title: Kommissionens direktiv 1999/27/EG av den 20 april 1999 om fastställande av gemenskapsmetoder för analys av amprolium, diclazuril och karbadox i djurfoder och om ändring av kommissionens direktiv 71/250/EEG, 73/46/EEG och om upphävande av direktiv 74/203/EEG (Text av betydelse för EES)

eurovoc_concepts:
analytical chemistry
animal nutrition
food additive
food inspection

text: L 118/36 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning 6. 5. 1999 KOMMISSIONENS DIREKTIV 1999/27/EG av den 20 april 1999 om fastst(cid:132)llande av gemenskapsmetoder f(cid:148)r analys av amprolium, diclazuril och karbadox i djurfoder och om (cid:132)ndring av kommissionens direktiv 71/250/EEG, 73/46/EEG och om upph(cid:132)vande av direktiv 74/203/EEG (Text av betydelse f(cid:148)r EES) (5) (6) av senapsolja och teobromin. De beskrivna meto- derna uppfyller inte l(cid:132)ngre sitt syfte mot bakgrund av nya vetenskapliga och tekniska r(cid:148)n. Dessa metoder b(cid:148)r d(cid:132)rf(cid:148)r utg(cid:134). I kommissionens fj(cid:132)rde direktiv 73/46/EEG av den 5 december 1972 om gemenskapsmetoder f(cid:148)r analys vid den officiella foderkontrollen (7), senast (cid:132)ndrat genom kommissionens direktiv 98/54/EG fastst(cid:132)lls analysmetoder f(cid:148)r bland annat best(cid:132)mning av retinol (A-vitamin). Den beskrivna metoden uppfyller inte l(cid:132)ngre sitt syfte mot bakgrund av nya vetenskapliga och tekniska r(cid:148)n. Denna metod b(cid:148)r d(cid:132)rf(cid:148)r utg(cid:134) betr(cid:132)ffande retinol. I kommissionens femte direktiv 74/203/EEG av den 25 mars 1974 om gemenskapsmetoder f(cid:148)r analys vid den officiella foderkontrollen (8), (cid:132)ndrat genom direktiv 81/680/EEG (9), fastst(cid:132)lls analysme- toder f(cid:148)r best(cid:132)mning av st(cid:132)rkelse och nedbryt- ningsprodukter av st(cid:132)rkelse med h(cid:148)g molekylvikt i foder som inneh(cid:134)ller betsnitsel, betmassa, torkad betblast eller torkade betblad, potatismos, torkad j(cid:132)st, inulinrika produkter eller fettgrevar, ampro- lium, etopabat, dinitolmid (DOT), nicarbazin och menadion (vitamin K3). Ingen av de beskrivna metoderna i det direktivet uppfyller l(cid:132)ngre sitt syfte mot bakgrund av nya vetenskapliga och tekniska r(cid:148)n. Detta direktiv b(cid:148)r d(cid:132)rf(cid:148)r upph(cid:132)vas. (7) De (cid:134)tg(cid:132)rder som f(cid:148)reskrivs i detta direktiv (cid:132)r f(cid:148)ren- liga med yttrandet fr(cid:134)n St(cid:132)ndiga foderkommitt(cid:130)n. EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DETTA DIREKTIV med beaktande av F(cid:148)rdraget om uppr(cid:132)ttandet av Euro- peiska gemenskapen, med beaktande av r(cid:134)dets direktiv 70/373/EEG av den 20 juli 1970 om inf(cid:148)rande av gemenskapsmetoder f(cid:148)r provtagning och analys vid den officiella foderkon- trollen (1), senast (cid:132)ndrat genom anslutningsakten f(cid:148)r (cid:153)sterrike, Finland och Sverige, s(cid:132)rsilt artikel 2 i detta, och av f(cid:148)ljande sk(cid:132)l: I direktiv 70/373/EEG fastst(cid:132)lls att den officiella foderkontrollen skall genomf(cid:148)ras enligt gemen- skapsmetoderna f(cid:148)r analys och provtagning n(cid:132)r det g(cid:132)ller att konstatera om de villkor som (cid:132)r fastst(cid:132)llda i lagar och andra f(cid:148)rfattningar om djurfoders beskaffenhet och sammans(cid:132)ttning f(cid:148)ljs. skall anges I r(cid:134)dets direktiv 70/524/EEG av den 23 november 1970 om fodertillsatser (2), senast (cid:132)ndrat genom f(cid:148)rordning (EG) nr 45/1999 (3), kommissionens f(cid:148)reskrivs f(cid:148)r (cid:148)vrigt att halten av amprolium och diclazuril i m(cid:132)rkningen om dessa (cid:132)mnen s(cid:132)tts till foderblandningar. Godk(cid:132)nnandet av karbadox som fodertillsats har (cid:134)terkallats genom f(cid:148)rordning 2788/98 av den 22 kommissionens december 1998 om (cid:132)ndring av r(cid:134)dets direktiv 70/ 524/EEG om fodertillsatser n(cid:132)r det g(cid:132)ller indrag- ning av godk(cid:132)nnande f(cid:148)r vissa tillv(cid:132)xtbefr(cid:132)mjande medel (4). Det (cid:132)r n(cid:148)dv(cid:132)ndigt att utf(cid:148)ra officiell kontroll av eventuellt olagligt bruk av f(cid:148)rbjudna (cid:132)mnen. (1) (2) (3) (4) Det b(cid:148)r uppr(cid:132)ttas analysmetoder i gemenskapen f(cid:148)r kontroll av dessa (cid:132)mnen. H(cid:142)RIGENOM F(cid:153)RESKRIVS F(cid:153)LJANDE. I kommissionens f(cid:148)rsta direktiv 71/250/EEG av den 15 juni 1971 om gemenskapsmetoder f(cid:148)r analys vid den officiella foderkontrollen (5), senast (cid:132)ndrat genom kommissionens direktiv 98/54/EG (6) fastst(cid:132)lls analysmetoder f(cid:148)r bland annat best(cid:132)mning (1) EGT L 170, 3. 8. 1970, s. 2. (2) EGT L 270, 14. 12. 1970, s. 1. (3) EGT L 6, 12. 1. 1999, s. 3. (4) EGT L 347, 23. 12. 1998, s. 31. (5) EGT L 155, 12. 7. 1971, s. 13. (6) EGT L 208, 24. 7. 1998, s. 49. Artikel 1 Medlemsstaterna skall kr(cid:132)va att analyserna i samband med den officiella foderkontrollen av halten av amprolium, diclazuril och karbadox skall ske enligt de metoder som beskrivs i bilagan. (7) EGT L 83, 30. 3. 1973, s. 21. (8) EGT L 108, 22. 4. 1974, s. 7. (9) EGT L 246, 29. 8. 1981, s. 32. 6. 5. 1999 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning L 118/37 Artikel 2 Direktiv 71/250/EEG (cid:132)ndras p(cid:134) f(cid:148)ljande s(cid:132)tt: 1) I artikel 1 skall ”senapsolja” och ”teobromin” utg(cid:134). 2) Punkterna 8 och 13 i bilagan skall utg(cid:134). Artikel 3 Direktiv 73/46/EEG (cid:132)ndras p(cid:134) f(cid:148)ljande s(cid:132)tt: 1) Artikel 2 skall utg(cid:134). 2) Bilaga II skall utg(cid:134). De skall 1 november 1999. till(cid:132)mpa best(cid:132)mmelserna fr(cid:134)n och med den N(cid:132)r medlemsstaterna antar dessa best(cid:132)mmelser skall de inneh(cid:134)lla en h(cid:132)nvisning till detta direktiv eller (cid:134)tf(cid:148)ljas av en s(cid:134)dan h(cid:132)nvisning n(cid:132)r de offentligg(cid:148)rs. N(cid:132)rmare f(cid:148)re- skrifter om hur h(cid:132)nvisningen skall g(cid:148)ras skall varje medlemsstat sj(cid:132)lv utf(cid:132)rda. Artikel 6 Detta direktiv tr(cid:132)der i kraft den tjugonde dagen efter det att det har offentliggjorts i Europeiska gemenskapernas officiella tidning. Artikel 4 Femte direktivet 74/203/EEG skall upph(cid:132)vas. Artikel 7 Detta direktiv riktar sig till medlemsstaterna. Artikel 5 Utf(cid:132)rdat i Bryssel den 20 april 1999. Medlemsstaterna skall, senast den 31 oktober 1999, s(cid:132)tta i kraft de lagar och andra best(cid:132)mmelser som (cid:132)r n(cid:148)dv(cid:132)ndiga f(cid:148)lja detta direktiv. De skall genast underr(cid:132)tta f(cid:148)r att kommissionen om detta. P(cid:134) kommissionens v(cid:132)gnar Franz FISCHLER Ledamot av kommissionen L 118/38 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning 6. 5. 