title: Smernica Komisie 98/73/ES z 18. septembra 1998, ktorou sa dvadsiatyštvrtýkrát prispôsobuje technickému pokroku smernica Rady 67/548/EHS o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení týkajúcich sa klasifikácie, balenia a označovania nebezpečných látokText s významom pre EHP.

eurovoc_concepts:
classification
dangerous substance
labelling
marketing standard
packaging

text: 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 139 31998L0073 L 305/1 ÚRADNÝ VESTNÍK EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV 16. 11. 1998 SMERNICA KOMISIE 98/73/ES z 18. septembra 1998, ktorou sa dvadsiatyštvrtýkrát prispôsobuje technickému pokroku smernica Rady 67/548/EHS o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení týkajúcich sa klasifikácie, balenia a označovania nebezpečných látok (Text s významom pre EHP) KOMISIA EURÓPSKYCH SPOLOČENSTIEV, PRIJALA TÚTO SMERNICU: so zreteľom na Zmluvu o založení Európskeho spoločenstva, Článok 1 so zreteľom na smernicu Rady 67/548/EHS z 27. júna 1967 o aproximácii zákonov, iných právnych predpisov a správnych opatrení týkajúcich sa klasifikácie, balenia a označovania nebez- pečných látok (1), naposledy zmenenú a doplnenú smernicou Komisie 97/69/ES (2), a najmä na jej článok 28, keďže príloha I k smernici 67/548/EHS obsahuje zoznam nebez- pečných látok a podrobnosti týkajúce sa klasifikácie, balenia a postupov pri označovaní každej z nich; keďže súčasný vedecký a technický pokrok preukázal, že zoznam nebezpečných látok v tejto prílohe treba zmeniť a doplniť; keďže príloha V k smernici 67/548/EHS ustanovuje metódy na stanovovanie fyzikálnochemických vlastností, toxicity a eko- toxicity látok a prípravkov; keďže prílohu V treba prispôsobiť technickému pokroku; Smernica 67/548/EHS sa týmto mení a dopĺňa takto: 1. Príloha I sa mení a dopĺňa takto: a) položky v prílohe I k tejto smernici nahrádzajú zodpove- dajúce položky v prílohe I k smernici 67/548/EHS; b) položky v prílohe II k tejto smernici sa vkladajú do prílohy I k smernici 67/548/EHS. 2. Príloha V sa mení a dopĺňa takto: a) znenie prílohy III A, III B a III C k tejto smernici sa pridáva k časti A prílohy V k smernici 67/548/EHS; b) znenie prílohy III D tejto smernice sa pridáva k časti C prí- lohy V k smernici 67/548/EHS. keďže opatrenia ustanovené v tejto smernici sú v súlade so stano- viskom Výboru pre prispôsobovanie smerníc technickému technických prekážok obchodu pokroku pri odstraňovaní s nebezpečnými látkami a prípravkami, Článok 2 (1) Ú. v. ES 196, 16. 8. 1967, s. 1. (2) Ú. v. ES L 343, 13. 12. 1997, s. 19. Členské štáty prijmú zákony, iné právne predpisy a správne opatrenia potrebné na dosiahnutie súladu s touto smernicou najneskôr do 31. októbra 1999. Ihneď o tom budú informovať Komisiu. 140 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 Keď členské štáty prijmú tieto opatrenia, tieto budú obsahovať odkaz na túto smernicu alebo ich bude sprevádzať takýto odkazpri príležitosti ich úradného uverejnenia. Metodiku týchto odkazov ustanovia členské štáty. Táto smernica je adresovaná členským štátom. Článok 4 V Bruseli 18. septembra 1998 Článok 3 Táto smernica nadobúda účinnosť dvadsiaty deň po jej uverejnení v Úradnom vestníku Európskych spoločenstiev. Za Komisiu Ritt BJERREGAARD člen Komisie ANEXO I — BILAG I — ANHANG I — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I — ANNEX I — ANNEXE I — ALLEGATO I — BIJLAGE I — ANEXO I — LIITE I — BILAGA I 142 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 143 144 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 145 146 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 147 148 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 149 150 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 151 152 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 153 154 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 155 156 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 157 158 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 159 160 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 161 162 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 163 164 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 165 166 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 167 168 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 169 170 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 171 172 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 173 174 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 175 176 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 177 178 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 179 180 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 181 182 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 183 184 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 185 186 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 187 188 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 189 190 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 191 192 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 193 194 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 195 196 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 197 198 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 199 200 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 201 202 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 203 204 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 205 206 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 207 ANEXO II — BILAG II — ANHANG II — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II — ANNEX II — ANNEXE II — ALLEGATO II — BIJLAGE II — ANEXO II — LIITE II — BILAGA II 208 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 209 210 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 211 212 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 213 214 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 215 216 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 217 218 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 219 220 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 221 222 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 223 224 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 225 226 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 227 228 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 229 230 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 231 232 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 233 234 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 235 236 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 237 238 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 239 240 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 241 242 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 243 244 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 245 246 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 247 248 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 249 250 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 251 252 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 253 254 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 255 256 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 257 258 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 259 260 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 261 262 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 263 264 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 265 266 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 267 268 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 269 270 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 271 272 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 273 274 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 275 276 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 277 278 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 PRÍLOHA III A A. 18. ČÍSELNÁ PRIEMERNÁ MOLEKULOVÁ HMOTNOSŤ A DISTRIBÚCIA MOLEKULOVÝCH HMOTNOSTÍ POLYMÉROV 1. METÓDA Táto metóda, založená na gélovej permeačnej chromatografii, je prevzatá z OECD TG 118 (1996). Základné princípy a ďalšie technické informácie sú uvedené v literárnom odkaze 1. 1. 1. Úvod Vlastnosti polymérov sú veľmi rôznorodé a nie je preto možné opísať jedinú metódu, ktorá by presne vyme- dzovala podmienky ich vzájomného oddeľovania a vyhodnocovania a ktorá by brala do úvahy všetky mož- nosti a špecifické situácie vyskytujúce sa pri separácii polymérov. Predovšetkým nie vždy sa dá pri kom- plexných polymérových systémoch použiť gélová permeačná chromatografia (GPC). Tam, kde nie je použitie GPC z praktického hľadiska možné, dajú sa molekulové hmotnosti stanoviť inými spôsobmi (po- zri prílohu). V takýchto prípadoch je potrebné uviesť všetky podrobnosti a použitie konkrétnej metódy sa musí odôvodniť. Opisovaná metóda je založená na norme DIN 55672 (1). Podrobné informácie o vykonaní pokusu a spô- sobe vyhodnotenia údajov možno nájsť v uvedenej norme. Všetky zmeny, ktoré sú potrebné v metóde uro- biť, musia byť odôvodnené. Možno použiť aj iné normy, no treba pri tom uviesť plný odkaz. Pri opisovanej metóde sa na kalibráciu používajú vzorky polystyrénu so známou polydosperzitou a možno ju modifiko- vať tak, aby bola vhodná pre určité polyméry, napríklad pre polyméry rozpustné vo vode a pre vetvené po- lyméry s dlhými reťazcami. 1. 2. Definície a jednotky Číselná priemerná molekulová hmotnosť Mn a hmotnostná priemerná molekulová hmotnosť Mw sa stano- vili pomocou týchto rovníc: kde: Hi je hladina signálu detektora od základnej čiary pre retenčný objem Vi Mi je molekulová hmotnosť polymérovej frakcie pri retenčnom objeme Vi a n je počet dátových bodov. Šírka distribúcie molekulových hmotností, ktorá je mierou disperzity systému, je daná pomerom Mw/Mn. 1. 3. Referenčné látky GPC je relatívna metóda, a preto je pri nej potrebné uskutočniť kalibráciu. Bežne sa na tento účel používajú lineárne skonštruované polystyrénové štandardy so známymi molekulovými hmotnosťami Mn a Mw a s úzkou oblasťou distribúcie molekulových hmotností. Kalibračnú krivku možno použiť na stanovenie molekulovej hmotnosti neznámej vzorky iba vtedy, ak sa pri separácii štandardov aj neznámej vzorky pou- žijú úplne rovnaké podmienky. Vzťahy stanovené medzi molekulovou hmotnosťou a elučným objemom sú platné iba pri špecifických pod- mienkach daného pokusu. Medzi tieto podmienky patria predovšetkým teplota, typ rozpúšťadla (alebo zmesi rozpúšťadiel), chromatografické podmienky a rozdeľovacia kolóna alebo systém kolón. 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 279 Takto stanovené molekulové hmotnosti vzoriek predstavujú pomerné hodnoty a označujú sa ako „mole- kulové hmotnosti polystyrénového ekvivalentu“. Znamená to, že v závislosti od štrukturálnych a chemic- kých rozdielov medzi vzorkou a štandardmi sa môžu molekulové hmotnosti do väčšej alebo menšej miery od svojich absolútnych hodnôt odlišovať. Prípadné použitie iných štandardov, napríklad polyetylénglyko- lu, polyetylénoxidu, polymetylmetakrylátu alebo kyseliny polyakrylovej, je potrebné odôvodniť. 1. 4. Princíp testovacej metódy Distribúciu molekulových hmotností vzorky aj priemerné molekulové hmotnosti (Mn, Mw) možno stano- viť pomocou metódy GPC. Metóda GPC predstavuje osobitný typ kvapalinovej chromatografie, pri ktorej dochádza k rozdeleniu vzorky na základe hydrodynamických objemov jej jednotlivých zložiek (2). K oddeľovaniu dochádza pri prechode vzorky cez kolónu, ktorá je naplnená poréznym materiálom, kto- rým je zvyčajne organický gél. Malé molekuly cez póry prechádzajú, zatiaľ čo veľké molekuly sa z objemu gélu vylučujú. Dráha, ktorú prekonajú veľké molekuly, je preto kratšia a vylučujú sa ako prvé. Molekuly strednej veľkosti do niektorých pórov vnikajú a vylučujú sa z kolóny neskôr. Najmenšie molekuly s hydro- dynamickým priemerom menším, ako je veľkosť pórov gélu, môžu vnikať do všetkých z nich a vylučujú sa ako posledné. V ideálnych podmienkach závisí oddeľovanie výlučne od veľkosti jednotlivých molekúl, hoci v praxi je ťažké vyhnúť sa aspoň určitému stupňu interferencie absorpčných vplyvov. Situácia sa môže zhoršiť aj v dôsledku nerovnomerného naliatia kolóny a mŕtvych objemov (2). Detekciu možno uskutočňovať napríklad pomocou merania indexu lomu alebo UV-absorpcie eluátov. Na základe takýchto údajov je možné zostrojiť jednoduchú distribučnú krivku. Aby bolo možné prisúdiť bodom na distribučnej krivke molekulové hmotnosti, je však potrebné kolónu najprv okalibrovať. Robí sa to tak, že na kolónu sa nanesú polyméry so známou molekulovou hmotnosťou, v ideálnom prípade aj s pri- bližne podobnou štruktúrou, napríklad rozličné polystyrénové štandardy. Zvyčajne sa získava gaussovská krivka, ktorá býva niekedy na strane nízkych molekulových hmotností mierne pretiahnutá. Zvislá os udáva hmotnostné množstvo jednotlivých typov molekúl vyplavených z kolóny, vodorovná os je vyjadrená ako dekadický logaritmus molekulovej hmotnosti. 1. 5. Kritériá kvality Reprodukovateľnosť (relatívna štandardná odchýlka, RSD) elučného objemu by mala byť lepšia ako 0,3 %. Ak sa chromatogram vyhodnocuje nezávisle od času a ak nespĺňa horeuvedené kritérium, potom je potrebné zabezpečiť reprodukovateľnosť analýzy pomocou vnútorného štandardu (1). Polydisperzita závisí od molekulových hmotností štandardov. V prípade polystyrénových štandardov sú typické hodnoty takéto: Mp < 2 000 2 000 ≤ Mp ≤ 106 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 Mw/Mn < 1,05 Mw/Mn < 1,20 (Mp je molekulová hmotnosť štandardu v maxime píku) 1. 6. Opis testovacej metódy 1. 