title: Směrnice Komise 98/73/ES ze dne 18. září 1998, kterou se po dvacáté čtvrté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látekText s významem pro EHP.

eurovoc_concepts:
classification
dangerous substance
labelling
marketing standard
packaging

text: 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 139 31998L0073 16. 11. 1998 ÚŘEDNÍ VĚSTNÍK EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ L 305/1 SMĚRNICE KOMISE 98/73/ES ze dne 18. září 1998, kterou se po dvacáté čtvrté přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (Text s významem pro EHP) KOMISE EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ, PŘIJALA TUTO SMĚRNICI: s ohledem na Smlouvu o založení Evropského společenství, Článek 1 s ohledem na směrnici Rady 67/548/EHS ze dne 27. června 1967 o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifi- kace, balení a označování nebezpečných látek (1), naposledy pozměněnou směrnicí Komise 97/69/ES (2), a zejména na článek 28 uvedené směrnice, Směrnice 67/548/EHS se mění takto: 1. Příloha I se mění takto: vzhledem k tomu, že příloha I směrnice 67/548/EHS obsahuje seznam nebezpečných látek společně s podrobnými údaji o postu- pech klasifikace a označování jednotlivých látek; že vědecké a technické poznatky ukazují, že by měl být seznam nebezpeč- ných látek ve výše uvedené příloze přizpůsoben a doplněn; vzhledem k tomu, že v příloze V směrnice 67/548/EHS uvedeny metody stanovení fyzikálních a chemických vlastností, toxicity a ekotoxicity látek a přípravků; že je nezbytné přizpůsobit výše uvedenou přílohu technickému pokroku; a) odpovídající položky v příloze I směrnice 67/548/EHS se nahrazují položkami v příloze I této směrnice; b) položky v příloze II této směrnice se vkládají do přílohy I směrnice 67/548/EHS. 2. Příloha V se mění takto: a) část A přílohy V směrnice 67/548/EHS se doplňuje o texty v příloze III A, III B a III C této směrnice; b) část C přílohy V směrnice 67/548/EHS se doplňuje o texty v příloze III D této směrnice. vzhledem k tomu, že opatření této směrnice jsou v souladu se sta- noviskem Výboru pro přizpůsobení technickému pokroku směr- nic pro odstranění technických překážek obchodu na úseku nebezpečných látek a přípravků, Článek 2 (1) Úř. věst. 196, 16. 8. 1967, s. 1. (2) Úř. věst. L 343, 13. 12. 1997, s. 19. Členské státy uvedou v účinnost právní a správní předpisy nezbytné pro dosažení souladu s touto směrnicí nejpozději do 31. října 1999. Neprodleně o nich uvědomí Komisi. 140 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 Tyto předpisy přijaté členskými státy musí obsahovat odkaz na tuto směrnici nebomusí být takový odkaz učiněn při jejichúředním vyhlášení. Způsob odkazu si stanoví členské státy. Tato směrnice je určena členským státům. Článek 4 Článek 3 V Bruselu dne 18. září 1998. Tato směrnice vstupuje v platnost dvacátým dnem po vyhlášení v Úředním věstníku Evropských společenství. Za Komisi Ritt BJERREGAARD členka Komise ANEXO I — BILAG I — ANHANG I — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I — ANNEX I — ANNEXE I — ALLEGATO I — BIJLAGE I — ANEXO I — LIITE I — BILAGA I 142 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 143 144 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 145 146 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 147 148 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 149 150 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 151 152 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 153 154 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 155 156 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 157 158 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 159 160 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 161 162 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 163 164 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 165 166 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 167 168 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 169 170 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 171 172 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 173 174 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 175 176 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 177 178 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 179 180 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 181 182 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 183 184 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 185 186 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 187 188 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 189 190 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 191 192 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 193 194 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 195 196 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 197 198 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 199 200 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 201 202 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 203 204 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 205 206 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 ANEXO II — BILAG II — ANHANG II — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II — ANNEX II — ANNEXE II — ALLEGATO II — BIJLAGE II — ANEXO II — LIITE II — BILAGA II 208 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 209 210 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 211 212 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 213 214 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 215 216 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 217 218 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 219 220 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 221 222 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 223 224 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 225 226 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 227 228 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 229 230 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 231 232 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 233 234 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 235 236 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 237 238 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 239 240 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 241 242 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 243 244 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 245 246 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 247 248 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 249 250 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 251 252 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 253 254 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 255 256 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 257 258 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 259 260 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 261 262 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 263 264 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 265 266 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 267 268 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 269 270 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 271 272 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 273 274 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 275 276 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 277 278 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 PŘÍLOHA III A A. 18 POČETNĚ PRŮMĚRNÁ MOLEKULOVÁ HMOTNOST A DISTRIBUCE MOLEKULOVÉ HMOTNOSTI POLYMERŮ 1. METODA Tato gelově permeační chromatografická metoda je replikou metody OECD TG 118 (1996). Základní prin- cipy a další technické informace jsou uvedeny v odkaze (1). 1. 1 Úvod Vlastnosti polymerů jsou tak rozdílné, že není možné popsat jedinou metodu a přesně stanovit podmínky separace a hodnocení, které by pokryly všechny eventuality a specifika vyskytující se při separaci polymerů. Zejména pro složité polymerní systémy není gelově permeační chromatografie (GPC) vždy vhodná. Není-li GPC použitelná, může být molekulová hmotnost stanovena jinými metodami (viz příloha). V takových případech by měly být uvedeny veškeré podrobnosti a zdůvodnění použité metody. Popsaná metoda je založena na normě DIN 55672 (1). Podrobné informace o provádění experimentů a o hodnocení údajů lze nalézt v uvedené normě DIN. V případě, že jsou nezbytné úpravy experimentálních podmínek, musí být změny zdůvodněny. Mohou být použity jiné normy, jsou-li na ně uvedeny úplné odkazy. V popsané metodě jsou ke kalibraci použity vzorky polystyrenu o známé polydisperzitě a metoda může být upravena tak, aby byla vhodná pro určité polymery, např. ve vodě rozpustné polymery a poly- mery s dlouhými větvemi. 1. 2 Definice a jednotky Početně průměrná molekulová hmotnost Mn a hmotnostně průměrná molekulová hmotnost Mw se stanoví pomocí těchto rovnic: kde Hi je výška signálu detektoru nad základní čarou pro retenční objem Vi, Mi je molekulová hmotnost frakce polymeru s retenčním objemem Vi a n je počet údajů. Šířka distribuce molekulové hmotnosti, která je mírou polydisperzity systému, je dána poměrem Mw/Mn. 1. 3 Referenční látky Vzhledem k tomu, že GPC je relativní metoda, musí být provedena kalibrace. K tomuto účelu se obvykle používá lineární polystyrenový standard s úzkou distribucí se známými průměrnými molekulovými hmot- nostmi Mn a Mw a se známou distribucí molekulové hmotnosti. Kalibrační křivka může být pro stanovení molekulové hmotnosti neznámého vzorku použita pouze tehdy, byly-li podmínky separace vzorku a stan- dardů identické. Stanovený vztah mezi molekulovou hmotností a elučním objemem je platný pouze za specifických pod- mínek určitého experimentu. Podmínky zahrnují především teplotu, rozpouštědlo (nebo směs rozpouště- del), chromatografické podmínky a separační kolonu nebo systém kolon. 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 279 Molekulové hmotnosti stanovené tímto způsobem jsou relativními hodnotami a označují se jako „moleku- lové hmotnosti ekvivalentní polystyrenu“. To znamená, že se molekulová hmotnost bude v závislosti na strukturních a chemických rozdílech mezi vzorkem a standardem od absolutní hodnoty více či méně lišit. Použijí-li se jiné standardy, např. poly(ethylenglykol), poly(ethylenoxid), poly(methyl-methakrylát), poly(akrylová kyselina), musí být použití zdůvodněno. 1. 4 Podstata zkušební metody Distribuce molekulové hmotnosti vzorku i průměrné molekulové hmotnosti (Mn, Mw) lze stanovit meto- dou GPC. GPC je speciální typ kapalinové chromatografie, při němž se vzorek dělí podle hydrodynamic- kých objemů jednotlivých složek (2). Separace probíhá při průchodu vzorku kolonou naplněnou porézním materiálem, obvykle organickým gelem. Malé molekuly proniknou do pórů, zatímco velké molekuly nikoli. Průchod velkých molekul je tedy kratší a jsou eluovány nejdříve. Středně velké molekuly pronikají do některých pórů a jsou eluovány poz- ději. Nejmenší molekuly se středním hydrodynamickým poloměrem menším než velikost pórů gelu proni- kají do všech pórů. Tyto molekuly jsou eluovány nakonec. V ideálním případě závisí separace pouze na velikosti molekul, ale v praxi je obtížné vyhnout se alespoň některým rušivým adsorpčním jevům. Nestejnoměrné plnění kolony a mrtvé objemy mohou situaci zhoršit (2). Detekce se provádí například měřením indexu lomu nebo UV absorpce a výsledkem je jednoduchá distri- buční křivka. Má-li být však křivce přiřazena skutečná molekulová hmotnost, je nezbytné kalibrovat kolonu polymery se známou molekulovou hmotností a v ideálním případě v podstatě podobnou strukturou, např. různými polystyrenovými standardy. Křivka má zpravidla gaussovský tvar, někdy deformovaný prodlou- žením na straně nízké molekulové hmotnosti, přičemž svislá osa udává hmotnostní zlomek různých mole- kulových hmotností a na vodorovné ose je vynesen logaritmus molekulové hmotnosti. 1. 5 Kritéria jakosti Opakovatelnost (relativní směrodatná odchylka: RSD) elučního objemu by měla být lepší než 0,3 %. Je-li chromatogram hodnocen v závislosti na čase a neodpovídá výše uvedenému kritériu (1), musí být požado- vaná opakovatelnost zajištěna korekcí vnitřním standardem. Polydisperzity jsou závislé na molekulových hmotnostech standardů. V případě polystyrenových standardů jsou typickými hodnotami Mp < 2 000 2 000 ≤ Mp ≤ 106 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 Mw/Mn < 1,05 Mw/Mn < 1,20 (Mp je molekulová hmotnost standardu odpovídající maximu píku) 1. 