title: Směrnice Komise 98/64/ES ze dne 3. září 1998, kterou se stanoví analytické metody Společenství pro stanovení aminokyselin, tuků a olachindoxu v krmivech a kterou se mění směrnice 71/393/EHSText s významem pro EHP

eurovoc_concepts:
analytical chemistry
animal nutrition
fats
food inspection
organic acid

text: 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 433 31998L0064 L 257/14 ÚŘEDNÍ VĚSTNÍK EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ 19. 9. 1998 SMĚRNICE KOMISE 98/64/ES ze dne 3. září 1998, kterou se stanoví analytické metody Společenství pro stanovení aminokyselin, tuků a olachindoxu v krmivech a kterou se mění směrnice 71/393/EHS (Text s významem pro EHP) KOMISE EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ, vzhledem k tomu, že musí být stanoveny analytické metody Společenství pro kontrolu těchto látek; s ohledem na Smlouvu o založení Evropského společenství, vzhledem k tomu, že opatření této směrnice jsou v souladu se stanoviskem Stálého výboru pro krmiva, Rady směrnici s ohledem na dne 20. července 1970 o zavedení metod odběru vzorků a analy- tických metod Společenství pro úřední kontrolu krmiv (1), na- posledy pozměněnou Aktem o přistoupení Rakouska, Finska a Švédska, a zejména na článek 2 uvedené směrnice, 70/373/EHS za vzhledem k tomu, že směrnice 70/373/EHS stanoví, že úřední kontrola krmiv za účelem kontroly, zda krmiva splňují poža- davky vyplývající z právních a správních předpisů týkajících se jejich jakosti a složení, se provádí za použití metod odběru vzorků a analýzy platných ve Společenství; vzhledem k tomu, že směrnice Rady 79/373/EHS ze dne 2. dubna 1979 o uvádění krmných směsí na trh (2), naposledy pozměněná směrnicí Komise 97/47/ES (3), a směrnice Rady 93/74/EHS ze dne 13. září 1993 o krmivech určených ke zvláštním účelům výživy (4), naposledy pozměněná směrnicí 96/25/ES (5), stanoví, že obsah aminokyselin a tuku musí být uvedeny na označení krmiv; vzhledem k tomu, že směrnice Rady 70/524/EHS ze dne listopadu 1970 o doplňkových látkách v krmivech (6), na- 23. posledy pozměněná směrnicí Komise 98/19/ES (7), stanoví, že obsah olachindoxu musí být uveden na označení, pokud je tato látka přidána do krmných směsí; vzhledem k tomu, že druhá směrnice Komise 71/393/EHS ze listopadu 1971, kterou se stanoví analytické metody dne 18. Společenství pro úřední kontrolu krmiv (8), naposledy pozmě- něná směrnicí Komise 84/4/EHS (9), stanoví metody analýzy mimo jiné i pro zjišťování obsahu tuku; že je vhodné uvedené metody upravit; (1) Úř. věst. L 170, 3. 8. 1970, s. 2. (2) Úř. věst. L 86, 6. 4. 1979, s. 30. (3) Úř. věst. L 211, 5. 8. 1977, s. 45. (4) Úř. věst. L 237, 22. 9. 1993, s. 23. (5) Úř. věst. L 125, 23. 5. 1996, s. 35. (6) Úř. věst. L 270, 14. 12. 1970, s. 1. (7) Úř. věst. L 96, 28. 3. 1998, s. 39. (8) Úř. věst. L 279, 2. 12. 1971, s. 7. (9) Úř. věst. L 15, 18. 1. 1984, s. 28. PŘIJALA TUTO SMĚRNICI: Článek 1 Členské státy stanoví, že analýzy pro úřední kontrolu obsahu tuku a obsahu olachindoxu v krmivech se aminokyselin, provádějí za použití metod uvedených v příloze této směrnice. Článek 2 V příloze směrnice Komise 71/393/EHS se bod „4. Stanovení obsahu tuku“ nahrazuje částí B přílohy této směrnice. Článek 3 1. Členské státy uvedou v účinnost právní a správní před- pisy nezbytné pro dosažení souladu s touto směrnicí nejpoz- ději do 31. prosince 1998. Uvědomí o nich neprodleně Komisi. Budou tyto předpisy používat od 1. ledna 1999. Tato opatření přijatá členskými státy musí obsahovat odkaz na tuto směrnici nebo musí být takový odkaz učiněn při jejich úředním vyhlášení. Způsob odkazu si stanoví členské státy. 434 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 2. Členské státy sdělí Komisi znění hlavních ustanovení vnitrostátních právních předpisů, které přijmou v oblasti působnosti této směrnice. Tato směrnice je určena členským státům. Článek 5 Článek 4 V Bruselu dne 3. září 1998. Tato směrnice vyhlášení v Úředním věstníku Evropských společenství. vstupuje v platnost dvacátým dnem po Za Komisi Franz FISCHLER člen Komise 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 435 PŘÍLOHA ČÁST A Stanovení aminokyselin 1. Účel a oblast použití Tato metoda slouží ke stanovení obsahu volných (syntetických a přirozených) a vázaných (peptidy vázané a volné) aminokyselin v krmivech za použití analyzátoru aminokyselin. Metoda je použitelná pro tyto amino- kyseliny: cyst(e)in, methionin, lysin, threonin, alanin, arginin, kyselinu asparagovou, kyselinu glutamovou, glycin, histidin, isoleucin, leucin, fenylalanin, prolin, serin, tyrosin a valin. Tato metoda nerozlišuje mezi solemi aminokyselin a nemůže také u aminokyselin rozlišovat mezi formami D a L. Není použitelná pro stanovení tryptofanu nebo hydroxy analogů aminokyselin. 2. Princip 2. 1 Volné aminokyseliny Volné aminokyseliny se extrahují zředěnou kyselinou chlorovodíkovou. Současně extrahované dusíkaté makro- molekuly se srážejí kyselinou sulfosalycilovou a odstraňují se filtrací. Zfiltrovaný roztok se upraví na pH 2,20. Aminokyseliny se separují iontoměničovou chromatografií a stanoví se po reakci s ninhydrinem fotometrickou detekcí při 570 nm. 2. 2 Vázané aminokyseliny Zvolený proces závisí na stanovovaných aminokyselinách. Cyst(e)in a methionin musí být před hydrolýzou oxidovány na kyselinu cysteovou a na methioninsulfon. Tyrosin se musí stanovovat v hydrolyzátech neoxido- vaných vzorků. Ostatní aminokyseliny uvedené v bodě 1 mohou být zjišťovány buď v oxidovaném nebo v neoxidovaném vzorku. Oxidace se provádí při 0 oC směsí kyseliny permravenčí a fenolu. Nadbytečné oxidační činidlo se rozloží dvojsí- ranem sodným. Oxidovaný nebo neoxidovaný vzorek se hydrolyzuje kyselinou chlorovodíkovou (c = 6 mol/l) po 23 hodin. Hydrolyzát se upraví na pH 2,20. Aminokyseliny se separují iontoměničovou chromatografií a stanovují se po reakci s ninhydrinem fotometrickou detekcí při 570 nm (440 nm pro prolin). 