title: Dyrektywa Komisji 98/73/WE z dnia 18 września 1998 r. dostosowująca po raz dwudziesty czwarty do postępu technicznego dyrektywę Rady 67/548/EWG w sprawie zbliżenia przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych odnoszących się do klasyfikacji, pakowania i etykietowania substancji niebezpiecznychTekst mający znaczenie dla EOG.

eurovoc_concepts:
classification
dangerous substance
labelling
marketing standard
packaging

formats: html pdf print

text: 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 139 31998L0073 16. 11. 1998 DZIENNIK URZĘDOWY WSPÓLNOT EUROPEJSKICH L 305/1 DYREKTYWA KOMISJI 98/73/WE z dnia 18 września 1998 r. dostosowująca po raz dwudziesty czwarty do postępu technicznego dyrektywę Rady 67/548/EWG w sprawie zbliżenia przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych odnoszących się do klasyfikacji, pakowania i etykietowania substancji niebezpiecznych (Tekst mający znaczenie dla EOG) KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH, PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DYREKTYWĘ: uwzględniając Traktat ustanawiający Wspólnotę Europejską, Artykuł 1 uwzględniając dyrektywę Rady 67/548/EWG z dnia 27 czerwca 1967 r. w sprawie zbliżenia przepisów ustawowych, wykonaw- czych i administracyjnych odnoszących się do klasyfikacji, pako- wania i etykietowania substancji niebezpiecznych (1), ostatnio zmienioną dyrektywą Komisji 97/69/WE (2), w szczególności jej art. 28, a także mając na uwadze, co następuje: załącznik I do dyrektywy 67/548/EWG zawiera wykaz substancji niebezpiecznych wraz z danymi szczegółowymi dotyczącymi procedur klasyfikacji i etykietowania w odniesieniu do każdej z tych substancji; obecny stan wiedzy naukowej i technicznej wska- zał, że wykaz substancji niebezpiecznych w tym załączniku powi- nien zostać dostosowany i uzupełniony; W dyrektywie 67/548/EWG wprowadza się następujące zmiany: 1. W załączniku I wprowadza się następujące zmiany: a) wpisy w załączniku I do niniejszej dyrektywy zastępują odpowiadające im wpisy w załączniku I do dyrektywy 67/548/EWG; b) wpisy w załączniku II do niniejszej dyrektywy dodaje się w załączniku I do dyrektywy 67/548/EWG. 2. W załączniku V wprowadza się następujące zmiany: a) teksty w załącznikach III A , III B i III C do niniejszej dyrek- tywy dodaje się w części A załącznika V do dyrektywy 67/548/EWG; załącznik V do dyrektywy 67/548/EWG ustanawia metody okreś- lania właściwości fizyczno-chemicznych , toksyczności i ekotok- syczności substancji oraz preparatów; niezbędne jest dostosowa- nie tego załącznika do postępu technicznego; b) tekst w części D załącznika III do niniejszej dyrektywy dodaje się w części C załącznika V do dyrektywy 67/548/EWG. środki przewidziane w niniejszej dyrektywie są zgodne z opinią Komitetu ds. Dostosowania do Postępu Technicznego Dyrektyw Mających na Celu Usunięcie Barier Technicznych w Handlu Niebezpiecznymi Substancjami i Preparatami, (1) Dz. U. 196 z 16. 8. 1967, str. 1. (2) Dz. U. L 343 z 13. 12. 1997, str. 19. Artykuł 2 Państwa przepisy Członkowskie wprowadzą w życie ustawodawcze, wykonawcze i administracyjne niezbędne do wykonania dnia dyrektywy 31 października 1999 r. Niezwłocznie powiadomią o tym Komisję. najpóźniej niniejszej do 140 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 Przepisy przyjęte przez Państwa Członkowskie zawierają odniesienie odniesienie takietowarzyszy ich urzędowej publikacji. Państwa Członkowskie określają sposób, w jaki odniesienia takie mają być umieszczane. dyrektywy niniejszej lub do Artykuł 4 Niniejsza dyrektywa skierowana jest do Państw Członkowskich. Sporządzono w Brukseli, dnia 18 września 1998 r. Artykuł 3 Niniejsza dyrektywa wchodzi w życie dwudziestego dnia po jej opublikowaniu w Dzienniku Urzędowym Wspólnot Europejskich. W imieniu Komisji Ritt BJERREGAARD Członek Komisji ANEXO I — BILAG I — ANHANG I — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I — ANNEX I — ANNEXE I — ALLEGATO I — BIJLAGE I — ANEXO I — LIITE I — BILAGA I 142 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 143 144 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 145 146 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 147 148 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 149 150 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 151 152 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 153 154 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 155 156 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 157 158 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 159 160 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 161 162 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 163 164 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 165 166 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 167 168 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 169 170 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 171 172 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 173 174 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 175 176 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 177 178 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 179 180 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 181 182 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 183 184 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 185 186 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 187 188 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 189 190 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 191 192 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 193 194 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 195 196 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 197 198 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 199 200 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 201 202 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 203 204 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 205 206 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 ANEXO II — BILAG II — ANHANG II — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II — ANNEX II — ANNEXE II — ALLEGATO II — BIJLAGE II — ANEXO II — LIITE II — BILAGA II 208 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 209 210 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 211 212 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 213 214 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 215 216 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 217 218 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 219 220 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 221 222 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 223 224 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 225 226 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 227 228 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 229 230 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 231 232 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 233 234 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 235 236 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 237 238 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 239 240 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 241 242 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 243 244 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 245 246 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 247 248 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 249 250 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 251 252 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 253 254 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 255 256 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 257 258 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 259 260 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 261 262 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 263 264 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 265 266 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 267 268 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 269 270 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 271 272 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 273 274 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 275 276 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 277 278 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 ZAŁĄCZNIK III A A. 18. ŚREDNIA LICZBOWA MASA CZĄSTECZKOWA I ROZKŁAD MASY CZĄSTECZKOWEJ POLIMERÓW 1. METODA Niniejsza metoda chromatografii żelowo-permeacyjnej (GPC) jest powtórzeniem OECD TG 118 (1996). Podstawowe zasady i dalsze informacje techniczne są podane w odnośniku 1. 1. 1. Wprowadzenie Skoro właściwości polimerów są tak zróżnicowane, nie istnieje możliwość opisania jednej metody ustala- jącej dokładnie warunki rozdzielania i oceny, która obejmuje wszystkie ewentualności i specyficzne przy- padki występujuące przy rozdzielaniu polimerów. W szczególności złożone systemy polimerów nie ule- gają często chromatografii żelowo-permeacyjnej (GPC). Jeśli GPC nie jest praktykowana, masa cząsteczkowa może być oznaczona za pomocą innych metod (patrz załącznik). W takich przypadkach powinny zostać podane pełne dane szczegółowe i uzasadnienia dla wykorzystanych metod. Opisana metoda oparta jest na normie DIN 55672 (1). Szczegółowe informacje o tym, w jaki sposób mają być przeprowadzane doświadczenia oraz w jaki sposób oceniać dane można znaleźć w powyższej normie DIN. W przypadku gdy niezbędne są modyfikacje warunków doświadczalnych, zmiany te muszą być uza- sadnione. Inne normy mogą być używane jedynie, gdy istnieją do nich pełne odniesienia. Opisana metoda wykorzystuje próbki polistyrenu o znanej polidyspersyjności do kalibracji i może istnieć konieczność zmodyfikowania jej, aby była odpowiednia dla niektórych polimerów, np. rozpuszczalnych w wodzie oraz polimerów o długich rozgałęzionych łańcuchach. 1. 2. Definicje i jednostki Średnia liczbowo masa cząsteczkowa Mn i średnia wagowo masa cząsteczkowa Mw są oznaczane, wyko- rzystując następujące równania: gdzie: Hi jest poziomem sygnału detektora z linii podstawowej dla objętości retencji Vi, Mi jest masą cząsteczkową polimerowej frakcji przy objętości retencji Vi, n jest liczbą punktów pomiarowych. Rozpiętość rozkładu masy cząsteczkowej, która jest miarą stopnia dyspersji systemu, jest podana na pod- stawie stosunku Mw/Mn 1. 3. Substancje odniesienia GPC jest metodą względną i w związku z tym musi zostać podjęta kalibracja. Polistyren w niewielkim stop- niu rozproszony, o liniowej budowie, posiada średnie masy cząsteczkowe Mn i Mw oraz znany rozkład masy cząsteczkowej jest zwykle wykorzystywany do tego celu. Krzywa kalibracji może być wykorzysty- wana w oznaczaniu masy cząsteczkowej nieznanej próbki wyłącznie jeżeli warunki rozdzielenia próbki oraz wzorce zostały wybrane w identyczny sposób. Określony związek między masą cząsteczkową oraz objętością elucji jest ważny wyłącznie w specyficz- nych warunkach, w których przeprowadzane jest konkretne doświadczenie. Warunki obejmują przede wszystkim temperaturę, rozpuszczalnik (lub mieszaninę rozpuszczalników), warunki chromatografii oraz kolumnę rozdzielającą lub systemy kolumn. 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 279 Masy cząsteczkowe próbki oznaczone w ten sposób są odpowiednimi wartościami oraz są opisane jako „ciężar równoważnikowy polistyrenu”. Oznacza to, że w zależności od strukturalnych i chemicznych róż- nic między od wartości absolutnych / całkowitych w większym lub mniejszym stopniu. Jeżeli wykorzystywane są inne wzorce, np. glikolu polietylenowego, tlenku polietylenu, metaakrylanu polimetylu, kwasu poliakrylowego, należy podać odpowiednie przyczyny. a wzorcami, masy cząsteczkowe mogą odchylać próbką się 1. 4. Zasada metody badawczej Zarówno rozkład masy cząsteczkowej próbki, jak i średnie masy cząsteczkowe (Mn, M w) mogą być ozna- czane, wykorzystując GPC. GPC jest szczególnym rodzajem chromatografii cieczowej, w której próbka jest rozdzielana według hydrodynamicznych objętości pojedynczych składników (2). Rozdzielenie następuje, kiedy próbka przechodzi przez kolumnę, która jest wypełniona porowatym mate- riałem – zazwyczaj organicznym żelem. Małe cząsteczki mogą wnikać w pory, podczas gdy duże cząsteczki są wykluczane. Droga dużych cząsteczek jest z tego względu krótsza i to one są poddane procesowi elucji w pierwszej kolejności. Średnich rozmiarów cząsteczki wnikają w niektóre pory i są później poddawane elucji. Najmniejsze cząsteczki o średnim hydrodynamicznym promieniu, mniejszym niż pory żelu, mogą wnikać we wszystkie pory. Poddawane są elucji na końcu. W sytuacji idealnej rozdzielanie jest kontrolowane wyłącznie przez wielkość czasteczki gatunku, ale w prak- tyce trudno jest uniknąć co najmniej niewielkich zakłócających efektów absorbcyjnych. Nierówne wypeł- nienia kolumny oraz objętości martwe mogą pogorszyć sytuację (2). Detekcji dokonuje się przez np. współczynnik załamania światła lub pochłaniania promieni UV, i daje w wyniku nieskomplikowaną krzywą rozkładu. Jednakże w celu przypisania rzeczywistych wartości masy cząsteczkowej do krzywej, niezbędne jest poddanie kolumny kalibracji przez przepuszczanie polimerów o znanej masie cząsteczkowej oraz, w idealnym przypadku, o podobnej strukturze, np. różnych wzorców polistyrenowych. Krzywa Gaussa, powstająca zazwyczaj w ten sposób, czasami wypaczona jest małymi „ogonami” skierowanymi w stronę małych mas cząsteczkowych, oś pionowa wskazująca jakość w masie, różnych wyeluowanych odmian polistyrenu, a oś pozioma wskazuje logarytm z masy cząsteczkowej. 1. 5. Kryteria jakościowe Powtarzalność (względne odchylenie standardowe: RSD) objętości eluowania powinna być lepsza niż 0,3 %. Wymagana powtarzalność analizy musi być zapewniona przez korektę dokonywaną poprzez wzorce wewnętrzne, jeżeli chromatogram jest uzyskiwany w zależności od czasu i nie odpowiada wyżej wspo- mnianym kryteriom (1). Polidyspersyjności są zależne od mas cząsteczkowych wzorców. W przypadku wzorców polistyrenowych typowe wartości to: Mp < 2 000 2 000 ≤ Mp ≤ 106 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 Mw/Mn < 1,05 Mw/Mn < 1,20 (Mp jest masą cząsteczkową wzorca w maksimum piku) 1. 6. Opis metody badawczej 1. 6. 