6 Popis zkušební metody 1. 6. 1 Příprava standardních roztoků polystyrenu Polystyrenové standardy se rozpustí opatrným mícháním ve zvoleném eluentu. Při přípravě roztoků se musí zohlednit doporučení výrobce. Koncentrace zvolených standardů závisí na různých faktorech, např. na vstřikovaném objemu, viskozitě roz- toku a citlivosti analytického detektoru. Maximální vstřikovaný objem musí být přizpůsoben délce kolony, aby nedošlo k přesycení. Typické vstřikované objemy pro analytickou separaci pomocí GPC s kolonou o rozměrech 30 cm × 7,8 mm jsou obvykle 40 až 100 μl. Větší objemy jsou možné, ale neměly by překročit 250 μl. Optimální poměr mezi vstřikovaným objemem a koncentrací musí být stanoven před vlastní kalib- rací kolony. 280 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 1. 6. 2 Příprava roztoku vzorku Stejné požadavky platí v zásadě pro přípravu roztoků vzorku. Vzorek se opatrným třepáním rozpustí ve vhodném rozpouštědle, např. v tetrahydrofuranu (THF). V žádném případě by neměl být rozpuštěn pomocí ultrazvukové lázně. Je-li to nezbytné, přečistí se roztok vzorku filtrací přes membránový filtr o veli- kosti pórů 0,2 až 2 μm. Přítomnost nerozpuštěných částic musí být zaznamenána v závěrečném protokolu, neboť mohou pocházet z frakcí s vysokou molekulovou hmotností. Pro stanovení hmotnostní koncentrace nerozpuštěných částic vyjádřené v procentech by měla být použita vhodná metoda. Roztoky by měly být použity do 24 hodin. 1. 6. 3 Přístroje a pomůcky — zásobník rozpouštědla, — odplynovací zařízení (podle potřeby), — dávkovací čerpadlo, — tlumič rázů (podle potřeby), — vstřikovací systém, — chromatografické kolony, — detektor, — průtokoměr (podle potřeby), — zapisovač, — nádoba na odpad. Musí být zajištěno, aby byl systém GPC inertní k použitým rozpouštědlům (např. použitím ocelových kapilár pro THF). 1. 6. 4 Vstřikování a systém dávkování rozpouštědla Určený objem roztoku vzorku se vnese na kolonu buď dávkovačem nebo ručně v ostře ohraničené zóně. Příliš rychlý pohyb pístu vzad nebo vpřed (při ručním vnesení) může způsobit změny v pozorované distri- buci molekulové hmotnosti. Dávkovač rozpouštědla by pokud možno neměl působit rázy a v ideálním případě by měl být opatřen tlumičem rázů. Průtok je řádově 1 ml/min. 1. 6. 5 Kolona Podle typu vzorku se k charakterizaci polymeru použije jednoduchá kolona nebo několik za sebou řaze- ných kolon. Komerčně je dostupná řada porézních materiálů definovaných vlastností (např. velikost pórů, vylučovací meze). Výběr separačního gelu nebo délky kolony závisí jak na vlastnostech vzorku (hydrody- namický objem, distribuce molekulové hmotnosti), tak na specifických podmínkách separace, jako jsou roz- pouštědlo, teplota a průtok (1, 2, 3). 1. 6. 6 Teoretická patra Použitá kolona nebo kombinace kolon musí být charakterizována počtem teoretických pater. Při použití THF jako eluentu to zahrnuje vnesení roztoku ethylbenzenu nebo jiné vhodné nepolární rozpuštěné látky na kolonu známé délky. Počet teoretických pater je dán touto rovnicí: W1/2)2 N = 5,54( Ve W)2 nebo N = 16(Ve kde N Ve je počet pater v maximu, je eluční objem píku, W šířka píku na základní čáře, W½ šířka píku v polovině výšky. 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 281 1. 6. 7 Separační účinnost Vedle počtu teoretických pater, který je veličinou určující šířku pásu, hraje roli také separační účinnost, která se stanoví ze strmosti kalibrační křivky. Separační účinnost kolony se získá z tohoto vztahu: V -V e,M x e,(10M x) plocha průřezu kolony 3 2] ≥ 6,0[cm cm kde Ve, Mx je eluční objem pro polystyren s molekulovou hmotností Mx, Ve, (10Mx) je eluční objem pro polystyren s 10krát větší molekulovou hmotností. Rozlišení systému je obecně definováno tímto vztahem: R1,2 = 2× Ve1-Ve2 W1+W2 × 1 log10(M2/M1) kde Ve1, Ve2 jsou eluční objemy dvou standardů polystyrenu v maximu píku, W1, W2 jsou šířky píků na základní čáře, M1, M2 jsou molekulové hmotnosti odpovídající maximu píků (měly by se lišit faktorem 10). Hodnota R pro kolonový systém by měla být větší než 1,7 (4). 1. 6. 8 Rozpouštědla Všechna rozpouštědla musí mít vysokou čistotu (v případě THF 95 % čistotu). Zásobník rozpouštědla (v případě potřeby pod inertní atmosférou) musí být dostatečně velký pro kalibraci kolony a pro několik analýz vzorku. Z rozpouštědla musí být před jeho dopravou čerpadlem na kolonu odstraněny plyny. 1. 6. 9 Kontrola teploty Teplota kritických vnitřních součástí (vstřikovací smyčky, kolon, detektoru a vedení) by měla být konstantní a měla by být v souladu s volbou rozpouštědla. 1. 6. 10 Detektor Detektor slouží ke kvantitativnímu zaznamenávání koncentrace vzorku eluovaného z kolony. Nemá-li dojít ke zbytečnému rozšíření píků, musí být objem kyvety detektoru co nejmenší. Neměl by být větší než 10 μl, s výjimkou detektorů k měření rozptylu světla a viskozity. K detekci se obvykle používá diferenciálního refraktometru. Vyžadují-li to však specifické vlastnosti vzorku nebo elučního rozpouštědla, lze použít jiné typy detektorů, např. UV/vis, IR detektory a viskozitní detektory atd. 2. ÚDAJE A PŘEDKLÁDÁNÍ ZPRÁV 2. 1 Údaje Pokud jde o podrobná kritéria hodnocení a o požadavky týkající se registrace a zpracování údajů, měla by být použita norma DIN (1). Pro každý vzorek musí být provedeny dva nezávislé experimenty. Analýzy musí být provedeny samostatně. Pro každé měření musí být uvedeny hodnoty Mn, Mw, Mw/Mn a Mp. Je nezbytné výslovně uvést, že naměřené hodnoty jsou relativními hodnotami odpovídajícími molekulové hmotnosti použitého standardu. 282 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 Po stanovení retenčních objemů nebo retenčních časů (případně korigovaných za použití vnitřního stan- dardu) se proti těmto veličinám vynesou do grafu hodnoty log Mp (přičemž Mp je výška maxima píku kalib- račního standardu). Pro jeden řád hodnot molekulové hmotnosti jsou nezbytné alespoň dva kalibrační body a pro celou křivku, která by měla pokrýt odhadovanou molekulovou hmotnost vzorku, se požaduje ales- poň pět naměřených bodů. Poslední bod kalibrační křivky na straně nízkých molekulových hmotností se určí hexylbenzenem nebo jiným vhodným nepolárním rozpouštědlem. Početně a hmotnostně průměrné molekulové hmotnosti se obecně určí elektronickým zpracováním údajů založeným na rovnicích v bodě 1. 2. Při manuálním zpracování údajů do číselné formy lze použít metodu ASTM D 3536-91 (3). Distribuční křivka musí být znázorněna ve formě tabulky nebo graficky (diferenciální četnost nebo kumu- lativní četnost v procentech proti log M). V grafickém znázornění by měl mít jeden řád molekulové hmot- nosti délku 4 cm a výška maxima píku by měla být asi 8 cm. U integrálních distribučních křivek by měla být vzdálenost mezi 0 a 100 % na ose y přibližně 10 cm. 2. 2 Protokol o zkoušce Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace: 2. 2. 1 Zkoušená látka — dostupné informace o zkoušené látce (identifikace, přísady, nečistoty), — popis zpracování vzorku, pozorované skutečnosti, problémy. 2. 2. 2 Přístrojové vybavení — zásobník eluentu, inertní plyn, odplynění eluentu, složení eluentu, nečistoty, — dávkovací čerpadlo, tlumič rázů, vstřikovací systém, — separační kolony (výrobce, všechny informace o charakteristikách kolon, jako jsou velikost pórů, druh separačního materiálu atd. , počet, délka a pořadí použitých kolon), — počet teoretických pater kolony (nebo kombinace kolon), separační účinnost (rozlišení systému), — informace o symetrii píků, — teplota kolony, způsob řízení teploty, — detektor (princip měření, typ, objem kyvety), — průtokoměr, je-li použit (výrobce, princip měření), — systém pro záznam a zpracování údajů (hardware a software). 2. 2. 3 Kalibrace systému — podrobný popis metody použité pro sestrojení kalibrační křivky, — informace o kritériích jakosti této metody (např. korelační koeficient, součet čtverců chyb atd. ), — informace o všech extrapolacích, předpokladech a aproximacích provedených během experimentálního postupu a při hodnocení a zpracování údajů, — všechny naměřené hodnoty použité při konstrukci kalibrační křivky musí být dokumentovány v tabulce, která musí pro každý kalibrační bod obsahovat tyto informace: — název vzorku, — výrobce vzorku, — charakteristické hodnoty standardů Mp, Mn, Mw a Mw/Mn, jak jsou poskytnuty výrobcem nebo jak jsou zjištěny z následných měření, společně s podrobnostmi o metodě stanovení, — vstříknutý objem a vstříknutá koncentrace, — hodnota Mp použitá po kalibraci, 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 283 — eluční objem nebo korigovaný retenční čas měřený v maximu píku, — hodnota Mp vypočtená pro maximum píku, — chyba vypočtené hodnoty Mp a kalibrační hodnoty Mp vyjádřená v procentech. 2. 2. 4 Hodnocení — hodnocení vlivu času: metody použité pro zajištění požadované reprodukovatelnosti (metoda korekce, vnitřní standard atd. ), — informace o tom, zda bylo hodnocení provedeno na základě elučního objemu nebo retenčního času, — informace o mezích hodnocení v případě, že pík nebyl úplně analyzován, — popis metody vyrovnávání křivek, bylo-li použito, — příprava a postupy předúpravy vzorku, — popřípadě přítomnost nerozpuštěných částic, — vstříknutý objem (μl) a vstříknutá koncentrace (mg/ml), — pozorované skutečnosti, které vedou k odchylkám od ideálních charakteristik metody GPC, — podrobný popis všech změn zkušebních postupů, — podrobnosti o rozsahu chyb, — jakékoli další informace a pozorování relevantní pro interpretaci výsledků. 3. LITERATURA (1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1. (2) Yau, W. W. , Kirkland, J. J. , Bly, D. D. (eds. ) (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. (3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Dis- tribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. (4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Dis- tribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 284 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 Příloha Příklady jiných metod stanovení početně průměrné molekulové hmotnosti (Mn) polymerů Gelově permeační chromatografie (GPC) je preferovanou metodou stanovení Mn, zejména tehdy, je-li k dispozici sada standardů, jejichž struktura je srovnatelná se strukturou polymeru. Vyskytnou-li se praktické obtíže při použití GPC nebo očekává-li se, že látka nevyhoví regulativním kritériím na Mn (což je třeba potvrdit), jsou k dispozici alterna- tivní metody, jako jsou: 1. Využití koligativních vlastností 1. 1 Ebulioskopie/kryoskopie: spočívá v měření zvýšení bodu varu (ebulioskopie) nebo snížení bodu tuhnutí (kryoskopie) rozpouštědla po přidání polymeru. Metoda je založena na skutečnosti, že vliv rozpuštěného poly- meru na bod varu nebo bod tuhnutí závisí na molekulové hmotnosti polymeru (1, 2). Použitelnost: Mn < 20 000. 1. 2 Snížení tlaku par: spočívá v měření tlaku par zvolené referenční kapaliny před přidáním a po přidání známého množství polymeru (1, 2). Použitelnost: Mn < 20 000 (teoretická; v praxi však má omezený význam). 1. 3 Membránová osmometrie: spočívá na principu osmózy, tj. přirozené snahy molekul rozpouštědla proniknout polopropustnou membránou ze zředěného do koncentrovaného roztoku a dosáhnout rovnováhy. Při zkoušce je koncentrace zředěného roztoku nulová, zatímco koncentrovaný roztok obsahuje polymer. Pronikáním roz- pouštědla membránou dochází ke tlakovému rozdílu, který závisí na koncentraci a molekulové hmotnosti poly- meru (1, 3, 4). Použitelnost: Mn od 20 000 do 200 000. 1. 4 Osmometrie v parní fázi: spočívá ve srovnání rychlosti vypařování aerosolu čistého rozpouštědla s alespoň třemi aerosoly obsahujícími polymer v různých koncentracích (1, 5, 6). Použitelnost: Mn < 20 000. 2. Analýza koncových skupin Použití této metody vyžaduje znalost jak celkové struktury polymeru, tak povahy koncových skupin řetězce (které musí být odlišitelné od hlavního řetězce například metodou NMR nebo titrací nebo derivatizací). Stano- vení počtu koncových skupin polymeru může vést k hodnotě molekulové hmotnosti (7, 8, 9). Použitelnost: Mn až do 50 000 (s klesající spolehlivostí). LITERATURA (1) Billmeyer, F. W. Jr. , (1984). Textbook of Polymer Science, 3. vydání, John Wiley, New York. (2) Glover C. A. , (1975). Absolute Colligative Property Methods. Kapitola 4. V: Polymer Molecular Weights, část I, P. E. Slade, Jr. (ed. ), Marcel Dekker, New York. (3) ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Poly- mers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. (4) Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. V: Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper (ed. ), J. Wiley and Sons, 25–52. (5) ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 285 (6) Morris, C. E. M. , (1989). Vapour Pressure Osmometry. V: Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper (ed. ), J. Wiley and Sons. (7) Schröder, E. , Müller, G. , Arndt, K. -F. , (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Mnichov. (8) Garmon, R. G. , (1975). End-Group Determinations, kapitola 3. V: Polymer Molecular Weights, Část I, P. E. Slade, Jr. (ed. ) Marcel Dekker, New York. (9) Amiya, S. , et al. (1990). Pure Appl. Chem. , 62, 2139-2146. 