title: Směrnice Rady 98/57/ES ze dne 20. července 1998 o ochraně proti Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

eurovoc_concepts:
food inspection
fruit vegetable
plant disease
plant health control
potato
protection of plant life

text: 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 375 31998L0057 21. 8. 1998 RADA EVROPSKÉ UNIE, ÚŘEDNÍ VĚSTNÍK EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ L 235/1 SMĚRNICE RADY 98/57/ES ze dne 20. července 1998 o ochraně proti Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. s ohledem na Smlouvu o založení Evropského společenství, a zejména na článek 43 této smlouvy, vzhledem k tomu, že jedním z organismů škodlivých pro brambory a rajčata je patogen Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. způsobující bakteriální hnědou hnilobu brambor a bakteriální vadnutí brambor a rajčat; že tato choroba se vyskytla v některých částech Společenství a dosud existují omezená ohniska infekce; s ohledem na návrh Komise (1), s ohledem na stanovisko Evropského parlamentu (2), vzhledem k tomu, že pěstování brambor a rajčat je v celém Společenství silně ohroženo, pokud u těchto kultur nebudou přijata účinná opatření, aby se zjistilo místo výskytu a rozsah rozšíření tohoto organismu, zabránilo jeho výskytu a šíření a, v případě zjištění jeho výskytu, aby se zabránilo jeho šíření a byl potlačován s cílem jeho vyhubení; s ohledem na výboru (3), stanovisko Hospodářského a sociálního vzhledem k tomu, že škodlivý organismus Ralstonia solana- cearum (Smith) Yabuuchi et al. byl dříve znám pod názvem Pseu- domonas solanacearum (Smith) Smith; že název Ralstonia solana- cearum (Smith) Yabuuchi et al. se pravděpodobně stane obecně uznávaným označením pro tento škodlivý organismus; že v této směrnici by mělo být k tomuto vědeckému vývoji přihlédnuto; vzhledem k tomu, že produkce brambor a rajčat zaujímá v zemědělství Společenství důležité místo; že výnosy brambor a rajčat jsou však stále ohrožovány škodlivými organismy; vzhledem k tomu, že ochranou kultur brambor a rajčat proti takovým škodlivým organismům se má nejen zachovat produkční kapacita, nýbrž i zvýšit produktivita zemědělství; vzhledem k tomu, že ochranná opatření proti zavlečení škodli- vých organismů na území některého členského státu by měla jen omezený účinek, pokud by se v boji proti těmto orga- nismům nepostupovalo současně v celém Společenství a nebylo učiněno vše potřebné k zabránění jejich šíření; a systematicky (1) Úř. věst. C 124, 21. 4. 1997, s. 12 a Úř. věst. C 108, 7. 4. 1998, s. 85. (2) Úř. věst. C 14, 19. 1. 1998, s. 34. (3) Úř. věst. C 206, 7. 7. 1997, s. 57. vzhledem k tomu, že je proto třeba ve Společenství přijmout určitá opatření; že kromě toho musí být členským státům umožněno přijmout v nezbytných případech doplňující nebo přísnější opatření za předpokladu, že tím nebude bráněno pohybu brambor a rajčat uvnitř Společenství, kromě případů upravených směrnicí Rady 77/93/EHS ze dne 21. pro- since 1976 o ochranných opatřeních proti zavlékání orga- nismů škodlivých rostlinám nebo rostlinným produktům do členských států (4); že tato opatření musí být oznámena ostatním členským státům a Komisi; vzhledem k tomu, že u těchto opatření je třeba vzít v úvahu, že ke zjištění, kde se patogen vyskytuje, jsou nezbytné systema- tické úřední průzkumy; že tyto průzkumy by měly zahrnovat prohlídky a případně i odběry vzorků a testy, jelikož tento škodlivý organismus může za určitých podmínek latentně přežívat jak v porostech brambor, tak v uskladněných bram- borových hlízách, aniž by byl objeven; že šíření tohoto pato- genu uvnitř porostu není nejvýznamnějším faktorem, ale že se tento patogen může šířit i povrchovou vodou a prostřednic- lilkovitých, a proto tvím volně rostoucích rostlin z čeledi zavlažování porostů brambor a rajčat kontaminovanou vodou představuje nebezpečí infekce pro tyto kultury; že tento patogen může také přečkat zimu v plevelných rostlinách infekce od jednoho brambor a rajčat, což představuje zdroj vegetačního období k druhému; že k šíření tohoto patogenu dochází i kontaminací brambor po dotyku s infikovanými bramborami nebo se sázecími, sklízecími a přepravními zaříze- ními a skladovacími nebo přepravními kontejnery kontamino- vanými předchozím dotykem s napadenými bramborami; (4) Úř. věst. L 26, 31. 1. 1977, s. 20. Směrnice naposledy pozměněná směrnicí Komise 98/2/ES (Úř. věst. L 15, 21. 1. 1998, s. 34). 376 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 vzhledem k tomu, že šíření tohoto patogenu je možno omezit nebo mu zabránit dezinfikováním takových předmětů; že pokud se takto infikují sadbové brambory, hrozí značné nebez- pečí, že se patogen rozšíří; obdobně latentní infekce sadbových brambor představuje značné nebezpečí rozšíření patogenu, kterému je možné se vyvarovat použitím sadbových brambor vyprodukovaných v rámci úředně schváleného programu, který zaručuje, že byly zkontrolovány a shledány prostými napadení; vzhledem k tomu, že současné znalosti o biologii a epidemio- logii Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. jsou v pod- mínkách Evropy neúplné, takže již dnes lze předpokládat, že za několik let bude nutné navrhovaná opatření přezkoumat; že rovněž lze očekávat, že na základě dalších výzkumů budou zlepšovány testovací metody, zejména co do citlivosti a selekti- vity, tak, aby byly zvoleny a jednotně upraveny ty nejlepší z dostupných testovacích metod; vzhledem k tomu, že pro stanovení podrobností těchto obecných opatření i pro přijetí přísnějších nebo doplňkových opatření členskými státy za účelem toho, aby zabránily zavle- je žádoucí, aby členské státy čení patogenu na jejich území, úzce spolupracovaly s Komisí v rámci Stálého rostlinolékař- ského výboru (dále jen „výbor“), Článek 2 se zda vyskytuje organismus 1. Členské státy provádějí každý rok systematické úřední v uvedeném průzkumy, rostlinném materiálu pocházejícím z jejich území. Za účelem zjištění jiných možných zdrojů infekce ohrožujících produkci uvedeného rostlinného materiálu provedou členské státy v oblastech, v nichž je uvedený rostlinný materiál produkován, hodnocení rizika, a pokud při tomto hodnocení bude zjištěno nebezpečí šíření organismu, provedou cílené úřední průzkumy na rostlinách, které nepatří k uvedenému rostlinnému mate- riálu, včetně planých lilkovitých hostitelských rostlin, v povr- chové vodě používané pro zavlažování nebo postřik uvedeného rostlinného materiálu a v odpadních vodách vypouštěných průmyslovými zařízeními pro zpracování nebo balírnami uvedeného rostlinného materiálu, jsou používány k zavlažování nebo postřik uvedeného rostlinného materiálu. Rozsah těchto cílených průzkumů se stanoví v závislosti na zjištěném riziku. Členské státy mohou rovněž provádět úřední průzkumy organismu u jiného materiálu, jako je pěstební substrát, zemina a pevný odpad z průmyslových zařízení pro zpracování nebo z balíren. které 2. Úřední průzkumy podle odstavce 1 se provádějí: PŘIJALA TUTO SMĚRNICI: a) u uvedeného rostlinného materiálu podle přílohy I oddílu II bodu 1; Článek 1 b) u hostitelských rostlin jiných než uvedený rostlinný mate- riál a u vody a odpadních vod pomocí vhodných postupů; případně se odeberou vzorky, které jsou podrobeny úřed- nímu nebo úředně kontrolovanému laboratornímu testo- vání; Tato směrnice upravuje opatření proti Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. , dříve známému pod názvem Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith (dále jen „škodlivý organismus“), která je třeba v členských státech přijmout a jejichž cílem, pokud jde o hostitelské rostliny uvedené v příloze I oddíle 1 (dále jen „uvedený rostlinný materiál“), je: a) zjistit místa výskytu a rozsah rozšíření organismu; b) zabránit výskytu a šíření organismu a c) v případě zjištění výskytu organismu zabránit jeho šíření a provádět ochranná opatření s cílem jeho vyhubení. c) v případě potřeby u jiného materiálu pomocí vhodných postupů. Další podrobnosti kontrolních prohlídek, počet, původ a slo- žení vzorků, jakož i časový rozvrh jejich odběru v rámci těchto průzkumů stanoví příslušné úřední subjekty ve smyslu směrnice 77/93/EHS na základě uznávaných vědeckých a stati- stických zásad, biologie organismu a s přihlédnutím k pro- dukčním systémům používaným v dotyčném členském státu pro uvedený rostlinný materiál, případně i pro jiné hostitelské rostliny. 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 377 Podrobnosti a výsledky úředních průzkumů uvedených 3. v odstavci 1 se každoročně oznamují členským státům a Komisi v souladu s přílohou I oddílem II bodem 2. Tato oznámení se předkládají do 1. června, kromě farmářské sadby brambor, u které se oznámení předkládá do 1. září. Podrob- nosti a výsledky týkající se porostů se musí vztahovat na produkci předchozího roku. Podrobnosti oznámení mohou být předloženy výboru. ve vztahu k vlastní produkci a) zakázat přemísťování rostlin a hlíz ze všech porostů, partií nebo zásilek, ze kterých byly odebrány vzorky, ledaže by se přemísťování uskutečnilo pod jejich dohledem a pokud prokazatelně neexistuje nebezpečí rozšíření škodlivého orga- nismu; Postupem podle článku 16a směrnice 77/93/EHS se 4. stanoví: b) provést kroky ke zjištění původu podezřelého výskytu; — vhodné metody průzkumů a laboratorní testování podle odst. 2 prvního pododstavce písm. b). Postupem podle článku 16a směrnice 77/93/EHS je 5. možno stanovit: — vhodné metody průzkumů podle odst. 2 prvního pododstavce písm. c), — další podrobnosti průzkumů podle odst. 2 druhého pododstavce, aby byla zaručena srovnatelná úroveň záruk mezi členskými státy. Článek 3 c) přijmout další vhodná preventivní opatření na základě odhadu rizika, zejména ve vztahu k produkci uvedeného rostlinného materiálu a k přemísťování jiných partií sadbo- vých brambor než těch uvedených v písmenu a), které byly vyprodukovány v místě produkce, z kterého byly odebrány vzorky uvedené v písmenu a), aby se zabránilo šíření tohoto škodlivého organismu. 3. V případě podezření z výskytu, kdy existuje nebezpečí kontaminace uvedeného rostlinného materiálu nebo povrchové vody z jiného nebo do jiného členského státu, oznámí ten členský stát, ve kterém bylo podezření ohlášeno, druhému člen- skému státu resp. ostatním členským státům neprodleně podrobnosti týkající se tohoto podezření v souladu se zjiš- těným nebezpečím, a dotyčné členské státy budou vhodným způsobem spolupracovat. Tímto způsobem informovaný(é) členský(é) stát(y) přijme(ou) preventivní opatření podle odst. 2 písm. c), případně i další opatření podle odstavců 1 a 2. Členské státy zajistí, že podezření z výskytu tohoto škodlivého organismu nebo jeho potvrzení na jejich území bude ohlášeno jejich příslušným úředním subjektům. Postupem podle článku 16a směrnice 77/93/EHS je 4. možno stanovit: — opatření uvedená v odst. 2 písm. c). Článek 4 1. V případě podezření z výskytu zajistí příslušné úřední subjekty dotyčného členského státu, že uvedený rostlinný mate- riál bude podroben úřednímu nebo úředně kontrolovanému laboratornímu testování k potvrzení nebo vyvrácení podezření z výskytu, které budou provedeny podle příslušné metody popsané v příloze II a v souladu s podmínkami přílohy III bodem 1, a ve všech ostatních případech podle jiných úředně schválených metod. Potvrdí-li se podezření, uplatní se poža- davky stanovené v příloze III bodě 2. 