1999 BILAGA DEL A BEST(cid:142)MNING AV AMPROLIUM 1-[(4-amino-2-propyl-5-pyrimidylmetyl]-2-metyl-pyridiniumkloridhydroklorid 1. Syfte och r(cid:132)ckvidd Metoden avser best(cid:132)mning av amprolium i djurfoder och f(cid:148)rblandningar. Detektionsgr(cid:132)nsen (cid:132)r 1 mg/kg och den undre gr(cid:132)nsen f(cid:148)r best(cid:132)mningen 25 mg/kg. 2. Princip Provet extraheras med en vatten-metanol-blandning. Efter utsp(cid:132)dning med den r(cid:148)rliga fasen och membranfiltrering best(cid:132)ms amproliumhalten genom katjonbytesv(cid:132)tskekromatografi (HPLC) med UV- detektor. 3. 3. 1 3. 2 3. 3 3. 4 Reagens Metanol Acetonitril, HPLC-kvalitet Vatten, HPLC-kvalitet Natriumdiv(cid:132)tefosfatl(cid:148)sning, c = 0,1 mol/l L(cid:148)s 13,80 g natriumdiv(cid:132)tefosfatmonohydrat i vatten (3. 3) i en 1 l m(cid:132)tkolv, sp(cid:132)d till m(cid:132)rket med vatten (3. 3) och blanda. 3. 5 Natriumperkloratl(cid:148)sning, c =1,6 mol/l L(cid:148)s 224,74 g natriumperkloratmonohydrat i vatten (3. 3) i en 1 l m(cid:132)tkolv, sp(cid:132)d till m(cid:132)rket med vatten (3. 3) och blanda. 3. 6 R(cid:148)rlig fas f(cid:148)r HPLC (se anm(cid:132)rkning 9. 1). En blandning av acetonitril (3. 2), natriumdiv(cid:132)tefosfatl(cid:148)sning (3. 4) och natirumperkloratl(cid:148)sning (3. 5), 450+450+100 (v+v+v). Filtrera f(cid:148)re anv(cid:132)ndning l(cid:148)sningen genom ett 0,22 lm membranfilter (4. 3) och avlufta den (i ultraljudsbad (4. 4) i minst 15 minuter). 3. 7 Standardsubstans: rent amprolium, 1-[(4-amino-2-propylpyrimidin-5-yl)metyl]-2-metyl-pyridiniumklo- ridhydroklorid, E 750 (se punkt 9. 2) 3. 7. 1 Standardl(cid:148)sning av amprolium, 500 lg/ml V(cid:132)g med en noggrannhet av 0,1 mg upp 50 mg amprolium (3. 7) i en 100 ml m(cid:132)tkolv, l(cid:148)s det i 80 ml metanol (3. 1) och placera kolven i ett ultraljudsbad i 10 min (4. 4). L(cid:134)t l(cid:148)sningen anta rumstemperatur, fyll upp till m(cid:132)rket med vatten och blanda. L(cid:148)sningen kan lagras i en m(cid:134)nad vid h(cid:148)gst 4 (cid:176)C. 3. 7. 2 Arbetsstandardl(cid:148)sning av amprolium, 50 lg/ml Pipettera 5,0 ml av lagerstandardl(cid:148)sningen (3. 7. 1) till en 50 ml m(cid:132)tkolv, fyll till m(cid:132)rket med den extraktionsl(cid:148)sningen (3. 8) och blanda. L(cid:148)sningen kan lagras i en m(cid:134)nad vid h(cid:148)gst 4 (cid:176)C. 3. 7. 3 Kalibreringsl(cid:148)sningar (cid:153)verf(cid:148)r 0,5, 1,0 och 2,0 ml av arbetsstandardl(cid:148)sningen (3. 7. 2) till ett antal 50 ml m(cid:132)tkolvar. Fyll till m(cid:132)rket med den r(cid:148)rliga fasen (3. 6) och blanda. Dessa l(cid:148)sningar motsvarar 0,5, 1,0 respektive 2,0 lg amprolium per ml. Dessa l(cid:148)sningar m(cid:134)ste beredas p(cid:134) nytt f(cid:148)re varje anv(cid:132)ndning. 6. 5. 1999 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning L 118/39 3. 8 Extraktionsl(cid:148)sning Metanol-vatten-blandning (3. 1) 2+1 (v+v) 4. Utrustning 4. 1 HPLC-utrustning med injektionssystem som l(cid:132)mpar sig f(cid:148)r injektionsvolymer p(cid:134) 100 ll 4. 1. 1 V(cid:132)tskekromatografikolonn 125 mm x 4 mm, katjonbytare Nucleosil 10 SA, 10 lm packning, eller motsvarande 4. 1. 2 Variabel UV-detektor eller diodarraydetektor 4. 2 4. 3 4. 4 4. 5 Membranfilter, PTFE-material, 0,45 lm Membranfilter, 0,22 lm Ultraljudsbad Mekanisk skakapparat eller magnetomr(cid:148)rare 5. Utf(cid:148)rande 5. 1 Allm(cid:132)nt 5. 1. 1 Blindprov F(cid:148)r utbytesf(cid:148)rs(cid:148)ket (5. 1. 2) b(cid:148)r ett blindprov analyseras f(cid:148)r kontroll av att varken amprolium eller andra st(cid:148)rande (cid:132)mnen (cid:132)r n(cid:132)rvarande. Blindprovet b(cid:148)r vara av samma typ som provet och varken amprolium eller andra st(cid:148)rande (cid:132)mnen skall kunna p(cid:134)visas i det. 5. 1. 2 Utbytesf(cid:148)rs(cid:148)k Ett utbytesf(cid:148)rs(cid:148)k b(cid:148)r utf(cid:148)ras genom en analys av blindprovet tillsatt (”spikat”) med en m(cid:132)ngd ampro- lium som motsvarar den i provet. F(cid:148)r spikning p(cid:134) niv(cid:134)n 100 mg/kg, s(cid:132)tt 10,0 ml av stamstandardl(cid:148)s- ningen (3. 7. 1) till en 250 ml kolv och indunsta till ca 0,5 ml. Tills(cid:132)tt 50 g av blindprovet, blanda ordentligt, l(cid:134)t st(cid:134) i tio minuter och r(cid:148)r om igen flera g(cid:134)nger f(cid:148)re extraktionen (5. 2). Om ett blindprov av samma typ som provet inte finns att tillg(cid:134) (se 5. 1. 1) kan ett utbytestest g(cid:148)ras med standardtillsatsmetoden. Denna inneb(cid:132)r att det prov som skall analyseras spikas med samma m(cid:132)ngd amprolium som finns i provet. Detta prov analyseras tillsammans med det ”ospikade” provet och utbytet kan ber(cid:132)knas genom subtraktion. 5. 2 Extraktion 5. 2. 1 F(cid:148)rblandningar (med mindre (cid:132)n 1 % amprolium) och djurfoder V(cid:132)g beroende p(cid:134) amproliumhalten in 5–40 g av provet med en noggrannhet p(cid:134) 0,01 g i en 500 ml E-kolv och tills(cid:132)tt 200 ml extraktionsl(cid:148)sning (3. 8). Placera kolven i ultraljudsbadet (4. 4) i 15 minuter. Ta kolven ur badet och skaka l(cid:148)sningen i 1 timme i skakapparat eller p(cid:134) magnetomr(cid:148)rare (4. 5). Sp(cid:132)d en del av l(cid:148)sningen med den r(cid:148)rliga fasen (3. 6) till en amproliumhalt av 0,5–2 lg/ml och blanda (se iakttagelse 9. 3). Filtrera 5–10 ml av den utsp(cid:132)dda l(cid:148)sningen genom ett membranfilter (4. 2). G(cid:134) vidare till HPLC-best(cid:132)mningen (5. 3). 5. 2. 2 F(cid:148)rblandningar (med minst 1 % amprolium) V(cid:132)g beroende p(cid:134) amproliumhalten in 1–4 g av f(cid:148)rblandningen med en noggrannhet p(cid:134) 0,001 g i en 500 ml E-kolv och tills(cid:132)tt 200 ml extraktionsl(cid:148)sning (3. 8). Placera kolven i ultraljudsbadet i 15 minuter (4. 4). Ta kolven ur badet och skaka l(cid:148)sningen i 1 timme i skakapparat eller p(cid:134) magnetomr(cid:148)rare (4. 5). Sp(cid:132)d en del av l(cid:148)sningen med den r(cid:148)rliga fasen (3. 6) till en amproliumhalt av 0,5–2 lg/ml och blanda. Filtrera 5–10 ml av den utsp(cid:132)dda l(cid:148)sningen genom ett membranfilter (4. 2). G(cid:134) vidare till HPLC-best(cid:132)mningen (5. 3). 5. 3 HPLC-best(cid:132)mning L 118/40 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning 6. 5. 1999 5. 3. 1 Parametrar: F(cid:148)ljande villkor anges som v(cid:132)gledning; andra f(cid:148)ruts(cid:132)ttningar kan v(cid:132)ljas om de ger motsvarande resultat. V(cid:132)tskekromatografikolonn (4. 1. 1): R(cid:148)rlig fas (3. 6): Fl(cid:148)de: Detektionsv(cid:134)gl(cid:132)ngd: Injektionsvolym: 125 mm · 4 mm, katjonbytare Nucleosil 10 SA, 10 lm packning, eller motsvarande En blandning av acetonitril (3. 2), natriumdiv(cid:132)tefosfatl(cid:148)s- ning (3. 4) och natriumperkloratl(cid:148)sning (3. 5), 450 + 450 + 100 (v + v + v). 0,7–1 ml/min 264 nm 100 ll Kontrollera det kromatografiska systemets stabilitet genom att flera g(cid:134)nger injicera kalibreringsl(cid:148)s- ningen (3. 7. 