286 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 PŘÍLOHA III B A. 19 OBSAH NÍZKOMOLEKULÁRNÍCH LÁTEK V POLYMERECH 1. METODA Tato gelově permeační chromatografická metoda je replikou metody OECD TG 119 (1996). Základní prin- cipy a další technické informace jsou uvedeny v odkazech. 1. 1 Úvod Vlastnosti polymerů jsou tak rozdílné, že není možné popsat jedinou metodu a přesně stanovit podmínky separace a hodnocení, které by pokryly všechny eventuality a specifika vyskytující se při separaci polymerů. Zejména pro složité polymerní systémy není gelově permeační chromatografie (GPC) vždy vhodná. Není-li GPC použitelná, může být molekulová hmotnost stanovena jinými metodami (viz příloha). V takových případech by měly být uvedeny veškeré podrobnosti a zdůvodnění použité metody. Popsaná metoda je založena na normě DIN 55672 (1). Podrobné informace o provádění experimentů a o hodnocení údajů lze nalézt v uvedené normě DIN. V případě, že jsou nezbytné úpravy experimentálních podmínek, musí být změny zdůvodněny. Mohou být použity jiné normy, jsou-li na ně uvedeny úplné odkazy. V popsané metodě jsou ke kalibraci použity vzorky polystyrenu o známé polydisperzitě a metoda může být upravena tak, aby byla vhodná pro určité polymery, např. ve vodě rozpustné polymery a poly- mery s dlouhými větvemi. 1. 2 Definice a jednotky Nízká molekulová hmotnost je konvenčně definována jako molekulová hmotnost pod 1 000. Početně průměrná molekulová hmotnost Mn a hmotnostně průměrná molekulová hmotnost Mw se stanoví pomocí těchto rovnic: kde Hi je výška signálu detektoru nad základní čarou pro retenční objem Vi, Mi je molekulová hmotnost frakce polymeru pro retenční objem Vi a n je počet údajů. Šířka distribuce molekulové hmotnosti, která je mírou polydisperzity systému, je dána poměrem Mw/Mn. 1. 3 Referenční látky Vzhledem k tomu, že GPC je relativní metoda, musí být provedena kalibrace. K tomuto účelu se obvykle používá lineární polystyrenový standard s úzkou distribucí se známými průměrnými molekulovými hmot- nostmi Mn a Mw a se známou distribucí molekulové hmotnosti. Kalibrační křivka může být pro stanovení molekulové hmotnosti neznámého vzorku použita pouze tehdy, byly-li podmínky separace vzorku a stan- dardů identické. 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 287 Stanovený vztah mezi molekulovou hmotností a elučním objemem je platný pouze za specifických pod- mínek určitého experimentu. Podmínky zahrnují především teplotu, rozpouštědlo (nebo směs rozpouště- del), chromatografické podmínky a separační kolonu nebo systém kolon. Molekulové hmotnosti stanovené tímto způsobem jsou relativními hodnotami a označují se jako „moleku- lové hmotnosti ekvivalentní polystyrenu“. To znamená, že se molekulová hmotnost bude v závislosti na strukturních a chemických rozdílech mezi vzorkem a standardem od absolutní hodnoty více či méně lišit. Použijí-li se jiné standardy, např. poly(ethylenglykol), poly(ethylenoxid), poly(methyl-methakrylát), poly (akrylová kyselina), musí být použití zdůvodněno. 1. 4 Podstata zkušební metody Distribuce molekulové hmotnosti vzorku i průměrné molekulové hmotnosti (Mn, Mw) lze stanovit meto- dou GPC. GPC je speciální typ kapalinové chromatografie, při němž se vzorek dělí podle hydrodynamic- kých objemů jednotlivých složek (2). Separace probíhá při průchodu vzorku kolonou naplněnou porézním materiálem, obvykle organickým gelem. Malé molekuly proniknou do pórů, zatímco velké molekuly nikoliv. Průchod velkých molekul je tedy kratší a jsou eluovány nejdříve. Středně velké molekuly pronikají do některých pórů a jsou eluovány poz- ději. Nejmenší molekuly se středním hydrodynamickým poloměrem menším než velikost pórů gelu proni- kají do všech pórů. Tyto molekuly jsou eluovány nakonec. V ideálním případě závisí separace pouze na velikosti molekul, ale v praxi je obtížné vyhnout se ales- poň některým rušivým adsorpčním jevům. Nestejnoměrné plnění kolony a mrtvé objemy mohou situaci zhoršit (2). Detekce se provádí například měřením indexu lomu nebo UV absorpce a výsledkem je jednoduchá distri- buční křivka. Má-li být však křivce přiřazena skutečná molekulová hmotnost, je nezbytné kalibrovat kolonu polymery se známou molekulovou hmotností a v ideálním případě v podstatě podobnou strukturou, např. různé polystyrenové standardy. Křivka má zpravidla gaussovský tvar, někdy deformovaný prodloužením na straně nízké molekulové hmotnosti, přičemž svislá osa udává hmotnostní zlomek různých molekulových hmotností a na vodorovné ose je vynesen logaritmus molekulové hmotnosti. Obsah molekul o nízké hmotnosti se odečte z této kalibrační křivky. Výpočet může být správný pouze tehdy, je-li odezva nízkomolekulárních látek hmotnostně ekvivalentní polymeru jako celku. 1. 5 Kritéria jakosti Opakovatelnost (relativní směrodatná odchylka: RSD) elučního objemu by měla být lepší než 0,3 %. Je-li chromatogram hodnocen v závislosti na čase a neodpovídá výše uvedenému kritériu (1), musí být požado- vaná opakovatelnost zajištěna korekcí vnitřním standardem. Polydisperzity jsou závislé na molekulových hmotnostech standardů. V případě polystyrenových standardů jsou typickými hodnotami: Mp < 2 000 2 000 ≤ Mp ≤ 106 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 Mw/Mn < 1,05 Mw/Mn < 1,20 (Mp je molekulová hmotnost standardu odpovídající maximu píku) 1. 6 Popis zkušební metody 1. 6. 1 Příprava standardních roztoků polystyrenu Polystyrenové standardy se rozpustí opatrným mícháním ve zvoleném eluentu. Při přípravě roztoků se musí zohlednit doporučení výrobce. 288 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 Koncentrace zvolených standardů závisí na různých faktorech, např. na vstřikovaném objemu, viskozitě roz- toku a citlivosti analytického detektoru. Maximální vstřikovaný objem musí být přizpůsoben délce kolony, aby nedošlo k přesycení. Typické vstřikované objemy pro analytickou separaci pomocí GPC s kolonou o rozměrech 30 × 7,8 mm jsou obvykle 40 až 100 μl. Větší objemy jsou možné, ale neměly by překročit 250 μl. Optimální poměr mezi vstřikovaným objemem a koncentrací musí být stanoven před vlastní kalib- rací kolony. 1. 6. 2 Příprava roztoku vzorku Stejné požadavky platí v zásadě pro přípravu roztoků vzorku. Vzorek se opatrným třepáním rozpustí ve vhodném rozpouštědle, např. v tetrahydrofuranu (THF). V žádném případě by neměl být rozpuštěn pomocí ultrazvukové lázně. Je-li to nezbytné, přečistí se roztok vzorku filtrací přes membránový filtr o veli- kosti pórů 0,2 až 2 μm. Přítomnost nerozpuštěných částic musí být zaznamenána v závěrečném protokolu, neboť mohou pocházet z frakcí s vysokou molekulovou hmotností. Pro stanovení hmotnostní koncentrace nerozpuštěných částic vyjádřené v procentech by měla být použita vhodná metoda. Roztoky by měly být použity do 24 h. 1. 6. 3 Korekce na obsah nečistot a přísad Korekce obsahu frakce s M < 1 000 v důsledku příspěvku od přítomných nepolymerních specifických slo- žek (např. nečistot a/nebo přísad) je obvykle nezbytná, není-li naměřený obsah < 1 %. Dosáhne se toho přímou analýzou roztoku polymeru nebo eluátu GPC. V případech, kdy je eluát po průchodu kolonou pro další analýzu příliš zředěný, musí být zkoncentrován. Může být nezbytné odpařit eluát do sucha a opět jej rozpustit. Zkoncentrování eluátu musí být provedeno za podmínek, při nichž je zajištěno, že nedojde ke změnám v eluátu. Zpracování eluátu po GPC závisí na analytické metodě použité ke kvantitativnímu stanovení. 1. 6. 4 Přístroje a pomůcky Aparatura pro GPC sestává z těchto částí: — zásobník rozpouštědla, — odplynovací zařízení (podle potřeby), — dávkovací čerpadlo, — tlumič rázů (podle potřeby), — vstřikovací systém, — chromatografické kolony, — detektor, — průtokoměr (podle potřeby), — zapisovač, — nádoba na odpad. Musí být zajištěno, aby byl systém GPC inertní k použitým rozpouštědlům (např. použitím ocelových kapilár pro THF). 1. 6. 5 Vstřikování a systém dávkování rozpouštědla Určený objem roztoku vzorku se vnese na kolonu buď dávkovačem nebo ručně v ostře ohraničené zóně. Příliš rychlý pohyb pístu vzad nebo vpřed (při ručním vnesení) může způsobit změny v pozorované distri- buci molekulové hmotnosti. Dávkovač rozpouštědla by pokud možno neměl působit rázy a v ideálním případě by měl být opatřen tlumičem rázů. Průtok je řádově 1 ml/min. 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 289 1. 6. 6 Kolona Podle typu vzorku se k charakterizaci polymeru použije jednoduchá kolona nebo několik za sebou řaze- ných kolon. Komerčně je dostupná řada porézních materiálů definovaných vlastností (např. velikost pórů, vylučovací meze). Výběr separačního gelu nebo délky kolony závisí jak na vlastnostech vzorku (hydrody- namický objem, distribuce molekulové hmotnosti), tak na specifických podmínkách separace, jako jsou roz- pouštědlo, teplota a průtok (1, 2, 3). 1. 6. 7 Teoretická patra Použitá kolona nebo kombinace kolon musí být charakterizována počtem teoretických pater. Při použití THF jako eluentu to zahrnuje vnesení roztoku ethylbenzenu nebo jiné vhodné nepolární rozpuštěné látky na kolonu známé délky. Počet teoretických pater je dán touto rovnicí: W1/2)2 N = 5,54( Ve W)2 nebo N = 16(Ve kde N Ve je počet pater, je eluční objem v maximu píku, W šířka píku na základní čáře, W½ šířka píku v polovině výšky. 1. 6. 8 Separační účinnost Vedle počtu teoretických pater, který je veličinou určující šířku pásu, hraje roli také separační účinnost, která se stanoví ze strmosti kalibrační křivky. Separační účinnost kolony se získá z tohoto vztahu: V -V e,M x e,(10M x) plocha průřezu kolony 3 2] ≥ 6,0[cm cm kde Ve, Mx je eluční objem pro polystyren s molekulovou hmotností Mx, Ve, (10 Mx) je eluční objem pro polystyren s 10krát větší molekulovou hmotností. Rozlišení systému je obecně definováno tímto vztahem: R1,2 = 2× Ve1-Ve2 W1+W2 × 1 log10(M2/M1) kde Ve1, Ve2 jsou eluční objemy dvou standardů polystyrenu v maximu píku, W1, W2 jsou šířky píků na základní čáře, M1, M2 jsou molekulové hmotnosti odpovídající maximu píků (měly by se lišit faktorem 10). Hodnota R pro kolonový systém by měla být větší než 1,7 (4). 1. 6. 9 Rozpouštědla Všechna rozpouštědla musí mít vysokou čistotu (v případě THF 99,5 % čistotu). Zásobník rozpouštědla (v případě potřeby pod inertní atmosférou) musí být dostatečně velký pro kalibraci kolony a pro několik analýz vzorku. Z rozpouštědla musí být před jeho dopravou čerpadlem na kolonu odstraněny plyny. 290 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 1. 6. 10 Kontrola teploty Teplota kritických vnitřních součástí (vstřikovací smyčky, kolon, detektoru a vedení) by měla být konstantní a měla by být v souladu s volbou rozpouštědla. 1. 6. 11 Detektor Detektor slouží ke kvantitativnímu zaznamenávání koncentrace vzorku eluovaného z kolony. Nemá-li dojít ke zbytečnému rozšíření píků, musí být objem kyvety detektoru co nejmenší. Neměl by být větší než 10 μl, s výjimkou detektorů k měření rozptylu světla a viskozity. K detekci se obvykle používá diferenciálního refraktometru. Vyžadují-li to však specifické vlastnosti vzorku nebo elučního rozpouštědla, lze použít jiné typy detektorů, např. UV/vis, IR detektory a viskozitní detektory atd. 2. ÚDAJE A JEJICH PŘEDKLÁDÁNÍ 2. 