2. Do potvrzení nebo vyvrácení podezření z výskytu podle odstavce 1 musí příslušné úřední subjekty členského státu v každém případu podezření, kdy: i) byly zjištěny symptomy choroby způsobené tímto orga- nismem a rychlý screeningový test podle přílohy II oddílu I bodu 1 a oddílu II byl pozitivní nebo ii) výsledek screeningového testu podle přílohy II oddílu I bodu 2 a oddílu III byl pozitivní, Článek 5 1. Potvrdí-li se úředním nebo úředně kontrolovaným testo- váním, které bylo provedeno u uvedeného rostlinného mate- riálu podle příslušné metody popsané v příloze II, nebo ve všech ostatních případech podle jiných úředně schválených metod, výskyt tohoto organismu v jednom vzorku odebraném podle této směrnice, musí příslušné úřední subjekty členského státu s ohledem na uznávané vědecké zásady, biologii orga- nismu a produkční, tržní a zpracovatelské systémy používané pro hostitelské rostliny organismu: a) ohledně uvedeného rostlinného materiálu i) zjistit rozsah a prvotní zdroje napadení podle přílohy IV a provést další testování podle čl. 4 odst. 1 alespoň u všech sadbových příbuzných brambor; klonově porostů 378 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 ii) prohlásit za napadený uvedený rostlinný materiál, zásilku a/nebo partii, z nichž byly odebrány vzorky, a stroje, dopravní prostředky, přepravní kontejnery, jakož i všechny skladovací prostory nebo jejich části ostatní předměty, včetně obalového materiálu, které přišly do styku s uvedeným rostlinným materiálem, z něhož byly odebrány vzorky; prohlásit rovněž za napadené, jednotky s chráněnou produkcí plodin a místa produkce, ze kterých byl uvedený rostlinný materiál sklizen a ze kterých byly odebrány vzorky; u vzorků, které byly odebrány během vegetačního období, prohlásit pole, místa produkce jednotky s chráněnou produkcí plodin, ze a případně i kterých byly odebrány vzorky, za napadené; to třeba, pole, je-li iii) zjistit rozsah pravděpodobného napadení v důsledku kontaktu před nebo po sklizni, během produkce, zavla- žování nebo postřiku anebo z důvodu klonové pří- buznosti s materiálem prohlášeným za napadený podle přílohy V bodu 1; iv) vymezit zónu podle přílohy V bodu 2 podbodu i) na základě prohlášení o napadení podle bodu ii), zjištění rozsahu pravděpodobného napadení podle bodu iii) a možného rozšíření tohoto organismu; 2. Členské státy neprodleně oznámí ostatním členským státům a Komisi podle přílohy V bodu 3 každé prohlášení o napadení podle odst. 1 písm. a) bodu ii) a odst. 1 písm. c) bodu ii) a podrobné informace o vymezení zóny podle odst. 1 písm. a) bodu iv), případně podle odst. 1 písm. c) bodu iii). Podrobnosti oznámení podle tohoto odstavce mohou být předloženy výboru. Současně členské státy předloží Komisi doplňkové oznámení podle přílohy V bodu 4. Podrobnosti oznámení podle tohoto pododstavce se neprodleně předloží členům výboru. 3. Na základě oznámení podle odstavce 2 a v něm obsaže- ných údajů provedou ostatní v oznámení uvedené členské státy šetření podle odst. 1 písm. a) bodu i), případně odst. 1 písm. c) bodu i) a přijmou další vhodná opatření v souladu s odstavci 1 a 2. b) ohledně jiných porostů hostitelských rostlin než těch uvede- ných v písmenu a), jimiž by mohla být ohrožena produkce uvedeného rostlinného materiálu: Článek 6 i) provést šetření podle písm. a) bodu i); ii) prohlásit za napadené hostitelské rostliny tohoto orga- nismu, ze kterých byl odebrán vzorek; iii) zjistit rozsah pravděpodobného napadení podle písm. a) bodu iii) a vymezit zónu podle písm. a) bodu iv), pokud jde o produkci uvedeného rostlinného materiálu; c) ohledně povrchové vody (včetně odpadních vod z prů- myslových zařízení na zpracování nebo balíren uvedeného rostlinného materiálu) a volně rostoucích hostitelských lilkovitých, kterými by při zavlažování, rostlin z čeledi postřiku nebo zaplavení povrchovou vodou mohla být ohrožena produkce uvedeného rostlinného materiálu: i) provést ve vhodných termínech na základě vzorků povrchové vody a případně volně rostoucích hostitel- ských rostlin z čeledi lilkovitých šetření, včetně úřed- ního průzkumu, za účelem stanovení rozsahu napadení; ii) prohlásit dle závažnosti a na základě šetření podle bodu i) povrchovou vodu za kontaminovanou; iii) zjistit rozsah pravděpodobného napadení a vymezit zónu na základě prohlášení o napadení podle bodu ii) a možného rozšíření tohoto organismu podle přílohy V bodu 1 a bodu 2 podbodu ii). Členské státy stanoví, že uvedený rostlinný materiál, který 1. byl podle čl. 5 odst. 1 písm. a) bodu ii) prohlášen za napa- dený, nesmí být vysázen a že pod dohledem a se schválením příslušných úředních subjektů je podroben některému z opatře- ní uvedených v příloze VI bodu 1 tak, aby bylo zaručeno, že neexistuje žádné prokazatelné nebezpečí rozšíření organismu. Členské státy stanoví, že uvedený rostlinný materiál, který 2. byl podle čl. 5 odst. 1 písm. a) bodu iii) a písm. c) bodu iii) prohlášen za pravděpodobně napadený, včetně uvedeného rostlinného materiálu, u kterého bylo zjištěno riziko a který byl vyprodukován v místech produkce prohlášených za prav- děpodobně napadená podle čl. 5 odst. 1 písm. a) bodu iii), nesmí být vysázen, a že pod dohledem příslušných úředních subjektů je vhodným způsobem použit nebo zlikvidován podle přílohy VI bodu 2 tak, aby bylo zaručeno, že neexistuje žádné prokazatelné nebezpečí rozšíření organismu. Členské státy stanoví, že stroje, dopravní prostředky, 3. přepravní kontejnery, skladovací prostory nebo jejich části, jakož i všechny ostatní předměty, včetně obalového materiálu, které byly podle čl. 5 odst. 1 písm. a) bodu ii) prohlášeny za napadené nebo podle čl. 5 odst. 1 písm. a) bodu iii) a písm. c) bodu iii) prohlášeny za pravděpodobně napadené, budou vhodným způsobem zničeny nebo dekontaminovány podle přílohy VI bodu 3. Po dekontaminaci se tyto předměty již nepovažují za napadané. 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 379 4. Aniž jsou dotčena opatření přijatá podle odstavců 1, 2 a 3, členské státy stanoví, že v zóně vymezené podle čl. 5 odst. 1 písm. a) bodu iv) a písm. c) bodu iii) bude přijat soubor opatření uvedených v příloze VI bodech 4. 1 a 4. 2. Podrobnosti těchto opatření se každoročně sdělují ostatním členským státům a Komisi. Podrobnosti tohoto oznámení mohou být předloženy výboru. Článek 9 Aniž jsou dotčena ustanovení směrnice 77/93/EHS, mohou členské státy v souladu se směrnicí Komise 95/44/ES (1) pro pokusné nebo vědecké účely a pro práci ve šlechtění odrůd povolit odchylky z opatření uvedených v článcích 6 a 8 této směrnice. Článek 7 Článek 10 Členské státy stanoví, že sadbové brambory musí splňovat 1. požadavky směrnice 77/93/EHS a pocházet v přímé linii z materiálu brambor, který byl získán v rámci úředně schvále- ného programu a na základě úředního nebo úředně kontrolo- vaného testování podle příslušné metody popsané v příloze II byl shledán prostým tohoto organismu. Členské státy provádějí toto testování: a) v případech, kdy výskyt organismu ve vlastní produkci sadbových brambor byl potvrzen: i) při testování předcházejících generací, včetně výchozího systematickém testování klonového materiálu a při klonů základního sadbového materiálu nebo ve ii) v případech, kterých prokazatelně není žádná klonová příbuznost, při testování všech klonů základního sadbového materiálu nebo předcházejících generací, včetně výchozího klonového materiálu a b) v jiných případech buď u každé rostliny výchozího klono- vého materiálu nebo u reprezentativních vzorků ze základ- ního sadbového materiálu nebo předcházejících generací. Členské státy mohou pro svou vlastní produkci přijmout doplňující nebo přísnější opatření k boji proti tomuto orga- nismu nebo k zabránění jeho rozšíření, pokud budou v sou- ladu s ustanoveními směrnice 77/93/EHS. Podrobnosti těchto opatření se každoročně oznamují ostatním členským státům a Komisi. Podrobnosti tohoto oznámení mohou být předloženy výboru. Článek 11 Změny příloh této směrnice, nezbytné s ohledem na vývoj se přijímají postupem vědeckých a technických poznatků, podle článku 16a směrnice 77/93/EHS. Pokud jde o metody popsané v příloze II a opatření uvedená v příloze VI bodech 4. 1 a 4. 2 této směrnice, vypracuje Komise zprávu o přezkou- mání těchto metod a opatření na základě získaných zkušeností a předloží ji výboru do 1. ledna 2002. Postupem podle článku 16a směrnice 77/93/EHS je 2. možno přijmout: Článek 12 — prováděcí pravidla k odst. 1 druhému pododstavci písm. a), Členské státy uvedou v účinnost právní a správní před- 1. pisy nezbytné pro dosažení souladu s touto směrnicí nejpoz- ději do 21. srpna 1999. Neprodleně o nich uvědomí Komisi. — pravidla týkající se reprezentativních vzorků uvedených v odst. 1 druhém pododstavci písm. b). Tato opatření přijatá členskými státy musí obsahovat odkaz na tuto směrnici nebo musí být takový odkaz učiněn při jejich úředním vyhlášení. Způsob odkazu si stanoví členské státy. Článek 8 2. Členské státy neprodleně sdělí Komisi hlavní ustanovení vnitrostátních právních předpisů, které přijmou v oblasti působnosti této směrnice. Komise o nich uvědomí ostatní členské státy. Členské státy zakáží držení tohoto organismu a manipulaci s ním. (1) Úř. věst. L 184, 3. 8. 1995, s. 34. Směrnice naposledy pozměněná směrnicí Komise 97/46/ES (Úř. věst. L 204, 31. 7. 1997, s. 43). 380 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 Článek 13 V Bruselu dne 20. července 1998. Tato směrnice vstupuje v platnost dnem vyhlášení v Úředním věstníku Evropských společenství. Tato směrnice je určena členským státům. Článek 14 Za Radu předseda W. MOLTERER 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 381 PŘÍLOHA I ODDÍL I Seznam hostitelských rostlin Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. uvedených v článku 1 Rostliny Solanum tuberosum L. (včetně hlíz) kromě semen Rostliny Lycopersicon lycopersicum (L. ) Karsten ex Farw. kromě plodů a semen brambor rajče ODDÍL II Průzkum 1. Úřední průzkumy podle čl. 2 odst. 2 písm. a) se řídí biologií organismu a zvláštními produkčními systémy v dotyčných členských státech a zahrnují: i) u brambor — prohlídku porostu ve vhodných termínech v době růstu a/nebo odběr vzorků sadbových a ostatních brambor během vegetačního období nebo ve skladech. Tyto vzorky se podrobí úřední nebo úředně kontro- lované prohlídce, při níž se hlízy rozřezávají, a — u sadbových a případně ostatních brambor úřední nebo úředně kontrolované laboratorní testování podle metody popsané v příloze II; ii) u rajčat — prohlídku porostu ve vhodných termínech alespoň u rostlin v době růstu určených pro profesionální použití k opětnému sázení. 2. Oznámení úředních průzkumů uvedených v čl. 2 odst. 3 obsahuje: i) v případě průzkumů brambor: — odhadovanou celkovou pěstební plochu v hektarech pro sadbové a ostatní brambory, — roztřídění na sadbové brambory (různých kategorií) a konzumní brambory, a případně podle regionů, — počet a časový rozvrh odběrů vzorků pro testování, — počet prohlídek na poli, — počet a velikost vzorků u vizuálních prohlídek hlíz; ii) v případě průzkumů rajčat, alespoň u rostlin v době růstu určených pro profesionální použití k opětnému sázení: — odhadovaný celkový počet rostlin, — počet vizuálních prohlídek; iii) v případě průzkumů jiných hostitelských rostlin než brambor a rajčat včetně volně rostoucích hostitelských rostlin z čeledi lilkovitých: — druh, — počet a datum odběrů vzorků, — plocha nebo vodní tok, odkud byly odebrány vzorky, — analytická metoda; iv) v případě průzkumů vodních zdrojů a odpadních vod z průmyslových zařízení na zpracování a z balíren: — počet a datum odběrů vzorků, — plocha, vodní tok nebo umístění provozů, odkud byly odebrány vzorky, — analytická metoda. 382 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 PŘÍLOHA II TESTOVACÍ SCHÉMA PRO DIAGNÓZU, DETEKCI A IDENTIFIKACI RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. OBLAST POUŽITÍ TESTOVACÍHO SCHÉMATU V tomto schématu se popisují různé druhy postupů pro: i) diagnózu bakteriální hnědé hniloby hlíz bramboru a bakteriálního vadnutí rostlin bramboru a rajčete; ii) detekci Ralstonia solanacearum ve vzorcích hlíz bramboru; iii) identifikaci Ralstonia solanacearum. V dodatcích je podrobně vysvětlena příprava materiálů k testům, tzn. pěstebních substrátů, pufrů, roztoků a činidel. OBSAH ODDÍL I: Použití testovacího schématu 1. Diagnóza bakteriální hnědé hniloby hlíz bramboru a bakteriálního vadnutí rostlin bramboru a rajčete. 2. Detekce a identifikace Ralstonia solanacearum ve vzorcích hlíz bramboru. ODDÍL II: Diagnóza bakteriální hnědé hniloby hlíz bramboru a bakteriálního vadnutí rostlin bram- boru a rajčete 1. Příznaky. 2. Rychlý(é) screeningový(é) test(y). 3. Postup při izolaci. 4. Potvrzovací test(y). ODDÍL III: Detekce a identifikace Ralstonia solanacearum ve vzorcích hlíz bramboru 1. Příprava vzorku pro testování. 2. Imunofluorescenční test (IF test). 3. ELISA test (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay test). 4. PCR test (polymerázová řetězová reakce). 5. Kultivace na selektivních živných médiích. 6. Biotest. 7. Obohacovací testy. 