6. 1. Príprava štandardných roztokov polystyrénu Polystyrénové štandardy sa opatrným miešaním rozpustia vo zvolenom elučnom činidle. Pri príprave roz- tokov sa treba riadiť odporúčaniami výrobcov. Voľba koncentrácií štandardov závisí od rozličných faktorov, napríklad od nanášacieho objemu, viskozity roztoku a citlivosti analytického detektora. Maximálny nanášací objem musí byť prispôsobený dĺžke kolóny, aby nedochádzalo k jej preťaženiu. Zvyčajné nanášacie objemy pri analytických separáciách pomocou GPC sa pri kolóne s rozmerom 30 cm x 7,8 mm pohybujú v rozmedzí 40 až 100 μl. Je možné použiť aj vyššie objemy, nemali by však presiahnuť 250 μl. Pred samotnou kalibráciou kolóny je potrebné určiť optimálny pomer medzi nanášacím objemom a koncentráciou nanášanej vzorky. 280 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 1. 6. 2. Príprava roztoku vzorky V zásade rovnaké požiadavky sa vzťahujú aj na prípravu roztokov vzoriek. Vzorka sa opatrným potriasa- ním rozpustí vo vhodnom rozpúšťadle, napríklad v tetrahydrofuráne (THF). V žiadnom prípade ju nemožno rozpúšťať v ultrazvukovom kúpeli. V prípade potreby sa vzorka prečistí filtráciou cez membránový filter s veľkosťou pórov medzi 0,2 a 2 μm. V záverečnej správe sa treba zmieniť o prítomnosti nerozpustených tuhých častíc, ktoré môžu byť dôsled- kom prítomnosti vysokých molekulových hmotností. Percentuálne zastúpenie hmotnosti rozpustených čias- točiek je potrebné určiť pomocou primeranej metódy. Roztoky sa musia použiť do 24 hodín. 1. 6. 3. Prístrojové vybavenie — nádrž na rozpúšťadlo, — zariadenie na odplynenie kvapalín (ak je potrebné), — čerpadlo, — tlmič pulzov kvapaliny (ak je potrebný), — nanášací systém, — chromatografické kolóny, — detektor, — prietokomer (ak je potrebný), — zariadenie na zaznamenávanie a spracúvanie údajov, — nádoba na odpad. Treba zabezpečiť inertnosť systému GPC voči používaným rozpúšťadlám (napríklad použitím oceľových kapilár, ak je rozpúšťadlo THF). 1. 6. 4. Nanášací systém a systém na privádzanie rozpúšťadla Buď pomocou automatického nanášacieho zariadenia, alebo ručne sa na kolónu nanesie v ostro vymedze- nej zóne presne definované množstvo roztoku vzorky. Príliš rýchle vytiahnutie striekačky alebo stlačenie jej piestu pri ručnom nanášaní vzorky môže spôsobiť zmeny v pozorovanej distribúcii molekulových hmot- ností. Systém na privádzanie rozpúšťadla by nemal spôsobovať pulzové vlny, čo možno v ideálnom prípad zabezpečiť zaradením tlmiča pulzov. Prietok sa pohybuje okolo hodnoty 1 ml/min. 1. 6. 5. Kolóna V závislosti od vzorky možno polymér charakterizovať buď pomocou jedinej kolóny, alebo pomocou via- cerých za sebou spojených kolón. Ako náplň kolóny je komerčne dostupných viacero poréznych materiá- lov s definovanými vlastnosťami limit vylučovania). Voľba separačného gélu a dĺžky kolóny závisí od vlastností vzorky (hydrodynamické objemy, distribúcia molekulových hmotností) aj od špecifických podmienok pri separácii, napríklad od typu rozpúšťadla, teploty a rýchlosti prietoku (1) (2) (3). (napríklad veľkosť pórov, 1. 6. 6. Teoretické poschodia kolóny Kolóna alebo kombinácia viacerých kolón používaných pri separácii musí byť charakterizovaná počtom teoretických poschodí. V prípade THF ako rozpúšťadla sa to robí tak, že na kolónu so známou dĺžkou sa nanesie roztok etylbenzénu alebo iného vhodného nepolárneho rozpúšťadla. Počet teoretických poschodí udáva táto rovnica: W1/2)2 N = 5,54( Ve W)2 alebo N = 16(Ve kde: N Ve je počet teoretických poschod je elučný objem v maxime píku W je šírka píku pri základnej čiare W1/2 je šírka píku v polovici jeho výšky. 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 281 1. 6. 7. Účinnosť separácie Okrem počtu teoretických poschodí, ktorý určuje šírku pásu, hrá pri separácii úlohu aj jej účinnosť, ktorá sa určuje na základe strmosti kalibračnej krivky. Účinnosť separácie kolóny možno získať z tohto vzťahu: V – V e,M x e,(10M x) vel’kost plochy prierezu kolóny 3 2] ≥ 6,0 [cm cm kde: Ve, Mx je elučný objem polystyrénu s molekulovou hmotnosťou Mx Ve (10Mx) je elučný objem polystyrénu s desaťnásobne väčšou molekulovou hmotnosťou. Rozlíšiteľnosť systému sa zvyčajne definuje takto: R1,2 = 2 × Ve1 – Ve2 W1 + W2 × 1 log10(M2/M1) kde: Ve1, Ve2 sú elučné objemy dvoch polystyrénových štandardov v maxime píku W1, W2 sú šírky píkov pri základnej čiare M1, M2 sú molekulové hmotnosti v maxime píku (mali by sa líšiť o faktor 10). R-hodnota kolóny musí byť vyššia ako 1,7 (4). 1. 6. 8. Rozpúšťadlá Všetky rozpúšťadlá musia mať vysoký stupeň čistoty (pri THF je stupeň čistoty 99,5 %). Zásobník na roz- púšťadlo (v prípade potreby s atmosférou inertného plynu) musí byť dostatočne veľký, aby umožnil kalib- ráciu kolóny a analýzu niekoľkých vzoriek. Pred vháňaním do kolóny pomocou čerpadla treba rozpúšťadlo zbaviť plynov. 1. 6. 9. Kontrola teploty Teplota kritických vnútorných zložiek systému (nanášacia slučka, detektor a hadičky) musí byť stála a musí zodpovedať zvolenému rozpúšťadlu. 1. 6. 10. Detektor Účelom detektora je kvantitatívne zaznamenávanie koncentrácie vzorky, ktorá sa eluuje z kolóny. V záujme eliminácie zbytočného rozširovania píku by mala mať kyveta meracej komôrky detektora čo možno naj- menší objem. S výnimkou detektorov založených na rozptyle svetla a viskozitných detektorov by nemal tento objem presahovať 10 μl. Ako detekčná metóda sa zvyčajne používa diferenciálna refraktometria. V závislosti od osobitných požiadaviek vzorky alebo elučného činidla však možno použiť aj iné typy detek- torov, napríklad UV/VIS, IR, viskozitný detektor atď. 2. ÚDAJE A PRÍPRAVA TESTOVACEJ SPRÁVY 2. 1. Údaje Podrobné vyhodnocovacie kritériá a požiadavky vzťahujúce sa na zber a spracúvanie údajov sú uvedené v norme DIN (1). Pri každej vzorke je potrebné uskutočniť dva nezávislé pokusy. Každý z nich treba analyzovať osobitne. Pri každom meraní treba udať Mn, Mw, Mw/Mn a Mp. Treba výslovne uviesť, že namerané hodnoty sú pomerné hodnoty ekvivalentné použitým štandardom. 282 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 Po stanovení retenčných objemov alebo retenčných časov (podľa možnosti korigovaných použitím vnú- torného štandardu) sa voči jednej z týchto hodnôt nanášajú do grafu hodnoty log Mp (Mp je maximum píku kalibračného štandardu). Na každú dekádu molekulových hmotností treba použiť aspoň dva kalibračné body, na zostrojenie celej kalibračnej krivky, ktorá by mala pokrývať odhadnutú molekulovú hmotnosť vzorky, je potrebných aspoň päť bodov. Koncový bod kalibračnej krivky v oblasti nízkych molekulových hmotností sa definuje pomocou n-hexylbenzénu alebo iného vhodného nepolárneho rozpúšťadla. Číselné priemerné a hmotnostné priemerné molekulové hmotnosti sa vo všeobecnosti stanovujú pomocou elek- tronického spracúvania údajov, založeného na vzorcoch uvedených v časti 1. 2. V prípade manuálnej digi- talizácie sa možno riadiť dokumentom ASTM D 3536-91 (3). V prípade zadržania každého nerozpustného polyméru v kolóne je vysoko pravdepodobné, že jeho mole- kulová hmotnosť je vyššia ako molekulová hmotnosť rozpustnej frakcie. Výsledkom nevzatia tejto skutoč- nosti do úvahy môže byť nadhodnotenie zastúpenia zložiek s nízkou molekulovou hmotnosťou. Návod na uskutočnenie korekcie obsahu zložiek s nízkou molekulovou hmotnosťou na nerozpustný polymér je uvedený v prílohe. 2. 2. Správa z testu Správa z testu musí obsahovať tieto informácie: 2. 2. 1. Testovaná látka — dostupné informácie o testovanej látke (totožnosť, prísady, nečistoty/prímesi), — postup spracovania vzorky, zistené skutočnosti, problémy. 2. 2. 2. Prístroje a zariadenia — zásobník na elučné činidlo, inertný plyn, zariadenie na odplynenie elučného činidla, zloženie elučného činidla, nečistoty/prímesi, — čerpadlo, tlmič pulzov kvapaliny, nanášací systém, — rozdeľovacie kolóny (výrobca, všetky informácie o charakteristikách kolón, ako sú veľkosť pórov, druh separačného materiálu atď. , počet, dĺžka a usporiadanie použitých kolón), — počet teoretických poschodí kolóny (alebo kombinácie kolón), účinnosť rozdeľovania (rozlišovacia schopnosť systému), — informácie o symetrii píkov, — teploty kolóny, spôsob kontroly teploty, — detektor (princíp merania, typ, objem meracej kyvety), — prietokomer, ak sa používa (výrobca, princíp merania), — systém na zaznamenávanie a spracúvanie údajov (hardvér a softvér). 2. 2. 3. Kalibrácia systému — podrobné opísanie metódy použitej na zostrojenie kalibračnej krivky, — informácie o kritériách kvality tejto metódy (napríklad korelačný koeficient, odchýlka súčtu štvorcov atď. ), — informácie o všetkých extrapoláciách, predpokladoch a aproximáciách, ktoré sa uskutočnili počas prie- behu pokusu, a o vyhodnocovaní a spracúvaní údajov, — všetky merania, ktoré boli použité na zostrojenie kalibračnej krivky musia byť zdokumentované v tabuľke, ktorá obsahuje pre každý bod merania tieto informácie: — názov vzorky, — výrobcu vzorky, — charakteristické hodnoty štandardov, t. j. Mp, Mn, Mw a Mw/Mn, tak ako ich uvádza výrobca alebo ako boli odvodené z následných meraní, a tiež podrobnosti o metóde stanovenia, — nanášací objem a koncentráciu nanesenej vzorky, — hodnotu Mp, ktorá bola použitá na kalibráciu, 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 283 — elučný objem alebo opravený retenčný čas, nameraný pri maxime píku, — Mp vypočítaná v maxime píku, — percentuálna odchýlka vypočítanej hodnoty Mp od kalibračnej krivky. 2. 2. 4. Vyhodnotenie — vyhodnotenie na základe času: metódy použité na zabezpečenie požadovanej reprodukovateľnosti (ko- rekčná metóda, vnútorné štandardy atď. ), — informácia o tom, či bolo vyhodnotenie vykonané na základe elučného objemu, alebo retenčného času, — informácie o limitoch vyhodnocovania, ak nebola vykonaná úplná analýza píku, — opísanie vyrovnávacej/prekladacej metódy, ak sa pri grafickom vyhodnocovaní použila, — príprava a predbežné spracovanie vzorky, — prítomnosť nerozpustených čiastočiek, ak boli pozorované, — objem (μl) a koncentrácia (mg/ml) nanesenej vzorky, — opísanie vplyvov, ktoré mohli spôsobiť odchýlku od ideálneho GPC profilu, — podrobné opísanie modifikácií uskutočnených v testovacej metóde, — podrobnosti o rozsahu chýb merania, — všetky iné informácie a pozorované skutočnosti, ktoré by mohli byť významné z hľadiska interpretácie výsledkov. 3. ODKAZY 1. DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmit- tel, Teil I. 2. Yau, W. W. , Kirkland, J. J. , and Bly, D. D. eds. (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography; J. Wiley and Sons. 3. ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 4. ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High-Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 284 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 Príloha Príklad ďalších metód na stanovenie číselnej priemernej molekulovej hmotnosti (Mn) polymérov Prednostnou metódou na stanovenie Mn je gélová permeačná chromatografia (GPC), najmä ak je k dispozícii sada štandardov so štruktúrou podobnou štruktúre stanovovaného polyméru. V prípadoch, v ktorých je použitie GPC sprevádzané praktickými problémami alebo ak je vopred známe, že polymér nespĺňa regulačné kritérium pre Mn, sú k dispozícii náhradné metódy ako napríklad: 1. Využitie koligatívnych vlastností 1. 1. Ebulioskopia/kryoskopia: meria sa pri nich zvyšovanie bodu varu (ebulioskopia) alebo znižovanie bodu tuhnutia (kryoskopia) rozpúšťadla, do ktorého sa pridáva polymér. Metóda je založená na skutočnosti, že vplyv rozpus- teného polyméru na bod varu/tuhnutia kvapaliny závisí od jeho molekulovej hmotnosti (1) (2). Použiteľnosť: Mn < 20 000. 1. 2. Znižovanie tlaku pár: pri tejto metóde sa meria tlak pár zvolenej referenčnej kvapaliny pred a po pridaní zná- mych množstiev polyméru (1) (2). Použiteľnosť: Mn < 20 000 (teoreticky; v praxi je užitočnosť metódy obmedzená). 1. 3. Membránová osmometria: metóda využíva princíp osmózy, t. j. prirodzený sklon molekúl rozpúšťadla prechá- dzať cez polopriepustnú membránu zo zriedeného do koncentrovaného prostredia až po dosiahnutie rovno- váhy. Pri pokuse má zriedený roztok nulovú koncentráciu a koncentrovaný roztok obsahuje polymér. Prechá- dzaním rozpúšťadla vzniká rozdiel tlaku, ktorého veľkosť závisí od koncentrácie a molekulovej hmotnosti polyméru (1) (3) (4). Použiteľnosť: Mn medzi 20 000 — 200 000. 1. 4. Osmometria v plynnej fáze: pri tejto metóde sa porovnáva rýchlosť odparovania čistého aerosólu rozpúšťadla s rýchlosťou odparovania najmenej troch aerosólov obsahujúcich rozličné koncentrácie polyméru (1) (5) (6). Použiteľnosť: Mn < 20 000. 2. Analýza koncovej skupiny Na použitie tejto metódy je potrebné poznať celkovú štruktúru polyméru a aj povahu skupín nachádzajúcich sa na konci reťazcov (tieto skupiny musia byť od hlavného reťazca polyméru odlíšiteľné napríklad pomocou NMR alebo titrácie/derivatizácie). Zo stanovenia molekulárnej koncentrácie koncových skupín, ktoré sa nachá- dzajú v polyméri, možno vypočítať hodnotu molekulovej hmotnosti (7) (8) (9). Použiteľnosť: Mn do 50 000 (s klesajúcou spoľahlivosťou). ODKAZY 1. Billmeyer, F. W. Jr. (1984) Textbook of Polymer Science, 3rd ed. , John Wiley, New York. 2. Glover, C. A. (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P. E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York. 3. ASTM D 3750-79 (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylva- nia. 4. Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper ed. , J. Wiley and Sons, pp. 25 - 52. 