3) som inneh(cid:134)ller 1,0 lg/ml tills konstanta toppar och retentionstider uppn(cid:134)s. 5. 3. 2 Kalibreringskurva Injicera varje kalibreringsl(cid:148)sning (3. 7. 3) flera g(cid:134)nger och best(cid:132)m medeltoppareorna f(cid:148)r varje koncentra- tion. Konstruera en kalibreringskurva med kalibreringsl(cid:148)sningarnas medeltoppareor l(cid:132)ngs y-axeln och de motsvarande koncentrationerna i lg/ml l(cid:132)ngs x-axeln. 5. 3. 3 Provl(cid:148)sning Injicera provl(cid:148)sningen (5. 2) flera g(cid:134)nger med samma m(cid:132)ngd som kalibreringsl(cid:148)sningarna och best(cid:132)m medeltopparean f(cid:148)r amproliumtopparna. 6. Resultatber(cid:132)kning Anv(cid:132)nd medeltopparean f(cid:148)r provl(cid:148)sningens amproliumtoppar f(cid:148)r att best(cid:132)mma provl(cid:148)sningens koncentration i lg/ml med hj(cid:132)lp av kalibreringskurvan (5. 3. 2). Amproliuminneh(cid:134)llet w i mg/kg i provet f(cid:134)s genom f(cid:148)ljande formel: w = V·b·f m [mg/kg] d(cid:132)r V = extraktionsl(cid:148)sningens (3. 8) volym i ml enligt 5. 2 (dvs. 200 ml) b = amproliumkoncentration i provl(cid:148)sningen (5. 2) i lg/ml f = sp(cid:132)dningsfaktorn enligt 5. 2 m = provportionens massa i gram 7. Utv(cid:132)rdering av resultat 7. 1 Identitet Analytens identitet kan bekr(cid:132)ftas genom co-kromatografs eller genom anv(cid:132)ndning av en diodarrayde- tektor med vars hj(cid:132)lp spektret f(cid:148)r provextraktet (5. 2) och kalibreringsl(cid:148)sningen (3. 7. 3) inneh(cid:134)llande 2,0 lg/ml j(cid:132)mf(cid:148)rs. 7. 1. 1 Co-kromatografi Ett provextrakt (5. 2) spikas genom tillsats av en l(cid:132)mplig m(cid:132)ngd kalibreringsl(cid:148)sning (3. 7. 3). M(cid:132)ngden tillsatt amprolium b(cid:148)r vara densamma som den m(cid:132)ngd amprolium som best(cid:132)mts i provextraktet. Endast niv(cid:134)n p(cid:134) amproliumtoppen b(cid:148)r f(cid:148)rh(cid:148)jas efter beaktande av b(cid:134)de den tillsatta m(cid:132)ngden och sp(cid:132)dningen av extraktet. Toppens bredd m(cid:134)ste p(cid:134) mitten ligga inom 5 10 % av den ursprungliga bredden p(cid:134) amproliumtoppen i det icke spikade provextraktet. 6. 5. 1999 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning L 118/41 7. 1. 2 Diodarraydetektion Resultaten utv(cid:132)rderas enligt f(cid:148)ljande kriterier: a) V(cid:134)gl(cid:132)ngden f(cid:148)r provets och standardspektrets maximala absorption, noterad vid kromatogrammets toppkurva, skall inte skilja sig inom detektorns uppl(cid:148)sning. Vid diodarraydetektion ligger uppl(cid:148)s- ningen vanligen inom 5 2 nm. b) Mellan 210 och 320 nm skall det provspektrum och det standardspektrum som noterats vid kromatogrammets toppkurva inte skilja sig (cid:134)t f(cid:148)r de delar av spektret som ligger inom 10–100 % av den relativa absorbansen. Detta kriterium (cid:132)r uppfyllt om samma maxima (cid:132)r n(cid:132)rvarande och avvikelsen mellan de b(cid:134)da spektren inte vid n(cid:134)gon m(cid:132)tpunkt (cid:148)verskrider 15 % av standardana- lytens absorbans. c) Mellan 210 och 320 nm skall den upp(cid:134)tg(cid:134)ende linjen, toppen och den ned(cid:134)tg(cid:134)ende linjen fr(cid:134)n samma provextrakt inte skilja sig fr(cid:134)n varandra i de delar av spektret som ligger inom 10–100 % av den relativa absorbansen. Detta kriterium (cid:132)r uppfyllt om samma maxima observeras och avvikelsen mellan de b(cid:134)da spektren inte vid n(cid:134)gon m(cid:132)tpunkt (cid:148)verskrider 15 % av standardana- lytens absorbans. Om n(cid:134)got av dessa kriterier inte (cid:132)r uppfyllt har n(cid:132)rvaro av analyten inte bekr(cid:132)ftats. 7. 2 Repeterbarhet Skillnaden mellan resultaten av tv(cid:134) parallella best(cid:132)mningar som utf(cid:148)rs p(cid:134) samma prov f(cid:134)r inte (cid:148)verstiga (cid:190) 15 % i relation till det h(cid:148)gre v(cid:132)rdet f(cid:148)r amproliuminneh(cid:134)ll mellan 25 och 500 mg/kg (cid:190) 75 mg/kg f(cid:148)r amproliuminneh(cid:134)ll mellan 500 och 1 000 mg/kg (cid:190) 7,5 % i relation till det h(cid:148)gre v(cid:132)rdet f(cid:148)r amproliuminneh(cid:134)ll f(cid:148)r (cid:148)ver 1 000 mg/kg 7. 3 Utbyte I fr(cid:134)ga om spikade (rena) blindprov skall utbytet vara minst 90 %. 8. Resultat av en samordnad unders(cid:148)kning En samordnad unders(cid:148)kning genomf(cid:148)rdes med analys av tre fj(cid:132)derf(cid:132)foder (proverna 1–3), ett mineral- foder (prov 4) och en f(cid:148)rblandning (prov 5). Resultaten framg(cid:134)r av f(cid:148)ljande tabell: L n Genomsnitt [mg/kg] sr [mg/kg] [%] CV r sR [mg/kg] CVR [%] Nominell halt [mg/kg] Prov 1 (blindprov) Prov 2 Prov 3 Prov 4 Prov 5 14 56 (cid:190) (cid:190) (cid:190) (cid:190) (cid:190) (cid:190) 14 56 45,5 2,26 4,95 2,95 6,47 50 14 56 188 3,57 1,90 11,8 6,27 200 14 56 5 129 178 3,46 266 5,19 15 60 25 140 550 2,20 760 3,00 5 000 25 000 L: n: s : r CV : r s R: CV antal laboratorier antal individuella v(cid:132)rden repeterbarhetens standardavvikelse repeterbarhetens variationskoefficient reproducerbarhetens standardavvikelse R: reproducerbarhetens variationskoefficient L 118/42 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning 6. 5. 1999 9. Anm(cid:132)rkningar 9. 1 9. 2 9. 3 Om provet inneh(cid:134)ller tiamin kommer tiamintoppen i kromatogrammet att ligga strax f(cid:148)re amprolium- toppen. Med denna metod m(cid:134)ste amprolium och tiamin separeras. Om amprolium och tiamin inte separeras med den kolonn (4. 1. 1) som anv(cid:132)nds f(cid:148)r den h(cid:132)r metoden skall upp till 50 % av acetonitril- delen av den r(cid:148)rliga fasen (3. 6) ers(cid:132)ttas med metanol. Enligt den brittiska farmakop(cid:130)n uppvisar amproliuml(cid:148)sningens spektrum (c = 0,02 mol/l) i saltsyra (c = 0,1 mol/l) maxima vid 246 och 262 nm. Absorbansen skall vara 0,84 vid 246 nm och 0,80 vid 262 nm. Extraktet m(cid:134)ste alltid sp(cid:132)das med den r(cid:148)rliga fasen, i annat fall kan retentionstiden f(cid:148)r amprolium- toppen f(cid:148)r(cid:132)ndras v(cid:132)sentligt p(cid:134) grund av f(cid:148)r(cid:132)ndringar av jonstyrkan. DEL B BEST(cid:142)MNING AV DICLAZURIL (+)-4-klorfenyl-[2,6-dikloro-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-yl)fenyl]acetonitril 1. Syfte och r(cid:132)ckvidd Metoden avser best(cid:132)mning av diclazuril i djurfoder och f(cid:148)rblandningar. Detektionsgr(cid:132)nsen (cid:132)r 0,1 mg/kg och den undre gr(cid:132)nsen f(cid:148)r best(cid:132)mningen 0,5 mg/kg. 2. Princip Efter tillsats av den interna standarden skall provet extraheras med surgjord metanol. F(cid:148)r djurfoder skall en andel av extraktet renas med en C18-patron f(cid:148)r extraktion av den fasta fasen. Diclazuril elueras fr(cid:134)n patronen med en blandning av surgjord metanol och vatten. Efter indunstning l(cid:148)ses (cid:134)terstoden i DMF/vatten. F(cid:148)r indunstas och (cid:134)terstoden l(cid:148)sas i DMF/vatten. Diclazurilinneh(cid:134)llet best(cid:132)ms genom en reversed-phase v(cid:132)tskekromatografi (HPLC) med UV-detektor. f(cid:148)rblandningar skall extraktet 3. Reagens 3. 