8. Test patogenity. Dodatek 1 Živná média pro izolaci a kultivaci Ralstonia solanacearum. Dodatek 2 Materiál pro přípravu vzorku. Dodatek 3 Materiál pro IF test. Dodatek 4 Stanovení stupně kontaminace v IF testu. Dodatek 5 Materiál pro ELISA test. Dodatek 6 Materiál pro PCR test. Dodatek 7 Materiál pro test na selektivních živných médiích a obohacovací test. Literatura. 383 383 385 387 387 387 388 388 391 391 392 394 394 396 397 397 397 398 399 400 401 402 403 403 404 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 383 ODDÍL I POUŽITÍ TESTOVACÍHO SCHÉMATU 1. Diagnóza bakteriální hnědé hniloby hlíz bramboru a bakteriálního vadnutí rostlin bramboru a rajčete Testovací postup je určen pro hlízy bramboru, které vykazují typické příznaky bakteriální hnědé hniloby nebo příznaky vyvolávající pode- zření z jejího výskytu, a pro a rostliny bramboru a rajčete, které vykazují typické příznaky bakteriálního vadnutí nebo příznaky vyvolá- vající podezření z jeho výskytu. Zahrnuje rychlý screeningový test, izolaci původce z infikovaného vodivého pletiva na diagnostických médiích a, při pozitivním nálezu, identifikaci kultury jako Ralstonia solanacearum. Postupový diagram 384 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 Poznámky k postupovému diagramu (1) Popis příznaků v oddílu II. 1. (2) Rychlé screeningové testy usnadňují předběžnou diagnózu. Vhodnými testy jsou: — test na výtok slizu z cévních svazků (oddíl II. 2), — test na přítomnost granulí poly-β-hydroxybutyrátu (oddíl II. 2), — IF test (oddíl III. 2), — ELISA test (oddíl III. 3), — PCR test (oddíl III. 4). (3) Ačkoliv je izolace původce hnědé hniloby z rostlinného materiálu s typickými příznaky metodou zřeďovacích roztěrů poměrně jednoduchá, může zakládání kultivace v pokročilých stádiích infekce selhat. Saprofytické bakterie rostoucí na nemocné tkáni mohou přerůst původce na izolačním médiu nebo bránit jeho růstu. Je-li izolační test negativní, přestože existují typické příznaky choroby, je třeba izolaci opakovat, přednostně kultivací na selektivních živných médiích. (4) Pro spolehlivou identifikaci čisté kultury Ralstonia solanacearum je nezbytné provést alespoň jeden z testů uvede- ných v oddílu II. 4. 1 v kombinaci s testem patogenity (oddíl II. 4. 3). Charakteristika kmene není povinná, doporu- čuje se však pro každý nový případ. 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 385 2. Detekce a identifikace Ralstonia solanacearum ve vzorcích hlíz bramboru Testovací postup je určen k detekci latentních infekcí v hlízách bramboru jedním nebo lépe několika screeningovými testy, které se při pozitivním nálezu potvrdí izolací patogenu. V případě izolace typických kolonií se čistá kultura identifikuje jako Ralstonia solanacearum. Postupový diagram 386 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 Poznámky k postupovému diagramu (1) V e l i k o s t v z o r k u Standardní velikost vzorku je 200 hlíz. Metoda je však vhodná i pro vzorky s méně než 200 hlízami. (2) S c r e e n i n g o v ý ( é ) t e s t ( y ) Jediný test nemusí být dostatečně citlivý nebo spolehlivý k detekci Ralstonia solanacearum v jednom vzorku. Proto se doporučuje provedení několika testů založených pokud možno na rozdílných biologických principech. (3) I m u n o f l u o r e s c e n č n í t e s t ( I F t e s t ) IF test je osvědčeným screeningovým testem. To je výhodou oproti jiným testům, které ještě nejsou plně vyvinuty nebo ověřeny. Test se používá pro mnoho jiných karanténních bakterií, např. Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Podle parametrů udávaných pro tuto metodu se jedná o citlivý test (hranice detekovatelnosti 103–104 buněk v 1 ml pelety z bramborového extraktu). Rozhodujícím faktorem pro spolehlivost výsledku testu je kvalita antiséra. Přijatelné je jen antisérum s vysokým titrem (nejméně 2 000 u surového antiséra) a všechny testy musí být prováděny při antisérovém titru nebo při jednom ředění pod úroveň titru. Upřednostňuje se nepřímá metoda. Přímou metodu lze použít, pokud citlivost a specifičnost testu jsou rovnocenné citlivosti a speci- fičnosti nepřímé metody. IF test má výhodu subjektivního vyhodnocení buněčné morfologie a intenzity fluorescence, které vypovídají o specifičnosti reakce. Časté jsou křížové reakce se sérologicky příbuznými bakteriemi se stejnou buněčnou morfologií jako Ralstonia solanacearum, které pocházejí z půdy nebo ulpívají na hlíze. IF test lze provádět jako jediný screeningový test, pokud však existuje podezření na výskyt křížové reakce, měl by být proveden další test založený na jiném biologickém principu. V takovém případě je nejvhodnější kultivace na selektivních živných médiích. (4) K u l t i v a c e n a s e l e k t i v n í c h ž i v n ý c h m é d i í c h S modifikovaným médiem SMSA a metodologií testování používanou při této metodě se jedná o citlivý a selektivní test na Ralstonia solanacearum. Výsledek je k dispozici za 3–6 dnů po přípravě vzorku. Původce choroby se získá přímo v kultuře a lze jej snadno identifikovat. Má-li se plně využít potenciálu tohoto testu, je třeba pečlivě připravit pupkovou část hlíz, aby byly vyloučeny sekundární bakterie z hlíz, které si na médiu konkurují s Ralstonia solanacearum a mohly by tak ovlivňovat vývoj patogenu. Některé kmeny mohou kromě toho špatně růst, jelikož složky živného média mohou mít též vliv na cílový organismus. Rovněž je třeba pečlivě rozlišovat Ralstonia solanacearum od jiných bakterií, které by se na médiu mohly vyvíjet. Selektivní plotnový roztěr lze použít jako jediný screeningový test, avšak při negativním výsledku testu, u nějž je podezření, že k němu došlo inhibicí Ralstonia solanacearum jinými bakteriemi v médiu, by měl být proveden druhý screeningový test. V takových případech je nejvhodnější IF test. (5) E L I S A t e s t ELISA test je v zásadě méně citlivý než IF test (hranice detekovatelnosti 104–105 buněk v 1 ml pelety z bramborového extraktu). Je levný a rychlý, obecně však vykazuje spíše falešné pozitivní výsledky (křížové reakce) a falešné negativní výsledky (inhibice fenolo- vými molekulami v bramborovém extraktu). Požadavky na specifičnost antiséra jsou mimořádně vysoké. ELISA test nelze provést jako jediný screeningový test. (6) P C R t e s t PCR test je potenciálně velmi citlivý detekční test, i když může být snadno inhibován složkami extraktu z rostlin nebo hlíz, které vedou k falešným negativním výsledkům. Některé odrůdy brambor obsahují více inhibitorů než jiné. Proto je třeba tyto inhibitory odstranit. Jednou z možností je zředění, přitom však dojde i ke zředění populací Ralstonia solanacearum. Ve všech fázích přípravy vzorku a testu musí být postupováno velmi pečlivě, aby se zabránilo kontaminaci, která by vedla k falešným pozitivním výsledkům. Falešně pozitivní výsledky by se mohly vyskytnout i v důsledku homologních sekvencí jiných organismů. Proto nelze PCR test používat jako jediný screeningový test. (7) O b o h a c o v a c í t e s t Inkubace vzorku pelety z bramborového extraktu v semiselektivním tekutém médiu, např. v modifikovaném SMSA tekutém médiu, umožňuje množení Ralstonia solanacearum. Ještě důležitější je možná skutečnost, že se tímto způsobem zároveň zředí i potenciální inhibitory testů ELISA a PCR. Ralstonia solanacearum lze tak v obohaceném bujónu detekovat pomocí IF testu, ELISA testu nebo PCR testu. Přímé roztěry z obohaceného tekutého média se nedoporučují. Tyto obohacovací metody nebyly dostatečně vyzkoušeny a otes- továny. Jsou zde zahrnuty pouze pro jejich vysoký potenciál. Pro nedostatek zkušeností je však nelze použít jako jedinou detekční metodu. (8) B i o t e s t Tento test se používá pro izolaci Ralstonia solanacearum z pelet bramborového extraktu selektivním obohacením na hostitelské rostlině a lze jej provést na rostlinách rajčete nebo na rostlinách lilku vejcoplodého. Vyžaduje optimální inkubační podmínky podle návodů uvedených u této metody. Bakterie, které inhibují Ralstonia solanacearum na živném médiu SMSA, tento test s největší pravděpodob- ností neovlivňují. (9) P o t v r z o v a c í t e s t ( y ) Čistou kulturu Ralstonia solanacearum lze spolehlivě identifikovat alespoň jedním z testů uvedených v oddílu II. 4. 1 v kombinaci s testem patogenity (oddíl II. 4. 3). Charakteristika kmene není povinná, doporučuje se však pro každý nový případ. 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 387 DIAGNÓZA BAKTERIÁLNÍ HNĚDÉ HNILOBY HLÍZ BRAMBORU A BAKTERIÁLNÍHO VADNUTÍ ROSTLIN BRAMBORU A RAJČETE ODDÍL II 1. 1. 1 Příznaky P ř í z n a k y n a p a d e n í u b r a m b o r Rostlina bramboru. V rané fázi infekce listy na vrcholu rostliny při vysokých teplotách ve dne vadnou a v noci se regenerují. Vadnutí se rychle stane nevratným a vede k odumírání rostliny. Vodivá pletiva v příčně rozříznutých stoncích zvadlých rostlin jsou hnědě zbarvená, na řezu vytéká nebo lze snadno vytlačit mléčný exsudát. Při ponoření rozříznutého stonku do vody ve svislé poloze vytékají z cévních svazků slizová vlákna. Hlíza bramboru. Bramborové hlízy se na pupkové části rozříznou napříč. V rané fázi infekce má prstenec cévních svazků sklovitě žluté až světle hnědé zbarvení a po několika minutách z něj samovolně nebo po lehkém stisknutí slupky v blízkosti řezné plochy vytéká bledý exsudát krémové barvy. Zbarvení je později zřetelně hnědé a nekróza se může rozšířit až do parenchymatického pletiva. V pokročilých stadiích se infekce šíří od pupkových částí hlíz a z oček, což vede ke vzniku načervenale hnědých, lehce vmáčknutých lézí na slupce. Z nich může vytékat bakteriální sliz, na němž ulpívají půdní částice. 1. 2 P ř í z n a k y u r a j č a t Rostlina rajčete. Prvním patrným příznakem je povadlý vzhled nejmladších listů. Za podmínek příznivých pro patogen (teplota půdy přibližně 25 °C při nasycené vzdušné vlhkosti) je jedna strana rostliny nebo celá rostlina během několika dnů postižena epinastií a vad- nutím, což vede k úplnému odumření rostliny. Za méně příznivých podmínek (teplota půdy do 21 °C) se může na stonku tvořit velký počet postranních výhonů. Na stonku lze pozorovat slizovitý pás, který je viditelným znakem nekrózy cévního systému. Při příčném rozříznutí stonku vytéká z hnědě zbarveného vodivého pletiva stonku po kapkách bílý nebo nažloutlý bakteriální sliz. 2. Rychlé screeningové testy Rychlé screeningové testy umožňují předběžnou diagnózu. Používá se jeden nebo několik z následujících testů: Test vytékání bakteriálního slizu z cévních svazků Přítomnost Ralstonia solanacearum v zavadlých stoncích bramboru nebo rajčete lze zjistit následujícím jednoduchým testem: Stonky se uříznou nízko nad zemí a řezná plocha se vloží do kádinky s vodou. Krátce nato z cévních svazků samovolně vytékají vlákna bakteriálního slizu. Žádná jiná bakterie způsobující cévní infekce u rostlin bramboru a rajčete nevykazuje tento příznak. Detekce granulí poly-β-hydroxybutyrátu (PHB) Granule PHB v buňkách Ralstonia solanacearum se zviditelní obarvením nilskou modří A a sudánskou černí B. Připraví se buď roztěr exsudátu, nebo suspendovaného pletiva na podložním sklíčku nebo roztěr 48hodinové kultury na živné půdě YPGA nebo SPA (dodatek 1). Připraví se roztěry pro pozitivní kontroly kmene biovaru 2 rasy 3, a v případě potřeby i pro negativní kontroly heterologního kmene, a nechají se vyschnout. Spodní strana podložního sklíčka se několikrát rychle protáhne plamenem až do fixace roztěru. T e s t n i l s k o u m o d ř í 1. Fixovaný roztěr se přelije 1 % vodním roztokem nilské modři A. Inkubuje se 10 minut při 55 °C. 2. Barvicí roztok se nechá stéci. Krátce se opláchne pod slabě tekoucí vodou. Přebytečná voda se vysaje savým papírem. 3. Roztěr se přelije 8 % vodním roztokem kyseliny octové. Inkubuje se 1 minutu při pokojové teplotě. 4. Opláchne se pod slabě tekoucí vodou a osuší se savým papírem. 5. Znovu se navlhčí kapkou vody. Přikryje se krycím sklíčkem. 6. Obarvený roztěr pozorujeme pod epifluorescenčním mikroskopem při 450 nm pod olejovou imerzí při zvětšení 1 000 x. Sledujeme sytě oranžovou fluorescenci granulí PHB. Pozorování provádíme i při normálním světle, abychom se ujistili, že granule jsou intracelulární a že morfologie buňky je typická pro Ralstonia solanacearum. 