5. ASTM 3592-77 (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 285 6. Morris, C. E. M. (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper ed. , John Wiley and Sons. 7. Schröder, E. , Müller, G. , and Arndt, K-F. , (1989). Polymer characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich. 8. Garmon, R. G. , (1975) End-Group Determinations, Chapter 3. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P. E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York. 9. Amiya, S. , et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146. 286 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 PRÍLOHA III B A. 19 OBSAH ZLOŽIEK S NÍZKOU MOLEKULOVOU HMOTNOSŤOU V POLYMÉROCH 1. METÓDA Táto metóda, založená na gélovej permeačnej chromatografii, je prevzatá z OECD TG 119 (1996). Základné princípy a ďalšie technické informácie sú uvedené v literárnych odkazoch. 1. 1. Úvod Vlastnosti polymérov sú veľmi rôznorodé a nie je preto možné opísať jedinú metódu, ktorá by presne vyme- dzovala podmienky ich separácie a vyhodnocovania a ktorá by brala do úvahy všetky možnosti a špeci- fické situácie vyskytujúce sa pri separácii polymérov. Predovšetkým nie vždy možno pri komplexných po- lymérových systémoch použiť gélovú permeačnú chromatografiu (GPC). Tam, kde nie je použitie GPC z praktického hľadiska možné, dajú sa molekulové hmotnosti stanoviť inými spôsobmi (pozri prílohu). V takýchto prípadoch je potrebné uviesť všetky podrobnosti a použitie konkrétnej metódy treba odôvod- niť. Opisovaná metóda je založená na norme DIN 55672 (1). Podrobné informácie o vykonaní pokusu a spô- sobe vyhodnotenia údajov možno nájsť v uvedenej norme. Všetky zmeny, ktoré sú potrebné v metóde uro- biť, musia byť odôvodnené. Možno použiť aj iné normy, no treba pri tom uviesť plný literárny odkaz. Pri opisovanej metóde sa na kalibráciu používajú vzorky polystyrénu so známou polydisperzitou a možno ju modifikovať tak, aby bola vhodná pre určité polyméry, napríklad pre polyméry rozpustné vo vode a vetvené polyméry s dlhými reťazcami. 1. 2. Definície a jednotky Nízka molekulová hmotnosť je arbitrárne definovaná ako molekulová hmotnosť nižšia ako 1 000 dalto- nov. Číselná priemerná molekulová hmotnosť Mn a hmotnostná priemerná molekulová hmotnosť Mw sa stano- vili pomocou týchto rovníc: kde: Hi je hladina signálu detektora od základnej čiary retenčného objemu Vi Mi je molekulová hmotnosť polymérovej frakcie pri retenčnom objeme Vi a n je počet dátových bodov. Šírka distribúcie molekulových hmotností, ktorá predstavuje mieru disperzity systému, je daná pomerom Mw/Mn. 1. 3. Referenčné látky GPC je relatívna metóda, a preto je potrebné uskutočniť kalibráciu. Bežne sa na tento účel používajú lineárne konštruované polystyrénové štandardy so známymi molekulovými hmotnosťami Mn a Mw a s úzkou oblas- ťou distribúcie. Kalibračnú krivku možno použiť na stanovenie molekulovej hmotnosti neznámej vzorky iba vtedy, ak sa pri separácii štandardov aj neznámej vzorky použijú úplne rovnaké podmienky. 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 287 Vzťahy stanovené medzi molekulovou hmotnosťou a elučným objemom sú platné iba pri špecifických pod- mienkach daného pokusu. Medzi tieto podmienky patrí predovšetkým teplota, typ rozpúšťadla (alebo zmesi rozpúšťadiel), chromatografické podmienky a rozdeľovacia kolóna alebo systém kolón. Takto stanovené molekulové hmotnosti vzoriek predstavujú pomerné hodnoty a označujú sa ako „mole- kulové hmotnosti polystyrénového ekvivalentu“. Znamená to, že v závislosti od štrukturálnych a chemic- kých rozdielov medzi vzorkou a štandardmi sa môžu molekulové hmotnosti do väčšej alebo menšej miery od svojich absolútnych hodnôt odlišovať. Prípadné použitie iných štandardov, napríklad polyetylénglyko- lu, polyetylénoxidu, polymetylmetakrylátu alebo kyseliny polyakrylovej, je potrebné odôvodniť. 1. 4. Princíp testovacej metódy Distribúciu molekulových hmotností vzorky aj priemerné molekulové hmotnosti (Mn, Mw) možno stano- viť pomocou metódy GPC. Metóda GPC predstavuje osobitný typ kvapalinovej chromatografie, pri ktorej dochádza k rozdeleniu vzorky na základe hydrodynamických objemov jej jednotlivých zložiek (2). K oddeľovaniu dochádza pri prechode vzorky cez kolónu, ktorá je naplnená poréznym materiálom, kto- rým je zvyčajne organický gél. Malé molekuly cez póry prechádzajú, zatiaľ čo veľké molekuly sa z objemu gélu vylučujú. Dráha, ktorú prekonajú veľké molekuly, je preto kratšia a tieto sa vylučujú ako prvé. Mole- kuly strednej veľkosti do niektorých pórov vnikajú a vylučujú sa z kolóny neskôr. Najmenšie molekuly s hydrodynamickým priemerom menším, ako je veľkosť pórov gélu, môžu vnikať do všetkých z nich a vylu- čujú sa ako posledné. V ideálnych podmienkach závisí oddeľovanie výlučne od veľkosti jednotlivých molekúl, no v praxi býva ťažké vyhnúť sa aspoň určitej interferencii absorpčných vplyvov. Situácia sa môže zhoršiť aj v dôsledku nerovnomerného naliatia kolóny a mŕtvych objemov (2). Detekciu je možné uskutočňovať napríklad pomocou merania indexu lomu alebo UV-absorpcie eluátov. Na základe takýchto údajov je možné zostrojiť jednoduchú distribučnú krivku. Molekulové hmotnosti možno bodom na distribučnej krivke prisúdiť iba po predchádzajúcom okalibrovaní kolóny. Robí sa to tak, že na kolónu sa nanesú polyméry so známou molekulovou hmotnosťou, v ideálnom prípade aj s približne podobnou štruktúrou, napríklad rozličné polystyrénové štandardy. Zvyčajne sa získava gaussovská krivka, ktorá býva niekedy na strane nízkych molekulových hmotností mierne pretiahnutá. Zvislá os udáva hmot- nostné množstvo jednotlivých typov molekúl vyplavených z kolóny, vodorovná os je vyjadrená ako deka- dický logaritmus molekulovej hmotnosti. Obsah zložiek s nízkou molekulovou hmotnosťou sa odvádza z tejto krivky. Výpočet môže byť presný iba vtedy, ak zložky s nízkou molekulovou hmotnosťou ekvivalentne na hmotnostnom základe zodpovedajú polyméru ako celku. 1. 5. Kritériá kvality Reprodukovateľnosť (relatívna štandardná odchýlka, RSD) elučného objemu by mala byť lepšia ako 0,3 %. Ak sa chromatogram vyhodnocuje nezávisle od času a ak nespĺňa horeuvedené kritérium, potom je potrebné zabezpečiť reprodukovateľnosť analýzy pomocou vnútorného štandardu (1). Polydisperzita závisí od molekulových hmotností štandardov. V prípade polystyrénových štandardov sú typické tieto hodnoty: Mp < 2 000 2 000 ≤ Mp ≤ 106 Mp > 106 Mw/Mn < 1,20 Mw/Mn < 1,05 Mw/Mn < 1,20 (Mp je molekulová hmotnosť štandardu v maxime píku) 1. 6. Opis testovacej metódy 1. 6. 1. Príprava štandardných roztokov polystyrénu Polystyrénové štandardy sa rozpustia opatrným miešaním vo zvolenom elučnom činidle. Pri príprave roz- tokov sa treba riadiť odporúčaniami výrobcov. 288 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 Voľba koncentrácií štandardov závisí od rozličných faktorov, napríklad od nanášacieho objemu, viskozity roztoku a citlivosti analytického detektora. Maximálny nanášací objem musí byť prispôsobený dĺžke kolóny, aby nedochádzalo k jej preťaženiu. Zvyčajné nanášacie objemy pri analytických separáciách pomocou GPC sa pri kolóne s rozmerom 30 cm x 7,8 mm pohybujú v rozmedzí 40 až 100 μl. Je možné použiť aj vyššie objemy, nemali by však presiahnuť 250 μl. Pred samotnou kalibráciou kolóny je potrebné určiť optimálny pomer medzi nanášacím objemom a koncentráciou nanášanej vzorky. 1. 6. 2. Príprava roztoku vzorky V zásade rovnaké požiadavky sa vzťahujú aj na prípravu roztokov vzoriek. Vzorka sa opatrným potriasa- ním rozpustí vo vhodnom rozpúšťadle, napríklad v tetrahydrofuráne (THF). V žiadnom prípade ju nemožno rozpúšťať v ultrazvukovom kúpeli. V prípade potreby sa vzorka prečistí filtráciou cez membránový filter s veľkosťou pórov medzi 0,2 a 2 μm. V záverečnej správe je potrebné zmieniť sa o prítomnosti nerozpustených tuhých častíc, ktoré môžu byť dôsledkom prítomnosti vysokých molekulových hmotností. Percentuálne zastúpenie hmotnosti rozpuste- ných čiastočiek je potrebné určiť pomocou primeranej metódy. Roztoky sa musia použiť do 24 hodín. 1. 6. 3. Korekcia na obsah nečistôt a prímesí Zvyčajne je potrebné vykonať korekciu na obsah molekúl s molekulovou hmotnosťou M < 1 000, ktorými prispievajú zložky nepolymérovej povahy (napríklad nečistoty, resp. prímesi). Korekciu netreba vykonať v prípade, ak je ich nameraný obsah nižší ako 1 %. Na tento účel možno analyzovať priamo roztok pol- yméru alebo GPC eluát. V prípadoch, v ktorých je eluát po prechode cez kolónu na vykonanie ďalšej analýzy príliš zriedený, treba ho koncentrovať. Môže byť potrebné eluát odpariť dosucha a opätovne rozpustiť. Koncentrovanie eluátu treba vykonať za takých podmienok, ktoré zaručia, že v ňom neprebehnú žiadne zmeny. Spracovanie elu- átu po GPC závisí od analytickej metódy, ktorá sa použije na kvantitatívne stanovenie. 1. 6. 4. Prístrojové vybavenie Prístrojové vybavenie GPC zahŕňa tieto zložky: — nádrž na rozpúšťadlo, — zariadenie na odplyňovanie kvapalín (ak je potrebné), — čerpadlo, — tlmič pulzov kvapaliny (ak je potrebný), — nanášací systém, — chromatografické kolóny, — detektor, — prietokomer (ak je potrebný), — zariadenie na zaznamenávanie a spracúvanie údajov, — nádoba na odpad. Treba zabezpečiť inertnosť systému GPC voči používaným rozpúšťadlám (napríklad použitím oceľových kapilár, ak je rozpúšťadlo THF). 1. 6. 5. Nanášací systém a systém na privádzanie rozpúšťadla Buď pomocou automatického nanášacieho zariadenia, alebo ručne sa na kolónu nanesie v ostro vymedze- nej zóne definované množstvo roztoku vzorky. Príliš rýchle vytiahnutie striekačky alebo stlačenie jej piestu pri ručnom nanášaní vzorky môže spôsobiť zmeny v pozorovanej distribúcii molekulových hmotností. Sys- tém na privádzanie rozpúšťadla by nemal spôsobovať pulzové vlny, čo možno v ideálnom prípade zabez- pečiť zaradením tlmiča pulzov. Rýchlosť prietoku sa pohybuje okolo hodnoty 1 ml/min. 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 289 1. 6. 6. Kolóna V závislosti od vzorky možno polymér charakterizovať buď pomocou jedinej kolóny, alebo pomocou via- cerých za sebou spojených kolón. Ako náplň kolóny je komerčne dostupných viacero poréznych materiá- lov s definovanými vlastnosťami (napríklad veľkosť pórov, limit vylučovania). Voľba separačného gélu a dĺžky kolóny závisí od vlastností vzorky (hydrodynamické objemy, distribúcia molekulových hmotností) teploty a rýchlosti aj od špecifických podmienok pri separácii, napríklad od typu rozpúšťadla, prietoku (1) (2) (3). 1. 6. 7. Teoretické poschodia kolóny Kolóna alebo kombinácia viacerých kolón používaných pri separácii musí byť charakterizovaná počtom teoretických poschodí. V prípade THF ako rozpúšťadla sa to robí tak, že na kolónu so známou dĺžkou sa nanesie roztok etylbenzénu alebo iného vhodného nepolárneho rozpúšťadla. Počet teoretických poschodí udáva táto rovnica: W1/2)2 N = 5,54( Ve W)2 alebo N = 16(Ve kde: N Ve je počet teoretických poschodí je elučný objem v maxime píku W je šírka píku pri základnej čiare W1/2 je šírka píku v polovici jeho výšky. 1. 6. 8. Účinnosť separácie Okrem počtu teoretických poschodí, ktorý určuje šírku pásu, hrá pri separácii úlohu aj jej účinnosť, ktorá sa určuje na základe strmosti kalibračnej krivky. Účinnosť separácie kolóny možno získať z tohto vzťahu: V e,M x – V e,(10M x) vel’kostʼ plochy prierezu kolóny 3 2] ≥ 6,0[cm cm kde: VeMx Ve(10Mx) je elučný objem polystyrénu s molekulovou hmotnosťou Mx je elučný objem polystyrénu s desaťnásobne väčšou molekulovou hmotnosťou. Rozlíšiteľnosť systému sa zvyčajne definuje takto: R1,2 = 2 × Ve1 – Ve2 W1 + W2 × 1 log10(M2/M1) kde: Ve1, Ve2 sú elučné objemy dvoch polystyrénových štandardov v maxime píku W1, W2 sú šírky píkov pri základnej čiare M1, M2 sú molekulové hmotnosti v maxime píku (mali by sa líšiť o faktor 10). R-hodnota kolóny musí byť vyššia ako 1,7 (4). 1. 6. 9. Rozpúšťadlá Všetky rozpúšťadlá musia mať vysoký stupeň čistoty (pri THF je stupeň čistoty 99,5 %). Zásobník na roz- púšťadlo (v prípade potreby s atmosférou inertného plynu) musí byť dostatočne veľký na to, aby umožnil kalibráciu kolóny a analýzu niekoľkých vzoriek. Pred vháňaním do kolóny pomocou čerpadla treba elučné činidlo zbaviť plynov. 290 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 1. 6. 10. Kontrola teploty Teplota kritických vnútorných zložiek systému (nanášacia slučka, detektor a hadičky) musí byť stála a musí zodpovedať zvolenému rozpúšťadlu. 1. 6. 11. Detektor Účelom detektora je kvantitatívne zaznamenávanie koncentrácie vzorky eluovanej z kolóny. V záujme eli- minácie zbytočného rozširovania píku by mala mať kyveta meracej komôrky detektora čo možno najmenší objem. S výnimkou detektorov založených na rozptyle svetla a viskozitných detektorov by nemal presa- hovať 10 μl. Ako detekčná metóda sa zvyčajne používa diferenciálna refraktometria. Možno použiť aj iné typy detektorov (napríklad UV/VIS, IR, viskozitný detektor atď. ), ak si to vyžaduje osobitný charakter vzorky alebo elučného činidla. 2. ÚDAJE A PRÍPRAVA TESTOVACEJ SPRÁVY 2. 