3. Činidla Musí být použita dvakrát destilovaná voda nebo voda obdobné jakosti (vodivost < 10 µS). 3. 1 3. 2 3. 3 3. 4 3. 5 3. 6 3. 7 3. 8 3. 9 peroxid vodíku, w = 30 % kyselina mravenčí, w = 98–100 % fenol dvojsíran sodný hydroxid sodný kyselina 5-sulfosalicylová, dihydrát kyselina chlorovodíková o hustotě přibližně 1,18 g/ml citronan sodný, dihydrát 2,2-thiodiethanol (thiodiglykol) 3. 10 chlorid sodný 3. 11 ninhydrin 3. 12 petrolether, bod varu 40–60 °C 3. 13 norleucin nebo jiná sloučenina použitelná jako vnitřní standard 3. 14 dusík – plyn (< 10 ppm kyslíku) 436 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 3. 15 1-oktanol 3. 16 aminokyseliny 3. 16. 1 standardní látky uvedené v bodě 1; čisté sloučeniny neobsahující krystalizační vodu. Vysuší se ve vakuu nad P2O5 nebo H2SO4 týden před použitím 3. 16. 2 kyselina cysteová 3. 16. 3 methioninsulfon 3. 17 hydroxid sodný, roztok c = 7,5 mol/l: 300 g NaOH (3. 5) se rozpustí ve vodě a doplní do 1 litru. 3. 18 hydroxid sodný, roztok c = 1 mol/l: 40 g NaOH (3. 5) se rozpustí ve vodě a doplní do 1 litru. 3. 19 roztok kyseliny mravenčí a fenolu: Smíchá se 889 g kyseliny mravenčí (3. 2) se 111 g vody a přidá se 4,73 g fenolu (3. 3). 3. 20 hydrolyzační směs, c = 6 mol HCl/l s přídavkem 1 g fenolu/l: K 492 ml HCl (3. 7) se přidá 1 g fenolu (3. 3) a doplní se vodou do 1 litru. 3. 21 extrakční směs, c = 6 mol HCl/l s přídavkem 2% thiodiglykolu: 8,2 ml HCl (3. 7) se rozředí přibližně 900 ml vody, přidá se 20 ml thiodiglykolu (3. 9) a doplní vodou na 1 litr (3. 7 a 3. 9 se nesmí smíchat přímo). 3. 22 kyselina 5-sulfosalicylová, β = 6 %: 60 g kyseliny 5-sulfosalicylové (3. 6) se rozpustí ve vodě a doplní vodou na 1 litr. 3. 23 oxidační směs (kyselina permravenčí – fenol): V malé kádince se smíchá 0,5 ml peroxidu vodíku (3. 1) s 4,5 ml roztoku kyseliny mravenčí s fenolem (3. 19); ponechá se v klidu 1 hodinu při 20–30 oC, aby se utvořila kyselina permravenčí, před přidáním ke vzorku se směs ochladí v lázni s ledovou vodou (15 minut). Pozor: Je nutno zamezit kontaktu s kůží a používat ochranný oděv. 3. 24 citronanový tlumivý roztok, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: V přibližně 800 ml vody se rozpustí 19,61 g citronanu sodného (3,8), 5 ml thiodiglykolu (3. 9), 1 g fenolu (3. 3) a 16,50 ml HCl (3. 7). pH se upraví na 2,20. Doplní se vodou na objem 1 litru. 3. 25 eluční tlumivé roztoky připravované podle podmínek pro použitý analyzátor (4. 9) 3. 26 ninhydrinové činidlo připravované podle podmínek pro použitý analyzátor (4. 9) 3. 27 Standardní roztoky aminokyselin. Tyto roztoky je nutno uschovávat při teplotě pod 5 oC. 3. 27. 1 zásobní standardní základní roztoky aminokyselin (3. 16. 1), c = 2,5 µmol/ml pro každou aminokyselinu v kyselině chlorovodíkové. Tento roztok lze obdržet i komerčně připravené. 3. 27. 2 zásobní standardní základní roztok kyseliny cysteové a methioninsulfonu, c = 1,25 µmol/ml 0,2115 g kyseliny cysteové (3. 16. 2) a 0,2265 g methioninsulfonu se rozpustí (3. 16. 3) v citronanovém tlumivém roztoku (3. 24) v litrové odměrné baňce a doplní se po značku citronanovým tlumivým roztokem. Skladuje se při teplotě pod 5 oC nejdéle 12 měsíců. Tento roztok se nepoužívá, pokud standardní základní roztok (3. 27. 1) obsahuje kyselinu cysteovou a methioninsulfon. 3. 27. 3 zásobní standardní základní roztok vnitřního standardu, např. norleucinu, c = 20 µmol/ml 0,6560 g norleucinu (3. 13) se rozpustí v citronanovém tlumivém roztoku (3. 24) v odměrné baňce na 250 ml a doplní se po značku citronanovým tlumivým roztokem. Skladuje se při teplotě pod 5 oC nejdéle 6 měsíců. 3. 27. 4 kalibrační roztok standardních aminokyselin pro použití s hydrolyzáty, c = 5 nmol/50 µl kyseliny cysteové a methioninsulfonu a c = 10 nmol/50 µl u ostatních aminokyselin 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 437 Ve 100 ml kádince se rozpustí 2,2 g chloridu sodného (3. 10) v 30 ml citronanového tlumivého roztoku (3. 24). Přidají se 4,00 ml zásobního standardního základního roztoku aminokyselin (3. 27. 1), 4,00 ml zásob- ního standardního základního roztoku kyseliny cysteové a methioninsulfonu (3. 27. 2) a 0,50 ml zásobního standardního základního roztoku vnitřního standardu (3. 27. 3), pokud se používá. pH se upraví na 2,20 hydro- xidem sodným (3. 18). Roztok se kvantitativně převede do 50 ml odměrné baňky, doplní po značku citronanovým tlumivým roztokem (3. 24) a zamíchá se. Skladuje se při teplotě pod 5 oC nejdéle 3 měsíce. Viz také poznámky 9. 1. 3. 27. 5 kalibrační roztok standardních aminokyselin pro použití s hydrolyzáty, připravenými podle bodu 5. 3. 3. 1 a pro extrakty (5. 2). Kalibrační roztok se připravuje podle 3. 27. 4 s vynecháním chloridu sodného. 4. 4. 1 4. 2 4. 3 4. 4 4. 5 4. 6 4. 7 4. 8 4. 9 Skladujte při teplotě pod 5 oC nejdéle 3 měsíce. Přístroje a pomůcky baňka s kulatým dnem o obsahu 100 nebo 250 ml opatřená zpětným chladičem nádoba z borosilikátového skla o obsahu 100 ml se šroubovým uzávěrem s gumovým nebo teflonovým těsněním (např. Duran, Schott) pro použití v sušárně sušárna s nuceným větráním a tepelnou regulací s přesností lepší než ±2 °C pH metr (tři desetinná místa) membránový filtr (0,2 µm) odstředivka rotační vakuová odparka mechanická třepačka nebo magnetická míchačka analyzátor aminokyselin nebo zařízení HPLC s iontoměničovou kolonou, zařízením pro ninhydrin, post kolo- novou derivatizaci a fotometrickým detektorem. Kolona se naplní sulfonovanou polystyrenovou pryskyřicí, která umožňuje vzájemné oddělení aminokyselin a separaci od jiných ninhydrin pozitivních látek. Průtok tlumivého roztoku a ninhydrinu zajišťují čerpadla se stálostí průtoku ± 0,5 % po dobu zahrnující standardní kalibraci i analýzu vzorku. Některé analyzátory aminokyselin je možno použít v případě, že hydrolyzát vykazuje koncentraci sodíkových iontů c = 0,8 mol/l a obsahuje zbytkovou mravenčí kyselinu z oxidačního kroku. Jiné analyzátory nezaručují uspokojivou separaci určitých aminokyselin, obsahuje-li hydrolyzát nadbytečnou mravenčí kyselinu a/nebo vysoké koncentrace sodíkových iontů. V takovém případě se sníží objem kyseliny před úpravou pH odpařením hydrolyzátu na objem 5 ml. Odpaření se má provádět ve vakuu při teplotě nejvýše 40 oC. 5. Postup 5. 