title: Nõukogu direktiiv 98/57/EÜ, 20. juuli 1998, haigusetekitaja Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. kontrolli kohta

eurovoc_concepts:
food inspection
fruit vegetable
plant disease
plant health control
potato
protection of plant life

text: 03/23. kd ET Euroopa Liidu Teataja 31998L0057 21. 8. 1998 EUROOPA ÜHENDUSTE TEATAJA NÕUKOGU DIREKTIIV 98/57/EÜ, 20. juuli 1998, haigusetekitaja Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. kontrolli kohta 375 L 235/1 EUROOPA LIIDU NÕUKOGU, võttes arvesse Euroopa Ühenduse asutamislepingut, eriti selle artiklit 43, üks kartulile ja tomatile kahjulikke organisme on Ralstonia sola- nacearum (Smith) Yabuuchi et al. , mis on kartuli bakter-pruun- mädaniku ning kartulite ja tomatite bakteriaalse närbumise nakkusetekitaja; selle nakkusetekitaja tekitatud haiguspuhanguid on esinenud mõnes ühenduse osas ning siiani eksisteerib mõni nakkusallikas; võttes arvesse komisjoni ettepanekut, (1) võttes arvesse Euroopa Parlamendi arvamust, (2) võttes arvesse majandus- ja sotsiaalkomitee arvamust (3) ning arvestades, et: kahjulik organism Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. oli varem tuntud nime all Pseudomonas solanacearum (Smith) et al. Smith; nimi Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi muutub tõenäoliselt nimetatud kahjuliku organismi üldtunnus- tatud nimeks; käesolevas direktiivis tuleks seda teaduslikku arengut arvesse võtta; kartuli- ja tomatikasvatusel on ühenduse põllumajanduses oluline koht; kahjulikud organismid ohustavad pidevalt kartuli ja tomati saagikust; kartuli- ja tomatikasvatuse kaitsmine selliste kahjulike organis- mide eest peaks lisaks tootmismahu säilitamisele suurendama põllumajanduse tootlikkust; liikmesriigi territooriumile kahjulike organismide sissetoomise vastu võetavatel kaitsemeetmetel on üksnes piiratud mõju, kui selliste organismide vastu ei võidelda samal ajal ja metoodiliselt kogu ühenduses ega hoita ära nende levimist; (1) EÜT C 124, 21. 4. 1997, lk 12 ja EÜT C 108, 7. 4. 1998, lk 85. (2) EÜT C 14, 19. 1. 1998, lk 34. (3) EÜT C 206, 7. 7. 1997, lk 57. kogu ühenduses on kartuli- ja tomatikasvatuse jaoks märkimis- väärne oht, kui nende kultuuride puhul ei võeta tõhusaid meet- meid kõnealuse kahjuliku organismi asukoha ja leviku määra- miseks, haigusjuhtude ja leviku vältimiseks ning, kui haigus avastatakse, haiguse leviku takistamiseks ja tõrjeks haiguse likvi- deerimise eesmärgil; selle tagamiseks tuleb kogu ühenduses võtta teatavaid meet- meid; lisaks peavad liikmesriigid olema valmis võtma vajaduse korral lisameetmeid või rangemaid meetmeid, tingimusel et see ei takista kartulite või tomatite liikumist ühenduse piires, välja arvatud nõukogu 21. detsembri 1976. aasta direktiivis 77/93/EMÜ (taimedele või taimsetele saadustele kahjulike orga- nismide ühendusse sissetoomise ja seal levimise vastu võetavate kaitsemeetmete kohta) (4) sätestatud ulatuses; sellistest meetme- test tuleb teatada teistele liikmesriikidele ja komisjonile; meetmete puhul tuleb arvesse võtta, et haigusetekitaja asukoha määramiseks on vaja teha korrapäraseid ametlikke uuringuid; sellised uuringud peaksid hõlmama kontrollimenetlust ja vaja- duse korral ka proovivõtu- ja katsemeetodeid, sest teatavate keskkonnatingimuste juures võib haigus olla varjatud ja märka- matu nii kasvavatel kartulitaimedel kui ladustatud kartulimugu- latel; haigusetekitaja levik kasvavate kultuuride hulgas ei ole kõige olulisem tegur, kuid haigusetekitaja võib levida pinnavee ja teatavate taimede kaudu ning seetõttu on kartuli- ja tomatitaimede niisutamine nakatunud veega sellistele põllukultuuridele ohtlik; haigusetekitaja võib püsida üle talve isekülvanud kartuli- ja tomatitaimedes ning see võib olla nakkusallikas ühest hooajast järgmisse; haigusetekitaja levib ka kartulite kokkupuutel nakatunud kartulitega ning naka- tunud kartulitega kokku puutunud istutus-, koristus- ja käitle- misvahendite või transpordi- ja ladustusmahutitega; looduslike maavitsaliste (4) EÜT L 26, 31. 1. 1977, lk 20. Direktiivi on viimati muudetud komis- joni direktiiviga 98/2/EÜ (EÜT L 15, 21. 1. 1998, lk 34). 376 ET Euroopa Liidu Teataja 03/23. kd haigusetekitaja levikut saab vähendada või vältida selliste esemete nakkusest puhastamise teel; seemnekartuli selline saas- tamine on peamine oht haigusetekitaja levikul; samuti on seem- nekartuli varjatud nakatumine oluline nakkusetekitaja leviku oht ning seda on võimalik vältida, kasutades ametlikult tunnus- tatud programmi raames toodetud seemnekartulit, mida on kontrollitud ja mis on haigusest vabaks tunnistatud; praegused teadmised organismi Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. bioloogiast ja epidemioloogiast on Euroopa tingimustes ebatäielikud ning eeldatakse, et ettepandud meet- mete läbivaatamine on vajalik mitmel hooajal; samuti eelda- takse katsemenetluse parandamist edasiste uuringute põhjal, eriti katsemeetodite tundlikkuse ja spetsiifilisuse puhul, et valida ja standardida optimaalseid võimalikke katsemeetodeid; selliste üldmeetmete üksikasjade kindlaksmääramiseks ning haigusetekitaja leviku vältimiseks oma territooriumil liikmesrii- kide poolt võetavate rangemate või täiendavate meetmete jaoks on soovitav, et liikmesriigid teevad komisjoniga tihedat koos- tööd alalise taimetervise komitee (edaspidi “komitee”) raames, Artikkel 2 Liikmesriigid viivad igal aastal leidmiseks muust materjalist kui läbi korrapäraseid amet- 1. likke uuringuid organismi leidmiseks oma territooriumilt pärit loetletud taimses materjalis. Teiste võimalike saasteallikate määratlemiseks, mis ohustavad loetletud taimse materjali toot- mist, teevad liikmesriigid riskianalüüsi ning, välja arvatud juhul, leviku ohtu, kui analüüsiga ei ole kindlaks tehtud organismi viivad loetletud taimse materjali tootmise aladel läbi ametliku sihtuuringu organismi loet- letud taimsest materjalist, sealhulgas looduslikest maavitsalistest peremeestaimedest, samuti pinnaveest, mida kasutatakse loet- letud taimse materjali niisutamiseks või sellele pihustamiseks, ning vedeljäätmetest, mis väljutatakse loetletud taimset materjali käitlevatest tööstuslikest töötlemis- või pakendamiskohtadest ja mida kasutatakse loetletud taimse materjali kastmiseks või sellele niisutamiseks. Sellise sihtuuringu ulatus määratakse kind- laks vastavalt identifitseeritud ohule. Liikmesriigid võivad teha ka ametlikke uuringuid organismi leidmiseks sellisest materjalist nagu kasvusubstraat, muld ja tööstuslikest töötlemis- või paken- damiskohtadest tulevad tahked jäätmed. 