1. Údaje Podrobné vyhodnocovacie kritériá a požiadavky vzťahujúce sa na zber a spracúvanie údajov sú uvedené v norme DIN (1). Pri každej vzorke je potrebné uskutočniť dva nezávislé pokusy. Každý z nich treba analyzovať osobitne. Pri každom meraní treba udat’ Mn, Mw, Mw/Mn a Mp. Treba výslovne uviesť, že namerané hodnoty sú pomerné hodnoty, ekvivalentné použitým štandardom. Po stanovení retenčných objemov alebo retenčných časov (podľa možnosti korigovaných použitím vnú- torného štandardu) sa voči jednej z týchto hodnôt nanášajú do grafu hodnoty log Mp (Mp je maximum píku kalibračného štandardu). Na každú dekádu molekulových hmotností treba použiť aspoň dva kalibračné body, na zostrojenie celej kalibračnej krivky, ktorá by mala pokrývať odhadnutú molekulovú hmotnosť vzorky, je potrebných aspoň päť bodov. Koncový bod kalibračnej krivky v oblasti nízkych molekulových hmotností sa definuje pomocou n-hexylbenzénu alebo iného vhodného nepolárneho rozpúšťadla. Pri sta- noveni sa časť krivky zodpovedajúcej molekulovým hmotnostiam nižším ako 1 000 podľa potreby kori- guje na nečistoty a prísady. Nanášacie krivky sa zvyčajne hodnotia pomocou elektronického spracovania údajov. V prípade manuálnej digitalizácie sa možno riadiť dokumentom ASTM D 3536-91 (3). V prípade zadržania každého nerozpustného polyméru v kolóne je vysoko pravdepodobné, že jeho mole- kulová hmotnosť je vyššia ako molekulová hmotnosť rozpustnej frakcie. Výsledkom nevzatia tejto skutoč- nosti do úvahy môže byť nadhodnotenie zastúpenia zložiek s nízkou molekulovou hmotnosťou. Návod na uskutočnenie korekcie obsahu zložiek s nízkou molekulovou hmotnosťou na nerozpustný polymér je uvedený v prílohe. Distribučná krivka sa musi znázorniť vo forme tabuľky alebo graficky (diferenciálna frekvencia alebo kumu- latívna frekvencia v percentách proti log M). V grafickom znázorneni by mal mať jeden poriadok moleku- lovej hmotnosti dľžku 4 cm a výška maxima piku by mala byť asi 8 cm. Pri integrálnych distribučných kriv- kách by mala byť vzdialenosť medzi 0 a 100 % na osi y približne 10 cm. 2. 2. Správa z testu Správa z testu musí obsahovať tieto informácie: 2. 2. 1. Testovaná látka — dostupné informácie o testovanej látke (totožnosť, prísady, nečistoty/prímesi), — opis spracovania vzorky, zistené skutočnosti, problémy. 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 291 2. 2. 2. Prístroje a zariadenia — zásobník na elučné činidlo, inertný plyn, odplynenie elučného činidla, zloženie elučného činidla, nečistoty/prímesi, — čerpadlo, tlmič pulzov kvapaliny, nanášací systém, — rozdeľovacie kolóny (výrobca, všetky informácie o charakteristikách kolón, ako napríklad veľkosť pórov, druh separačného materiálu atď. , počet, dĺžka a usporiadanie použitých kolón), — počet teoretických poschodí kolóny (alebo kombinácie kolón), účinnosť rozdeľovania (rozlišovacia schopnosť systému), — informácie o symetrii píkov, — teploty kolóny, spôsob kontroly teploty, — detektor (princíp merania, typ, objem kyvety), — prietokomer, ak sa používa (výrobca, princíp merania), — systém na zaznamenávanie a spracúvanie údajov (hardvér a softvér). 2. 2. 3. Kalibrácia systému — podrobné opísanie metódy použitej na zostrojenie kalibračnej krivky, — informácie o kritériách kvality tejto metódy (napríklad korelačný koeficient, odchýlka súčtu štvorcov atď. ), — informácie o všetkých extrapoláciách, predpokladoch a aproximáciách, ktoré sa uskutočnili počas prie- behu pokusu a o vyhodnocovaní a spracúvaní údajov, — všetky merania, ktoré boli použité na zostrojenie kalibračnej krivky, musia byť zdokumentované v tabuľke, ktorá obsahuje tieto informácie pre každý bod merania: — názov vzorky, — výrobcu vzorky, — charakteristické hodnoty štandardov, t. j. Mp, Mn, Mw a Mw/Mn, tak ako ich uvádza výrobca alebo ako boli odvodené z následných meraní, ako aj podrobnosti o metóde stanovenia, — nanášací objem a koncentráciu nanesenej vzorky, — hodnotua Mp, ktorá bola použitá na kalibráciu, — elučný objem alebo opravený retenčný čas nameraný pri maxime píku, — Mp vypočítanú v maxime píku, — percentuálnu odchýlku vypočítanej hodnoty Mp od kalibračnej krivky. 2. 2. 4. Informácie o obsahu polyméru s nízkou molekulovou hmotnosťou — opísanie metódy, ktorá sa použila na vykonanie analýzy a spôsobu vykonania pokusu, — informácie o percentuálnom obsahu molekúl s nízkou molekulovou hmotnosťou (w/w) vzhľadom na celkové množstvo vzorky, — informácie o percentuálnom obsahu (w/w) nečistôt, prísad a iných molekúl nepolymérovej povahy vzhľadom na celkové množstvo vzorky. 2. 2. 5. Vyhodnotenie — vyhodnotenie na základe času: metódy použité na zabezpečenie požadovanej reprodukovateľnosti (ko- rekčná metóda, vnútorné štandardy atď. ), — informácia o tom, či bolo vyhodnotenie vykonané na základe elučného objemu, alebo retenčného času, — informácie o limitoch vyhodnocovania, ak nebola vykonaná úplná analýza píku, — opísanie vyrovnávacej/prekladacej metódy, ak sa použila, 292 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 — príprava a predbežné spracovanie vzorky, — prítomnosť nerozpustených čiastočiek, ak boli pozorované, — objem (μl) a koncentrácia (mg/ml) nanesenej vzorky, — opísanie vplyvov, ktoré mohli spôsobiť odchýlku od ideálneho GPC profilu, — podrobné opísanie modifikácií uskutočnených v testovacej metóde, — podrobnosti o rozsahu chýb merania, — všetky iné informácie a pozorované skutočnosti, ktoré by mohli byť významné z hľadiska interpretácie výsledkov. 3. ODKAZY 1. DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmit- tel, Teil I. 2. Yau, W. W. , Kirkland, J. J. , and Bly, D. D. eds. (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons. 3. ASTM D 3536-91 (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography - GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 4. ASTM D 5296-92 (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High-Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 293 Príloha Návod na uskutočnenie korekcie obsahu zložiek s nízkou molekulovou hmotnosťou na nerozpustný polymér Prítomnosť nerozpustného polyméru vo vzorke spôsobuje úbytok hmotnosti počas analýzy GPC. Nerozpustný pol- ymér sa nevratne zachytáva v kolóne alebo na filtri, zatiaľ čo rozpustná časť vzorky prechádza cez kolónu. Ak je možné určiť alebo merať prírastok indexu lomu (dn/dc) polyméru, potom je možné určiť aj veľkosť straty hmotnosti vzorky v kolóne. V takomto prípade sa uskutočňuje korekcia pomocou externej kalibrácie, pri ktorej sa na kalibro- vanie odpovede refraktometra používajú štandardné materiály so známou koncentráciou a známym pomerom dn/dc. V príklade, ktorý je uvedený v ďalšom texte, sa ako štandard použil poly(metyl)metakrylát (pMMA). Pri externej kalibrácii pre analýzu akrylových polymérov sa ako štandard používa roztok pMMA so známou kon- centráciou v tetrahydrofuráne, ktorý sa podrobuje analýze pomocou GPC. Zo získaných údajov sa pomocou tohto vzťahu zistí konštanta refraktometra: K = R/(C × V × dn/dc) kde: K R C V je konštanta refraktometra (v mikrovoltsekundách/ml) je nameraná hodnota pre pMMA (v mikrovoltsekundách) je koncentrácia štandardu pMMA (v mg/ml) je objem vzorky nanesenej do refraktometra (v ml) dn/dc je prírastok indexu lomu pre roztok pMMA v tetrahydrofuráne (v ml/mg). Pri štandardoch pMMA sa zvyčajne získavajú tieto údaje: R C = 2 937 891 = 1,07 mg/ml = 0,1 ml V dn/dc = 9 × 10–5 ml/mg. Výsledná hodnota K = 3,05 × 1011 sa potom použije na vypočítanie teoretickej odpovede detektora, ak ním prejde 100 % naneseného polyméru. 294 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 PRÍLOHA III C A. 20 ROZPÚŠŤACIE/EXTRAKTÍVNE VLASTNOSTI POLYMÉROV VO VODE 1. METÓDA Metóda je prevzatá z revidovanej verzie OECD TG 120 (1997). Ďalšie technické informácie sa nachádzajú v odkaze (1). 1. 1. Úvod Skôr ako sa pri určitých polyméroch, napríklad emulzných, bude dať použiť metóda, ktorá je opísaná v ďal- šom texte, môže byť potrebné vykonať prípravné postupy. Metódu nemožno použiť pri kvapalných po- lyméroch a pri polyméroch, ktoré pri pokusných podmienkach reagujú s vodou. V prípadoch, v ktorých nie je metóda praktická alebo uskutočniteľná, možno extrakčné vlastnosti polymé- rov stanovovať inými metódami, ktoré je potrebné podrobne opísať a ich použitie odôvodniť. 1. 2. Referenčné látky Žiadne. 1. 3. Princíp testovacej metódy Extraktívne vlastnosti polymérov vo vodnom prostredí sa stanovujú pomocou bankovej metódy (pozri A. 6 rozpustnosť vo vode, banková metóda) s modifikáciami, ktoré sú opísané v ďalšom texte. 1. 4. Kvalitatívne kritériá Žiadne. 1. 5. Opis testovacej metódy 1. 5. 1. Vybavenie Pre metódu je potrebné toto vybavenie: — drviace zariadenie, napríklad drvič, na získanie čiastočiek so známou veľkosťou, — trepacie zariadenie s možnosťou kontrolovania teploty, — systém membránových filtrov, — primerané analytické zariadenie, — štandardizované sitá. 1. 5. 2. Príprava vzorky Reprezentatívna vzorka sa najprv rozdrví a pomocou primeraných sít upraví tak, aby sa získali čiastočky s veľkosťou medzi 0,125 a 0,25 mm. Počas drvenia môže byť v záujme zachovania stability vzorky potrebné zabezpečiť chladenie. Materiály gumovitej konzistencie možno drviť pri teplote kvapalného dusíka (1). Ak dosiahnutie uvedeného rozmeru čiastočiek nie je možné, potom je potrebné pokúsiť sa o dosiahnutie ich najmenšieho možného rozmeru a výsledok treba zaznamenať. V testovacom protokole je potrebné uviesť spôsob uskladnenia vzorky pred vykonaním testu. 1. 5. 3. Postup Do každej z troch nádob so sklenou zátkou sa naváži 10 g testovanej látky a pridá sa k nim 1 000 ml vody. Ak spracúvanie 10 g testovanej látky nie je z praktického hľadiska možné, potom treba použiť jej najvyššie možné množstvo blízke tejto hodnote a objem vody mu treba príslušným spôsobom prispôsobiť. 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 295 Potom sa nádoby tesne uzavrú a nechajú sa premiešavať pri teplote 20 °C. Treba pri tom použiť trepacie alebo miešacie zariadenie pracujúce pri stálej teplote. Po 24 hodinách sa obsah každej nádoby scentrifu- guje alebo prefiltruje a pomocou vhodnej analytickej metódy sa v čírej vodnej fáze stanoví koncentrácia polyméru. Ak pre vodnú fázu neexistujú vhodné analytické metódy, potom možno celkovú rozpustnosť/extraktivitu stanoviť na základe suchej hmotnosti zvyšku na filtri alebo suchej hmotnosti scen- trifugovanej usadeniny. Zvyčajne býva potrebné uskutočniť kvantitatívne rozlíšenie medzi nečistotami a prímesami na jednej strane a medzi polymérnymi zložkami s nízkou molekulovou hmotnosťou na druhej strane. V prípade gravimet- rických stanovení je tiež dôležité vykonať slepé meranie bez testovacej látky, aby sa vzali do úvahy prímesi/nečistoty, ktoré sú do pokusu zanášané počas jeho postupu. Rozpúšťacie/extraktívne správanie polymérov vo vode pri 37 °C pH 2 a pH 9 možno stanoviť rovnakým spôsobom ako pri vykonávaní pokusu pri 20 °C. Požadované hodnoty pH možno dosiahnuť pridaním buď vhodných tlmivých roztokov, alebo vhodných kyselín, alebo zásad, ako sú kyselina chlorovodíková, kyse- lina octová, hydroxid sodný alebo draselný analytickej čistoty, alebo NH3. V závislosti od použitej analytickej metódy treba uskutočniť jeden alebo dva testy. Ak sú na priame ana- lyzovanie obsahu polymérovej zložky vodnej fázy k dispozícii dostatočne špecifické metódy, potom by mal postačovať jediný z horeuvedených testov. Ak však takéto metódy k dispozícii nie sú a stanovenie rozpúšťacích/extraktívnych vlastností polyméru je obmedzené na nepriamu analýzu pomocou stanovenia iba celkového množstva organicky viazaného uhlíka (TOC) vo vodnom extrakte, potom je potrebné usku- točniť prídavný test. Takýto prídavný test je potrebné vykonať v triplikátoch s použitím desaťnásobne men- šieho množstva polyméru a rovnakého množstva vody ako pri prvom teste. 1. 5. 4. Analýza 1. 5. 4. 1. Testy v y kon á van é s je d n ý m m n o ž s t v o m v z o r k y Môžu existovať metódy na priamu analýzu polymerických zložiek vodnej fázy. Možno uvažovať taktiež o nepriamej analýze rozpustených/extrahovaných zložiek, pri ktorej sa stanovuje celkové množstvo roz- pustných čiastočiek, ktoré sa upravuje na obsah zložiek nepolymérovej povahy. Analýzu celkového obsahu polymérových látok vo vodne fáze možno uskutočniť: buď pomocou dostatočne citlivej metódy, napríklad: — pomocou stanovenia TOC, pri ktorom sa vzorka najprv rozloží kyselinou persírovou alebo kyselinou dvojchrómovu za vzniku CO2, po čom nasleduje stanovenie pomocou IR alebo chemickej analýzy, — pomocou atómovej absorpčnej spektrometrie (AAS) alebo na ekvivalentnej metóde založenej na emi- sii induktívne naviazanej plazmy (Inductively Coupled Plasma, ICP) pri polyméroch s obsahom kre- míka alebo kovov, — pomocou UV absorpcie alebo spektrofluorometrie pri arylových polyméroch, — LC-MS pri nízkomolekulárnych vzorkách, alebo pomocou vákuového odparenia vodného extraktu dosucha a následnou spektroskopickou (IR, UV atď. ), alebo AAS/ICP analýzou zvyšku. Ak analýza vodnej fázy ako takej nie je z praktického hľadiska uskutočniteľná, potom je potrebné podro- biť vodný extrakt extrakcii organickým rozpúšťadlom nemiešateľným s vodou, čo môže byť napríklad chló- rovaný uhľovodík. Rozpúšťadlo sa potom nechá odpariť a zvyšok sa analyzuje na obsah daného polyméru horeuvedeným spôsobom. Všetky zložky takéhoto zvyšku, ktoré sa vyhodnotia ako nečistoty alebo prí- mesi, je potrebné od výsledku odrátať, aby sme stanovili stupeň rozpustnosti/extrakcie iba samotného po- lyméru. Ak je množstvo takýchto materiálov vo vzorke relatívne veľké, potom môže byť potrebné podrobiť zvy- šok napríklad analýze pomocou HPLC alebo GC. Umožní to odlíšiť nečistoty od prítomných monomérov alebo ich derivátov, čím sa umožní stanovenie ich skutočného obsahu. V niektorých prípadoch môže postačovať jednoduché odparenie organického rozpúšťadla dosucha a odvá- ženie zvyšku. 296 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 1. 5. 4. 2. Te s t y v y k o n á v a n é s d v o m a m n o ž s t v a m i v z o r k y Všetky vodné extrakty sa analyzujú na prítomnosť TOC. Nerozpustená/neextrahovaná časť vzorky sa podrobí gravimetrickému stanoveniu. Ak zostanú po centri- fugácii alebo filtrácii obsahu každej banky prichytené na stenách nádoby zvyšky polyméru, potom treba nádobu oplachovať filtrátom dovtedy, kým sa nebude na jej stenách nachádzať žiaden viditeľný zvyšok. Fil- trát sa potom podrobí opätovnej centrifugácii alebo filtrácii. Zvyšky, ktoré zostanú na filtri alebo v cen- trifugačnej kyvete, sa nechajú vysušiť pri 40 °C a odvážia sa. V sušení sa pokračuje až po dosiahnutie kon- štantnej hmotnosti. 