1 Vatten, HPLC-kvalitet. 3. 2 Ammoniumacetat 3. 3 Tetrabutylammoniumv(cid:132)tesulfat (TBHS) 3. 4 Acetonitril, HPLC-kvalitet 3. 5 Metanol, HPLC-kvalitet 3. 6 N,N-dimetylformamid (DMF) 3. 7 3. 8 Saltsyra, q20 =1,19 g/ml Standardsubstans: diclazuril 1,2,4-triazin-2-yl)-fenyl]-acetonitril, E771. II-24: ren (+)-4-klorfenyl-[2,6-dikloro-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dioxo- 3. 8. 1 Stamstandardl(cid:148)sning av diclazuril, 500 lg/ml. V(cid:132)g med en noggrannhet av 0,1 mg upp 25 mg av standardsubstansen diclazuril (3. 8) i en 50 ml m(cid:132)tkolv. L(cid:148)s i DMF (3. 6), fyll till m(cid:132)rket med DMF (3. 6) och blanda. Sl(cid:134) in kolven i aluminiumfolie eller anv(cid:132)nd en kolv av f(cid:132)rgat glas. F(cid:148)rvara i kylsk(cid:134)p. L(cid:148)sningen kan lagras i en m(cid:134)nad vid h(cid:148)gst 4 (cid:176)C. 6. 5. 1999 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning L 118/43 3. 8. 2 Standardl(cid:148)sning av diclazuril, 50 lg/ml. S(cid:132)tt 5,00 ml av lagerstandardl(cid:148)sningen (3. 8. 1) till en 50 ml m(cid:132)tkolv, fyll till m(cid:132)rket med DMF (3. 6) och blanda. Sl(cid:134) in kolven i aluminiumfolie eller anv(cid:132)nd en kolv av f(cid:132)rgat glas. F(cid:148)rvara i kylsk(cid:134)p. L(cid:148)sningen kan lagras i en m(cid:134)nad vid h(cid:148)gst 4 (cid:176)C. 3. 9 Intern standardsubstans: 2,6-dikloro-a-(4-klorofenyl)-4-(4,5 dihydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazine-2-(3H)- yl)-a-metylbenzen-acetonitril 3. 9. 1 Intern stamstandardl(cid:148)sning, 500 lg/ml. V(cid:132)g med en noggrannhet av 0,1 mg upp 25 mg av den interna standardsubstansen (3. 9) i en 50 ml m(cid:132)tkolv. L(cid:148)s i DMF (3. 6), fyll till m(cid:132)rket med DMF (3. 6) och blanda. Sl(cid:134) in kolven i aluminiumfolie eller anv(cid:132)nd en kolv av f(cid:132)rgat glas. F(cid:148)rvara i kylsk(cid:134)p. L(cid:148)sningen kan lagras i en m(cid:134)nad vid h(cid:148)gst 4 (cid:176)C. 3. 9. 2 Intern standardl(cid:148)sning, 50 lg/ml. S(cid:132)tt 5,00 ml av den interna standardl(cid:148)sningen (3. 9. 1) till en 50 ml m(cid:132)tkolv, fyll till m(cid:132)rket med DMF (3. 6) och blanda. Sl(cid:134) in kolven i aluminiumfolie eller anv(cid:132)nd en kolv av f(cid:132)rgat glas. F(cid:148)rvara i kylsk(cid:134)p. L(cid:148)sningen kan lagras i en m(cid:134)nad vid h(cid:148)gst 4 (cid:176)C. 3. 9. 3 Intern standardl(cid:148)sning f(cid:148)r f(cid:148)rblandningar, p/1000 mg/ml (p = nominell diclazurilhalt i f(cid:148)rbland- ningen i mg/kg) V(cid:132)g med en noggrannhet av 0,1 mg upp p/10 mg av den interna standardsubstansen i en 100 ml m(cid:132)tkolv, l(cid:148)s i DMF (3. 6) i ett ultraljudsbad (4. 6), fyll till m(cid:132)rket med DMF och blanda. Sl(cid:134) in kolven i aluminiumfolie eller anv(cid:132)nd en kolv av f(cid:132)rgat glas. F(cid:148)rvara i kylsk(cid:134)p. L(cid:148)sningen kan lagras i en m(cid:134)nad vid h(cid:148)gst 4 (cid:176)C. 3. 10 Kalibreringsl(cid:148)sning, 2 lg/ml. Pipettera 2,00 ml diclazurilstandardl(cid:148)sning (3. 8. 2) och 2,00 ml intern standardl(cid:148)sning (3. 9. 2) till en 50 ml m(cid:132)tkolv. Tills(cid:132)tt 16 ml DMF (3. 6), fyll till m(cid:132)rket med vatten och blanda. Denna l(cid:148)sning m(cid:134)ste beredas p(cid:134) nytt f(cid:148)re varje anv(cid:132)ndning. 3. 11 C18 extraktionspatron f(cid:148)r den fasta fasen, t. ex. Bond Elut, storlek: 1 cm3, sorbent: 100 mg. 3. 12 Extraktionsl(cid:148)sning: surgjord metanol. Pipettera 5,0 ml saltsyra (3. 7) till 1000 ml metanol (3. 5) och blanda. 3. 13 R(cid:148)rlig fas f(cid:148)r HPLC: EluentA: ammoniumacetat – tetrabutylammoniumv(cid:132)tesulfatl(cid:148)sning. 3. 13. 1 L(cid:148)s 5 g ammoniumacetat (3. 2) och 3,4 g TBHS (3. 3) i 1000 ml vatten (3. 1) och blanda. 3. 13. 2 Eluent B: acetonitril (3. 4) 3. 13. 3 Eluent C: metanol (3. 5) 4. 4. 1 4. 2 Utrustning Mekanisk skakapparat Utrustning f(cid:148)r tertiary-gradient-HPLC 4. 2. 1 Kolonn f(cid:148)r v(cid:132)tskekromatografi, 100 mm · 4,6 mm, Hypersil ODS, 3 lm packning, eller motsvarande 4. 2. 2 Variabel UV-detektor eller diodarraydetektor. 4. 3 4. 4 Vakuumrotationsindustare Membranfilter, 0,45 lm. L 118/44 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning 6. 5. 1999 4. 5 4. 6 Vakuumgrenr(cid:148)r Ultraljudsbad 5. Utf(cid:148)rande 5. 1 Allm(cid:132)nt 5. 1. 1 Blindprov Ett blindprov b(cid:148)r analyseras f(cid:148)r kontroll av att varken diclazuril eller andra st(cid:148)rande (cid:132)mnen (cid:132)r n(cid:132)rvarande. Blindprovet b(cid:148)r vara av samma typ som provet och varken diclazuril eller andra st(cid:148)rande (cid:132)mnen skall kunna p(cid:134)visas i det. 5. 1. 2 Utbytesf(cid:148)rs(cid:148)k Ett utbytesf(cid:148)rs(cid:148)k b(cid:148)r utf(cid:148)ras genom en analys av blindprovet tillsatt (”spikat”) med en m(cid:132)ngd diclazuril som motsvarar den i provet. F(cid:148)r spikning p(cid:134) niv(cid:134)n 1 mg/kg, s(cid:132)tt 0,1 ml av stamstandardl(cid:148)sningen (3. 8. 1) till 50 g av ett blindprov, blanda noga och l(cid:134)t st(cid:134) i 10 minuter. Blanda sedan flera g(cid:134)nger f(cid:148)re vidare hantering. Om ett blindprov av samma typ som provet inte finns att tillg(cid:134) (se 5. 1. 1) kan ett utbytestest g(cid:148)ras med standardtillsatsmetoden. Denna inneb(cid:132)r att det prov som skall analyseras spikas med samma m(cid:132)ngd diclazuril som finns i provet. Detta prov analyseras tillsammans med det ”ospikade” provet och utbytet kan ber(cid:132)knas genom subtraktion. 5. 2 Extraktion 5. 2. 1 Djurfoder V(cid:132)g med 0,01 g noggrannhet upp ungef(cid:132)r 50 g prov. (cid:153)verf(cid:148)r detta till en 500 ml E-kolv, tills(cid:132)tt 1,00 ml intern standardl(cid:148)sning (3. 9. 2) och 200 ml extraktionsl(cid:148)sning (3. 12) samt tillslut kolven. Skaka blandningen i skakapparaten (4. 1) (cid:148)ver natt. L(cid:134)t st(cid:134) i 10 minuter. (cid:153)verf(cid:148)r 20 ml av supernatanten till ett l(cid:132)mpligt glask(cid:132)rl och sp(cid:132)d med 20 ml vatten. (cid:153)verf(cid:148)r denna l(cid:148)sning till en extraktionspatron (3. 11) och l(cid:134)t den g(cid:134) igenom patronen genom att l(cid:132)gga p(cid:134) vakuum (4. 5). Tv(cid:132)tta patronen med 25 ml av en blandning av extraktionsl(cid:148)sning (3. 12) och vatten, 65 + 35 (V + V). Kasta de uppsamlade fraktionerna och eluera (cid:132)mnena med 25 ml av en blandning av extraktionsl(cid:148)sning (3. 12) och vatten, 80 + 20 (V + V). Indunsta med hj(cid:132)lp av en rotationsindunstare (4. 3) denna fraktion vid 60 C tills den precis har torkat. L(cid:148)s (cid:134)terstoden i 1,0 ml DMF (3. 6), tills(cid:132)tt 1,5 ml vatten och blanda. Filtrera genom ett membranfilter (4. 4). G(cid:134) vidare till HPLC-best(cid:132)mningen (5. 3). 5. 2. 