2. Lõikes 1 osutatud ametlik uuring viiakse läbi: ON VASTU VÕTNUD KÄESOLEVA DIREKTIIVI: a) loetletud taimsel materjalil kooskõlas I lisa II jao punktis 1 sätestatud üksikasjadega; ja Artikkel 1 b) muudel peremeestaimedel kui loetletud taimne materjal ning veel, sealhulgas vedelatel jäätmetel, vastavalt asjakohastele meetoditele ning vajaduse korral võetakse proovid, millega tehakse ametlikke või ametliku järelevalve all laborikatseid; võtma organismi Ralstonia Käesolevas direktiivis käsitletakse meetmeid, mida liikmesriigid peavad solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. vastu, varem tuntud kui Pseudomonas solana- cearum (Smith) Smith (edaspidi “organism”), et seoses I lisa 1. jaos loetletud organismi peremeestaimedega (edaspidi “loet- letud taimne materjal”): a) määrata selle asukoht ja levik; b) vältida selle esinemist ja levikut; ning c) haiguse avastamise korral vältida selle levikut ja tõrjuda haigust likvideerimise eesmärgil. c) vajaduse korral muul materjalil vastavalt asjakohastele meetoditele. Nende uuringute jaoks määravad vastutavad ametiasutused direktiivis 77/93/EMÜ määratletud tähenduses kontrollimenet- luse edasised üksikasjad ning proovide arvu, päritolu, stratifit- seerimise ja võtmise aja, võttes arvesse usaldusväärseid teadus- likke ja statistilisi põhimõtteid ja organismi bioloogiat ning arvestades loetletud taimse materjali ja vajaduse korral orga- nismi muude peremeestaimede konkreetseid tootmissüsteeme asjaomases liikmesriigis. 03/23. kd ET Euroopa Liidu Teataja 377 Lõikes 1 osutatud ametlike uuringute üksikasjadest ja tule- 3. mustest teavitatakse igal aastal teisi liikmesriike ja komisjoni vastavalt I lisa II jao punkti 2 sätetele. Need teated esitatakse juuniks, välja arvatud oma ettevõttes seemnekartulina kasu- 1. tatavaid esitatakse 1. septembriks. Saaki käsitlevad üksikasjad ja saagi kohta saadud tulemused esitatakse eelmise aasta toodangu kohta. Selliste teadete üksikasjad võib esitada komisjonile. teated, mis käsitlevad kartuleid Direktiivi 77/93/EMÜ artiklis 16a 4. võetakse vastu järgmine säte: sätestatud korras — lõike 2 esimese lõigu punktis b sätestatud uuringute ja labo- ratoorse kontrolli asjakohased meetodid. Direktiivi 77/93/EMÜ artiklis 16a sätestatud korras võib 5. vastu võtta järgmised sätted: — lõike 2 esimese lõigu punktis c sätestatud uuringute asja- kohased meetodid, — lõike 2 teises lõigus sätestatud uuringute täpsemad üksik- asjad, et tagada võrreldav kindlusaste liikmesriikides. Artikkel 3 a) keelavad liikmesriikide vastutavad ametiasutused kõikidest saakidest, partiidest või saadetistest, kust proovid on võetud, pärit taimede ja mugulate liikumise, välja arvatud nende kontrolli all ja tingimusel, et on tehtud kindlaks organismi leviku identifitseeritava ohu puudumine; b) võtavad liikmesriikide vastutavad ametiasutused meetmeid kahtlustatava haiguse esinemise päritolu tuvastamiseks; c) kehtestavad liikmesriikide vastutavad ametiasutused asja- kohased täiendavad ettevaatusabinõud vastavalt hinnatava ohu tasemele, eelkõige seoses loetletud taimse materjali toot- misega ja muude kui selliste punktis a osutatud seemnekar- tulipartiide liikumisega, mis on toodetud tootmiskohas, kust punktis a osutatud proovid on võetud, et vältida organismi levikut. Nendel haiguse esinemise kahtluse juhtudel, kus on loet- 3. letud taimse materjali või pinnavee saastumise oht teisest liik- mesriigist või teise liikmesriiki, peab liikmesriik, kus on teatatud haiguse esinemise kahtlusest, teatama viivitamata vastavalt iden- tifitseeritud ohule kõnealuse esinemise kahtluse üksikasjad teis- tele asjaomastele liikmesriikidele ning need liikmesriigid teevad asjakohast koostööd. Liikmesriigid, keda on teavitatud, kehtes- tavad ettevaatusabinõud vastavalt lõike 2 punktile c ning võtavad vastavalt vajadusele täiendavaid meetmeid vastavalt lõigetele 1 ja 2. Liikmesriigid tagavad, et organismi esinemise kahtlusest või kinnitusest nende territooriumil teatatakse nende vastutavatele ametiasutustele. Direktiivi 77/93/EMÜ artiklis 16a 4. võetakse vastu järgmine säte: sätestatud korras — lõike 2 punktis c osutatud meetmed. Artikkel 4 1. Haiguse esinemise kahtluse korral tagavad asjaomase liik- mesriigi või asjaomaste liikmesriikide vastutavad ametiasutused, et viiakse läbi ametlikud või ametliku järelevalve all tehtud laboratoorsed katsed, kasutades loetletud taimse materjali puhul II lisa lisas sätestatud asjakohast meetodit ning vastavalt III punktis 1 määratletud tingimustele, ning kõikidel muudel juhtudel mis tahes muud ametlikult heakskiidetud meetodit, et kinnitada või lükata ümber haiguse esinemise kahtlus. Kinnita- mise korral kohaldatakse III lisa punktis 2 sätestatud nõudeid. Kuni haiguse esinemise kahtluse kinnitamiseni või ümber- 2. lükkamiseni lõike 1 alusel sellistel esinemise kahtluste juhtudel, kus: Artikkel 5 Kui ametlik või ametliku järelevalve all tehtud labora- 1. toorne katse, kasutades loetletud taimse materjali puhul II lisas sätestatud meetodit või muudel juhtudel mis tahes muud amet- likult heakskiidetud meetodit, kinnitab organismi olemasolu vastavalt käesolevale direktiivile võetud proovis, siis liikmesriigi vastutavad ametiasutused, võttes arvesse usaldusväärseid teadus- likke põhimõtteid, organismi bioloogiat ning asjakohaseid orga- nismi peremeestaimede tootmis-, turustamis- ja töötlemissüs- teeme selles liikmesriigis: i) on nähtud organismi põhjustatud haiguse sümptomeid ning saadud II lisa I jao punktis 1 ja II jaos määratletud kiirmeeto- di(te) positiivne tulemus; või a) loetletud taimse materjali korral: ii) on saadud II lisa I jao punktis 2 ja III jaos määratletud meetodi(te) positiivne tulemus, siis seoses oma toodanguga: i) viivad läbi uurimise, et määrata kindlaks saastumise ulatus ja esmane allikas või esmased allikad vastavalt IV lisa sätetele koos täiendavate katsetega vastavalt artikli 4 lõikele 1 vähemalt kõikide samast kloonist pärit seemne- kartuli varudega, ning 378 ET Euroopa Liidu Teataja 03/23. kd laevad, ii) tunnistavad saastunuks loetletud taimse materjali, saade- tise ja/või partii, kust proov on võetud, ning seadmed, sõidukid, laod või nende osad ning mis tahes muud objektid, sealhulgas pakkematerjali, mis on olnud kontaktis loetletud taimse materjaliga, kust proov on võetud; tunnistavad saastunuks vajaduse korral põllu(d), kasvuhoone osa(d) loetletud taimne materjal on koristatud ja kust proov on võetud; ning kasvuperioodil võetud proovide puhul tunnistavad saastunuks põllu(d), tootmiskoha(d) ja vajaduse korral kasvuhoone osa(d), kust proov on võetud, ning ja tootmiskoha(d), kust iii) määravad kindlaks, võttes arvesse V lisa punkti 1 sätteid, tõenäolise saaste ulatuse koristamisele eelneva või järg- neva kontakti kaudu või tootmise, niisutamise või pihus- tamise kaudu või seoses saastunuks tunnistatud taime- dega samast kloonist pärinemisega, ning iv) piiritlevad tsooni punkti iii alusel ii alusel saastunuks tunnista- tõenäolise saastamise ulatuse mise, punkti määramise ja organismi võimaliku leviku põhjal vasta- valt V lisa punkti 2 alapunkti i sätetele; iii) määravad kindlaks tõenäolise saastumise ja piiritlevad tsooni punkti ii alusel saastunuks tunnistamise põhjal ning organismi võimaliku leviku, võttes arvesse V lisa punkti 1 ja punkti 2 alapunkti ii sätteid. Liikmesriigid teavitavad viivitamata teisi liikmesriike ja 2. komisjoni vastavalt V lisa punkti 3 sätetele mis tahes saastumi- sest, mis on kindlaks määratud vastavalt lõike 1 punkti a alapunktile ii ja lõike 1 punkti c alapunktile ii, ning piiritletud tsooni üksikasjadest vastavalt vajadusele kas lõike 1 punkti a alapunkti iv või lõike 1 punkti c alapunkti iii alusel. Käesoleva lõike alusel edastatud teate üksikasjad võib edastada komiteele. Liikmesriigid edastavad samal ajal komisjonile V lisa punktis 4 sätestatud täiendava teate. Käesoleva lõigu alusel edastatud teate üksikasjad edastatakse viivitamata komitee liikmetele. 