388 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 T e s t s u d á n s k o u č e r n í 1. Fixovaný roztěr se přelije 0,3 % roztokem sudánské černě B v 70 % ethanolu. Inkubuje se 10 minut při pokojové teplotě. 2. Barvicí roztok se nechá stéci. Krátce se opláchne pod slabě tekoucí vodou. Přebytečná voda se vysaje savým papírem. 3. Roztěr se krátce ponoří do xylolu. Osuší se savým papírem. Upozornění! Xylol je zdraví škodlivá látka. Nutno pracovat v digestoři. 4. Roztěr se přelije 0,5 % vodním roztokem safraninu. Nechá se 10 sekund stát při pokojové teplotě. Upozornění! Safranin je zdraví škodlivá látka. Nutno pracovat v digestoři. 5. Opláchne se pod slabě tekoucí vodou. Osuší se savým papírem a přikryje se krycím sklíčkem. 6. Obarvený roztěr pozorujeme mikroskopem v procházejícím světle pod olejovou imerzí při zvětšení 1 000 x. Granule PHB v buňkách Ralstonia solanacearum jsou zbarvené modročerně. Buněčné stěny jsou zbarvené růžově. J i n é t e s t y Z jiných screeningových testů je vhodný IF test (oddíl III. 2), ELISA test (oddíl III. 3) a PCR test (oddíl III. 4). 3. 3. 1 3. 2 3. 3 3. 4 Postup při izolaci Odebereme slizový sekret nebo části odbarveného pletiva z prstence cévních svazků hlízy bramboru nebo z vodivých pletiv ve stonku rostlin bramboru nebo rajčete. Suspendujeme v malém objemu sterilní destilované vody nebo v 50 mM fosfátovém pufru a necháme 5–10 minut stát. Připravíme nejméně dvě desetinná ředění suspenze (1/10 a 1/100), v případě potřeby i více. Standardní objem suspenze a ředění převedeme na univerzální živné médium NA, YPGA a SPA (dodatek 1) a/nebo na Kelmanovo tetrazo- liové médium (dodatek 1) a/nebo na selektivní médium SMSA (dodatek 7). Potom je vhodnou metodou rozprostřeme nebo rozetřeme na plotny. Může být užitečné připravit samostatné plotny každého média se zředěnou kulturou buněčné suspenze virulentního kmene biovaru 2 rasy 3 Ralstonia solanacearum jako pozitivní kontrolu. Plotny se inkubují 3 dny při 28 °C. Při pomalém růstu lze dobu inkubovace prodloužit až na 6 dnů, přičemž se však kolonie na médiu SMSA stávají atypickými a odumírají. Na univerzálních živných substrátech tvoří virulentní izoláty Ralstonia solanacearum perlově bílé, ploché, nepravidelné a tekuté kolonie, často s charakteristickými spirálkami. Na Kelmanově tetrazoliovém médiu tvoří virulentní izoláty Ralstonia solanacearum typické krémově zbarvené, ploché, nepravidelné, tekuté kolonie s krvavě červeně zbarvenými spirálkami. Nevirulentní formy Ralstonia solanacearum naproti tomu tvoří máslovité tmavě červené kolonie. Na médiu SMSA tvoří virulentní izoláty Ralstonia solanacearum mléčně bílé, ploché, nepravidelné a tekuté kolonie s krvavě červeně zbar- veným středem. Nevirulentní formy Ralstonia solanacearum tvoří na médiu SMSA méně tekuté kolonie, které jsou celé růžové až červené. 3. 5 Kolonie s charakteristickou morfologií subkultur se vyčistí na univerzálním živném médiu. Je třeba se vyvarovat pravidelnému přeočková- vání, které může vést ke ztrátě virulence. 4. Potvrzovací testy 4. 1 Identifikace Ralstonia solanacearum Čisté kultury Ralstonia solanacearum se identifikují nejméně jednou z následujících metod: V ý ž i v o v é a e n z y m a t i c k é t e s t y Poznámka: Do každého testu je nutno zahrnout vhodné kontrolní kmeny. 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 389 Následující fenotypové vlastnosti Ralstonia solanacearum jsou buď vždy prítomny, nebo chybí: – + O+/F- + + + + – + – – – – – – fluoreskující pigmenty inkluze PHB oxidační/fermentační test kataláza oxidáza podle Kovace redukce dusičnanů využití citrátů růst při 40 °C růst v 1 % NaCl růst v 2 % NaCl arginin-dihydroláza ztekucení želatiny hydrolýza škrobu hydrolýza eskulinu produkce levanu Média a metody viz Lelliott & Stead (1987). I F t e s t Připraví se suspenze 106 buněk na 1 ml kultury a kontrolního kmene. Připraví se řada dvojnásobného ředění antiséra. Použije se IF metody (oddíl III. 2). IF titr kultury musí odpovídat IF titru pozitivní kontroly. E L I S A t e s t Připraví se suspenze o hustotě větší než 106 buněk na 1 ml kultury a kontrolního kmene. Použije se metody ELISA (oddíl III. 3). Extinkce kultury musí odpovídat extinkci pozitivní kontroly. P C R t e s t Připraví se suspenze 106 buněk na 1 ml kultury a kontrolního kmene. Použije se metody PCR (oddíl III. 4). PCR produkt kultury musí mít stejnou velikost a stejný vzor restrikční enzymové analýzy (REA) jako pozitivní kontrola. F l u o r e s c e n č n í h y b r i d i z a c e i n s i t u ( F I S H ) Připraví se suspenze 106 buněk na 1 ml kultury a kontrolního kmene. Použije se metody FISH (van Beuningen et al. , 1995) s PCR primerem OLI-1 (Seal et al. , 1993). Kultura musí vykazovat stejnou reakci jako pozitivní kontrola. P r o t e i n o v ý p r o f i l Denaturované proteiny celých buněk se oddělují elektroforézou v polyakrylamidovém gelu (PAGE) (Stead, 1992a). S t a n o v e n í p r o f i l u m a s t n ý c h k y s e l i n ( F A P ) Kultura a pozitivní kontrola se nechají růst 48 hodin při 28 °C na tryptikázovém sójovém agaru a pak se použije metody FAP (Janse, 1991; Stead, 1992a; Stead, 1992b). Profil kultury musí být shodný s profilem pozitivní kontroly. Charakteristickými mastnými kyselinami za uvedených podmínek jsou: 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH a 18:1 2OH. 4. 2 Charakteristika kmene Charakteristika kmene není povinná, ale doporučuje se ji provést pro každý nový případ při použití alespoň jednoho z následujících testů: 390 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 U r č e n í b i o v a r u Ralstonia solanacearum se dělí na biovary podle schopnosti vytvářett kyselinu ze tří hexózovych alkoholů a tří cukrů (Hayward, 1964, 1994): Využití — maltózy — laktózy — celobiózy — mannitu — sorbitu — dulcitu 1 - - - - - - 2 + + + - - - biovar 3 + + + + + + 4 - - - + + + 5 + + + + - - Doplňkovými testy lze biovar 2 členit na subfenotypy (Hayward, 1994): Využití trehalózy Využití inozitolu Využití D-ribózy Pektolytická aktivita S t a n o v e n í r a s y biovar 2 biovar 2-A biovar 2-T - + - nízká + - - nízká + + + vysoká Rasa (Buddenhagen et al. , 1962) se stanovuje na základě testu patogenity na rostlinách rajčete nebo lilku vejcoplodého a na rostlinách tabáku, jakož i testem hypersenzitivní reakce (HR) na listech tabáku (Lozano a Sequeira, 1970): Reakce u: — rostlin rajčete/lilku vejcoplodého — rostlin tabáku — listů tabáku 1 vadnutí vadnutí rasa (*) 2 žádná reakce žádná reakce nekróza (48 hod. ) a vadnutí (7–8 dnů) hypersenzitivní reakce (12– 24 hod. ) 3 vadnutí žádná reakce chloróza (2–8 dnů) (*) Rasa 4 (patogenní na zázvoru a některých jiných hostitelích) a rasa 5 (patogenní jen na moruši) nebyly zohledněny. Stanovení rasy testem patogenity nebo testem hypersenzitivní reakce na tabáku nemusí být příliš spolehlivé a může se také provádět na základě stano- vení biovaru a původního hostitele. Kulturu lze dále charakterizovat pomocí: G e n o m o v é h o f i n g e r p r i n t u Molekulární odlišení kmenů komplexu Ralstonia solanacearum lze provést: analýzou RFLP (Cook et al. , 1989). repetitivní sekvencí PCR [REP-, ERIC & BOX (Louws et al. , 1995; Smith et al. , 1995)]. 4. 3 Test patogenity Tento test slouží k potvrzení diagnózy Ralstonia solanacearum a k potvrzení virulence kultur identifikovaných jako Ralstonia solanacearum. Z kultury a pozitivního kontrolního kmene se připraví inokulum o hustotě 106 buněk na 1 ml. Naočkuje se 5–10 rostlin rajčete nebo lilku vejcoplodého ve stadiu třetího listu nebo stadiu starším (oddíl III. 6). Inkubuje se až dva týdny při teplotě 22–28 °C a vysoké relativní vlhkosti vzduchu a denně se zavlažuje. Sledují se příznaky vadnutí a/nebo epinastie, chlorózy a zakrslosti. Z rostlin s charakteristickými příznaky Ralstonia solanacearum se provede izolace takto: — odebere se část pletiva stonku 2 cm nad místem inokulace, — rozmělní se a suspenduje se v malém množství sterilní destilované vody nebo ve fosfátovém pufru 50 mM, pak se rozetře na plotny, inkubuje se a poté se vyhodnotí typické kolonie Ralstonia solanacearum 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 391 DETEKCE A IDENTIFIKACE RALSTONIA SOLANACEARUM VE VZORCÍCH HLÍZ BRAMBORU Upozornění: Vzorek standardní velikosti sestává z 200 hlíz. Metoda je však vhodná i pro vzorky s méně než 200 hlízami. ODDÍL III 1. Příprava vzorku pro testování Upozornění: Peletu z bramborového extraktu, získanou touto metodou, lze použít i pro detekci Clavibacter michiganensis subsp. sepedo- nicus. Před testem je možné, je-li to považováno za účelné, provést následující postupy: i) vzorek se inkubuje až 2 týdny při teplotě 25–30 °C, aby se podpořilo namnožení slabých populací Ralstonia solanacearum; ii) hlízy se omyjí pod tekoucí vodou s přídavkem vhodného dezinfekčního a mycího prostředku. Hlízy se nechají usušit na vzduchu. 1. 1 1. 2 Čistým a dezinfikovaným skalpelem nebo nožem na zeleninu se odstraní slupka hlízy na pupkové části tak, aby byla vidět vodivá pletiva. Na pupkové části každé hlízy se opatrně vyřízne malý kónický výkroj (průměru 3–5 mm) z vodivého pletiva. Přitom se dbá na to, aby se zasáhlo co nejméně nevodivého pletiva. Provede se u každé hlízy vzorku. Upozornění: V této fázi je možno hlízy zkoumat vizuálně (oddíl II. 1). Hlízy vykazující příznaky se vytřídí a zkouší odděleně (oddíl II). Pupkové části hlíz se dají do uzavřené nádoby a měly by se neprodleně zpracovat. Není-li to možné, neměly by se uchovávat déle než 24 hodin nebo při teplotě 4 °C déle než 72 hodin. 1. 3 Pupkové části se zpracovávají jednou z následujících metod: i) Pupkové části se dají do vhodné nádoby. Přidá se macerační pufr (dodatek 2) v takovém objemu, aby překryl pupkové části. Pupkové části se v mixeru Waring Blender nebo Ultra Thurrax rozmělní až do úplné homogenizace. Je třeba se vyvarovat příliš silné homogenizaci. Macerát se nechá 15–30 minut máčet. ii) Pupkové části se dají do vhodné nádoby. Přidá se macerační pufr v takovém objemu, aby překryl pupkové části. Nádoba se postaví na třepačku. Inkubuje se při 50–100 kmitech za minutu po dobu 4 hodin při teplotě 20–22 °C nebo po dobu 16–24 hodin při teplotě 4 °C. iii) Pupkové části se dají do pevného jednorázového maceračního sáčku (např. sáček Stomacher, rozměry 105 mm x 150 mm, sterili- zován zářením). Pupkové části se vhodným nástrojem, např. kladivem, rozmělní až do úplné homogenizace. Přidá se macerační pufr v takovém objemu, aby překryl pupkové části. Macerát se nechá 15–30 minut odstát. 1. 4 Bakterie se z upravených pupkových částí hlíz extrahují jednou z následujících metod: i) Macerát se opatrně slije do centrifugační zkumavky, přičemž tuhý zbytek se ponechá v nádobě nebo sáčku. Je-li slitý macerát zakalený, odstřeďuje se při teplotě do 10 °C po dobu 10 minut při odstředivé síle ne větší než 180 g. Slitý macerát nebo supernatant z prvního odstřeďování se odstřeďuje po dobu 15 minut při 7 000 g nebo po dobu 10 minut při 10 000 g a teplotě do 10 °C. Supernatant se slije tak, aby se peleta nezvířila. ii) Macerát se přefiltruje přes filtrační systém s velikostí pórů 40–100 µm. Filtraci posílíme vakuovým čerpadlem. Filtrát se zachycuje v centrifugační zkumavce. Filtr se promyje maceračním pufrem. Filtrát se odstřeďuje po dobu 15 minut při 7 000 g nebo po dobu 10 minut při 10 000 g a teplotě do 10 °C. Supernatant se slije tak, aby se peleta nezvířila. 392 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 1. 5 Peleta se resuspenduje v 1 ml peletového pufru (dodatek 2). Rozdělí se na dvě stejné části a každá část se nalije do mikrozkumavky. Jedna mikrozkumavka se použije pro test. Zbytek tohoto extraktu se během testu uchovává při teplotě 4 °C. Do druhé mikrozkumavky se přidá 10–25 % objemových sterilního glycerinu. Protřepe se a skladuje při teplotě –18 °C (několik týdnů) nebo –70 °C (několik měsíců). 2. IF test Použije se antisérum pro Ralstonia solanacearum, přednostně rasy 3 biovaru 2. Stanoví se titr u suspenze o hustotě 106 buněk na 1 ml homologního kmene Ralstonia solanacearum s vhodným ředěním konjugátu fluorescenčního isothiokyanátu (FITC) podle doporučení výrobce. Surové sérum by mělo mít IF titr nejméně 1: 2 000. Použije se víceobjektové podložní sklíčko nejlépe s 10 okénky o průměru nejméně 6 mm. Na každé podložní sklíčko se nanese kontrola konjugátu FITC. Test by měl být opakován s kontrolou PBS, pokud kontrola FITC vykáže nějakou pozitivní buňku. Připraví se několik pozitivních kontrolních podložních sklíček se suspenzí 106 buněk na 1 ml jednoho kmene příslušné rasy a biovaru Ralstonia solanacearum. V každé řadě testu se použije jedno podložní sklo. 2. 