138) soppresso; 2) l’allegato II (cid:138) soppresso. Articolo 4 La quinta direttiva 74/203/CEE (cid:138) abrogata. La presente direttiva entra in vigore il ventesimo giorno successivo alla pubblicazione nella Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:133) europee. Articolo 7 Gli Stati membri sono destinatari della presente direttiva. Articolo 5 Fatto a Bruxelles, il 20 aprile 1999. regolamentari Gli Stati membri mettono in vigore le disposizioni legisla- tive, amministrative necessarie per conformarsi alla presente direttiva, non oltre il 31 ottobre 1999. Essi ne informano immediatamente la Commis- sione. e Per la Commissione Franz FISCHLER Membro della Commissione L 118/38 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:133) europee 6. 5. 1999 ALLEGATO PARTE A DETERMINAZIONE DELL’AMPROLIUM Cloridrato del cloruro di 1-[(4-ammino-2 - propil-5 pirimidinil)metil]-2-picolinio 1. Finalit(cid:133) e campo di applicazione Il presente metodo serve per la determinazione dell’amprolium negli alimenti per animali e nelle premiscele. Il limite di rivelazione (cid:138) di 1 mg/kg, il limite di determinazione (cid:138) di 25 mg/kg. 2. Principio Il campione viene estratto con una miscela metanolo/acqua. Dopo diluizione con una fase mobile e filtrazione per membrana, il contenuto di amprolium viene determinato per cromatografia in fase liquida ad alte prestazioni (HPLC) a scambio cationico, impiegando un rivelatore UV. 3. Reattivi 3. 1. Metanolo 3. 2. Acetonitrile, qualit(cid:133) per HPLC 3. 3. Acqua, qualit(cid:133) per HPLC 3. 4. Soluzione di fosfato monosodico, c = 0,1 mol/1 In un matraccio tarato da 1 000 ml, sciogliere 13,80 g di fosfato monosodico monoidrato in acqua (3. 3), portare a volume con acqua (3. 3) e mescolare. 3. 5. Soluzione di perclorato sodico, c = 1,6 mol/1 In un matraccio tarato da 1 000 ml, sciogliere 224,74 g di perclorato sodico monoidrato in acqua (3. 3), portare a volume con acqua (3. 3) e mescolare. 3. 6. Fase mobile per HPLC (cfr. osservazione 9. l) Miscela di acetonitrile (3. 2), soluzione di fosfato monosodico (3. 4) e soluzione di perclorato sodico (3. 5), 450+450+100 (v+v+v). Prima dell’impiego, filtrare per filtro a membrana da 0,22 lm (4. 3) e degassare la soluzione [ad esempio nel bagno ad ultrasuoni (4. 4), per almeno 15 minuti]. 3. 7. Sostanza di riferimento (standard): cloridrato di 1-[(4-ammino-2-propilpirimidin5-il)metil]-2-metil-piridinio (amprolium, E 750), di purezza garantita (cfr. 9. 2). 3. 7. 1. Soluzione madre di amprolium, 500 lg/ml In un matraccio tarato da 100 ml, pesare 50 mg di standard (amprolium, 3. 7) con l’approssimazione di 0,1 mg; sciogliere in 80 ml di metanolo (3. l) e collocare per 10 minuti il matraccio in bagno ad ultrasuoni (4. 4). Dopo il trattamento ultrasonico raffreddare la soluzione a temperatura ambiente, portare a volume con acqua e mescolare. A temperatura @4 (cid:176)C, la soluzione rimane stabile per un mese. 3. 7. 2. Soluzione intermedia di amprolium, 50 lg/ml. In un matraccio tarato da 50 ml, pipettare 5,0 ml della soluzione madre (3. 7. l), portare a volume col solvente di estrazione (3. 8) e mescolare. A temperatura @4 (cid:176)C la soluzione rimane stabile per un mese. 3. 7. 3. Soluzioni di taratura Trasferire 0,5, 1,0 e 2,0 ml della soluzione intermedia (3. 7. 2) in una serie di matracci tarati da 50 ml. Portare a volume con la fase mobile (3. 6) e mescolare. Queste soluzioni corrispondono rispettivamente a 0,5, 1,0 e 2,0 lg/ml di amprolium. Esse vanno preparate estemporaneamente prima dell’uso. 6. 5. 1999 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:133) europee L 118/39 3. 8. Solvente di estrazione Miscela metanolo (3. l)- acqua 2+1 (v+v). 4. Apparecchiatura 4. 1. Apparecchiatura HPLC con sistema di iniezione adeguato a volumi da 100 ll. 4. 1. 1. Colonna per cromatografia in fase liquida, 125 mm x 4 mm, a scambio cationico (riempimento: Nucleosil 10 SA, 10 lm, od equivalente). 4. 1. 2. Rivelatore UV a lunghezza d’onda variabile, o rivelatore a serie di diodi. 4. 2. Filtro a membrana in PTFE, da 0,45 lm. 4. 3. Filtro a membrana, da 0,22 lm. 4. 4. Bagno ad ultrasuoni. 4. 5. Agitatore meccanico o mescolatore magnetico. 5. Modo di operare 5. 1. Generalit(cid:133) 5. 1. 1. «Bianco» Per poter procedere alla prova di recupero (5. l. 2) (cid:138) necessario disporre di un mangime di riferimento («bianco»), di tipo simile a quello del campione e da utilizzare come termine di confronto. L’analisi non deve evidenziare la presenza di quantit(cid:133) rivelabili di amprolium o di sostanze capaci di interferire. 5. 1. 2. Prova di recupero Deve essere eseguita una prova di recupero analizzando il «bianco» addizionato di una quantit(cid:133) di amprolium analoga a quella presente nel campione. Per ottenere una concentrazione di 100 mg/kg, trasferire 10,0 ml della soluzione madre (3. 7. l) in una beuta da 250 ml, e concentrare evaporando fino a 0,5 ml circa. Aggiungere 50 g di «bianco», mescolare accuratamente e lasciar riposare per 10 minuti agitando nuovamente varie volte prima di procedere all’estrazione (5. 2). Se non fosse disponibile un «bianco» di tipo simile a quello del campione (cfr. 5. 1. 1), la prova di recupero pu(cid:149) essere eseguita col metodo di addizione della sostanza di riferimento. In questo caso, un’aliquota del campione da analizzare viene addizionata di una quantit(cid:133) nota di amprolium, analoga a quella gi(cid:133) presente. Quest’aliquota viene analizzata insieme ad una del campione non addizionato, e il recupero pu(cid:149) essere calcolato per differenza. 5. 2. Estrazione 5. 2. 1. Premiscele (contenenti meno dell’1 % di amprolium) ed alimenti per animali. In una beuta da 500 ml, pesare con l’approssimazione di 0,01 g un’adeguata quantit(cid:133) del campione (da 5 a 40 g, secondo il suo contenuto in amprolium), ed aggiungere 200 ml di solvente di estrazione (3. 8). Collocare la beuta nel bagno (4. 4) e lasciarvela per 15 minuti. Togliere la beuta dal bagno ad ultrasuoni e mantenerla per un’ora sotto agitazione meccanica o magnetica (4. 5). Diluire un’aliquota dell’estratto con la fase mobile (3. 6) fino a un contenuto di amprolium dell’ordine di 0,5-2 lg/ml, poi mescolare. Filtrare per filtro a membrana (4. 2) da 5 a 10 ml della soluzione diluita. Procedere alla determinazione HPLC (5. 3). 5. 2. 2. Premiacele (contenenti fino all’l % di amprolium) ed alimenti per animali. In una beuta da 500 ml, pesare con l’approssimazione di 0,001 g un’adeguata quantit(cid:133) del campione (da 1 a 5 g, secondo il suo contenuto in amprolium) ed aggiungere 200 ml di solvente ed estrazione (3. 8). Collocare la beuta nel bagno ad ultrasuoni (4. 