3. Lõike 2 alusel saadetud teate ning selles nimetatud üksik- asjade põhjal korraldavad teised teates nimetatud liikmesriigid vastavalt lõike 1 punkti a alapunktile i uurimise ning võtavad vajaduse korral täiendavaid meetmeid vastavalt lõigetele 1 ja 2. b) muude kui punktis a nimetatud peremeestaimede saagi korral, kui on loetletud taimse materjali tootmise identifit- seeritav oht: i) viivad läbi uurimise vastavalt punkti a alapunktile i, ja Artikkel 6 ii) tunnistavad saastunuks organismi peremeestaimed, kust proov on võetud, ja iii) määravad kindlaks tõenäolise saastumise ja piiritlevad ja iv seoses tsooni vastavalt punkti a alapunktidele iii loetletud taimse materjali tootmisega; 1. Liikmesriigid näevad ette, et artikli 5 lõike 1 punkti a ala- punkti ii alusel saastunuks tunnistatud taimset materjali ei või ja istutada ning nende vastutavate ametiasutuste kontrolli all heakskiidul kohaldatakse selle suhtes ühte VI lisa punkti 1 sätet, et tagada organismi leviku identifitseeritavaohu puudumine. c) pinnavee korral (sealhulgas loetletud taimset materjali käitle- vast tööstusliku töötlemise või pakendamise kohast pärit vedelate jäätmete korral) ning seotud looduslike maavitsa- liste peremeestaimede korral, kui esineb loetletud taimse identifitseeritav oht niisutamise, pihustamise või materjali pinnavee üleujutamise kaudu: 2. Liikmesriigid näevad ette, et loetletud taimset materjali, mis on artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iii ja punkti c ala- punkti iii kohaselt tõenäoliselt saastunud, sealhulgas taimset materjali, mille puhul on identifitseeritud oht, ning mis on toodetud artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iii alusel tõenäoli- selt saastunuks tunnistatud tootmiskohtades, ei või istutada ning see tuleb vastutavate ametiasutuste kontrolli all asjakoha- selt kasutada või hävitada vastavalt VI lisa punktile 2, nii et on tagatud organismi leviku identifitseeritava ohu puudumine. i) viivad läbi pinnavee ja looduslike maavitsaliste pere- meestaimede, kui need on olemas, proovide uurimise, mis hõlmab ametlikku uuringut asjakohastel aegadel, et määrata saastumise ulatus, ja ii) tunnistavad vajalikus ulatuses ja punkti i alusel tehtud uurimise põhjal saastunuks pinnavee, kust proov(id) on võetud, ja ii alusel Liikmesriigid näevad ette, et mis tahes seadmed, sõidukid, 3. laevad, laod või nende osad ning mis tahes muud objektid, seal- hulgas pakkematerjal, mis on artikli 5 lõike 1 punkti a ala- punkti tunnistatud saastunuks või mille kohta on määratud kindlaks, et need on artikli 5 lõike 1 punkti a ala- punkti iii ja punkti c alapunkti iii alusel tõenäoliselt saastunud, hävitatakse või puhastatakse saastatusest, kasutades VI lisa punktis 3 määratletud asjakohaseid meetodeid. Pärast saastatu- sest puhastamist ei käsitata neid objekte enam saastununa. 03/23. kd ET Euroopa Liidu Teataja 379 4. Ilma et see piiraks lõigete 1, 2 ja 3 alusel rakendatud meetmeid, näevad liikmesriigid ette, et artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iv ja punkti c alapunkti iii alusel piiritletud tsoonis rakendatakse VI lisa punktides 4. 1 ja 4. 2 määratletud meet- meid. Nende meetmete üksikasjad teatatakse igal aastal teistele liikmesriikidele ja komisjonile. Selle teatamise üksikasjad võib esitada komisjonile. Artikkel 9 Ilma et see piiraks direktiivi 77/93/EMÜ sätete kohaldamist, võivad liikmesriigid direktiivis 95/44/EÜ (1) sätestatud korras lubada erandeid käesoleva direktiivi artiklites 6 ja 8 osutatud meetmetest katsete ja teaduslike eesmärkide puhul ning sordiva- likualase töö puhul. Artikkel 7 Artikkel 10 Liikmesriigid näevad ette, et seemnekartul peab vastama 1. direktiivi 77/93/EMÜ nõuetele ning olema pärit otse ametlikult kinnitatud programmi alusel saadud materjalist, mille kohta on II lisas sätestatud meetodit kasutades ametlike või ametliku järe- levalve all tehtud katsete käigus leitud, et see on organismist vaba. Eespool nimetatud katsed viib läbi liikmesriik: a) juhtudel, kui selle riigi seemnekartuli toodangus on kinni- tatud organismi olemasolu; i) b) tehes katseid varasema paljundusmaterjaliga, seal- hulgas esmase kloonaretusega, ning tehes süstemaatilisi katseid eliitseemnekartuli kloonidega, või ii) juhtudel, kui on tehtud kindlaks, et taimed ei ole pärit samast kloonist, tehes katseid kõikide eliitseemnekartuli kloonidega või varasema paljundusmaterjaliga, sealhulgas esmane kloonaretus; ning b) muudel juhtudel, kas eliitseemnekartuli esmase kloonaretuse iga taimega või esindavate proovidega või varasema paljun- dusmaterjaliga. Direktiivi 77/93/EMÜ artiklis 16a sätestatud korras võib 2. vastu võtta järgmised meetmed: — lõike 1 teise lõigu punkti a üksikasjalikud rakendusees- kirjad, — lõike 1 teise lõigu punktis b sätestatud esindavaid proove käsitlevad eeskirjad. Liikmesriigid võivad seoses oma toodanguga vastu võtta selli- seid lisameetmeid või rangemaid meetmeid, mis on vajalikud organismiga võitlemiseks või selle leviku vältimiseks niivõrd, kuivõrd need on kooskõlas direktiivi 77/93/EMÜ sätetega. Nende meetmete üksikasjad teatatakse teistele liikmesriikidele ja komisjonile. Selle teate üksikasjad võib esitada komisjonile. Artikkel 11 Käesoleva direktiivi lisade muudatused, mis tehakse teaduse ja tehnika arengut silmas pidades, võetakse vastu direktiivi 77/93/EMÜ artiklis 16a sätestatud korras. Käesoleva direktiivi II lisas sätestatud meetodite ja VI lisa lõigetes 4. 1 ja 4. 2 sätestatud meetmete korral koostab komisjon aruande, milles ta vaatab need meetodid ja meetmed üle saadud kogemustest lähtudes, ning see aruanne esitatakse komiteele enne 1. jaanuari 2002. Artikkel 12 Liikmesriigid jõustavad käesoleva direktiivi 1. järgimiseks vajalikud õigusnormid 21. augustil 1999. Liikmesriigid teatavad neist viivitamata komisjonile. liikmesriigid need meetmed vastu võtavad, lisavad nad Kui meetmetesse või meetmete ametliku avaldamise korral nende juurde viite käesolevale direktiivile. Sellise viitamise viisi näevad ette liikmesriigid. Artikkel 8 2. Liikmesriigid edastavad viivitamata komisjonile käesoleva direktiiviga reguleeritavas valdkonnas vastuvõetud siseriiklike põhiliste õigusnormide teksti. Komisjon teavitab sellest teisi liik- mesriike. Liikmesriigid keelavad organismi hoidmise ja käitlemise. (1) EÜT L 184, 3. 8. 1995, lk 34. Direktiivi on viimati muudetud komis- joni direktiiviga 97/46/EÜ (EÜT L 204, 31. 7. 1997, lk 43). 