2. ÚDAJE 2. 1. Testy vykonávané s jedným množstvom vzorky Je potrebné uviesť jednotlivé výsledky získané pri každej z troch baniek a priemerné hodnoty vyjadrené v jednotkách hmotnosti na objem roztoku (zvyčajne mg/l) alebo v jednotkách hmotnosti na hmotnosť vzorky polyméru (zvyčajne mg/g). Treba uviesť i straty hmotnosti vzorky (vypočítané ako hmotnosť roz- pustenej látky vydelená hmotnosťou pôvodnej vzorky). Treba vypočítať relatívne štandardné odchýlky (RS- D). Údaje pre celkové množstvo látky (polymér + hlavné prímesi atď. ) a iba pre samotný polymér (t. j. po odčítaní príspevku horeuvedených prímesí) treba uviesť osobitne. 2. 2. Testy vykonávané s dvoma množstvami vzorky Treba uviesť jednotlivé hodnoty TOC vodných extraktov oboch pokusov vykonaných v triplikátoch, vyjad- rené v jednotkách hmotnosti na objem rozpúšťadla (zvyčajne mgC/l), ako aj v jednotkách hmotnosti na hmotnosť pôvodnej vzorky (zvyčajne mgC/g). Z neexistencie rozdielu medzi výsledkami získanými pri vysokom a nízkom pomere vzorka/voda môže vyplývať, že všetky extrahovateľné látky boli skutočne aj extrahované. V takomto prípade nebude priama analýzy zvyčajne potrebná. Treba uviesť jednotlivé hmotnosti zvyškov vyjadrené ako percentuálny podiel z pôvodnej hmotnosti vzorky. Pri každom z pokusov treba vypočítať priemerné hodnoty. Rozdiely medzi hodnotou 100 a ziste- ným percentuálnym zastúpením predstavujú percentuálne zastúpenie rozpustenej a extrahovateľnej hmoty v pôvodnej vzorke. 3. PRÍPRAVA TESTOVACEJ SPRÁVY 3. 1. Správa z testu Správa z testu musí obsahovať tieto informácie: 3. 1. 1. Testovaná látka — dostupné informácie o testovanej látke (totožnosť, prísady, obsah nízkomolekulárnych zložiek). 3. 1. 2. Pokusné podmienky — opísanie použitých postupov a pokusných podmienok, — opísanie analytických a detekčných metód. 3. 1. 3. Výsledky — výsledky týkajúce sa rozpustnosti/extrahovateľnosti v mg/l; jednotlivé a priemerné hodnoty extrakč- ných testov pri jednotlivých roztokoch, rozdelené podľa obsahu polyméru a nečistôt, prímesí atď. , — výsledky týkajúce sa rozpustnosti/extrahovateľnosti v mg/g polyméru, — TOC hodnoty vodných extraktov, hmotnosť rozpusteného podielu a vypočítané percento, ak bolo sta- novené, 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 297 — pH každej vzorky, — informácie o hodnotách získaných pri slepých vzorkách, — ak je potrebné, aj informácie o chemickej nestálosti testovanej látky počas samotného testovania aj ana- lytických postupov, — všetky informácie, ktoré môžu mať význam pre interpretovanie výsledkov. 4. ODKAZY 1. DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke. 298 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 PRÍLOHA III D C. 13 BIOKONCENTRÁCIA: PRIETOKOVÝ RYBÍ TEST 1. METÓDA Táto metóda je prevzatá z OECD TG 305 (1996). 1. 1. Úvod Táto metóda opisuje postup, ktorý sa používa na charakterizáciu potenciálu látok na biokoncentrovanie v rybách pri prietočných podmienkach. Prednosť sa dáva prietočným testovacím režimom, no pod pod- mienkou spĺňania kritérií platnosti možno použiť aj poloprietočné režimy. Metóda poskytuje dostatok podrobností na uskutočnenie testu a súčasne poskytuje primeranú voľnosť na prispôsobenie pokusného usporiadania podmienkam jednotlivých laboratórií a rozličným charakteri- stikám testovaných látok. Najplatnejším spôsobom ju možno použiť pri stálych organických chemických zlúčeninách s hodnotami log Pow medzi 1,5 a 6,0 (1), no dá sa ešte použiť aj pre superlipofilné látky (s hod- notou Pow > 6,0). Predbežne odhadnutá hodnota biokoncentračného faktora (BCF), ktorý sa niekedy ozna- čuje ako KB, týchto superlipofilných látok bude pravdepodobne vyššia ako hodnota rovnovážneho bio- koncentračného faktora (BCFss), ktorú možno dosiahnuť v laboratórnych pokusoch. Predbežné odhady biokoncentračného faktora organických látok s hodnotami log Pow do 9,0 možno získať pomocou rov- nice Bintena a spol. (2). Medzi parametre, ktoré charakterizujú biokoncentračný potenciál, patria vychy- távacia konštanta/konštanta rýchlosti vychytávania (k1), konštanta rýchlosti depurácie/vylučovania (k2) a BCFss. Analyzovanie vzoriek vody i rýb uľahčuje použitie rádioaktívne označených látok, na základe ktorých sa dá overiť, či treba uskutočniť identifikáciu a kvantifikáciu degradačných produktov. Pri meraní celkových rádioaktívnych zvyškov (napríklad spaľovaním alebo solubilizáciou tkanív) je BCF založené na materskej látke, všetkých jej metabolitoch zadržaných v organizme a tiež na asimilovanom uhlíku. Hodnoty BCF, ktoré sú založené na celkovom množstve rádioaktívnych zvyškov, preto nemožno priamo porovnávať s hodnotami BCF získanými pomocou špecifickej chemickej analýzy iba materskej látky. Na stanovenie BCF založeného iba na materskej látke možno v štúdiách s rádioaktívne označenými lát- kami použiť čistiace postupy a v prípade potreby možno stanovovať najvýznamnejšie metabolity. Je tiež možná kombinácia rybej metabolickej štúdie a biokoncentračnej štúdie, pri ktorej sa analyzujú a identifi- kujú metabolity v tkanivách. 1. 2. Definície a jednotky Biokoncentrácia/bioakumulácia je zvyšovanie koncentrácie testovanej látky v alebo na organizme (jeho urče- nom tkanive) vzhľadom na jej koncentráciu v okolitom prostredí. Biokoncentračný faktor (BCF alebo KB) v ktoromkoľvek čase počas vychytávacej fázy tohto akumulačného testu predstavuje koncentráciu testovanej látky v/na rybe alebo jej určenom tkanive [Cf ako μg/g (ppm)], vydelenú koncentráciou tejto látky v okolitom prostredí [Cw ako μl/ml (ppm)]. Rovnovážny biokoncentračný faktor (BCFss alebo KB) sa počas dlhého časového obdobia významne nemení, koncentrácia testovanej látky v okolitom prostredí je počas tohto obdobia stála. Plató alebo rovnovážny stav nastáva pri grafickom znázornení závislosti obsahu testovanej látky v rybe (Cf) od času vtedy, keď sa priebeh krivky stáva paralelný s časovou osou a tri po sebe idúce analýzy Cf, usku- točnené na vzorkách odobratých minimálne v dvojdňových intervaloch, sa od seba neodlišujú o viac ako ± 20 % a ak počas týchto troch odberov vzoriek nedochádza k žiadnym významným zmenám. Pri ana- lyzovaní spájaných vzoriek je potrebné vykonať najmenej štyri bezprostredne za sebou idúce analýzy. Pri pomaly sa vychytávajúcich látkach je primeranejší interval sedem dní. 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 299 Biokoncentračné faktory vypočítané priamo z kinetických konštánt (k1/k2) sa nazývajú kinetický koncen- tračný faktor (BCFk). Rozdeľovací koeficient oktanol-voda (Pow) je pomer rozpustnosti chemickej zlúčeniny v n-oktanole a vo vode pri rovnovážnych podmienkach (metóda A. 8), tiež označovaný ako Kow. Dekadický logaritmus veličiny Pow sa používa na vyjadrenie potenciálu chemickej látky na biokoncentráciu vo vodných živočíchoch. Expozičná alebo vychytávaciafáza je čas, počas ktorého sú ryby vystavené testovanej chemickej látke. Rýchlostná konštanta vychytávania (k1) je číselná hodnota, ktorá definuje rýchlosť zvyšovania koncentrácie testovanej látky v/na testovaných rybách (alebo ich určenom tkanive), keď sú ryby vystavené jej prítom- nosti (k1 sa vyjadruje ako deň–1). Poexpozičná alebo depuračná (vylučovacia) fáza je čas, ktorý nasleduje po premiestnení testovaných rýb z pro- stredia obsahujúceho testovanú látku do média, v ktorom táto látka nie je prítomná a počas ktorého sa skúma depurácia (alebo čisté vylučovanie) látky z testovacích rýb (alebo z ich určených tkanív). Rýchlostná konštanta depurácie (vylučovania) (k2) je číselná hodnota definujúca rýchlosť znižovania koncen- trácie testovanej látky v testovacích rybách (alebo ich určených tkanivách) po premiestnení testovacích rýb z média obsahujúceho testovanú látku do média, ktoré túto látku neobsahuje (k2 sa vyjadruje ako deň–1). 1. 3. Princíp testovacej metódy Test pozostáva z dvoch fáz, t. j. z expozičnej (vychytávacej) a poexpozičnej (depuračnej) fázy. Počas vychy- távacej fázy sa dve oddelené skupiny jedného druhu rýb vystavujú najmenej dvom koncentráciám testo- vanej látky. Potom sa premiestnia do prostredia, ktoré testovanú látku neobsahuje, a začne prebiehať depu- račná fáza. Okrem prípadov, v ktorých dochádza počas vychytávacej fázy iba k nevýznamnému vychytávaniu testovanej látky (t. j. hodnota BCF je nižšia ako 10), je depuračná fáza vždy potrebná. Počas oboch fáz testu sa sleduje koncentrácia testovanej látky v/na rybách (alebo ich určených tkanivách). Okrem dvoch testovaných koncentrácií sa kontrolná skupina rýb vystavuje prostrediu s úplne identickými pod- mienkami, ktoré však neobsahuje testovanú látku. Účelom tejto skupiny je vztiahnutie možných nepriaz- nivých účinkov pozorovaných počas biokoncentračného testu na príslušné kontroly a získanie koncen- trácie testovanej látky v pozadí. S výnimkou prípadov, v ktorých sa preukáže dosiahnutie rovnovážneho stavu skôr, trvá vychytávacia fáza 28 dní. Predpovedanie dĺžky vychytávacej fázy potrebnej na dosiahnutie rovnovážneho stavu možno usku- točniť na základe rovnice, ktorá je uvedená v prílohe 3. Depuračná fáza sa začne premiestnením rýb do čistej nádrže s úplne rovnakým prostredím, ktoré však neobsahuje testovanú látku. Vždy keď je to možné, sa biokoncentračný faktor prednostne vypočíta ako pomer (BCFss) koncentrácie testovanej látky v rybách (Cf) a vo vode (Cw) pri zjavnom rovnovážnom stave a tiež ako kinetický biokoncentračný faktor (BCFk), ako pomer rýchlostných konštánt vychytávania (k1) a depurácie (k2) za predpokladu, že proces sa riadi kinetikou prvého poriadku. V prípadoch, v ktorých sa proces zjavne neriadi kinetikou prvého poriadku, treba použiť komplexnejšie modely (príloha 5). Ak sa rovnovážny stav nedosiahne do 28 dní, potom je potrebné pokračovať vo vychytávacej fáze až do jeho dosiahnutia alebo počas 60 dní podľa toho, čo nastane prv. Potom sa začína depuračná fáza. Na základe modelu, ktorý najlepšie opisuje namerané koncentrácie testovanej látky v rybách a vo vode, sa vypočíta rýchlostná konštanta vychytávania, rýchlostná koncentrácia depurácie (vylučovania) (alebo rých- lostné konštanty v prípade komplexnejších modelov), biokoncentračný faktor a tam, kde je to možné, aj intervaly spoľahlivosti každého z týchto parametrov. BCF sa vyjadruje ako funkcia celkovej vlhkej hmotnosti rýb. Z osobitných dôvodov sa však môžu v prí- padoch dostatočnej veľkosti rýb niekedy použiť určené tkanivá alebo orgány (napríklad sval, pečeň), alebo sa môžu ryby rozdeliť na jedlé (rezy/filety) alebo nejedlé časti (vnútornosti). Pretože pri mnohých organic- kých látkach sa pozoruje jasná súvislosť medzi ich biokoncentračným potenciálom a lipofilitou, existuje tiež príslušná súvislosť medzi obsahom tuku v testovaných rybách a pozorovanou biokoncentráciou týchto látok. V záujme znižovania takéhoto zdroja variability výsledkov testovania by sa pri veľmi lipofilných lát- kach (t. j. ak je ich log Pow > 3) mala biokoncentrácia vyjadrovať okrem celkovej telesnej hmotnosti rýb aj na obsah tuku. 300 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 Ak je to možné, obsah tuku by sa mal stanovovať v rovnakom biologickom materiáli, ktorý sa použil na stanovenie koncentrácie testovanej látky. 1. 4. Informácie o testovanej látke Pred uskutočnením testu na zisťovanie biokoncentrácie treba mať k dispozícii tieto informácie o testova- nej látke: a) rozpustnosť vo vode; b) rozdeľovací koeficient oktanol-voda Pow (označovaný aj ako Kow, stanovený pomocou metódy HPLC uvedenej v A. 8); c) hydrolýzu; d) fototransformáciu vo vode, stanovenú pri slnečnom alebo simulovanom slnečnom svetle a pri takých svetelných podmienkach, pri akých sa bude uskutočňovať test na stanovenie biokoncentrácie (3); e) povrchové napätie (t. j. pri látkach, pri ktorých nemožno stanoviť log Pow); f) tlak nasýtených pár; g) okamžitú biodegradáciu (ak je to potrebné). Medzi ďalšie požadované informácie patrí toxicita pre druh rýb použitý v teste, podľa možnosti vyjadrená ako asymptotická LC50 (t. j. nezávislá od času). Na kvantifikáciu testovanej látky v testovaných roztokoch a v biologickom materiáli musí byť k dispozícii primeraná analytická metóda so známou presnosťou a spo- ľahlivosťou. Musia byť známe aj údaje o príprave a skladovaní vzorky. Treba tiež poznať analytický prah detekcie testovanej látky vo vode a v rybích tkanivách. Pri používaní testovaných látok označených uhlí- kom 14C treba poznať aj percentuálne zastúpenie rádioaktivity spojenej s nečistotami/prímesami. 1. 5. Platnosť testu Aby bol test platný, musia byť dodržané tieto podmienky: — výkyvy teploty menšie ako ± 2 °C, — koncentrácia rozpusteného kyslíka nesmie klesnúť pod 60 % saturácie, — koncentrácia testovanej látky v komorách sa musí udržiavať v rozmedzí ± 20 % priemeru hodnôt nameraných počas vychytávacej fázy, — úhyn alebo iné nepriaznivé vplyvy/choroby sú na konci testu u testovaných aj kontrolných rýb nižšie ako 10 %; pri trvaní testu počas niekoľkých týždňov alebo mesiacov musí byť úhyn alebo iné nepriaz- nivé javy nižší ako 5 % za týždeň a celkovo nesmie presiahnuť 30 %. 1. 6. Referenčné zlúčeniny V prípade potreby možno experimentálne postupy overiť pomocou referenčných zlúčenín so známym bio- koncentračným potenciálom. Nemožno však zatiaľ odporúčať žiadne konkrétne látky. 1. 7. Opis testovacej metódy 1. 7. 