4) e lasciarvela per 15 minuti. Togliere la beuta dal bagno ad ultrasuoni e mantenerla per un’ora sotto agitazione meccanica o magnetica (4. 5). Diluire un’aliquota dell’estratto con la fase mobile (3. 6) fino a un contenuto di amprolium dell’ordine di 0,5-2 lg/ml, poi mescolare. Filtrare per filtro a membrana (4. 2) da 5 a 10 ml della soluzione diluita. Procedere alla determinazione HPLC (5. 3). 5. 3. Determinazione HPLC L 118/40 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:133) europee 6. 5. 1999 5. 3. 1. Parametri: Le seguenti condizioni vengono proposte a titolo di orientamento; (cid:138) possibile operare in condizioni diverse, purch(cid:130) si ottengano risultati equivalenti. Colonna analitica (4. 1. 1): Fase mobile (3. 6): 125 mm · 4 mm, a scambio cationico, riempita con Nucleosil 10 SA, 10 lm, od equivalente miscela di acetonitrile (3. 2), soluzione di fosfato monoso- dico (3. 5), soluzione di perclorato 450 +450 + 100 (V + V + V). sodico (3. 4) e Velocit(cid:133) di efflusso: 0,7-1 ml/min. Lunghezza d’onda di rivelazione: Volume di iniezione: 264 nm 100 ll Verificare la stabilit(cid:133) del sistema cromatografico iniettando varie volte la soluzione di taratura (3. 7. 3) contenente 1,0 lg/ml, fino a costanza dell’altezza delle cuspidi e dei tempi di ritenzione. 5. 3. 2. Curva di taratura Iniettare pi(cid:151) volte ciascuna soluzione di taratura (3. 7. 3) varie volte, e determinare le altezze (le superfici) medie delle cuspidi per ciascuna concentrazione. Tracciare la curva di taratura, riportando in ordinata le altezze (le superfici) medie delle cuspidi delle soluzioni di taratura, e in ascissa le corrispondenti concentrazioni, espresse in lg/ml. 5. 3. 3. Soluzione del campione Iniettare pi(cid:151) volte l’estratto del campione (5. 2), impiegando lo stesso volume di quello prelevato per le soluzioni di taratura e determinare le altezze (le superfici) medie delle cuspidi dell’amprolium. 6. Calcolo dei risultati Partendo dall’altezza (dalla superficie) media delle cuspidi dell’amprolium nella soluzione del campione, determinare la concentrazione di tale soluzione, espressa in lg/ml, riportandosi alla curva di taratura (5. 3. 2). Il contenuto w di amprolium nel campione, espresso in mg/kg, (cid:138) dato dalla seguente formula: w = V·b·f m [mg/kg] dove: V = volume del solvente di estrazione (3. 8) in ml, secondo (5. 2) (cio(cid:138): 200 ml); b = concertazione in amprolium dell’estratto del campione (5. 2), espressa in lg/ml; f = fattore di diluizione secondo (5. 2); m = massa dell’aliquota esaminata, espressa in g. 7. Convalida dei risultati 7. 1. Identit(cid:133) L’identit(cid:133) dell’analita pu(cid:149) essere confermata mediante co-cromatografia, oppure mediante un rivelatore a serie di diodi che permetta di confrontare gli spettri dell’estratto del campione (5. 2) e della soluzione di taratura (3. 7. 3) contenente 2,0 lg/ml. 7. 1. 1. Co-cromatografia A un estratto del campione (5. 2) viene aggiunto un quantitativo adeguato della soluzione di taratura (3. 7. 3). Il quantitativo di amprolium aggiunto deve essere analogo a quello di amprolium rilevato nell’estratto del campione. Soltanto l’altezza della cuspide dell’amprolium deve essere aumentata, tenendo conto del quantitativo aggiunto e della diluizione dell’estratto. L’ampiezza della cuspide, a mezza altezza, deve rientrare nel 10 % in pi(cid:151) o in meno dell’ampiezza iniziale della cuspide dell’amprolium per l’estratto del campione non addizionato. 6. 5. 1999 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:133) europee L 118/41 7. 1. 2. Rivelazione mediante serie di diodi I risultati vengono valutati secondo i seguenti criteri: a) la lunghezza d’onda di assorbimento massimo degli spettri del campione e dello standard, registrata al vertice della cuspide sul cromatogramma, deve rientrare in un margine determinato dal potere di risoluzione del sistema di rivelazione. Per la rivelazione mediante serie di diodi essa (cid:138) generalmente di 2 nm; b) fra 210 e 320 nm, gli spettri del campione e dello standard registrati al vertice della cuspide sul cromatogramma non debbono essere diversi per le parti dello spettro situate fra il 10 e il 100 % dell’assorbanza relativa. Questo criterio (cid:138) soddisfatto quando sono presenti gli stessi massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto fra gli spettri non supera il 15 % dell’assorbanza dello standard dell’analita; c) fra 210 e 320 nm, gli spettri della curva ascendente, del vertice e della curva discendente della cuspide prodotta dall’estratto del campione non devono essere diversi gli uni dagli altri per le parti dello spettro situate fra il 10 % e il 100 % dell’assorbanza relativa. Questo criterio (cid:138) soddisfatto quando sono presenti gli stessi massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto fra gli spettri non supera il 15 % dell’assorbanza dello spettro del vertice della cuspide. Se uno di questi criteri non (cid:138) soddisfatto, la presenza dell’analita non (cid:138) confermata. 7. 2. Ripetibilit(cid:133) La differenza fra i risultati di due determinazioni effettuate in parallelo sullo stesso campione non deve superare: (cid:190) il 15 %, rispetto al valore pi(cid:151) elevato per i contenuti di amprolium compresi fra 25 mg/kg e 500 mg/kg; (cid:190) 75 mg/kg, per i contenuti di amprolium compresi fra 500 mg/kg e 1 000 mg/kg; (cid:190) il 7,5 %, rispetto al valore pi(cid:151) elevato per i contenuti di amprolium superiori a 1 000 mg/kg. 7. 3. Recupero Per un campione addizionato («bianco»), il recupero non deve essere inferiore al 90 %. 8. Risultati di uno studio collaborativo E’ stato organizzato uno studio collaborativo durante il quale sono stati analizzati tre alimenti per pollame (campioni 1-3), un alimento minerale (campione 4) ed una premiscela (campione 5). I risultati dello studio figurano nella seguente tabella: Campione 1 («bianco») Campione 2 Campione 3 Campione 4 Campione 5 14 56 (cid:190) (cid:190) (cid:190) (cid:190) (cid:190) (cid:190) 14 56 45,5 2,26 4,95 2,95 6,47 50 14 56 188 3,57 1,90 11,8 6,27 200 14 56 5 129 178 3,46 266 5,19 15 60 25 140 550 2,20 760 3,00 5 000 25 000 L N Media [mg/kg] s [mg/kg] r CV [%] r sR [mg/kg] CVR [%] Contenuto nominale [mg/kg] L: n: numero di laboratori numero di valori individuali s : r CV s : R CV deviazione standard della ripetibilit(cid:133) r: coefficiente di variazione della ripetibilit(cid:133) deviazione standard della riproducibilit(cid:133) : coefficiente di variazione della riproducibilit(cid:133) R L 118/42 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:133) europee 6. 5. 1999 9. Osservazioni 9. 1. 9. 2. 9. 