1 Příprava vzorku Vzorek se upraví mletím tak, aby prošel sítem s oky 0,5 mm. Vzorky s vysokou vlhkostí se musí před mletím vysušit na vzduchu při teplotě nepřesahující 50 oC nebo při zmrazení. Vzorky s vysokým obsahem tuku se před mletím extrahují petroletherem (3. 12). 5. 2 Stanovení volných aminokyselin v krmivech a v premixech Do kónické baňky se odváží příslušné množství (1–5 g) upraveného vzorku (5. 1) s přesností na 0,2 mg a přidá se 100,0 ml extrakční směsi (3. 21). Potom se třepe 60 minut na mechanické třepačce nebo míchá na magnetické míchačce (4. 8). Po usazení sedimentu se odpipetuje 10,0 ml supernatantu do kádinky o obsahu 100 ml. 438 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 Za stálého míchání se přidá 50 ml roztoku kyseliny sulfosalicylové a pokračuje se v míchání na magnetické míchačce dalších 5 minut. Supernantant se přefiltruje nebo odstředí tak, aby se odstranila veškerá sraženina. 10,0 ml odstředěného roztoku se přenese do kádinky o obsahu 100 ml, pH se upraví na 2,20 pomocí roztoku hydroxidu sodného (3. 18), potom se roztok převede pomocí citronanového tlumivého roztoku (3. 24) do odměrné baňky přiměřené velikosti a doplní po značku tlumivým roztokem (3. 24). Použije-li se interní standard, přidá se 1,00 ml interního standardu (3. 27. 3) na každých 100 ml odstředěného roztoku a potom se doplní po značku tlumivým roztokem (3. 24). Dále se pokračuje podle bodu 5. 4 – chromatografie. Nejsou-li extrakty zpracovány týž den, uschovávají se při teplotě pod 5 oC. 5. 3 Stanovení celkových aminokyselin 5. 3. 1 ox i da ce 0,1 až 1 g upraveného vzorku (5. 1) se odváží s přesností 0,2 mg: — do baňky s kulatým dnem o obsahu 100 ml (4. 1) pro otevřenou hydrolýzu (5. 3. 2. 3) nebo — do baňky s kulatým dnem o obsahu 250 ml (4. 1), požaduje-li se nízká koncentrace sodíku nebo — do nádoby o obsahu 100 ml se šroubovací uzávěrem (4. 2) (pro uzavřenou hydrolýzu 5. 3. 2. 4). Odvážená část vzorku by měla mít obsah dusíku asi 10 mg a obsah vlhkosti nepřesahující 100 mg. Baňka/nádoba se umístí do lázně s ledovou vodou a ochladí se na 0 oC, potom se přidá 5 ml oxidační směsi (3. 23) a promíchá se skleněnou lžící se zahnutou špičkou. Baňka/nádoba se uzavře i se lžící vzduchotěsnou folií a vloží se i s lázní s ledovou vodou do chladničky při 0 oC a ponechá se tam 16 hodin. Po 16 hodinách se vyjme z chladničky a přebytečné oxidační činidlo se rozloží přidáním 0,84 g dvojsíranu sodného (3. 4). Dále se pokračuje podle 5. 3. 2. 1. 5. 3. 2 hy drolý z a 5. 3. 2. 1 hydrolýza oxidovaných vzorků K oxidovanému vzorku připravenému podle 5. 3. 1 se přidá 25 ml hydrolyzační směsi (3. 20) tak, aby neulpěl žádný vzorek na stěnách nádoby ani na lžíci. Podle zvoleného postupu hydrolýzy se pokračuje podle 5. 3. 2. 3 nebo 5. 3. 2. 4. 5. 3. 2. 2 hydrolýza neoxidovaných vzorků Do baňky s kulatým dnem o obsahu 100 ml nebo 250 ml (4. 1) nebo do nádoby o obsahu100 ml se šroubo- vacím uzávěrem (4. 2) se odváží 0,1 až 1 g upraveného vzorku (5. 1) s přesností na 0,2 mg. Odvážená část vzorku by měla mít obsah dusíku asi 10 mg. Opatrně se přidá 25 ml hydrolyzační směsi (3. 20) a smíchá se se vzorkem. Dále se postupuje buď podle 5. 3. 2. 3 nebo podle 5. 3. 2. 4. 5. 3. 2. 3 otevřená hydrolýza Ke směsi v baňce (připravené podle 5. 3. 2. 1 nebo 5. 3. 2. 2) se přidají 3 skleněné kuličky a směs se uvede do mírného varu pod zpětným chladičem na dobu 23 hodin. Po skončení hydrolýzy se zpětný chladič promyje 5 ml citronanového tlumivého roztoku (3. 24). Baňka se odpojí a ochladí se v ledové lázni. Dále se postupuje podle 5. 3. 3. 5. 3. 2. 4 uzavřená hydrolýza Baňka se směsí připravenou podle 5. 3. 2. 1 nebo 5. 3. 2. 2 se umístí do sušárny (4. 3) při 110 oC. Aby se během první hodiny zabránilo narůstání tlaku (v důsledku vyvíjení plynných látek) a nedošlo k výbuchu, položí se šroubovací uzávěr volně na baňku. Nádoba se neuzavírá. Po uplynutí jedné hodiny se uzávěr zašroubuje a uza- vřená baňka se ponechá v sušárně (4. 3) 23 hodin. Po skončení hydrolýzy se baňka vyjme ze sušárny, opatrně se odšroubuje uzávěr a postaví se do lázně s ledovou vodou. Baňka se nechá vychladnout. Podle zvoleného postupu při úpravě pH (5. 3. 3) se obsah baňky kvantitativně převede pomocí citronanového tlumivého roztoku (3. 24) do kádinky o obsahu 250 ml nebo do baňky s kulatým dnem o obsahu 250 ml. Dále se postupuje podle 5. 3. 3 5. 3. 3 úp r a v a p H Podle toho, jakou toleranci k sodíku má analyzátor aminokyselin (4. 9), postupujte při úpravě pH podle 5. 3. 3. 1 nebo 5. 3. 3. 2. 5. 3. 3. 1 pro chromatografické systémy (4. 9), vyžadující nízkou koncentraci sodíku: Pokud analyzátor aminokyselin vyžaduje nízkou koncentraci sodíku (má-li se snížit obsah kyselin), doporučuje se použít vnitřní zásobní standardní roztok (3. 27. 3). 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 439 V takovém případě se před odpařováním přidají do hydrolyzátu 2,00 ml vnitřního zásobního standardního základního roztoku (3. 27. 3). Do hydrolyzátu pořízeného podle 5. 3. 2. 3 nebo 5. 3. 2. 4. se přidají 2 kapky 1-oktanolu (3. 15). Na rotační odparce (4. 