1. Prístrojové vybavenie Pri všetkých súčastiach zariadení sa treba vyhýbať používaniu materiálov, ktoré sa môžu rozpúšťať, absor- bovať a vylúhovávať a ktoré môžu mať na ryby nepriaznivé účinky. Možno používať bežné nádrže pra- vouhlého alebo valcovitého tvaru z vhodného materiálu a takej veľkosti, ktorá zodpovedá veľkosti násady rýb. Pokiaľ možno, treba sa vyhýbať používaniu hadičiek a rúrok z mäkkých plastických látok. Prednostne treba používať hadičky, rúrky vyrobené z teflónu (R), nehrdzavejúcej ocele alebo skla. Zo skúseností vyplýva, že pri látkach s vysokým absorpčným koeficientom (napríklad pri syntetických pyretroidoch) môže byť potrebné používať posilanizované sklo. V takýchto prípadoch je potrebné zariadenia po skon- čení pokusu zlikvidovať. 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 301 1. 7. 2. Voda Pri testoch sa vo všeobecnosti používa prírodná voda, ktorá musí byť získavaná z nekontaminovaných zdrojov s jednotnou kvalitou. Riediaca voda musí mať takú kvalitu, aby umožnila prežívanie zvoleného druhu rýb počas celého obdobia aklimatizácie a testovania bez toho, aby sa pri nich prejavil nezvyčajný vzhľad alebo správanie. V ideálnom prípade treba preukázať, že testovaný druh dokáže vo vode používa- nej na riedenie prežívať, rásť a rozmnožovať sa (napríklad pomocou testu v laboratórnej kultúre alebo testu toxicity pre životný cyklus). Vodu treba charakterizovať najmenej z hľadiska pH, tvrdosti, celkového obsahu tuhých látok a organicky viazaného uhlíka a pokiaľ možno tiež obsahu amoniaku, dusitanov a alkalitov a pri morských druhoch aj z hľadiska slanosti. Hoci sú parametre, ktoré sú potrebné na zaručenie opti- málneho blahobytu rýb, dobre známe, v prílohe 1 sú uvedené odporúčané maximálne koncentrácie celého radu parametrov charakterizujúcich sladkú aj morskú vodu. Voda musí mať počas celého trvania testu stálu kvalitu. Hodnota pH by sa mala pohybovať v rozmedzí 6,0 až 8,5, no počas daného testu by nemala kolísať o viac ako ± 0, 5 jednotiek pH. Aby voda neovplyvňovala neprimeraným spôsobom výsledky testovania (napríklad vznikaním komplexov testovanej látky) alebo aby nemal nepriaznivý vplyv na násadu testovacích rýb, je potrebné zabezpečiť v pravidelných intervaloch odber vzoriek na analýzu. Ak je známe, že voda má relatívne stálu kvalitu, stačí, ak sa v nej bude napríklad raz za každé tri mesiace stanovovať obsah ťažkých kovov (napríklad Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), hlavných anió- nov a katiónov (napríklad Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), pesticídov (napríklad celkové organofosforečné a orga- nochloridové pesticídy), celkového organicky viazaného uhlíka a rozsuspendovaných tuhých častíc. Ak si voda preukázateľne zachováva stálu kvalitu počas najmenej jedného roka, potom možno vykonávať tieto stanovenia menej často (napríklad každých šesť mesiacov). Obsah prirodzených tuhých častíc aj celkového organicky viazaného uhlíka by mal byť v riediacej vode čo možno najnižší, aby sa zabránilo absorpcii testovanej látky na organickú hmotu, v dôsledku čoho by sa mohla znížiť jej biologická dostupnosť (4). Maximálny prípustný obsah tuhých častíc je 5 mg/l (suchá hmotnosť, neprechádzajúca cez 0,45 μm filter) a celkového organicky viazaného uhlíka 2 mg/l (pozri prí- lohu 1). V prípade potreby treba vodu pred použitím filtrovať. Príspevok testovacích rýb (exkrementy) a zvyškov krmiva k obsahu organicky viazaného uhlíka vo vode by mal byť čo možno najnižší. Koncen- trácia organicky viazaného uhlíka v testovacej nádrži by nemala počas celého trvania testu prekročiť kon- centráciu organicky viazaného uhlíka, pochádzajúcu z testovanej látky, prípadne použitého solubilizač- ného činidla, o viac ako 10 mg/l (± 20 %). 1. 7. 3 Testovacie roztoky Pripraví sa zásobný roztok testovanej látky s vhodnou koncentráciou. Zásobný roztok treba podľa mož- nosti pripraviť jednoduchým zmiešaním alebo trepaním testovanej látky v rozpúšťacej vode. Použitie roz- púšťadiel alebo disperzných činidiel (rozpúšťajúcich činidiel) sa neodporúča, hoci v niektorých prípadoch to môže byť v záujme prípravy zásobného roztoku s vhodnou koncentráciou potrebné. Medzi rozpúšťadlá, ktoré možno použiť, patrí etanol, metanol, etylénglykol, momometyléter, etylénglykoldimetyléter, dime- tylformamid a trietylénglykol. Ako disperzné činidlá možno použiť Cremophor RH 40, Tween 80, 0,01 % metylcelulózu a HCO-40. Činidlá, ktoré ľahko podliehajú biodegradácii, treba používaťs opatrnosťou, pre- tože môžu v prietokových testoch spôsobovať problémy s rastom baktérií. Testovanú látku možno ozna- čiť rádioaktívnym izotopom a musí mať najvyššiu možnú čistotu (napríklad podľa možnosti > 98 %). Pri prietočných testoch je potrebný systém pre nepretržitý prívod a zrieďovanie zásobného roztoku testo- vanej látky (napríklad dávkovacie čerpadlo, úmerný dávkovač, saturátorový systém), ktorým sa zabezpe- čuje jej prívod do testovacích komôr. Objem každej testovacej komory by sa mal denne vymeniť aspoň päťkrát. Treba uprednostniť prietočný systém, hoci tam, kde to nie je možné (malo by to napríklad nepriaz- nivý vplyv na testovací organizmus) sa môžu pod podmienkou splnenia kritérií validity použiť aj polo- prietočné usporiadania. Prietokovú rýchlosť zásobného roztoku aj zrieďovacej vody je potrebné skontro- lovať 48 hodín pred začatím pokusu a potom najmenej raz denne počas celého jeho trvania. Treba pri tom kontrolovať aj rýchlosť prietoku cez každú testovaciu komoru a zabezpečiť, aby výkyvy prietoku v rámci komôr i medzi nimi nepresahovali 20 %. 302 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 1. 7. 4. Vol’ba biologických druhov Pri voľbe biologických druhov sa treba riadiť týmito kritériami: musia byť ľahko dostupné, možno ich zís- kať vo výhodnej veľkosti a možno ich uspokojivo udržiavať v laboratóriu. Ako ďalšie kritériá pri voľbe vhodných druhov rýb treba brať do úvahy ich rekreačný, komerčný a ekologický význam, ako aj ich pomernú citlivosť, úspešnosť použitia v minulosti a podobne. Odporúčané testovacie druhy sú uvedené v prílohe 2. Možno použiť aj iné druhy, postup testovania však treba upraviť tak, aby sa dosiahli vhodné testovacie podmienky. Použitie daného druhu a pokusnej metódy treba v takomto prípade odôvodniť. 1. 7. 5. Uchovávanie rýb Aklimatizujte zásobnú populáciu rýb najmenej dva týždne vo vode a pri testovacej teplote. Počas celej akli- matizácie ich kŕmte dostatočným množstvom stravy, ktorá sa bude používať aj počas pokusu. Po 48-hodinovej privykacej-adaptačnej fáze sa zaznamená úhyn a uplatnia sa tieto selekčné kritériá: — úhyn za sedem dní prevyšuje 10 % celej populácie: celá násada sa vyradí, — úhyn za sedem dní je medzi 5 a 10 % populácie: aklimatizovať ďalších sedem dní, — úhyn za sedem dní je nižší ako 5 % populácie: násadu možno použiť; ak je úhyn počas ďalších sied- mich dní vyšší ako 5 %, celá násada sa vyradí. Treba zabezpečiť, aby boli použité testovacie ryby bez zjavných chorôb a abnormalít. Všetky choré ryby treba z pokusu vyradiť. Dva týždne pred testom ani počas jeho trvania nesmú byť ryby ošetrované proti ochoreniam. 1. 8. Priebeh testu 1. 8. 1. Predbežná skúška V záujme optimalizácie podmienok hlavného testovania môže byť užitočné vykonať predbežný pokus zameraný napríklad na voľbu koncentrácie/koncentrácií testovanej látky a trvanie vychytávacej a depurač- nej fázy. 1. 8. 2. Podmienky vystavenia testovanej látke 1. 8. 2. 1. Trv anie v y chyt áv a cej fá z y Trvanie vychytávacej fázy možno predpovedať na základe praktických skúseností (napríklad na základe predchádzajúcej štúdie alebo znalosti o akumulácii príbuznej látky) alebo na základe istých empirických vzťahov vychádzajúcich buď z rozpustnosti danej látky vo vode, alebo z jej rozdeľovacieho koeficientu v systéme oktanol/voda (pozri prílohu 3). Okrem prípadov, v ktorých nastane rovnovážny stav preukázateľne skôr, by mala vychytávacia fáza trvať 28 dní. Ak sa rovnovážny stav do 28 dní nedosiahne, potom treba vychytávaciu fázu a analyzovanie vzo- riek predĺžiť buď do jeho dosiahnutia, alebo na 60 dní, podľa toho, čo nastane skôr. 1. 8. 2. 2. Trv anie depur a č n e j f á z y Na dosiahnutie dostatočného odstránenia (napríklad 95 %) testovanej látky z tela zvyčajne stačí polovičný čas trvania vychytávacej fázy (tento odhad je vysvetlený v prílohe 3). Ak je čas potrebný na 95 % odstrá- nenie testovanej látky z praktického hľadiska pridlhý a je napríklad dva razy dlhší ako trvanie vychytávacej fázy (t. j. viac ako 56 dní), potom možno použiť kratšie obdobie (napríklad kým koncentrácia testovanej látky nebude nižšia ako 10 % rovnovážnej koncentrácie). V prípade látok, ktorých vychytávanie a depu- rácia sa riadia zložitejším priebehom ako pri jednokomorovom rybom modeli s kinetikou prvého poriad- ku, treba použiť na stanovenie rýchlostnej konštanty depurácie dlhšie obdobie. Podmienkou však je, aby bola koncentrácia testovanej látky počas takéhoto predĺženého obdobia vždy vyššia, ako je prah analytic- kej detekcie. 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 303 1. 8. 2. 3. Počty t e s t o v a c í c h r ý b Počet testovacích rýb na testovanú koncentráciu voľte tak, aby boli pri každom odbere vzoriek k dispozícii najmenej štyri kusy na jedno meranie. V prípade potreby vyššej štatistickej sily treba na jednu vzorku viac rýb. V prípade použitia dospelých rýb zaznamenajte, či sa pokus vykonáva na samčekoch, alebo samičkách, alebo na oboch pohlaviach. Pri používaní oboch pohlaví treba ešte pred začatím testovania zdokumento- vať, že rozdiel v obsahu tuku medzi nimi nie je významný. Môže byť potrebné spájanie všetkých samčekov i samičiek. Pri každom odbere vzoriek treba vyberať ryby podobnej veľkosti, tak aby najmenšie z nich neboli menšie ako dve tretiny hmotnosti najväčších. Všetky musia byť z rovnakého roka a musia pochádzať z toho istého zdroja. Vek a hmotnosť majú podľa všetkého niekedy na hodnoty BCF významný vplyv (1), a preto je potrebné tieto údaje presne zaznamenávať. Odporúča sa, aby sa priemerná hmotnosť rýb zistila pomocou odváženia subpopulácie rýb ešte pred uskutočnením testovania. 1. 8. 2. 4. Veľkosť ná s a d y Používa sa vysoký pomer vody k rybám, aby sa minimalizovalo znižovanie Cw spôsobené pridaním rýb na začiatku pokusu a aby sa zabránilo znižovaniu koncentrácie rozpusteného kyslíka. Je dôležité, aby veľ- kosť násady zodpovedala použitému druhu rýb. V každom prípade sa však odporúča zvyčajná veľkosť násady v rozmedzí 0,1 do 1,0 g rýb (vlhká hmotnosť) na liter vody a deň. Možno použiť aj vyššie násady, treba však zabezpečiť udržiavanie požadovanej koncentrácie testovanej látky v rozmedzí povolených výky- vov ± 20 % a koncentrácia rozpusteného kyslíka nesmie klesnúť pod 60 % saturácie. Pri voľbe primeraných režimov nasadzovania treba brať do úvahy bežné prirodzené prostredie daného dru- hu. Napríklad ryby žijúce pri dne si môžu vyžadovať väčšiu plochu dna nádrže pri rovnakom objeme vody ako druhy žijúce pri hladine. 1. 8. 2. 5. Kŕ me nie Počas aklimatizačnej aj testovacej fázy sa ryby kŕmia primeranou stravou so známym obsahom tukov a cel- kových bielkovín v množstve dostatočnom na udržiavanie rýb v dobrom zdravotnom stave a na pribera- nie telesnej hmotnosti. Počas aklimatizačnej aj testovacej fázy sa ryby kŕmia denne množstvom, ktoré zod- povedá približne 1 až 2 % telesnej hmotnosti. Takýto režim kŕmenia zabezpečí počas celého testu relatívne stálu koncentráciu lipidov. Množstvo krmiva treba pravidelne prepočítavať, napríklad raz týždenne, aby sa zabezpečila jednotná telesná hmotnosť aj obsah tukov. Na účely takéhoto výpočtu možno hmotnosť rýb nachádzajúcich sa v testovacej komore odhadnúť na základe hmotnosti rýb odobratých z danej komory pri poslednom odbere vzoriek. Ryby, ktoré zostávajú v pokusnej komore, sa nesmú vážiť. Neskonzumované krmivo aj výkaly sa z testovacej komory denne odsávajú, a to krátko po skončení kŕme- nia (do pol až jednej hodiny). Testovacie komory treba počas celého testovacieho obdobia udržiavať v čo možno najčistejšom stave, aby sa na čo možno najnižšiu úroveň znižovala aj koncentrácia organickej hmoty. Prítomnosť organicky viazaného uhlíka totiž môže obmedzovať biologickú dostupnosť testovanej látky (1). Mnohé krmivá obsahujú rybaciu múčku, krmivo je preto potrebné analyzovať na prítomnosť testovanej látky. Je žiaduce, aby sa v krmive stanovoval aj obsah pesticídov a ťažkých kovov. 1. 8. 2. 6. Sve t l o a t e p l o t a Dĺžka fotoperiódy je zvyčajne 12 až 16 hodín a teplota (± 2 °C) by mala byť primeraná druhu testovacích rýb (príloha 2). Musí byť známy typ osvetlenia a jeho charakteristiky. Treba zachovávať opatrnosť z hľa- diska možnosti fototransformácie testovanej látky pod vplyvom svetelných podmienok štúdie. Treba udr- žiavať primerané osvetlenie, aby sa ryby nevystavovali účinkom neprirodzených fotoproduktov. V niekto- rých prípadoch môže byť potrebné používať filtre na elimináciu ultrafialového žiarenia s vlnovou dĺžkou nižšou ako 290 nm. 1. 8. 2. 7. Testované koncent r á c i e Ryby sa v prietočných podmienkach vystavujú najmenej dvom koncentráciám testovanej látky vo vode. Vyššia (alebo najvyššia) koncentrácia testovanej látky sa zvyčajne volí tak, aby predstavovala približne 1 % jej akútnej asymptotickej LC50 a aby bola najmenej desať ráz vyššia ako jej prah detegovateľnosti pomocou používanej analytickej metódy. 