3. Se il campione contiene tiamina, la relativa cuspide compare nel cromatogramma poco prima di quella dell’amprolium. Secondo questo metodo, l’amprolium e la tiamina debbono essere separati. Se l’am- prolium e la tiamina non vengono separati dalla colonna (4. 1. 1) impiegata col presente metodo, sostituire con metanolo fino al 50 % della porzione di acetonitrile della fase mobile (3. 6). Secondo la farmacopea britannica, lo spettro di una soluzione di amprolium (c= 0,02 mol/l) in acido cloridrico (c= 0,1 mol/l) mostra dei massimi a 246 nm e 262 nm. La densit(cid:133) ottica deve essere di 0,84 a 246 nm e 0,80 a 262 nm. L’estratto deve essere sempre diluito con la fase mobile, poich(cid:130) altrimenti il tempo di ritenzione della cuspide dell’amprolium potrebbe spostarsi significativamente per effetto delle variazioni della forza ionica. PARTE B DETERMINAZIONE DEL DICLAZURIL 2,6 cloro-alfa-(4-clorofenil)-4-[4,5-diidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2(3H)-yi]benzenacetonitrile 1. Finalit(cid:133) e campo di applicazione Il presente metodo serve per la determinazione del diclazuril negli alimenti per animali e nelle premiscele. Il limite di rivelazione (cid:138) di 0,1 mg/kg, il limite di determinazione (cid:138) di 0,5 mg/kg. 2. Principio Dopo aggiunta di uno standard interno, il campione viene estratto con metanolo acidificato. Nel caso degli alimenti, un’aliquota dell’estratto viene purificata su una cartuccia C 18 per estrazione in fase solida. Il diclazuril viene eluito dalla cartuccia con una miscela di metanolo acidificato ed acqua. Dopo evaporazione, il residuo viene ripreso con DMF/acqua. Nel caso delle premiacele, l’estratto viene evaporato ed il residuo viene ripreso con DMF/acqua. Il contenuto di diclazuril viene determinato per cromatografia in fase liquida ad alto rendimento (HPLC), a gradiente ternario e fase invertita, impie- gando un rivelatore UV. 3. Reattivi 3. 1. Acqua, qualit(cid:133) per HPLC 3. 2. Acetato di ammonio 3. 3. Solfidrato di tetrabutilammonio (TBHS) 3. 4. Acetonitrile, qualit(cid:133) per HPLC 3. 5. Metanolo, qualit(cid:133) per HPLC 3. 6. N, N-dimetilformammide (DMF) 3. 7. 3. 8. Acido cloridico, p20 = 1,19 g/ml Sostanza di riferimento (standard): (+)-4-clorofenil[2,6-dicloro-4-(2,3,4,5-tetraidro-3,5-dioxo-l,2,4-triazin-2-il)fenil] acetonitrile (diclazuril II-24, E 771), di purezza garantita 3. 8. 1. Soluzione madre di diclazuril, 500 lg/ml. In un matraccio tarato da 50 ml, pesare 25 mg di standard (diclazuril, 3. 8) con l’approssimazione di 0,1 mg. Sciogliere in DMF (3. 6), portare a volume con DMF (3. 6) e mescolare. Avvolgere il matraccio con foglio d’alluminio (od impiegare un matraccio in vetro scuro) e conservare in frigorifero. A temperatura @4 (cid:176)C, la soluzione rimane stabile per un mese. 6. 5. 1999 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:133) europee L 118/43 3. 8. 2. Soluzione standard di diclazuril, 50 lg/ml Trasferire 5,00 ml della soluzione madre (3. 8. l) in un matraccio tarato da 50 ml, portare a volume con DMF (3. 6) e mescolare. Avvolgere il matraccio con foglio d’alluminio (od impiegare un matraccio in vetro scuro) e conservare in frigorifero. A temperatura @4 (cid:176)C, la soluzione rimane stabile per un mese. 3. 9. Standard interno: 2,6 cloro-alfa-(4-clorofenil)-4-[4,5-diidro-3,5-dioxo-l,2,4-triazin-2(3H)-yi]benzen-acetonitrile, E771 3. 9. 1. Soluzione madre dello standard interno, 500 lg/ml. In un matraccio tarato da 50 ml, pesare 25 mg dello standard interno (3. 9) con l’approssimazione di 0,1 mg. Sciogliere in DMF (3. 6), portare a volume con DMF (3. 6) e mescolare. Avvolgere il matraccio con foglio d’alluminio (od impiegare un matraccio in vetro scuro) e conservare in frigorifero. A temperatura non superiore a 4 (cid:176)C, la soluzione rimane stabile per un mese. 3. 9. 2. Soluzione dello standard interno, 50 lg/ml Trasferire 5,00 ml della soluzione madre dello standard interno (3. 9. l) in un matraccio tarato da 50 ml, portare a volume con DMF (3. 6) e mescolare. Avvolgere il matraccio con foglio d’alluminio (od impiegare un matraccio in vetro scuro) e conservare in frigorifero. A temperatura non superiore a 4 (cid:176)C, la soluzione rimane stabile per un mese. 3. 9. 3. Soluzione dello standard interno per le premiscele, p/1 000 mg/ml (p = contenuto nominale di diclazuril nella premiscela, in mg/kg) In un matraccio tarato da 100 ml, pesare p/10 mg dello standard interno con l’approssimazione di 0,1 mg, Sciogliere in DMF (3. 6) in bagno ad ultrasuoni (4. 6), portare a volume con DMF e mescolare. Avvolgere il matraccio con foglio d’alluminio (od impiegare un matraccio in vetro scuro) e conservare in frigorifero. A temperatura @4 (cid:176)C, la soluzione rimane stabile per un mese. 3. 10. Soluzione di taratura, 2 lg/ml In un matraccio tarato da 50 ml, pipettare 2,00 ml di soluzione standard di diclazuril (3. 8. 2) e 2,00 ml di soluzione dello standard interno (3. 9. 2). Aggiungere 16 ml di DMF (3. 6), portare a volume con acqua e mescolare. Questa soluzione deve essere preparata estemporaneamente prima dell’uso. 3. 11. Cartuccia C18 per estrazione in fase solida (es. : Bond Elut). Misura: 1 cm. Massa sorbente: 100 mg. 3. 12. Solvente di estrazione: metanolo acidificato Pipettare 5,0 ml di acido cloridrico (3. 7) in 1000 ml di metanolo (3. 5) e mescolare. 3. 13. Fase mobile per HPLC. Eluente A: soluzione di acetato di ammonio (cid:190) solfidrato di tetrabutilammonio. 3. 13. 1. Sciogliere 5 g di acetato d’ammonio (3. 2) e 3,4 g di TBHS (3. 3) in 1 000 ml d’acqua (3. l) e mescolare. 3. 13. 2. Eluente B: acetonitrile (3. 4). 3. 13. 3. Eluente C: metanolo (3. 5) 4. Apparecchiatura 4. 1. Agitatore meccanico 4. 2. Apparecchiatura per HPLC a gradiente ternario 4. 2. 1. Colonna per cromatografia in fase liquida, 100 mm x 4,6 mm, con riempimento in Hypersil ODS da 3 lm, od equivalente 4. 2. 2. Rivelatore UV a lunghezza d’onda variabile, o rivelatore a serie di diodi 4. 3. Evaporatore rotativo sotto vuoto 4. 4. Filtro a membrana, 0,45 lm L 118/44 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:133) europee 6. 5. 1999 4. 5. Collettore da vuoto 4. 6. Bagno ad ultrasuoni. 5. Modo di operare 5. 1. Generalit(cid:133) 5. 1. 1. «Bianco» (cid:221) necessario disporre di un mangime di riferimento («bianco»), nel quale dev’essere verificata l’assenza del diclazuril e di sostanze capaci di interferire. Il «bianco» deve essere di tipo simile a quello del campione, e la sua analisi non deve evidenziare la presenza di diclazuril o di sostanze capaci di interferire. 5. 1. 2. Prova di recupero Deve essere eseguita una prova di recupero analizzando il «bianco» addizionato di una quantit(cid:133) di diclazuril analoga a quella presente nel campione. Per ottenere una concentrazione di 1 mg/kg, aggiungere 0,1 ml della soluzione madre (3. 