2 F(cid:148)rblandningar V(cid:132)g med 0,001 g noggrannhet upp ungef(cid:132)r 1 g prov. (cid:153)verf(cid:148)r detta till en 500 ml E-kolv, tills(cid:132)tt 1,00 ml intern standardl(cid:148)sning (3. 9. 3) och 200 ml extraktionsl(cid:148)sning (3. 12) samt tillslut kolven. Skaka blandningen i skakapparaten (4. 1) (cid:148)ver natt. L(cid:134)t st(cid:134) i 10 minuter. (cid:153)verf(cid:148)r 10 000/p ml (p = den nominella halten av diclazuril i f(cid:148)rblandningen i mg/kg) av supernatanten till en rundkolv av l(cid:132)mplig storlek. Indunsta med en rotationsindunstare (4. 3) under minskat tryck vid 60 (cid:176)C tills (cid:134)terstoden precis har torkat. L(cid:148)s (cid:134)terstoden i 10,0 ml DMF (3. 6), tills(cid:132)tt 15,0 ml vatten (3. 1) och blanda. G(cid:134) vidare till HPLC-best(cid:132)mningen (5. 3). 5. 3 HPLC-best(cid:132)mning 5. 3. 1 Parametrar F(cid:148)ljande villkor anges som v(cid:132)gledning; andra f(cid:148)ruts(cid:132)ttningar kan v(cid:132)ljas om de ger motsvarande resultat. (cid:190) V(cid:132)tskekromatografikolonn (4. 2. 1): 100 mm · 4,6 mm, Hypersil ODS, 3 lm packning, eller motsva- rande (cid:190) R(cid:148)rlig fas: Eluent A (3. 13. 1): Vattenl(cid:148)sning av och tetrabutylammoniumv(cid:132)tesulfat ammoniumacetat Eluent B (3. 13. 2): acetonitril Eluent C (3. 13. 3): metanol 6. 5. 1999 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning L 118/45 (cid:190) Elueringss(cid:132)tt: (cid:190) linj(cid:132)r gradient (cid:190) utg(cid:134)ngsf(cid:148)rh(cid:134)llanden: A+B+C = 60+20+20 (V+V+V) (cid:190) efter 10 minuters gradienteluering under 30 minuter till: A+B+C = 45+20+35 (V+V+V) Sk(cid:148)lj med B i 10 min. (cid:190) Fl(cid:148)de: 1,5–2 ml/min (cid:190) Injektionsvolym: (cid:190) Detektionsv(cid:134)gl(cid:132)ngd: 20 ll 280 nm Kontrollera det kromatografiska systemets stabilitet genom att flera g(cid:134)nger injicera kalibreringsl(cid:148)s- ningen (3. 10) som inneh(cid:134)ller 2 lg/ml till dess konstanta toppar och retentionstider uppn(cid:134)s. 5. 3. 2 Kalibreringsl(cid:148)sning Injicera 20 ll av kalibreringsl(cid:148)sningen (3. 10) flera g(cid:134)nger och best(cid:132)m medeltopph(cid:148)jden (arean) f(cid:148)r diclazuril och den interna standarden. 5. 3. 3 Provl(cid:148)sning Injicera 20 ll av provl(cid:148)sningen (5. 2. 1 eller 5. 2. 2) flera g(cid:134)nger och best(cid:132)m medeltopph(cid:148)jden (arean) f(cid:148)r diclazuril och den interna standarden. 6. 6. 1 Resultatber(cid:132)kning Djurfoder Diclazurilinneh(cid:134)llet w i mg/kg i provet f(cid:134)s genom f(cid:148)ljande formel: w = hd,s. hi,c hi,s. hd,c. bd,c. 10V m [mg/kg] d(cid:132)r h d,s = topph(cid:148)jd (area) f(cid:148)r diclazuril i provl(cid:148)sningen (5. 2. 1) h = topph(cid:148)jd (area) f(cid:148)r den interna standarden i provl(cid:148)sningen (5. 2. 1) i,s h d,c h i,c = topph(cid:148)jd (area) f(cid:148)r diclazuril i kalibreringsl(cid:148)sningen (3. 10) = topph(cid:148)jd (area) f(cid:148)r den interna standarden i kalibreringsl(cid:148)sningen (3. 10) b d,c = diclazurilkoncentrationen i kalibreringsl(cid:148)sningen i lg/ml (3. 10) m = provportionens massa i g V = provextraktets volym enligt 5. 2. 1 (dvs. 2,5 ml) 6. 2 F(cid:148)rblandningar Diclazurilinneh(cid:134)llet w i mg/kg i provet f(cid:134)s genom f(cid:148)ljande formel: w = hd,s. hi,c. h h. bd,c. 0,02. V. p m [mg/kg] i,s d,c d(cid:132)r hd,c = topph(cid:148)jd (area) f(cid:148)r diclazuril i kalibreringsl(cid:148)sningen (3. 10) hi,c = topph(cid:148)jd (area) f(cid:148)r den interna standarden i kalibreringsl(cid:148)sningen (3. 10) hd,s = topph(cid:148)jd (area) f(cid:148)r diclazuril i provl(cid:148)sningen (5. 2. 2) hi,s = topph(cid:148)jd (area) f(cid:148)r den interna standarden i provl(cid:148)sningen (5. 2. 2) bd,c = diclazurilkoncentrationen i kalibreringsl(cid:148)sningen i lg/ml (3. 10) m = provportionens massa i g V = provextraktets volym enligt 5. 2. 2 (dvs. 25 ml) p = nominell diclazurilhalt i f(cid:148)rblandningen i mg/kg L 118/46 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning 6. 5. 1999 7. Utv(cid:132)rdering av resultaten 7. 1 Identitet Analytens identitet kan bekr(cid:132)ftas genom co-kromatografi eller genom anv(cid:132)ndning av en diodarrayde- tektor med vars hj(cid:132)lp spektret f(cid:148)r provextraktet (5. 2. 1 eller 5. 2. 2) och kalibreringsl(cid:148)sningen (3. 10) j(cid:132)mf(cid:148)rs. 7. 1. 1 Co-kromatografi Ett provextrakt (5. 2. 1 eller 5. 2. 2) spikas genom tillsats av en l(cid:132)mplig m(cid:132)ngd kalibreringsl(cid:148)sning (3. 10). M(cid:132)ngden tillsatt diclazuril b(cid:148)r vara densamma som den m(cid:132)ngd diclazuril som hittats i provextraktet. Endast niv(cid:134)n p(cid:134) diclazuriltoppen b(cid:148)r f(cid:148)rh(cid:148)jas efter beaktande av b(cid:134)de den tillsatta m(cid:132)ngden och sp(cid:132)dningen av extraktet. Toppens bredd m(cid:134)ste p(cid:134) mitten ligga inom 5 10 % av den ursprungliga bredden p(cid:134) diclazuriltoppen i det icke spikade provextraktet. 7. 1. 2 Diodarraydetektion Resultaten utv(cid:132)rderas enligt f(cid:148)ljande kriterier: a) V(cid:134)gl(cid:132)ngden f(cid:148)r provets och standardspektrets maximala absorption, noterad vid kromatogrammets toppkurva, skall inte skilja sig inom detektorns uppl(cid:148)sning. Vid diodarraydetektion ligger uppl(cid:148)s- ningen vanligen inom 5 2 nm. b) Mellan 230 och 320 nm skall det provspektrum och det standardspektrum som noterats vid kromatogrammets toppkurva inte skilja sig (cid:134)t f(cid:148)r de delar av spektret som ligger inom 10–100 % av den relativa absorbansen. Detta kriterium (cid:132)r uppfyllt om samma maxima (cid:132)r n(cid:132)rvarande och avvikelsen mellan de b(cid:134)da spektren inte vid n(cid:134)gon m(cid:132)tpunkt (cid:148)verskrider 15 % av standardana- lytens absorbans. c) Mellan 230 och 320 nm skall den upp(cid:134)tg(cid:134)ende linjen, toppen och den ned(cid:134)tg(cid:134)ende linjen fr(cid:134)n samma provextrakt inte skilja sig fr(cid:134)n varandra i de delar av spektret som ligger inom 10–100 % av den relativa absorbansen. Detta kriterium (cid:132)r uppfyllt om samma maxima observeras och avvikelsen mellan de b(cid:134)da spektren inte vid n(cid:134)gon m(cid:132)tpunkt (cid:148)verskrider 15 % av standardana- lytens absorbans Om n(cid:134)got av dessa kriterier inte (cid:132)r uppfyllt har n(cid:132)rvaro av analysmaterialet inte p(cid:134)visats. 7. 2 Repeterbarhet Skillnaden mellan resultaten av tv(cid:134) parallella best(cid:132)mningar som utf(cid:148)rs p(cid:134) samma prov f(cid:134)r inte (cid:148)verstiga (cid:190) 30 % i relation till det h(cid:148)gre v(cid:132)rdet f(cid:148)r diclazurilinneh(cid:134)ll mellan 0,5 och 2,5 mg/kg (cid:190) 0,75 mg/kg f(cid:148)r diclazurilinneh(cid:134)ll mellan 2,5 och 5 mg/kg (cid:190) 15 % i relation till det h(cid:148)gre v(cid:132)rdet f(cid:148)r diclazurilinneh(cid:134)ll f(cid:148)r (cid:148)ver 5 mg/kg 7. 3 Utbyte I fr(cid:134)ga om spikade (rena) blindprov skall utbytet vara minst 80 %. 