1. Przygotowanie roztworów wzorcowych polistyrenu Wzorce polistyrenu są rozpuszczane przez ostrożne mieszanie w wybranym eluencie. Zalecenia wytwórcy muszą być uwzględnione w trakcie przygotowania roztworu. Stężenia wybranych wzorców są zależne od wielu czynników, np. od objętości wstrzykiwanej substancji, lepkości roztworu oraz czułości detektora analitycznego. Maksymalna objętość injekcji musi być dostoso- wana do długości kolumny, w celu uniknięcia przeładowania. Typowe objętości injekcji dla analitycznego rozdzielenia przy użyciu GPC z kolumną o wymiarach 30 cm × 7,8 mm wynoszą na ogół 40–100 μl. Wyż- sze objętości są możliwe, ale nie powinny przekraczać 250 μl. Optymalny stosunek między objętością injekcji a stężeniem musi być określony przed rzeczywistą kalibracją kolumny. 280 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 1. 6. 2. Przygotowywanie roztworu próbki Zasadniczo te same wymagania stosuje się do przygotowywania roztworów próbek. Próbka jest rozpusz- czana w odpowiednim rozpuszczalniku, np. tetrahydrofuranie (THF), przez lekkie wstrząsanie. W żadnym okolicznościach nie powinno się rozpuszczać próbki w wannie ultradźwiękowej. W razie konieczności, próbka roztworu jest oczyszczana poprzez membranowy filtr posiadający pory o wymiarach między 0,2 a 2 μm. Obecność nierozpuszczalnych cząstek musi być zapisana w sprawozdaniu końcowym, ponieważ może to być odpowiednie dla próbek o dużej masie cząsteczkowej. Powinna zostać wykorzystana odpowiednia metoda w celu określenia udziału procentowego w masie rozpuszczonych cząstek. Roztwór powinien zostać wykorzystany w ciągu 24 godzin. 1. 6. 3. Aparatura — zbiornik na rozpuszczalnik, — odgazowywacz (w danym przypadku), — pompa, — nawilżacz pulsowy (w danym przypadku), — system wtryskowy, — kolumny chromatograficzne, — detektor, — przepływomierz (w danym przypadku), — urządzenie rejestrujące dane, — naczynie na odpady. Należy zapewnić, że system GPC jest obojętny w odniesieniu do stosowanych rozpuszczalników (np. przez wykorzystanie stalowych kapilar w przypadku rozpuszczalnika THF). 1. 6. 4. System wtryskowy i system dostarczający rozpuszczalnik Określona objętość roztworu próbki jest umieszczona w kolumnie albo wykorzystując automatyczny prób- nik, albo ręcznie w ściśle określonej strefie. Zbyt szybkie wycofywanie lub zniżanie tłoka nurnikowego, jeśli jest wykonywane ręcznie, może spowodować zmiany w obserwowanym rozkładzie masy cząsteczkowej. System dostarczający rozpuszczalnik, na ile jest to możliwe, powinien być wolny od pulsacji, co można osiągnąć przez wbudowanie do niego tłumika pulsacji. Szybkość przepływu wynosi 1 ml/min. 1. 6. 5. Kolumna W zależności od próbki, właściwości polimeru oznacza się albo za pomocą prostej kolumny, albo kilku kolumn połączonych w sekwencję. Pewna ilość materiałów porowatych kolumn o określonych właściwo- ściach dostępna jest w ogólnej sprzedaży (np. rozmiar porów, granica ekskluzji). Wybór żelu rozdzielają- cego lub długość kolumny jest uzależniona zarówno od właściwości próbki (objętości hydrodynamiczne, rozkład masy cząsteczkowej), jak i od specyficznych warunków rozdzielania, takich jak rozpuszczalnik, temperatura i prędkość przepływu (1) (2) (3). 1. 6. 6. Półki teoretyczne Kolumna lub połączenie kolumn wykorzystywanych do rozdzielania musi być scharakteryzowana przez ilość półek teoretycznych. Obejmuje to, w przypadku THF jako rozpuszczalnikia eluencyjnego, umieszcze- nie roztworu etylobenzenu lub innych odpowiednich niepolarnych substancji rozpuszczonych w kolum- nie o znanej długości. Liczba półek teoretycznych jest uzyskiwana na podstawie następującego równania: W1/2)2 N = 5,54( Ve W)2 lub N = 16(Ve gdzie: N jest liczbą półek teoretycznych, jest objętością eluecyjną w maksimum piku, Ve W jest podstawową szerokością piku, W1/2 jest szerokością piku w połowie wysokości. 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 281 1. 6. 7. Wydajność rozdzielania Oprócz liczby półek teoretycznych, która jest określającą ilościowo szerokością pasma, ważną rolę odgrywa także wydajność rozdzielenia, będąca określaną przez nachylenie krzywej kalibracyjnej. Wydajność roz- dzielania kolumny jest uzyskiwana z następującego stosunku: V –V e,M x e,(10 M x) przekroju poprzecznego kolumny 3 2] ≥ 6,0[cm cm gdzie: Ve, Mx jest objętością elucyjną dla polistyrenu o masie cząsteczkowej Mx, Ve, (10 Mx) jest objętością elucyjną dla polistyrenu o 10-krotnie większej masie cząsteczkowej Mx. Rozkład systemu jest zwykle określany w następujący sposób: R1,2 = 2× Ve1-Ve2 W1+W2 × 1 log10(M2/M1) gdzie: Ve1, Ve2 są objętościami eluencyjnymi dwóch wzorców polistyrenowych w maksimum piku, W1, W2 są szerokościami piku linii podstawowej, M1 M2 są masami cząsteczkowymi w maksimum piku (powinny różnić się współczynnikiem o 10). Wartość R dla systemu kolumn powinna być większa niż 1,7 (4). 1. 6. 8. Rozpuszczalniki Wszystkie rozpuszczalniki muszą posiadać wysoką czystość (dla THF używana jest czystość 99,5 %). Zbior- nik na rozpuszczalnik (o ile jest to konieczne – w atmosferze gazu obojętnego) musi być odpowiednio duży dla kalibracji kolumny i analiz wielu próbek. Rozpuszczalnik musi być odgazowany zanim zostanie prze- niesiony do kolumny za pomocą pompy. 1. 6. 9. Kontrola temperatury Temperatura krytycznych komponentów wewnętrznych (pętla wtryskowa, kolumny, detektor i przewody) powinna być stała i zgodna z wyborem rozpuszczalnika. 1. 6. 10. Detektor Zadaniem detektora jest rejestracja ilościowa stężenia próbki eluowanej z kolumny. W celu uniknięcia niepotrzebnego poszerzenia pików, objętość kuwety komórki detektora musi być tak mała, jak to tylko jest możliwe. Nie powinna być większa niż 10 μl z wyjątkiem detektorów mierzących światło rozproszone oraz lepkość. W celu detekcji zazwyczaj używana jest refraktometria różnicowa. Jednakże jeżeli wymagają tego właściwości próbki lub właściwości eluacyjne rozpuszczalnika, mogą być używane inne rodzaje detektora, np. UV/VIS, IR, detektory lepkości, itd. 2. DANE I SPORZĄDZANIE SPRAWOZDAŃ 2. 1. Dane Powinno nastąpić odniesienie do normy DIN (1) w celu uzyskania szczegółowych kryteriów oceny, jak rów- nież do wymogów odnoszących się do zbierania i przetwarzania danych. Dla każdej próbki muszą zostać przeprowadzone dwa niezależne doświadczenia. Próbki muszą być anali- zowane pojedynczo. Dla każdego pomiaru muszą być zapewnione Mn, Mw, Mw/Mn, Mp. Niezbędne jest wyraźne wskazanie, że zmierzone wartości są wartościami względnymi, równoważnymi masom cząsteczkowym użytych wzor- ców. 282 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 Po określeniu objętości retencji lub czasów retencji (możliwie poprawionych, wykorzystując wzorzec wewnętrzny), wartości logarytmu Mp (Mp będącego maksymalną wartością piku wzorca kalibracji) są wykreślane w oparciu o jedną z tych wielkości. Niezbędne są co najmniej dwa punkty kalibracji na dekadę masy cząsteczkowej oraz wymagane jest co najmniej pięć punktów pomiarowych dla całkowitej krzywej, która powinna obejmować oszacowaną masę cząsteczkową próbki. Niska wartość punktu końcowego masy cząsteczkowej krzywej wzorcowania jest oznaczana za pomocą n-heksylobenzenu lub innego odpo- wiedniego niepolarnego roztworu. Średnia liczbowo i średnia wagowo masa cząsteczkowa są zwykle okreś- lane za pomocą przetwarzania danych elektronicznych, w oparciu o wzory z sekcji 1. 2. W przypadku gdy używana jest ręczna digitalizacja, można powołać się na ASTMD 3536-91 (3). Krzywa rozkładu musi być dostarczona w formie tabeli lub ilustracji (różnicowa częstotliwość lub procent sumy w oparciu o logarytm M). Na wizerunku graficznym jedna dekada masy cząsteczkowej powinna mieć normalnie około 4 cm szerokości, a maksymalna wartość szczytowa około 8 cm wysokości. W przypadku krzywych całkowego rozkładu, różnica w rzędnych między 0 a 100 % powinna wynosić około 10 cm. 2. 2. Sprawozdanie z badania Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje: 2. 2. 1. Substancja badana — dostępne informacje dotyczące substancji badanej (tożsamość, dodatki, zanieczyszczenia), — opis przetwarzania próbki, uwagi, problemy. 2. 2. 2. Oprzyrządowanie — zbiornik z eluentem, obojętny gaz, odgazowywanie eluenta, skład eluenta, zanieczyszczenia, — pompa, pulsowy tłumik, system wtryskowy, — kolumny rozdzielające (wytwórca, wszystkie informacje dotyczące właściwościach kolumn, takie jak rozmiar poru, rodzaj rozdzielającego materiału itd. , liczba, długość oraz kolejność użytych kolumn), — liczba teoretycznych półek kolumny (lub połączonych kolumn), wydajność rozdzielania, (rozdzielczość tego systemu), — informacja dotycząca symetrii pików, — temperatura kolumny, rodzaj sterowania temperaturą, — detektor (zasada pomiarów, rodzaj, objętość kuwety), — przepływomierz w przypadkach kiedy jest używany (wytwórca, zasada pomiarów), — system umożliwiający rejestrację i przetwarzanie danych (osprzęt i oprogramowanie). 2. 2. 3. Kalibracja systemu — szczegółowy opis metody używanej w celu skonstruowania krzywej kalibracji, — informacja dotycząca kryteriów jakościowych dla tej metody (np. współczynnik korelacji, błąd sumy kwadratów itd. ), — informacje dotyczące ekstrapolacji, założenia i przybliżenia, poczynione w trakcie procedury doświad- czalnej oraz szacowania i przetwarzania danych, — wszystkie pomiary przeprowadzone w celu konstrukcji krzywej kalibracji powinny być udokumento- wane w tabelach, które zawierają następujące informacje dla każdego z punktów kalibracji: — nazwa próbki, — wytwórca próbki, — wartości charakterystyczne wzorców: Mp, Mn, Mw oraz Mw/Mn, dostarczone przez wytwórcę lub na podstawie odpowiednich pomiarów, razem ze szczegółami dotyczącymi metody oznaczania, — objętość oraz stężenie wstrzykiwanej próbki, — wartość Mp używana dla kalibracji, 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 283 — objętość eluencyjna lub poprawiony czas retencji, mierzony przy maksimach piku, — Mp obliczone przy maksimum piku, — błąd procentowy wyliczonej Mp oraz wartość kalibracyjna. 2. 2. 4. Ocena: — ocena na podstawie czasu: wszystkie metody mające na celu zapewnienie wymaganej odtwarzalności (metoda poprawiania, wzorce wewnętrzne itd. ), — informacja dotycząca tego, czy ocena została przeprowadzona na podstawie objętości eluencyjnej lub czasu retencji, — informacja dotycząca ograniczeń oceny, jeżeli pik nie został poddany analizie w całości, — opis metod wygładzających, jeżeli są wykorzystywane, — procedury przygotowawcze oraz wstępnego przetworzenia próbki, — obecność nierozpuszczalnych cząstek, jeżeli istnieją, — objętość wtrysku (μl) oraz stężenie wtrysku (mg/ml), — uwagi wskazujące skutki, które prowadzą do odchyleń od idealnego profilu GPC, — szczegółowy opis wszystkich zmian w procedurach badawczych, — szczegóły dotyczące zakresów błędów, — wszystkie inne informacje oraz uwagi istotne w odniesieniu do interpretacji wyników. 3. BIBLIOGRAFIA (1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tertrahydrofuran (THF) als Elution- smittel, Teil 1. (2) Yau, W. W. , Kirkland, J. J. , and Bly, D. D. eds, (1979). „Modern Size Exclusion Liquid Chromatography”, J. Wiley and Sons. (3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. (4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and MolecularWeight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 284 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 Załącznik Przykłady innych metod określania średniej liczbowo masy cząsteczkowej (Mn) w odniesieniu do polimerów Chromatografia żelowo-permeacyjna (GPC) jest preferowaną metodą określania Mn, w szczególności kiedy dostępny jest zestaw wzorców, których struktura jest porównywalna ze strukturą polimerów. Jednakże w przypadku gdy ist- nieją trudności praktyczne w wykorzystywaniu GPC lub już istnieje przypuszczenie, że substancja nie będzie pod- legała kryterium regulującym Mn (a które wymaga potwierdzenia), dostępne są metody alternatywne, takie jak: 1. Wykorzystywanie własności koligatywnych 1. 1. Ebuliometria/kriometria: obejmuje pomiar podwyższenia temperatury wrzenia (ebuliometria) lub spadku tem- peratury zamarzania (kriometria) rozpuszczalnika, kiedy dodany zostaje polimer. Metoda oparta jest na fak- cie, że skutek rozpuszczonego polimeru na temperaturę wrzenia/zamarzania płynu zależy od masy cząstecz- kowej polimeru (1) (2). Zastosowanie: Mn < 20 000. 1. 2. Zmniejszanie ciśnienia pary: obejmuje pomiar ciśnienia pary wybranego płynu odniesienia przed i po dodaniu znanych ilości polimeru (1) (2). Zastosowanie: Mn < 20 000 (teoretycznie; jednakże w praktyce wartości są ograniczone). 1. 3. Osmometria membranowa: opiera się na zasadzie osmozy, tzn. naturalnej skłonności cząsteczek rozpuszczal- nika do przenikania przez półprzepuszczalną membranę z rozcieńczonego do stężonego roztworu aż do osią- gnięcia równowagi. W trakcie badania rozcieńczony roztwór posiada zerowe stężenie polimeru, natomiast stę- żony roztwór zawiera polimer. Skutkiem przepuszczenia rozpuszczalnika przez membranę jest zróżnicowanie ciśnienia, które zależne jest od stężenia i masy cząsteczkowej polimeru (1) (3) (4). Zastosowanie: Mn w zakresie 20 000–200 000. 1. 4. Osmometria fazy parowania: obejmuje porównanie wskaźnika parowania czystego rozpuszczalnika aerozolu do co najmniej trzech aerozoli zawierających polimer o różnych stężeniach (1) (5) (6). Zastosowanie: Mn < 20 000. 2. Analiza grupy końcowej W celu wykorzystania tej metody, potrzeba wiedzy zarówno o całkowitej strukturze polimeru, jak i o charak- terze łańcucha kończącego grupy końcowe (która musi być możliwa do odróżnienia od głównego szkieletu, np. przez NMR lub miareczkowanie / różniczkowanie). Oznaczenie stężenia cząsteczkowego grup końcowych obecnych w polimerze może prowadzić do wyprowadzenia wartości masy cząsteczkowej (7) (8) (9). Zastosowanie, Mn do 50 000 (ze zmniejszającą się wiarygodnością). BIBLIOGRAFIA (1) Billmeyer, F. W. Jr. , (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn. , John Wiley, New York. (2) Glover, C. A. , (1975). Absolute Colligative Property Methods. Rozdział 4. W: Polymer Molecular Weights, Part I P. E. Slade, Jr. ed. , Marcel Dekker, New York. (3) ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsyl- vania. (4) Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. W: Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper ed. , J. Wiley and Sons. pp. 25–52. (5) ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 285 (6) Morris, C. E. M. , (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper ed. , John Wiley and Sons. (7) Schröder, E. , Müller, G. , and Arndt, K-F. , (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich. (8) Garmon, R. G. , (1975). End-Group Determinations, Rozdział 3. W: Polymer Molecular Weights, Part I, P. E. Sla- de, Jr. ed. Marcel Dekker, New York. (9) Amiya, S. , et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146. 