380 ET Euroopa Liidu Teataja 03/23. kd Artikkel 13 Brüssel, 20. juuli 1998 Käesolev direktiiv jõustub Euroopa Ühenduste Teatajas avaldamise päeval. Artikkel 14 Käesolev direktiiv on adresseeritud liikmesriikidele. Nõukogu nimel eesistuja W. MOLTERER 03/23. kd ET Euroopa Liidu Teataja 381 I LISA I JAGU Bakteri Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. peremeestaimede loetelu, millele on osutatud artiklis 1 Taimed (k. a mugulad), v. a botaanilised seemned, perekonnast Solanum tuberosum L. Taimed, v. a viljad ja seemned, perekonnast Lycopersicon lycopersicum (L. ) Karsten ex Farw. Kartul Tomat II JAGU Uuringud 1. Artikli 2 lõike 2 punktis a osutatud ametlikud uuringud peavad põhinema organismi bioloogilistel omadustel ja asjaomase liikmesriigi konkreetsetel tootmissüsteemidel ning peavad hõlmama: i) kartuli puhul: — kasvava kultuuri visuaalset kontrolli asjakohasel ajal ja/või proovide võtmist nii seemne- kui teistest kartuli- test kasvuperioodil või laos. Ametliku kontrolli käigus tuleb läbi viia materjali visuaalne kontroll, poolitades mugulaid, ning — seemnekartuli puhul ja vajadusel ka teiste kartulite puhul ametlikke või ametliku järelevalve all tehtud labo- ratoorseid katseid, kasutades II lisas esitatud meetodeid; ii) tomati puhul: — kasvava kultuuri visuaalset kontrolli asjakohasel ajal ning vähemalt nendel taimedel, mis on ette nähtud ümberistutamiseks nende ametialase kasvatamise eesmärgil. 2. Artikli 2 lõikes 3 osutatud ametlike uuringute aruanne peab sisaldama: i) kartulite uuringute puhul: — seemne- ja muu kartuli kasvatamiseks arvestatud kogupindala hektarites, — eristamist seemne- ja söögikartuliks ja vajaduse korral kasvatuspiirkonna järgi, — kontrollimiseks võetud proovide arvu ja aega, — põllul tehtud visuaalsete kontrollide arvu, — mugulate visuaalsete kontrollide arvu (ja proovi suurusi); ii) ametialase kasvatamise jaoks ümberistutamiseks ettenähtud tomatitaimede uuringute puhul: — taimede hinnangulist koguarvu, — visuaalsete kontrollide arvu; iii) muude peremeestaimede kui kartuli ja tomati, sh maavitsaliste sugukonna metsikute peremeestaimede uurin- gute puhul: — liiki, — võetud proovide arvu ja aega, — vastavalt vajadusele piirkonda või jõge, kust proov on võetud, — analüüsimeetodit; iv) tööstusliku töötlemise või pakendamise koha vee ja vedelate jäätmete uuringute puhul: — proovide arvu ja aega, — vastavalt vajadusele piirkonda või jõge või asukohta, kust proov on võetud, — analüüsimeetodit. 382 ET Euroopa Liidu Teataja 03/23. kd II LISA HAIGUSETEKITAJA RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. DIAGNOOSIMISE, AVAS- TAMISE JA IDENTIFITSEERIMISE MÄÄRAMISMETOODIKA Käesoleva metoodikaga kirjeldatakse eri menetlusi, mis on seotud: MÄÄRAMISMETOODIKA RAKENDUSALA i) bakter-pruunmädaniku diagnoosimisega kartulimugulates ja bakteriaalse närbumise diagnoosimisega kartuli- ja toma- titaimedes; ii) haigusetekitaja Ralstonia solanacearum avastamisega kartulimugulates; iii) haigusetekitaja Ralstonia solanacearum identifitseerimisega. Liidetes on esitatud üksikasjalikud kirjeldused katsematerjali (kasvusöötmete, puhvrite, lahuste, reaktiivide) ettevalmista- miseks. SISUKORD I JAGU Määramismetoodika rakendamine 1. Bakter-pruunmädaniku diagnoosimine kartulimugulates ja bakteriaalse närbumise diagnoosi- mine kartuli- ja tomatitaimedes. 2. Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum avastamine ja identifitseerimine kartulimugulates. II JAGU Bakter-pruunmädaniku diagnoosimine kartulimugulates ja bakteriaalse närbumise diag- noosimine kartuli- ja tomatitaimedes 1. Sümptomid. 2. Määramise kiirmeetod(id). 3. Bakterite isoleerimine. 4. Kontrollkatse(d). III JAGU Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum avastamine ja identifitseerimine kartulimugulates 1. Proovi ettevalmistamine katseks. 2. IF-uuring (immunofluorestsentsuuring). 3. ELISA-test (ensüümne immunosorbenttest). 4. PCR-test (polümeraasi ahelreaktsioon). 5. Bakterite kasvatamine selektiivsöötmel. 6. Biotest. 7. Rikastussöötme testid. 8. Patogeensustest. 1. liide Kasvusöötmed haigusetekitaja Ralstonia solanacearum isoleerimiseks ja kultiveerimiseks. 2. liide Proovi ettevalmistamiseks vajalikud materjalid. 3. liide IF-uuringuks vajalikud materjalid. 4. liide Nakatuvuse taseme määramine IF-uuringus. 5. liide ELISA-testiks vajalikud materjalid. 6. liide PCR-testiks vajalikud materjalid. 7. liide Selektiivsöötmeteks ja rikastussöötmeteks vajalikud materjalid. Viited. 383 383 385 387 387 387 388 388 391 391 392 394 394 396 397 397 397 398 399 400 401 402 403 403 404 03/23. kd ET Euroopa Liidu Teataja 383 I JAGU MÄÄRAMISMETOODIKA RAKENDAMINE 1. Bakter-pruunmädaniku diagnoosimine kartulimugulates ja bakteriaalse närbumise diagnoosimine kartuli- ja tomatitaimedes Määramismetoodika on ette nähtud kartulimugulate jaoks, millel on tüüpilised või oletatavad bakter-pruunmädaniku sümptomid ning kartuli- ja tomatitaimede jaoks, millel on tüüpilised või oletatavad bakteriaalse närbumise sümptomid. Siia kuuluvad kiirmeetodid, saas- tunud juhtkoest patogeeni isoleerimine selektiivsöötmele ja positiivse tulemuse korral haigusetekitaja identifitseerimine. Protsessi tutvustus diagrammina 384 ET Euroopa Liidu Teataja 03/23. kd Diagrammi viidete selgitus: (1) Sümptomite kirjeldus on esitatud II jao 1. punktis. (2) Kiirmeetodid hõlbustavad oletatava diagnoosi määramist. Asjakohased meetodid on: — varre juhtkoe lima voolavuse test (II jao 2. punkt), — polü-β-hüdroksübutüraadi graanulite esinemise test (II jao 2. punkt), — IF-uuring (III jao 2. punkt), — ELISA-test (III jao 3. punkt), — PCR-test (III jao 4. punkt). (3) Kuigi esmaseks sammuks on tüüpiliste sümptomitega taimsest materjalist haigusetekitaja isoleerimine kasvusöötme- plaatidele, võib selline kultiveerimine ebaõnnestuda infektsiooni edasiarenenud faaside tõttu. Saprofüütsed bakterid, mis kasvavad haigestunud kudedel, võivad isoleerimissöötmel haigusetekitaja kasvu maha suruda. Kui bakteri isolee- rimine annab negatiivse tulemuse, kuid haiguse sümptomid on tüüpilised, tuleb eraldamist korrata, eelistatult selek- tiivsöötmel. (4) Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum puhaskultuuri identifitseerimine saavutatakse vähemalt ühega nendest testi- dest, mis on esitatud II jao punktis 4. 1, kasutades seda koos patogeensustestiga (II jao punkt 4. 3). Tüve iseloomusta- mine ei ole kohustuslik, kuid on soovituslik iga uue juhtumi korral. 03/23. kd ET Euroopa Liidu Teataja 385 2. Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum avastamine ja identifitseerimine kartulimugulates Määramismetoodika on ette nähtud varjatud nakkuse avastamiseks kartulimugulates kas ühe või eelistatult mitme määramismeetodiga ning positiivse tulemuse korral tuleb vastav haigusetekitaja isoleerida; juhul kui tüüpiliste kolooniate isoleerimine on võimalik, peab järgnema ka haigusetekitaja Ralstonia solanacearum puhaskultuuri identifitseerimine. Protsessi tutvustus diagrammina 386 ET Euroopa Liidu Teataja 03/23. kd Diagrammi viidete selgitus: (1) P r o o v i s u u r u s Standardne proovi suurus on 200 mugulat. Siiski saab sama protseduuri kohaldada ka juhul, kui proovis on vähem kui 200 mugulat. (2) M ä ä r a m i s m e e t o d ( i d ) Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum avastamiseks proovis ei pruugi üks test olla piisavalt tundlik või usaldusväärne. Seetõttu on soovitatav läbi viia rohkem kui üks test ning need peaksid eelistatult põhinema erinevatel bioloogilistel põhimõtetel. (3) I m m u n o f l u o r e s t s e n t s u u r i n g ( I F ) IF-uuring on hästi toimiv