7) se sníží objem na 5-10 ml za vakua při 40 o C. Pokud by se objem náhodou snížil pod 5 ml, hydrolyzát je třeba odstranit a začít analýzu znovu. pH se upraví na 2,20 roztokem hydroxidu sodného (3. 18) a pokračuje se podle bodu 5. 3. 4. 5. 3. 3. 2 pro všechny ostatní analyzátory aminokyselin (4. 9) Hydrolyzáty připravené podle 5. 3. 2. 3 nebo 5. 3. 2. 4 se částečně zneutralizují opatrným přidáním 17 ml roztoku hydroxidu sodného (3. 17), za stálého míchání a při zajištěné teplotě pod 40 oC. pH se upraví na 2,20 roztokem hydroxidu sodného (3. 18) při pokojové teplotě. Dále se pokračuje podle bodu 5. 3. 4. 5. 3. 4 roz tok v zor ků pr o ch roma tog ra fi i Hydrolyzát (5. 3. 3. 1 nebo 5. 3. 3. 2) s upraveným pH se kvantitativně převede pomocí citronanového tlumivého roztoku (3. 24) do odměrné baňky o obsahu 200 ml a tlumivým roztokem (3. 24) se doplní po značku. Nebyl-li dosud použit vnitřní standard, přidají se 2,00 ml vnitřního standardu (3. 27. 3) a potom se doplní po značku citronanovým tlumivým roztokem (3. 24). Důkladně se promíchá. Dále se přejde k chromatografii (5. 4) Nejsou-li roztoky vzorků analyzovány týž den, uschovávají se při teplotě pod 5 oC. 5. 4 Chromatografie Před chromatografií musí mít extrakt (5. 3. 4) pokojovou teplotu. Směs se protřepe a potřebné množství se zfiltruje membránovým filtrem 0,2 µ (4. 5). Výsledný čirý roztok se podrobí ionexové chromatografii na analyzátoru aminokyselin (4. 9). (5. 2) a hydrolyzát Nástřik lze provést ručně nebo automaticky. Přitom je důležité, aby se na sloupec nastřikovalo stejné množství roztoku ± 0,5 % jak při analýze standardů tak vzorků s výjimkou, kdy je použito vnitřního standardu. Rovněž poměr sodíku k aminokyselinám by měl být v standardních roztocích a v roztocích vzorků co možná nejpo- dobnější. Frekvence kalibrace závisí hlavně na stabilitě ninhydrinového činidla a analytického systému. Standard nebo vzorek se ředí citronanovým tlumivým roztokem (3. 24) tak, aby plocha píku standardu tvořila 30 – 200 % plochy píku pro jednotlivé aminokyseliny v roztoku vzorků. Chromatografie aminokyselin se mírně liší v závislosti na typu použitého analyzátoru a použitého ionexu. Zvolený systém musí být schopen separovat jednotlivé aminokyseliny od sebe vzájemně i od ostatních ninhydrin pozitivních materiálů. V rozsahu svého působení by měl chromatografický systém lineárně reagovat na změny objemů aminokyselin dávkovaných na sloupec. Při analýze equimolárního roztok zkoušených aminokyselin, by měly být dosaženy dále uvedené poměry sedla k vrcholu píku. Tyto equimolární roztoky musí obsahovat nejméně 30 % maximálního obsahu jednotlivých aminokyselin, které mohou být ještě přesně stanoveny na použitém analyzátoru aminokyselin (4. 9). Při separaci threoninu a serinu by poměr výšky sedla a vrcholu píku nižšího z obou překrývajících se amino- kyselin na chromatogramu neměl přesahovat 2:10 (pokud se stanoví pouze cyst(e)in, methionin, threonin a lysin, je stanovení nepříznivě ovlivněno nedostatečnou separací přilehlých píků). Pro všechny ostatní amino- kyseliny musí být separace lepší než 1:10. Systém musí zaručit, že lysin bude separován od „lysinových náhražek“ a ornithinu. 6. Výpočet a vyjádření výsledků Plocha píků vzorků a standardu se měří pro každou jednotlivou aminokyselinu a vypočítává se množství aminokyseliny v g na kg vzorku. g aminokyseliny na kg vzorku ¼ A × E × MV × F B × V × 1 000 Je-li použit interní standard, násobí se výsledek: D C 440 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 A = plocha píku hydrolyzátu nebo extraktu B C = plocha píku kalibračního standardního roztoku = plocha píku interního standardu v hydrolyzátu nebo v extraktu D = plocha píku interního standardu v kalibračním standardním roztoku MV = molekulární váha stanovovaných aminokyselin E V F = koncentrace standardu v µmol/ml = hmotnost navážky vzorku (g) (korigovaná na původní váhu pokud je vzorek vysušen nebo odtučněn) = celkový objem zkušebního roztoku (5. 3. 4) v ml nebo celkový objem zředěného extraktu vypočteného podle 6. 1 Cystin a cystein se v hydrolyzátech oxidovaného vzorku stanoví jako kyselina cysteová, ale vypočítávají se jako cystin (C6H12N2O4S2, MV 240,30) s použitím MV 120,15 (= 0,5 x 240,30). Methionin se v hydrolyzátech oxidovaného vzorku stanoví methionin s použitím MV methioninu: 149,21. jako methioninsulfon, ale vypočítává se jako Přidaný volný methionin se zjišťuje po extrakci jako methionin, pro výpočet se použije stejná MV. 6. 1 Celkový objem zředěného extraktu (F) při stanovení volných aminokyselin (5. 2) se vypočítá podle tohoto vzorce: F ¼ 100 ml × Þ ð 10 ml þ 5 ml 10 ml × V ml 10 ml V = objem výsledného extraktu 7. Vyhodnocení metody Tato metoda byla vyzkoušena porovnáním na mezinárodní úrovni v roce 1990 při použití čtyř různých krmiv (krmná směs pro prasata, krmná směs pro broilery, proteinový koncentrát, premix). Po vyloučení extrémů jsou výsledky středních hodnot a standardních odchylek uvedeny v následující tabulce: střední hodnoty v g/kg Referenční materiál Krmná směs pro prasata Krmná směs pro brojlery Proteinový koncentrát Premix n = počet zúčastněných laboratoří 7. 1 Opakovatelnost Aminokyselina Threonin cyst(e)in Methionin lysin 6,94 n = 15 9,31 n = 16 22,32 n = 16 58,42 n = 16 3,01 n = 17 3,92 n = 18 5,06 n = 17 _ 3. 27 n =. 17 5,08 n = 18 12,01 n = 17 90,21 n = 16 9,55 n = 13 13,93 n = 16 47,74 n = 15 98,03 n = 16 Opakovatelnost vyjádřená jako vnitrolaboratorní standardní odchylka je dána následující tabulkou: 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 441 standardní odchylka (Sr) opakovatelnosti v laboratoři v g/kg Referenční materiál Krmná směs pro prasata Krmná směs pro brojlery Proteinový koncentrát Premix n = počet zúčastněných laboratoří Aminokyselina Threonin cyst(e)in Methionin lysin 0,13 n = 15 0,20 n = 16 0,48 n = 16 1. 