8. l) a 50 g di «bianco», mescolare accuratamente e lasciar riposare per 10 minuti, agitando nuovamente varie volte prima di procedere all’estrazione (5. 2). Se non fosse disponibile un «bianco» di tipo simile a quello del campione (cfr. 5. 1. 1), la prova di recupero pu(cid:149) essere eseguita col metodo di addizione della sostanza di riferimento. In questo caso, un’aliquota del campione da analizzare viene addizionata di una quantit(cid:133) nota di diclazuril, analoga a quella gi(cid:133) presente. Quest’aliquota viene analizzata insieme ad una del campione non addizionato, ed il recupero pu(cid:149) essere calcolato per differenza. 5. 2. Estrazione 5. 2. 1. Alimenti Pesare 50 g circa del campione con l’approssimazione di 0,01 g. Trasferire in una beuta da 500 ml, aggiungere 1,00 ml di soluzione dello standard interno (3. 9. 2) e 200 ml di solvente di estrazione (3. 12), poi coprire il recipiente. Mantenere sotto agitazione la miscela per una notte, nell’agitatore (4. l). Lasciar depositare per 10 minuti. Trasferire un’aliquota da 20 ml del surnatante in un adatto contenitore in vetro e diluire con 20 ml d’acqua. Trasferire questa soluzione in una cartuccia di estrazione (3. 11) e filtrare sotto vuoto (4. 5). Lavare la cartuccia con 25 ml di una miscela di solvente di estrazione (3. 12) e d’acqua, 65+35 (V+V). Eliminare le frazioni raccolte ed eluire la mescolanza con 25 ml di una miscela di solvente di estrazione (3. 12) e d’acqua, 80+20 (V+V). Evaporare questa frazione a 60 (cid:176)C, nell’evaporatore rotativo (4. 3), fino a secchezza incipiente. Riprendere il residuo con 1,0 ml di DMF (3. 6), aggiungere 1,5 ml d’acqua (3. 1) e mescolare. Filtrare per filtro a membrana (4. 4). Procedere alla determinazione HPLC (5. 3). 5. 2. 2. Premiscele Pesare 1 g circa del campione, con l’approssimazione di 0,01 g. Trasferire in una beuta da 500 ml, aggiungere 1,00 ml di soluzione dello standard interno (3. 9. 3) e 200 ml di solvente di estrazione (3. 12), poi coprire il recipiente. Agitare per una notte sull’agitatore (4. 1). Lasciare depositare per 10 minuti. Trasferire un’aliquota da 10 000/p ml (p = contenuto nominale di diclazuril nella premiscela, espresso in mg/kg) del surnatante in un matraccio a fondo arrotondato di dimensioni convenienti. Evaporare nell’evaporatore rotativo (4. 3), sotto pressione ridotta e a 60 (cid:176)C, fino a secchezza incipiente. Riprendere il residuo con 10,0 ml DMF (3. 6), aggiungere 15,0 d’acqua (3. 1) e mescolare. Procedere alla determina- zione HPLC (5. 3). 5. 3. Determinazione HPLC 5. 3. 1. Parametri Le seguenti condizioni vengono proposte a titolo di orientamento; (cid:138) possibile operare in condizioni diverse, purch(cid:130) si ottengano risultati equivalenti. (cid:190) Colonna cromatografica in fase liquida (4. 2. 1. ): 100 mm · 4,6 mm, con Hypersil ODS, riempimento da 3 lm, od equivalente (cid:190) Fase mobile: Eluente A (3. 13. 1): soluzione acetato di acquosa di ammonio e di solfidrato di tetrabuti- lammonio Eluente B (3. 13. 2): acetonitrile Eluente C (3. 13. 3): metanolo 6. 5. 1999 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:133) europee L 118/45 (cid:190) Modo di eluizione: (cid:190) gradiente lineare (cid:190) condizioni iniziali: A+B+C = 60+20+20 (V+V+V) (cid:190) dopo 10 minuti, gradiente di eluizione per 30 minuti fino a: A+B+C = 45+20+35 (V+V+V) Risciacquare con B per 10 minuti (cid:190) Velocit(cid:133) di efflusso: 1,5 – 2 ml/min (cid:190) Volume di iniezione: 20 ll (cid:190) Lunghezza d’onda di rivela- 280 ml zione: Verificare la stabilit(cid:133) del sistema cromatografico iniettando pi(cid:151) volte la soluzione di taratura (3. 10), contenente 2 lg/ml, fino a costanza dell’altezza delle cuspidi e dei tempi di ritenzione. 5. 3. 2. Soluzione di taratura Iniettare pi(cid:151) volte 20 ll della soluzione di taratura (3. 10) e determinare l’altezza (la superficie) media delle cuspidi del diclazuril e dello standard interno. 5. 3. 3. Soluzione del campione Iniettare pi(cid:151) volte 20 ll della soluzione del campione (5. 2. 1 o 5. 2. 2) e determinare l’altezza (la superficie) media delle cuspidi del diclazuril e dello standard interno. 6. Calcolo dei risultati 6. 1. Alimenti Il contenuto w di diclazuril nel campione, espresso in mg/kg, (cid:138) dato dalla seguente formula: w = hd,s. hi,c hi,s. hd,c. bd,c. 10V m [mg/kg] dove: = altezza (superficie) della cuspide dello standard interno nella soluzione del campione (5. 2. 1); hd,s = altezza (superficie) della cuspide del diclazuril nella soluzione del campione (5. 2. 1); hi,s hd,c = altezza (superficie) della cuspide del diclazuril nella soluzione di taratura (3. 10); hi,c = altezza (superficie) della cuspide dello standard interno nella soluzione di taratura (3. 10); bd,c = concentrazione del diclazuril nella soluzione di taratura, lg/ml (3. 10); m = massa dell’aliquota analizzata, g V = volume dell’estratto del campione secondo 5. 2. 1 (cio(cid:138): 2,5 ml). 6. 2. Premiscele Il contenuto w di diclazuril nel campione, espresso in mg/kg, (cid:138) data dalla seguente formula: w = hd,s. hi,c hi,s. hd,c. bd,c. 0,02V. p m [mg/kg] dove: = altezza (superficie) della cuspide dello standard interno nella soluzione di taratura (3. 10); = altezza (superficie) della cuspide del diclazuril nella soluzione di taratura (3. 10); hd,c hi,c hd,s = altezza (superficie) della cuspide del diclazuril nella soluzione del campione (5. 2. 2); hi,s bd,c m = massa dell’aliquota analizzata, g; = concentrazione del diclazuril nella soluzione di taratura (3. 10); = altezza (superficie) della cuspide dello standard interno nella soluzione del campione (5. 2. 2); V = volume dell’estratto del campione secondo 5. 2. 2 (cio(cid:138): 2,5 ml); p = contenuto nominale di diclazuril nella premiscela, mg/kg. L 118/46 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:133) europee 6. 5. 1999 7. Convalida dei risultati 7. 1. Identit(cid:133) L’identit(cid:133) dell’analita pu(cid:149) essere confermata mediante co-cromatografia, oppure mediante un rivelatore a serie di diodi che permetta di confrontare gli spettri dell’estratto del campione (5. 2. 1 o 5. 2. 2) e della soluzione di taratura (3. 10). 7. 1. 1. Co-cromatografia A un estratto del campione (5. 2. 1 o 5. 2. 2) viene aggiunto un quantitativo adeguato della soluzione di taratura (3. 10). Il quantitativo di diclazuril aggiunto deve essere analogo a quello di diclazuril trovato nell’estratto del campione. Debbono essere aumentate soltanto le altezze delle cuspidi del diclazuril e dello standard interno, tenendo conto dei quantitativi aggiunti e della diluizione dell’estratto. L’ampiezza delle cuspidi, a met(cid:133) altezza, deve rientrare nel 5 10 % dell’ampiezza iniziale della cuspide del diclazuril o di quella dello standard interno del campione non addizionato. 