1 Údaje Pokud jde o podrobná kritéria hodnocení a o požadavky týkající se registrace a zpracování údajů, měla by být použita norma DIN (1). Pro každý vzorek musí být provedeny dva nezávislé experimenty. Analýzy musí být provedeny samostatně. Ve všech případech je důležité stanovit také údaje ze slepých pokusů zpracovaných za stejných podmínek jako vzorek. Je nezbytné výslovně uvést, že naměřené hodnoty jsou relativními hodnotami odpovídajícími molekulové hmotnosti použitého standardu. Po stanovení retenčních objemů nebo retenčních časů (případně korigovaných za použití vnitřního stan- dardu) se proti těmto veličinám vynesou do grafu hodnoty log Mp (přičemž Mp je výška maxima píku kalib- račního standardu). Pro jeden řád hodnot molekulové hmotnosti jsou nezbytné alespoň dva kalibrační body a pro celou křivku, která by měla pokrýt odhadovanou molekulovou hmotnost vzorku, se požaduje ales- poň pět naměřených bodů. Poslední bod kalibrační křivky na straně nízkých molekulových hmotností se určí hexylbenzenem nebo jiným vhodným nepolárním rozpouštědlem. Při stanovení se část křivky odpo- vídající molekulovým hmotnostem nižším než 1 000 podle potřeby koriguje na nečistoty a přísady. Eluční křivky se obvykle hodnotí pomocí elektronického zpracování údajů. Při manuálním zpracování údajů do číselné formy lze použít metodu ASTM D 3536-91 (3). Jestliže je v koloně zachycen nerozpustný polymer, je jeho molekulová hmotnost pravděpodobně vyšší než molekulová hmotnost rozpuštěné frakce, a pokud by tato skutečnost nebyla zohledněna, došlo by k nad- hodnocení obsahu molekul o nízké hmotnosti. Návod na korigování obsahu molekul o nízké hmotnosti na obsah nerozpuštěného polymeru je uveden v příloze. Distribuční křivka musí být znázorněna ve formě tabulky nebo graficky (diferenciální četnost nebo kumu- lativní četnost v procentech proti log M). V grafickém znázornění by měl mít jeden řád molekulové hmot- nosti délku 4 cm a výška maxima píku by měla být asi 8 cm. U integrálních distribučních křivek by měla být vzdálenost mezi 0 a 100 % na ose y přibližně 10 cm. 2. 2 Protokol o zkoušce Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace: 2. 2. 1 Zkoušená látka — dostupné informace o zkoušené látce (identifikace, přísady, nečistoty), — popis zpracování vzorku, pozorované skutečnosti, problémy. 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 291 2. 2. 2 Přístrojové vybavení — zásobník eluentu, inertní plyn, odplynění eluentu, složení eluentu, nečistoty, — dávkovací čerpadlo, tlumič rázů, vstřikovací systém, — separační kolony (výrobce, všechny informace o charakteristikách kolon, jako jsou velikost pórů, druh separačního materiálu atd. , počet, délka a pořadí použitých kolon), — počet teoretických pater kolony (nebo kombinace kolon), separační účinnost (rozlišení systému), — informace o symetrii píků, — teplota kolony, způsob řízení teploty, — detektor (princip měření, typ, objem kyvety), — průtokoměr, je-li použit (výrobce, princip měření), — systém pro záznam a zpracování údajů (hardware a software). 2. 2. 3 Kalibrace systému — podrobný popis metody použité pro sestrojení kalibrační křivky, — informace o kritériích jakosti této metody (např. korelační koeficient, součet čtverců chyb atd. ), — informace o všech extrapolacích, předpokladech a aproximacích provedených během experimentálního postupu a při hodnocení a zpracování údajů, — všechny naměřené hodnoty použité při konstrukci kalibrační křivky musí být dokumentovány v tabulce, která musí pro každý kalibrační bod obsahovat tyto informace: — název vzorku, — výrobce vzorku, — charakteristické hodnoty standardů Mp, Mn, Mw a Mw/Mn, jak jsou poskytnuty výrobcem nebo jak jsou zjištěny z následných měření, společně s podrobnostmi o metodě stanovení, — vstříknutý objem a vstříknutá koncentrace, — hodnota Mp použitá po kalibraci, — eluční objem nebo korigovaný retenční čas měřený v maximu píku, — hodnota Mp vypočtená pro maximum píku, — chyba vypočtené hodnoty Mp a kalibrační hodnoty Mp vyjádřená v procentech. 2. 2. 4 Informace o obsahu podílu s nízkou molekulovou hmotností v polymeru — popis metod použitých v analýze a způsobu, jakým byly experimenty provedeny, — informace o obsahu podílu s nízkou molekulovou hmotností vyjádřeném v hmotnostních procentech celkového vzorku, — informace o nečistotách, přísadách a jiných nepolymerních podílech vyjádřených v hmotnostních pro- centech celkového vzorku. 2. 2. 5 Hodnocení — hodnocení vlivu času: metody použité pro zajištění požadované reprodukovatelnosti (metoda korekce, vnitřní standard atd. ), — informace o tom, zda bylo hodnocení provedeno na základě elučního objemu nebo retenčního času, — informace o mezích hodnocení v případě, že pík nebyl úplně analyzován, — popis metody vyrovnávání křivek, bylo-li použito, 292 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 — příprava a postupy předúpravy vzorku, — popřípadě přítomnost nerozpuštěných částic, — vstříknutý objem (μl) a vstříknutá koncentrace (mg/ml), — pozorované skutečnosti, které vedou k odchylkám od ideálních charakteristik metody GPC, — podrobný popis všech změn zkušebních postupů, — podrobnosti o rozsahu chyb, — jakékoli další informace a pozorování relevantní pro interpretaci výsledků. 3. LITERATURA (1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Díl 1. (2) Yau, W. W. , Kirkland, J. J. , Bly, D. D. (eds. ) (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. (3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Dis- tribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. (4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Dis- tribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 293 Příloha Korekce obsahu nízkomolekulárních látek na přítomnost nerozpuštěného polymeru Je-li ve vzorku přítomen nerozpuštěný polymer, dochází ke ztrátě hmotnosti během analýzy GPC. Nerozpuštěné polymery jsou nevratně zachyceny v koloně nebo na filtru při filtraci vzorku, zatímco rozpustný podíl vzorku kolo- nou projde. V případě, že lze odhadnout nebo změřit přírůstek indexu lomu (d n/d c) polymeru, lze odhadnout ztrátu hmotnosti vzorku na koloně. V takovém případě se korekce provede pomocí externí kalibrace standardními mate- riály o známé koncentraci a známé hodnotě d n/d c, čímž se kalibruje refraktometr. V příkladě uvedeném dále je jako standard použit poly(methyl-methakrylát) (PMMA). Při externí kalibraci pro analýzu polyakrylátů se analyzuje metodou GPC standard PMMA známé koncentrace v tetrahydrofuranu a výsledné údaje se použijí pro nalezení konstanty refraktometru podle rovnice: K = R/(C × V × d n/d c) kde K R C V d n/d c je přírůstek indexu lomu pro PMMA v tetrahydrofuranu (ml/mg). je konstanta refraktometru (μVs/ml), je odečet pro standard PMMA (μVs), je koncentrace standardu PMMA (mg/ml), je vstříknutý objem (ml) a Pro standard PMMA jsou typické tyto údaje: R C = 2 937 891 = 1,07 mg/ml = 0,1 ml V d n/d c = 9 × 10-5 ml/mg. Výsledná hodnota K = 3,05 × 1011 se poté použije pro výpočet teoretické odezvy detektoru v případě, že detektorem prošlo 100 % vstříknutého polymeru. 294 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 PŘÍLOHA III C A. 20 CHOVÁNÍ POLYMERŮ PŘI ROZPOUŠTĚNÍ NEBO EXTRAKCI VE VODĚ 1. METODA Popsaná metoda je replikou revidované verze metody OECD TG 120 (1997). Další technické informace jsou uvedeny v odkaze (1). 1. 1 Úvod U určitých polymerů, např. emulzních polymerů, může být před použitím dále popsané metody nezbytná předúprava. Tato metoda není použitelná pro kapalné polymery a pro polymery, které za zkušebních pod- mínek reagují s vodou. Není-li metoda použitelná nebo proveditelná, je možné zkoumat chování polymerů při rozpouštění a extrakci jinými metodami. V takových případech by měly být uvedeny všechny podrobnosti použité metody a její zdůvodnění. 1. 2 Referenční látky Nejsou. 1. 3 Podstata zkušební metody Chování polymerů při rozpouštění nebo extrakci ve vodném prostředí se zjišťuje baňkovou metodou (viz A. 6, rozpustnost ve vodě, baňková metoda) s úpravou uvedenou dále. 1. 4 Kritéria jakosti Nejsou. 1. 5 Popis zkušební metody 1. 5. 1 Přístroje a pomůcky Pro provedení metody je nezbytné toto zařízení: — drticí zařízení, např. mlýnek pro přípravu částic o známé velikosti, — třepačka s možností řízení teploty, — membránový filtrační systém, — vhodné analytické vybavení, — normalizovaná síta. 1. 5. 2 Příprava vzorku Reprezentativní vzorek musí být nejdříve omezen za použití vhodného síta na velikost částic 0,125 až 0,25 mm. Kvůli stálosti vzorku nebo kvůli procesu drcení může být nezbytné chlazení. Kaučukovité mate- riály mohou být drceny při teplotě kapalného dusíku (1). Pokud není možné dosáhnout požadované velikosti částic, je třeba přijmout taková opatření, aby byla veli- kost částic zmenšena co nejvíce; výsledky by měly být zaznamenány. Ve zprávě je nezbytné uvést, jak byl rozdrcený vzorek uchován do provedení zkoušky. 1. 5. 3 Postup Do každé ze tří nádob opatřených skleněnými zátkami se naváží po 10 g zkoušené látky a přidá se po 1 000 ml vody. Ukáže-li se zpracování 10 g polymeru neschůdným, mělo by být použito nejbližší vyšší množství, které lze zpracovat, a objem vody by měl být podle toho upraven. 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 295 Nádoby se těsně zazátkují a poté se třepou při 20 °C. Měla by být použita třepačka nebo míchačka schopná pracovat při konstantní teplotě. Po 24 hodinách se obsah každé nádoby odstředí nebo zfiltruje a v čiré vodné fázi se vhodnou analytickou metodou stanoví koncentrace polymeru. Nejsou-li k dispozici vhodné analytické metody pro vodnou fázi, lze celkovou rozpustnost nebo extrahovatelnost zhodnotit z hmot- nosti sušiny na filtru nebo odstředěné sraženiny. Obvykle je nezbytné kvantitativně rozlišit nečistoty a přísady na jedné straně, a nízkomolekulární podíly na druhé straně. V případě gravimetrického stanovení je také důležité provést slepý pokus bez použití zkoušené látky s cílem zohlednit zbytky pocházející z experimentálního postupu. Chování při rozpouštění nebo extrakci polymerů ve vodě při 37 °C a pH 2 a 9 může být stanoveno způ- sobem popsaným v případě provádění experimentu při 20 °C. Hodnot pH lze dosáhnout přidáním buď vhodných pufrů, nebo vhodných kyselin nebo zásad, např. kyseliny chlorovodíkové, kyseliny octové, hyd- roxidu sodného nebo draselného analytické čistoty nebo NH3. V závislosti na použité metodě by měla být provedena jedna nebo dvě zkoušky. Jsou-li k dispozici dosta- tečně specifické metody pro přímou analýzu vodné fáze na obsah polymeru, měla by stačit jedna zkouška, jak je uvedena výše. Nejsou-li však takové metody k dispozici a zjištění chování polymeru při rozpouštění nebo extrakci je omezeno na nepřímou analýzu stanovením celkového obsahu organického uhlíku (TOC) ve vodném extraktu, měla by být provedena dodatečná zkouška. Tato dodatečná zkouška by měla být rov- něž provedena třikrát, přičemž se použije 10krát menší množství vzorků polymeru a stejné množství vody jako v první zkoušce. 1. 5. 4 Analýza 1. 5. 4. 1 Zk o uš k a s j edn ou v el ik o stí vzorku Metody pro přímou analýzu složek polymeru ve vodné fázi mohou být k dispozici. V opačném případě lze také zvážit nepřímou analýzu rozpuštěných nebo extrahovaných složek polymeru stanovením celkového obsahu rozpustných složek a provedením korekce na obsah nepolymerních složek. Analýza vodné fáze na obsah celkového polymerního podílu je možná buď dostatečně citlivou metodou, např. — stanovením celkového obsahu organického uhlíku (TOC) rozkladem persíranem nebo dichromanem za vzniku CO2 a následnou IR analýzou nebo chemickou analýzou, — atomovou absorpční spektrometrií (AAS) nebo jejím protějškem spektrometrií s indukčně vázaným plazmatem (ICP) pro silikonové polymery nebo polymery obsahující kov, — UV absorpcí nebo spektrofluorimetrií pro aromatické polymery, — kapalinovou chromatografií s hmotovým spektrometrem (LC-MS) pro nízkomolekulární vzorky, nebo vakuovým odpařením vodného extraktu do sucha a spektroskopickou (IR nebo UV atd. ) nebo AAS/ICP analýzou zbytku. Není-li analýza vodné fáze jako takové možná, měl by být vodný extrakt extrahován organickým roz- pouštědlem nemísitelným s vodou, např. chlorovaným uhlovodíkem. Rozpouštědlo se poté odpaří a zby- tek se analyzuje způsobem popsaným výše pro obsah polymeru. Jakékoli složky, které jsou identifikovány jako nečistoty nebo přísady, se odečtou, aby byl stanoven stupeň rozpustnosti samotného polymeru. Jsou-li přítomna relativně velká množství takových materiálů, může být nezbytné analyzovat zbytek například HPLC nebo GC, aby se odlišily nečistoty z přítomného monomeru nebo deriváty monomeru a aby tak mohl být stanoven skutečný obsah monomeru nebo jeho derivátů. V některých případech může být postačující pouhé odpaření organického rozpouštědla do sucha a zvážení suchého zbytku. 296 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 1. 5. 4. 2 Zkouška se dvěma různými velikos tm i v zorku Všechny vodné extrakty se analyzují na celkový obsah organického uhlíku (TOC). Provede se gravimetrické stanovení nerozpuštěného nebo neextrahovaného podílu vzorku. Zůstávají-li po odstředění nebo filtraci obsahu každé nádoby usazeny na stěnách nádoby zbytky polymeru, měla by být nádoba oplachována filtrátem, dokud není vyčištěna od všech viditelných zbytků. Poté se filtrát opět odstředí nebo zfiltruje. Zbytky, které zůstanou na filtru nebo v centrifugační kyvetě, se vysuší ve vakuu při 40 °C a zváží. Sušení se provádí do konstantní hmotnosti. 