304 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 Najvyššiu testovanú koncentráciu tiež možno stanoviť vydelením hodnoty akútnej 96-hodinovej LC50 prí- slušným pomerom akútnej/chronickej koncentrácie (príslušné pomery sa môžu pri niektorých chemiká- liách pohybovať od 3 to 100). Ak je to možné, druhú (prípadne ďalšie) z testovaných koncentrácií treba voliť tak, aby sa od prvej odlišovala/odlišovali o faktor 10. Ak to z dôvodu kritéria 1 % hodnoty LC50 alebo analytického prahu nie je možné, potom možno použiť faktor nižší ako 10 alebo treba uvažovať o ozna- čení testovanej látky izotopom 14C. Nesmú sa používať koncentrácie, ktoré sú vyššie ako rozpustnosť testo- vanej látky. V prípade použitia solubilizačného činidla nesmie byť jeho koncentrácia vyššia ako 0,1 ml/l a malo by byť rovnaké pre všetky pokusné nádrže. Musí byť známe, akým spôsobom prispievajú spoločne s testovanou látkou k celkovému obsahu organicky viazaného uhlíka v testovanej vode. V každom prípade treba urobiť všetko pre to, aby sa tieto látky nemuseli vôbec používať. 1. 8. 2. 8. K o n t r o l y Okrem pokusných skupín je potrebné mať aj kontrolnú skupinu udržiavanú iba v riediacej vode a v prí- slušných prípadoch aj kontrolnú skupinu udržiavanú v riediacej vode s prídavkom iba solubilizačného činidla. Podmienkou je, aby solubilizačné činidlo nemalo na ryby žiadny účinok. Ak takýto účinok má, potom je potrebné zaradiť do pokusu obidve kontrolné skupiny. 1. 8. 3. Frekvencia merania kvality vody Počas testu treba vo všetkých nádržiach sledovať obsah rozpusteného kyslíka, TOC, pH a teplotu. Pri kon- trolnej skupine a v jednej nádrži s vyššou (najvyššou) koncentráciou treba merať celkovú tvrdosť, a ak to prichádza do úvahy, aj slanosť vody. Množstvo rozpusteného kyslíka, a ak to prichádza do úvahy, aj sla- nosť je počas vychytávacej fázy potrebné merať minimálne tri razy, t. j. na jej začiatku, približne v strede a na konci. Počas depuračnej fázy treba tieto hodnoty merať raz týždenne. TOC sa musí merať na začiatku testu (24 a 48 hodín pred začatím vychytávacej fázy) pred pridaním rýb a potom najmenej raz týždenne počas vychytávacej aj depuračnej fázy. Teplotu treba merať denne, pH na začiatku a konci každého obdo- bia a tvrdosť raz počas každého testu. Aspoň v jednej nádrži by sa malo zabezpečiť kontinuálne meranie teploty. 1. 8. 4. Odber a analyzovanie vzoriek rýb a vody 1. 8. 4. 1. Ha rm o n o g r a m o d o b e r a n i a v z o r i e k r ý b a v o d y Voda na stanovenie koncentrácie testovanej látky sa z testovacích nádrží odoberá pred pridaním rýb a počas vychytávacej i depuračnej fázy. Vzorky vody sa ako minimum odoberajú v rovnakom čase ako ryby a tiež pred kŕmením. Počas vychytávacej fázy sa merajú koncentrácie testovanej látky, aby sa overovalo spĺňanie kritéria platnosti. Vzorky rýb sa odoberajú najmenej päť ráz počas vychytávacej a najmenej štyri razy počas depuračnej fázy. Dostatočne presné hodnoty BCF sa niekedy pri takomto počte vzoriek vypočítavajú veľmi ťažko, najmä ak sa depurácia zjavne riadi inou ako jednoduchou kinetikou prvého poriadku. V takýchto prípadoch je žia- duce robiť odber počas oboch fáz častejšie (pozri prílohu 4). Navyše odobraté vzorky sa uskladňujú a ana- lyzujú iba vtedy, ak sa výsledky prvého kola analýz ukážu byť pre výpočet BCF s požadovanou presnosťou nedostatočné. Príklad prijateľného harmonogramu odberu vzoriek je uvedený v prílohe 4. Jednoducho možno vypočítať aj iné harmonogramy, použijúc pri tom iné predpokladané hodnoty Pow potrebné na výpočet dĺžky vysta- venia, ktorá je potrebná na dosiahnutie 95 % vychytávania. Počas vychytávacej fázy pokračujú odbery až po dosiahnutie rovnovážneho stavu alebo počas 28 dní, podľa toho, čo nastane skôr. Ak sa rovnovážny stav do 28 dní nedosiahne, odbery pokračujú až do jeho dosiahnutia alebo počas 60 dní, podľa toho, čo nastane skôr. Pred začatím depuračnej fázy sa ryby pre- miestnia do čistej nádrže. 1. 8. 4. 2. O d b e r a p r í p r a v a v z o r i e k Vzorky vody sa na analyzovanie odoberajú napríklad odsávaním pomocou inertnej hadičky zo stredu testo- vacej nádrže. Oddelenie frakcií testovanej látky dostupných pre biodegradáciu od frakcií pre biodegradá- ciu nedostupných často nemožno uskutočniť ani filtráciou, ani centrifugáciou (najmä v prípade superlipo- filných chemikálií s hodnotou log Pow > 5 (1) (5), takže podrobovať vzorky týmto postupom nemusí byť potrebné. 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 305 Namiesto toho treba vykonávať také opatrenia, ktoré zabezpečia čo možno najlepšiu čistotu nádrží, a počas vychytávacej aj depuračnej fázy treba sledovať obsah celkového organicky viazaného uhlíka. Pri každom odbere vzoriek sa z testovacích nádrží odoberie primeraný počet rýb (zvyčajne minimálne šty- ri). Odobraté ryby sa rýchle opláchnu, osušia pomocou absorpčného materiálu a pomocou najprimera- nejšej a najhumánnejšej metódy ihneď usmrtia a odvážia. Voda aj ryby by sa mali analyzovať podľa možnosti ihneď po odbere, čím sa predíde degradácii alebo iným stratám. Priebežne počas vykonávania testu treba vypočítavať približné rýchlosti vychytávania a depurácie. Okamžitým vykonávaním analýz predídeme aj oddialeniu identifikácie dosiahnutia rovnovážneho stavu. Pri oddialení analýz treba vzorky primeraným spôsobom uskladniť. Pred začatím štúdie sa treba obozná- miť so správnym spôsobom skladovania danej testovanej látky — napríklad zamrazením, skladovaním pri 4 °C, extrahovaním atď. 1. 8. 4. 3. Kva l i t a a n a l y t i c k ý c h m e t ó d Celý postup v zásade závisí od presnosti a citlivosti analytických metód používaných pri testovanej látke. Treba preto experimentálne overiť, či sú presnosť a reprodukovateľnosť chemických analýz, ako aj úroveň opätovného získania testovanej látky z vody aj z rýb pre danú metódu uspokojivé. Treba tiež overiť, či nie je testovaná látka v detegovateľných množstvách prítomná v riediacej vode. V prípade potreby sa hodnoty Cw a Cf získané z testu upravia podľa úrovne opätovného získania testova- nej látky a hodnôt pozadia zistených pri kontrolách. So vzorkami rýb aj vody je potrebné počas celého testovania zaobchádzať tak, aby sa minimalizovala koncentrácia a straty (vznikajúce napríklad v dôsledku absorpcie na odoberacie zariadenie). 1. 8. 4. 4. Analy z o v a n i e r y b í c h v z o r i e k V prípade použitia rádioaktívne označeného materiálu možno stanovovať celé množstvo označenej látky (t. j. materskú zlúčeninu aj jej metabolity) alebo možno vzorky prečistiť a stanovovať materskú látku oso- bitne. V rovnovážnom stave alebo na konci vychytávacej fázy, podľa toho, čo nastane skôr, možno cha- rakterizovať aj hlavné metabolity. V prípadoch, v ktorých je hodnota BCF vyjadreného celkovým množ- stvom rádioaktívnych zvyškov ≥ 1 000 %, môže byť žiaduce a pre niektoré kategórie chemických látok, ako sú pesticídy, sa to dôrazne odporúča, aby sa identifikovali a kvantifikovali tie degradačné produkty testovanej látky, ktoré v rybích tkanivách predstavujú v rovnovážnom stave ≥ 10 % celkového množstva zvyškov. Po identifikácii a kvantifikácii degradačných produktov, ktoré predstavujú v rybích tkanivách ≥ 10 % celkového množstva rádioaktívnych zvyškov, sa tiež odporúča identifikácia a kvantifikácia takýchto degradačných produktov aj v testovanej vode. Koncentráciu testovanej látky je zvyčajne potrebné stanoviť v každej jednej odváženej rybe. Ak to nie je možné, potom možno vzorky odobraté pri rovnakom odbere spájať, hoci spájaním sa obmedzujú štatis- tické metódy, ktoré možno použiť pri spracúvaní výsledkov. Ak má niektorá štatistická metóda a stupeň štatistickej významnosti osobitnú dôležitosť, potom je potrebné použiť v teste taký počet rýb, ktorý umožní uskutočniť požadovaný spôsob spájania vzoriek (6) (7). BCF je potrebné vyjadriť ako funkciu celkovej vlhkej hmotnosti a v prípade vysoko lipofilných látok aj ako funkciu obsahu tuku. Ak je to možné, obsah tuku treba stanoviť pri každom odbere vzoriek. Obsah tuku treba stanoviť pomocou vhodnej metódy (literárne odkazy 8 a 2 v prílohe 3). Ako štandardnú metódu možno odporúčať extrakciu zmesou chloroformu a metanolu (9). Jednotlivé metódy neposkytujú rovnaké výsledky (10), pri každej z nich je preto dôležité uviesť podrobné údaje. Ak je to možné, obsah tuku treba stanovovať v rovnakom extrakte, ktorý sa pripravil na analyzovanie testovanej látky, pretože tuky býva často potrebné pred chromatografickým krokom zo vzorky odstrániť. Obsah tukov v rybách (ako mg/kg vlhkej hmotnosti) na konci pokusu by sa nemal líšiť od obsahu tukov na jeho začiatku o viac ako ± 25 %. Treba zaznamenať aj percentuálny obsah sušiny v tkanivách, aby bolo možné vyjadriť obsah tuku aj na suchú hmotnosť. 306 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 2. ÚDAJE 2. 1. Spracovanie výsledkov Vychytávacia krivka testovanej látky sa získa grafickým vynášaním koncentrácie v/na rybách (alebo urče- nom tkanive) počas vychytávacej fázy proti času na aritmetických osiach. Ak krivka dosiahne plató, t. j. ak sa stane približne asymptotická k časovej osi, potom možno rovnovážnu hodnotu BCFss vypočítať zo vzťa- hu: Cf rovnovážne (priemer) Cw rovnovážne (priemer) Ak sa rovnovážny stav nedosiahne, potom sa môže dať BCFss vypočítať s presnosťou dostatočnou na vyhodnotenie rizika na základe „rovnovážneho stavu“ pri 80 % (1,6/k2) alebo 95 % (3,0/k2) rovnováhe. Stanovuje sa aj koncentračný faktor (BCFk), ktorý je vyjadrený ako pomer dvoch kinetických konštánt prvého poriadku, t. j. k1/k2. Rýchlostná konštanta depurácie (k2) sa zvyčajne stanovuje z depuračnej krivky (t. j. z grafického znázornenia znižovania koncentrácie testovanej látky v rybách v závislosti od času). Z hodnoty k2 a na základe Cf, ktorá je odvodená z vychytávacej krivky, sa potom vypočíta rýchlostná kon- štanta vychytávania (k1). Prednostným spôsobom stanovovania BCFk a oboch rýchlostných konštánt k1 a k2 sú nelineárne metódy odhadovania parametrov pomocou počítača (11). Na výpočet k1 a k2 možno okrem toho použiť grafické metódy. V prípade zjavnej nelineárnosti depuračnej krivky (t. j. ak sa depurá- cia neriadi kinetikou prvého poriadku) treba použiť komplexnejšie modely (pozri literárne odkazy v prí- lohe 3) a poradiť sa s bioštatistikom. 2. 2. Interpretácia výsledkov V prípadoch, v ktorých sa koncentrácie testovaných roztokov pohybujú na úrovni blízkej prahu detego- vateľnosti analytickej metódy, treba interpretovať výsledky s veľkou opatrnosťou. Jasne vymedzené krivky vychytávania a odbúravania sú príznakom dobrej kvality údajov o biokoncentrá- cii. Rozdiely vychytávacích/depuračných konštánt medzi dvoma testovanými koncentráciami musia byť menšie ako 20 %. Významné rozdiely v rýchlosti vychytávania a depurácie medzi dvoma testovacími kon- centráciami treba zaznamenať a treba sa pokúsiť sa o ich možné vysvetlenie. Medza spoľahlivosti hodnôt BCF sa pri dobre zostavených štúdiách zvyčajne približuje k hodnote ± 20 %. 3. PRÍPRAVA TESTOVACEJ SPRÁVY Správa z testu musí obsahovať tieto informácie: 3. 1. Testovaná látka — fyzikálna povaha a v primeraných prípadoch fyzikálno-chemické vlastnosti, — identifikačné chemické údaje (vrátane obsahu organicky viazaného uhlíka, ak to prichádza do úvahy) — v prípade rádioaktívneho označenia presná poloha označeného atómu/označených atómov a percento rádioaktivity viazanej na nečistoty/prímesi. 3. 2. Testovací biologický druh — vedecký názov, kmeň, pôvod, všetky zásahy uskutočnené pred pokusom, aklimatizácia, vek, rozsah hmotností atď. 3. 3. Testovacie podmienky — typ pokusu (napríklad prietočný alebo poloprietočný systém), — typ a charakteristiky osvetlenia a dĺžka svetlej fázy/svetlých fáz, — zostava pokusu (napríklad počet a veľkosť testovacích komôr, rýchlosť výmeny celého objemu vody, počet replikátov, počet rýb v replikáte, počet testovaných koncentrácií, dĺžka vychytávacej a depurač- nej fázy, frekvencia odoberania vzoriek rýb a vody), 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 307 — metóda prípravy zásobného roztoku a frekvencia jeho obnovovania (solubilizačné činidlo, v prípade použitia musí byť uvedená jeho koncentrácia a príspevok k obsahu organicky viazaného uhlíka), — nominálne testované koncentrácie, priemery hodnôt nameraných v testovacích nádržiach a ich štan- dardné odchýlky a spôsob, akým sa vypočítali, — zdroj zrieďovacej vody, opis jej každého ošetrenia pred pokusom, výsledky každého preukazovania, že ryby sú schopné v pokusnej vode žiť, charakteristiky vody: pH, tvrdosť, teplota, koncentrácia rozpus- teného kyslíka, zvyškové hladiny chlóru (ak boli merané), celkový organicky viazaný uhlík, rozsuspen- dované tuhé častice, slanosť testovacieho média (ak prichádza do úvahy) a všetky ďalšie merania, — kvalita vody v testovacej nádrži, pH, tvrdosť, TOC, teplota a koncentrácia rozpusteného kyslíka, — podrobné informácie o režime kŕmenia (napríklad typ krmiva, zdroj, zloženie –– prinajmenšom obsah tukov a bielkovín, a ak to je možné, aj dávané množstvo a frekvencia kŕmenia), — informácie o spracúvaní vzoriek rýb a vody vrátane údajov o ich príprave, skladovaní, extrakcii a ana- lytických metódach použitých pri stanovovaní testovanej látky a obsahu tukov (ak sa meral). 3. 