8. Resultat av samordnad unders(cid:148)kning En samordnad unders(cid:148)kning genomf(cid:148)rdes d(cid:132)r fem prover analyserades av 11 laboratorier. Proverna bestod av tv(cid:134) f(cid:148)rblandningar, en blandad med en organisk matris (O 100) och den andra med en oorganisk matris (A 100). Den teoretiska halten (cid:132)r 100 mg diclazuril per kg. De tre foderblandning- arna f(cid:148)r fj(cid:132)derf(cid:132) kom fr(cid:134)n tre olika f(cid:148)retag (NL) (L1/Z1/K1). Den teoretiska halten (cid:132)r 1 mg diclazuril per kg. Laboratorierna instruerades att av varje prov analysera ett enda prov eller ett dubbelprov. (N(cid:132)rmare upplysningar om den samordnade unders(cid:148)kningen (cid:134)terfinns i Journal of AOAC Interna- tional, volym 77, nr 6 1994, s. 1359–1361). Resultaten framg(cid:134)r av f(cid:148)ljande tabell: 6. 5. 1999 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning L 118/47 L n Genomsnitt (mg/kg) S r CV S R CV (%) r (mg/kg) (%) R Prov 1 A 100 11 19 100,8 5,88 5,83 7,59 7,53 Prov 2 O 100 11 18 103,5 7,64 7,38 7,64 7,38 Nominell halt (mg/kg) 100 100 L: antal laboratorier Prov 3 L 1 11 19 0,89 0,15 17,32 0,17 18,61 1 Prov 4 Z 1 11 19 1,15 0,02 1,92 0,11 9,67 1 Prov 5 K 1 6 12 0,89 0,03 3,34 0,12 13,65 1 n: S r: : CVr : SR CVR antal individuella v(cid:132)rden repeterbarhetens standardavvikelse repeterbarhetens variationskoefficient reproducerbarhetens standardavvikelse : reproducerbarhetens variationskoefficient 9. Anm(cid:132)rkningar Diclazurilsvaret m(cid:134)ste tidigare ha visats vara linj(cid:132)rt i det koncentrationsintervall m(cid:132)tningarna g(cid:132)ller. DEL C BEST(cid:142)MNING AV KARBADOX Metyl-3-(kinoxalin-2-ylmetylen)karbazat-1,4-dioxid 1. Syfte och r(cid:132)ckvidd Metoden avser best(cid:132)mning av karbadox i djurfoder, f(cid:148)rblandningar och beredningar. Detektions- gr(cid:132)nsen (cid:132)r 1 mg/kg och den undre gr(cid:132)nsen f(cid:148)r best(cid:132)mningen 10 mg/kg. 2. Princip Provet j(cid:132)mviktas med vatten och extraheras med metanol-acetonitril. F(cid:148)r djurfoder renas en del av det filtrerade extraktet p(cid:134) en aluminiumoxidkolonn. F(cid:148)r f(cid:148)rblandningar och foderberedningar sp(cid:132)ds en del av det filtrerade extraktet till l(cid:132)mplig koncentration med vatten, metanol och acetonitril. Karbadoxin- inneh(cid:134)llet best(cid:132)ms genom en reversed-phase v(cid:132)tskekromatografs (HPLC) och UV-detektor. 3. 3. 1 3. 2 3. 3 3. 4 3. 5 Reagens Metanol Acetonitril, HPLC-kvalitet (cid:142)ttiksyra w = 100 % Aluminiumoxid: neutral, aktivitetsgrad I Metanol-acetonitril 1 + 1 (v + v) Blanda 500 ml metanol (3. 1) med 500 ml acetonitril (3. 2). 3. 6 (cid:142)ttiksyra, a = 10 % Sp(cid:132)d 10 ml (cid:132)ttiksyra (3. 3) till 100 ml med vatten. 3. 7 Natriumacetat, CH3 COONa L 118/48 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning 6. 5. 1999 3. 8 3. 9 Vatten, HPLC-kvalitet Acetatbuffertl(cid:148)sning, c = 0,01 mol/l, pH = 6,0 L(cid:148)s 0,82 g natriumacetat (3. 7) i 700 ml vatten (3. 8) och justera pH till 6,0 med (cid:132)ttiksyra (3. 6). (cid:153)verf(cid:148)r till en 1000 ml m(cid:132)tkolv, fyll p(cid:134) vatten (3. 8) till m(cid:132)rket och blanda. 3. 10 R(cid:148)rlig fas f(cid:148)r HPLC Blanda 825 ml acetatbuffert (3. 9) med 175 ml acetonitril (3. 2). Filtrera genom 0,22 lm filter (4. 5) och avlufta l(cid:148)sningen (t. ex. i ultraljudsbad i 10 minuter). 3. 11 Standardsubstans Ren karbadox: Metyl 3-(2-quinoxalinylmetylen)karbazat N1,N4-dioxid, E 850 3. 11. 1 Lagerstaml(cid:148)sning av karbadox, 100 lg/ml (se Observera 5. Utf(cid:148)rande): V(cid:132)g med en noggrannhet av 0,1 mg upp 25 mg av standardsubstansen karbadox (3. 11) i en 250 ml m(cid:132)tkolv. L(cid:148)s i metanol-acetonitril (3. 5) med hj(cid:132)lp av ultraljudsbad (4. 7). L(cid:134)t l(cid:148)sningen anta rumstempe- ratur efter ultraljudsbehandling, fyll upp till m(cid:132)rket med metanol-acetonitril (3. 5) och blanda. Sl(cid:134) in kolven i aluminiumfolie eller anv(cid:132)nd en kolv av f(cid:132)rgat glas. F(cid:148)rvara i kylsk(cid:134)p. L(cid:148)sningen kan lagras i en m(cid:134)nad vid h(cid:148)gst 4 (cid:176)C. 3. 11. 2 Kalibreringsl(cid:148)sningar (cid:153)verf(cid:148)r 2,0, 5,0, 10,0 och 20,0 ml av arbetsstandardl(cid:148)sningen (3. 11. 1) till ett antal 100 ml m(cid:132)tkolvar. Tills(cid:132)tt 30 ml vatten, fyll till m(cid:132)rket med metanolacetonitril (3. 5) och blanda. Sl(cid:134) in m(cid:132)tkolven i aluminiumfolie. Dessa l(cid:148)sningar motsvarar 2,0, 5,0, 10,0 respektive 20,0 lg/ml karbadox. Kalibreringsl(cid:148)sningarna m(cid:134)ste beredas p(cid:134) nytt f(cid:148)re varje anv(cid:132)ndning. Observera: F(cid:148)r best(cid:132)mning av karbadox i djurfoder som inneh(cid:134)ller mindre (cid:132)n 10 mg/kg m(cid:134)ste kalibreringsl(cid:148)sningar med koncentrationer under 2,0 lg/ml beredas. 3. 12 Vatten-[metanol-acetonitril]-blandning (3. 5), 300+700 ( v+v). Blanda 300 ml vatten med 700 ml av metanol-acetonitril-blandningen (3. 5). 4. 4. 1 4. 2 4. 3 Utrustning Skakapparat eller magnetomr(cid:148)rare. Glasfiberfiltrerpapper (Whatman GF/A eller motsvarande) Glaskolonn (l(cid:132)ngd 300–400 mm, intern diameter ca 10 mm) av matterat glas och med avtapp- ningskran. Observera: en glaskolonn med st(cid:132)ngningsventil eller med avsmalnande (cid:132)nde kan ocks(cid:134) anv(cid:132)ndas. I s(cid:134) fall skall en tuss glassull tryckas ned i nedre (cid:132)nden med en glasstav. 4. 4 HPLC-utrustning med injektionssystem avpassat f(cid:148)r injektionsvolymer p(cid:134) 20 ll 4. 4. 1 V(cid:132)tskekromatografikolonn: 300 mm · 4 mm, C18, 10 lm packning, eller motsvarande 4. 4. 2 Variabel UV-detektor eller diodarraydetektor f(cid:148)r intervallet 225–400 nm 4. 5 4. 6 4. 7 Membranfilter, 0,22 lm. Membranfilter, 0,45 lm. Ultraljudsbad 5. Utf(cid:148)rande Observera: karbadox (cid:132)r ljusk(cid:132)nsligt. Utf(cid:148)r alla moment i d(cid:132)mpad belysning eller anv(cid:132)nd f(cid:132)rgade glask(cid:132)rl eller glask(cid:132)rl inslagna i aluminiumfolie. 5. 1 Allm(cid:132)nt 6. 5. 1999 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning L 118/49 5. 1. 1 Blindprov F(cid:148)r utbytesf(cid:148)rs(cid:148)ket (5. 1. 2) b(cid:148)r ett blindprov analyseras f(cid:148)r kontroll av att varken karbadox eller andra st(cid:148)rande (cid:132)mnen (cid:132)r n(cid:132)rvarande. Blindprovet b(cid:148)r vara av samma typ som provet och varken karbadox eller andra st(cid:148)rande (cid:132)mnen skall kunna p(cid:134)visas i det. 5. 1. 2 Utbytesf(cid:148)rs(cid:148)k Ett utbytesf(cid:148)rs(cid:148)k b(cid:148)r utf(cid:148)ras genom en analys av blindprovet tillsatt (”spikat”) med en m(cid:132)ngd karbadox som motsvarar den i provet. F(cid:148)r spikning p(cid:134) niv(cid:134)n 50 mg/kg, s(cid:132)tt 5,0 ml av stamstandardl(cid:148)sningen (3. 11. 