määramismeetod. Seda eelistatakse teistele testidele, mis ei ole veel täielikult välja arendatud või kinnitatud. Seda meetodit kasutatakse veel ka teiste seadusega ettenähtud haigusetekitajate avastamiseks, nt Clavibacter michiganensis subsp. sepedo- nicus'e määramisel. Arvestades kõnesoleva meetodi puhul kindlaksmääratud uuringuparameetreid on see tundlik test (tundlikkuslävi on 103–104 rakku 1 ml kartuliekstrakti bakterpelleti kohta). Uuringu tulemuste usaldusväärsuse kriitiliseks teguriks on antiseerumi kvaliteet. Vastuvõetav on vaid kõrge tiitrimisarvuga (lahjenda- mata antiseerumi puhul vähemalt 2000) antiseerum ning kõik uuringud tuleb läbi viia antiseerumi tiitril või ühe lahjenduse võrra tiitrimisarvust allpool. Eelistatud on kaudne meetod. Otsest meetodit võib kasutada juhul, kui uuringu tundlikkus ja spetsiifilisus on võrdväärsed vastavate kaudse meetodi näitajatega. IF-uuringu eelis on subjektiivne tõlgendamine rakuvärvumise morfoloogia ja fluorestseerumise intensiivsuse puhul, mis annavad teavet reaktsiooni spetsiifilisuse kohta. Võivad esineda ka ristreaktsioonid raku morfoloogialt bakteriga Ralstonia solanacearum sarnaste sellega seroloogiliselt seotud mulla bakterite või kartulikoes esinevate bakterite vahel. IF-uuringut võib kasutada ainsa määramismeetodina, kuigi juhul, kui esineb ristreaktsiooni kahtlus, tuleks läbi viia täiendav määramistest, mis põhineb erineval bioloogilisel põhimõttel. Sellisel juhul on kõige sobivam selektiivsöötmel kasvatamine. (4) B a k t e r i t e k a s v a t a m i n e s e l e k t i i v s ö ö t m e l Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum kasvatamine modifitseeritud SMSA-söötmel on piisavalt tundlik ja selektiivne meetod. Tulemus on nähtav 3–6 päeva järel pärast proovi ettevalmistamist. Haigusetekitaja saadakse otse söötmele, millelt on võimalik teda identifitsee- rida. Selle uuringu kogu potentsiaali kasutamiseks tuleb väga hoolikalt eemaldada kartulitelt basaalsed tipud, et vältida sekundaarseid baktereid kartulimugulates, mis on Ralstonia solanacearum’i konkurendid kasvusöötmel ning võivad mõjutada haigusetekitaja arengut. Mõned bakteritüved võivad kasvusöötmel kasvada väga halvasti, kuna söötme komponendid mõjutavad uuritavat organismi. Samuti nõuab suurt tähelepanu eristada haigusetekitajat Ralstonia solanacearum teistest bakteritest, mis võivad kasvusöötmel areneda. Selektiiv- söötmel kasvatamist võib kasutada ainsa määramismeetodina, tingimusel et, kui on kahtlus, et haigusetekitaja Ralstonia solanacearum kasvu söötmeplaadil inhibeerivad teised bakterid ning testi tulemuseks on saadud negatiivne vastus, tuleb proovi kindlasti uuesti kont- rollida, kasutades erinevat määramismeetodit, et kinnitada määratud diagnoosi või see ümber lükata. Sellisel juhul on kõige sobivam kasutada IF-uuringut. (5) E L I S A - t e s t ELISA-test on üldiselt vähem tundlik kui IF-uuring (tundlikkuse läviväärtus on 104–105 rakku 1 ml kartuliekstrakti bakterpelleti kohta). Test on odav ja kiire, kuid üldiselt vähe kaitstud eksitavate positiivsete (ristreaktsioonide tõttu) ja eksitavate negatiivsete tule- muste eest (kartuliekstraktis esinevate inhibeerivate fenoolsete ainete tõttu). Nõuded antiseerumi spetsiifilisusele on äärmiselt kõrged. ELISA-testi ei või kasutada ainsa määramismeetodina. (6) P C R - t e s t PCR-test on väga tundlik, kuigi testi võivad pärssida taime- või mugulaekstrakti komponendid, andes eksitava negatiivse tulemuse. Mõned kartulisordid sisaldavad rohkem inhibiitoreid kui teised. Seepärast on vaja need inhibiitorid kõrvaldada. Inhibeerimist saab vähendada proovi lahjendades, kuid sel juhul väheneb ka Ralstonia solanacearum’i bakterirakkude arv proovis. Kõigis proovi ja testi ette- valmistusetappides tuleb hoolitseda, et välditakse nakatumist, mis võib viia eksitava positiivse tulemuseni. Eksitavad positiivsed tule- mused võivad tuleneda ka teiste organismide järjestuse homoloogilisusest. Nendel põhjustel ei või otsest PCR-testi kasutada ainsa määramismeetodina. (7) R i k a s t u s s ö ö t m e t e s t Inkubeerides kartuliekstrakti bakterpelleti proove poolselekteerivas kasvupuljongis, nagu näiteks modifitseeritud SMSA-puljongis, saame mitmekordistada Ralstonia solanacearum’i rakkude arvu. Veelgi olulisem, see lahjendab ka ELISA- või PCR-testi võimalikke inhi- biitoreid. Nõnda saab rikastuspuljongit kasutades avastada haigusetekitaja Ralstonia solanacearum IF-uuringuga, ELISA- ja PCR-testiga. Otseseid väljakülve kasvuagaritele ei soovitata rikastuspuljongist teha. Selliseid rikastusmeetodeid ei ole veel põhjalikult uuritud ja kontrollitud. Käesolevas dokumendis on need esitatud, kuna neil on suur potentsiaal. Siiski ei tohiks neid kasutada ainsa määramis- meetodina, kuna ei ole piisavalt kogemusi. (8) B i o t e s t Biotesti kasutatakse haigusetekitaja Ralstonia solanacearum isoleerimiseks kartuliekstrakti bakterpelletist selekteeriva rikastamise abil peremeestaimes, milleks võib kasutada tomati- või baklažaanitaimi. Test eeldab optimaalseid kasvatamistingimusi, nagu on nimetatud käesoleva meetodi puhul. Bakterid, mis võivad inhibeerida haigusetekitaja Ralstoniasolanacearum kasvu SMSA-söötmel, ei mõjuta tõenäoliselt seda testi. (9) K o n t r o l l k a t s e ( d ) Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum puhaskultuuri identifitseerimine saavutatakse vähemalt ühega nendest testidest, mis on esitatud II jao punktis 4. 1, kasutades seda koos patogeensustestiga (II jao punkt 4. 3). Tüve iseloomustamine ei ole kohustuslik, kuid on soovi- tuslik iga uue juhtumi korral. 03/23. kd ET Euroopa Liidu Teataja 387 Bakter-pruunmädaniku diagnoosimine kartulimugulates ja bakteriaalse närbumise diagnoosimine kartuli- ja tomatitaimedes II JAGU 1. 1. 1. Sümptomid S ü m p t o m i d k a r t u l i t e l Kartulitaim. Infektsiooni varajases staadiumis võib päevaste kõrgete temperatuuride juures täheldada närbumist alates alumistest lehtedest taime tipu suunas, kuid öösel taim toibub. Närbumine muutub kiiresti pöördumatuks ning taim hukkub. Närbunud taime varre ristlõike juhtkude võib olla pruuniks muutunud ning piimjas nire võib immitseda lõikepinnalt või erituda kergesti pigistamisel. Kui läbilõigatud taimevars on asetatud vertikaalselt vette, on näha limaniitide väljavoolamist juhtkimpudest. Kartulimugul. Kartulimugulast tuleb teha ristläbilõige basaalsest (ehk stoolonipoolsest) tipust. Infektsiooni varajane staadium esineb juhtkoe- ringi klaasistumisena ja värvusemuutusena kollakast helepruunini ning ringist võib pärast mõne minuti möödumist iseeneslikult või pöial- dega kergel pigistamisel erituda ristläbilõike lähedalt kahvatu kreemjas eritis. Hiljem muutub juhtkoering selgelt eristatavalt pruuniks ning kärbumine võib ulatuda põhikoeni. Edasiarenenud infektsioonifaasis võib lima eralduda ka basaalsest tipust või kartulisilmadest, mille tule- museks on punakaspruunid sissevajunud koorekahjustused, millest võib erituda bakterilima, põhjustades mullaosakeste kleepumist mugu- lale. 1. 