30 n = 16 0,10 n = 17 0,11 n = 18 0,13 n = 17 _ 0,11 n = 17 0,16 n = 18 0,27 n = 17 2,19 n = 16 0,26 n = 13 0,28 n = 16 0,99 n = 15 2,06 n = 16 Variační koeficient (%) vnitrlaboratorních standardních odchylek (Sr) Referenční materiál Krmná směs pro prasata Krmná směs pro brojlery Proteinový koncentrát Premix Aminokyselina Threonin cyst(e)in Methionin lysin 1,9 a = 15 2,1 n = 16 2,7 n = 16 2,2 n = 16 3,3 n = 17 2,8 n = 18 2,6 n = 17 _ 3,4 n =. 17 3,1 n = 18 2,2 n = 17 2,4 n = 16 2,8 n = 13 2,1 n = 16 2,4 n = 15 2,1 n = 16 n = počet zúčastněných laboratoří 7. 2 Reprodukovatelnost Výsledky mezilaboratorních standardních odchylek vyplývající ze shora uvedených zkoušek jsou obsaženy v následující tabulce: Mezilaboratorní standardní odchylka (SR) v g/kg Referenční materiál Krmná směs pro prasata Krmná směs pro brojlery Proteinový koncentrát Premix n = počet zúčastněných laboratoří Aminokyselina threonin Cyst(e)in methionin lysin 0,28 n = 15 0,48 n = 16 0,85 n = 16 2,49 n = 16 0,30 n = 17 0,34 n = 18 0,62 n = 17 - 0,23 n = 17 0,55 n = 18 1,57 n = 17 6,20 n = 16 0,30 n = 13 0,75 n = 16 1,24 n = 15 6,62 n = 16 442 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 Variační koeficient (%) mezilaboratorních standardních odchylek (SR) Referenční matriál Krmná směs pro prasata Krmná směs pro brojlery Proteinový koncentrát Premix aminokyselina threonin Cyst(e)in methionin lysin 4,1 n = 15 5,2 n = 16 3,8 n = 16 4,3 n = 16 9,9 n = 17 8,8 n = 18 12,3 n = 17 _ 7,0 n = 17 10,9 n = 18 13,0 n = 17 6,9 n = 16 3,2 n = 13 5,4 n = 16 3,0 n = 15 6,7 n = 16 n = počet zúčastněných laboratoří 8. Použití referenčních materiálů Správné použití uvedené metody se ověřuje opakovaným měřením certifikovaných referenčních materiálů, jsou- li k dispozici. Doporučuje se kalibrace certifikovanými kalibračními roztoky aminokyselin. 9. 9. 1 9. 2 9. 3 Poznámky Vzhledem k rozdílům mezi analyzátory aminokyselin by se měly uvedené koncentrace kalibračních roztoků standardů aminokyselin (viz 3. 27. 4 a 3. 27. 5) a roztoků vzorků (5. 3. 4) považovat za doporučené. Lineární rozsah přístroje se musí zkontrolovat pro všechny aminokyseliny. Standardní roztok se ředí citronanovým tlumivým roztokem tak, aby se dosáhlo ploch píků uprostřed tohoto rozsahu. Pokud se k analýze hydrolyzátů použije zařízení pro vysoce účinnou kapalinovou chromatografii, musí být podmínky zkoušek optimalizovány v souladu s doporučením výrobce. Při použití této metody u krmiv obsahujících více než 1 % chloridu (koncentráty, minerální krmiva, doplňková krmiva) může dojít k podhodnocení obsahu methioninu a musí se proto použít speciální postup. ČÁST B STANOVENÍ TUKŮ 1. Účel a oblast použití Touto metodou se stanoví obsah tuku v krmivech. Metoda se nevztahuje na analýzu olejnatých semen a plodin, jejichž zkoušení se řídí podle nařízení Rady 136/66/EHS ze dne 22. září 1996. Podle druhu a složení krmiva se pro analýzu použije jeden ze dvou následujících postupů: 1. 1 Postup A – přímo extrahovatelné tuky Tato metoda je použitelná pro krmiva rostlinného původu, s výjimkou těch, které jsou zahrnuty do okruhu postupu B. 1. 2 Postup B – celkový tuk Tato metoda je použitelná pro krmiva živočišného původu a pro všechny krmné směsi. Používá se pro všechny materiály, z nichž není možno tuk úplně extrahovat bez předchozí hydrolýzy (např. lepky, kvasnice, brambo- rové proteiny a výrobky, které byly podrobeny zpracování, jako vytlačování, vločkování a zahřívání). 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 443 1. 3 Interpretace výsledků Ve všech případech, kdy se dosáhlo vyššího výsledku postupem B, než postupem A, je třeba považovat za platnou hodnotu podle postupu B. 2. Princip 2. 1 Postup A Vzorek se extrahuje petroletherem. Rozpouštědlo se oddestiluje a zbytek se vysuší a zváží. 2. 2 Postup B Vzorek se zahřívá s kyselinou chlorovdíkovou. Směs se ochladí a přefiltruje. Promytý a usušený zbytek se pak zpracuje podle postupu A. Činidla petrolether s bodem varu mezi 40 a 50 oC. Hodnota bromového čísla musí být menší než 1 a zbytek po odpa- řování menší než 2 mg/100 ml síran sodný, bezvodý kyselina chlorovodíková, c = 3 mol HCl/l filtrační prostředky, např. křemelina, Hyflo-supercel. Přístroje a pomůcky Extrakční přístroj, se sifonem (Soxhletův přístroj), refluxní rychlost by měla umožnit asi 10 cyklů za hodinu. U typu bez sifonu by měla být refluxní rychlost asi 10 ml za minutu. Extrakční patrony, bez látek rozpustných v petroletheru, s porositou v souladu s požadavky podle bodu 4. 1. Sušárna, buď vakuová nařízená na 75 oC ± 3 oC, nebo horkovzdušná nařízená na 100 oC ± 3 oC. 3. 3. 1 3. 2 3. 3 3. 4 4. 4. 1 4. 2 4. 3 5. Postup 5. 1 Postup A (viz bod 8. 1) Do extrakční patrony se naváží 5 g vzorku s přesností na 1 mg (4. 2) a přikryjte smotkem vaty bez tuku. Patrona se umístí do extrakčního přístroje (4. 1) a extrahujte šest hodin petroletherem (3. 1). Petroletherový extrakt se jímá do suché, předem zvážené baňky, která obsahuje úlomky pemzy (1). Rozpouštědlo se oddestiluje, zbytek v baňce se suší 1,5 hodiny v sušárně (4. 3). Nechá se vychladnout v exsi- kátoru a zváží. Suší se dalších 30 minut, aby se zjistilo, zda je hmotnost tuku konstantní (ztráta hmotnosti mezi dvěma následujícími váženími musí být menší než 1 mg). 5. 2 Postup B Do kádinky o obsahu 400 ml nebo do kónické baňky o obsahu 300 ml se odváží 2,5 g vzorku s přesností na 1 mg (viz bod (8,2) a přidá se 100 ml kyseliny chlorovodíkové (3. 3) a úlomky pemzy. Kádinka se přikryje hodinovým sklem nebo se kónická baňka opatří refluxním chladičem. Směs se přivede do mírného varu na malém plameni nebo na topné desce a vaří se po dobu jedné hodiny. Během varu se musí zabránit usazování částeček vzorku na stěnách nádoby. Směs se ochladí a přidá se dostatečné množství filtračního prostředku (3. 