1) till en 200 ml E-kolv. Indunsta l(cid:148)sningen till ca 0,5 ml i ett kv(cid:132)vgasfl(cid:148)de. Tills(cid:132)tt 10 g av blindprovet, blanda ordentligt och l(cid:134)t st(cid:134) i tio minuter. R(cid:148)r om igen flera g(cid:134)nger f(cid:148)re extraktionen (5. 2). Om ett blindprov av samma typ som provet inte finns att tillg(cid:134) (se 5. 1. 1) kan ett utbytestest g(cid:148)ras med standardtillsatsmetoden. Denna inneb(cid:132)r att det prov som skall analyseras spikas med samma m(cid:132)ngd karbadox som finns i provet. Detta prov analyseras tillsammans med det ”ospikade” provet och utbytet kan ber(cid:132)knas genom subtraktion. 5. 2 Extraktion 5. 2. 1 Djurfoder V(cid:132)g med en noggrannhet av 0,01 g upp 10 g av provet och (cid:148)verf(cid:148)r till en 200 ml E-kolv. Tills(cid:132)tt 15,0 ml vatten, blanda och l(cid:134)t j(cid:132)mvikta i 5 min. Tills(cid:132)tt 35,0 ml metanol-acetonitril-blandning (3. 5), tillslut kolven och placera den i skakapparat eller p(cid:134) magnetomr(cid:148)rare i 30 minuter (4. 1) Filtrera l(cid:148)sningen genom glasfiberfiltrerpapper (4. 2). Spara denna l(cid:148)sning till reningssteget (5. 3). 5. 2. 2 F(cid:148)rblandningar (0,1–2,0 %) V(cid:132)g med en noggrannhet av 0,001 g upp 1 g omalt prov och (cid:148)verf(cid:148)r till en 200 ml E-kolv. Tills(cid:132)tt 15,0 ml vatten, blanda och l(cid:134)t j(cid:132)mvikta i 5 minuter. Tills(cid:132)tt 35,0 ml metanol-acetonitril-blandning (3. 5), tillslut kolven och placera den i skakapparat eller p(cid:134) magnetomr(cid:148)rare i 30 minuter (4. 1) Filtrera l(cid:148)sningen genom glasfiberfiltrerpapper (4. 2). Pipettera upp en delm(cid:132)ngd filtrat i en 50 ml m(cid:132)tkolv. Tills(cid:132)tt 15,0 ml vatten, fyll till m(cid:132)rket med metanol-acetonitril (3. 5) och blanda. Karbadoxkoncentra- tionen i slutl(cid:148)sningen skall vara ungef(cid:132)r 10 lg/ml. En del av l(cid:148)sningen filtreras genom ett 0,45 lm membranfilter. G(cid:134) vidare till HPLC-best(cid:132)mningen (5. 4). 5. 2. 3 Foderberedningar (; 2 %) V(cid:132)g med en noggrannhet av 0,001 g upp 0,2 g omalt prov och (cid:148)verf(cid:148)r till en 250 ml E-kolv. Tills(cid:132)tt 45,0 ml vatten, blanda och l(cid:134)t j(cid:132)mvikta i 5 minuter. Tills(cid:132)tt 105,0 ml metanol-acetonitril-blandning (3. 5), tillslut kolven och homogenisera. Ultraljudsbehandla (4. 7) provet i 15 minuter och placera det i skakapparat eller p(cid:134) magnetomr(cid:148)rare i 15 minuter (4. 1). Filtrera l(cid:148)sningen genom glasfiberfiltrerpapper (4. 2). Sp(cid:132)d en delm(cid:132)ngd av filtratet med vatten-metanol-acetonitril-blandningen (3. 12) till en slutlig karba- doxkoncentration p(cid:134) 10–15 lg/ml (f(cid:148)r en 10 % l(cid:148)sning blir sp(cid:132)dningsfaktorn 10). En del av l(cid:148)sningen filtreras genom ett 0,45 lm membranfilter. G(cid:134) vidare till HPLC-best(cid:132)mningen (5. 4). 5. 3 Rening 5. 3. 1 Preparation av aluminiumoxidkolonnen V(cid:132)g upp 4 g aluminiumoxid (3. 4) och (cid:148)verf(cid:148)r det till glaskolonnen (4. 3). 5. 3. 2 Rening av prov Tills(cid:132)tt 15 ml av det filtrerade extraktet (5. 2. 1) till aluminiumoxidkolonnen och h(cid:132)ll bort de f(cid:148)rsta 2 ml eluat. Samla upp n(cid:132)sta 5 ml och filtrera en del genom ett 0,45 lm filter (4. 6). G(cid:134) vidare till HPLC-best(cid:132)mningen (5. 4). 5. 4 HPLC-best(cid:132)mning L 118/50 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning 6. 5. 1999 5. 4. 1 Parametrar F(cid:148)ljande villkor anges som v(cid:132)gledning; andra f(cid:148)ruts(cid:132)ttningar kan v(cid:132)ljas om de ger motsvarande resultat. V(cid:132)tskekromatografikolonn (4. 1. 1): 300 mm · 4 mm, C18, 10 lm packning eller motsvarande R(cid:148)rlig fas (3. 10): Fl(cid:148)de: Detektionsv(cid:134)gl(cid:132)ngd: Injektionsvolym: En blandning av acetatbuffert (3. 9) och acetonitril (3. 2), 825+175 (v+v) 1,5–2 ml/min 365 nm 20 ll Kontrollera det kromatografiska systemets stabilitet genom att flera g(cid:134)nger injicera kalibreringsl(cid:148)s- ningen (3. 11. 2) som inneh(cid:134)ller 5,0 lg/ml tills konstanta toppar och retentionstider uppn(cid:134)s. 5. 4. 2 Kalibreringskurva Injicera varje kalibreringsl(cid:148)sning (3. 11. 2) flera g(cid:134)nger och best(cid:132)m medeltoppareorna f(cid:148)r varje koncen- tration. Konstruera en kalibreringskurva med kalibreringsl(cid:148)sningarnas medeltoppareor l(cid:132)ngs y-axeln och de motsvarande koncentrationerna i lg/ml l(cid:132)ngs x-axeln. 5. 4. 3 Provl(cid:148)sning Injicera provextraktet [(5. 3. 2) f(cid:148)r djurfoder, (5. 2. 2) f(cid:148)r f(cid:148)rblandningar och (5. 2. 3) f(cid:148)r foderberedningars flera g(cid:134)nger och best(cid:132)m medeltoppareorna f(cid:148)r karbadoxtopparna. 6. Resultatber(cid:132)kning Anv(cid:132)nd medeltopparean f(cid:148)r provl(cid:148)sningens karbadoxtoppar f(cid:148)r att best(cid:132)mma provl(cid:148)sningens koncen- tration i lg/ml med hj(cid:132)lp av kalibreringskurvan (5. 4. 2). 6. 1 Djurfoder Karbadoxinneh(cid:134)llet w (mg/kg) i provet f(cid:134)s genom f(cid:148)ljande formel: w = b · V1 m [mg/kg] d(cid:132)r b = karbadoxkoncentration i provl(cid:148)sningen (5. 3. 2) i lg/ml, V 1 = extraktionsvolymen i ml (dvs. 50) m = provportionens massa i g 6. 2 F(cid:148)rbl(cid:132)ndningar och foderberedningar Karbadoxinneh(cid:134)llet w (mg/kg) i provet f(cid:134)s genom f(cid:148)ljande formel: w = · f b · V 2 m [mg/kg] d(cid:132)r: b = Karbadoxkoncentration i provl(cid:148)sningen (5. 2. 2 eller 5. 2. 3) i lg/ml, V 2 = extraktionsvolymen i ml (dvs. 50 f(cid:148)r f(cid:148)rblandningar och 150 f(cid:148)r foderberedningar) f = utsp(cid:132)dningsfaktor enligt 5. 2. 2 (f(cid:148)rblandningar) eller 5. 2. 3 (foderberedningar) m = provportionens massa i g 6. 5. 1999 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning L 118/51 7. 7. 1 Utv(cid:132)rdering av resultaten Identitet Analytens identitet kan bekr(cid:132)ftas genom co-kromatografi eller genom anv(cid:132)ndning av en diodarray- detektor med vars hj(cid:132)lp spektret f(cid:148)r provextraktet och kalibreringsl(cid:148)sningen (3. 11. 2) inneh(cid:134)llande 10,0 lg/ml j(cid:132)mf(cid:148)rs. 7. 1. 1 Co-kromatografi Ett provextrakt spikas genom tillsats av en l(cid:132)mplig m(cid:132)ngd kalibreringsl(cid:148)sning (3. 11. 2). M(cid:132)ngden tillsatt karbadox b(cid:148)r vara densamma som den m(cid:132)ngd som hittats i provextraktet. Endast niv(cid:134)n p(cid:134) karbadoxtoppen b(cid:148)r f(cid:148)rh(cid:148)jas efter beaktande av b(cid:134)de den tillsatta m(cid:132)ngden och sp(cid:132)dningen av extraktet. Toppens bredd m(cid:134)ste p(cid:134) mitten ligga inom 10 % av den ursprungliga bredden. 7. 1. 