286 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 ZAŁĄCZNIK III B A. 19 ZAWARTOŚĆ POLIMERÓW O MAŁEJ MASIE CZĄSTECZKOWEJ 1. METODA Niniejsza metoda chromatografii żelowo-permeacyjnej jest powtórzeniem OECD TG 119 (1996). Podsta- wowe zasady i dalsze informacje techniczne są podane w odniesieniach. 1. 1. Wprowadzenie Ze względu na to, że właściwości polimerów są tak zróżnicowane, nie istnieje możliwość opisania poje- dynczej metody ustalającej dokładnie warunki rozdzielenia i oceny, która obejmuje wszystkie ewentualno- ści i właściwości pojawiające się w trakcie rozdzielania polimerów. w szczególności złożone systemy poli- merów często nie ulegają często chromatografii żelowo-permeacyjnej (GPC). Jeśli GPC nie jest stosowane, masa cząsteczkowa może być ustalona za pomocą innych metod (patrz Załącznik). w takich przypadkach powinny zostać podane wszystkie szczegóły i uzasadnienia dla wykorzystanych metod. Opisana metoda oparta jest na normie DIN 55672 (1). Szczegółowe informacje dotyczące tego, w jaki spo- sób przeprowadzać doświadczenia oraz w jaki sposób oceniać dane można znaleźć w niniejszej normie DIN. w przypadku gdy niezbędne są zmiany warunków doświadczeń, wspomniane zmiany muszą być uza- sadnione. Inne normy mogą być wykorzystywane tylko w przypadku gdy istnieją do nich pełne odniesie- nia. Opisana metoda wykorzystuje próbki polistyrenu o znanej polidyspersyjności w odniesieniu do kali- bracji oraz może wystąpić konieczność jej zostać zmodyfikowania, tak aby była odpowiednia dla niektórych polimerów, np. polimerów rozpuszczalnych w wodzie i polimerów o długich rozgałęzieniach łańcucha. 1. 2. Definicje i jednostki Mała masa cząsteczkowa jest arbitralnie określana jako masa cząsteczkowa poniżej 1 000daltonów. Średnia liczbowo masa cząsteczkowa Mn i średnia wagowo masa cząsteczkowa Mw jest określana przy uży- ciu następujących równań: gdzie: Hi jest poziomem detektora sygnału z linii podstawowej dla objętości retencyjnej, Mi jest masą cząsteczkową polimerowej frakcji przy objętości retencyjnej Vi, i n jest liczbą punktów pomiarowych. Szerokość rozkładu masy cząsteczkowej, który jest miarą dyspersyjności systemu, jest podana na podsta- wie stosunku Mw/Mn. 1. 3. Substancje odniesienia Ze względu na to, że GPC jest metodą względną, musi zostać podjęta kalibracja. Wzorce polistyrenowe mało rozproszone, o linearnej budowie, posiadają średnie masy cząsteczkowe Mn i Mw oraz znany rozkład masy cząsteczkowej są zwykle używane do tego celu. Krzywa kalibracji może być wykorzystywana wyłącz- nie w celu określania masy cząsteczkowej nieznanej próbki, jeżeli warunki rozdzielenia próbki oraz wzorca zostały dobrane w identyczny sposób. 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 287 Ustalony związek między masą cząsteczkową oraz objętością elucji jest ważny wyłącznie w specyficznych warunkach danego doświadczenia. Warunki obejmują przede wszystkim temperaturę, rozpuszczalnik (lub mieszaninę rozpuszczalników), warunki chromatografii oraz kolumnę rozdzielającą lub systemy kolumn. Masy cząsteczkowe próbki ustalone w ten sposób są względnymi wartościami oraz są opisane jako rów- noważnik mas cząsteczkowych polistyrenowych. Oznacza to, że w zależności od strukturalnych i chemicz- nych różnic między próbką a wzorcami, masy cząsteczkowe mogą odchylać się od wartości absolut- nych w większym lub mniejszym stopniu. Jeśli wykorzystywane są inne wzorce, np. glikolu polietylenowe, tlenku polietylenu, metaakrylanu polimetylu czy kwasu poliakrylowego, powinny zostać podane odpo- wiednie przyczyny. 1. 4. Zasada metody badawczej Zarówno rozkład masy cząsteczkowej próbki, jak i średnie masy cząsteczkowe (Mn, Mw) mogą być usta- lane, wykorzystując GPC. GPC jest szczególnym rodzajem chromatografii cieczowej, w której próbka jest oddzielana według hydrodynamicznych wielkości pojedynczych składników (2). Rozdzielenie następuje wówczas gdy próbka przechodzi przez kolumnę, która jest wypełniona porowa- tym materiałem – jest to zazwyczaj organiczny żel. Małe cząsteczki mogą wnikać w pory, podczas gdy duże cząsteczki są wykluczane. Ścieżka dużych cząsteczek jest niniejszym krótsza i to one są najpierw poddane procesowi eluacji. Średnie cząsteczki wnikają w niektóre pory i są później poddawane eluacji. Najmniejsze cząsteczki o średnim hydrodynamicznym promieniu, mniejszym niż pory żelu, mogą wnikać we wszyst- kie pory. Są poddawane eluacji na końcu. W sytuacji idealnej oddzielanie jest kontrolowane całkowicie rozmiarem odmian cząsteczkowych, ale w praktyce trudno jest uniknąć co najmniej niewielkich efektów absorbcyjnych. Nierówne wypełnienie kolumny oraz objętość martwa mogą tylko pogorszyć sytuację (2). Na detekcję ma wpływ np. współczynnik załamania lub pochłanianie promieni UV, oraz wydajności nie- skomplikowanej krzywej rozkładu. Jednakże w celu przypisania rzeczywistych wartości masy cząsteczko- wej do krzywej, niezbędne jest poddanie kolumny kalibracji przez przepuszczanie polimerów o znanej masie cząsteczkowej oraz, w idealnym przypadku, o podobnej strukturze, np. różnych wzorców polisty- renowych. Krzywa Gaussa powstająca zazwyczaj w ten sposób, czasami wypaczona jest małymi „ogonami” skierowanymi w stronę małych mas cząsteczkowych, oś pionowa wskazująca jakość, w masie, różnych wyeluowanych odmian polistyrenu, a oś pozioma wskazuje logarytm z masy cząsteczkowej. Zawartość niskich mas cząsteczkowych jest uzyskiwana na podstawie krzywej. Obliczenia mogą być tylko wtedy dokładne, gdy odmiany o małych masach cząsteczkowych odpowiadają polimerowi jako całości. 1. 5. Kryteria jakościowe Powtarzalność (względne odchylenie standardowe: RSD) objętości eluowania powinna być lepsza niż 0,3 %. Wymagana powtarzalność analizy musi być zapewniona przez korektę dokonywaną poprzez wewnętrzne wzorce, jeżeli chromatogram jest oceniany w oparciu o czas i nie odpowiada wyżej wspomnianym kryte- riom (1). Polidyspersyjności są zależne od mas cząsteczkowych wzorców. w przypadku wzorców polisty- renowych typowe wartości to: Mp < 2 000 2 000 ≤ Mp ≤ 106 Mp > 106 Mw/Mn<1,20 Mw/Mn <1,05 Mw/Mn <1,20 (Mp jest masą cząsteczkową wzorca w maksimum piku). 1. 6. Opis metody badawczej 1. 6. 1. Przygotowanie wzorcowych roztworów polistyrenu Wzorce polistyrenu są rozpuszczane przez ostrożne mieszanie w wybranym eluencie. Zalecenia wytwórcy muszą zostać uwzględnione w trakcie przygotowywania roztworów. 288 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 Stężenia wybranych wzorców są zależne od wielu czynników, np. od objętości injekcji, lepkości roztworu oraz czułości detektora analitycznego. Maksymalna objętość injekcji musi być dostosowana do długości kolumny, w celu uniknięcia przeładowania. Typowe objętości injekcji dla analitycznych rozdzieleń wyko- rzystując GPC z kolumną o wymiarach 30 cm × 7,8 mm wynoszą zazwyczaj między 40 a 100 μl. Wyższe objętości są możliwe, ale nie powinny przekraczać 250 μl. Optymalny stosunek między objętością injekcji oraz stężeniem musi być określony przed rzeczywistą kalibracją kolumny. 1. 6. 2. Przygotowywanie roztworu próbki Zasadniczo te same wymagania stosuje się do przygotowywania roztworów próbek. Próbka jest rozpusz- czana w odpowiednim rozpuszczalniku, np. tetrahydrofuranie (THF), przez lekkie wstrząsanie. w żadnych okolicznościach nie powinno się rozpuszczać próbki w wannie ultradźwiękowej. w razie konieczności, próbka roztworu jest oczyszczana przez membranowy filtr posiadający pory o wymiarach między 0,2 i 2 μm. Obecność nierozpuszczalnych cząstek musi być uwzględniona w sprawozdaniu końcowym, jako że może być to ważne w odniesieniu do próbek o wysokiej masie cząsteczkowej. Powinna zostać wykorzystana odpowiednia metoda w celu określenia procentu wagowego nierozpuszczonych cząstek. Roztwór musi zostać wykorzystany w ciągu 24 godzin. 1. 6. 3. Korekta w odniesieniu do zawartości zanieczyszczeń oraz dodatków Zazwyczaj niezbędna jest korekta udziału zawartości odmian M < 1 000w odniesieniu do udziału niepol- imerowych szczególnych obecnych składników (np. zanieczyszczenia i/lub dodatki), chyba że zmierzona zawartość wynosi już < 1 %. Osiągane jest to przez bezpośrednią analizę roztworu polimerowego lub eluentu metodą GPC. W przypadkach gdy eluent, po przejściu przez kolumnę jest za bardzo rozcieńczony, aby można go było poddać dalszej analizie, musi zostac zagęszczony. Może okazać się niezbędne odparowanie eluentu do sucha oraz ponowne jego rozpuszczenie. Stężenie eluentu musi zostać uzyskane w warunkach, które zapewniają, że nie pojawią się żadne zmiany w eluencie. Obróbka eluentu po fazie GPC jest zależna od wykorzystanej metody analitycznej wykorzystywanej do oznaczania ilościowego. 1. 6. 4. Aparatura Aparatura GPC składa się z następujących części składowych: — zbiornik na rozpuszczalnik, — odgazowywacz (w miarę potrzeb), — pompa, — nawilżacz pulsowy (w miarę potrzeb), — system wtryskowy, — kolumny chromatograficzne, — detektor, — przepływomierz (w miarę potrzeb), — urządzenia rejestrujące dane, — naczynie na odpady. Musi zostać zapewnione, że system GPC będzie jest obojętny w odniesieniu do stosowanych rozpuszczal- ników (np. przez wykorzystanie stalowych kapilar w przypadku rozpuszczalnika THF). 1. 6. 5. System wtryskowy i system dostarczający rozpuszczalnik Określona objętość roztworu próbki jest umieszczona w kolumnie albo przy użyciu automatycznego prób- nika, albo ręcznie do ściśle określonej strefy. Zbyt szybkie wstrzykiwanie, jeśli jest wykonywane ręcznie, może spowodować zmiany w obserwowalnym rozkładzie masy cząsteczkowej. System dostarczający roz- puszczalnik, na ile jest to możliwe, powinien być wolny od pulsacji, co można osiągnąć poprzez wbudo- wanie do niego tłumika pulsacji. Prawidłowa prędkość przepływu wynosi 1 ml/min. 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 289 1. 6. 6. Kolumna W zależności od próbki, właściwości polimeru określa się albo za pomocą prostej kolumny, albo kilku kolumn połączonych w sekwencję. Pewna ilość materiałów porowatych kolumn o określonych właściwo- ściach dostępna jest w ogólnej sprzedaży (np. rozmiar porów, granica ekskluzji). Wybór żelu rozdzielają- cego lub długość kolumny jest uzależniona zarówno od właściwości próbki (objętości hydrodynamiczne, rozkład masy cząsteczkowej), jak i od specyficznych warunków rozdzielania, takich jak rozpuszczalnik, temperatura i prędkość przepływu (1) (2) (3). 1. 6. 7. Półki teoretyczne Kolumna lub połączenie kolumn wykorzystywanych do rozdzielania musi być scherakteryzowana przez ilość półek teoretycznych. Obejmuje to, w przypadku THF jako rozpuszczalnikia eluencyjnego, umieszcze- nie roztworu etylobenzenu lub innych odpowiednich niepolarnych substancji rozpuszczonych w kolum- nie o znanej długości. Liczba półek teoretycznych jest uzyskiwana na podstawie następującego równania: W1/2)2 N = 5,54( Ve W)2 lub N = 16(Ve gdzie: N Ve jest liczbą półek teoretycznych, jest objętością eluencyjną w maksimum piku, W jest wyjściową szerokością piku, W½ jest szerokością piku w połowie wysokości. 1. 6. 8. Wydajność rozdzielania Oprócz liczby półek teoretycznych, która jest określającą ilościowo szerokością pasma, ważną rolę odgrywa także wydajność rozdzielenia, będąca określaną przez nachylenie krzywej kalibracyjnej. Wydajność roz- dzielania kolumny jest uzyskiwana z następującego stosunku: V -V eM x e(10M x) L 3 2] ≥ 6,0[cm cm gdzie: Ve, Mx Ve, (10 Mx) jest objętością eluencyjną dla polistyrenu o masie cząsteczkowej Mx jest objętością eluencyjną dla polistyrenu o 10-krotnie większej masie cząsteczkowej. Rozdzielczość systemu jest zwykle określana w następujący sposób: R1,2 = 2× Ve1-Ve2 W1+W2 × 1 log10(M2/M1) gdzie: Ve1, Ve2 są objętościami eluencyjnymi dwóch wzorców polistyrenowych w maksimum piku, W1, W2 są największymi szerokościami piku w lini podstawowej, M1 M2 są masami cząsteczkowymi przy maksimum piku (powinny różnić się współczynnikiem o 10). Wartość R w odniesieniu do systemu kolumn powinna być wyższa niż 1,7 (4). 1. 6. 9. Rozpuszczalniki Wszystkie rozpuszczalniki muszą posiadać wysoką czystość (dla THF używana jest czystość 99,5 %). Zbior- nik na rozpuszczalnik (o ile jest to konieczne - w atmosferze gazu obojętnego) musi być odpowiednio duży dla kalibracji kolumny i analiz wielu próbek. Rozpuszczalnik musi być odgazowany zanim zostanie prze- niesiony do kolumny za pomocą pompy. 290 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 1. 6. 10. Kontrola temperatury Temperatura krytycznych komponentów wewnętrznych (pętla wtryskowa, kolumny, detektor i przewody) powinna być stała i zgodna z wyborem rozpuszczalnika. 1. 6. 11. Detektor Zadaniem detektora jest rejestracja ilościowa stężenia próbki eluowanej z kolumny. w celu uniknięcia niepotrzebnego poszerzenia pików, objętość kuwety komórki detektora musi być tak mała, jak to tylko jest możliwe. Nie powinna być większa niż 10 μl z wyjątkiem detektorów mierzących światło rozproszone oraz lepkość. w celu detekcji zazwyczaj używana jest refraktometria różnicowa. Jednakże, jeżeli wymagają tego właściwości próbki lub właściwości eluacyjne rozpuszczalnika, mogą być używane inne rodzaje detektora, np. UV/VIS, IR, detektory lepkości itd. 2. DANE I SPORZĄDZANIE SPRAWOZDAŃ 2. 1. Dane Powinno nastąpić odniesienie do normy DIN (1) w celu uzyskania szczegółowych kryteriów oceny, jak rów- nież do wymogów odnoszących się do zbierania i przetwarzania danych. Dla każdej próbki muszą zostać przeprowadzone dwa niezależne doświadczenia. Próbki muszą być anali- zowane pojedynczo. We wszystkich przypadkach, zasadnicze jest ustalenie danych również z prób śle- pych, poddawanych przetworzeniu w takich samych warunkach co próbka. Niezbędne jest wyraźne wskazanie, że zmierzone wartości są wartościami względnymi, równoważnymi masom cząsteczkowym użytych wzorców. Po określeniu objętości retencji lub czasów retencji (możliwie poprawionych wykorzystując wzorzec wewnętrzny), wartości logarytmu Mp (Mp będącego maksymalną wartością piku wzorca kalibracji) są wykreślane w oparciu o jedną z tych wielkości. Niezbędne są co najmniej dwa punkty kalibracji na dekadę masy cząsteczkowej oraz wymagane jest co najmniej pięć punktów pomiarowych dla całkowitej krzywej, która powinna obejmować oszacowaną masę cząsteczkową próbki. Niska wartość punktu końcowego masy cząsteczkowej krzywej wzorcowania jest określana za pomocą n-heksylobenzenu lub innego odpo- wiedniego niepolarnego roztworu. Część krzywej odpowiadająca masom cząsteczkowym poniżej 0031000 jest ustalana i korygowana w razie konieczności w odniesieniu do zanieczyszczeń oraz dodatków. Krzywe eluacji są zazwyczaj oceniane za pomocą elektronicznego przetwarzania danych w przypadku gdy uży- wana jest ręczna digitalizacja, można powołać się na ASTMD 3536-91 (3). Jeśli jakikolwiek nierozpuszczalny polimer jest zachowany w kolumnie, jego masa cząsteczkowa może być wyższa niż masa cząsteczkowa frakcji rozpuszczalnej, a jeśli nie jest brana pod uwagę może skutkować nadmiernym oszacowaniem zawartości niskiej masy cząsteczkowej. Wskazówki w odniesieniu do korygo- wania zawartości niskiej masy cząsteczkowej w odniesieniu do nierozpuszczalnego polimeru są przewi- dziane w Załączniku. Krzywa rozkładu musi być przewidziana w formie tabeli lub ilustracji (różnicowa częstotliwość lub pro- cent sumy w oparciu o logarytm M). Na wizerunku graficznym jedna dekada masy cząsteczkowej powinna mieć normalnie około 4 cm szerokości, a maksymalna wartość szczytowa około 8 cm wysokości. w przy- padku krzywych całkowego rozkładu, różnica w rzędnych między 0 a 100 % powinna wynosić około 10 cm. 2. 