7. 1. 2. Rivelazione mediante serie di diodi I risultati vengono valutati secondo i seguenti criteri: a) La lunghezza d’onda dell’assorbimento massimo degli spettri del campione e dello standard, registrata al vertice della cuspide sul cromatogramma, deve rientrare in un margine derminato dal potere di risoluzione del sistema di rivelazione. Per la rivelazione mediante serie di diodi, essa (cid:138) generalmente di 5 2 nm. b) fra 210 e 320 nm, gli spettri del campione e dello standard registrati al vertice della cuspide sul cromatogramma non debbono essere diversi per le parti dello spettro situate fra il 10 e il 100 % dell’assorbanza relativa. Questo criterio (cid:138) soddisfatto quando sono presenti gli stessi massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto fra gli spettri non supera il 15 % dell’assorbanza dello standard dell’analita; c) fra 210 e 320 nm, gli spettri della curva ascendente, del vertice e della curva discendente della cuspide prodotta dall’estratto del campione non debbono essere diversi gli uni dagli altri per le parti dello spettro situate fra il 10 % e il 100 % dell’assorbanza relativa. Questo criterio (cid:138) soddisfatto quando sono presenti gli stessi massimi e quando in tutti i punti osservati lo scarto fra gli spettri non supera il 15 % dell’assorbanza dello spettro del vertice della cuspide. Se uno di questi criteri non (cid:138) soddisfatto, la presenza dell’analita non (cid:138) confermata. 7. 2. Ripetibilit(cid:133) La differenza fra i risultati di due determinazioni in parallelo, effettuate sullo stesso campione, non deve superare: (cid:190) il 30 % rispetto al valore pi(cid:151) elevato, per i contenuti di diclazuril compresi fra 0,5 mg/kg e 2,5 mg/kg; (cid:190) 0,75 mg/kg, per i contenuti di diclazuril compresi fra 2,5 mg/kg e 5 mg/kg; (cid:190) il 15 % rispetto al valore pi(cid:151) elevato, per i contenuti di diclazuril oltre 5 mg/kg. 7. 3. Recupero Per un campione addizionato («bianco»), il recupero non deve essere inferiore all’80 %. 8. Risultati di uno studio collaborativo (cid:221) stato organizzato uno studio collaborativo, nel corso del quale 5 campioni sono stati analizzati da 11 laboratori. Questi campioni consistevano di due premiscele; una era mescolata con una matrice organica (O 100) e l’altra con una matrice inorganica (A 100). Il contenuto teorico era di 100 mg diclazuril/kg. I tre mangimi misti per il pollame sono stati preparati da tre diversi produttori (NL) (L1/Z1/K1). Il contenuto teorico era di 1 mg diclazuril/kg. Ai laboratori (cid:138) stato chiesto di analizzare ciascun campione uno sola volta o in duplicato. (Maggiori informazioni: Journal of AOAC Interna- tional, Volume 77, n. 6, 1994, p. 1359-1361). I risultati sono riportati nella tabella che segue. 6. 5. 1999 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:133) europee L 118/47 Campione 1 A 100 Campione 2 O 100 Campione 3 L 1 Campione 4 Z 1 Campione 5 K 1 L N Media S [mg/kg] [%] r [mg/kg] [%] R r CV S R CV 11 19 100,8 5,88 5,83 7,59 7,53 11 18 103,5 7,64 7,38 7,64 7,38 Contenuto nominale [mg/kg] 100 100 11 19 0,89 0,15 17,32 0,17 18,61 1 11 19 1,15 0,02 1,92 0,11 9,67 1 6 12 0,89 0,03 3,34 0,12 13,65 1 L: n: S : r CV SR: CV R numero di laboratori numero di valori singoli deviazione standard della ripetibilit(cid:133) r: coefficiente di variazione della ripetibilit(cid:133) deviazione standard della riproducibilit(cid:133) : coefficiente di variazione della riproducibilit(cid:133). 9. Osservazioni Deve essere dimostrato in precedenza che il responso del diclazuril (cid:138) lineare in tutto entro il campo di concentrazioni misurate. PARTE C DETERMINAZIONE DEL CARBADOX Metil-3-(2-chinossalinilinmetilene) carbazato-N1,N4-diossido 1. Finalit(cid:133) e campo di applicazione Il presente metodo serve per la determinazione del carbadox negli alimenti per animali, premiscele e preparati. Il limite di rivelazione (cid:138) di 1 mg/kg. Il limite di determinazione (cid:138) di 10 mg/kg. 2. Principio Il campione viene equilibrato con acqua ed estratto con metanolo-acetonitrile. Nel caso degli alimenti, un’aliquota dell’estratto filtrato viene purificata su colonna di ossido di alluminio. Per le premiscele e i preparati, un’aliquota dell’estratto filtrato viene diluita a concentrazione appropriata con acqua, meta- nolo ed acetonitrile. Il contenuto di carbadox viene determinato per cromatografia in fase liquida ad alte prestazioni, in fase invertita, impiegando un rivelatore UV. 3. 3. 1. 3. 2. 3. 3. 3. 4. 3. 5. Reattivi Metanolo Acetonitrile, qualit(cid:133) per HPLC Acido acetico, w=100 % Ossido di alluminio: neutro, grado di attivit(cid:133) I Metanolo-acetonitrile 1+1 (v+v) Miscelare 500 ml di metanolo (3. l) con 500 ml di acetonitrile (3. 2). 3. 6. Acido acetico, s = 10 % Diluire con acqua 10 ml di acido acetico (3. 3) e portare a 100 ml. 3. 7. Acetato di sodio, CH 3 COONa L 118/48 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:133) europee 6. 5. 1999 3. 8. 3. 9. Acqua, qualit(cid:133) per HPLC Soluzione tampone all’acetato, c = 0,01 mol/1, pH = 6. 0 Sciogliere 0,82 grammi di acetato di sodio (3. 7) in 700 ml d’acqua (3. 8) e regolare il pH a 6,0 con acido acetico (3. 6). Trasferire in un matraccio tarato da 1 000 ml, portare a volume con acqua (3. 8) e mescolare. 3. 10. Fase mobile per HPLC Mescolare 825 ml di soluzione tampone all’acetato (3. 9) con 175 ml di acetonitrile (3. 2). Filtrare per filtro da 0,22 lm (4. 5) e degassare la soluzione (ad esempio trattando ad ultrasuoni per 10 minuti). 3. 11. Sostanza di riferimento (standard): N1,N4-diossido del metil 3-(2-chinossalinilmetilen) carbazato (carbadox, E 850), di purezza garantita. 3. 11. 1. Soluzione madre di carbadox, 100 lg/ml (cfr. 5, Modo di operare) In un matraccio tarato da 250 ml, pesare 25 mg di carbadox standard con l’approssimazione di 0,1 mg. Sciogliere in metanolo-acetonitrile (3. 5) trattando con ultrasuoni (4. 7). Dopo il trattamento con ultra- suoni, raffreddare a temperatura ambiente, portare a volume con metanolo-acetonitrile (3. 5) e mesco- lare. Avvolgere il matraccio con foglio d’alluminio od utilizzare vetreria scura e conservare in frigori- fero. A temperatura non superiore a 4 (cid:176)C, questa soluzione si mantiene stabile per un mese 3. 11. 2. Soluzione di taratura Trasferire 2,0, 5,0, 10,0 e 20,0 ml della soluzione madre (3. 11. 1) in una serie di matracci tarati da 100 ml. Aggiungere 30 ml d’acqua, portare a volume con metanolo-acetonitrile (3. 