2. ÚDAJE 2. 1 Zkouška s jednou velikostí vzorku Pro každou ze tří nádob by měly být uvedeny jednotlivé výsledky a průměrné hodnoty vyjádřené v jednot- kách hmotnosti vztažené na objem roztoku (obvykle mg/l) nebo v jednotkách hmotnosti vztažené na hmot- nost vzorku polymeru (obvykle mg/g). Kromě toho by měla být uvedena ztráta hmotnosti vzorku (vypoč- tená jako hmotnost rozpuštěné látky dělená hmotností výchozího vzorku). Měly by být vypočteny relativní směrodatné odchylky (RSD). Měly by být uvedeny jednotlivé hodnoty pro celkovou látku (polymer + hlavní přísady atd. ) a pro samotný polymer (tj. po odečtení příspěvku od těchto přísad). 2. 2 Zkouška se dvěma různými velikostmi vzorku Pro každý experiment by měly být uvedeny jednotlivé hodnoty TOC ve vodných extraktech obou trojích experimentů a průměrné hodnoty vyjádřené v jednotkách hmotnosti vztažené na objem roztoku (obvykle mg C/l) a rovněž v jednotkách hmotnosti vztažené na hmotnost výchozího vzorku (obvykle mg C/g). Není-li mezi výsledky pro vysoké a nízké poměry vzorek/voda rozdíl, může to znamenat, že všechny extra- hovatelné složky byly skutečně vyextrahovány. V takovém případě obvykle nebývá přímá analýza nezbytná. Měly by být uvedeny jednotlivé hmotnosti zbytků vyjádřené v procentech počátečních hmotností vzorků. Měly by být vypočteny průměrné hodnoty za celý experiment. Rozdíly mezi 100 % a zjištěnými hodno- tami v procentech představují množství rozpustného a extrahovatelného materiálu v původním vzorku vyjádřené v procentech. 3. ZPRÁVY 3. 1 Protokol o zkoušce Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace: 3. 1. 1 Zkoušená látka — dostupné informace o zkoušené látce (identifikace, přísady, nečistoty, obsah podílu o nízké moleku- lové hmotnosti). 3. 1. 2 Experimentální podmínky — popis použitých postupů a experimentálních podmínek, — popis analytických a detekčních metod. 3. 1. 3 Výsledky — výsledky rozpustnosti nebo extrahovatelnosti v mg/l; jednotlivé a střední hodnoty pro extrakční zkoušky v různých roztocích, rozepsané podle obsahu polymeru, nečistot, přísad atd. , — výsledky rozpustnosti nebo extrahovatelnosti v mg/g polymeru, — hodnoty TOC ve vodných extraktech, hmotnost rozpuštěné látky a vypočtené procentuální hodnoty (pokud byly stanoveny), 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 297 — hodnota pH každého vzorku, — informace o hodnotách získaných při slepém pokusu, — podle potřeby upozornění na chemickou nestálost zkoušené látky během zkušebních postupů a ana- lytických postupů, — všechny informace, které jsou důležité pro interpretaci výsledků. 4. LITERATURA (1) DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke. 298 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 PŘÍLOHA III D C. 13 BIOAKUMULACE: PRŮTOKOVÁ ZKOUŠKA NA RYBÁCH 1. METODA Tato bioakumulační metoda je replikou metody OECD TG 305 (1996). 1. 1 Úvod V této metodě je popsán postup pro charakterizaci schopnosti látek bioakumulovat se v rybách za průto- kových podmínek. Ačkoliv jsou průtokové režimy preferovány, připouštějí se i semistatické režimy, jsou-li splněna kritéria validace. V metodě jsou dostatečně popsány podrobnosti pro provedení zkoušky, přičemž je poskytnuta dostatečná volnost pro přizpůsobení experimentálního uspořádání podmínkám v jednotlivých laboratořích a různým vlastnostem zkoušených látek. Metoda je nejefektivnější pro stabilní organické chemikálie s hodnotou log Po/v od 1,5 do 6,0 (1), ale může být také použita na superlipofilní látky (s hodnotou log Po/v > 6,0). Předběžně odhadnutý bioakumulační faktor (BCF), někdy označovaný jako KB, bude pro takové superlipo- filní látky pravděpodobně vyšší než hodnota bioakumulačního faktoru v ustáleném stavu (BCFus), která je očekávána z laboratorních experimentů. Předběžné odhady pro organické látky s hodnotou log Po/v až asi 9,0 lze získat pomocí rovnice Binteina et al (2). Mezi parametry, které charakterizují bioakumulační poten- ciál, patří rychlostní konstanta příjmu (k1), rychlostní konstanta vylučování (k2) a BCFus. Izotopově značené zkoušené látky mohou usnadnit analýzu vzorků vody a ryb a mohou být použity v případě, že by měla být provedena identifikace a kvantifikace produktů rozkladu. Měří-li se celkový obsah radioaktivního zbytku (například po spálení nebo solubilizaci tkáně), je hodnota BCF založena na výchozí sloučenině, všech zadržených metabolitech a také na asimilovaném uhlíku. Hodnoty BCF založené na cel- kovém obsahu radioaktivního zbytku tedy nemohou být přímo srovnatelné s hodnotou BCF získanou spe- cifickou chemickou analýzou pouze výchozí sloučeniny. V izotopových studiích mohou být pro stanovení BCF výchozí sloučeniny zařazeny čisticí postupy, a je-li to považováno za nezbytné, mohou být charakterizovány hlavní metabolity. Je možné rovněž kombinovat studii metabolismu ryb se studií bioakumulace analýzou a identifikací zbytků v tkáních. 1. 2 Definice a jednotky Biokoncentrace/Bioakumulace je nárůst koncentrace zkoušené látky v organismu (v jeho specifikované tkáni) nebo na něm vzhledem ke koncentraci zkoušené látky v okolním médiu. Bioakumulační faktor (BCF nebo KB) je koncentrace zkoušené látky v rybách nebo na nich nebo v jejich speci- fikovaných tkáních (Cr v μg/g (ppm)) dělená koncentrací chemikálie v okolním médiu (Cv v μg/ml (ppm)), a to kdykoliv ve fázi příjmu při této zkoušce. Bioakumulační faktor v ustáleném stavu (BCFus nebo KB) se po dlouhou dobu výrazně nemění; koncentrace zkoušené látky v okolním médiu je po tuto dobu konstantní. Plató nebo ustálený stav je stav dosažený tehdy, je-li při grafickém znázornění křivka časové závislosti kon- centrace zkoušené látky v rybách (Cr) rovnoběžná s časovou osou a tři po sobě jdoucí analýzy Cr vzorků odebraných v intervalech alespoň dvou dnů se neliší více než o ± 20 % a není-li mezi těmito třemi dobami odběru žádný výrazný rozdíl. Analyzují-li se spojené vzorky, požadují se čtyři po sobě jdoucí analýzy. V případě zkoušených látek, jejichž příjem probíhá pomalu, jsou vhodnější sedmidenní intervaly. 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 299 Bioakumulační faktory vypočtené přímo z kinetických rychlostních konstant (k1/k2) se nazývají kinetické aku- mulační faktory (BCFk). Rozdělovací koeficient n-oktanol/voda (Po/v) je rovnovážný poměr mezi rozpustností chemikálie v oktan-1-olu a ve vodě (metoda A. 8) a označuje se také jako Ko/v. Logaritmus hodnoty Po/v se používá jako ukazatel potenciálu chemikálie bioakumulovat se ve vodních organismech. Expozice nebo fáze příjmu je časový úsek, během něhož jsou ryby vystaveny působení zkoušené chemikálie. Rychlostní konstanta příjmu (k1) je číselná hodnota definující rychlost nárůstu koncentrace zkoušené látky v testovacích rybách nebo na nich (nebo v jejich specifikovaných tkáních), jsou-li ryby této chemikálii vysta- veny (k1 se vyjadřuje v jednotce den– 1). Poexpoziční nebo vylučovací fáze je časový úsek po přemístění testovacích ryb z média obsahujícího zkouše- nou látku do média, které tuto látku neobsahuje, během něhož se studuje vylučování látky z testovacích ryb (nebo její čistý úbytek v nich). Rychlostní konstanta vylučování (k2) je číselná hodnota definující rychlost poklesu koncentrace zkoušené látky v testovacích rybách (nebo v jejich specifikovaných tkáních) po jejich přemístění z média obsahujícího zkoušenou látku do média, které tuto látku neobsahuje (k2 se vyjadřuje v jednotce den– 1). 1. 3 Podstata zkušební metody Zkouška má dvě fáze: fázi expozice (příjem) a poexpoziční fázi (vylučování). Během fáze příjmu jsou dvě oddělené skupiny ryb stejného druhu vystaveny alespoň dvěma koncentracím zkoušené látky. Poté jsou přemístěny do média, které zkoušenou látku neobsahuje, aby začala fáze vylučování. Fáze vylučování je vždy nezbytná, není-li příjem látky během fáze příjmu nevýznamný (např. je-li BCF menší než 10). Kon- centrace zkoušené látky v rybách nebo na nich (nebo v jejich specifikovaných tkáních) se sleduje v průběhu obou fází zkoušky. Vedle těchto dvou zkušebních koncentrací se za stejných podmínek, s výjimkou přítomnosti zkoušené látky, udržuje kontrolní skupina ryb, aby mohly být na odpovídající kontrolní sku- pině porovnány možné nepříznivé účinky pozorované při bioakumulačních zkouškách a aby byly získány koncentrace zkoušené látky v pozadí. Fáze příjmu trvá 28 dnů, není-li prokázáno, že je rovnováhy dosaženo dříve. Délku fáze příjmu a dobu potřebnou k ustavení rovnovážného stavu lze předpovědět pomocí rovnice v příloze 3. Fáze vylučování poté začne po přemístění ryb do jiné nádrže bez zkoušené látky. Je-li to možné, vypočítají se bioakumu- lační faktory nejlépe jako poměr (BCFus), tj. poměr koncentrace v rybách (Cr) a ve vodě (Cv) ve zřetelném rovnovážném stavu, a jako kinetický bioakumulační faktor (BCFk), tj. poměr rychlostních konstant příjmu (k1) a vylučování (k2) za předpokladu kinetiky prvního řádu. Neřídí-li se zjevně naměřené hodnoty kineti- kou prvního řádu, měl by být použit složitější model (příloha 5). Nedojde-li k ustálenému stavu do 28 dnů, měla by být fáze příjmu prodloužena do jeho dosažení nebo na 60 dnů, podle toho, co nastane dříve; poté začne fáze vylučování. Rychlostní konstanta příjmu, rychlostní konstanta (nebo konstanty, jsou-li použity složitější modely) vylu- čování (úbytku), bioakumulační faktor a, je-li to možné, intervaly spolehlivosti každého z těchto parametrů se vypočítají z modelu, který popisuje naměřené koncentrace zkoušené látky v rybách a ve vodě. Faktor BCF se vyjadřuje jako funkce celkové živé hmotnosti ryby. Pro zvláštní účely však mohou být pou- žity specifikované tkáně nebo orgány (např. svalovina, játra), je-li ryba dostatečně velká nebo je-li možné ji rozdělit na jedlý (vykostěný) podíl a nejedlý podíl (vnitřnosti). Vzhledem k tomu, že u mnoha organických látek existuje zřetelný vztah mezi schopností bioakumulace a lipofilností, existuje také odpovídající vztah mezi obsahem tuku v testovacích rybách a pozorovanou bioakumulací takové látky. Aby se tedy snížilo kolísání výsledků pro tyto látky s vysokou lipofilností (tj. s log Po/v > 3), měla by být bioakumulace vzta- žena vedle celkové hmotnosti těla také k obsahu tuku. 300 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 Obsah tuku by měl být stanoven pokud možno na stejném biologickém materiálu, jaký je použit ke sta- novení koncentrace zkoušené látky. 1. 4 Informace o zkoušené látce Před prováděním zkoušek bioakumulace by měly být o zkoušené látce známy tyto informace: a) rozpustnost ve vodě; b) rozdělovací koeficient n-oktanol/voda Po/v (označovaný také jako Ko/v, stanovený metodou HPLC, viz A. 8); c) hydrolýza; d) fototransformace ve vodě stanovená ozářením slunečním nebo simulovaným slunečním světlem za podmínek zkoušky bioakumulace (3); e) povrchové napětí (u látek, u nichž nelze stanovit log Po/v); f) tlak par; g) v případě potřeby „snadná“ biologická rozložitelnost. Další požadovanou informací je toxicita pro druh ryby, který má být použit, nejlépe asymptotická hodnota LC50 (tj. časově nezávislá). K dispozici musí být vhodná analytická metoda o známé přesnosti a citlivosti pro kvantitativní stanovení zkoušené látky ve zkušebních roztocích a v biologickém materiálu a dále pod- robnosti o přípravě a uchovávání vzorků. Měly by být také známy meze stanovitelnosti zkoušené látky jak ve vodě, tak v rybích tkáních. Je-li použita zkoušená látka značená 14C, měla by být známá aktivita nečistot vyjádřená v procentech. 1. 5 Validita zkoušky Aby byla zkouška platná, měly by být splněny tyto podmínky: — kolísání teploty je menší než ±2 °C, — koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesne pod 60 % nasycení, — koncentrace zkoušené látky v nádrži je udržována v intervalu ±20 % kolem střední hodnoty naměřených hodnot během fáze příjmu, — mortalita nebo jiné nepříznivé účinky a choroby jak u kontrolních, tak u exponovaných ryb je na konci zkoušky menší než 10 %; jestliže je zkouška prodloužena na několik týdnů nebo měsíců, měl by být úhyn nebo jiné nepříznivé účinky v obou skupinách ryb menší než 5 % za měsíc nebo by neměl překročit celkem 30 %. 1. 6 Referenční sloučeniny Použití referenčních sloučenin o známém bioakumulačním potenciálu by mohlo být užitečné pro kontrolu experimentálního postupu. Zatím však ještě nelze doporučit žádné specifické látky. 1. 7 Popis zkušební metody 1. 7. 