2. Sprawozdanie z badania Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje: 2. 2. 1. Substancja badana — dostępne informacje dotyczące badanej substancji (tożsamość, dodatki, zanieczyszczenia), — opis przetwarzania próbki, uwagi, problemy. 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 291 2. 2. 2. Oprzyrządowanie — zbiornik z eluentem, obojętny gaz, odgazowywanie eluentu, skład eluentu, zanieczyszczenia, — pompa, pulsowy tłumik, system wtryskowy, — kolumny rozdzielające (wytwórca, wszystkie informacje dotyczące właściwości kolumn, takie jak roz- miar poru, rodzaj rozdzielającego materiału itd. , liczba, długość oraz kolejność użytych kolumn), — liczba półek teoretycznych kolumny (lub połączonych ), wydajność rozdzielania, (rozdzielczość syste- mu), — informacja dotycząca symetrii pików, — temperatura kolumny, rodzaj sterowania temperaturą, — detektor (zasada pomiarów, rodzaj, objętość kuwetowa), — przepływomierz w przypadkach, gdy jest używany (wytwórca, zasada pomiarów), — system umożliwiający rejestrację i przetwarzanie danych (osprzęt i oprogramowanie). 2. 2. 3. Kalibracja systemu — szczegółowy opis metody używanej do przygotowania krzywej kalibracji, — informacja dotycząca kryteriów jakościowych dla niniejszej metody (np. współczynnik korelacji, błąd sumy kwadratów itd. ), — informacja dotycząca ekstrapolacji, założenia i przybliżenia poczynione w trakcie procedury doświad- czalnej oraz oszacowanie i przetwarzanie danych, — wszystkie pomiary przeprowadzone w celu przygotowania krzywej kalibracji powinny być udokumen- towane w tabelach, które zawierają następujące informacje dla każdego punktu kalibracji: — nazwa próbki, — producent próbki, — właściwości wartości wzorców Mp, Mn, Mw oraz Mw/Mn, jak przewidziano przez wytwórcę lub uzyskane na podstawie kolejnych pomiarów, razem ze szczegółami dotyczącymi metody wyzna- czania, — objętość wtrysku oraz stężenie wtrysku, — wartość Mp używanej dla kalibracji, — objętość eluencyjna lub poprawiony czas retencji, mierzony przy maksimach piku, — Mp obliczone przy maksimum piku, — błąd procentowy wyliczonej Mp oraz wartość kalibracji. 2. 2. 4. Informacja dotycząca zawartości polimerów o niskiej masie cząsteczkowej — opis metod stosowanych w analizach i sposobie, w jaki przeprowadzone zostały doświadczenia, — informacja dotycząca zawartości procentowej frakcji o małej masie cząsteczkowej w odniesieniu do masy całkowitej próbki, — informacja dotycząca zanieczyszczeń, dodatków i innych niepolimerowych składnikach w procen- tach w odniesieniu do masy całkowitej próbki. 2. 2. 5. Ocena — ocena na podstawie czasu: wszystkie metody mające na celu zapewnienie wymaganej odtwarzalności (metoda poprawiania, wzorce wewnętrzne itd. ), — informacja dotycząca tego, czy ocena została przeprowadzona na podstawie objętości eluencyjnej lub czasu retencji, — informacja dotycząca ograniczeń oceny, jeżeli pik nie został poddany analizie w całości, — opis metod wygładzających, jeżeli są wykorzystywane, 292 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 — procedury przygotowawcze oraz wstępnego przetworzenia próbki, — obecność nierozpuszczalnych cząstek, jeżeli istnieją, — objętość wtrysku (μl) oraz stężenie wtrysku (mg/ml), — uwagi wskazujące skutki, które prowadzą do odchyleń od idealnego profilu GPC, — szczegółowy opis wszystkich zmian w procedurach badawczych, — szczegóły dotyczące zakresów błędów, — wszystkie inne informacje oraz uwagi istotne w odniesieniu do interpretacji wyników. 3. BIBLIOGRAFIA (1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elution- smittel, Teil 1. (2) Yau, W. W. , Kirkland, J. J. , and Bly, D. D. eds. (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. (3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular ECight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. (4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test method for Molecular ECight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 293 Załącznik Wytyczne dotyczące korygowania zawartości związków o niskiej masie cząsteczkowej w odniesieniu do obecności nierozpuszczalnych polimerów Jeśli w próbce obecny jest nierozpuszczalny polimer, skutkiem tego jest utrata masy podczas analizy GPC. Nieroz- puszczalny polimer pozostaje nieodwracalnie w kolumnie lub na filtrze próbkowym, podczas gdy rozpuszczalna część próbki przechodzi przez kolumnę. W przypadku gdy inkrement współczynnika załamania światła (dn/dc) poli- meru może zostać oszacowany lub zmierzony, można oszacować utratę masy próbki na kolumnie. W takim przy- padku przeprowadza się korektę, wykorzystując zewnętrzną kalibrację wzorcowymi materiałami o znanym stężeniu oraz dn/dc w celu kalibracji reakcji refraktometru. W poniższym przykładzie wykorzystywany jest wzorzec metaa- krylanu polimetylu (pMMA). W zewnętrznej kalibracji, w celu analizy akrylowych polimerów, wzorzec pMMA, o znanym stężęniu w tetrahyd- rofuranie, jest analizowany przez GPC, a otrzymane dane są wykorzystywane w celu znalezienia stałej refraktometru zgodnie ze wzorem: K = R/(C × V × dn/dc) gdzie: K R C jest stałą refraktometru (w mikrowoltosekundach/ml), jest wskaźnikiem wzorca pMMA (w mikrowoltosekundach), jest stężeniem wzorca pMMA (w mg/ml), V jest objętością dozowaną (w ml) oraz dn/dm jest inkrementem współczynnika załamania światła dla pMMA w tetrahydrofuranie (w ml/mg). Następujące dane są typowe dla wzorca pMMA: R C = 2 937 891, = 1,07 mg/ml, V = 0,1 ml, dn/dc = 9 × 10-5 ml/mg. Uzyskana wartość K, 3,05 × 1011, jest następnie wykorzystywana w celu obliczania teoretycznej reakcji detektora, jeżeli 100 % wtryśniętego polimeru eluowało przez detektor. 294 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 ZAŁĄCZNIK III C A. 20. ZACHOWANIE POLIMERÓW W WODZIE – ROZPUSZCZANIE/EKSTRAKCJA 1. METODA Opisana metoda jest powtórzeniem wersji poprawionej OECD WT 120 (1997). Dalsze informacje tech- niczne podane są w pozycji w bibligrafii (1). 1. 1. Wprowadzenie W odniesieniu do niektórych polimerów, takich jak np. polimerów emulsyjnych, zanim można zastoso- wać metodę opisaną poniżej, konieczne mogą być wstępne prace przygotowawcze. Metoda ta nie ma zastosowania do polimerów płynnych oraz do polimerów, które reagują z woda w warunkach badania. Jeżeli metoda nie zachowanie rozpuszczanie/ekstrakcja może zostać zbadane za pomocą innych metod. W takich przypadkach należy podać pełne szczegóły oraz uzasadnienie dla zastosowania metody. jest praktyczna jest możliwe zastosowanie, lub nie jej 1. 2. Substancje odniesienia Brak. 1. 3. Zasada metody badawczej Zachowanie polimerów rozpuszczanie/ekstrakcja w środowisku wodnym ustalane jest przy wykorzysta- niu metody kolbowej (patrz A. 6 – rozpuszczalność w wodzie, metoda kolbowa) ze zmianami opisanymi poniżej. 1. 4. Kryteria jakościowe Brak. 1. 5. Opis metody badawczej 1. 5. 1. Sprzęt W odniesieniu do tej metody wymagany jest następujący sprzęt: — przyrząd zgniatający, np. młyn do wytwarzania cząstek o znanym rozmiarze, — aparatura do wstrząsania z możliwością kontroli temperatury, — system filtrowania membranowego, — właściwy sprzęt analityczny, — znormalizowane sita. 1. 5. 2. Przygotowanie próbki Próbka reprezentatywna musi zostać najpierw zmniejszona do wielkości cząsteczek między 0,125 i 0,25 mm wykorzystując właściwe sita. W odniesieniu do stabilności próbki lub w odniesieniu do pro- cesu mielenia wymagane może być chłodzenie. Materiały o właściwościach podobnych do gumy mogą być kruszone w temperaturze ciekłego azotu (1). Jeżeli wymagana frakcja wielkości cząsteczki jest nieosiągalna, powinno zostać podjęte działanie w celu zmniejszenia wielkości cząsteczek do najmniejszej możliwej wielkości oraz złożone sprawozdanie o wyniku. W sprawozdaniu niezbędne jest wskazanie sposobu, w jaki skruszona próbka była składowana przed bada- niem. 1. 5. 3. Procedura Trzy próbki o masie 10 g są odważane do trzech naczyń wyposażonych w szklane korki i dodaje się po 1 000ml wody do każdego z naczyń. Jeżeli zastosowanie ilości 10 g polimeru okazuje się niewykonalne, powinna zostać wykorzystana największa, najbliższa tej wartości ilość, jaką można zastosować, a objętość wody powinna zostać odpowiednio dostosowana. 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 295 Naczynia są szczelnie zamykane korkiem, a następnie wstrząsane w temperaturze 20 °C. Powinno zostać wykorzystane urządzenie wstrząsające lub mieszające, działające w stałej temperaturze. Po okresie 24 godzin zawartość każdego naczynia jest odwirowywana lub filtrowana, a stężenie polimeru w czystej fazie wodnej ustalana jest za pomocą odpowiedniej metody. Jeżeli odpowiednie metody analityczne w odnie- sieniu do fazy wodnej nie są dostępne, całkowitą rozpuszczalność/podatności na ekstrakcję można osza- cować z suchej masy pozostałości filtracyjnej lub z odwirowanego strątu. Zazwyczaj niezbędne jest ilościowe zróżnicowanie między zanieczyszczeniami i dodatkami z jednej stro- ny, oraz odmianami o małej masie cząsteczkowej z drugiej strony. W przypadku oznaczania grawime- trycznego ważne jest także przeprowadzenie próby ślepej bez wykorzystania substancji badanej, w celu uwzględnienia pozostałości powstających w wyniku metody doświadczalnej. Zachowanie polimerów rozpuszczanie/ekstrakcja w wodzie w temperaturze 37 °C przy pH 2 i pH 9 może zostać ustalone w ten sam sposób, jak opisano w odniesieniu do przeprowadzania doświadczenia w tempe- raturze 20 °C. Wartości pH można osiągnąć przez dodanie albo odpowiednich roztworów buforowych albo odpowiednich kwasów lub zasad, takich jak kwas solny, kwas octowy, wodorotlenek sodu lub potasu o czystości analitycznej lub NH3. W zależności od wykorzystanej metody analizy, należy przeprowadzić jedno lub dwa badania. Jeżeli dostępne są wystarczająco szczegółowe metody w odniesieniu do bezpośredniej analizy fazy wodnej dla komponentu polimerowego, wystarczy przeprowadzić jedno badanie, jak opisano powyżej. Jednakże, jeżeli takie metody nie są dostępne, a określenie zachowania rozpuszczania/ekstrakcji polimeru jest ogra- niczone do analizy pośredniej przez ustalanie tylko całkowitej zawartości węgla organicznego (TOC) eks- traktu wodnego, powinno zostać przeprowadzone dodatkowe badanie. Takie dodatkowe badanie należy także przeprowadzić na trzykrotnie, stosując dziesięciokrotnie mniejsze próbki polimeru oraz takie same ilości wody, jak ilości wykorzystane w pierwszym badaniu. 1. 5. 4. Analiza 1. 5. 4. 1. Ba da n i e pr z ep ro wadz an e z prób ką jednego rozmia ru Mogą być dostępne metody analizy bezpośredniej komponentów polimerowych w fazie wodnej. Alterna- tywnie można rozważyć pośrednią analizę rozpuszczonych/ekstrahowanych komponentów polimero- wych przez określenie całkowitej zawartości części rozpuszczalnych i korektę w odniesieniu do kompo- nentów, które nie są właściwe dla polimerów. Możliwa jest analiza fazy wodnej dla ogółu odmian polimerowych albo przez wystarczającą czułą metodę, np. : — TOC, wykorzystującą ekstrahowanie na ciepło nadsiarczanu lub dwuchromianu, w celu otrzymania CO2, a następnie wykonanie oznaczenia za pomocą podczerwieni IR lub analizy chemicznej, — spektometrie absorpcji atomowej (AAS) lub jej równoważnik emisji indukcyjnie wzbudzonej plazmy (ICP) dla krzemu lub polimerów zawierających metale, — pochłanianie UV lub spektrofluorometrie dla polimerów arylu, — LC-MS dla próbek o małej masie cząsteczkowej, lub przez odparowywanie w warunkach próżniowych do sucha ekstraktu wodnego i analizę spektrosko- pową (IR, UV, itd. ) lub analizę AAS/ICP pozostałości. Jeżeli niemożliwa jest analiza samej fazy wodnej, roztwór wodny należy ekstrahować za pomocą orga- nicznego rozpuszczalnika niemieszającego się z woda, np. chlorowanego węglowodoru. Rozpuszczalnik jest następnie odparowywany, a pozostałość analizowana pod kątem podanej zawartości polimeru w spo- sób określony powyżej. Wszelkie komponenty w tej pozostałości, które są identyfikowane jako zanieczy- szczenia lub dodatki, mają zostać odjęte w celu określenia stopnia rozpuszczenia/ekstrakcji samego poli- meru. Jeżeli obecne są względnie duże ilości takich substancji, może wystąpić konieczność poddania pozostało- ści np. analizie HPLC lub GC, w celu odróżnienia zanieczyszczeń od obecnego monomeru i frakcji pochod- nych monomeru, tak, aby można było ustalić ich rzeczywistą zawartość. W niektórych przypadkach wystarczające może być zwykłe odparowanie organicznego rozpuszczalnika do sucha i zważenie suchej pozostałości. 296 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 1. 5. 4. 2. Ba da ni e pr z e p r o w a d z a n e z d w o m a p r ó b k a m i o r ó ż n y c h ro z m i a r a c h c z ą s t e c z e k Wszystkie ekstrakty wodne analizuje w odniesieniu do TOC. Oznaczanie grawimetryczne przeprowadzane jest na nierozpuszczonej/niewyekstrahowanej części próbki. Jeżeli po odwirowaniu lub filtrowaniu zawartości każdego z naczyń pozostałości polimerów pozostają przytwierdzone do ścianek naczynia, naczynie powinno zostać przepłukane filtratem do momentu oczysz- czenia naczynia ze wszystkich widocznych pozostałości. Następnie filtrat ponownie jest ponownie odwi- rowywany oraz filtrowany. Pozostałości na filtrze lub w rurze wirnikowej są suszone w temperaturze 40 °C w próżni, oraz ważone. Suszenie kontynuuje się do momentu osiągnięcia stałej wagi. 2. DANE 2. 