5) e mescolare. Avvolgere i matracci con foglio d’alluminio. Queste soluzioni corrispondono rispettivamente a 2,0, 5,0, 10,0 e 20,0 lg/ml di carbadox. Le soluzioni di taratura debbono essere preparate estemporaneamente prima dell’uso. Nota: per la determinazione del carbadox negli alimenti contenenti meno di 10 mg/kg si dovranno preparare soluzioni di taratura a concentrazioni inferiori a 2,0 lg/ml. 3. 12. Miscela acqua [metanolo-acetonitrile] (3. 5), 300+700 (v+v) Mescolare 300 ml d’acqua con 700 ml della miscela metanolo-acetonitrile (3. 5). 4. 4. 1. 4. 2. 4. 3. Apparecchiatura Agitatore da laboratorio o mescolatore magnetico. Carta da filtro in fibra di vetro (Whatman GF/A od equivalente). Colonna in vetro (lunghezza: 300-400 mm, diametro interno: 10 mm circa), con setto in vetro sinterizzato e valvola di scarico. Nota: si pu(cid:149) anche impiegare una colonna di vetro provvista di rubinetto oppure una colonna di vetro ad estremit(cid:133) affusolata. In questo caso, si deve inserire un piccolo tampone di lana di vetro all’estremit(cid:133) inferiore e pressarlo verso il basso con una bacchetta di vetro. 4. 4. Apparecchiatura HPLC con sistema di iniezione adeguato a volumi da 20 ll. 4. 4. 1. Colonna per cromatografia in fase liquida: 300 mm x 4 mm, C 18, con riempimento 10 lm o equivalente. 4. 4. 2. Rivelatore UV con regolazione variabile della lunghezza d’onda o rivelatore a serie di diodi, funzio- nante nell’intervallo 225-400 nm. 4. 5. 4. 6. 4. 7. Filtro a membrana, 0,22 lm. Filtro a membrana, 0,45 lm. Bagno ad ultrasuoni. 5. Modo di operare Nota: il carbadox (cid:138) fotosensibile. Effettuare tutte le operazioni in luce attenuata od impiegare vetreria scura od avvolta in foglio d’alluminio. 5. 1. Generalit(cid:133) 6. 5. 1999 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:133) europee L 118/49 5. 1. 1. «Bianco» Per eseguire la prova di recupero (5. 1. 2) (cid:138) necessario disporre di un mangime di riferimento («bianco»), nel quale dev’essere verificata l’assenza del carbadox e di sostanze capaci di interferire. Il «bianco» deve essere di tipo simile a quello del campione, e la sua analisi non deve evidenziare la presenza di carbadox o di sostanze capaci di interferire. 5. 1. 2. Prova di recupero Deve essere eseguita una prova di recupero analizzando il «bianco» (5. 1. 1 ) addizionato di una quantit(cid:133) di carbadox analoga a quella presente nel campione. Per ottenere una concentrazione di 50 mg/kg, introdurre 5,0 ml della soluzione madre (3. 11. 1) in una beuta da 200 ml. Evaporare la soluzione a 0,5 ml circa, in corrente di azoto. Aggiungere 10 g del «bianco», mescolare ed aspettare 10 minuti prima di passare all’estrazione. Se non fosse disponibile un «bianco» di tipo simile a quello del campione (cfr. 5. 1. 1), la prova di recupero pu(cid:149) essere eseguita col metodo di addizione della sostanza di riferimento. In questo caso, un’aliquota del campione da analizzare viene addizionata di una quantit(cid:133) nota di carbadox, analoga a quella gi(cid:133) presente. Quest’aliquota viene analizzata insieme ad una del campione non addizionato, ed il recupero pu(cid:149) essere calcolato per differenza. 5. 2. Estrazione 5. 2. 1. Alimenti Pesare 10 gr circa del campione con l’approssimazione di 0,01 g, e trasferirli in una beuta da 200 ml. Aggiungere 15,0 ml d’acqua, mescolare ed equilibrare per 5 minuti. Aggiungere 35,0 ml di metanolo- acetonitrile (3. 5), coprire ed agitare per 30 minuti sull’agitatore o col mescolatore magnetico (4. 1). Filtrare la soluzione per carta in fibre di vetro (4. 2). Conservare questa soluzione per lo stadio della purificazione (5. 3). 5. 2. 2. Premiscele (0,1-2,0 %) Pesare 1 g circa del campione non macinato con l’approssimazione di 0,001 g, e trasferirlo in una beuta da 200 ml. Aggiungere 15,0 ml d’acqua, mescolare ed equilibrare per 5 minuti. Aggiungere 35,0 ml di metanolo-acetonitrile (3. 5), tappare ed agitare per 30 minuti sull’agitatore o col mescolatore magnetico (4. l). Filtrare la soluzione per carta in fibre di vetro (4. 2). Pipettare un’aliquota del filtrato in un matraccio tarato da 50 ml. Aggiungere 15,0 ml d’acqua, portare a volume con metanolo-acetonitrile (3. 5) e mescolare. La concentrazione di carbadox nella soluzione finale (cid:138) circa di 10 lg/ml. Filtrare un’aliquota per filtro da 0,45 lm (4. 6). Procedere alla determinazione HPLC (5. 4). 5. 2. 3. Preparazioni (; 2 %) Pesare 0,2 g circa del campione non macinato con l’approssimazione di 0,001 g, e trasferirli in un matraccio da 250 ml. Aggiungere 45,0 ml d’acqua, mescolare ed equilibrare per 5 minuti. Aggiungere 105 ml di metanolo-acetonitrile (3. 5), coprire ed omogeneizzare. Sottoporre il campione ad ultrasuoni (4. 7) per 15 minuti, poi scuotere od agitare per 15 minuti (4. 1). Filtrare la soluzione per carta da filtro in fibre di vetro (4. 2). Diluire un’aliquota del filtrato con la miscela acqua-metanolo-acetonitrile (3. 12), fino a una concentrazione finale di carbadox dell’ordine di 10-15 lg/ml (per una preparazione al 10 %, il fattore di diluizione (cid:138) 10). Filtrare un’aliquota per filtro da 0,45 lm (4. 6). Procedere alla determina- zione HPLC (5. 4). 5. 3. Purificazione 5. 3. 1. Preparazione della colonna di ossido di alluminio Pesare 4 g di ossido di alluminio (3. 4) e trasferire nella colonna di vetro (4. 3). 5. 3. 2. Purificazione del campione Far passare 15 ml-dell’estratto filtrato (5. 2. 1) per la colonna di ossido di alluminio ed eliminare i primi due ml di eluato. Raccogliere i successivi 5 ml e filtrare un’aliquota per filtro da 0,45 lm (4. 6). Procedere alla determinazione HPLC (5. 4). 5. 4. Determinazione HPLC L 118/50 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:133) europee 6. 5. 1999 5. 4. 1. Parametri Le seguenti condizioni vengono proposte a titolo di orientamento; (cid:138) possibile operare in condizioni diverse, purch(cid:130) si ottengano risultati equivalenti. Colonna per liquida (4. 1. 1): cromatografia in fase 300 mm · 4 mm, C18, riempimento da 10 lm od equiva- lente Fase mobile (3. 10): miscela di soluzioni tampone all’acetato (3. 9) e di acetoni- rile (3. 2), 825+175 (V + V) Velocit(cid:133) di efflusso: 1,5-2 ml/min Lunghezza d’onda di rivelazione: 365 nm. Volume di iniezione: 20 ll Verificare la stabilit(cid:133) del sistema cromatografico iniettando pi(cid:151) volte la soluzione di taratura (3. 11. 2) contenente 5,0 lg/ml, fino a costanza delle altezze (delle superfici) delle cuspidi e dei tempi di ritenzione. 5. 4. 2. Curva di taratura Iniettare pi(cid:151) volte ciascuna soluzione di taratura (3. 11. 2) e determinare le altezze (le superfici) delle cuspidi per ciascuna concentrazione. Tracciare una curva di taratura riportando in ordinata le altezze (le superfici) medie delle cuspidi della soluzione di taratura e in ascissa le corrispondenti concentrazioni, espresse in lg/ml. 5. 