2. S ü m p t o m i d t o m a t i t e l Tomatitaim. Esimeseks nähtavaks sümptomiks on noorimate lehtede longu vajumine. Haigusetekitaja jaoks soodsate keskkonnatingimuste juures (mulla temperatuur 25 oC küllastunud niiskuse juures) esineb taime osaline või täielik närbumine, millele järgneb kogu taime kokku- varisemine mõne päeva jooksul. Vähem soodsate tingimuste korral (mulla temperatuur alla 21 °C) võib varrel areneda suurel hulgal kõrval- juuri. Varrel võib esineda värvuse kadumist, mis annab tunnistust juhtkoes esinevast nekroosist. Kui varrest teha ristlõige, on näha, et juht- kude on värvuselt muutunud pruunikaks ja sealt erituvad valged või kollakad bakterilima tilgad. 2. Kiirmeetodid Kiirmeetodid hõlbustavad oletatava diagnoosi määramist. Kasutatakse üht või mitut järgmistest testidest. Varrelima test Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum esinemist närbunud kartuli- või tomativartes saab määrata järgmise lihtsa eeltestiga. Taimevars lõigatakse läbi kohe ülalpool mullapinda. Lõikepind asetatakse veeklaasi. Veidi aja pärast erituvad iseeneslikult juhtkimpudest bakterilima niidid. Teised bakterid, mis kutsuvad kartuli- või tomatitaimedes esile juhtkoe infektsiooni, sellist nähtust ei põhjusta. Polü-ß-hüdroksübutüraadi (PHB) graanulite tuvastamine Ralstonia solanacearum’i rakkudes esinevaid polü-ß-hüdroksübutüraadi (PHB) graanuleid saab nähtavaks muuta värvainetega Niiluse sinine A ja Sudaani must B. Mikroskoobi alusklaasil valmistatakse ette äie limasest eritisest või suspendeeritud koest või 48tunnisest bakterkultuurist, mis on kasvatatud söötmetel YPGA või SPA (vt 1. liide). Valmistatakse ette ka positiivsed haigusetekitaja kontrolläiged biotüübi 2/rassi 3 tüvega ning vajaduse korral negatiivne kontrolläie erineva baktertüvega. Lastakse kuivada. Klaasi alumine pool tõmmatakse mitu korda kiiresti läbi leegi, et äie fikseeruks objektiklaasil. V ä r v i m i n e N i i l u s e s i n i s e g a 1) Fikseeritud äie ujutatakse üle Niiluse sinise A 1 %lise vesilahusega. Inkubeeritakse 10 minutit 55 °C juures. 2) Värvilahus valatakse pealt ära. Pestakse kiiresti tasaselt voolava kraanivee all. Liigne vesi eemaldatakse kuivatuspaberiga. 3) Äie ujutatakse üle äädikhappe 8 %lise vesilahusega. Inkubeeritakse 1 minut toatemperatuuril. 4) Pestakse tasaselt voolava kraanivee all. Kuivatatakse kuivatuspaberiga. 5) Niisutatakse uuesti veetilgaga. Asetatakse peale katteklaas. 6) Värvitud äiet vaadeldakse mikroskoobis, millele on sobitatud epifluorestsentsvalgusallikas ja filter lainepikkusega 450 nm ning kasuta- takse õliimmersiooni 1000kordsel suurendusel. Vaadeldakse ereoranžilt fluorestseeruvaid PHB graanuleid. Vaadeldakse valgusmikroskoobis, et olla kindel, et graanulid on rakusisesed ning et rakumorfoloogia on Ralstoniasolanacearum’i bakterirakkudele tüüpiline. 388 ET Euroopa Liidu Teataja 03/23. kd V ä r v i m i n e S u d a a n i m u s t a g a 1) Fikseeritud äie ujutatakse üle Sudaani musta B 0,3 %lise lahusega 70 %lises etanoolis. Inkubeeritakse 10 minutit toatemperatuuril. 2) Värvilahus valatakse pealt ära. Pestakse kiiresti kraanivee all. Eemaldatakse liigne vesi. Liigne vesi eemaldatakse kuivatuspaberiga. 3) Äie kastetakse lühikeseks ajaks ksülooli. Kuivatatakse kuivatuspaberiga. Ettevaatust! Ksülool on ohtlik aine. Tööta tõmbekapi all. 4) Äie ujutatakse üle 0,5 %lise (mass/maht) safraniini vesilahusega ja jäetakse 10 sekundiks toatemperatuuril seisma. Ettevaatust! Safraniin on ohtlik aine. Tööta tõmbekapi all. 5) Pestakse tasaselt voolava kraanivee all. Kuivatatakse kuivatuspaberiga. Asetatakse peale katteklaas. 6) Värvitud äiet vaadeldakse valgusmikroskoobis, millel on ülekantud valgus ning kasutatakse õliimmersiooni 1000kordsel suurendusel. Ralstonia solanacearum’i rakkudes esinevad PHB graanulid värvuvad sinakasmustaks. Rakusein värvub kahvatupunaseks. T e i s e d m e e t o d i d Teised 4. punkt). sobilikud meetodid Bakterite isoleerimine on IF-uuring (III jao 2. punkt), ELISA-test (III jao 3. punkt) ja PCR-test (III jao Kartulimugula juhtkoeringi muutunud värvusega osast või kartuli- või tomatitaime varre juhtkimpudest eemaldatakse eritist või mõned lõiked. Lahustatakse väikeses koguses steriilses destilleeritud vees või 50 mM fosfaatpuhvris. Jäetakse 5–10 minutiks seisma. Suspensioonist valmistatakse rida 10kordseid lahjendusi, näiteks lahjendused 1/10 ja 1/100 või vajadusel rohkem. Suspensioonist ja selle lahjendustest mõõdetakse kindel kogus üldsöötmele (NA, YPGA ja SPA, 1. liide) ja/või Kelmani tetrasooliumsööt- mele (1. liide) ja/või SMSA-selektiivsöötmele (7. liide). Kasutatakse söötmeplaadil joonkülvi tehnikat või vastava lahjenduse laiali külvamist söötmeplaadile. Vajadusel valmistatakse iga söötmega eraldi söötmeplaadid positiivse haigusetekitaja kontrolliks, kasutades virulentse Rals- tonia solanacearum’i biotüübi 2/rassi 3 tüve. 3. 3. 1 3. 2 3. 3 3. 4 Kasvusöötme plaate inkubeeritakse 28 oC juures kolm päeva. Üldsöötmel on virulentse Ralstonia solanacearum’i kolooniad pärljasvalged, lamedad, ebaühtlase kujuga, fluidaalsed ning sageli iseloomulike spiraalsete keeretega. Kelmani tetrasooliumsöötmel on virulentse Ralstonia solanacearum’i tüüpilised kolooniad kreemikad, lamedad, ebaühtlase kujuga ja flui- daalsed ning keskelt veripunase värvusega keeretega. Ralstonia solanacearum’i avirulentse vormi kolooniad on sügavpunase värvusega. SMSA-söötmel on virulentse Ralstonia solanacearum’i tüüpilised kolooniad piimjasvalged, lamedad, ebaühtlase kujuga ja fluidaalsed, keskelt veripunase värvusega. Avirulentse vormi kolooniad SMSA-söötmel on vähem fluidaalsed, värvuselt täiesti roosad või punased. 3. 5 Iseloomuliku morfoloogiaga kolooniad puhastatakse, külvates need uuesti üldsöötmele. Välditakse regulaarset ümberkülvamist, sest see võib põhjustada virulentsuse kadumist. 4. Kontrollkatse(d) 4. 1. Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum identifitseerimine Ralstonia solanacearum’i bakteri puhaskultuur identifitseeritakse vähemalt ühe järgmise protseduuri abil. T o i t u m u s l i k u d j a e n s ü m a a t i l i s e d t e s t i d Märkus: Igas testis tuleb kasutada vastavaid kontrolltüvesid. 03/23. kd ET Euroopa Liidu Teataja 389 Järgmised haigusetekitaja Ralstonia solanacearum fenotüübilised omadused esinevad või puuduvad: Fluorestseeruv pigment PHB esinemine – + Oksüdatsiooni/fermentatsioonitest (O/F-test) O+/F– Katalaas Kovaci oksüdaas Nitraatide redutseerimine Tsitraadi kasutamine Kasv 40 °C juures Kasv 1 % NaCl-s Kasv 2 % NaCl-s Arginiini dihüdrolaas Želatiini veeldamine Tärklise hüdrolüüs Aesuliini hüdrolüüs Levani tootmine + + + + – + – – – – – – Söötmed ja meetodid on esitatud kogumikus Lelliott & Stead (1987). I F - u u r i n g Bakterkultuurist ja kontrolltüve(de)st valmistatakse rakususpensioon sisaldusega 106 rakku milliliitri kohta. Antiseerumist valmistatakse rida kahekordseid lahjendusi. Viiakse läbi IF-uuring (III jao 2. punkt). Kultuuri IF-tiiter peab olema võrdväärne positiivse kontrolli omaga. E L I S A - t e s t Bakterkultuurist ja kontrolltüve(de)st valmistatakse rakususpensioon sisaldusega rohkem kui 106 rakku milliliitri kohta. Viiakse läbi ELISA- test (III jao 3. punkt). Kultuuri ELISA-väärtus peab olema võrdväärne positiivse kontrolli omaga. P