1. Badanie przeprowadzane z próbką jednego rozmiaru cząstek Powinny zostać podane poszczególne wyniki dla każdej z trzech kolb oraz wartości średnie, wyrażone jed- nostkach masy na objętość roztworu (zwykle mg/l) lub masy na masę próbki polimeru (zwykle mg/g). Dodatkowo powinna zostać również podana utrata wagi próbki (obliczona jako masa substancji rozpusz- czonej podzielona przez masę pierwszej próbki). Błędy względne powinny zostać odliczone (RSD). Dla całej substancji (polimer + niezbędne substancje dodane, itd. ) oraz dla samego polimeru (tj. po odjęciu sub- stancji dodanych) należy podąć oddzielne dane liczbowe. 2. 2. Badanie przeprowadzane z dwoma próbkami o różnych rozmiarach cząsteczki Powinny zostać podane poszczególne wartości TOC ekstraktów wodnych dwóch trzykrotnie przeprowa- dzanych doświadczeń oraz średnich wartość dla każdego doświadczenia, wyrażone w jednostkach masy na objętość roztworu (zwykle mg/l) oraz w jednostkach masy na wagę pierwszej próbki (zwykle mgC/g). Jeżeli nie istnieje różnica między wynikami w wysokich oraz niskich współczynnikach proporcji próbka/woda, może to wskazywać na to, że wszystkie możliwe do wyekstrahowania komponenty zostały faktycznie wyekstrahowane. W takim przypadku analiza bezpośrednia zazwyczaj nie byłaby konieczna. Powinny zostać podane masy poszczególnych pozostałości, wyrażone jako udział początkowych mas próbek. Dla każdego eksperymentu powinny zostać obliczone wartości średnie. Różnice pomiędzy wartością 100 i otrzymanymi procentami wyrażają procenty materiału rozpuszczonego i ekstrahowanego w pierwotnej próbce. 3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDAŃ 3. 1. Sprawozdanie z badania Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje: 3. 1. 1. Substancja badana — dostępne informacje dotyczące substancji badanej (tożsamość, substancje dodane, zanieczyszczenia, zawartość odmian o malej masie cząsteczkowej). 3. 1. 2. Warunki przeprowadzania doświadczenia — opis wykorzystanych procedur i warunków przeprowadzania doświadczenia, — opis metod analizy i wykrywania. 3. 1. 3. Wyniki — wyniki rozpuszczalności/podatności na ekstrakcję w mg/l; wartości poszczególne i średnie dla badań ekstrakcji w poszczególnych roztworach rozbite na zawartość polimerów oraz zanieczyszczeń, dodatki itd. , — wyniki rozpuszczalności/podatności na ekstrakcję w mg/g polimeru, — wartości TOC ekstraktów wodnych, masa substancji rozpuszczonej oraz udziały procentowe jeżeli zostały zmierzone, 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 297 — pH każdej próbki, — informacje dotyczące wartości ślepej próby, — w miare potrzeb odniesienia do niestabilności chemicznej substancji badanej, zarówno podczas pro- cesu badania, jak i podczas procesu analitycznego, — wszystkie informacje które są ważne w odniesieniu do interpretacji wyników. 4. BIBLIOGRAFIA (1) DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke. 298 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 ZAŁĄCZNIK III D C. 13 BIOKONCENTRACJA: BADANIE RYB W WARUNKACH PRZEPŁYWU 1. METODA Ta metoda biokoncentracji jest powtórzeniem OECD WT 305 (1996). 1. 1. Wprowadzenie Metoda ta opisuje procedurę charakteryzowania biokoncentracyjnego potencjału substancji znajdujących się w rybach w warunkach przepływu. Chociaż preferuje się bardziej wymogi obowiązujące dla badań w warunkach przepływu, dopuszczalne są wymogi obowiązujące dla badań w warunkach częściowo sta- tycznych, pod warunkiem, że spełnione są kryteria prawidłowości. Metoda podaje wystarczające szczegóły dla przeprowadzenia badania, jednocześnie zezwalając na sto- sowną dowolność w dostosowywaniu procedury doświadczalnej do warunków w poszczególnych labo- ratoriach oraz na zróżnicowane właściwości substancji badanych. Jest ona najbardziej prawidłowo stoso- wana w odniesieniu do chemikaliów organicznych o wartościach log Pow między 1,5 i 6,0 (1), ale może być także stosowana do substancji superlipofilowych (o wartości log Pow > 6,0). Wstępne oszacowanie czynnika biokoncentracji (BCF), czasami oznaczanego jako KB, dla takich substancji będzie prawdopodob- nie wyższe niż wartość czynnika biokoncentracji w stanie ustalonym (BCFss), które spodziewa się uzyskać w doświadczeniach laboratoryjnych. Wstępne oszacowania czynnika biokoncentracji dla chemikaliów organicznych o wartościach log Pow wynoszących około 9,0 można uzyskać, stosując równanie Binteina i inne (2). Parametry, które charakteryzują potencjał biokoncentracji zawierają stałą szybkość absorpcji (k1), stałą szybkość oczyszczania (k2) oraz BCFss. Substancje badane oznakowane radiologicznie mogą ułatwić analizę próbek wody i ryb oraz mogą być wykorzystywane do określania, czy konieczne jest wykonanie identyfikacji i kwantyfikacji degradacji. Jeżeli mierzony jest ogół pozostałości radioaktywnych (np. przez spalanie lub rozpuszczanie tkanki), BCF jest oparte na związku macierzystym, wszelkich zatrzymanych metabolitach, a także na asymilowanym węglu. Z tego względu BCFS, oparty na ogóle pozostałości radioaktywnych, nie może być bezpośrednio porów- nywalny z BCF uzyskiwanym w drodze szczegółowej analizy chemicznej wyłącznie związku macierzy- stego. W badaniach substancji oznaczonych radiologicznie można zastosować procedury oczyszczania w celu określenia czynnika BCF w oparciu o związek macierzysty i, jeżeli uzna się to za konieczne, można opisać główne metabolity. Możliwe jest także połączenie badania metabolizmu ryb z badaniem biokoncentracji poprzez analizę i identyfikacje pozostałości w tkankach. 1. 2. Definicje i jednostki Biokoncentracja/bioakumulacja: jest wzrostem koncentracji substancji badanej w organizmie lub na nim (jego określonych tkankach), w stosunku do koncentracji substancji badanej w otaczającym środowisku. Czynnik biokoncentracji (BCF lub KB) w każdym momencie w trakcie fazy absorpcji tego badania akumulacji jest stężeniem substancji badanej w/na rybie lub w jej określonych tkankach (Cf jako μg/g (ppm)), podzie- lone przez koncentrację tej substancji chemicznej w otaczającym środowisku (Cw jako μg/ml (ppm)). Stały czynnik biokoncentracji (BCFss lub KB) nie zmienia się znacząco w długim okresie czasu, stężenie sub- stancji badanej w otaczającym środowisku w tym okresie czasu jest stale. Plateau lub stan ustalony osiągany jest wykreślając ilość substancji badanej w rybach (Cf) w zależności od momentu, kiedy krzywa staje się równoległa do osi czasu, a trzy następujące po sobie analizy Cf, wyko- nane na próbkach pobranych w odstępach, co najmniej dwóch dni, różnią się od siebie o ± 20 % i nie ma znacznych różnic między trzema okresami pobierania próbek. Przy wspólnej analizie próbek wymagane są przynajmniej cztery następujące po sobie analizy. W odniesieniu do substancji badanych, które są pobie- rane powoli, odstępy czasu powinny wynosić odpwiednio siedem dni. 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 299 Czynniki biokoncentracji, obliczane bezpośrednio ze stałych wskaźników kinetycznych (k1/k2), określane sa jako czynniki koncentracji kinetycznej, BCFk. Współczynnik podziału oktanol-woda (Pow) jest to stosunek rozpuszczalności substancji chemicznej w n-okta- nolu i wodzie w równowadze (metoda A. 8), wyrażany także jako Kow. Logarytm Pow wykorzystywany jest jako wskaźnik zdolności substancji chemicznej do biokoncentracji przez organizmy wodne. Faza narażenia na działanie substancji / absorpcji jest to czas, w trakcie którego ryby narażone są na działanie badanej substancji chemicznej. Stała szybkość absorpcji (k1) jest wartością liczbową określającą tempo wzrostu koncentracji substancji bada- nej w rybach i na nich (lub w nich czy ich określonych tkankach) w czasie gdy ryby wystawione są na dzia- łanie tej substancji, (k1 wyraża się w dniach–1). Faza po narażeniu na działanie substancji/oczyszczania (ubytku) jest to czas następujący po przeniesieniu ryb ze środowiska zawierającego substancje do środowiska wolnego od tej substancji, w trakcie, którego badane jest oczyszczanie (lub ich określonych tkanek) z substancji (ubytek netto). Stała szybkość oczyszczania (ubytku) (k2) jest wartością liczbową określającą tempo zmniejszania koncentra- cji substancji badanej w badanych rybach (lub ich określonych tkankach) po przeniesieniu badanych ryb ze środowiska zawierającego substancje badaną do środowiska wolnego od tej substancji (k2 wyrażana jest w dniach –1). 1. 3. Zasada metody badawczej Badanie składa się z dwóch faz: faza narażenia na działanie substancji (absorpcja) i faza po narażeniu na działanie substancji (oczyszczania). Podczas fazy absorpcji oddzielne grupy ryb jednego gatunku narażone są na działanie substancji badanej o co najmniej dwóch różnych stężeniach. Następnie ryby przenosi się do środowiska wolnego od substancji badanej w celu przeprowadzenia fazy oczyszczania. Faza oczysz- czania jest zawsze konieczna, chyba że absorpcja substancji podczas fazy absorpcji jest nieznaczna (np. czynnik BCF jest mniejszy niż 10). Stężenie substancji badanej w/na rybach (lub w ich określonych tkan- kach) śledzi się w obu fazach badania. Oprócz dwóch badań stężeń substancji badanej, kontrolowaną grupę ryb przetrzymuje się w identycznych warunkach, z wyjątkiem obecności substancji badanej, w celu odnie- sienia możliwych negatywnych skutków zaobserwowanych w badaniu biokoncentracji do odpowiedniej grupy kontrolowanej oraz w celu uzyskania bazowych stężeń substancji badanej. Faza absorpcji trwa 28 dni, jeżeli nie wykaże się, że równowaga została osiągnięta wcześniej. Przewidy- wany czas trwania fazy absorpcji i czas osiągnięcia stanu ustalonego można obliczyć w oparciu o równa- nie podane w załączniku 3. Następnie rozpoczyna się okres oczyszczania przez przeniesienie ryb do takiego samego środowiska, ale bez substancji badanej w innym czystym naczyniu. W miarę możliwości czynnik biokoncentracji oblicza się zarówno jako stosunek (BCFss) stężenia w rybach (Cf) i w wodzie (Cw) w pozornym stanie ustalonym, jak też jako kinetyczny czynnik biokoncentracji (BCFk), będący stosun- kiem stałych szybkości absorpcji (k1) i oczyszczania (k2), uznając kinetykę reakcji pierwszego rzędu. Jeżeli kinetyka reakcji pierwszego rzędu jest w oczywisty sposób nieprzestrzegana, należy zastosować bardziej złożone wzory (załącznik 5). Jeżeli stanu ustalonego nie osiągnie się w ciągu 28 dni, fazę absorpcji należy przedłużyć do czasu osią- gnięcia stanu ustalonego lub do 60 dni, w zależności od tego, co nastąpi najpierw; następnie rozpoczyna się fazę oczyszczania. Stała szybkość absorpcji, stała szybkość reakcji (lub stałe, w przypadku gdy zastosowane są bardziej zło- żone wzory) oczyszczania (ubytku), czynnik biokoncentracji oraz, w miarę możliwości, przedziały ufno- ści dla każdego z tych parametrów oblicza się w oparciu o wzór, który najlepiej opisuje mierzone stężenia substancji badanej w rybach i wodzie. BCF wyraża się jako funkcje całkowitej mokrej masy ryb. Jednakże, do szczególnych celów, można wyko- rzystać określone tkanki lub organy (np. mięsnie, wątroba), jeżeli ryby są wystarczająco duże, lub podzie- lić ryby na części jadalne (filet) i niejadalne (wnętrzności). Ze względu na to, że w odniesieniu do wielu sub- stancji organicznych istnieje wyraźny związek między zdolnością do biokoncentracji i lipofilowości, istnieje także odpowiadająca mu zależność między zawartością lipidów w rybach i zaobserwowaną bio- koncentracją takich substancji. Dlatego, w celu zmniejszenia tego źródła zróżnicowania w wynikach bada- nia dla substancji o wysokiej lipofilowosci (tj. o log Pow > 3), biokoncentracja powinna być wyrażona w odniesieniu do zawartości lipidów oprócz całkowitej masy ciała. 300 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 Zawartość lipidów powinna być określana na takim samym materiale biologicznym, jaki jest wykorzys- tywany dla określania substancji badanej, jeżeli jest to możliwe. 1. 4. Informacje dotyczące substancji badanej Przed przeprowadzaniem badania na biokoncentrację powinny być znane następujące informacje doty- czące substancji badanej: a) rozpuszczalność w wodzie; b) współczynnik podziału oktanol-woda Pow (oznaczany także jako Kow, ustalany za pomocą metody HPLC w A. 8); c) hydroliza; d) fotodysocjacja w wodzie, określana w warunkach napromieniowania słonecznego lub symulowanym napromienianiu słonecznym i w warunkach napromieniania badania na biokoncentracji (3); e) napięcie powierzchniowe (np. dla substancji, dla których nie można ustalić log Pow); f) prężność pary; g) biodegradalność inicjalna (jeżeli dotyczy). Inną wymaganą informacją jest toksyczność dla ryby, które mają być wykorzystywane w trakcie badania, najlepiej asymptotyczna LC50 (tj. niezależna od czasu). Dostępna musi być odpowiednia metoda analizy o potwierdzonej dokładności, precyzji i czułości, dla kwantyfikacji substancji badanej w roztworach bada- wczych i materiale biologicznym, wraz ze szczegółami dotyczącymi przygotowania i składowania próbki. Powinna być również znana analityczna granica detekcji substancji badanej zarówno w wodzie, jak i w tkankach ryb. Jeśli wykorzystywana jest substancja oznakowana 14C, powinien być znany udział radioak- tywności związany z zanieczyszczeniami. 1. 5. Ważność badania Następujące warunki powinny mieć zastosowanie w odniesieniu do badania, aby było ono ważne: — zmiana temperatury jest mniejsza niż ± 2 °C, — stężenie rozpuszczonego tlenu nie spada poniżej 60 % nasycenia, — stężenie substancji badanej w komorach utrzymuje się na poziomie ± 20 % średniej zmierzonych war- tości w trakcie fazy absorpcji, — śmiertelność lub inne negatywne skutki / choroby, zarówno wśród ryb kontrolnych, jak i badanych, jest mniejsza, niż 10 % po zakończeniu badania; w przypadku, gdy badanie jest przedłużone o kilka tygodni lub miesięcy, śmiertelność lub inne negatywne skutki w obydwu grupach ryb powinny być niż- sze niż 5 % w stosunku miesięcznym i całkowicie nie powinny przekraczać 30 %. 1. 6. Związki odniesienia Wykorzystanie związków odniesienia o znanej zdolności do biokoncentracji może być użyteczne przy sprawdzaniu procedury doświadczalnej, jeżeli jest to wymagane. Jednakże niemożliwe jest na razie pole- cenie konkretnych substancji. 1. 7. Opis metody badawczej 1. 7. 1. Aparatura Należy zadbać, aby unikać, wykorzystywania w odniesieniu do wszystkich części aparatury, materiałów, które mogą rozpuszczać się, sorbować lub ługować i wywoływać szkodliwe skutki dla ryb. Można wyko- rzystywać standardowe, prostokątne lub cylindryczne zbiorniki, wykonane z materiałów chemicznie obo- jętnych i o odpowiedniej pojemności, zgodnej ze wskaźnikiem pojemności. Wykorzystanie rur z mięk- kiego plastiku powinno być minimalne. Zalecane jest wykorzystywanie rur teflonowych, ze stali nierdzewnej i/lub szklanych. Doświadczenie wskazało, że dla substancji o wysokich współczynnikach absorpcji, jak np. syntetyczne pyretroidy, może być wymagane szkło silanizowane. W takich sytuacjach sprzęt będzie musiał po zostać wyrzucony po wykorzystaniu. 