4. 3. Soluzione del campione Iniettare pi(cid:151) volte l’estratto del campione [(5. 3. 2) per gli alimenti, (5. 2. 2) per le premiscele e (5. 2. 3) per i preparati], e determinare l’altezza (la superficie) media delle cuspidi del carbadox. 6. Calcolo dei risultati Partendo dall’altezza (dalla superficie) media delle cuspidi del carbadox nella soluzione del campione, determinare la concentrazione di tale soluzione in lg/ml riportandosi alla curva di taratura (5. 4. 2). 6. 1. Alimenti Il contenuto w (mg/kg) di carbadox nel campione (cid:138) dato dalla seguente formula: w = b · V 1 m [mg/kg] dove: b = concentrazione di carbadox nell’estratto del campione, (5. 3. 2) lg/kg; = volume di estrazione in ml (cio(cid:138) 50); V1 m = massa dell’aliquota analizzata in g. 6. 2. Premiscele e preparati Il contenuto w (mg/kg) di carbadox nel campione (cid:138) dato dalla seguente formula: w = · f b · V 2 m [mg/kg] dove: b = concentrazione di carbadox nell’estratto del campione, (5. 3. 2) lg/kg; V2 = volume di estrazione in ml (cio(cid:138) 50 per le premiscele, 150 per i preparati); f = fattore di diluizione secondo 5. 2. 2 (premiscele) o 5. 2. 3 (preparati); m = massa dell’aliquota analizzata in g. 6. 5. 1999 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:133) europee L 118/51 7. 7. 1. Convalida dei risultati L’identit(cid:133) dell’analita pu(cid:149) essere confermata mediante co-cromatografia, oppure mediante un rivelatore a serie di diodi che permetta di confrontare gli spettri dell’estratto del campione e della soluzione di taratura (3. 11. 2) contenente 10,0 lg/ml. 7. 1. 1. Co-cromatografia All’estratto del campione si aggiunge un quantitativo adeguato della soluzione di taratura (3. 11. 2). Il quantitativo di carbadox aggiunto deve essere analogo a quello di cui (cid:138) valutata la presenza nell’estratto del campione. Deve essere aumentata soltanto l’altezza della cuspide del carbadox, tenendo conto del quantitativo aggiunto e della diluizione dell’estratto. L’ampiezza della cuspide, a met(cid:133) della sua altezza massima, deve rientrare nel 10 % circa dell’ampiezza originale. 7. 1. 2. Rivelatore a serie di diodi I risultati vengono valutati secondo i criteri che seguono: a) La lunghezza d’onda di assorbimento massimo degli spettri del campione dello standard, registrata al vertice della cuspide sul cromatogramma, deve essere la stessa entro un margine determinato dal potere di risoluzione del sistema di rivelazione. Per la rivelazione mediante serie di diodi, essa (cid:138) generalmente di 5 2 nm. b) Fra 225 e 400 nm, gli spettri del campione e dello standard registrati al vertice della cuspide sul cromatogramma non debbono essere diversi per le parti dello spettro situate fra il 10 % e il 100 % dell’assorbanza relativa. Questo criterio (cid:138) soddisfatto quando sono presenti gli stessi valori massimi e quando in nessun caso lo scarto osservato fra gli spettri supera il 15 % della densit(cid:133) ottica dello spettro della sommit(cid:133) del picco. c) Tra 225 e 400 nm, gli spettri della curva ascendente, del vertice della curva discendente della cuspide prodotta dall’estratto del campione non debbono essere diversi fra loro per le parti dello spettro situate fra il 10 e il 100 % dell’assorbanza relativa. Questo criterio (cid:138) soddisfatto quando gli stessi massimi sono presenti e quando in tutti i punti osservati la deviazione fra gli spettri non superi il 15 % dell’assorbanza dello spettro al vertice. Se uno di questi criteri non (cid:138) soddisfatto, la presenza dell’analita non (cid:138) confermata. 7. 2. Ripetibilit(cid:133) Per contenuti di 10 mg/kg e superiori, la differenza fra i risultati di due determinazioni parallele effettuate sullo stesso campione non deve superare il 15 % rispetto al risultato pi(cid:151) alto. 7. 3. Recupero Per un campione addizionato (bianco), il recupero non deve essere inferiore al 90 %. 8. Risultati di uno studio collaborativo (cid:221) stato organizzato uno studio collaborativo nel quale 8 laboratori hanno analizzato 6 alimenti, 4 premiscele e 3 preparati. Su ciascun campione sono state eseguite analisi in doppio. (Per maggiori informazioni: Journal of the AOAC, Volume 71, 1998, pag. 484-490). I risultati (ad esclusione di quelli fuori campo) sono mostrati qui appresso: Tabella 1. Risultato dello studio collaborativo sugli alimenti L n Media [mg/kg] [mg/kg] S r CV [%] r SR [mg/kg] CVR [%] Contenuto nominale [mg/kg] Campione 1 Campione 2 Campione 3 Campione 4 Campione 5 Campione 6 8 15 50,0 2,90 5,8 3,92 7,8 8 14 47,6 2,69 5,6 4,13 8,7 8 15 48,2 1,38 2,9 2,23 4,6 8 15 49,7 1,55 3,1 2,58 5,2 8 15 46,9 1,52 3,2 2,26 4,8 8 15 49,7 2,12 4,3 2,44 4,9 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 L 118/52 IT Gazzetta ufficiale delle Comunit(cid:133) europee 6. 5. 1999 Tabella 2. Risultati dello studio collaborativo sulle premiscele e i preparati Premiscele Preparati A B C D 7 14 8,89 0,37 4,2 0,37 4,2 7 14 9,29 0,28 3,0 0,28 3,0 7 14 9,21 0,28 3,0 0,40 4,3 7 14 8,76 0,44 5,0 0,55 6,3 A 8 16 94,6 4,1 4,3 5,4 5,7 B 8 16 98,1 5,1 5,2 6,4 6,5 C 8 16 104 7,7 7,4 7,7 7,4 10,0 10,0 10,0 10,0 100 100 100 L n Media [mg/kg] [mg/kg] S r CV [%] r SR [mg/kg] [%] CV R Contenuto nominale [mg/kg] L: n: s r: CV S : R CV R numero di laboratori numero di valori singoli deviazione standard della ripetibilit(cid:133) r: coefficiente di variazione della ripetibilit(cid:133) deviazione standard della riproducibilit(cid:133) : coefficiente di variazione della riproducibilit(cid:133)


title: ΓΡΑΠΤΗ ΕΡΩΤΗΣΗ αρ θ. 1119/99 του Barbara DUEHRKOP DUEHRKOP Πρόγραμμα της Επιτροπής για την καταπολέμηση της χρήσης αναβολικών ουσιών στον αθλητισμό

eurovoc_concepts:
health policy
performance drugs
professional sport
public awareness campaign