1 Podložní sklíčka se připraví podle jedné z následujících metod: i) Pelety s relativně nízkým obsahem škrobu: 2. 2 2. 3 Na řadu okének se nanese pipetou odměřený standardní objem (na jedno okénko o průměru 6 mm stačí 15 µl - u větších okének je nutné použít odpovídající větší objem) resuspendované pelety. Další řadu lze použít jako duplikát nebo pro druhý vzorek, jak je znázorněno na obrázku 1. ii) Jiné pelety: Připraví se desetinná ředění (1/10, 1/100 a 1/1000) resuspendované pelety v peletovém pufru. Na řadu okének se nanese pipetou odměřený standardní objem (na jedno okénko o průměru 6 mm stačí 15 µl – u větších okének je nutné použít odpovídající větší objem) resuspendované pelety a každé ředění. Další řadu lze použít jako duplikát nebo pro druhý vzorek, jak je znázorněno na obrázku 2. Kapky se nechají uschnout. Bakteriální buňky se na podložním sklíčku fixují buď zahřátím, ožehnutím nebo 95 % ethanolem. Postup při IF testu i) Při přípravě podložního sklíčka podle 2. 1. i): Připraví se sada dvojnásobného ředění antiséra v IF pufru (dodatek 3): 1/4 titru (T/4), 1/2 titru (T/2), titr (T) a dvojnásobek titru (2T). ii) Při přípravě podložního sklíčka podle 2. 1. ii): Připraví se pracovní ředění antiséra v IF pufru. Pracovní ředění je ředění antiséra s optimální specifičností a obvykle činí polovinu hodnoty titru. Obrázek 1 Příprava podložního sklíčka podle 2. 1. i) a 2. 3. i) 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 393 Obrázek 2 Příprava podložního sklíčka podle 2. 1. ii) a 2. 3. ii) 2. 3. 1 Podložní sklíčka se vyloží na savý papír. Všechna testovací okénka se překryjí ředěním(i) antiséra. Na okénka FITC se nanese PBS. Objem antiséra, nanesený na okénka, musí odpo- vídat objemu naneseného extraktu. 2. 3. 2 Inkubuje se přikryté po dobu 30 minut při pokojové teplotě. 2. 3. 3 2. 3. 4 Z podložního sklíčka se setřesou kapky antiséra a sklíčko se opatrně opláchne IF pufrem. Omývá se 5 minut IF pufrem Tween a poté 5 minut v IF pufru (dodatek 3). Přebytečná vlhkost se pečlivě odstraní. Podložní sklíčka se vyloží na vlhký savý papír. Testovací okénka a okénko FITC se pokryjí ředěním konjugátu FITC použitým ke stanovení titru. Objem konjugátu, nanesený na okénka, musí odpovídat objemu naneseného antiséra. 2. 3. 5 Inkubuje se přikryté po dobu 30 minut při pokojové teplotě. 2. 3. 6 Z podložního sklíčka se setřesou kapky konjugátu. Omývá a oplachuje se jako podle bodu 2. 3. 3. Pečlivě se odstraní přebytečná vlhkost. 2. 3. 7 Na každé okénko se nanese pipetou 5–10 µl 0,1 M fosfátově pufrovaného glycerinu (dodatek 3) nebo podobná krycí kapalina a přiloží se krycí sklíčko. 2. 4 Hodnocení IF testu Podložní sklíčka se zkoumají pod epifluorescenčním mikroskopem s filtry vhodnými pro excitaci FITC pod olejovou imerzí při zvětšení 500 až 1 000 x. Každé okénko se zkoumá mikroskopicky ve dvou navzájem kolmých průměrech a rovněž po obvodu. Nejprve se zkoumá podložní sklíčko s pozitivní kontrolou. Buňky musí odchylném zbarvení je třeba test opakovat. jasně fluoreskovat a být plně vybarvené. Upozornění: Při Nejprve se zkoumá nepřítomnost fluoreskujících buněk v kontrolních okénkách FITC. Fluoreskující buňky v kontrolním okénku FITC ukazují na nespecifickou vazbu konjugátu, autofluorescenci nebo kontaminaci. Upozornění: Při takovém zjištění je třeba test opakovat. V testovacích okénkách se pozorují jasně fluoreskující buňky s charakteristickou morfologií Ralstonia solanacearum. Intenzita fluorescence musí odpovídat intenzitě fluorescence pozitivního kontrolního kmene při stejném zředění antiséra. Na buňky s neúplným zabarvením nebo se slabou fluorescencí se nebere zřetel, ledaže by těchto buněk bylo mnoho (viz vyhodnocení výsledku IF testu). Vyhodnocení výsledku IF testu: i) Pro každý vzorek, v němž nebyly nalezeny žádné fluoreskující buňky s charakteristickou morfologií, je IF test negativní. ii) Pro každý vzorek, v němž byly nalezeny jasně fluoreskující buňky s charakteristickou morfologií, se stanoví průměrný počet buněk na mikroskopické pole a vypočte se počet buněk na 1 ml (N) resuspendované pelety (dodatek 4). Hustota bakterií přibližně 103 buněk na 1 ml resuspendované pelety je považována za mez detekce pro IF test: — u vzorků s N > 103 buněk na 1 ml resuspendované pelety se výsledek IF testu hodnotí jako pozitivní, — u vzorků s N < 103 buněk na 1 ml resuspendované pelety může být výsledek IF testu hodnoten jako pozitivní. 394 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 iii) Při zjištění velkého počtu (N > 105 buněk na 1 ml) neúplně nebo slabě fluoreskujících buněk u titru antiséra by měl být proveden druhý test: — buď test založený na jiném biologickém principu, nebo — další IF test, buď s druhým antisérem, nebo s desetinásobným zředěním pelety. 3. ELISA test (podle Robinsona-Smithe et al. , 1995) Použije se antisérum pro Ralstonia solanacearum, přednostně pro rasu 3 biovar 2. Stanoví se titr u suspenze 106 buněk na 1 ml homolog- ního kmene Ralstonia solanacearum. Doporučuje se používat mikrotitrační destičky NUNC-Polysorb. Test by měl zahrnovat negativní kontrolu bramborového extraktu a kontrolu fosfátového pufru (PBS). Jako pozitivní kontrola se používá suspenze o hustotě větší než 106 buněk na 1 ml kmene příslušné rasy a biovaru Ralstonia solanacearum. Test se provede stejně jako u vzorku(ů), avšak odděleně od vzorků na mikrotitrační destičce. 3. 1 Do mikrozkumavky se napipetuje 100–200 µl resuspendované pelety. 3. 2 3. 3 3. 4 3. 5 3. 6 3. 7 3. 8 3. 9 Zahřívá se po dobu 4 minut při teplotě 100 °C. Mikrozkumavka se pak položí na led. Přidá se stejný objem dvojnásobně silného uhličitanového krycího pufru (dodatek 5). Protřepe se. Do nejméně dvou jamek v mikrotitrační destičce se dá vždy po 100 µl. Inkubuje se po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C nebo přes noc při teplotě 4 °C. Extrakty se z jamek úplně odstraní. Jamky se třikrát vymyjí PBS Tween (dodatek 5); poslední mycí roztok by měl v jamkách zůstat nejméně 5 minut. Připraví se vhodné ředění antiséra Ralstonia solanacearum v blokačním pufru (dodatek 5). Do jamek se dá po 100 µl ředěného antiséra. Inkubuje se po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C. Antisérum se z jamek úplně odstraní. Jamky se vymyjí výše popsaným způsobem (3. 4). Připraví se vhodné ředění konjugátu alkalické fosfatázy v blokačním pufru. Do jamek se dá po 100 µl ředěného konjugátu. Inkubuje se po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C. Konjugát se z jamek úplně odstraní. Jamky se vymyjí výše popsaným způsobem (3. 4 a 3. 6). Připraví se alkalický roztok ze substrátu fosfatázy (dodatek 5). Do jamek se dá po 100 µl. Inkubuje se po dobu 30 minut až 1 hodiny v temnu při pokojové teplotě. 3. 10 Odečte se extinkce při 409 nm. Vyhodnocení výsledku ELISA testu ELISA test je negativní, jestliže optická hustota vzorku je nižší než dvojnásobek optické hustoty negativní kontroly. ELISA test je pozitivní, jestliže optická hustota vzorku je vyšší než dvojnásobek optické hustoty negativní kontroly. 4. PCR test (podle Seala et al. , 1993) Upozornění: Při všech krocích přípravy vzorků a jiných činnostech v souvislosti s PCR se musí používat špičky pipet s filtrem. Jako pozitivní kontrola se připraví suspenze 106 buněk na 1 ml kmene rasy 3 biovaru 2 Ralstonia solanacearum. Test se provede stejným způsobem jako u vzorku(ů). 4. 1 Do mikrozkumavky se napipetuje 100 µl resuspendované pelety. Alternativně lze dát 90 µl resuspendované pelety do mikrozkumavky, která obsahuje 10 µl 0,5 M NaOH. Promíchá se opakovaným převracením mikrozkumavky. 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 395 4. 2 4. 3 4. 4 Zahřívá se po dobu 4 minut při teplotě 100 °C. Mikrozkumavka se pak ihned umístí do ledu. Připraví se nejméně dvě desetinná ředění (např. 1/10 a 1/100, nebo v případě potřeby více) ve sterilní destilované nebo ultračisté vodě (UPW). Ve sterilní mikrozkumavce se připraví reakční směs pro PCR (dodatek 6) tak, že se přidají následující složky v tomto pořadí: Pro reakční objem 50 µl Složka Množství Konečná koncentrace Sterilní destilovaná voda nebo ultračistá voda 10 x PCR pufr d-ATP d-CTP d-GTP d-TTP Primer OLI-1 (20 µM) Primer Y-2 (20 µM) Polymeráza Taq (5U/µl) 30,8 µl–33,8 µl 5,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 2,5 µl 2,5 µl 0,2 µl Celkový objem 45 µl–48 µl Pro více reakcí: 1 x 0,2 mM 0,2 mM 0,2 mM 0,2 mM 1 µM 1 µM 1,0 U Vypočte se množství každé složky pro potřebný počet reakcí. Složky se smíchají a 45–48 µl směsi se dá do sterilních mikrozkumavek PCR. Mikrozkumavky s reakční směsí PCR se uloží do ledu. Pro reakční objem 25 µl: Množství složek se přiměřeně sníží. 4. 5 Amplifikace PCR 4. 5. 1 Nepovinně! Mikrokumavky s povařeným vzorkem a pozitivní kontrolou se pulzačně odstředí. Do mikrozkumavek s reakční směsí PCR se v uvedeném pořadí přidá 2–5 µl vzorku(ů), vodní kontrola a pozitivní kontrola. Mikrozku- mavky se postaví do vyhřívacího bloku termocykleru. 4. 5. 2 Provede se následující program: 1 cyklus: i) 2 minuty při teplotě 96 °C:: denaturace matrice 50 cyklů: ii) 20 sekund při teplotě 94 °C: denaturace iii) 20 sekund při teplotě 68 °C: napojování primeru iv) 30 sekund při teplotě 72 °C: prodloužení kopie 1 cyklus v) 10 minut při teplotě 72 °: další prodloužení 1 cyklus vi) udržování při teplotě 4 °C. Upozornění: Tyto parametry se vztahují na termocykler Perkin Elmer 9600. U jiných termocyklerů může být zapotřebí vrstva minerál- ního oleje v reakční mikrozkumavce PCR a/nebo změna trvání kroku ii), iii) a iv) v apmlifikačním profilu. 4. 5. 3 Mikrozkumavky se vyjmou z termocykleru. Produkt PCR se analyzuje. Nelze-li to provést okamžitě, mikrozkumavky se uloží při teplotě 4 °C pro použití v tomtéž dni nebo při teplotě –18 °C pro použití za delší dobu. 4. 6 Analýza produktu PCR Fragmenty PCR se analyzují elektroforézou v agarózovém gelu a obarvením ethidiumbromidem. 4. 6. 1 Připraví se vhodný agarózový gel tak, že agaróza se opatrně povaří v tris-acetátovém elektroforetickém pufru (TAE). 396 4. 6. 2 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 Roztavená agaróza se ochladí na teplotu 50–60 °C, nalije se do komůrky na nalévání gelu elektroforézní aparatury a vloží se hřeben. Roztok se nechá ztuhnout. 4. 6. 3 Hřeben se vyjme. Gel se ponoří do pufru TAE tak, aby byl pokryt 2–3 mm vrstvou pufru. 4. 6. 4 Na parafilm se nanese kapka 3 µl nanášecího pufru. Přidá se 12 µl produktu PCR ze vzorků, pozitivní kontroly a vodní kontroly a před nanášením se smísí lehkým nasáváním do špičky pipety. Uvedené objemy lze přizpůsobit kapacitě jamek v agarózovém gelu. 4. 6. 5 Jamky v gelu se pečlivě naplní. Nejméně do jedné jamky se jako srovnávací substance nanese vhodný marker DNA. 4. 6. 6 K elektroforézní aparatuře se připojí síťový zdroj. Elektroforéza se provádí při 5–8 V/cm, dokud se čelo barviva nebude nacházet ve vzdá- lenosti 1 cm od okraje gelu. 4. 6. 7 Vypne se proudové napájení a síťový zdroj se odpojí z elektroforézní aparatury. Gel se opatrně vyjme a po dobu 30–45 minut se barví v roztoku ethidiumbromidu. Upozornění: Při manipulaci s ethidiumbromidem, který je silným mutagenem, je třeba vždy použít jednorázové rukavice! 4. 6. 8 Barvivo se vymývá v destilované vodě po dobu 10–15 minut. 4. 6. 9 Amplifikované fragmenty DNA se zviditelní transiluminací. PCR produkt Ralstonia solanacearum s primery OLI-1 a Y-2 má délku 288 bp. Porovná se s markerem DNA a pozitivní kontrolou. Upozornění: Vodní kontrola musí být v každém případě negativní. Pokud je pozitivní, je třeba test opakovat. 4. 6. 10 Pro zdokumentování se gel případně vyfotografuje. 4. 6. 11 Pravost amplifikovaného fragmentu se potvrdí restrikční enzymovou analýzou (REA). 4. 7 Restrikční enzymová analýza (REA) 4. 7. 1 4. 7. 2 Do nové mikrozkumavky se dá 8,5 µl produktu PCR (4. 5. 3). Přidá se 1 µl enzymového pufru (10 x) a 0,5 µl restrikčního enzymu AvaII. Promísí se jemným odsávátím do špičky pipety. Zůstávají-li na stěnách mikrozkumavky kapky, pulzně se odstředí v mikroodstředivce. Inkubuje se po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C. 4. 