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 301 1. 7. 2 Woda Zwykle do badania wykorzystywana jest woda naturalna, która powinna być uzyskiwana z niezanieczy- szczonego źródła oraz ze źródła o jednolitej jakości. Woda rozcieńczana powinna być jakości, która pozwoli na przetrwanie wybranych gatunków ryb przez okres trwania aklimatyzacji i okres badań oraz nie będzie powodowała pojawienia się nieprawidłowego ich wyglądu lub zachowania. W idealnym przy- padku powinno się wskazać, że badane gatunki mogą przeżyć, rosnąć i rozmnażać się w wodzie rozcień- czonej (np. badanie w warunkach laboratoryjnych lub na toksyczność w cyklu życia). Woda powinna być scharakteryzowana, przynajmniej przez pH, twardość, całkowitą zawartość ciał stałych, całkowitą zawar- tość węgla organicznego oraz w miarę możliwości amonu, azotynu oraz alkaliczności i, w odniesieniu do gatunków morskich, zasolenia. Parametry, które są ważne dla optymalnego dobrostanu ryb, są znane w pełni, jednak załącznik 1 podaje zalecane najwyższe stężenia kilku parametrów dla badanych wód słod- kich i morskich. W czasie trwania badania jakość wody powinna być stała. Wartość pH powinna mieścić się w zakresie 6,0–8,5, ale podczas danego badania powinna wynosić ± 0,5 jednostek pH. W celu zapewnienia, że woda rozcieńczana nie wpłynie negatywnie na wyniki badania (np. przez zmianę właściwości substancji bada- nej) lub na zachowanie ryb, co pewien czas należy pobierać próbki do analizy. Powinny zostać oznaczone zawartości metali ciężkich (np. Cu, Pb, Zn, Cd, Ni), głównych anionów i kationów (np. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), pestycydów (np. całkowitej zawartości pestycydów organofosforowych i organochlorowych), zawar- tości węgla organicznego i zawiesin, np. co trzy miesiące, w przypadku, gdy wiadomo, że woda rozcień- czona ma względnie stałą jakość. Jeżeli wykazano, że woda ma stałą jakość przez okres co najmniej jed- nego roku, oznaczenia mogą być przeprowadzane rzadziej, a odstępy czasu między oznaczeniami wydłużone (np. co sześć miesięcy). Naturalna zawartość cząstek jak również całkowita zawartość węgla organicznego (TOC) wody do roz- cieńczania powinna możliwie jak najniższa, w celu uniknięcia absorpcji substancji badanej do materii orga- nicznej, która może zmniejszyć jej biodostępność. Najwyższa dopuszczalna wartość wynosi 5 mg/l dla czą- stek stałych (masa sucha, która nie jest przepuszczana przez filtr 0,45 ml) oraz 2 mg/l dla całkowitej zawartości węgla organicznego (patrz załącznik 1). W miarę potrzeb, woda powinna zostać przefiltro- wana przed wykorzystaniem. Udział zawartości węgla organicznego w wodzie, z badania ryb (odchody) oraz z pozostałości pożywienia powinien być możliwie jak najniższy. W trakcie trwania badania stężenie węgla organicznego w naczyniu do badania nie powinno przekraczać stężenia węgla organicznego pocho- dzącego z substancji badanej i jeżeli jest wykorzystywany, środka rozpuszczającego o więcej niż 10 mg/l (± 20 %). 1. 7. 3. Badane roztwory Podstawowy roztwór substancji badanej przygotowywany jest w odpowiednim stężeniu. Roztwór podsta- wowy powinien być przygotowywany przez mieszanie lub wstrząsanie substancji badanej w wodzie do rozcieńczania. Nie zaleca się wykorzystywania rozpuszczalników lub dyspergatorów (czynników rozpusz- czających); jednakże może to nastąpić w niektórych przypadkach, w celu wytworzenia roztworu podsta- wowego o odpowiednim stężeniu. Rozpuszczalniki, które mogą zostać wykorzystane, to etanol, metanol, eter monometylowy glikolu etylenowego, eter dwumetylenowy glikolu etylenowego, dwumetyloforma- mid i glikol trójetylenowy. Dopuszczalne dyspergatory to kremofor RH40, Tween 80, metyloceluloza 0,01 % i HCO-40. Wykorzystując czynniki łatwo ulegające biodegradacji należy zachować ostrożność, ponieważ mogą one powodować problemy z porostem bakterii w badaniach przepływowych. Substancja badana może być oznakowana radiologicznie i powinna być o możliwie największej czystości (np. > 98 %). W odniesieniu do badań przepływowych wymagany jest system, który nieprzerwanie dostarcza i rozcień- cza roztwór podstawowy substancji badanej (np. pompa dozująca, rozcieńczalnik proporcjonalny, syt- nik), w celu dostarczenia koncentratów badanych do komór badawczych. Zezwala się na co najmniej pię- ciokrotną wymianę całej objętości roztworu dziennie w każdej komorze badawczej. Preferowana ma być technika przepływowa, ale w przypadkach gdy nie jest to możliwe (np. gdy zachodzi negatywne działanie na organizmy badane), dopuszczalne jest stosowanie techniki półstatycznej, pod warunkiem że spełnione są kryteria ważności. Szybkość przepływu roztworów podstawowych i wody do rozcieńczania powinny być sprawdzane 48 godzin przed badaniem, a potem co najmniej raz dziennie. W tej kontroli zawarte jest określenie szybkości przepływu przez każdą komorę badawczą i zapewnione jest, że nie różni się ona mię- dzy komorami i wewnątrz nich o więcej niż 20 %. 302 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 1. 7. 4. Wybór gatunków Ważnymi kryteriami w wyborze gatunków jest fakt, że są one łatwo dostępne, mogą być uzyskane w odpo- wiednich rozmiarach i mogą być z powodzeniem przetrzymywane w laboratorium. Inne kryteria w odnie- sieniu do wybierania gatunków obejmują względy rekreacyjne, handlowe i ekologiczne, jak również porównywalną wrażliwość, pomyślne wykorzystanie w przeszłości itp. Zalecane gatunki do badania są podane w załączniku 2. Inne gatunki mogą zostać wykorzystane, ale może istnieć konieczność dostosowania procedury badawczej celu zapewnienia odpowiednich warunków dla przeprowadzenia badania. W takim przypadku powinno zostać odnotowane racjonalne uzasadnienie w odniesieniu do wyboru gatunku i metody doświadczalnej. 1. 7. 5. Przetrzymywanie ryb Podstawową populacje ryb aklimatyzować przez co najmniej dwa tygodnie w wodzie w temperaturze badania i karmić w oparciu o wystarczającą dietę, tego samego rodzaju, która ma być wykorzystana w trak- cie badania. Po 48-godzinnym okresie adaptacji, odnotowuje się współczynnik śmiertelności i stosuje się następujące kryteria: — śmiertelność wyższa niż 10 % populacji w ciągu siedmiu dni: odrzucić całą partię, — śmiertelność między 5 i 10 % populacji w ciągu siedmiu dni: aklimatyzować przez dodatkowe siedem dni, — śmiertelność niższa niż 5 % populacji w ciągu siedmiu dni: zaakceptować partię, jeżeli śmiertelność jest wyższa niż 5 % w ciągu siedmiu dodatkowych dni – odrzucić całą partię. Zapewnić, że ryby wykorzystywane w badaniu są wolne od dostrzegalnych chorób i nieprawidłowości. Odrzucić wszystkie chore ryby. Ryby nie powinny być leczone na żadna chorobę w okresie dwóch tygo- dni poprzedzających badanie, albo w trakcie badania. 1. 8. Przeprowadzenie badania 1. 8. 1. Badanie wstępne Może być ono użyteczne w celu przeprowadzenia wstępnego doświadczenia w celu zoptymalizowania warunków dla przeprowadzenia badania ostatecznego, np. wybór stężenia(stężeń) substancji, czasu trwa- nia fazy absorpcji i oczyszczania. 1. 8. 2. Wa run ki n ar aż enia na działanie substancji 1. 8. 2. 1. Cz a s t r wa ni a f a z y w c h ł a n i a n i a Przewidzenie czasu trwania fazy wchłaniania może zostać uzyskane w oparciu o doświadczenie praktyczne (np. z poprzedniego badania lub nagromadzenia powiązanej substancji chemicznej) lub w oparciu o pewne empiryczne związki wykorzystujące wiedzę dotyczącą albo rozpuszczalności w wodzie albo współczyn- nika podziału oktanol/woda substancji badanej (patrz załącznik 3). Faza wchlaniania powinna trwać 28 dni, chyba że może zostać udowodnione, iż równowagę osiągnięto wcześniej. Jeśli stan ustalony nie został osiągnięty przed upływem 28 dni, faza absorpcji powinna zostać przedłużona, pobierając dalsze pomiary, do momentu osiągnięcia stanu ustalonego, lub też do 60 dni, w zależności od tego, który z tych dwóch okresów jest krótszy. 1. 8. 2. 2. Cza s t r wa ni a f a z y oc z y s z c z a n i a Okres połowy czasu trwania fazy absorpcji jest zazwyczaj wystarczająca do zmniejszenia pojawiania się (95 %) substancji w masie ciała (patrz załącznik 3 dla wyjaśnienia oszacowania). Jeżeli czas wymagany do osiągnięcia 95 % straty jest zbyt długi co jest jednocześnie niepraktyczne, przekraczając przykładowo dwu- krotnie normalny czas trwania fazy absorpcji (tzn. więcej niż 56 dni), może zostać wykorzystany krótszy (np. do czasu, aż stężenie substancji badanej jest niższe niż 10 % stężenia substancji w stanie ustalonym). Jednakże w odniesieniu do substancji posiadającej bardziej złożone wzory absorpcji i oczyszczania niż te, które reprezentuje jednokomorowy model ryby i które oparte są na kinetyce pierwszego rzędu, można zastosować dłuższą fazę oczyszczania, w celu określenia stałych wartości wskaźnika utraty. Okres ten jed- nak może być regulowany przez okres, w trakcie którego stężenie substancji badanej w rybach pozostaje na poziomie powyżej analitycznego limitu wykrywania. 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 303 1. 8. 2. 3. Li c z b a ba d a n y c h r y b Wybrać taką liczba ryb przypadającą na badanie, aby w każdej próbce były co najmniej cztery ryby. Jeśli wymagana jest większa ilość, niezbędna będzie większa liczba ryb przypadających na badanie. Jeśli wyko- rzystywane są dorosłe ryby, udokumentować przed czy w doświadczeniu wykorzystano samce, samice czy też obie płci. Jeżeli wykorzystano ryby obu płci, udokumentować różnice występujące w zawartości lipidów, aby nie miały one znaczenia dla doświadczenia przed rozpoczęciem narażenia na działanie substancji; niezbędne może być połączenie wszystkich samic i samców ryb w jednym zbiorniku. W jakimkolwiek badaniu wybierane są ryby o podobnej masie tak, aby masa najmniejszej z nich nie była mniejsza niż dwie trzecie masy największej z ryb. Wszystkie ryby powinny należeć do tej samej klasy wie- kowej i pochodzić z tego samego źródła. Ze względu na to, że masa i wiek ryb mają znaczący wpływ na wartości BCF (1) szczegóły te są odpowiednio udokumentowane. Zaleca się zważenie podpróbki z zaso- bów ryb przed rozpoczęciem badania, w celu ustalenia średniej masy. 1. 8. 2. 4. Dos t a r c z a n i e r y b Wykorzystuje się wysoką proporcję między ilością ryb i wody w celu zminimalizowania zmniejszenia w Cw spowodowanego przez dodanie ryb na początku badania, a także w celu uniknięcia spadku stężenia rozpuszczonego tlenu. Proporcje te są stosowane również w tym celu, aby uniknąć spadków stężenia rozpuszczonego tlenu. Ważne jest, aby wskaźnik dostarczenia ryb był odpowiedni dla poszczególnych badanych gatunków. W każdym przypadku zaleca się, aby wskaźnik dostarczenia ryb wynosił 0,1–1,0 g ryb (masa mokra) na litr wody dziennie. Wysokie wskaźniki dostarczania ryb mogą być wykorzystane, jeśli wykaże się, że wymagane stężenie substancji badanej może być zachowane w ramach ograniczeń ± 20 % oraz że stężenie rozpuszczonego tlenu nie spada poniżej 60 % nasycenia. Wybierając systemy dostarczania ryb, bierze się pod uwagę naturalne środowisko, w którym występują dane gatunki ryb. Na przykład ryby żyjące na dnie zbiorników mogą wymagać większej przestrzeni dna akwarium w odniesieniu do tej samej objętości wody niż ryby pelagiczne. 1. 8. 2. 5. K a r m i e ni e W czasie aklimatyzacji i badania, ryby są karmione według odpowiedniej diety, o znanej całkowitej zawar- tości lipidów i białek, w ilości wystarczającej do utrzymania ich w stanie zdrowym i do zachowania ich masy ciała. Ryby są karmione w czasie aklimatyzacji i badania ilością pokarmu, na poziomie w przybli- żeniu 1–2 % masy ich ciała dziennie; utrzymuje to stężenie lipidów u większości gatunków na w miarę stałym poziomie w czasie badania. Ilość pokarmu powinna być ponownie obliczana, na przykład raz na tydzień, w celu utrzymania stałej masy ciała i zawartości lipidów. W odniesieniu do tego obliczenia, masa ciała ryb w każdej komorze badawczej może być oszacowana na postawie masy ciała ryb pobranych jako próbkę w tej komorze ostatnio. Nie ważyć ryb pozostających w komorze. Pokarm, który nie został spożyty, oraz ekskrementy są wypłukiwane z komór badawczych wkrótce po kar- mieniu (od 30 minut do 1 godziny). Komory są utrzymane w miarę możliwości w czystości przez okres trwania badania tak, aby stężenie substancji organicznej utrzymane było na możliwie jak najniższym poziomie, ze względu na to, że obecność węgla organicznego może ograniczyć biodostepność substancji badanej (1). Ze względu na to, że wiele pokarmów jest uzyskiwanych z mączki rybnej, pokarm pokarm powinien być analizowany na obecność substancji badanej. Pożądane jest także analizowanie pokarmu na obecność pestycydów i metali ciężkich. 1. 8. 2. 6. Świ a t ł o i t e m p e r a t u r a Fotookres trwa zwykle 12–16 godzin, a temperatura (± 2 °C) powinna być odpowiednia dla gatunków badanych (patrz załącznik 2). Powinien być znany rodzaj oraz właściwości oświetlenia. Należy również zwrócić uwagę na możliwe fototransformacje substancji badanej w warunkach napromieniowania. Uni- kając narażenia ryb na działanie nienaturalnych fotoproduktów, należy wykorzystywać odpowiednie oświetlenie. W niektórych przypadkach odpowiednie może być wykorzystanie filtru w celu odfiltrowania promieniowania UV poniżej 290 nm. 1. 8. 2. 7. St ę ż e n i a b a d a n i a Ryby są narażone na działanie przynajmniej dwóch stężeń substancji badanej w wodzie w warunkach prze- pływu. Zazwyczaj wybiera się wyższe (lub najwyższe) stężenie substancji badanej, aby wynosiło około 1 % jego ostrej, asymptotycznej LC50, oraz aby było przynajmniej dziesięciokrotnie wyższe od jej limitu wykry- walności w wodzie przez wykorzystywaną metodę analityczną. 304 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 Najwyższe stężenie badania można również oznaczyć przez podzielenie ostrej 96h LC50 przez odpowiedni ostry / chroniczny wskaźnik (odpowiednie wskaźniki dla niektórych substancji chemicznych wynoszą 3–100). Jeśli jest to możliwe, wybrać inne stężenie (stężenia), tak aby różniło się ono od podanego wyżej współczynnika o 10. Jeśli nie jest to możliwe ze względu na kryterium 1 % z LC50 oraz na limit anali- tyczny, można użyć czynnika niższego od 10 albo też wziąć pod uwagę zastosowanie oznakowanej sub- stancji badanej C14. Żadne wykorzystane stężenie nie powinno przekraczać poziomu rozpuszczalności substancji badanej. W przypadku gdy wykorzystuje się czynnik rozpuszczający, jego stężenie nie powinno być wyższe niż 0,1 ml/l i powinno być takie samo we wszystkich naczyniach badawczych. Wpływ stężenia, wraz z substancją badaną, na całkowitą zawartość węgla organicznego w wodzie badanej powinien być znany. Jednakże, powinny zostać podjęte wszelkie wysiłki, w celu uniknięcia wykorzystania takich materiałów. 