1 Přístroje a pomůcky U všech částí zařízení je třeba se vyhýbat použití materiálů, které se mohou rozpouštět, sorbovat nebo vylu- hovat a mají nepříznivý účinek na ryby. Lze použít standardní pravoúhlé nebo válcové nádrže vyrobené z inertního materiálu a mající vhodný objem s ohledem na náplň. Použití měkkých trubek z plastu by mělo být minimalizováno. Měly by být použity trubky z teflonu (R), z korozivzdorné oceli a/nebo ze skla. Zku- šenosti ukázaly, že pro látky s vysokými absorpčními koeficienty, jako jsou syntetické pyrethroidy, je nutné použít silanizované sklo. V těchto případech musí být zařízení po použití zlikvidováno. 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 301 1. 7. 2 Voda Ke zkoušce se používá přírodní voda, která by měla být získána z nekontaminovaného zdroje stálé kvality. Ředicí voda musí mít kvalitu, která umožní přežití zvoleného druhu ryby po dobu aklimatizace a v prů- běhu fází zkoušky, aniž by vykazoval abnormální vzhled nebo chování. V ideálním případě by mělo být prokázáno, že testovací druh může v ředicí vodě přežít, růst a rozmnožovat se (např. zkouškou s labora- torní kulturou nebo zkouškou toxicity během životního cyklu). Voda by měla být charakterizována ales- poň hodnotou pH, tvrdostí, celkovým obsahem pevných látek, celkovým obsahem organického uhlíku a podle možnosti také obsahem amoniaku a dusičnanů, alkalitou a v případě mořských druhů salinitou. Všechny parametry, které jsou důležité pro optimální prospívání ryb, jsou známy; v příloze I jsou přesto uvedeny doporučené maximální koncentrace pro řadu parametrů sladké a mořské vody. Voda by měla mít po celou dobu zkoušky stejnou kvalitu. Hodnota pH by měla být v rozmezí 6,0 až 8,5, avšak během zkoušky by se pH nemělo lišit o více než ± 0, 5. Pro ujištění, že voda nebude mít přílišný vliv na výsledky zkoušky (například tvorbou komplexů se zkoušenou látkou) nebo nepříznivý vliv na stav obsádky ryb, by měly být odebírány v pravidelných intervalech její vzorky pro analýzu. Je-li kvalita ředicí vody relativně konstantní, mělo by být stanovení těžkých kovů (např. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), hlavních aniontů a kationtů (např. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), pesticidů (např. celkový obsah organických fosforových a chlorových pesticidů), celkový obsah organického uhlíku a suspendovaných látek provedeno např. každé tři měsíce. Je-li prokázáno, že kvalita vody je konstantní po dobu alespoň jednoho roku, mohou být sta- novení méně častá a intervaly lze prodloužit (např. každých šest měsíců). Celkový přirozený obsah částic a rovněž obsah organického uhlíku (TOC) v ředicí vodě by měl být co nej- nižší, aby nedošlo k absorpci zkoušené látky na organických látkách, což může snížit její biologickou dostupnost (4). Maximální přijatelná hodnota je 5 mg/l pro částice (sušina zachycená filtrem 0,45 μm) a 2 mg/l pro celkový organický uhlík (viz příloha 1). Je-li to nezbytné, měla by být voda před použitím fil- trována. Příspěvek k obsahu organického uhlíku od testovacích ryb (exkrety) a ze zbytků potravy by měl být co nejmenší. V průběhu zkoušky by neměla koncentrace organického uhlíku ve zkušební nádrži překročit koncentraci organického uhlíku pocházejícího ze zkoušené látky a ze solubilizačního činidla, je-li použito, o více než 10 mg/l (±20 %). 1. 7. 3 Zkušební roztoky Zásobní roztok zkoušené látky se připraví ve vhodné koncentraci. Zásobní roztok by měl být připraven nejlépe jednoduchým smícháním nebo protřepáním zkoušené látky s ředicí vodou. Použití rozpouštědel nebo dispersantů (solubilizačních činidel) se nedoporučuje; v některých případech však může být pro vytvoření zásobního roztoku o vhodné koncentraci nezbytné. Rozpouštědly, která mohou být použita, jsou ethanol, methanol, ethylenglykol-monomethylester, ethylenglykol-dimethylester, dimethylformamid a triethylenglykol. Dispersanty, které mohou být použity, jsou Cremophor RH40, Tween 80, 0,01 % methylcelulosa a HCO-40. Snadno biologicky odbouratelná činidla je třeba používat rozvážně, neboť mohou způsobit problémy s růstem bakterií v průtokových zkouškách. Zkoušená látka může být značena radioaktivními izotopy a měla by být nejvyšší čistoty (např. > 98 %). Při průtokových zkouškách je pro zajištění koncentrací zkoušené látky nezbytný systém, který nepřetržitě dávkuje a ředí zásobní roztok zkoušené látky (např. měřicí čerpadlo, proporcionální ředění, saturační systém). Přijatelná je výměna nejlépe pěti objemů v každé zkušební nádrži za den. Upřednostňuje se prů- tokový režim, není-li to však možné (např. jsou-li testovací organismy nepříznivě ovlivňovány), může být použita semistatická technika za předpokladu, že jsou splněna kritéria validity. Rychlosti průtoku zásob- ního roztoku a ředicí vody by měly být kontrolovány jak 48 hodin před zkouškou, tak poté alespoň denně během zkoušky. Tato kontrola by měla zahrnovat stanovení rychlosti průtoku v každé testovací nádrži a měla by zajistit, aby se rychlost průtoku neměnila o více než 20 % v rámci jedné nádrže nebo mezi ná- držemi. 302 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 1. 7. 4 Výběr druhů Důležitými kritérii pro výběr druhu jsou jeho dostupnost, možnost získat jej ve vyhovující velikosti a jeho bezproblémové udržování v laboratoři. Dalšími kritérii pro výběr druhu ryb jsou jeho rekreační, komerční a ekologický význam a rovněž srovnatelná citlivost, úspěšné dřívější použití atd. Doporučené druhy jsou uvedeny v příloze 2. Mohou být použity i jiné druhy, avšak zkušební postup musí být upraven, aby byly vytvořeny vhodné zkušební podmínky. V takovém případě by měly být uvedeny důvody pro výběr druhu a experimentální podmínky. 1. 7. 5 Chov ryb Obsádka ryb se nechá aklimatizovat alespoň dva týdny při zkušební teplotě a krmí se odpovídající stravou stejného typu jako v průběhu zkoušky. Po 48 hodinách aklimatizace se zaznamená úhyn a použijí se tato kritéria: — úhyn vyšší než 10 % populace za sedm dnů: vyměnit celou obsádku, — úhyn 5 až 10 % populace za sedm dnů: nechat aklimatizovat dalších sedm dnů, — úhyn nižší než 5 % populace za sedm dnů: násada se přijímá; dojde li během dalších sedmi dnů k úhynu vyššímu než 5 %, celá obsádka se vymění. Zajistí se, aby ryby použité pro zkoušku nevykazovaly pozorovatelné nemoci a abnormality. Všechny nemocné ryby se vymění. Dva týdny před zkouškou nebo v průběhu zkoušky nesmí být léčeny u ryb žádné nemoci. 1. 8 Provedení zkoušky 1. 8. 1 Předběžná zkouška Může být užitečné provést předběžný experiment s cílem optimalizovat zkušební podmínky konečné zkoušky, např. výběr koncentrace (koncentrací) zkoušené látky, délka fáze příjmu a fáze vylučování. 1. 8. 2 Podmínky expozice 1. 8. 2. 1 Dé l k a f á ze př í j m u Předpověď délky fáze příjmu lze získat z praktických zkušeností (např. z dřívější studie nebo podle che- mikálie podobné akumulace) nebo z určitých empirických vztahů využívajících znalosti buď rozpustnosti ve vodě nebo rozdělovacího koeficientu n-oktanol/voda pro zkoušenou látku (viz příloha 3). Fáze příjmu trvá 28 dnů, není-li prokázáno, že je rovnováhy dosaženo dříve. Nedosáhne-li se ustáleného stavu do 28 dnů, měla by být fáze příjmu prodloužena do jeho dosažení, přičemž se provádějí další měření, nebo na 60 dnů, podle toho, co nastane dříve. 1. 8. 2. 2 Dé l ka f á ze vyl uč ování Doba odpovídající polovině délky fáze příjmu je obvykle dostatečná k tomu, aby se přiměřeně snížil (např. o 95 %) obsah látky v organismu (vysvětlení odhadu – viz příloha 3). Jestliže doba nezbytná pro dosažení 95 % úbytku je neprakticky dlouhá, překračuje například dvakrát běžnou délku fáze příjmu (tj. více než 56 dnů), může být použita kratší doba (tj. dokud není koncentrace zkoušené látky menší než 10 % koncen- trace v rovnovážném stavu). V případě látek se složitějším charakterem příjmu a vylučování, než jaký představuje model ryby s jedním kompartmentem řídícím se kinetikou prvního řádu, však delší fáze vylu- čování umožní stanovit rychlostní konstanty úbytku. Délka fáze však může být určena dobou, po kterou zůstává koncentrace zkoušené látky v rybách nad mezí detekce analytické metody. 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 303 1. 8. 2. 3 Poč t y t e s t o v a c í c h r y b Počet ryb na jednu zkušební koncentraci se zvolí tak, aby byly pro každý odběr k dispozici nejméně čtyři ryby na jeden vzorek. Je-li požadována větší statistická váha, budou pro vzorek nezbytná větší množství ryb. Použijí-li se pohlavně dospělé ryby, uvede se, zda byly v experimentu použity samice nebo samci nebo obojí. Jsou-li použita obě pohlaví, mělo by být před započetím expozice prokázáno, že rozdíl v obsahu lipidů mezi oběma pohlavími není významný; oddělení samců a samic může být nezbytné. V každé zkoušce se vyberou ryby podobné hmotnosti, tak aby hmotnost nejmenší z nich nebyla nižší než dvě třetiny hmotnosti největší ryby. Všechny by měly být stejného stáří a měly by pocházet ze stejného zdroje. Vzhledem k tomu, že stáří a hmotnost ryby mají zřejmě často významný vliv na hodnoty BCF (1), musí být tyto podrobnosti přesně zaznamenány. Doporučuje se zvážit před zkouškou dílčí vzorek obsádky ryb s cílem odhadnout střední hmotnost. 1. 8. 2. 4 Ná s a d a Volí se vysoký poměr množství vody k množství ryb, aby se minimalizovalo snížení koncentrace Cv způ- sobené přidáním ryb na začátku zkoušky, a také proto, aby nedošlo k poklesu koncentrace rozpuštěného kyslíku. Je důležité, aby rychlost nasazování byla přiměřená použitému druhu. V každém případě se obvykle doporučuje rychlost nasazování 0,1 až 1,0 g ryb (živá hmotnost) na litr vody za den. Vysoká rychlost nasa- zování může být zvolena, je-li prokázáno, že požadovaná koncentrace zkoušené látky může být udržována v mezích ±20 % a že koncentrace rozpuštěného kyslíku neklesne pod 60 % nasycení. Při volbě režimu nasazování má být přihlédnuto k obvyklému přirozenému prostředí ryb. Například ryby žijící u dna mohou vyžadovat při stejném objemu vody větší plochu dna než pelagické druhy ryb. 1. 8. 2. 5 Kr m e n í Během aklimatizace a po dobu zkoušky se ryby krmí vhodnou stravou se známým obsahem tuku a cel- kových bílkovin podávanou v množství dostatečném pro udržení zdravého stavu a pro udržení tělesné hmotnosti. Ryby se krmí denně v průběhu aklimatizace a po dobu zkoušky množstvím přibližně 1 až 2 % tělesné hmotnosti; tím se udrží v průběhu zkoušky obsah tuku u většiny druhů ryb na relativně konstantní úrovni. Množství krmiva by mělo být například jednou týdně nově přepočítáno, aby byla udržena odpo- vídající tělesná hmotnost a obsah tuku. Hmotnost ryb v každé nádrži může být pro tento výpočet odhad- nuta z hmotnosti ryb naposledy odebraných z dotyčné nádrže. Ryby, které zůstaly v nádrži, se neváží. Nezkrmená potrava a exkrety se odstraňují z nádrží odsátím denně krátce po krmení (30 min. až 1 h). Nádrže se udržují v celém průběhu zkoušky v co nejvyšší čistotě, aby byla koncentrace organických látek co nejnižší, neboť přítomnost organického uhlíku může snižovat biologickou dostupnost zkoušené látky (1). Poněvadž mnoho krmiv pochází z rybí moučky, mělo by být krmivo analyzováno na přítomnost zkoušené látky. Je rovněž žádoucí, aby bylo krmivo analyzováno na přítomnost pesticidů a těžkých kovů. 1. 8. 2. 6 Světlo a t epl ota Fotoperioda je obvykle 12 až 16 hodin a teplota (±2 °C) by měla odpovídat testovacímu druhu (viz příloha 2). Druh a charakteristiky osvětlení by měly být známy. Měla by být věnována pozornost možné fototrans- formaci zkoušené látky za světelných podmínek studie. Mělo by být použito vhodné osvětlení, aby ryby nebyly vystaveny fotoproduktům nevyskytujícím se v přírodě. V některých případech může být vhodné použít filtr pro odfiltrování UV záření s vlnovou délkou kratší než 290 nm. 1. 8. 2. 7 Zk uš e bní koncen trace Ryby jsou vystaveny za průtokových podmínek alespoň dvěma koncentracím zkoušené látky ve vodě. Vyšší (nejvyšší) koncentrace zkoušené látky se obvykle volí tak, aby byla na úrovni 1 % její asymptotickéhodnoty akutní LC50 a aby byla desetkrát vyšší než je mez detekce této látky ve vodě při použité analytické metodě. 304 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 Nejvyšší zkušební koncentraci lze také stanovit dělením akutní 96hodinové LC50 příslušným poměrem akutní/chronická letální dávka (u některých chemikálií může koeficient ležet mezi 3 a 100). Je-li to možné, volí se další koncentrace tak, aby se lišila od výše uvedené faktorem 10. Není-li to možné z důvodu kritéria 1 % z LC50 nebo z důvodu kritéria meze detekce, může být použit nižší faktor než 10 nebo by mělo být zváženo použití zkoušené látky značené 14C. Žádná koncentrace by neměla překročit rozpustnost látky. Je-li použito solubilizační činidlo, neměla by jeho koncentrace být vyšší než 0,1 ml/l a mělo by být stejné ve všech zkušebních nádržích. Jeho příspěvek, společně s příspěvkem zkoušené látky, k celkovému obsahu organického uhlíku ve zkušební vodě by měl být znám. Měla by však být vynaložena maximální snaha takové látky nepoužívat. 