7. 3 Naštípaný fragment PCR se analyzuje elektroforézou v agarózovém gelu jako v bodě 4. 6. Vyhodnocení výsledku PCR testu PCR test je negativní, pokud nebyl prokázán charakteristický fragment 288 bp a přitom byl prokázán fragment u pozitivního kontrolního kmene Ralstonia solanacearum. PCR test je pozitivní, pokud byl prokázán fragment 288 bp a analýza REA ukazuje na to, že amplifikovaný fragment je identický s pozi- tivním kontrolním kmenem Ralstonia solanacearum. 5. Kultivace na selektivních živných médiích (podle Elphinstona et al. , 1996) 5. 1 Test se provádí vhodnou zřeďovací technikou roztěrů, např. : i) Připraví se nejméně dvě desetinná ředění (např. 1/10 a 1/100) resuspendované pelety v peletovém pufru. Odměřený standardní objem (50–100 µl) resuspendované pelety a každého ředění se nanese pipetou na modifikované selektivní SMSA médium (dodatek 7) a skle- něnou tyčinkou se rozprostře po celé ploše média. Pokud je to účelné, provede se 10 µl očkem zřeďovací roztěr resuspendované pelety. Mezi roztěry se očko sterilizuje plamenem. ii) Na modifikované selektivní SMSA médium se nanese odměřený standardní objem (50–100 µl) resuspendované pelety a skleněnou tyčinkou se rozetře po celé ploše média. Tyčinkou bez ožehnutí plamenem se provede roztěr na nejméně dvě další plotny s modifko- vaným SMSA médiem. Stejnou zřeďovací technikou roztěru se nanese suspenze virulentního kmene Ralstonia solanacearum rasa 3 biovar 2 o hustotě 106 buněk v 1 ml jako pozitivní kontrola na sadu samostatných ploten s modifikovaným SMSA médiem. Plotny se inkubují při teplotě 28 °C. Po 3 dnech se provede první kontrola ploten. Při negativním nálezu se dále inkubuje až do 6 dnů. Kolonie virulentních izolátů Ralstonia solanacearum jsou mléčně bílé, ploché, nepravidelné a fluidní, se zřetelně rozeznatelnými červenými až purpurovými středy s proužky nebo spirálkami. 5. 2 5. 3 5. 4 Kolonie s charakteristickou morfologií se vyčistí přeočkováním do čisté kultury na univerzálním médiu (dodatek 1). 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 397 5. 5 Identifikuje se čistá kultura (oddíl II. 4. 1) a pozitivní kultury Ralstonia solanacearum se potvrdí testem patogenity (oddíl II. 4. 3). Vyhodnocení výsledku kultivace na selektivních živných médiích Test na selektivním živném médiu je negativní, jestliže po šesti dnech nelze izolovat žádné kolonie bakterií nebo nejsou izolovány žádné charakteristické kolonie Ralstonia solanacearum za předpokladu, že není podezření z inhibice koloniemi jiných bakterií a že v pozitivních kontrolách byly zjištěny charakteristické kolonie Ralstonia solanacearum. Test na selektivním živném médiu je pozitivní, jestliže jsou izolovány charakteristické kolonie Ralstonia solanacearum. 6. 6. 1 6. 2 6. 3 6. 4 6. 5 6. 6 7. 7. 1 7. 2 7. 3 8. Biotest (podle Janse, 1988) Pro každý vzorek se použije 10 testovacích rostlin náchylných semenáčků rajčete nebo lilku vejcoplodého v růstové fázi třech pravých listů. Testovací rostliny se 24 hodin před inokulací nezavlažují. 100 µl resuspendované pelety se rozdělí mezi testované rostliny. Naočkuje se stonek v místě mezi děložními lístky a na jednom nebo několika dalších místech. Stejnou technikou se inokuluje 10 semenáčků suspenzí virulentního kmene Ralstonia solanacearum rasa 3 biovar 2 o hustotě 106 buněk v 1 ml jako pozitivní kontrola a peletovým pufrem jako negativní kontrola. Rostliny pozitivní kontroly se oddělí od ostatních rostlin, aby se zabránilo křížovým kontaminacím. Testovací rostliny se nechají růst po dobu až 4 týdnů při teplotě 22 až 28 °C, vysoké relativní vlhkosti vzduchu a při denním zavlažování. Rostliny pozitivní kontroly se oddělí od ostatních rostlin, aby se zabránilo křížovým kontaminacím. Sledují se příznaky vadnutí, epinastie, chlorózy a/nebo krnění. Provede se izolace z infikovaných rostlin (oddíl II). Identifikují se čisté kultury s charakteristickou morfologií (oddíl II. 4. 1) a kultury Ralstonia solanacearum se potvrdí testem patogenity (oddíl II. 4. 3). V případě potřeby se u testovacích rostlin, které nevykazují žádné příznaky infekce, zkontroluje, zda k infekci skutečně nedošlo. Z každé testované rostliny se 2 cm nad místem naočkování odebere úsek stonku dlouhý 1 cm. Části pletiv se homogenizují v maceračním pufru. Provede se test zřeďovací technikou (oddíl III. 5. 1). Při pozitivním nálezu se identifikují čisté kultury s charakteristickou morfologií (oddíl II. 4. 1) a kultury Ralstonia solanacearum se potvrdí testem patogenity (oddíl II. 4. 3). Vyhodnocení výsledku biotestu Biotest je negativní, jestliže testovací rostliny nejsou infikované Ralstonia solanacearum za předpokladu, že v pozitivních kontrolách byla Ralstonia solanacearum prokázána. Biotest je pozitivní, jestliže testovací rostliny jsou infikované Ralstonia solanacearum. Obohacovací test (podle J. G. Elphinstona et al. , 1996) Do 3 ml modifikovaného živného média SMSA se vloží 100 µl resuspendované pelety (dodatek 7). Inkubuje se po dobu 48 hodin, avšak ne déle než 72 hodin, při teplotě 28 °C s volně nasazeným víčkem za účelem větrání. Zavře se víčko mikrozkumavky a protřepe se. Množství se rozdělí pro IF test (tento oddíl bod 2), ELISA test (tento oddíl bod 3) a/nebo PCR test (tento oddíl bod 4). Test patogenity Viz oddíl II. 4. 3. 398 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 Dodatek 1 Živná média pro izolaci a kultivaci Ralstonia solanacearum Ž i v ný a g a r (N A ) Živný agar (Difco) Destilovaná voda V baňce o objemu 1 litr se připraví 0,5 litru média. Látky se rozpustí. Sterilizuje se 15 minut v autoklávu při teplotě 121 °C. Ochladí se na 50 °C. Provede se rozliv na plotny. K v a sn i č no- pe pton- g lu kosov ý a g a r (YPG A ) Kvasničný extrakt (Difco) Bacto pepton (Difco) D(+)glukosa (monohydrát) Bacto agar (Difco) Destilovaná voda V baňce o objemu 1 litr se připraví 0,5 litru média. Látky se rozpustí. Sterilizuje se 15 minut v autoklávu při teplotě 121 °C. Ochladí se na 50 °C. Provede se rozliv na plotny. Sac har oso-p ep ton ový a ga r (SPA) Sacharosa Pepton K2HPO4 MgSO4·7H2O Bacto agar (Difco) Destilovaná voda 23 g 1 l 5 g 5 g 10 g 15 g 1 l 20 g 5 g 0,5 g 0,25 g 15 g 1 l V baňce o objemu 1 litr se připraví 0,5 litru média. Látky se rozpustí. V případě potřeby se upraví pH na 7,2–7,4. Sterilizuje se 15 minut v autoklávu při teplotě 121 °C. Ochladí se na 50 °C. Provede se rozliv ploten. K e lmanov o te tra zoliov é mé di u m Kyseliny kasaminové (Difco) Bacto pepton Dextróza Bacto agar (Difco) Destilovaná voda 1 g 10 g 5 g 15 g 1 l V baňce o objemu 1 litr se připraví 0,5 litru média. Látky se rozpustí. Sterilizuje se 15 minut v autoklávu při teplotě 121 °C. Ochladí se na 50 °C. Přidá se filtrem sterilizovaný vodní roztok trifenyl-tetrazolium chloridu (Sigma) až do dosažení konečné koncentrace 50 mg/l. Provede se rozliv ploten. 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 399 Dodatek 2 Materiál pro přípravu vzorku M a c e r ač ní p uf r: 50 m M fosfá tov ý pu fr , p H 7, 0 Tento pufr se používá pro maceraci pletiv. Na2HPO4 KH2PO4 Destilovaná voda 4,26 g 2,72 g 1 l Látky se rozpustí a zkontroluje se pH. Podle potřeby se provede alikvotace. Sterilizuje se 15 minut v autoklávu při teplotě 121 °C. Při provádění přímého PCR testu se doporučuje přidat 5 % polyvinylpyrrolidonu 40 000 MWT (PVP-40), aby se snížilo působení inhibice amplifikace aromatickými molekulami v extraktu. Při použití homogenizační metody pomocí Waring-Blender nebo Ultra-Turrax k maceraci výkrojků pletiva bramboru se doporučuje přidat deflokulační prostředek, prostředek proti tvorbě pěny nebo antioxidant. Lubrol vločky Antipěnidlo DC-Silikon Tetrapyrofosfát sodný 0,5 g/l 1,0 ml/l 1,0 g/l Autoklávuje se odděleně. Přidává se až do dosažení žádané koncentrace. Pele tový pu fr : 10 mM fosfátový pu fr , pH 7,2 Tento pufr se používá pro resuspendování a ředění pelet z pupkových částí bramborových hlíz. Na2HPO4·12H2O NaH2PO4·2H2O Destilovaná voda 2,7 g 0,4 g 1 l Látky se rozpustí a zkontroluje se pH. Podle potřeby se provede alikvotace. Sterilizuje se 15 minut v autoklávu při teplotě 121 °C. 400 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 Dodatek 3 Materiál pro IF test IF pu fr : 10 mM r oz toku ch lor i du sodn éh o pu fr ov a né ho fosfá te m (PSB ), pH 7, 2 Tento pufr se používá pro ředění antiséra. Na2HPO4·12H2O NaH2PO4·2H2O NaCl Destilovaná voda 2,7 g 0,4 g 8,0 g 1 l Látky se rozpustí a zkontroluje se pH. Podle potřeby se provede alikvotace. Sterilizuje se 15 minut v autoklávu při teplotě 121 °C. IF pu fr T w ee n Tento pufr se používá k omytí podložních sklíček. K IF pufru se přidá 0,1% Tween 20. 0, 1 M g ly c e ri n pu fr ov a ný f osfá te m, pH 7, 6 Tento pufr se používá ke zvýšení fluorescence jako krycí tekutina na okénkách IF podložního sklíčka. Na2HPO4·12H2O NaH2PO4·2H2O Glycerin Destilovaná voda 3,2 g 0,15 g 50 ml 100 ml 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 401 (1) (2) (3) (4) Dodatek 4 Stanovení stupně kontaminace v IF testu Plocha (S) jednoho okénka na podloním sklíčku s více okénky ¼ πD2 4 kde D = průměr okénka. Plocha (s) pole objektivu ¼ πd2 4 kde d = průměr pole objektivu. Průměr pole (d) se zjišťuje buď přímým měřením nebo z následujících vzorců: s ¼ πi2 G2K2 ×4 kde i = koeficient pole (závislý na typu okuláru a pohybuje se mezi 8 a 24), K = koeficient tubusu (1 nebo 1,25), G = (100násobné, 40násobné atd. ) zvětšení objektivu. Ze vzorce (2) r d ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃ 4s π Ze vzorce (3) v u u t d ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ 4 × πi2 G2K2 × 4 ¼ i GK π Zjistí se počet typických fluoreskujících buněk v jednom poli (c). Vypočte se počet typických fluoreskujících buněk v celém okénku (C). C ¼ c S s Vypočte se počet typických fluoreskujících buněk v 1 ml pelety (N). N ¼ C × 1000 × F y kde y = objem pelety na okénku podložního sklíčka F = zřeďovací faktor pelety 402 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 Dodatek 5 Materiál pro ELISA test D v o j n á s o b n ý u h l i č i t a n o v ý p o v l a k o v ý p u f r , p H 9 , 6 Na2CO3 NaHCO3 Destilovaná voda 6,36 g 11,72 g 1 l Látky se rozpustí a zkontroluje se pH. Podle potřeby se provede alikvotace. Sterilizuje se 15 minut v autoklávu při teplotě 121 °C. Pokud extrakt obsahuje vysoký podíl aromatických molekul, lze jako antioxidant přidat siřičitan sodný s konečnou koncentrací 0,2 %. D e s e t i n á s o b n ý r o z t o k c h l o r i d u s o l n é h o p u f r o v a n ý f o s f á t e m ( P S B ) , p H 7 , 4 NaCl KH2PO4 Na2HPO4·12H2O KCl Destilovaná voda 80 g 2 g 29 g 2 g 1 l Látky se rozpustí a zkontroluje se pH. Podle potřeby se provede alikvotace. Sterilizuje se 15 minut v autoklávu při teplotě 121 °C. R o z t o k c h l o r i d u s o d n é h o – T w e e n – p u f r o v a n ý f o s f o r e č n a n e m ( P B S - T ) 10 x PBS 10 % Tween 20 Destilovaná voda 100 ml 5 ml 895 ml B l o k a č n í ( a n t i l á t k o v ý ) p u f r ( m u s í s e p ř i p r a v i t č e r s t v ý ) 10 x PBS Polyvinylpyrrolidon 44 000 MWT (PVP-44) 10 % Tween 20 Sušené mléko Destilovaná voda 10 ml 2 g 0,5 g 0,5 g do l00 ml A l k a l i c k ý s u b s t r á t o v ý r o z t o k f o s f a t á z y , p H 9 , 8 Dietanolamin Destilovaná voda 97 ml 800 ml Promísí se a pH se upraví koncentrovanou HCl na 9,8. Doplní se destilovanou vodou na objem 1 litru. Přidá se 0,2 g MgCl2. Na každých 15 ml roztoku se rozpustí 2 tablety (5 mg) substrátové fosfatázy (Sigma). 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 403 Dodatek 6 Materiál pro PCR test S e k v e n c e o l i g o n u k l e o t i d o v ý c h p r i m e r ů Primer OLI 1 5’–GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC–3’ Primer Y2 Potřebné chemikálie viz Seal et al. , 1993. 