2 Diodarraydetektion Resultaten utv(cid:132)rderas enligt f(cid:148)ljande kriterier: a) V(cid:134)gl(cid:132)ngden f(cid:148)r provets och standardspektrets maximala absorption, noterad vid kromatogrammets toppkurva, skall inte skilja sig inom detektorns uppl(cid:148)sning. Vid diodarraydetektion ligger uppl(cid:148)s- ningen vanligen inom 5 2 nm. b) Mellan 225 och 400 nm skall det provspektrum och det standardspektrum som noterats vid kromatogrammets toppkurva inte skilja sig (cid:134)t f(cid:148)r de delar av spektret som ligger inom 10–100 % av den relativa absorbansen. Detta kriterium (cid:132)r uppfyllt om samma maxima (cid:132)r n(cid:132)rvarande och avvikelsen mellan de b(cid:134)da spektren inte vid n(cid:134)gon m(cid:132)tpunkt (cid:148)verskrider 15 % av standardana- lytens absorbans. c) Mellan 225 och 400 nm skall den upp(cid:134)tg(cid:134)ende linjen, toppen och den ned(cid:134)tg(cid:134)ende linjen fr(cid:134)n samma provextrakt inte skilja sig fr(cid:134)n varandra i de delar av spektret som ligger inom 10–100 % av den relativa absorbansen. Detta kriterium (cid:132)r uppfyllt om samma maxima observeras och avvikelsen mellan de b(cid:134)da spektren inte vid n(cid:134)gon m(cid:132)tpunkt (cid:148)verskrider 15 % av standardana- lytens absorbans. Om n(cid:134)got av dessa kriterier inte (cid:132)r uppfyllt har n(cid:132)rvaro av analysmaterialet inte p(cid:134)visats. 7. 2 Repeterbarhet Skillnaden mellan resultaten fr(cid:134)n tv(cid:134) parallella best(cid:132)mningar som utf(cid:148)rs p(cid:134) samma prov f(cid:134)r inte (cid:148)verskrida 15 % i relation till det h(cid:148)gre resultatet f(cid:148)r karbadoxinneh(cid:134)ll p(cid:134) (cid:148)ver 10 mg/kg. 7. 3 Utbyte I fr(cid:134)ga om spikade prov (blindprov) skall utbytet vara minst 90 %. 8. Resultat av samordnad unders(cid:148)kning En samordnad unders(cid:148)kning genomf(cid:148)rdes med 6 djurfoder, 4 f(cid:148)rblandningar och 3 foderberedningar som analyserades av 8 laboratorier. Dubbelprover analyserades f(cid:148)r varje prov. (N(cid:132)rmare uppgifter om denna samordnade unders(cid:148)kning (cid:134)terfinns i Journal of the AOAC, volym 71, 1988, s. 484–490). Resultaten (efter uteslutning av extremv(cid:132)rden) framg(cid:134)r av f(cid:148)ljande tabell: Tabell 1. Resultat av den samordnade studien av djurfoder L n Genomsnitt (mg/kg) S (mg/kg) r CV S R (%) r (mg/kg) CVR (%) Prov 1 Prov 2 Prov 3 Prov 4 Prov 5 Prov 6 8 15 50,0 2,90 5,8 3,92 7,8 8 14 47,6 2,69 5,6 4,13 8,7 8 15 48,2 1,38 2,9 2,23 4,6 8 15 49,7 1,55 3,1 2,58 5,2 8 15 46,9 1,52 3,2 2,26 4,8 8 15 49,7 2,12 4,3 2,44 4,9 Nominell halt (mg/kg) 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 L 118/52 SV Europeiska gemenskapernas officiella tidning 6. 5. 1999 Tabell 2. Resultat av den samordnade studien av f(cid:148)rblandningar och foderberedningar F(cid:148)rblandningar Foderberedningar A B C D 7 14 8,89 0,37 4,2 0,37 4,2 7 14 9,29 0,28 3,0 0,28 3,0 7 14 9,21 0,28 3,0 0,40 4,3 7 14 8,76 0,44 5,0 0,55 6,3 A 8 16 94,6 4,1 4,3 5,4 5,7 B 8 16 98,1 5,1 5,2 6,4 6,5 C 8 16 104 7,7 7,4 7,7 7,4 L n Genomsnitt (g/kg) S (g/kg) r CV (%) r SR (mg/kg) (%) CV R Nominell halt (g/kg) 10,0 10,0 10,0 10,0 100 100 100 L: n: S : r CVr: : SR CV R antal laboratorier antal individuella v(cid:132)rden repeterbarhetens standardavvikelse repeterbarhetens variationskoefficient reproducerbarhetens standardavvikelse : reproducerbarhetens variationskoefficient


title: 2000/141/EC: Administrative Commission of the European Communities on social security for migrant workers - Decision No 174 of 20 April 1999 concerning the interpretation of Article 22a of Regulation (EEC) No 1408/71

eurovoc_concepts:
EU national
health insurance
migrant worker
social security

formats: html pdf print

text: L 47/30 EN Official Journal of the European Communities 19. 2. 2000 COMMISSION ADMINISTRATIVE COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES ON SOCIAL SECURITY FOR MIGRANT WORKERS DECISION No 174 of 20 April 1999 concerning the interpretation of Article 22a of Regulation (EEC) No 1408/71 (2000/141/EC) THE ADMINISTRATIVE COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES ON SOCIAL SECURITY FOR MIGRANT WORKERS, Having regard to Article 81(a) of Council Regulation No 1408/71 of 14 June 1971 on the application of social security schemes to employed persons, to self-employed persons and to members of their families moving within the Community (1), under which it is responsible for dealing with all administrative questions and questions of interpretation arising from the provisions of Regulation (EEC) No 1408/71 and subsequent Regulations, Having regard to Council Regulation (EC) No 3095/95 (2) of 22 December 1995, introducing Article 22a and extending the coverage of Article 22(1)(a) and (c) to all nationals of Member States who are insured under the legislation of a Member State and to the members of their families residing with them, even if they are neither employed nor self-employed, Whereas, in order to facilitate temporary residence and access to treatment with the authorisation of the competent institution in European Union territory the benefit of Article 22(1)(a) and (c) has been extended to all insured persons, it is necessary to reach a common understanding as to the meaning of the term ‘insured’ and to the group of persons that is covered by Article 22a; Whereas the conditions for entitlement to benefits vary from one Member State to another and in certain cases benefits are provided under special legislation it is necessary to establish the limits of the coverage provided for by Article 22a; Acting in accordance with the conditions laid down in Article 80(3) of Regulation (EEC) No 1408/71, HAS DECIDED AS FOLLOWS: 1. As Article 22a applies to persons who are nationals of a Member State and insured under the legislation of a Member State and to the members of their families residing with them, the words ‘insured under the legislation of a Member State’ shall be understood as including any person who is a national of a Member State and entitled to sickness benefits in kind under the legislation of a Member State either by virtue of insurance on a voluntary, compulsory or an optional continued basis on other grounds than as an employed or self-employed person for one or more of the contingencies covered by the branches of social security dealt with in (EEC) No Regulation 1408/71. (1) OJ L 149, 5. 7. 1971, p. 2. Amended and updated by Council Regulation (EC) No 118/97 (OJ L 28, 30. 1. 1997, p. 1). (2) OJ L 335, 30. 12. 1995, p. 1. 19. 2. 2000 EN Official Journal of the European Communities L 47/31 2. Furthermore, it shall mean any person, who is a national of a Member State, covered by the legislation of a Member State that provides for sickness benefits in kind on other grounds than insurance of the abovementioned kind and excluding beneficiaries whose rights to sickness benefits in kind derive solely from social and medical assistance schemes or schemes for victims of war or its consequences. 3. This Decision shall be published in the Official Journal of the European Communities and apply from the twentieth day following its publication. The Chairman of the Administrative Commission Arno BOKELOH