1. 8. 2. 8 Kontrolní experimenty Vedle zkušební série by měl být proveden kontrolní experiment s ředicí vodou, která popřípadě obsahuje solubilizační činidlo, pokud bylo zjištěno, že toto činidlo nemá na ryby žádné účinky. Není-li tomu tak, měly by být provedeny oba kontrolní experimenty. 1. 8. 3 Četnost měření kvality vody V průběhu zkoušky by mělo být v každé nádrži měřeno množství rozpuštěného kyslíku, TOC, pH a tep- lota. Celková tvrdost a popřípadě salinita by měly být měřeny v kontrolních experimentech a v jedné nádrži s vyšší (nejvyšší) koncentrací. Množství rozpuštěného kyslíku a popřípadě salinita by měly být měřeny ales- poň třikrát – na začátku, přibližně uprostřed a na konci fáze příjmu – a jednou týdně ve fázi vylučování. Hodnota TOC by měla být měřena na začátku zkoušky (24 hodin a 48 hodin před započetím fáze příjmu) před nasazením ryb a alespoň jednou týdně jak v průběhu fáze příjmu, tak v průběhu fáze vylučování. Tep- lota by měla být měřena denně, pH na začátku a na konci každé fáze a tvrdost vody jednou v průběhu zkoušky. Teplota by měla být měřena nejlépe nepřetržitě alespoň v jedné nádrži. 1. 8. 4 Odběr vzorků a analýza ryb a vody 1. 8. 4. 1 Ča s o vý r oz v r h o debírán í v z orků ryb a v ody Voda ze zkušebních nádrží se pro stanovení koncentrace zkoušené látky odebírá před nasazením ryb a během fáze příjmu i během fáze vylučování. Voda se odebírá alespoň ve stejnou dobu jako ryby a před krmením. Během fáze příjmu se stanovují koncentrace zkoušené látky, aby se ověřilo, že jsou v souladu s kritérii validity. Ryby se odebírají alespoň pětkrát během fáze příjmu a alespoň čtyřikrát během fáze vylučování. Vzhledem k tomu, že v mnoha případech bude obtížné s tímto počtem vzorků vypočítat rozumně přesný odhad hod- noty BCF, zejména jde-li o jinou než jednoduchou kinetiku prvního řádu, může být účelné odebírat vzorky v obou fázích častěji (viz příloha 4). Dodatečné vzorky se uloží a analyzují až poté, co se výsledky prvního kola analýz ukáží jako nedostatečné pro výpočet hodnoty BCF o požadované přesnosti. Příklad přijatelného časového rozvrhu odběru vzorků je uveden v příloze 4. Jiné plány lze snadno odvodit pomocí jiné předpokládané hodnoty Po/v, s níž se vypočítá expoziční doba pro 95 % příjem. V odběru vzorků se pokračuje během fáze příjmu do dosažení ustáleného stavu nebo po dobu 28 dnů, podle toho, co nastane dříve. Není-li ustáleného stavu dosaženo do 28 dnů, v odběru vzorků se pokračuje do ustavení ustáleného stavu nebo do 60 dnů, podle toho, co nastane dříve. Před zahájením fáze vylučování se ryby přemístí do čistých nádrží. 1. 8. 4. 2 Odběr vz orků a příprav a vzorků Vzorky vody pro analýzy se odebírají například odsáváním potrubím z inertního materiálu ze středu zku- šební nádrže. Vzhledem k tomu, že se biologicky nedostupná frakce zkoušené látky nedá často oddělit od biologicky dostupné frakce ani filtrací, ani odstředěním (zejména v případě superlipofilních chemikálií, tj. chemikálií s log Po/v > 5) (1, 5), nemohou být vzorky takto zpracovány. 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 305 Namísto toho je třeba učinit opatření pro to, aby byly nádrže udržovány co nejčistší, a obsah organického uhlíku by měl být pravidelně monitorován jak během fáze příjmu, tak během fáze vylučování. Při každém odběru se z nádrží odebere vhodný počet ryb (obvykle alespoň čtyři). Odebrané ryby se rychle omyjí pod tekoucí vodu, důkladně se osuší, ihned se usmrtí nejvhodnější humánní metodou a zváží se. Ryby a voda se pokud možno analyzují ihned po odběru s cílem předejít degradaci nebo ztrátám a vypočítat přibližné rychlosti příjmu a vylučování ještě v průběhu zkoušky. Okamžitá analýza rovněž zabrání opož- děnému stanovení plató při jeho dosažení. Neprovádí-li se analýza okamžitě, vzorky se vhodným způsobem uchovají. Před zahájením studie je třeba zjistit informace o řádné metodě uchovávání vzorků s ohledem na dotyčnou zkoušenou látku – například hluboké zmrazení, udržování při 4 °C, délka uchovávání, vyluhování atd. 1. 8. 4. 3 Kv a l i t a a n a l y t i c k é m e t o d y Vzhledem k tomu, že celý postup je určen hlavně správností, přesností a citlivostí analytické metody pou- žité pro analýzu zkoušené látky, je třeba experimentálně kontrolovat, že přesnost a reprodukovatelnost che- mické analýzy a rovněž výtěžek zkoušené látky jak z vody, tak ze vzorků ryb jsou pro danou analytickou metodu dostatečné. Kontroluje se také, zda se zkoušená látka nevyskytuje v použité ředicí vodě. Hodnoty Cv a Cr se podle potřeby korigují na výtěžky a hodnoty pozadí v kontrolních experimentech. Vzorky ryb a vody se zpracovávají tak, aby se minimalizovala kontaminace a ztráty (např. v důsledku adsorpce odběrným zařízením). 1. 8. 4. 4 Ana l ý z a v z ork ů ry b Je-li ve zkoušce použit materiál značený radioizotopy, je možné provést analýzu na celkovou aktivitu (tj. pro výchozí látku i s metabolity) nebo lze provést separaci, tak aby mohla být výchozí látka analyzována samostatně. Také hlavní metabolity mohou být charakterizovány v rovnovážném stavu nebo na konci fáze příjmu, podle toho, k čemu dojde dříve. Je-li hodnota BCF vyjádřená celkovou aktivitou reziduí ≥ 1 000 %, může být účelné, a pro určité kategorie chemikálií, např. pesticidy, se to důrazně doporučuje, identifikovat a kvantifikovat produkty rozkladu představující ≥ 10 % celkového množství reziduí v tkáních ryb v ustáleném stavu. Jsou-li produkty rozkladu představující ≥ 10 % celkových značených reziduí identifi- kovány a kvantifikovány, doporučuje se také identifikovat a kvantifikovat produkty rozkladu ve zkušební vodě. Koncentrace zkoušené látky by měla být obvykle stanovena pro každou jednotlivou zváženou rybu. Není-li to možné, mohou být vzorky při každém odběru sdružovány, avšak sdružování omezuje statistické postupy, které lze na údaje aplikovat. Pokud je důležitý určitý statistický postup a statistická váha, měl by být ve zkoušce nasazen přiměřený počet ryb vyhovující požadovanému sdružování a statistické váze (6, 7). Hodnota BCF by měla být vyjádřena jako funkce celkové hmotnosti a v případě lipofilních látek také jako funkce obsahu lipidů. Obsah lipidů v rybách se stanoví pokud možno při každém odběru. Pro stanovení obsahu lipidů by měla být použita vhodná metoda (odkazy 8 a 2 v příloze 3). Jako standardní metoda může být doporučena technika extrakce směsí chloroform a methanol (9). Různé metody neposkytují stejné hod- noty (10), a proto je důležité uvést podrobnosti o použité metodě. Je-li to možné, měla by být analýza lipidů provedena na extraktu připraveném pro analýzu zkoušené látky, neboť lipidy musí být často před chroma- tografickou analýzou odstraněny. Obsah lipidů v rybách (v mg/kg živé hmotnosti) na konci experimentu by se neměl lišit od jejich obsahu na počátku o více než ±25 %. Měl by být uveden také podíl pevných látek v tkáních, aby bylo možné provést přepočet koncentrace tuků z živé hmotnosti na sušinu. 306 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 2. ÚDAJE 2. 1 Zpracování výsledků Křivka příjmu zkoušené látky se sestrojí vynesením její koncentrace v rybách nebo na nich (nebo ve speci- fikovaných tkáních) v průběhu fáze příjmu proti času v lineárním měřítku. Dosáhla-li křivka plató, tj. pokud začíná být rovnoběžná s časovou osou, vypočítá se hodnota BCFus v rovnovážném stavu z poměru Cr v ustáleném stavu (střední hodnota) Cv v ustáleném stavu (střední hodnota) Není-li dosaženo ustáleného stavu, je možné vypočítat hodnotu BCFus s dostatečnou přesností pro posou- zení rizika z ustáleného stavu při 80 % (1,6/k2) nebo 95 % (3,0/k2) rovnováze. Také akumulační faktor BCFk se stanoví jako poměr dvou rychlostních konstant prvního řádu k1/k2. Rych- lostní konstanta vylučování se obvykle stanoví z křivky vylučování (tj. grafu poklesu koncentrace zkoušené látky v rybách v čase). Rychlostní konstanta příjmu se poté vypočte pomocí hodnoty k2 a hodnoty Cr odvo- zené z křivky příjmu (viz také příloha 5). Upřednostňovanou metodou pro získání hodnoty BCFk a rych- lostních konstant k1 a k2 je metoda nelineárního odhadu parametrů s využitím počítače (11). K výpočtu hodnot k1 a k2 lze jinak použít grafické metody. Není-li zjevně křivka vylučování křivkou prvního řádu, měly by být použity složitější modely (viz odkazy v příloze 3) a měl by být konzultován biostatistik. 2. 2 Interpretace výsledků Výsledky by měly být interpretovány opatrně v případě, že se naměřené koncentrace zkoušených roztoků pohybují na úrovních blízkých mezi detekce analytické metody. Jasně vymezené křivky příjmu a úbytku jsou ukazatelem dobré kvality údajů o bioakumulaci. Rozdíl kon- stant příjmu a vylučování pro dvě zkušební koncentrace by měl být nižší než 20 %. Pozorované významné rozdíly v rychlostech příjmu a vylučování mezi dvěma použitými zkušebními koncentracemi by měly být zaznamenány a mělo by být uvedeno jejich možné vysvětlení. Interval spolehlivosti hodnot BCF u dobře navržených studií se obecně blíží ± 20 %. 3. ZPRÁVY Protokol o zkoušce musí obsahovat tyto informace: 3. 1 Zkoušená látka — fyzikální povaha a popřípadě fyzikálně-chemické vlastnosti, — chemické identifikační údaje (včetně obsahu organického uhlíku, je-li to třeba), — v případě značení radioaktivními izotopy jejich přesná poloha a aktivita nečistot, vyjádřená v procen- tech. 3. 2 Testovací druh — vědecký název, kmen, zdroj, případné předběžné ošetření, aklimatizace, stáří, rozmezí velikostí atd. 3. 3 Zkušební podmínky — použitý zkušební postup (např. průtokový nebo semistatický), — typ a charakteristiky použitého osvětlení a fotoperioda (fotoperiody), — uspořádání zkoušky (např. počet a velikost zkušebních nádrží, rychlost výměny objemu vody, počet opakování, počet ryb v jednom opakování, počet zkušebních koncentrací, délka fází příjmu a vylu- čování, četnost odběru vzorků ryb a vzorků vody), 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 307 — metoda přípravy zásobních roztoků a častost jejich obnovování (je-li použito solubilizační činidlo, musí být uvedena jeho koncentrace a jeho příspěvek k obsahu organického uhlíku ve vodě), — nominální zkušební koncentrace, střední hodnoty naměřených koncentrací ve zkušebních nádržích, jejich směrodatné odchylky a metody jejich stanovení, — zdroj ředicí vody, popis jakékoli předchozí úpravy, výsledky jakéhokoli prokazování schopnosti zkušeb- ních ryb žít v této vodě a charakteristiky vody: hodnota pH, tvrdost, teplota, koncentrace rozpuštěného kyslíku, koncentrace zbytkového chloru (je-li měřena), obsah celkového organického uhlíku, obsah sus- pendovaných látek, popřípadě salinita zkušebního média a výsledky jakýchkoli jiných provedených měření, — kvalita vody ve zkušebních nádržích, hodnota pH, tvrdost vody, obsah TOC, teplota a koncentrace roz- puštěného kyslíku, — podrobné informace o krmení (například typ krmiva, zdroj, složení – alespoň pokud možno obsah lipidů a bílkovin, podávané množství a četnost), — informace o zpracování vzorků ryb a vody, včetně podrobností o přípravě, uchovávání, o extrakci a analytických postupech (a přesnosti), pokud jde o zkoušenou látku a obsah tuku (je-li měřen). 3. 4 Výsledky — výsledky jakýchkoli provedených předběžných studií, — úhyn kontrolních ryb a ryb v každé expoziční nádrži a jakékoli pozorované neobvyklé chování, — obsah lipidů v rybách (je-li stanoven při zkoušce), — křivky (včetně všech naměřených údajů) příjmu a vylučování zkoušené chemikálie rybami, doba dosa- žení ustáleného stavu, — hodnoty Cr a Cv (popřípadě se směrodatnými odchylkami a rozpětím) pro všechny odběry (hodnota Cr se vyjadřuje v μg/g živé hmotnosti (ppm) celého těla nebo specifikovaných tkání, např. lipidů, a Cv se vyjadřuje v μg/ml (ppm)); hodnoty Cv pro kontrolní experimenty (měly by být uvedeny také hodnoty pozadí), — bioakumulační faktor v ustáleném stavu (BCFus) a/nebo kinetický akumulační faktor (BCFk) a popřípadě 95 % meze spolehlivosti pro rychlostní konstanty příjmu a vylučování (úbytku) (vše vztaženo na celý organismus a na celkový obsah lipidů v rybě, je-li stanoven, nebo na její specifikované tkáně), intervaly spolehlivosti a směrodatné odchylky (jsou-li k dispozici) a metody výpočtu nebo analýzy údajů pro kaž- dou použitou koncentraci zkoušené látky, — v případě použití látek značených radioaktivními izotopy a je-li to nutné, musí být uvedena akumulace jakýchkoli detekovaných metabolitů, — všechny zvláštnosti zkoušky, všechny odchylky od těchto postupů a ostatní relevantní informace. Výsledky typu „nedetekováno při uvedené mezi detekce“ by se měly minimalizovat předběžným vývojem metod a uspořádáním experimentu, neboť takové výsledky nelze pro výpočet rychlostních konstant použít. 