4), aby při filtraci nedošlo ke ztrátám tuku. Filtruje se přes navlhčený dojitý filtrační papír zbavený tuku. Zbytek se promývá studenou vodou, až se získá neutrální filtrát. Provede se kontrola, zda filtrát neobsahuje žádný tuk. Jeho přítomnost ukazuje, že se vzorek musí před hydrolýzou extrahovat petroletherem podle postupu A. Dvojitý filtrační papír se zbytkem se položí na hodinové sklo a suší se půldruhé hodiny v horkovzdušné sušárně (4. 3) při teplotě 100 oC ± 3 oC. Dvojitý filtrační papír s vysušeným zbytkem se vloží do extrakční patrony (4. 2) a přikryje smotkem vaty bez tuku. Patrona se vloží do extrakčního přístroje (4. 1) a dále se pokračuje podle druhého a třetího odstavce bodu 5. 1. (1) Pokud se má tuk následně zkoušet na kvalitu, zamění se úlomky pemzy za skleněné kuličky. 444 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 6. Vyjádření výsledku Hmotnost zbytku se vyjádří jako procento ze vzorku. 7. Opakovatelnost Rozdíl ve výsledcích dvou souběžných stanovení prováděných na stejném vzorku stejným pracovníkem by neměl přesáhnout: — 0,2 % v absolutní hodnotě, při obsahu tuku nižším než 5 %, — 4,0 % relativně k nejvyššímu výsledku při obsahu od 5 do 10 %, — 0,4 % v absolutní hodnotě, při obsahu nad 10 %. Poznámky U výrobků s vysokým obsahem olejů a tuků, které se obtížně drtí nebo které neumožňují odebrat redukovaný homogenní vzorek, se postupuje následujícím způsobem: Odváží se 20 g vzorku s přesností na 1 mg a smíchá se s 10 nebo i více gramy bezvodého síranu sodného (3. 2). Extrahuje se petroletherem (3. 1) podle bodu 5. 1. Výsledný extrakt se doplní na 500 ml petroletherem (3. 1) a promíchá se. 50 ml roztoku se odpipetuje do malé suché, předem zvážené baňky, obsahující úlomky pemzy (1). Rozpouštědlo se oddestilujte, baňka se vysuší a pokračuje se podle posledního odstavce bodu 5. 1. Obsah tuku se vypočítá jako procento ze vzorku pomocí následujícího vzorce: (10 a + b) × 5 kde: a = hmotnost zbytku po první extrakci v gramech (poměrná část extraktu) b = hmotnost zbytku po druhé extrakci v gramech U výrobků, které mají nízký obsah tuku se může navážka zkušebního vzorku zvýšit na 5 g. Krmiva pro domácí zvířata, která mají vysoký obsah vody, se musí před hydrolýzou a extrakcí podle postupu B smíchat s bezvodým síranem sodným. V bodě 5. 2 se může na opláchnutí zbytků po filtraci účinněji použít horká voda místo vody studené. U některých krmiv se musí prodloužit doba sušení nad 1,5 hod. Je však třeba zamezit přílišnému vysoušení, které může vést k nízkým výsledkům. Je možno použít i mikrovlnnou troubu. Při obsahu tuku nad 15 % se doporučuje provést před hydrolýzou extrakci podle postupu A a následně extrakci podle postupu B. Záleží to do jisté míry na druhu krmiva a druhu tuku v krmivu. 8. 8. 1 8. 2 8. 3 8. 4 8. 5 8. 6 ČÁST C STANOVENÍ OLACHINDOXU (2-[N-2-(hydroxyethyl)karbamoyl]-3-methylchinoxalin-N1,N4-dioxid) 1. Účel a oblast použití Touto metodou se stanoví obsah olachindoxu v krmivech. Dolní mez stanovitelnosti je 5 mg/kg. 2. Princip Vzorek se extrahuje směsí vody a methanolu. Obsah olachindoxu se zjišťuje vysoce účinnou kapalinovou chro- matografií (HPLC) na reverzní fázi za použití UV detektoru. (1) Pokud se má tuk následně zkoušet na kvalitu, zamění se úlomky pemzy za skleněné kuličky. 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 445 3. 3. 1 3. 2 3. 3 3. 4 Činidla methanol methanol, pro HPCL voda, pro HPLC mobilní fáze pro HPLC: Směs vody (3. 3) a methanolu (3. 2), 900 + 100 (V + V) 3. 5 standardní látka: čistý olachindox 2-[N-2-(hydroxyethyl)karbomoyl]-3-methylchinoxalin-N1,N4-dioxid, E 851 3. 5. 1 zásobní standardní základní roztok olachindoxu, 250 µg/ml Do odměrné baňky o obsahu 200 ml se odváží 50 mg olachindoxu (3. 5) s přesností na 0,1 mg a přidá cca 190 ml vody. Baňka se postaví na 20 minut do ultrazvukové lázně (4. 1). Po vyjmutí z ultrazvukové lázně se roztok ochladí na laboratorní teplotu, doplní vodou po značku a zamíchá. Baňka se obalí hliníkovou fólií a uschovává v chladničce. Tento roztok se musí připravovat čerstvý každý měsíc. 3. 5. 2 pracovní standardní roztok olachindoxu, 25 µg/ml 10,0 ml zásobního standardního základního roztoku (3. 5. 1) se přenese do odměrné baňky o obsahu 100 ml, doplní se po značku mobilní fází (3. 4) a promíchá. Baňka se obalí hliníkovou fólií a uschovává v chladničce. Tento roztok se musí připravovat denně čerstvý. 3. 5. 3 kalibrační roztoky Do řady odměrných baněk o obsahu 50 ml se odpipetuje 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 15,0 a 20,0 ml pracovního stan- dardního roztoku (3. 5. 2). Doplní se mobilní fází (3. 4) po značku a promíchá. Baňka se obalí hliníkovou fólií. Tyto roztoky odpovídají 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 7,5 a 10,0 µg olachindoxu na ml. Tyto roztoky se musí připravovat denně čerstvé. 4. 4. 1 4. 2 4. 3 Přístroje a pomůcky ultrazvuková lázeň mechanická třepačka zařízení HPLC s proměnnou vlnovou délkou ultrafialového detektoru nebo s detektorem diodového pole 4. 3. 1 kolona pro kapalinovou chromatografii, 250 mm x 4 mm, plnidlo C18, 10 µm, nebo srovnatelná kolona 4. 4 membránové filtry s póry 0,45 µm 5. Postup Poznámka: Olachindox je citlivý na světlo. Všechny postupy se musí provádět při tlumeném světle nebo v nádo- bách z tmavého skla. 5. 1 Obecně 5. 1. 1 Modelové krmivo se musí předem analyzovat pro kontrolu, zda neobsahuje olachindox nebo jiné interferující látky. 5. 1. 2 Zkouška na výtěžnost se provede analýzou modelového krmiva obohaceného přidáním takového množství olachindoxu, které odpovídá jeho obsahu ve vzorku K fortifikaci na úroveň 50 mg/kg se odpipetuje 10,0 ml zásobního standardního základního roztoku (3. 5. 