C R - t e s t Bakterkultuurist ja kontrolltüve(de)st valmistatakse rakususpensioon sisaldusega 106 rakku milliliitri kohta. Viiakse läbi PCR-test (III jao 4. punkt). Bakterkultuuri PCR-produkt ja restrikteeriva ensüümanalüüsi (REA) mudel peavad olema sama suurusega, kui on positiivsel kont- rollil. F I S H - h ü b r i d i s a t s i o o n Bakterkultuurist ja kontrolltüve(de)st valmistatakse rakususpensioon sisaldusega 106 rakku milliliitri kohta. Viiakse läbi FISH-protseduur (van Beuningen et al. , 1995) koos PCR-praimeriga OLI-1 (Seal et al. , 1993). Bakterkultuuri reaktsioon peab olema sama, mis on positiivsel kontrollil. V a l g u p r o f i l e e r i m i n e Denatureeritud raku valgud eraldatakse elektroforeesiga polüakrüülamiidgeelis (PAGE) (Stead, 1992a). R a s v h a p e t e p r o f i l e e r i m i n e ( F A P ) Kultuuri ja positiivset kontrolltüve kasvatatakse 48 tundi 28 oC juures trüptikaas-sojaagaril ning viiakse läbi FAP-test (Janse, 1991; Stead, 1992a; Stead, 1992b). Kultuuri profiil peab olema identne positiivse kontrolli omaga. Määratud tingimuste juures on iseloomulikud rasv- happed järgmised: 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH ja 18:1 2OH. 4. 2. Tüve iseloomustamine Tüve iseloomustamine ei ole kohustuslik, kuid on iga uue juhtumi korral soovituslik, kasutades vähemalt üht järgmistest võimalustest. 390 ET Euroopa Liidu Teataja 03/23. kd B i o t ü ü b i m ä ä r a m i n e Ralstonia solanacearum eraldatakse kaheks biotüübiks kolmest heksoosalkoholist ja kolmest suhkrust happe tootmise võime põhjal (Hayward, 1964 & 1994): Järgmiste ainete kasutamine: – maltoos – laktoos – tsellobioos – mannitool – sorbitool – dultsitool 1 – – – – – – 2 + + + – – – Biotüüp 3 + + + + + + 4 – – – + + + 5 + + + + – – Lisatestid eristavad biotüübi 2 alamfenotüüpideks (Hayward, 1994): Trehaloosi kasutamine Inositooli kasutamine D-riboosi kasutamine Pektolüütiline aktiivsus R a s s i m ä ä r a m i n e biotüüp 2 biotüüp 2-A biotüüp 2-T – + – + – – madal madal + + + kõrge Rassi (Buddenhagen et al. , 1962) on võimalik määrata patogeensustesti põhjal nii tomati-, baklaaani- kui ka tubakataimedel ning ülitundlik- kuse reaktsioonil (HR) tubakalehtedes (Lozano & Sequeira, 1970): Reaktsioon järgmistel taimedel: – tomati- või baklažaanitaimed – tubakataimed – tubakalehed 1 närbumine närbumine kärbus (48 h) ja närbumine (7–8 päeva) Rass (*) 2 3 reaktsiooni ei esine närbumine reaktsiooni ei esine reaktsiooni ei esine HR (12–24 h) koltumine (2–8 päeva) (*) Rass 4 (patogeenne ingveril ja mõnel muul peremeestaimel) ja rass 5 (patogeenne ainult mooruspuul) ei ole hõlmatud. Rassi iseloomustus, kasutades patogeensus- või ülitundlikkustesti tubakal, ei ole väga usaldusväärne, selle asemel võib tuletada päritolu biotüübist ja looduslikust peremeestaimest lähtuvalt. Kultuuri saab iseloomustada järgmiselt. G e n o o m s e “ s õ r m e j ä l j e n d i ” v õ t m i n e Haigusetekitaja Ralstonia solanacearum liittüvede molekulaarse eristamise võib läbi viia: RFLP-analüüsiga (Cook et al. , 1989), korduvjärjestusega PCRga [REP-, ERIC- & BOX-PCR (Louws et al. , 1995; Smith et al. , 1995)]. 4. 3. Patogeensustest See on haigusetekitaja Ralstonia solanacearum diagnoosi kinnitav test ning on ette nähtud Ralstonia solanacearum’ina identifitseeritud bakter- kultuuri virulentsuse hindamiseks. Kultuurist ja positiivsest kontrolltüvest valmistatakse inokulaat, milles on 106 rakku milliliitri kohta. Inokuleeritakse 5–10 tomati- või bakla- žaanitaime, eelistatult siis, kui taimel on välja kasvanud kolmas pärisleht, või hiljem (III jao 6. punkt). Inkubeeritakse kuni kaks nädalat temperatuuril 22–28 °C ning kõrge suhtelise niiskuse juures, kastes taimi iga päev. Jälgitakse taime närbumise ja/või kiduraks jäämise, koltu- mise ja kängumise tundemärke. Sümptomitega taimedelt isoleeritakse järgmiselt: — varrest eemaldatakse koelõik 2 cm inokuleerimispunktist kõrgemalt, — see purustatakse ja lahustatakse väikeses koguses steriilses destilleeritud vees või 50 mM fosfaatpuhvris. Siis külvatakse see söötmeplaa- dile, inkubeeritakse ja kontrollitakse tüüpiliste Ralstonia soleanacearum’i kolooniate esinemist. 03/23. kd ET Euroopa Liidu Teataja 391 HAIGUSETEKITAJA RALSTONIA SOLANACEARUM AVASTAMINE JA IDENTIFITSEERIMINE KARTULIMUGULATES Märkus: Standardne proovi suurus on 200 mugulat. Siiski saab sama protseduuri kohaldada ka juhul, kui proovis on vähem kui 200 mugulat. III JAGU 1. Proovi ettevalmistamine analüüsiks Märkus: Bakterpelletit, mis saadakse selle meetodi käigus, kasutatakse ka haigusetekitaja Clavibacter michiganensis sub ssp. sepedonicus avasta- miseks. Enne analüüsi läbiviimist: 1. 1 1. 2 1. 3 i) inkubeeritakse proovi 25–30 °C juures kuni kaks nädalat, et ergutada väikesearvulise Ralstonia solanacearum’i populatsiooni paljunemist; ii) pestakse mugulaid voolava vee all koos sobiva desinfektsioonivahendiga ja puhastusvahendiga. Mugulad kuivatatakse õhu käes. Puhta ja desinfitseeritud skalpelli või juurviljanoa abil eemaldatakse koor iga mugula basaalse tipu juurest nii, et kõigepealt tuleb nähtavale juhtkude. Ettevaatlikult eemaldatakse kartuli basaalse tipu juurest juhtkoest väike koonusjas südamik (3–5 mm diameetriga). Välditakse ülemäärast mittevaskulaarset kudet. Selliselt toimitakse proovi iga mugulaga. Märkus: Selles etapis saab läbi viia mugulate visuaalse vaatluse (II jao 1. punkt). Iga sümptomitega või oluliselt mädanenud mugul tuleb asetada kõrvale ja seda tuleb kontrollida teistest eraldi (II jagu). Eemaldatud basaalsed tipud kogutakse suletavasse nõusse. Eelistatult tuleks eemaldatud basaalseid tippe töödelda kohe. Kui see ei ole võimalik, siis hoitakse neid kuni 24 tundi või 4 °C juures kuni 72 tundi. Basaalseid tippe töödeldakse, kasutades ühte järgmistest menetlustest. i) Basaalsed tipud asetatakse sobivasse nõusse. Lisatakse piisav kogus matseratsioonipuhvrit (2. liide), et basaalsed tipud oleksid kaetud. Basaalsed tipud peenestatakse köögikombaini või peenestaja Ultra Thurrax abil, kuni saavutatakse täielik homogenisatsioon. Ülemäärast homogeniseerimist tuleks vältida. Leotisel lastakse 15–30 minutit seista. ii) Basaalsed tipud asetatakse sobivasse nõusse. Lisatakse piisav kogus matseratsioonipuhvrit, et basaalsed tipud oleksid kaetud. Nõu asetatakse pöörlevale loksutile. Inkubeeritakse kiirusel 50–100 pööret minutis nelja tunni jooksul 20–22 °C juures või 16–24 tunni jooksul 4 °C juures. iii) Basaalsed tipud asetatakse tugevasse ühekordse kasutusega matseratsioonikotti (nt kiiritamise teel steriliseeritud Stomacheri kilekott mõõtudega 105 mm × 150 mm). Ettevaatlikult purustatakse basaalsed tipud sobiva töövahendiga, nt haamriga, kuni on saavutatud täielik homogenisatsioon. Lisatakse piisav kogus matseratsioonipuhvrit, et basaalsed tipud oleksid kaetud. Leotisel lastakse 15–30 minutit seista. 1. 