4. LITERATURA (1) Connell D. W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Envi- ron. Contam. Toxicol. 102, 117-156. (2) Bintein S. , Devillers J. , Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, 29-390. (3) OECD, Paris (1996 ). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3. (4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Dánsko. 308 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 (5) US EPA 822-R-94–002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. Červen 1994. (6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher‘s Lane, Rockville, MD 20852, July 1975. (7) US EPA (1974). Section 5, A(1). Analysis of Human or Animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesti- cide Residues in Human and Environmental Samples, Thompson J. F. (ed. ) Research Triangle Park, N. C. 27711. (8) Compaan H. (1980) v „The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aqua- tic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation“, kap. 2. 3, část II. Government Publishing Office, Haag, Nizozemsko. (9) Gardner et al, (1995). Limnol. Oceanogr. 30, 1099-1105. (10) Randall R. C. , Lee H. , Ozretich R. J. , Lake J. L. , Pruell R. J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Environ. Toxicol. Chem. 10, 1431-1436. (11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method Ring Test Programme, 1984 to 1985. Závěrečná zpráva březen 1987. Autoři: P. Kristensen, N. Nyholm. (12) ASTM E-1022–84 (Reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs. 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 309 Příloha 1 Chemické charakteristiky přijatelné ředicí vody Látka Koncentrační limit 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Částice pevné Celkový obsah organického uhlíku Neionizovaný amoniak Zbytkový chlor Celkové organické fosforové pesticidy Celkové organické chlorové pesticidy a polychlorované bifenyly Celkový organický chlor Hliník Arsen Chrom Kobalt Měď Železo Olovo Nikl Zinek Kadmium Rtuť Stříbro 5 mg/l 2 mg/l 1 μg/l 10 μg/l 50 ng/l 50 ng/l 25 ng/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 100 ng/l 100 ng/l 100 ng/l 310 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 Příloha 2 Doporučené druhy ryb pro zkoušení Doporučený druh Doporučené roz- pětí teploty při zkoušce (°C) Doporučená celková délka těla testo- vacích jedinců (cm) 1 2 3 4 5 6 7 8 Danio rerio (1) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan), danio pruhované 20–25 3,0 ± 0, 5 Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque), střevle Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus), kapr obecný Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck a Schlegel), halančík japonský 20–25 20–25 20–25 Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters), živorodka duhová 20–25 Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesque), slunečnice 20–25 Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) duhový (Walbaum), pstruh 13–17 5,0 ± 2, 0 5,0 ± 3, 0 4,0 ± 1, 0 3,0 ± 1, 0 5,0 ± 2, 0 8,0 ± 4, 0 Gasterosteus aculeatus (Teleostei, Gasterosteidae) (Linnaeus), koljuška tříostná 18–20 3,0 ± 1, 0 (1) Meyer A. , Orti G. (1993) Proc. R. Soc. London, Ser. B. , sv. 252, str. 231. V různých zemích byly použity různé druhy estuarinních a mořských druhů, například: ryba z čeledi Scienidae (smuhovití) Leiostomus xanthurus halančík Cyprinodon variegatus ryba z čeledi Argentinidae (stříbronicovití) Menidia beryllina ryba z čeledi Enbiotocidae (příbojkovití) Cymatogaster aggregata platýz z čeledi Pleuronectidae vranka z čeledi Cottidae koljuška tříostná mořčák z čeledi Moronidae ouklej obecná Parophrys vertulus Leptocottus armatus Gasterosteus aculeatus Dicentracus labrax Alburnus alburnus Opatřování ryb Sladkovodní ryby uvedené v tabulce se snadno chovají nebo jsou dobře dostupné po celý rok, zatímco dostupnost mořských nebo estuarinních ryb je omezena na určité země. Lze je množit a chovat buď v rybích farmách, nebo v laboratoři za kontrolovaných zdravotních a parazitologických podmínek tak, aby ryby byly zdravé a byly známého původu. Tyto ryby jsou dostupné v mnoha částech světa. 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 311 Příloha 3 Předpověď délky fáze příjmu a fáze vylučování 1. Předpověď délky fáze příjmu Před provedením zkoušky lze získat odhad hodnoty k2 a odtud lze získat dobu nezbytnou pro dosažení určitého stupně rovnovážného stavu (v procentech) z empirických vztahů mezi k2 a rozdělovacím koeficientem n-oktanol/voda (Po/v) nebo mezi k2 a rozpustností ve vodě (s). Odhad hodnoty k2 (den-1) lze získat například z tohoto empirického vztahu (1): log10 k2 = – 0,414 log10 (Po/v) + 1,47 (r2 = 0,95) (rovnice 1). Další vztahy viz odkaz 2. Není-li rozdělovací koeficient (Po/v) znám, lze jej odhadnout (3) ze znalosti rozpustnosti látky ve vodě (s) pomocí vztahu: log10 (Po/v) = – 0,862 log10 (s) + 0,710 (r2 = 0,994) (rovnice 2). kde s = rozpustnost (v mol/l): (n = 36). Tyto vztahy platí pouze pro chemikálie s hodnotou log Po/v od 2 do 6,5 (4). Dobu, za kterou dojde k dosažení určitého stupně rovnovážného stavu vyjádřeného v procentech, lze získat pomocí odhadu hodnoty k2, z obecné rovnice kinetiky popisující příjem a vylučování (kinetika prvního řádu): nebo je-li Cv konstanta: Pro blízký ustálený stav (t ∞) může být rovnice 3 zjednodušena (5, 6) na: Pak (k1/k2) × Cv je přiblížením ke koncentraci v rybách v „ustáleném stavu“ (Cr, s). Rovnice 3 může být přepsána na rovnici: Cf = Cf,s = (1 – e t –k 2 ) nebo = 1 – e t –k 2 Cf Cfs (rovnice 4). Při použití rovnice 4 lze předpovědět dobu potřebnou k dosažení určitého stupně ustáleného stavu vyjádřeného v procentech, je-li hodnota k2 předem odhadnuta z rovnice 1 nebo 2. Je pravidlem, že statisticky optimální délka fáze příjmu pro získání statisticky přijatelných údajů (BCFk) je doba nezbytná k tomu, aby křivka sestrojená vynesením logaritmu koncentrace zkoušené látky v rybách proti času v lineárním měřítku dosáhla svého středního bodu, popřípadě 1,6/k2, neboli 80 % ustáleného stavu, ale ne více než 3,0/k2, neboli 95 % rovnovážného stavu (7). Doba nezbytná pro dosažení 80 % ustáleného stavu je (rovnice 4): 0,80 = 1 – e t –k 80 nebo t80 = 2 1,6 k2 (rovnice 5). 312 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 Podobně 95 % ustáleného stavu je dosaženo: t95 = 3,0 k2 (rovnice 6). Například délka fáze příjmu (fp) pro zkoušenou látku s log Po/v = 4 je (při použití rovnic 1, 5 a 6): log10 k2 = – 0,414×(4) + 1,47 k2 = 0,652 den-1 fp (80 %) = 1,6/0,652, tj. 2,45 dnů (59 hodin) nebo fp (95 %) = 3,0/0,652, tj. 4,60 dnů (110 hodin). Podobně pro zkoušenou látku s hodnotou s = 10-5 mol/l (log s = 5,0) je délka fáze příjmu (při použití rovnic 1, 2, 5 a 6): log10 (Po/v) = – 0,862 (–5,0) + 0,710 = 5,02 log10k2 k2 = – 0,414 (5,02) + 1,47 = 0,246 den-1 fp (80 %) = 1,6/0,246, tj. 6,5 dnů (156 hodin) nebo fp (95 %) = 3,0/0,246, tj. 12,2 dnů (293 hodin). Rovnice: teq = 6,54 × 10-3 Po/v + 55,31 (hodin) může být eventuálně použita pro výpočet doby potřebné pro dosažení efektivního ustáleného stavu (4). 2. Předpověď délky fáze vylučování Předpověď doby nezbytné pro snížení obsahu látky v organismu na určitou procentuální úroveň počáteční kon- centrace může být rovněž získána z obecné rovnice kinetiky popisující příjem a vylučování (kinetika prvního řádu) (1, 8): V případě fáze vylučování se Cv předpokládá rovna nule. Rovnice může být zjednodušena na rovnici: kde Cr, 0 je koncentrace na počátku fáze vylučování. 50 % vyloučení bude dosaženo v čase (t50): Podobně 95 % vyloučení bude dosaženo v čase Je-li pro první fázi zvoleno dosažení 80 % příjmu (1,6/k2) a pro fázi vylučování je zvoleno dosažení 95 % úbytku (3,0/k2), je délka fáze vylučování přibližně dvojnásobkem délky fáze příjmu. Je však důležité poznamenat, že odhady jsou založeny na předpokladu, že se příjem a vylučování řídí kinetikou prvního řádu. Neřídí-li se zřejmě kinetikou prvního řádu, měly by být použity složitější modely (např. odkaz (1)). 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 313 Literatura (k příloze 3) (1) Spacie A. , Hamelink J. L. (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxi- col. Chem. 1, 309-320. (2) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of BCFs derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute. (3) Chiou C. T. , Schmedding D. W. (1982). Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Tech- nol. 16, 4-10. (4) Hawker D. W. , Connell D. W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kine- tics with fish. Water. Res. 22 (6), 701-707. (5) Branson D. R. , Blau G. E. , Alexander H. C. , Neely W. B. (1975). Transactions of the American Fisheries Society, 104, 785-792. (6) Ernst W. (1985). Accumulation in aquatic organisms. V: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of che- micals. (eds. ) Sheehman P. , Korte F. , Klein W. , Bourdeau P. H. Část 4. 4, 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd N. Y. (7) Reilly P. M. , Bajramovic R. , Blau G. E. , Branson D. R. , Sauerhoff M. W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, 614-622. (8) Könemann H. , Van Leeuwen K. (1980). Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of Six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, 3-19. 314 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 Příloha 4 Teoretický příklad plánu odběru vzorků pro bioakumulační zkoušky látek s log Po/v = 4 Odběr vzorků ryb Fáze příjmu 1. 2. 3. 4. 5. Fáze vylučování 6. 7. 8. 9. Plán dob odběru vzorků Minimální požado- vaná četnost (dny) Dodatečný odběr vzorků Počet vzorků vody Počet ryb na vzorek –1 0 0,3 0,6 1,2 2,4 4,7 5,0 5,9 9,3 14,0 0,4 0,9 1,7 3,3 5,3 7,0 11,2 17,5 2 (*) 2 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2 Přídavek 45 až 80 ryb 4 (4) 4 (4) 4 (4) 4 (4) 6 Přenesení ryb do vody neobsahující zkoušenou che- mikálii 4 (4) 4 (4) 4 (4) 6 (4) (*) Odběr vzorku vody po dodání alespoň tří „objemů nádrže“. Hodnoty v závorkách jsou počty vzorků (vody, ryb), které mají být odebrány, je-li prováděn dodatečný odběr. Poznámka: Předběžný odhad k2 pro log Po/v rovný 4,0 je 0,652 den- 1. Celková délka experimentu je stanovena na 3 × fp = 3 × 4,6 dnů, tj. 14 dnů. Odhad hodnoty „fp“ viz příloha 3. 13/sv. 21 CS Úřední věstník Evropské unie 315 Příloha 5 Omezení modelu U většiny údajů týkajících se bioakumulace se předpokládá, že jsou „rozumně“ dobře popsány jednoduchým dvoukompartmentovým nebo dvouparametrovým modelem, jak je patrné z přímky, která je aproximací bodů pro koncentrace v rybách během fáze vylučování, je-li vynesena na semilogaritmickém papíru. (Nelze-li tyto body popsat přímkou, měl by být použit složitější model (viz například Spacie a Hamelink, odkaz 1 v příloze 3). Grafická metoda stanovení rychlostní konstanty vylučování (úbytku) k2 Koncentrace zkoušené látky nalezená v každém vzorku ryb se vynese na semilogaritmickém papíru proti času odběru vzorků. Směrnice této přímky je rovna k2. k2 = ln (Cf1/Cf2) t2-t1 Je třeba si všimnout, že odchylky od přímky mohou znamenat složitější model vylučování, než je kinetika prvního řádu. Pro analýzu typů vylučování, které se odchylují od kinetiky prvního řádu, mohou být použity grafické metody. Grafická metoda stanovení rychlostní konstanty příjmu k1 Při dané konstantě k2 se k1 vypočte takto: Hodnota Cr se odečte ze středního bodu hladké křivky příjmu vytvořené vynesením logaritmu koncentrace proti času (v lineárním měřítku). 316 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 21 Počítačová metoda výpočtu rychlostních konstant příjmu a vylučování (úbytku) Pro získání hodnoty bioakumulačního faktoru a rychlostních konstant k1 a k2 se dává přednost metodě nelineárního odhadu parametrů s využitím počítače. Těmito programy se naleznou hodnoty k1 a k2 založené na souboru po sobě jdoucích údajů o koncentracích a na modelu: Cf = Cw∙ Cf = Cw∙ k1 k2 k1 k2 x (l –e –k 2 t) x (e –k 2(t –t –k 2 c)–e t) 0 < t < tc (rovnice 2). t < tc (rovnice 3). kde tc = čas konce fáze příjmu. Tento přístup poskytuje odhady směrodatné odchylky k1 a k2. Vzhledem k tomu, že ve většině případů lze odhadnout k2 z křivky vylučování s relativně vysokou přesností, a vzhle- dem k tomu, že mezi těmito dvěma parametry k1 a k2 existuje silná korelace, jsou-li odhadovány současně, může být účelné nejdříve vypočítat k2 pouze z údajů o vylučování a následně vypočítat k1 z údajů příjmu nelineární regresí