1) do kónické baňky o obsahu 250 ml a roztok se odpaří na cca 0,5 ml. Přidá se 50 g modelového krmiva, řádně se promíchá a nechá se 10 minut odstát, přičemž se ještě několikrát promíchá. Dále se přejde k extrakci (5. 2). Poznámka: Pro účely této metody má být modelové krmivo podobného typu jako zkoušený vzorek a nesmí obsahovat olachindox. 5. 2 Extrakce Naváží se přibližně 50 g vzorku s přesností na 0,01 g. Přenese se do kónické baňky o obsahu 1 000 ml, přidá se 100 ml methanolu (3. 1) a baňka se umístí na pět minut do ultrazvukové lázně (4. 1). Přidá se 410 ml vody a ponechá se v ultrazvukové lázni dalších 15 minut. Baňka se vyjme z ultrazvukové lázně, dále se třepe 30 minut ve třepačce (4. 2) a potom se přefiltruje složeným filtrem. 10,0 ml filtrátu se přenese do odměrné baňky o obsahu 20 ml, doplní se vodou po značku a promíchá. Poměrná část se přefiltruje membránovým filtrem (4. 4) (viz bod 9. Poznámky). Dále se pokračuje stanovením HPLC (5. 3). 446 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 5. 3 Stanovení HPLC 5. 3. 1 Pa r a m etr y : Následující podmínky jsou doporučené, mohou být použity jiné podmínky, za předpokladu, že dávají rovno- cenné výsledky. analytická kolona (4. 3. 1) mobilní fáze (3,4): Směs vody (3. 3) a methanolu (3. 2), 900 + 100 (V + V) průtoková rychlost: 1,5–2 ml/min detekční vlnová délka: 380 nm objem nástřiku: 20 µl–100 µl Stabilita chromatografického systému se zkontroluje tím, že se několikrát nastříkne kalibrační roztok (3. 5. 3) obsahující 2,5 µg/ml, až se dosáhne konstantních výšek píků a retenčních časů. 5. 3. 2 Ka li b ra čn í g r a f Pro každý kalibrační roztok se provede několik nástřiků a zjistí se střední hodnota výšky (plochy) píku pro každou koncentraci. Sestrojí se graf za použití středních hodnot výšek (ploch) píků kalibračních roztoků jako ordinát a příslušných koncentrací v µg/ml jako souřadnic. 5. 3. 3 R oztok v zor ku Provede se několik nástřiků extraktu vzorku (5. 2) při použití stejného objemu jako u kalibračních roztoků a zjistí se střední výška (plocha) píků olachindoxu. 6. Výpočet výsledků Ze střední hodnoty výšky (plochy) píků olachindoxu v roztoku vzorku se zjistí koncentrace v roztoku vzorku v µg/ml porovnáním s kalibračním grafem (5. 3. 2). Obsah olachindoxu ve vzorku w v mg/kg je dán následující rovnicí: w ¼ c × 1 000 m kde: c = koncentrace olachindoxu v extraktu vzorku (5. 2) v µg/ml m = hmotnost navážky vzorku v g (5. 2) 7. Vyhodnocení výsledků 7. 1 Identita Identita analytu může být potvrzena opakovaným stanovením s přídavkem (co-chromatography) anebo využitím detektoru s diodovým polem, přičemž se porovnávají spektra extraktu vzorku (5. 2) a kalibračního roztoku (3. 5. 3), obsahujícího 5,0 µg/ml olachindoxu. 7. 1. 1 Op a kov a né sta nov e ní m s p ří davke m (co-chr omatogr a phy) Extrakt vzorku (5. 2) se obohatí přídavkem přiměřeného množství kalibračního roztoku (3. 5. 3). Množství přida- ného olachindoxu by mělo odpovídat množství olachindoxu nalezeného v extraktu vzorku. S ohledem na přidané množství a zředění extraktu by mělo dojít jen ke zvýšení výšky píku olachindoxu. Šířka píku v polovině jeho výšky musí být v rozmezí ±10 % původní šířky píku olachindoxu v neobohaceném extraktu vzorku. 7. 1. 2 Dete ktor di odov é ho pole Výsledky se vyhodnocují podle následujících kritérií: a) při vlnové délce maximální absorpce vzorku i standardu musí být záznam spektra zaznamenaný ve vrcholu píku na chromatogramu stejný s nepřesností danou rozlišovací schopností detekčního systému. Pro detektor s diodovým polem se udává ±2 nm; 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 447 b) při vlnové délce mezi 220 a 400 nm se nesmí záznam spektra zkoušeného vzorku a standardu zazname- naný ve vrcholu píku chromatogramu lišit od ostatních částí spektra v rozsahu 10 až 100 % relativní absor- bance. Tohoto kritéria je dosaženo, jestliže jsou vykázána stejná maxima a jestliže nikde odchylka mezi dvěma spektry nepřesahuje 15 % absorbance standardního analytu; b) při vlnové délce mezi 220 a 350 nm se nesmí spektrum vzestupu, vrcholu a sestupu píku zkoušeného vzorku lišit od ostatních v této částí spektra v rozsahu 10 až 100 % relativní absorbance. Tohoto kritéria je dosaženo, jestliže jsou vykázána stejná maxima a jestliže ve všech sledovaných bodech odchylka mezi spektry nepřesahuje nikde 15 % absorbance spektra ve vrcholu píku. Není-li některé z těchto kritérií splněno, přítomnost analytu není potvrzena. 7. 2 Opakovatelnost Rozdíl mezi výsledky dvou souběžných stanovení, prováděných na stejném vzorku při obsahu olachindoxu mezi 10 a 20 mg/kg, nesmí přesáhnout15 % vyššího výsledku. 7. 3 Výtěžnost Pro obohacený modelový vzorek musí být výtěžnost nejméně 90 %. 8. Výsledky kruhového testu V rámci ES byl proveden kruhový test, při němž až 13 laboratoří analyzovalo čtyři vzorky krmiva pro selata, včetně jednoho modelového vzorku. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce: vzorek 1 vzorek 2 vzorek 3 vzorek 4 L A střední (mg/kg) (Sr) (mg/kg) (SR) (mg/kg) CVr (%) CVR (%) nominální obsah (mg/kg) výtěžnost (%) 13 40 - - - - - - - 10 40 14,6 0,82 1,62 5,6 11,1 15 97,3 11 44 48,0 2,05 4,28 4,3 8,9 50 96,0 11 44 95,4 6,36 8,42 6,7 8,8 100 95,4 L n Sr SR CVr CVR : počet laboratoří : počet jednotlivých hodnot : standardní odchylka opakovatelnosti : standardní odchylka reprodukovatelnosti : variační koeficient opakovatelnosti : variační koeficient reprodukovatelnosti 9. Poznámky Ačkoliv tato metoda nebyla ověřena pro krmivo obsahující více než 100 mg/kg olachindoxu, je možné obdržet uspokojivé výsledky menší navážkou vzorku a/nebo zředěním extraktu (5. 2) tak, aby se dosáhlo koncentrace v rozsahu kalibračního grafu (5. 3. 2)