1. 8. 2. 8. K o n t r o l e Powinna zostać przeprowadzona jedna kontrola wody do rozcieńczania lub, jeżeli jest to stosowne, jedna kontrola obejmującą czynnik rozpuszczający powinna zostać przeprowadzona oprócz badania, pod warunkiem, że ustalono, iż czynnik nie wywiera wpływu na ryby. Jeśli nie ustalono tego, powinny zostać zorganizowane obie kontrole. 1. 8. 3. Częstotliwość pomiarów jakości wody W trakcie badania powinny zostać przeprowadzone pomiary rozpuszczonego tlenu, TOC, pH oraz tem- peratury we wszystkich zbiornikach. Całkowita twardość i zasolenie, jeśli jest to odpowiednie, powinno zostać zmierzone w czasie kontroli, natomiast jeden ze zbiorników powinien zostać zbadany przy wyż- szym (lub najwyższym) stężeniu. Jako minimum, poziom rozpuszczonego tlenu oraz zasolenie, jeśli jest to odpowiednie powinno zostać zmierzone trzykrotnie: na początku, w połowie i pod koniec fazy absorp- cji oraz raz w tygodniu w czasie fazy oczyszczania. TOC powinno zostać zmierzone na początku badania (24 godziny i 48 godzin przed rozpoczęciem fazy absorpcji), przed wpuszczeniem ryb oraz przynajmniej raz w tygodniu w czasie fazy absorpcji i oczyszczania. Temperatura powinna być mierzona codziennie, pH na początku i na końcu każdego okresu, a twardość – raz w ciągu trwania badania. Zaleca się ciągłe monitorowanie temperatury, przynajmniej jednym pojemniku. 1. 8. 4. Pobieranie próbek oraz analiza ryb i wody 1. 8. 4. 1. P l a n p obi eran ia p r óbek ryb i wody Próbka wody z komór badawczych do oznaczania stężenia substancji badanej, pobierana jest przed wpusz- czeniem ryb, oraz w trakcie zarówno fazy absorpcji jak i oczyszczania. Próbki wody pobierane są przed karmieniem i w tym samym czasie, co próbki ryb. W trakcie fazy absorpcji oznaczane są stężenia sub- stancji badanych, w celu sprawdzenia ich zgodności z kryteriami ważności. Próbki ryb są pobierane przynajmniej pięć razy podczas fazy absorpcji oraz przynajmniej cztery razy pod- czas fazy oczyszczania. Ze względu na to, że czasami trudno będzie obliczyć dokładne oszacowanie war- tości BCF w oparciu o tą ilość próbek, zwłaszcza, jeśli wskazane są inne typy kinetyki niż prosta kinetyka pierwszego rzędu, wskazane może być pobieranie próbek podczas obu faz z większą częstotliwością (patrz załącznik 4). Dodatkowe próbki są składowane i analizowane jedynie wówczas gdy wyniki badań próbek pochodzących z pierwszej serii nie są wystarczające do obliczenia wartości czynnika BCF z pożądaną dokładnością. Przykład dopuszczalnego planu pobierania próbek podany jest w załączniku 4. Inne harmonogramy można łatwo obliczyć wykorzystując inne przyjęte wartości Pow dla określenia czasu narażenia na działa- nie czynników dla 95 % absorpcji. Pobieranie próbek kontynuuje się podczas fazy absorpcji do momentu, kiedy osiągnięty zostanie stan usta- lony lub przez 28 dni, w zależności od tego, który z tych dwóch okresów jest krótszy. Jeśli nie osiągnięto stanu ustalonego przed w okresie 28 dni, pobieranie próbek jest kontynuowane do czasu aż osiągnięty zos- tanie stan ustalony lub przez 60 dni, w zależności od tego, który z tych dwóch okresów jest krótszy. Przed rozpoczęciem fazy oczyszczania ryby przenoszone są do czystych zbiorników. 1. 8. 4. 2. P obieranie i prz ygo towywanie prób ek Próbki wody do analizy uzyskiwane na przykład = przez ich wypłukiwanie z centralnego punktu komory badawczej. Ze względu na to, że zarówno filtracja, jak i odwirowywanie nie zawsze powoduje oddzielenie się czynnika bioniedostępnego z pierwszej substancji od czynnika biodostępnego (zwłaszcza w substan- cjach superlipofilowych, tzn. w tych substancjach, które mają log Pow > 5) (1) (5), próbki mogą nie być poddawane takim obróbkom. 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 305 Zamiast tego pomiary powinny być pobierane w celu utrzymania zbiorników w czystości oraz zawartość całkowita węgla organicznego powinna być monitorowana zarówno podczas fazy absorpcji, jak i oczysz- czania. Odpowiednia ilość ryb (zwykle co najmniej 4) jest usuwana z komór badawczych podczas każdorazo- wego pobierania próbek. Ryby pobrane w próbkach są szybko opłukiwane wodą, plamione „na sucho”, zabijane, wykorzystując odpowiedni i humanitarny sposób, a następnie ważone. Preferowane jest analizowanie ryby i wody natychmiast po pobraniu próbek, w celu zapobieżenia degra- dacji lub innym stratom oraz w celu obliczenia średnich wskaźników absorpcji i oczyszczania w trakcie postępowania badania. Natychmiastow unika również opóźnień w określaniu, kiedy plateau zostało osią- gnięte. W przypadku niepowodzenia przeprowadzenia natychmiastowej analizy, próbki są składowane wykorzy- stując odpowiednią metodę. Przed rozpoczęciem badania uzyskiwane są informacje dotyczące właściwej metody składowania w odniesieniu do poszczególnych substancji badanych – np. głebokiego zamrażania, przetrzymywania w temperaturze 4 °C, czasu trwania składowania, ekstrakcji itp. 1. 8. 4. 3. J a koś ć met ody an a l i t y c z n e j Ze względu na to, że cała procedura uzależniona jest zasadniczo od dokładności, precyzji, i czułości metody analitycznej wykorzystywanej w odniesieniu do substancji badanej, sprawdzić doświadczalnie, iż precyzja oraz powtarzalność analizy chemicznej, jak również odzyskiwanie substancji badanej zarówno z wody, jak i są wystarczające dla danej metody. Sprawdzić również, że substancja badana nie jest wykry- walna wykorzystanej wodzie do rozcieńczania. W miarę potrzeb, wartości Cw i Cf, uzyskane z badania, są korygowane w odniesieniu do wartości tłowych uzyskanych w czasie kontroli. Z próbkami ryb i wody postępuje się w międzyczasie w taki sposób, aby zminimalizować zanieczyszczenie lub straty (np. wynikające z adsorpcji przez urządzenia do pobierania próbek). 1. 8. 4. 4. An al iz a p ró bek ry b Jeśli w badaniu wykorzystywane są substancje oznakowane radiologicznie, możliwe jest przeprowadzenie analizy w odniesieniu do całkowitego oznaczenia radiologicznego (np. macierzyste i metabolity) lub można oczyścić próbki tak, aby związek macierzysty mógł zostać poddany analizie oddzielnie. Główne metabolity mogą zostać również określone w stanie ustalonym lub pod koniec fazy pobierania, w zależ- ności od tego, która z tych faz nastąpi szybciej. Jeśli czynnik BCF jest ≥ 1 000% w kategoriach całkowitych pozostałości substancji oznakowanej radiologicznie, wskazane może być, a w odniesieniu do niektórych kategorii chemikaliów, takich jak pestycydy stanowczo zalecane zidentyfikowanie i obliczenie ilości degra- datów stanowiących ≥ 10 % całkowitej ilości pozostałości substancji w tkankach ryb w stanie ustalonym. Jeśli degradaty stanowiące ≥ 10 % całkowitych pozostałości substancji o oznaczeniu radiologicznym w tkankach ryb są zidentyfikowane i obliczone, zaleca się również identyfikację i podanie ilości degrada- tów w wodzie badanej. Stężenie substancji badanej powinno zazwyczaj być oznaczane dla każdej indywidualnie ważonej ryby. Jeśli nie jest to możliwe, można zebrać wszystkie próbki w jednym zbiorniku podczas każdego pobierania próbek, ale nie ogranicza to procedur statystycznych, które mogą mieć zastosowanie do danych. Jeżeli szczególne procedury statystyczne oraz moc statystyczna są ważnymi względami, odpowiednia liczba ryb w celu przystosowania odpowiedniej procedury zgromadzenia próbek w jednym zbiorniku powinna zostac objęta badaniem (6) (7). BCF powinno być wyrażone zarówno jako funkcja całkowitej masy mokrej oraz, w odniesieniu do sub- stancji wysoko-lipofilowych, jako funkcja zawartości lipidów. Zawartość lipidów ryb określa się podczas każdorazowego pobierania próbek, jeśli jest to możliwe. Odpowiednie metody powinny zostać wykorzys- tane w celu oznaczenia zawartości lipidów (odniesienia 8 i 2 w załączniku 3). Metoda ekstrakcji chloroform/metanol może być zalecana jako metoda standardowa (9). Różne metody nie dają identycz- nych wartości (10), zatem ważne jest podanie szczegółów dotyczących wykorzystanej metody. Jeśli jest to możliwe, analiza dla lipidów często powinna być przeprowadzona na tym samym ekstrakcie, który wytwo- rzony został dla potrzeb analizy na obecność substancji badanej, ze względu na to, że lipidy często muszą zostać usunięte z ekstraktu zanim zostanie on poddany analizie chromatograficznie. Zawartość lipidów w rybie (podana w mg/kg mokrej masy) pod koniec doświadczenia nie powinna różnić się od tej z początku doświadczenia o więcej niż ± 25 %. Procent zawartości ciał stałych w tkance powinien zostac także odnotowany, w celu umożliwienia przekształcenia stężenia lipidów z bazy mokrej w bazę stałą. 306 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 2. DANE 2. 1. Przetwarzanie wyników Krzywa absorpcji badanej substancji uzyskiwana jest przez wykreślenie jej stężenia w/na rybie (lub w okre- ślonych tkankach) w fazie absorpcji, w danym czasie, w skali arytmetycznej. Jeśli krzywa osiągnęła pla- teau, to znaczy, że stała się w przybliżeniu asymptotyczna do osi czasu, stan ustalony BCFSS obliczany jest w następujący sposób: C1 jako stan ustalony (średnia) Cw jako stan ustalony (średnia) W przypadku gdy nie został osiągnięty stan ustalony, może istnieć możliwość obliczenia BCFss o wystar- czającej precyzji dla oceny zagrożenia na podstawie „stanu ustalonego” przy 80 % (1,6/k2) lub 95 % (3,0/k2) równowagi. Również czynnik stężenia (BCFk) jest oznaczany jako stosunek k1/k2, dwóch stałych kinetycznych pierw- szego rzędu. Stała szybkość oczyszczania (k2) jest zwykle określana na podstawie krzywej oczyszczania (tzn. na podstawie wykresu spadku stężenia badanej substancji w rybie wraz z upływem czasu). Stała szyb- kość absorpcji (k1) wyliczana jest wówczas na podstawie k2 oraz wartości Cf, którą uzyskuje się z krzywej absorpcji (patrz także załącznik 5). Preferowaną metodą uzyskiwania BCFk oraz stałych wskaźników, k1 i k 2, jest wykorzystanie metod oceny parametrów nieliniowych na komputerze (11). W przeciwnym razie dla obliczenia k1 i k2 można korzystać z metod graficznych. Jeśli krzywa oczyszczenia w wyraźny sposób nie może być uznana za krzywą procesu pierwszego rzędu, wówczas powinny zostać zastosowane modele bardziej złożone (patrz odniesienia w załączniku 3) i powinno się zasięgnąć rady u biostatystyka. 2. 2. Interpretacja wyników Wyniki powinny być interpretowane uważnie w przypadku, gdy mierzone stężenia badanych roztworów występują na poziomach zbliżonych do granicy wykrywalności metody analitycznej. Jasno określone krzywe absorpcji i ubytku wskazują dobrej jakości dane o biostężeniu. Rozbieżność w sta- łych absorpcji/oczyszczenia między dwoma badanymi stężeniami powinna być niższa niż 20 %. Powinny zostać odnotowane zaobserwowane, znaczące różnice dotyczące szybkości absorpcji/oczyszczenia mię- dzy dwoma zastosowanymi badanymi stężeniami, podając możliwe wyjaśnienia. Ogólnie granica ufności BCFs, na podstawie dobrze zaprojektowanego podejścia badawczego, wynosi ± 20 %. 3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDAŃ Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje: 3. 1. Badana substancja — własności fizyczne oraz, gdy jest to istotne, właściwości fizyczno-chemiczne, — dane dotyczące identyfikacji chemicznej (łącznie z zawartością węgla organicznego, w odpowiednich przypadkach), — w przypadku oznakowania radiologicznego, dokładne położenie znaczonego atomu (znaczonych ato- mów) oraz zawartość procentową radioaktywności, związanej z nieczystościami. 3. 2. Badane gatunki — nazwa naukowa, gatunek, źródło, jakakolwiek obróbka wstępna, aklimatyzacja, wiek, zakres rozmia- rów itp. 3. 3. Warunki przeprowadzania badania — wykorzystana procedura badawcza (np. przepływowa lub półstatyczna), — rodzaj i właściwości zastosowanego oświetlenia i fotookresów, — projekt badania (np. numer i rozmiar komór badawczych, szybkość wymiany objętości wody, liczba powtórzeń, liczba ryb przypadających na powtórzenie, liczba stężeń badania, długość faz absorpcji i oczyszczenia, częstotliwość pobierania próbek ryb i wody), 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 307 — metoda przygotowania roztworów podstawowych i częstotliwość ich odnawiania, (jeśli został użyty, należy podać czynnik rozpuszczający, jego stężenie oraz jego udział w zawartości węgla organicznego wody używanej do przeprowadzenia badań), — nominalne stężenia badania, średnia mierzonych wartości oraz ich standardowe odchylenia, odnoszące się do naczyń używanych w badaniach oraz metoda, za pomocą, której zostały one uzyskane, — źródło wody do rozcieńczania, opis jakiejkolwiek obróbki wstępnej, wyniki przeprowadzenia dowodu na zdolność ryb do życia w wodzie oraz właściwości wody: pH, twardość, temperatura, stężenie rozpuszczonego tlenu, poziomy pozostałościowego chloru, (jeśli dokonano pomiaru), węgiel orga- niczny ogółem, zawiesina, stopień zasolenia środowiska zastosowanego w badaniach, (jeśli występuje taka potrzeba) oraz inne wykonane pomiary, — jakość wody w naczyniach wykorzystane w badaniach, pH, twardość, węgiel organiczny ogółem (TOC), temperatura oraz stężenie rozpuszczonego tlenu, — szczegółowe informacje w sprawie karmienia (np. rodzaj karmy, jej źródło, skład – przynajmniej, jeśli to możliwe, zawartość lipidów i białka, ilość podanej karmy i częstotliwość karmienia), — informacje w sprawie postępowania z próbkami ryb i wody, łącznie ze szczegółami dotyczącymi przy- gotowania, składowania, ekstrakcji i procedur analitycznych (oraz dokładność) w odniesieniu do bada- nej substancji i zawartości lipidów, (jeśli zmierzono). 3. 4. Wyniki — wyniki z wszelkich przeprowadzonych badań wstępnych, — śmiertelność ryb kontrolowanych oraz ryb w każdej z komór narażonych na działanie substancji oraz wszelkie inne zaobserwowane nieprawidłowe zachowania, — zawartość lipidów ryb (jeśli oznaczono w momencie przeprowadzania badania), — krzywe (łącznie z wszystkimi zmierzonymi danymi) przedstawiające absorpcję i oczyszczenie badanej substancji chemicznej w rybie, czas poprzedzający stan ustalony, — Cf i Cw (razem z odchyleniami standardowymi i zakresem, jeśli jest to stosowne) dla wszystkich cza- sów pbierania próbek (Cf wyrażone w μg/g mokrej masy (ppm)) całego organizmu lub określonych tka- nek, np. lipidy, i Cw w μg/ml (ppm). Wartości C w dla serii kontrolnych (należy również zgłosić tło), — czynnik biostężenia w stanie ustalonym (BCFss) i/lub czynnik stężenia kinetycznego (BCFk) oraz, w sto- sownych przypadkach, 95 % granicy ufności dla stałej szybkości absorpcji i oczyszczenia (ubytku), wyrażone w odniesieniu do całego organizmu i całkowitej zawartości lipidów jeśli dokonano pomia- ru, zwierzęcia lub jego poszczególnych tkanek, granice ufności i odchylenie standardowe, jeśli są dostępne, oraz metody analizy obliczeń/danych dla każdego stężenia wykorzystanej substancji bada- nej, — w przypadku gdy wykorzystano substancje oznakowane radiologicznie oraz jeśli jest wymagane, nagromadzenie jakichkolwiek wykrytych metabolitów może zostać przedstawione, — wszystko, co odbiega od normy, jeśli chodzi o badanie, wszelkie odchylenia od tych procedur oraz wszelkie inne ważne informacje. Zminimalizować ilość wyników jako „niewykrytych w granicy wykrywalności” w drodze opracowywania metod stosowanych przed badaniem i za pomocą projektu doświadczalnego, ponieważ wyniki takie nie mogą być użyte do obliczenia stałej szybkości reakcji. 