5’–CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT–3’ Dodatek 7 Materiál pro test na selektivních živných médiích a obohacovací test Selektivní médium SMSA (Engelbrecht, 1994, modifikováno Elphinstonem et al. , 1996) Základní médium Kaseinový hydrolyzát (Difco) Bacto pepton (Difco) Glycerin Agar (Difco) Destilovaná voda 1 g 10 g 5 ml 15 g 1 l V baňce o objemu 1 litr se připraví 0,5 litru média. Látky se rozpustí a zkontroluje se pH. V případě potřeby se před autoklávováním upraví pH na 6,5. Ralstonia solana- cearum při pH > 7,0 neroste na médiu příliš dobře. Sterilizuje se 15 minut v autoklávu při teplotě 121 °C. Ochladí se na 50 °C. Pro docílení uvedených konečných koncentrací se přidají následující látky (všechny od firmy Sigma): Krystalová violeť Polymixin B sulfát Bacitracin (*) Chloramfenikol Penicilin G Tetrazoliové soli 5 mg/l 100 mg/l 25 mg/l 5 mg/l 0,5 mg/l 50 mg/l (cca 600 000 jednotek) (cca 1 250 jednotek) (cca 825 jednotek) Sigma P-1004 Sigma B-0125 Sigma C-3175 Sigma P-3032 Látky se rozpustí v 70 % ethanolu na koncentrace uvedené pro připravený objem média. Některé látky, jako např. poly- mixin a chloramfenikol, se musí mírně zahřát a protřepat. SMSA bujón (Elphinstone et al. , 1996) Příprava stejná jako pro selektivní médium SMSA, avšak bez agaru nebo tetrazoliových solí. Alikvóty 3 ml se plní do univerzálních jednorázových zkumavek o objemu 30 ml. (*) Látky se rozpustí v 70 % ethanolu na koncentrace uvedené pro připravený objem média. Některé látky, jako např. polymixin a chlo- ramfenikol, se musí mírně zahřát a protřepat. 404 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 Literatura Buddenhagen, I. W. ; Sequeira, L. and Kelman, A. , 1962. Description of races in Pseudomonas solanacearum. Phytopathology 52, 726. Cook, D. ; Elizabeth B. and Sequeira, L. , 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restrictionfragment length polymorphism with DNA probes that specify virulence and hypersensitive respons. Molecular Plant-Microbe Interactions 2, 113–121. Dinesen I. G. and DeBoer, S. H. , 1995. Extraction of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus from composite samples of potato tubers. American Potato Journal 72, 133–142. Elphinstone, J. G. ; Hennessy, J. ; Wilson, J. and Stead, D. E. , 1996. Sensitivity of different methods for the detection of Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26. Engelbrecht, M. C. , 1994. Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. ACIAR Bacterial Wilt Newsletter 10, 3 –5. Hayward, A. C. , 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27, 265–277. Hayward, A. C. , 1994. Systematic and phylogeny of Pseudomonas solanacearum and related bacteria. V: Bacterial Wilt: the disease and its causative agent, Pseudomonas solanacearum (eds. Hayward and G. L. Hartman) CAB International Oxford, 127–135. Janse, J. D. , 1988. A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. EPPO Bulletin 18, 343 –351. Janse, J. D. , 1991. Infra- and intraspecific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatty acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14, 335–345. Kelman, A. , 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 64, 293–695. Lelliot, R. A. and Stead, D. E. , 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. (T. F. Preece ed. ) Blackwell Scientific Publications, Oxford. 216 pp. Louws, F. J. ; Fulbright, D. W. ; Stephens, C. T. and De Bruijn, F. J. , 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85, 528–536. Lozano, J. C. and Sequeira, L. , 1970. Differentiation of races of Pseudomonas solanacearum by a leafinfiltra- tion technique. Phytopathology 60, 838. Mirza, M. S. ; Rademaker, J. W. L. ; Janse, J. D. and Akkermans, A. D. L. , 1993. Specific 16S ribosomal RNA targeted oligonucleotide probe against Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Canadian Journal of Microbiology 39, 1029–1034. Robinson-Smith, A. ; Jones, P. ; Elphinstone, J. G. and Forde, S. M. D. , 1995. Production of antibodies to Pseu- domonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67–79. Seal, S. E. ; Jackson, L. A. ; Young, J. P. W. and Daniels, M. J. , 1993. Differentiation of Pseudomonas solana- cearum, P. syzygii, P. picketti and the blood disease bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construc- tion of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. Journal of General Microbiology 139, 1587–1594. Smith, J. J. ; Offord, L. C. ; Holderness, M. and Saddler, G. S. , 1995. Genetic diversity of Burkholderia solana- cearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61, 4262–4268. Stead, D. E. , 1992a. Techniques for detecting and identifying plant pathogenic bacteria. V: Techniques for rapid detection of plant pathogens (eds. J. M. Duncan and L. Torrance). Blackwell Scientific Publications, Oxford, 76–111. Stead, D. E. , 1992b. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42, 281–295. Van Beuningen, A. ; Derks, H. and Janse, J. D. , 1995. Detection and identification of Clavibacter michiga- nensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in-situ hybridisation (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Züchtungsforschung 2, 266–269. 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 405 PŘÍLOHA III 1. Ve všech případech podezření z výskytu škodlivého organismu, kdy screeningový(é) test(y) provedený(é) na uvedeném rostlinném materiálu podle metody popsané v příloze II, a ve všech ostatních případech podle některé z úředně schválených metod, dopadl pozitivně a na potvrzení nebo vyvrácení výsledku uvedenou metodou se ještě čeká, by měl být následující materiál zajištěn a vhodnou formou uschován: — dle možností partie (z níž byl vzorek odebrán) nebo část této partie v původním balení s etiketou, — dle možností zbývající část vzorků, — zbylé extrakty a další materiál připravený pro screeningový test, jako např. podložní sklíčka pro imunofluores- cenční test, a — všechny příslušné podklady, dokud není výše uvedený postup zcela ukončen. 2. Při potvrzení výskytu škodlivého organismu by měl být následující materiál zajištěn a vhodnou formou uschován nejméně po dobu jednoho měsíce po oznamovacím řízení podle čl. 5 odst. 2: — materiál uvedený v bodu 1, — případně vzorek infikovaných rostlin rajčete nebo lilku vejcoplodého naočkovaný extraktem z hlíz nebo rostlin a — izolovaná kultura původce. 406 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 PŘÍLOHA IV Šetření uvedené v čl. 5 odst. 1 písm. a) bodu i) se v závažných případech vztahuje na tyto faktory: i) místa produkce, — na nichž se pěstují nebo pěstovaly brambory, které jsou klonově příbuzné s bramborami, které byly prohlášeny za napadené tímto organismem, — na nichž se pěstují nebo pěstovala rajčata, která vyrostla z téže partie osiva jako rajčata, která byla prohlášena za napadená tímto organismem, — na nichž se pěstují nebo pěstovaly brambory nebo rajčata, které byly pro podezření z výskytu tohoto organismu zařazeny pod úřední kontrolu, — na nichž se pěstují nebo pěstovaly brambory, které jsou klonově příbuzné s bramborami, které byly vypěstovány v místech produkce prohlášených za napadená tímto organismem, — na nichž se pěstují brambory nebo rajčata a která leží v sousedství zamořených míst produkce, včetně takových míst, na kterých se pracovní nářadí a zařízení používají společně buď přímo nebo přes společného smluvního partnera, — na nichž se k zavlažování nebo postřiku používá povrchová voda ze zdroje, který se ukázal jako kontaminovaný tímto organismem nebo u něhož existuje podezření z kontaminace tímto organismem, — na nichž se k zavlažování nebo postřiku používá povrchová voda ze zdroje, který se používá společně s místy produkce, která se ukázala jako kontaminovaná tímto organismem nebo u nichž existuje podezření z kontami- nace tímto organismem, — která jsou nebo byla zaplavena povrchovou vodou, která se ukázala jako kontaminovaná tímto organismem nebo u níž existuje podezření z kontaminace tímto organismem, a ii) povrchovou vodu, která slouží k zavlažování nebo postřiku polí či míst produkce, která se ukázala jako kontamino- vaná tímto organismem, nebo která byla touto vodou zaplavena. 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 407 1. Faktory, na které je třeba brát zřetel při stanovení rozsahu pravděpodobného napadení podle čl. 5 odst. 1 písm. a) bodu iii) a písm. c) bodu iii), v závažných případech zahrnují: PŘÍLOHA V — uvedený rostlinný materiál, který byl pěstován v místě produkce, které bylo podle čl. 5 odst. 1 písm. a) bodu ii) prohlášeno za napadené, — místa produkce s výrobně technickým spojením s uvedeným rostlinným materiálem, který byl podle čl. 5 odst. 1 písm. a) bodu ii) prohlášen za napadený, včetně takových míst, na kterých se pracovní nářadí a zařízení používají společně buď přímo nebo přes společného smluvního partnera, — uvedený rostlinný materiál, který byl pěstován na místech produkce uvedených v předchozí odrážce nebo byl na takových místech přítomen v době, ve které uvedený rostlinný materiál, který byl podle čl. 5 odst. 1 písm. a) bodu ii) prohlášen za napadený, byl přítomen na místě produkce uvedeném v první odrážce, — sklady, do nichž byl uvedený rostlinný materiál dopraven z výše uvedených míst produkce, — jakékoli stroje, dopravní prostředky, přepravní kontejnery, skladovací prostory nebo jejich části jakož i ostatní předměty, včetně obalového materiálu, které mohly přijít do styku s uvedeným rostlinným materiálem, který byl podle čl. 5 odst. 1 písm. a) bodu ii) prohlášen za napadený, — veškerý uvedený rostlinný materiál, který byl skladován v zařízeních nebo přišel do styku s předměty uvedenými v předchozí odrážce před jejich očistou nebo dezinfekcí, — jako výsledek šetření a testování podle čl. 5 odst. 1 písm. a) bodu i) v případě brambor ty hlízy nebo rostliny se sesterským nebo rodičovským klonovým vztahem k uvedenému rostlinnému materiálu, resp. v případě rajčat ty rostliny, které vyrostly ze stejného osiva jako uvedený rostlinný materiál, který byl podle čl. 5 odst. 1 písm. a) bodu ii) prohlášen za napadený, a u nichž, třebaže byly vyšetřeny na původce s negativním výsledkem, se napa- dení na základě klonové vazby jeví pravděpodobným, — místa produkce uvedeného rostlinného materiálu, vztahujícího se k předchozí odrážce, — místa produkce uvedeného rostlinného materiálu, která byla zavlažována nebo postřikována vodou, která byla podle čl. 5 odst. 1 písm. c) bodu ii) prohlášena za kontaminovanou, — uvedený rostlinný materiál, který byl vypěstován na polích, která byla zaplavena kontaminovanou povrchovou vodou. 2. Stanovení možného rozšíření podle čl. 5 odst. 1 písm. a) bodu iv) a písm. c) bodu iii) zahrnuje: i) v případech podle čl. 5 odst. 1 písm. a) bodu iv) zkoumání následujících aspektů: — blízkost k jiným místům produkce, na nichž se pěstuje uvedený rostlinný materiál, — společná produkce a použití partií sadbových brambor, — místa produkce, na nichž byla k zavlažování nebo k postřikování uvedeného rostlinného materiálu použita povrchová voda v případech, kdy hrozí nebo hrozilo nebezpečí odtoku povrchové vody nebo zaplavení z míst produkce, která byla podle čl. 5 odst. 1 písm. a) bodu ii) prohlášena za napadená; ii) v případech, kdy byla povrchová voda podle čl. 5 odst. 1 písm. c) bodu ii) prohlášena za kontaminovanou: — místa produkce, na nichž se uvedený rostlinný materiál pěstuje v bezprostřední blízkosti povrchové vody prohlášené za kontaminovanou nebo která by touto povrchovou vodou mohla být zaplavena, — každá samostatná zavlažovací nádrž, která má spojitost s povrchovou vodou prohlášenou za kontamino- vanou. 408 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 3. Podrobnosti oznámení podle čl. 5 odst. 2 zahrnují: — datum ohlášení podezření z výskytu organismu podle článku 4 a datum odběru vzorků, popřípadě potvrzení o přítomnosti organismu podle článku 5, — popis jednotlivých aspektů prohlášení o napadení a vymezení zóny. 4. Podrobnosti doplňkového oznámení podle čl. 5 odst. 2 druhého pododstavce zahrnují: — pro každou zásilku nebo partii brambor prohlášenou za napadenou osvědčení podle článku 7 nebo 8 směrnice 77/93/EHS, číslo rostlinolékařského pasu nebo registrační číslo producenta brambor, společného skladu či expe- dičního střediska, — pro každou zásilku nebo partii rostlin rajčat prohlášenou za napadenou osvědčení podle článku 7 nebo 8 směr- nice 77/93/EHS a číslo rostlinolékařského pasu podle seznamu v příloze V části A kapitole 1 bodu 2. 2 směrnice 77/93/EHS, — označení odrůdy a kategorie v případě porostů sadbových brambor, a dle možností ve všech ostatních přípa- dech, — veškeré další údaje o potvrzení ohniska, které si Komise případně vyžádá. 