title: Regulamento (CE) nº 1893/98 da Comissão de 3 de Setembro de 1998 que determina os Estados-membros em que podem ser realizadas, a título da campanha de 1997/1998, as campanhas de promoção do consumo de sumo de uva

eurovoc_concepts:
food consumption
fruit juice
grape
sales promotion

formats: html pdf print

text: L 245/34 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias 4. 9. 98 REGULAMENTO (CE) Nº 1893/98 DA COMISS(cid:212)O de 3 de Setembro de 1998 que determina os Estados-membros em que podem ser realizadas, a t(cid:146)tulo da campanha de 1997/1998, as campanhas de promo(cid:135)(cid:209)o do consumo de sumo de uva A COMISS(cid:212)O DAS COMUNIDADES EUROPEIAS, Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia, Tendo em conta o Regulamento (CEE) nº 822/87 do Conselho, de 16 de Mar(cid:135)o de 1987, que estabelece a organiza(cid:135)(cid:209)o comum do mercado vitivin(cid:146)cola (1), com a (cid:156)ltima redac(cid:135)(cid:209)o que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) nº 1627/98 (2), e, nomeadamente, o nº 5 do seu artigo 46º e o seu artigo 81º, Tendo em conta o Regulamento (CEE) nº 3813/92 do Conselho, de 28 de Dezembro de 1992, relativo (cid:133) unidade de conta e (cid:133)s taxas de convers(cid:209)o a aplicar no (cid:131)mbito da pol(cid:146)tica agr(cid:146)cola comum (3), com a (cid:156)ltima redac(cid:135)(cid:209)o que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) nº 150/95 (4), Considerando que o Regulamento (CEE) nº 3461/85 da Comiss(cid:209)o, de 9 de Dezembro de 1985, relativo (cid:133) organi- za(cid:135)(cid:209)o de campanhas de promo(cid:135)(cid:209)o do consumo de sumo de uva (5), com a (cid:156)ltima redac(cid:135)(cid:209)o que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) nº 1402/97 (6), disp(cid:210)e, no nº 2 do seu artigo 1º, que s(cid:209)o determinados, para cada campanha, os Estados-membros em que se realizam as campanhas de promo(cid:135)(cid:209)o em cada um dos referidos Estados-membros; Considerando que o Regulamento (CEE) nº 2641/88 da Comiss(cid:209)o, de 25 de Agosto de 1988, que estabelece as regras de aplica(cid:135)(cid:209)o do regime da ajuda (cid:133) utiliza(cid:135)(cid:209)o de uvas, de mostos de uva e de mostos de uva concentrados com vista (cid:133) elabora(cid:135)(cid:209)o de sumo de uva (7), com a (cid:156)ltima redac(cid:135)(cid:209)o que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) nº 583/ /98 (8), fixou, no nº 2 do seu artigo 4º, em 25 % a parte da ajuda destinada ao financiamento da campanha de promo(cid:135)(cid:209)o; Considerando que o Regulamento (CE) nº 1475/97 da Comiss(cid:209)o, de 28 de Julho de 1997, que fixa os pre(cid:135)os de compra e as ajudas, bem como determinados outros elementos aplic(cid:145)veis, para a campanha de 1997/1998, (cid:133)s medidas de interven(cid:135)(cid:209)o no sector vitivin(cid:146)cola (9), estabe- leceu, no anexo VII, o montante da ajuda para a campanha de 1997/1998; Considerando que o montante dispon(cid:146)vel para este finan- ciamento depende das quantidades de produtos a que ser(cid:145) concedida a ajuda; que o montante dispon(cid:146)vel para o (1) JO L 84 de 27. 3. 1987, p. 1. (2) JO L 210 de 28. 7. 1998, p. 8. (3) JO L 387 de 31. 12. 1992, p. 1. (4) JO L 22 de 31. 1. 1995, p. 1. (5) JO L 332 de 10. 12. 1985, p. 22. (6) JO L 194 de 23. 7. 1997, p. 1. (7) JO L 236 de 26. 8. 1988, p. 25. (8) JO L 77 de 14. 3. 1998, p. 14. (9) JO L 200 de 29. 7. 1997, p. 25. financiamento da medida a t(cid:146)tulo da campanha de 1997/ /1998 est(cid:145) estimado em 7 milh(cid:210)es de ecus; Considerando que os Estados-membros que re(cid:156)nem as condi(cid:135)(cid:210)es para realizar estas campanhas de promo(cid:135)(cid:209)o s(cid:209)o os Estados-membros onde tais ac(cid:135)(cid:210)es t(cid:136)m sido realizadas em campanhas anteriores; Considerando que, para assegurar uma melhor gest(cid:209)o dos fundos or(cid:135)amentais, (cid:130) necess(cid:145)rio fixar uma data limite para a assinatura e o pagamento dos contratos; Considerando que as medidas previstas no presente regu- lamento est(cid:209)o em conformidade com o parecer do Comit(cid:130) de Gest(cid:209)o do Vinho, ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO: Artigo 1º 1. Para a campanha de 1997/1998, as campanhas de promo(cid:135)(cid:209)o do consumo de sumo de uva, referidas no nº 1 do artigo 1º do Regulamento (CEE) nº 3461/85, realizam-se na Alemanha, na (cid:214)ustria, em Fran(cid:135)a, em Espanha e nos Pa(cid:146)ses Baixos. O montante global destinado ao financiamento dessas campanhas (cid:130) de: (cid:190) 2 200 000 ecus na Alemanha, (cid:190) 700 000 ecus na (cid:214)ustria, (cid:190) 1 800 000 ecus em Fran(cid:135)a, (cid:190) 1 600 000 ecus em Espanha, (cid:190) 700 000 ecus nos Pa(cid:146)ses Baixos. contratos no (cid:131)mbito dessa 2. Os campanha de promo(cid:135)(cid:209)o ser(cid:209)o assinados, o mais tardar, nos nove meses seguintes (cid:133) entrada em vigor do presente regulamento. O pagamento dos contratos ser(cid:145) efectuado, o mais tardar, tr(cid:136)s meses ap(cid:155)s o final da correcta realiza(cid:135)(cid:209)o dos contratos. 3. A convers(cid:209)o em moeda nacional dos montantes refe- ridos no nº 1 (cid:130) efectuada com recurso (cid:133) taxa de convers(cid:209)o agr(cid:146)cola em vigor em 1 de Setembro de 1998. Artigo 2º O presente regulamento entra em vigor no s(cid:130)timo dia seguinte ao da sua publica(cid:135)(cid:209)o no Jornal Oficial das Comunidades Europeias. 4. 9. 98 PT Jornal Oficial das Comunidades Europeias L 245/35 O presente regulamento (cid:130) obrigat(cid:155)rio em todos os seus elementos e directamente aplic(cid:145)vel em todos os Estados-membros. Feito em Bruxelas, em 3 de Setembro de 1998. Pela Comiss(cid:209)o Franz FISCHLER Membro da Comiss(cid:209)o