4. Výsledky — výsledky všetkých predbežných štúdií, — úhyn rýb v kontrolnej skupine a v skupine nachádzajúcej sa v expozičnej komore a všetky pozorované abnormality v správaní, — obsah tukov v rybách (ak sa pri testovaní stanovoval), — krivky (vrátane všetkých nameraných údajov) opisujúce vychytávanie a depuráciu testovanej látky v rybách, čas potrebný na dosiahnutie rovnovážneho stavu, — Cf a Cw (spolu so štandardnou odchýlkou a rozsahom, ak je to potrebné) v každom čase odberu vzo- riek [Cf je vyjadrené v μg/g vlhkej hmotnosti (ppm) celého tela alebo jeho určeného tkaniva, napríklad tuku, a Cw vyjadrené v μg/ml (ppm)]. Hodnoty Cw pre kontrolné skupiny (treba uviesť aj hodnoty poza- dia), — rovnovážny biokoncentračný faktor (BCFss), resp. kinetický biokoncentračný faktor (BCFk), a ak to pri- chádza do úvahy, tak aj 95 % medzu spoľahlivosti pre konštanty vychytávania a depurácie (všetky vyjad- rené vzhľadom na celé telo zvieraťa alebo jeho určené tkanivo a celkový obsah tukov, ak bol meraný), medzu spoľahlivosti a štandardné odchýlky (ak sú k dispozícii) a metódy výpočtu pre každú použitú koncentráciu testovanej látky, — v prípade použitia rádioaktívne označených látok, a ak sa to vyžaduje, možno uviesť aj hromadenie všetkých zachytených metabolitov, — čokoľvek nezvyčajné, čo sa počas testu pozorovalo, všetky odchýlky od týchto postupov a všetky iné významné informácie. Počas predbežných pokusov a pri vypracúvaní experimentálnej zostavy minimalizujte výskyt výsledkov typu „nezachytené pri danom prahu detegovateľnosti“, pretože takéto výsledky sa nedajú použiť na výpo- čet konštánt. 4. ODKAZY 1. Connell D. W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Envi- ron. Contam. Toxicol. 102, pp. 117-156. 2. Bintein S. , Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29-390. 3. OECD, Paris (1996). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3. 4. Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Qua- lity Institute, Denmark. 308 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 5. US EPA 822-94-002 (1994). Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994. 6. US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide Analytical Manual, 1, 5600 Fisher‘s Lane, Rockville, MD 20852, July 1975. 7. US EPA (1974). Section 5, A(1). Analysis of Human or Animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Resi- dues in Human and Environmental Samples, Thompson J. F. (ed. ) Research Triangle Park, N. C. 27711. 8. Compaan H. (1980) in „The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aqu- atic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation“, Ch. 2. 3. Part II. Government Publishing Office, the Hague, Netherlands. 9. Gardner et al. (1995). Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099-1105. 10. Randall R. C. , Lee H. , Ozretich R. J. , Lake J. L. and Pruell R. J. (1991). Evaluation of selected methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp, 1431-1436. 11. CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method- Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholm. 12. ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for Conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs. 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 309 Príloha 1 Chemické charakteristiky prijateľnej zrieďovacej vody Látka Hraničná koncentrácia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Tuhé častice Celkový organicky viazaný uhlík Neionizovaný amoniak Zvyškový chlór Celkové pesticídy na báze organofosfátov Celkové pesticídy na báze organicky viazaného chlóru plus polychlórované bifenyly Celkový organicky viazaný chlór Hliník Arzén Chróm Kobalt Meď Železo Olovo Nikel Zinok Kadmium Ortuť Striebro 5 mg/l 2 mg/l 1 μg/l 10 μg/l 50 ng/l 50 ng/l 25 ng/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 1 μg/l 100 ng/l 100 ng/l 100 ng/l 310 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 Príloha 2 Druhy rýb odporúčané na testovanie Odporúčaný druh Odporúčaný roz- sah testovacích teplôt ( °C) Odporúčaná cel- ková dĺžka testova- cích zvierat (cm) 1 2 3 4 5 6 7 8 Danio rerio (1) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan) danio pásikavé 20 — 25 3,0 ± 0, 5 Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque) 20 — 25 5,0 ± 2, 0 Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus) kapor obyčajný 20 — 25 5,0 ± 3, 0 Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck a Schlegel) kaprozúbka 20 — 25 4,0 ± 1, 0 Poccilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) gupka dúhová 20 — 25 3,0 ± 1, 0 Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) slnečnica modrohrdlá (Rafinesque) 20 — 25 5,0 ± 2, 0 Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum) pstruh dúhový 13 — 17 8,0 ± 4, 0 Gasterosteus aculeatus pichľavka siná (Teleostei, Gasterosteidae) (Linneaus) 18 — 20 3,0 ± 1, 0 (1) Meyer A. , Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B. , Vol. 252, p. 231. V jednotlivých krajinách sa používajú rozličné brakické a morské druhy rýb, napríklad: kaprozúbka pichľavka siná pyskatec belička európska Leiostomus xanthurus Cyprinodon variegatus Menidia beryllina Cymatogaster aggregata Parophrys vertulus Leptocottus armatus Gasterosteus aculeatus Dicentracus labrax Alburnus alburnus Odchyt Sladkovodné ryby, ktoré sú uvedené v tabuľke, sa jednoducho chovajú, resp. sú dostupné počas celého roka, zatiaľ čo dostupnosť morských a brakických druhov je čiastočne obmedzená na jednotlivé krajiny. V kontrolovaných pod- mienkach bez výskytu ochorení a parazitov ich možno rozmnožovať a chovať buď na rybích farmách, alebo v labo- ratóriách, takže pokusné zvieratá sú zdravé a je známy ich pôvod. Tieto ryby sú dostupné v mnohých častiach sveta. 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 311 Príloha 3 Predpoveď trvania vychytávacej a depuračnej fázy 1. Predpoveď trvania vychytávacej fázy Pred vykonaním testu možno na základe empirického vzťahu medzi k2 a rozdeľovacím koeficientom pre zmes n-oktanol/voda (Pow) alebo medzi k2 a rozpustnosťou vo vode (s) odhadnúť hodnotu konštanty k2, a tým aj istý zlomok času potrebný na dosiahnutie rovnovážneho stavu. Odhad hodnoty k2 (vyjadrený ako deň–1) možno získať napríklad na základe tohto vzťahu (1): log10 k2 = – 0,414 log10(Pow) + 1,47 (r2 = 0,95) (rovnica 1) Ďalšie vzťahy sú uvedené v literárnom odkaze 2. Ak hodnota Pow nie je známa, potom sa dá odhad (3) urobiť na základe znalosti rozpustnosti látky (s) pomocou vzťahu: log10(Pow) = 0,862 log10(s) + 0,710 (r2 = 0,994) (rovnica 2) kde s = rozpustnosť (mol/l): (n = 36). Tieto vzťahy platia iba pre chemické látky s hodnotou log Pow v rozmedzí 2 a 6,5 (4). Čas potrebný na dosiahnutie istej časti rovnovážneho stavu sa dá získať pomocou dosadenia hodnoty k2 do vše- obecnej kinetickej rovnice, ktorá opisuje vychytávanie a depuráciu (kinetika prvého poriadku): alebo ak je Cw konštantné: V oblastiach blízkych rovnovážnemu stavu (t ∞) možno rovnicu 3 zjednodušiť (5) (6) na vzťah: Hodnota súčinu k1/k2. Cw sa približuje ku koncentrácii v rybách pri „rovnovážnom stave“ (Cfs). Rovnica 3 sa dá prepísať takto: t -k 2 ) Cf = Cf,s = (1 – e alebo = 1 – e t -k 2 Cf Cfs (rovnica 4) Po predbežnom odhade hodnoty k2 na základe rovnice 1 alebo 2 možno pomocou rovnice 4 vypočítať určité percento rovnovážneho stavu. Ako orientácia platí, že štatisticky významná dĺžka trvania vychytávacej fázy pre získanie štatisticky význam- ných údajov (BCFk) je čas, za ktorý dosiahne krivka závislosti logaritmu koncentrácie testovanej látky v rybách od lineárneho času svoju polovicu, čiže 1,6/k2 alebo 80 % rovnovážneho stavu, avšak nie viac ako 3,0/k2 alebo 95 % rovnovážneho stavu (7). Čas potrebný na dosiahnutie 80 % rovnovážneho stavu je (rovnica 4): 0,80 = 1 – e t –k 80 2 jeb t80 = 1,6 k2 (rovnica 5) 312 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 Podobne pre 95 % rovnovážneho stavu platí: t95 = 3,0 k2 (rovnica 6) Napríklad trvanie vychytávacej fázy (zvyšovanie koncentrácie) pre látky s hodnotou log Pow = 4 je (s použitím rovníc 1, 5 a 6): log10 k2 = – 0,414. (4) + 1,47 k2 = 0,652 dní–1 do (80 %) = 1,6/0,652, t. j. 2,45 dní (59 hodín) alebo do (95 %) = 3,0/0,652, t. j. 4,60 dní (110 hodín) Podobne pre testovanú látku s hodnotou s = 10–5 mol/l (log(s) = 5,0) je trvanie zvyšovania koncentrácie (rovnice 1, 2, 5 a 6): log10 (Pow) = – 0,862 (– 5,0) + 0,710 = 5,02 log10 k2 = – 0,414 (5,02) + 1,47 k2 = 0,246 dní–1 do (80 %) = 1,6/0,246, t. j. 6,5 dní (156 hodín) alebo do (95 %) = 3,0/0,246, t. j. 12,2 dní (293 hodín) Alternatívne možno na vypočítanie času potrebného na dosiahnutie efektívneho rovnovážneho stavu použiť výraz (4): teq = 6,54 × 10–3 Pow + 55,31 (hodiny). 2. Predpovedanie trvania depuračnej fázy Na základe všeobecnej rovnice opisujúcej vychytávanie a depuráciu (kinetika prvého poriadku) sa dá odhadnúť aj čas, ktorý je potrebný na zníženie telesnej koncentrácie látky na určité percento jej pôvodnej koncentrácie v tele (1) (8). Predpokladá sa, že hodnota Cw je počas depuračnej fázy nulová. Rovnicu možno preto zjednodušiť na vzťah: kde Cf, o je koncentrácia na začiatku depuračnej fázy. 50 % depurácia sa potom dosiahne za čas (t50): Podobne sa dá vypočítať, že 95 % depurácia sa dosiahne za: Ak sa v prvom období dosiahne 80 % vychytávania (1,6/k2) a celkové odbúranie počas depuračnej fázy bude 95 % (3,0/k2), potom trvá depuračná fáza približne dva razy tak dlho ako fáza vychytávacia. Je však potrebné mať na pamäti, že tieto odhady sú založené na predpoklade, že vychytávanie aj depurácia sa riadia kinetikou prvého poriadku. Ak pri nich kinetika prvého poriadku zjavne neplatí, potom je potrebné pou- žiť komplexnejšie modely [uvedené napríklad v literárnom odkaze (1)]. 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 313 Odkazy (citované v prílohe 3) 1. Spacie A. a Hamelink J. L. (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and Chem. 1, pp. 309-320. 2. Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Den- mark. 3. Chiou C. T. a Schmedding D. W. (1982). Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), pp. 4-10. 4. Hawker D. W. and Connell D. W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), pp. 701-707. 5. Branson D. R. , Blau G. E. , Alexander H. C. and Neely W. B. (1975). Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp. 785-792. 6. Ernst W. (1985). Accumulation in Aquatic Organisms. In: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of che- micals. Ed. By Sheehman P. , Korte F. , Klein W. and Bourdeau P. H. Part 4. 4, pp 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley and Sons Ltd. N. Y. 7. Reilly P. M. , Bajramovic R. , Blau G. E. , Branson D. R. and Sauerhoff M. W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, pp. 614-622. 8. Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980). Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of Six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, pp. 3-19. 314 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 Príloha 4 Teoretický príklad odberu vzoriek pre stanovovanie biokoncentrácie látok s hodnotou log Pow = 4 Harmonogram odberov Odbery rýb Minimálna požado- vaná častosť odberov (dni) Prídavné odbery Počet vzoriek vody Počet rýb na vzorku Vychytávacia fáza Prvý Druhý Tretí Štvrtý Piaty Depuračná fáza Šiesty Siedmy Ôsmy –1 0 0,3 0,6 1,2 2,4 4,7 5,0 5,9 9,3 Deviaty 14,0 0,4 0,9 1,7 3,3 5,3 7,0 11,2 17,5 2 (*) 2 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2 (2) 2 Pridať 45 až 80 rýb 4 (4) 4 (4) 4 (4) 4 (4) 6 Preniesť ryby do vody bez testova- nej látky 4 (4) 4 (4) 4 (4) 6 (4) (*) Vodu odoberajte až po pridaní najmenej „troch objemov testovacej komory“. Čísla v zátvorkách udávajú počet vzoriek (vody, rýb), ktoré sa majú odobrať v prípade dodatočného odoberania vzoriek. Pozn. : vopred odhadnutá hodnota k2 pre látky s log Pow = 4 je 0,652 dní–1. Celkové trvanie pokusu je 3 × fázy vychytávania = 3 × 4,6 dní, t. j. 14 dní. Spôsob odhadu „fázy vychytávania“ je uvedený v prílohe 3. 13/zv. 21 SK Úradný vestník Európskej únie 315 Príloha 5 Rozlišovacia schopnosť modelu Pri väčšine biokoncentračných údajov sa predpokladá, že sú „dostatočne uspokojivo“ opísané pomocou dvojdielneho/dvojparametrového modelu, ktorý vyplýva z priamky udávajúcej koncentrácie testovanej látky v rybách počas depuračnej fázy, keď sa graficky znázornia na semilogaritmickom papieri. (Ak nemožno tieto body opísať priamkou, potom treba použiť komplexnejšie modely; pozri napríklad v Spacie a Hamelink, odkaz 1 v prílohe 3. ) Grafická metóda na stanovenie rýchlostnej konštanty depurácie (eliminácie) k2 Vyneste koncentráciu testovanej látky zistenú v každej rybej vzorke proti času na semilogaritmickom papieri. Sklon krivky je: k2 = ln (Cf1/Cf2) t2 – t1 Treba si uvedomiť, že odchýlky od priamkového priebehu môžu poukazovať na komplexnejší priebeh depurácie ako ten, ktorý podlieha kinetike prvého poriadku. Na riešenie priebehu depurácie podliehajúcej kinetike nie prvého poriadku môže byť potrebné použitie grafickej metódy. Grafická metóda na stanovenie konštanty vychytávania k1 Hodnota k1 sa na základe známej hodnoty k2 vypočíta takto: Hodnota Cf sa odčíta v strede hladkej vychytávacej priamky získanej z údajov vynesením dekadického logaritmu kon- centrácie proti času (v aritmetickej mierke). 316 SK Úradný vestník Európskej únie 13/zv. 21 Počítačová metóda na výpočet rýchlostných konštánt vychytávania a depurácie Prednostnou metódou na stanovovanie biokoncentračného faktora a oboch rýchlostných konštánt k1 a k2 sú neli- neárne metódy odhadovania parametrov pomocou počítača. Tieto programy vypočítavajú hodnoty pre k1 a k2 na základe známych po sebe idúcich koncentrácií v čase a podľa tohto modelu: Cf = Cw ∙ k1 k2 × (l – e –k 2 t) Cf = Cw ∙ k1 k2 × (e –k 2(t –t c) – e –k 2 t) 0 < t < tc (rovnica 2) t < tc (rovnica 3) kde tc = čas na konci vychytávacej fázy. Takýmto prístupom možno získať odhady štandardných odchýlok k1 a k2. Hodnotu k2 možno vo väčšine prípadov stanoviť na základe depuračnej krivky s veľkou presnosťou a medzi k1 a k2 existuje silná korelácia, ak sa stanovujú súčasne. Odporúčame preto, aby sa najprv vypočítala na základe iba depu- račných údajov hodnota k2, a potom možno pomocou nelineárnej regresnej analýzy vypočítať k1