4. BIBLOGRAFIA (1) Connell D. W. (1988). Bio accumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Envi- ron. Contam. Toxicol. 102, pp. 117–156. (2) Bintein S. , Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29–390. (3) OECD, Paris (1996). Direct phototrans’formation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3 (4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bio availability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark. 308 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 (5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994. (6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher’s Lane, Rockville, MD 20852. July1975. (7) US EPA (1974). Section 5, A(l). Analysis of Human or animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Resi- dues in Human and Emronmental Samples, Thompson J. F. (ed. ) Research Triangle Park, N. C. 27711. (8) Compaan H. (1980) in „The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aqua- tic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation”, Rozdział 2. 3, Part II. Government Publishing Office, the Hague, Netherlands. (9) Gardner et al, (1995). Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099-1105. (10) Randall R. C, Lee H, Ozretich R. J, Lake J. L. and Pruell R. J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bio accumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp. 1431-1436. (11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method-Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final report Marzec1987. Autorzy: P. Kristensen i N. Nyholm. (12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs. 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 309 Załącznik I Właściwości chemiczne dopuszczalnej wody do rozcieńczania Substancja Ograniczenie stężenia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Cząstki stałe Węgiel organiczny ogółem Amoniak niejonizowany Chlor pozostały Pestycydy fosforoorganiczne Pestycydy z grupy węglowodorów chlorowanych oraz bifenyle polichlo- rowane Chlor organiczny ogółem Glin Arsen Chrom Kobalt Miedź Żelazo Ołów Nikiel Cynk Kadm Rtęć Srebro 5 mg/l 2 mg/l 1 μg/l 10 μg/l 50 ng/l 50 ng/l 25 ng/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 100 ng/l 100 ng/l 100 ng/l 310 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 Załącznik 2 Gatunki ryb zalecane do przeprowadzenia badania Zalecane gatunki Zalecany zakres temperatur bada- nia (°C) Zalecana całkowita długość badanego zwierzęcia (cm) 1 2 3 4 5 6 7 8 Danio rerio (1) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan) Danio pręgowany 20–25 3,0 ± 0,5 Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque) Strzebla Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus) Karp Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck and Schlegel) Ryżówka Poccilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) Gupik Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) Okoń błękitnoskrzeli (Bluegill) (Rafinesque) 20–25 20–25 20–25 20–25 20–25 5,0 ± 2,0 5,0 ± 3,0 4,0 ± 1,0 3,0 ± 1,0 5,0 ± 2,0 Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum) Pstrąg tęczowy 13–17 8,0 ± 4,0 Gasterosteus aculeatus (Teleostei, Gasterosteidae) (Linnaeus) Cier- nik 18–20 3,0 ± 1,0 (1) Meyer A, Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B, Vol. 252, str. 231. W różnych krajach wykorzystano różne gatunki występujące w wodach przybrzeżnych i gatunki morskie, na przykład: Spot Owczarz karpiowaty Kiżucz Szumień mały Złocica europejska Kur rogacz Ciernik trzypromienny Labraks Ukleja Leiostomus xanthurus Cyprinodon variegatus Mienidia beryl Cymatogaster aggregata Parophrys vertulus Leptocottus armatus Gasteroseteus aculeatus Dicentratracus labrax Alburnus alburnus Gromadzenie Ryby słodkowodne, wymienione w tabeli, są łatwe w hodowli i/lub są szeroko dostępne w ciągu roku, podczas gdy dostępność gatunków morskich i zamieszkujących wody przybrzeżne jest częściowo ograniczona do odpowiednich krajów. Nadają się one do hodowli i rozmnażania albo w gospodarstwach rybnych, albo w laboratoriach, w warun- kach chroniących je od chorób i pasożytów. Ryby te dostępne są w wielu częściach świata. 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 311 Załącznik 3 Przewidywanie czasu trwania faz wchłaniania i oczyszczenia 1. Przewidywanie czasu trwania fazy wchłaniania Przed przeprowadzeniem badania, oszacować k2 i wskutek tego pewien udział procentowy czasu potrzebnego do osiągnięcia stanu ustalonego może zostać uzyskany na podstawie zależności empirycznych między k2 a n-oktanolo/wodnym współczynnikiem podziału (Pow) oraz k2 i wodną rozpuszczalnością (s). Oszacowanie k2 (dzień-1) może zostać uzyskane na przykład z następujących zależności empirycznych (1) log10k2 = -0,414 log10(Pow) + 1,47 (r2 = 0,95) (równanie 1) W odniesieniu do innych zależności – patrz odniesienie 2. Jeśli nie jest znany współczynnik podziału (Pow), można dokonać oszacowania (3) na podstawie wiedzy o rozpuszczalności wodnej substancji, wykorzystując wzór: log10(Pow) = 0,862 log10(s) + 0,710 (r2 = 0,994) (równanie 2) gdzie: s = rozpuszczalność (mol/l): (n = 36). Zależności te stosują się jedynie do substancji chemicznych o wartościach log Pow pomiędzy 2 a 6,5 (4). Czas potrzebny do osiągnięcia pewnego udziału procentowego stanu ustalonego może zostać uzyskany przez stosowanie oszacowania k2, na podstawie ogólnego równania kinetycznego, opisującego absorpcje i oczyszcza- nie (kinetyka pierwszego rzędu): lub jeśli Cw jest stałe, w następujący sposób: W momencie zbliżania się do stanu stacjonarnego (t ∞), równanie 3 można zredukować (5) (6) do: Wówczas k1/k2 Cw zbliża się do stężenia w rybie w stanie ustalonym (Cf,s). Równanie 3 może zostać rozpisane do: Cf = Cf,s = (1 – e t –k 2 ) lub = 1 – e t –k 2 Cf Cfs (równanie 4) Stosując równanie 4, czas potrzebny do osiągnięcia udziału procentowego stanu ustalonego może zostać prze- widziany, jeśli k2 jest uprzednio oszacowane, wykorzystując równania 1 lub 2. Jako wytyczna, statystycznie optymalny czas trwania fazy absorpcji dla wytworzenia statystycznie możliwych do przyjęcia danych (BCFk) jest okresem, który jest wymagany do tego, aby krzywa logarytmu stężenia substan- cji badanej w rybie, wykreślona w zestawieniu z czasem podanym liniowo, osiągnęła swój punkt środkowy lub 1,6/k2, lub też 80 % stanu ustalonego, ale nie więcej niż 3,0/k2 lub 95 % stanu ustalonego (7). Czas potrzebny do osiągnięcia 80 % stanu ustalonego (równanie 4): 0,80 = 1 – e t –k 80 2 lub t80 = 1,6 k2 (równanie 5) 312 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 Podobnie 95 % stanu ustalonego wynosi: t95 = 3,0 k2 (równanie 6) Na przykład czas trwania fazy wchłaniania (up) dla substancji badanej o log Pow = 4 wynosiłby (wykorzystując równania 1, 5 i 6): log10k2 = -0,414. (4) + 1,47 k2= 0,652 dni-1 up (80 %) = 1,6/0,652, i. e. 2,45 days (59 godzin) lub up (95 %) = 3,0/0,652, i. e. 4,60 days (110 godzin) Podobnie, w odniesieniu do substancji badanej s = 10-5 mol/1 (log(s) = 5,0) czas trwania wynosiłby (wykorzy- stując równania 1, 2, 5 i 6): log10 (Pow) = -0,862 (-5,0) + 0,710 = 5,02 log10k2 k2 = -0,414 (5,02) + 1,47 = 0,246 dni-1 up (80 %) = 1,60/0,246, tj. 6,5 dni (156 godzin) lub up (95 %) = 3, 0/0, 246, tj. 12,2 dni (293 godzin Alternatywnie, wyrażenie: teq = 6,54 x 10-3 Pow + ,31 (godzin) może być wykorzystane do obliczenia czasu potrzebnego do skutecznego osiągnięcia stanu ustalonego (4). 2. Przewidywanie czasu trwania fazy oczyszczenia Przewidywanie ilości czasu potrzebnego do wyeliminowania zanieczyszczenia z organizmu do pewnej ilości udziału procentowego stężenia początkowego może zostać uzyskane na podstawie ogólnego równania, opisu- jącego absorpcje i oczyszczanie (kinetyka pierwszego rzędu) (1) (8). Dla fazy oczyszczania przyjmuje się Cw równe zeru. Równanie można zredukować do: Gdzie Cf, jest stężeniem z początku stanu oczyszczania 50 %. Oczyszczanie osiągnięte zostanie wówczas w cza- sie (t 50): Podobnie 95 % oczyszczania zostanie osiągnięte w następującym czasie: Jeśli 80 % absorpcji wykorzystywane jest w odniesieniu do pierwszego okresie (1,6/k2), a 95 % ubytku w fazie oczyszczania (3,0/k2), wówczas faza oczyszczania jest w przybliżeniu dwa razy dłuższa niż długość fazy wchła- niania. Jednakże ważne jest aby odnotować, że oszacowania oparte są na założeniu, że wzory absorpcji i oczyszczania będą zgodne z kinetyką pierwszego rzędu. Jeśli w wyraźny sposób kinetyka pierwszego rzędu nie jest przestrze- gana, powinny zostać wykorzystane bardziej złożone modele (np. odniesienie (1)). 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 313 Literatura (załącznika 3) (1) Spacie A. and Hamelink J. L. (1982) Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Toxicol. and Chem. 1, pp. 309–320. (2) Kristensen P. (1991 ) Bioconcentration in fish: comparison of BCFs derived from OecD and ASTM testing methods; influence of p articulate matter to the bio availability of chemicals. Danish Water Quality Institute. (3) Chiou C. T. and Schmedding (3) (1982). Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Tech- nol. 16, pp. 1. 4–10. (4) Hawker D. W. and Connell D. W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), pp. 701-707. (5) Branson D. R. , Blau G. E. , Alexander H. C. i Neely W. B. (1975). Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp. 785–792. (6) Ernst W. (1985). Accumulation in Aquatic organisms. W: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of che- micals. Ed. by Sheehman P. , Korte F. , Klein W. and Bourdeau P. H. Part 4. 4, str. 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd N. Y. (7) Reilly P. M. , Bajramovic R. , Blau G. E. , Branson D. R. i Sauerhoff M. W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kenetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, pp. 614–622. (8) Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980). Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, pp. 3–19. 314 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 Załącznik 4 Teoretyczny przykład harmonogramu pobierania próbek w odniesieniu do badań biokoncentracji substancji o log Pow = 4 Harmonogram badania próbek Minimalna wyma- gana częstotliwość (dni) Dodatkowe pobiera- nie probek Liczba ryb przypadają- cych na jedną próbkę Liczba próbek wody Pobieranie próbek ryb Faza wchłaniania pierwsza druga trzecia czwarta piąta Faza oczyszczania szósta siódma ósma -1 0 0,3 0,6 1,2 2,4 4,7 5,0 5,9 9,3 0,4 0,9 1,7 3,3 5,3 7,0 11,2 17,5 2 (*) 2 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2 Dodać 45–80 ryb 4 (4) 4 (4) 4 (4) 4 (4) 6 Przenieść ryby do wody wolnej od badanej substancji chemicznej 4 (4) 4 (4) 4 (4) 6 (4) dziewiąta 14,0 (*) Woda próbki po dostarczeniu co najmniej trzech objętości komór. Wartości w nawiasach są liczbami próbek (woda, ryby), które mają zostać pobrane, jeśli przeprowadzane jest dodatkowe pobieranie próbek. Uwagi: Oznaczenie k2 dla log Pow z 4,0 przed badaniem wynosi 0,652 dnia-1. Całkowita długość trwania eksperymentu ustalona jest na 3 × faza absorpcji = 3 × 4,6 dnia, np. 14 dni. W odniesieniu do oszacowania absorpcji – odnieść się do załącznika 3. 13/t. 21 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 315 Załącznik 5 Rozróżnianie modeli Większość danych dotyczących biokoncentracji uznano za dość dobrze opisane za pomocą prostego modelu dwu- komorowego o dwóch parametrach, jak wskazano za pomocą krzywej prostoliniowej, która zbliża się do punktów stężenia w rybach, w czasie fazy oczyszczania, gdy są one wykreślone na papierze półlogarytmicznym. (W przypad- ków gdy punktów tych nie można opisać za pomocą krzywej prostoliniowej, wówczas należy zastosować modele złożone; patrz na przykład: Spacie i Hamelink, odniesienie 1 w literaturze w załączniku 3). Graficzne metody oznaczaniaa stałej szybkości oczyszczania (ubytku) k2 Wykreślić stężenie substancji badnej zawartej w każdej z próbek ryb w czasie pobierania próbek na papierze półlo- garytmicznym. Nachyleniem tej linii jest k2. k2 = ln(Cf1/Cf2) t1 Należy zauważyć, że odchylenia od linii prostej mogą wskazywać na bardziej złożony schemat oczyszczania niż ten oparty na kinetyce pierwszego rzędu. Metoda graficzna może być zastosowana do analizowania typów oczyszcza- nia, które są odchyleniem od kinetyki procesu pierwszego rzędu. Graficzne metody oznaczania stałej szybkości absorpcji k1 Mając podane k2, obliczyć k1 w następujący sposób: Wartość Cf odczytywana jest ze środkowego punktu części gładkiej krzywej absorpcji, powstałej w oparciu o dane, gdy stężenie logarytmiczne jest wykreślone w zależności od czasu (w skali arytmetycznej). 316 PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej 13/t. 21 Metoda komputerowego obliczania stałych szybkości absorpcji i oczyszczania (ubytku) Preferowaną metodą uzyskiwania czynnika biokoncentracji oraz stałych szybkości reakcji, k1 i k2, jest wykorzysta- nie metod oceny parametrów nieliniowych na komputerze. Programy te przypisują wartości dla k1 i k2 w oparciu o zestaw danych dotyczących czasu sekwencyjnego stężenia i modelu: Cf = Cw∙ k1 k2 x (l - e -k 2 t) 0 < t < tc (równanie 2) Cf = Cw∙ k1 k2 x(e -k 2(t -t k 2 c)e t) t < tc (równanie 3) gdzie: tc = czas przy końcu fazy absorpcji Podejście to przewiduje standardowe oszacowania odchyleń k1 i k2. Ponieważ k2 w większości przypadków może zostać oszacowane na podstawie krzywej oczyszczenia z dość wysoką dokładnością oraz ze względu na istnienie silnego związku między dwoma parametrami k1 i k2, gdy obliczane są równocześnie, wskazane może być obliczanie najpierw k2, jedynie na podstawie danych dotyczących oczyszczania, a w następnej kolejności obliczanie k1, na podstawie danych dotyczących wchłaniania, używając regresji nieliniowej