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text: 21. 12. 1999 EL Επι΄σηµη Εφηµερι΄δα των Ευρωπαι¨κω΄ν Κοινοτη΄των C 370/167 (1999/C 370/236) ΓΡΑΠΤΗ ΕΡΩΤΗΣΗ P-1111/99 υποβολη΄: Paul Rübig (PPE) προς την Επιτροπη΄ (15 Απριλι΄ου 1999) Θε΄µα: Ο ανταγωνισµο΄ς στην ενιαι΄α αγορα΄ του τοµε΄α παραγωγη΄ς σανι΄δων σε΄ρφινγκ Στο΄χος των κανο΄νων της ΕΕ για τον ανταγωνισµο΄ ει΄ναι η εξασφα΄λιση µιας ανταγωνιστικη΄ς ευρωπαι¨κη΄ς εσωτερικη΄ς αγορα΄ς και η αποτροπη΄ των αρνητικω΄ν συνεπειω΄ν της κυριαρχι΄ας µι΄ας η΄ περισσο΄τερων επιχειρη΄σεων στην Ενιαι΄α Αγορα΄. Ένας µεγα΄λος αριθµο΄ς παραγωγω΄ν αποτελει΄ εγγυ΄ηση για τον ελε΄υθερο ανταγωνισµο΄, µεριµνα΄ για την ελευ΄θερη προ΄σβαση στην αγορα΄ και εξασφαλι΄ζει εξ ορισµου΄ περισσο΄τερες θε΄σεις εργασι΄ας απο΄ ο΄,τι ε΄να µονοπω΄λιο η΄ ε΄να ολιγοπω΄λιο. Συ΄µφωνα µε πληροφορι΄ες που πηγα΄ζουν απο΄ τη Γερµανι΄α, ο τοµε΄ας παραγωγη΄ς σανι΄δων σε΄ρφινγκ χαρακτηρι΄ζεται απο΄ αυξανο΄µενη συγκε΄ντρωση αγορα΄ς µετα΄ την εξαγορα΄ µεµονωµε΄νων παραγωγω΄ν εταιρειω΄ν. Πω΄ς εκτιµα΄ η Επιτροπη΄ την κατα΄σταση στην αγορα΄ σανι΄δων σε΄ρφινγκ και ποια΄ µερι΄δια συµµετοχη΄ς στην αγορα΄ θεωρει΄ ως βα΄ση για κα΄θε µεµονωµε΄νο παραγωγο΄ (ενδεχοµε΄νως χωρι΄ς να τους κατονοµα΄ζει αλλα΄ αναφε΄ροντας τη χω΄ρα προε΄λευσης); Ποια΄ σχε΄δια εξαγορα΄ς δηλω΄θηκαν στις αρχε΄ς ανταγωνισµου΄ κατα΄ τη δια΄ρκεια των τελευται΄ων ε΄ξι µηνω΄ν; Προκυ΄πτει απο΄ ο΄λα αυτα΄ η ανα΄γκη ανα΄ληψης δρα΄σης εκ µε΄ρους της Επιτροπη΄ς και, αν ναι, σε ποιες ενε΄ργειες προχωρει΄ η΄ σχεδια΄ζει να προχωρη΄σει; Απα΄ντηση του κ. Van Miert εξ ονο΄µατος της Επιτροπη΄ς (6 Μαι΅ου 1999) Συ΄µφωνα µε τους ευρωπαι¨κου΄ς κανο΄νες ελε΄γχου περι΄ συγκεντρω΄σεων επιχειρη΄σεων (κανονισµο΄ς (ΕΟΚ) 4064/89 του Συµβουλι΄ου της 21ης ∆εκεµβρι΄ου 1989 για τον ε΄λεγχο των συγκεντρω΄σεων µεταξυ΄ επιχειρη΄σεων (1)), η Επιτροπη΄ πρε΄πει να ενηµερω΄νεται µο΄νο για µεγα΄λες συγκεντρω΄σεις ο΄πως η συγχω΄νευση, η απορρο΄φηση και οι κοινε΄ς επιχειρη΄σεις που ε΄χουν κοινοτικη΄ δια΄σταση. Η συγκε΄ντρωση ε΄χει κοινοτικη΄ δια΄σταση ο΄ταν ο κυ΄κλος εργασιω΄ν των συγκεκριµε΄νων επιχειρη΄σεων υπερβαι΄νει το ο΄ριο που προβλε΄πει ο κανονισµο΄ς. Κανονικα΄, ο συνολικο΄ς παγκο΄σµιος κυ΄κλος εργασιω΄ν των συγκεκριµε΄νων επιχειρη΄σεων θα πρε΄πει να ξεπερνα΄ει τα 5 δισεκα- τοµµυ΄ρια ευρω΄ και ο κοινοτικο΄ς κυ΄κλος εργασιω΄ν δυ΄ο τουλα΄χιστον επιχειρη΄σεων θα πρε΄πει να ξεπερνα΄ει τα 250 εκατοµµυ΄ρια ευρω΄. Συγκεντρω΄σεις που δεν υπερβαι΄νουν αυτα΄ τα ο΄ρια υπα΄γονται στη δικαιοδοσι΄α των αρχω΄ν για τον ανταγωνισµο΄ του εκα΄στοτε κρα΄τους µε΄λους, ο΄πως για παρα΄δειγµα της Bundeskartellamt στη Γερµανι΄α. τσι γι΄νεται στις περισσο΄τερες περιπτω΄σεις συγκεντρω΄σεων. Η Επιτροπη΄ δεν ει΄χε ως τω΄ρα την ευκαιρι΄α να εξετα΄σει εις βα΄θος την αγορα΄ των ιστιοσανι΄δων (σε΄ρφινγκ). Η Επιτροπη΄ δεν ενηµερω΄θηκε για καµι΄α εξαγορα΄ ο΄σον αφορα΄ τον τοµε΄α παραγωγη΄ς ιστιοσανι΄δων τους τελευται΄ους ε΄ξι µη΄νες και δεν ε΄λαβε κανε΄να στοιχει΄ο που να βεβαιω΄νει ο΄τι η συγκε΄ντρωση στον τοµε΄α αυτο΄ ε΄πρεπε να γι΄νει συ΄µφωνα µε τον κανονισµο΄ ΕΟΚ αριθ. 4064/89 του Συµβουλι΄ου. Εποµε΄νως, δεν θα πραγµατοποιηθει΄ ε΄λεγχος περι΄ συγκεντρω΄σεως στον τοµε΄α αυτο΄. Πιθανο΄ν, οι εθνικε΄ς αρχε΄ς περι΄ ανταγωνισµου΄ να γνωρι΄ζουν παρο΄µοιες περιπτω΄σεις και να µπορου΄ν να δω΄σουν χρη΄σιµες πληροφορι΄ες για το θε΄µα αυτο΄. (1) ΕΕ L 395 της 30. 12. 1989. (1999/C 370/237) ΓΡΑΠΤΗ ΕΡΩΤΗΣΗ P-1119/99 υποβολη΄: Bárbara Dührkop Dührkop (PSE) προς την Επιτροπη΄ (20 Απριλι΄ου 1999) Θε΄µα: Προ΄γραµµα της Επιτροπη΄ς για την καταπολε΄µηση της χρη΄σης αναβολικω΄ν ουσιω΄ν στον αθλητισµο΄ Τα τελευται΄α χρο΄νια ε΄χει σηµειωθει΄ θεαµατικη΄ αυ΄ξηση στη χρη΄ση αναβολικω΄ν ουσιω΄ν στον αθλητισµο΄. Ο επαγγελµατισµο΄ς, η υπερβολικη΄ εµπορευµατοποι΄ηση και τα µεγα΄λα χρηµατικα΄ ποσα΄ που διακινου΄νται στον τοµε΄α του επαγγελµατικου΄ αθλητισµου΄, ε΄χουν µετατρε΄ψει πολλου΄ς αθλητε΄ς σε µηχανε΄ς, απο΄ τους οποι΄ους απαιτου΄νται επιδο΄σεις ανθρωπι΄νως αδυ΄νατες. Για του΄το γι΄νεται συχνα΄ προσφυγη΄ στη χρη΄ση φαρµα΄κων και απαγορευµε΄νων ουσιω΄ν που βλα΄πτουν την υγει΄α των αθλητω΄ν


title: SKRIFTLIG FORESPØRGSEL nr. 1060/99 af Carlos BRU PURÓN Gebyrer ved omveksling af valuta

eurovoc_concepts:
Economic and Monetary Union
bank
bank charges
euro area
exchange transaction

text: C 370/158 De Europæiske Fællesskabers Tidende DA 21. 12. 1999 (1999/C 370/223) SKRIFTLIG FORESPØRGSEL E-1043/99 af Ilona Graenitz (PSE) til Kommissionen (20. april 1999) Om: Screeningundersøgelse af ansøgerlandes miljølovgivning Hvilket referencetidspunkt opereres der med ved screeningundersøgelsen af ansøgerlandenes miljølov- givning? Vil dette referencetidspunkt blive tilpasset varigheden af forhandlingerne? Svar afgivet på Kommissionens vegne af Hans van den Broek (7. maj 1999) Ved undersøgelsen af ansøgerlandenes overtagelse af den gældende fællesskabsret på miljøområdet tages der hensyn til alle de fællesskabsbestemmelser, der er vedtaget indtil 1. januar 1999. De bestemmelser, som Fællesskabet vedtager efter denne dato, vil dog også indgå i screeningen med henblik på en vurdering af, hvorvidt ansøgerlandene har overtaget disse og gennemført dem i national ret. Derfor vil Kommissionen drøfte de for nylig vedtagne bestemmelser med ansøgerlandene på et belejligt tidspunkt i forhandlings- processen. (1999/C 370/224) SKRIFTLIG FORESPØRGSEL E-1060/99 af Carlos Bru Purón (PSE) til Kommissionen (20. april 1999) Om: Gebyrer ved omveksling af valuta Med henblik på fremtiden benytter visse banker i euroområdet indeværende år til at opkræve gebyrer ved omveksling af europæiske valutaer på op til over 25 %, idet de desuden anvender et regressivt kriterium, som gør det forholdsmæssigt dyrere at omveksle små beløb. Påtænker Kommissionen at advare medlemsstaternes banker eller bankorganisationer om de uheldige virkninger, som denne kedelige udnyttelse af gebyrerne i sidste øjeblik kan få for bankforretninger i fremtiden? Svar afgivet på Kommissionens vegne af Mario Monti (7. maj 1999) Kommissionen kan oplyse det ærede medlem, at den allerede har rettet henvendelse til banker og bankorganisationer vedrørende de gebyrer, bankerne opkræver for omveksling af pengesedler i euro- zonen. I et brev af januar 1999 til de største europæiske bankforbund understregede Kommissionen, at det er af største betydning, at offentlighedens tillid til indførelsen af euroen og banksystemets troværdighed som helhed ikke undermineres af den omstændighed, at fordel af forhøjede gebyrer på transaktioner mellem tidligere nationale valutaer i euro-zonen. Den 5. februar 1999 opfordrede Kommissionen i en pressemeddelelse (1) på ny bankerne til at søge at skabe yderligere gennemskuelighed ved at offentliggøre information om ændringerne af samtlige gebyrer (før og efter indførelsen af euroen) for omveksling i euro-zonen af pengesedler og grænseoverskridende checks, over- førsler og betaling med kort. Kommissionen har også for nylig givet offentligheden adgang til en analyse af de klager, den har modtaget gennem den specialoprettede e-mail og fax-tjeneste der blev bebudet i IP/99/ 90. Bankorganisationerne er ligeledes blevet anmodet om at reagere på informationen i denne analyse. finansinstitutterne drager illoyal Det ærede medlem henvises endvidere til Kommissionens svar på skriftlig forespørgsel E-3825/98 fra Caudron (2) og P-52/99 fra Tamino (3) og til svarene på mundtlig forespørgsel O-29/99 fra Hendrick og


title: SCHRIFTLICHE ANFRAGE Nr. 1054/99 von Angela BILLINGHAM Europäischer Bahnpaß für Senioren

eurovoc_concepts:
elderly person
feasibility study
intra-EU transport
rail transport
railway tariff
tariff reduction
tourism
travel

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