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 409 PŘÍLOHA VI 1. Opatření uvedená v čl. 6 odst. 1 jsou tato: — spálení, nebo — použití jako krmivo po tepelné úpravě, která vylučuje nebezpečí přežití tohoto organismu, nebo — hluboké zakopání na skládkách, odkud nehrozí nebezpečí prosáknutí na zemědělské půdy nebo kontaminace povrchové vody, která by mohla být použita k zavlažování zemědělských půd, nebo — průmyslové zpracování přímou neprodlenou dodávkou do zpracovatelského závodu s úředně schválenými zaříze- ními na odstraňování odpadů, která splňují ustanovení přílohy VII, nebo — jiná opatření, pokud prokazatelně nepředstavují žádné rozpoznatelné nebezpečí rozšiřování tohoto organismu; tato opatření musejí být neprodleně oznámena Komisi a ostatním členským státům. 2. Vhodné použití nebo likvidace uvedeného rostlinného materiálu podle čl. 6 odst. 2 pod dohledem příslušných úřed- ních subjektů dotyčného členského státu při jejich vzájemném informování za účelem zajištění kontroly v kterém- koliv okamžiku a se souhlasem příslušného úředního subjektu členského státu, v němž se brambory mají balit nebo zpracovávat, s ohledem na zařízení k odstraňování odpadů uvedená v první a druhé odrážce, zahrnuje: i) v případě hlíz bramboru: — jejich použití jako konzumních brambor určených ke spotřebě, balených v provozech vybavených vhodnými zařízeními k odstraňování odpadů do obalů pro přímou dodávku a použití, které nevyžadují změnu obalu, a určených pro takovou přímou dodávku a použití, nebo — jejich použití jako konzumních brambor určených k průmyslovému zpracování po přímé a okamžité dodávce do zpracovatelského závodu vybaveného vhodnými zařízeními k odstraňování odpadů, nebo — jiné použití nebo likvidaci, pokud prokazatelně nepředstavují žádné rozpoznatelné nebezpečí rozšiřování tohoto organismu a s výhradou souhlasu příslušných úředních subjektů; tato opatření musejí být neprodleně oznámena Komisi a ostatním členským státům; ii) v případě jiných částí rostlin včetně stonků a zbytků listů: — jejich zničení, nebo — jiné použití nebo likvidaci, pokud prokazatelně nepředstavují žádné rozpoznatelné nebezpečí rozšiřování tohoto organismu; tato opatření musejí být neprodleně oznámena Komisi a ostatním členským státům. 3. Vhodné metody dekontaminace předmětů uvedených v čl. 6 odst. 3 zahrnují očistu a případnou desinfekci tak, aby nehrozilo žádné rozpoznatelné nebezpečí rozšiřování tohoto organismu; tato opatření se provádějí pod dohledem příslušných úředních subjektů členských států. 4. Soubor opatření, uvedených v čl. 6 odst. 4, která přijmou členské státy v zóně vymezené podle čl. 5 odst. 1 písm. a) bodu iv) a písm. c) bodu iii), zahrnuje: 4. 1 V případech, kdy místa produkce byla podle čl. 5 odst. 1 písm. a) bodu ii) prohlášena za napadená: a) na poli nebo na jednotce s chráněnou produkcí plodin, které(á) bylo(a) prohlášeno(a) za napadené(ou) podle čl. 5 odst. 1 písm. a) bodu ii), buď: 410 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 i) v průběhu nejméně čtyř hospodářských let následujících po prohlášení místa produkce za napadené: — opatření k odstranění planě rostoucích rostlin bramboru a rajčete i ostatních hostitelských rostlin organismu, včetně plevelů z čeledi lilkovitých, a — zákaz pěstování: — hlíz a rostlin bramboru, — rostlin a osiva rajčete, — se zřetelem na biologii organismu: — jiných hostitelských rostlin, — rostlin rodu Brassica, u kterých prokazatelně existuje nebezpečí přežití tohoto organismu, — kultur, u kterých prokazatelně existuje nebezpečí rozšiřování tohoto organismu, — v prvním sklizňovém období brambor a rajčat, následujícím po období uvedeném v předchozí odrážce, a za podmínky, že pole bylo nejméně dva hospodářské roky po sobě před osázením shledáno prostým planě rostoucích rostlin bramboru a rajčete i ostatních hostitelských rostlin včetně plevelů z čeledi lilkovitých: — v případě brambor pěstování úředně certifikované sadby brambor výlučně pro produkci konzum- ních brambor a — provedení úředních průzkumů, včetně testování, podle čl. 2 odst. 1, — v sklizňovém období brambor a rajčat, následujícím po sklizňovém období uvedeném v předchozí odrážce a po příslušném rotačním cyklu, v případě brambor výsadbu úředně certifikované sadby pro produkci sadbových nebo konzumních brambor, a v případě brambor a rajčat provedení úředních průzkumů podle č. 2 odst. 1; nebo ii) v průběhu pěti hospodářských let následujících po prohlášení místa produkce za napadené: — opatření k odstranění planě rostoucích rostlin bramboru a rajčete i ostatních hostitelských rostlin organismu, včetně plevelů z čeledi lilkovitých, a — v prvních třech letech buď ponechání pole ladem nebo pěstování obilovin podle zjištěného rizika, anebo jeho využití jako stálé pastviny s častým nízkým sečením nebo intenzivní pastvou nebo pěsto- vání semenných porostů trav s následným pěstováním nehostitelských rostlin v dalších dvou letech, které prokazatelně nepředstavují žádné nebezpečí přežití nebo rozšiřování organismu, — v prvním sklizňovém období brambor a rajčat následujícím po období uvedeném v předchozí odrážce: — v případě brambor pěstování úředně certifikované sadby brambor pro produkci sadbových nebo konzumních brambor a provedení úředních průzkumů, včetně testování, podle čl. 2 odst. 1; b) na ostatních polích: — v hospodářském roce následujícím po prohlášení místa produkce za napadené: — zákaz pěstování hlíz nebo rostlin bramboru ani jiných hostitelských rostlin organismu a opatření k odstranění planě rostoucích rostlin bramboru a rajčete i ostatních hostitelských rostlin organismu, včetně plevelů z čeledi lilkovitých, nebo — v případě hlíz bramboru výsadbu úředně certifikované sadby brambor výlučně k produkci konzum- ních brambor, za předpokladu, že příslušným úředním subjektům bylo uspokojivě prokázáno, že bylo odstraněno nebezpečí spojené s planě rostoucími rostlinami bramboru a rajčete i z jiných hostitel- ských rostlin organismu, včetně plevelů z čeledi lilkovitých. Porost je v přiměřených lhůtách kontro- lován a planě rostoucí rostliny bramboru jsou testovány na přítomnost organismu; kromě toho jsou kontrolovány sklizené hlízy bramboru, 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 411 — v prvním hospodářském roce následujícím po hospodářském roce uvedeném v předchozí odrážce: — v případě brambor výlučně výsadbu úředně certifikované sadby brambor pro produkci buď sadbových nebo konzumních brambor, — v průběhu alespoň druhého hospodářského roku následujícího po hospodářském roce uvedeném v první odrážce: — v případě brambor výlučně výsadbu úředně certifikované sadby brambor nebo sadby brambor vy- pěstované pod úředním dohledem z úředně certifikované sadby brambor k produkci sadbových nebo konzumních brambor, — v každém z hospodářských roků uvedených v předchozích odrážkách opatření k odstranění planě rostoucích rostlin bramboru a rajčete i ostatních hostitelských rostlin organismu, včetně plevelů z čeledi lilkovitých, a provedení úředních průzkumů podle čl. 2 odst. 1; při pěstování sadby brambor k produkci sadbových brambor musí být provedeno vyšetření hlíz; c) neprodleně po prohlášení pole za napadené podle čl. 5 odst. 1 písm. a) bodu ii) a v každém z následujících hospodářských roků až do prvního povoleného sklizňového období brambor nebo rajčat včetně podle písmene a): — očištění a případně dezinfekci všech strojů a skladovacích zařízení v místě produkce, které byly použity při produkci brambor nebo rajčat, podle metod uvedených v bodu 3, — zavedení úředních kontrol zavlažovacích a postřikovacích programů, včetně zákazu těchto programů jako prevence proti rozšiřování organismu; d) na jednotce s chráněnou produkcí plodin, prohlášené za napadenou podle čl. 5 odst. 1 písm. a) bodu ii), u níž je možná úplná výměna pěstebního substrátu: — zákaz pěstování hlíz nebo rostlin bramboru ani jiných hostitelských rostlin, včetně rostlin a semen rajčete, ledaže dotyčná jednotka byla podrobena úředně kontrolovaným opatřením k odstranění orga- nismu a veškerého hostitelského rostlinného materiálu včetně alespoň úplné výměny pěstebního substrátu a vyčištění, popřípadě vydezinfikování výše uvedené jednotky a veškerého vybavení, a v návaznosti byla schválena pro produkci brambor nebo rajčat příslušnými úředními subjekty a — v případě produkce brambor použití úředně certifikované sadby brambor, minihlíz nebo mikrorostlin získaných z testovaných zdrojů, — zavedení úředních kontrol zavlažovacích a postřikových programů, včetně zákazu těchto programů jako prevence proti rozšiřování organismu. 4. 2 Bez dotčení opatření uvedených v bodu 4. 1 členské státy ve vymezené zóně: a) neprodleně po prohlášení o napadení po dobu nejméně tří hospodářských let: aa) v případech, kdy zóna byla vymezena podle čl. 5 odst. 1 písm. a) bodu iv): — zajistí dohled příslušných úředních subjektů nad zařízeními, ve kterých se pěstují nebo skladují bram- borové hlízy či rajčata nebo se s nimi manipuluje, jakož i nad prostorami, které smluvně poskytují stroje používané k produkci brambor a rajčat, — vyžadují vyčištění a případně dezinfekci strojů a skladů v těchto prostorách podle vhodných metod uvedených v bodu 3, 412 CS Úřední věstník Evropské unie 03/sv. 23 — vyžadují, aby v této zóně byla pro všechny kultury brambor používána výlučně certifikovaná sadba nebo sadba vypěstovaná pod úředním dohledem a aby sadbové brambory, které byly vypěstovány v místech produkce zařazených jako pravděpodobně napadená podle čl. 5 odst. 1 písm. a) bodu iii), byly po sklizni vyšetřeny, — vyžadují oddělené nakládání se sklizenými sadbovými bramborami a s konzumními bramborami ve všech podnicích v rámci této zóny, — provádí úřední průzkumy podle čl. 2 odst. 1; ab) v případech, kdy povrchová voda je prohlášena za kontaminovanou podle čl. 5 odst. 1 písm. c) bodu ii) nebo je považována za jeden ze zdrojů možného rozšiřování organismu podle přílohy V bodu 2: — provádí ve vhodných termínech každoroční šetření, včetně odběru vzorků povrchové vody a případ- ných hostitelských rostlin z čeledi lilkovitých v dotyčných vodních zdrojích, a testování: — uvedeného rostlinného materiálu podle příslušné metody popsané v příloze II, nebo — v ostatních případech podle jiné úředně schválené metody; — zavedou úřední kontroly zavlažovacích a postřikových programů, včetně zákazu používání vody prohlášené za kontaminovanou k zavlažování a postřiku uvedeného rostlinného materiálu a pří- padně jiných hostitelských rostlin, aby zabránily rozšiřování organismu. Tento zákaz může být na základě výsledků uvedeného každoročního šetření přezkoumán, — při kontaminaci odpadních vod zavedou úřední kontroly likvidace odpadů z průmyslových zařízení pro zpracování nebo z balíren, které nakládají s uvedeným rostlinným materiálem; b) vypracují v případě potřeby program k obnově veškerých porostů sadbových brambor na přiměřené časové období. 03/sv. 23 CS Úřední věstník Evropské unie 413 PŘÍLOHA VII Úředně schválená zařízení k odstraňování odpadů uvedená v příloze VI bodu 1 čtvrté odrážce musí splňovat níže uvedené podmínky, aby se vyloučilo nebezpečí rozšiřování organismu: i) odpad ze zpracování brambor a rajčat (včetně bramborových slupek, odpadních brambor a rajčat), jakož i jiný tuhý odpad z brambor a rajčat, se likvidují takto: — hlubokým zakopáním na skládkách, odkud nehrozí nebezpečí prosáknutí na zemědělské půdy nebo kontaktu s povrchovou vodou, která by mohla být použita k zavlažování zemědělských půd. Odpad je dopraven přímo na skládku za takových podmínek izolace, aby nehrozilo žádné nebezpečí ztráty odpadů, nebo — spálením; ii) odpadní vody: před dalším použitím se odpadní vody, které obsahují suspendované pevné látky, za účelem odstranění těchto látek přefiltrují nebo odkalí v usazovacích nádržích. Tyto pevné látky se likvidují podle bodu i). Následně se odpadní vody: — před dalším použitím zahřejí na teplotu nejméně 70 °C po dobu alespoň 30 minut, nebo — ošetří jiným úředně povoleným a kontrolovaným způsobem, při kterém nehrozí nebezpečí, že by odpad přišel do styku se zemědělskými půdami nebo vodními zdroji, které by mohly být použity k zavlažování zemědělských půd. Podrobnosti tohoto způsobu se oznamují ostatním členským státům a Komisi