4 Töödeldud basaalsetest tippudest ekstraheeritakse bakterid, kasutades ühte järgmistest menetlustest. i) Leotis nõrutatakse ettevaatlikult tsentrifuugiküvetti nii, et settinud koepraht jääb nõu või koti põhja. Kui leotis on hägune, siis seda tsentrifuugitakse kuni 180 g juures 10 minutit temperatuuril alla 10 °C. Leotist või esimesest tsentrifuugimisest saadud supernatanti tsentrifuugitakse 7 000 g juures 15 minutit või 10 000 g juures 10 minutit temperatuuril alla 10 °C. Supernatant valatakse ära bakterpelleti osa segi ajamata. ii) Leotis filtreeritakse läbi filtersüsteemi, mille poori suuruseks on 40–100 µm. Filtreerimist saab intensiivistada vaakumpumpa kasutades. Filtraat kogutakse tsentrifuugiküvetti. Filter pestakse matseratsioonipuhvriga. Filtraati tsentrifuugitakse 7 000 g juures 15 minutit või 10 000 g juures 10 minutit temperatuuril alla 10 °C. Supernatant valatakse ära bakterpelleti osa segi ajamata. 392 ET Euroopa Liidu Teataja 03/23. kd 1. 5 Bakterpellet suspendeeritakse uuesti 1 ml fosfaatpuhvris (2. liide). Jagatakse kaheks võrdseks osaks ning asetatakse kumbki eraldi mikrokatsutisse. Testimiseks kasutatakse üht mikrokatsutit. Ülejääki säilitatakse testimise ajal 4 °C juures. Teisele osale lisatakse 10–25 % (mahuprotsent) steriilset glütserooli. Segatakse. Säilitatakse –18 °C juures (nädalaid) või –70 °C juures (kuid). 2. IF-uuring Kasutatakse antiseerumit haigusetekitaja Ralstonia solanacearum jaoks, eelistatult rassile 3/biotüübile 2. Määratakse tiiter, kasutades Ralstonia solanacearum’i homoloogse tüve baktersuspensiooni sisaldusega 106 rakku milliliitri kohta ja vastavat FITC (fluorestsiinisotiotsüanaadi) konjugaadi lahjendust vastavalt tootja soovitustele. Lahjendamata algseerumi tiiter peaks olema vähemalt 1: 2000. Kasutatakse mitmeaknalisi mikroskoobi alusklaase, millel on eelistatult 10 vähemalt 6 mm läbimõõduga aknavälja. Iga objektiklaas peab sisaldama ka FITC-konjugaadi kontrolli. Kui FITC-kontrollaknas ilmneb mõni positiivne bakterirakk, siis tuleb testi korrata PBS-kontrolli kasutades. Eraldi valmistatakse ette positiivsed Ralstonia solanacearum’i sobiva rassi/biotüübi kontroll-objektiklaasid, kasutades baktersuspensiooni sisal- dusega 106 rakku milliliitri kohta. Iga uue testiseeria puhul kasutatakse üht objektiklaasi. 2. 1 Valmistatakse ette objektiklaasid, kasutades üht järgmistest menetlustest. i) Bakterpelletite puhul, mille tärklisesisaldus on suhteliselt väike: pipetitakse sobiv kogus (6 mm diameetriga aknavälja jaoks on piisav kogus 15 µl; suuremate aknaväljade puhul suurendatakse kogust) uuesti suspendeeritud bakterpelletit aknaväljade reale. Teist rida võib kasutada duplikaadina või teise proovi jaoks, nagu on näidatud joonisel 1. ii) Muude bakterpelletite puhul: valmistatakse lõplikust bakterpelletist 10kordsed lahjendused, nt 1/10; 1/100 ja 1/1000 pelletipuhvrisse. Pipetitakse sobiv kogus (6 mm diameetriga aknavälja jaoks on piisav kogus 15 µl; suuremate aknaväljade puhul suurendatakse kogust) uuesti suspendeeritud bakterpelletit ja iga lahjendust aknaväljade reale. Teist rida võib kasutada duplikaadina või teise proovi jaoks, nagu on näidatud joonisel 2. 2. 2 Suspensioonitilkadel lastakse kuivada. Bakterirakud fikseeritakse objektiklaasile kuumutades, kuumutades objektiklaasi leegil või hoides 95 %lises etanoolis. 2. 3 IF-uuringu käik i) Vastavalt punkti 2. 1 alapunktis i kirjeldatud objektiklaasi ettevalmistamisele: valmistatakse rida kahekordseid antiseerumi lahjendusi IF-puhvris (3. liide): ¼ tiiter (T/4), ½ tiiter (T/2), tiiter (T) ja 2kordne tiiter (2T). ii) Vastavalt punkti 2. 1 alapunktis ii kirjeldatud objektiklaasi ettevalmistamisele: valmistatakse antiseerumi töölahjendus (WD) IF-puhvris. Optimaalse spetsiifilisusega antiseerumi töölahjendus on lahjendus, mis on tavaliselt ligikaudu pool IF-tiitrist. Objektiklaasi ettevalmistamine vastavalt punkti 2. 1 alapunktile i ja punkti 2. 3 alapunktile i Joonis 1 03/23. kd ET Euroopa Liidu Teataja 393 Objektiklaasi ettevalmistamine vastavalt punkti 2. 1 alapunktile ii ja punkti 2. 3 alapunktile ii Joonis 2 2. 3. 1 Objektiklaasid asetatakse niiskele kuivatuspaberile. Vastavad aknaväljad kaetakse antiseerumi lahjendus(t)ega. PBS-puhvrit mõõdetakse FITC-konjugaadi aknaväljadesse. Aknaväljadele lisatud antiseerumi kogus peab olema ekvivalentne objektiklaasile lisatud ekstrakti kogusega. 2. 3. 2 Kaetud objektiklaase inkubeeritakse 30 minutit toatemperatuuril. 2. 3. 3 2. 3. 4 Antiseerumi tilgad raputatakse objektiklaasilt maha ja objektiklaase loputatakse hoolikalt IF-puhvriga. Pestakse 5 minutit Tweeniga IF- puhvris ning seejärel 5 minutit IF-puhvris (3. liide). Ettevaatlikult eemaldatakse liigne niiskus. Objektiklaasid asetatakse niiskele kuivatuspaberile. Vastavad aknaväljad ja FITC-aknaväli kaetakse FITC-konjugaadi lahjendustega, mida kasutati tiitri määramisel. Aknaväljadele lisatud konjugaadi kogus peab olema sama, mis antiseerumi kogus. 2. 3. 5 Kaetud objektiklaase inkubeeritakse 30 minutit toatemperatuuril. 2. 3. 6 2. 3. 7 Konjugaadi tilgad raputatakse objektiklaasilt maha. Loputatakse ja pestakse nagu eespool kirjeldatud (2. 3. 3). Ettevaatlikult eemaldatakse liigne niiskus. Igasse aknavälja pipetitakse 5–10 µl 0,1 M fosfaatpuhverdatud glütseriini (3. liide) või samalaadset kattevedelikku ning objektiklaas kaetakse katteklaasiga. 2. 4 IF-uuringu tulemused Objektiklaase vaadeldakse mikroskoobis, millele on paigaldatud epifluorestsentsvalgusallikas ja sobilikud filtrid tööks FITCiga ning kasuta- takse õliimmersiooni suurendusel 500–1000 korda. Aknavälju vaadeldakse risti läbi kahe diameetri täisnurga suhtes ja ümber aknavälja välisääre. Esialgu kontrollitakse positiivse tulemusega kontroll-objektiklaasi. Rakukestad peavad säravalt fluorestseeruma ja olema täielikult värvunud. Märkus: Kui fluorestseerumine ei ole täielik, tuleb uuringut korrata. Objektiklaaside tulemus. Esmalt vaadeldakse FITC-kontrolli aknavälju, milles peaksid puuduma fluorestseeruvad rakud. Fluorestseeruvate rakkude esinemine FITC-kontrolli aknaväljas viitab konjugaadi mittespetsiifilisele konjugeerumisele või saastumisele. Märkus: Sel juhul korra- takse uuringut. Uuritavates kontrollaknaväljades vaadeldakse eredalt fluorestseeruvaid rakke, mis on haigusetekitajale Ralstonia solanacearum iseloomuliku morfoloogiaga. Fluorestseerumise intensiivsus peaks olema ekvivalentne positiivse kontrolltüve omaga sama antiseerumi lahjenduse juures. Mittetäielikult värvunud või nõrgalt fluorestseeruvate rakkude arvu ei tohiks arvesse võtta (vt IF-uuringu tulemuse tõlgendamist). IF-uuringu tulemuse tõlgendamine i) IF-uuringu tulemus on negatiivne, kui morfoloogiliselt tüüpilisi säravalt fluorestseeruvaid rakke ei esine. ii) Kui objektiklaasi aknaväljal esineb morfoloogiliselt tüüpilisi eredalt fluorestseeruvaid rakke, siis tuleb kindlaks määrata keskmine rakkude arv mikroskoobi vaatevälja kohta ja arvutada rakkude arv (N) 1 ml lahjendamata bakterpelleti kohta (4. liide). IF-uuringu avastamispiir on ligikaudu 103 rakku 1 milliliitris uuesti suspendeeritud bakterpelletis: — proovide puhul, milles N > 103 rakku 1 milliliitris uuesti suspendeeritud bakterpelletis, käsitatakse IF-uuringut positiivsena; — proovide puhul, milles N < 103 rakku 1 milliliitris uuesti suspendeeritud bakterpelletis, võib IF-testi käsitada positiivsena. 394 ET Euroopa Liidu Teataja 03/23. kd iii) Kui värvumata on jäänud väga suur hulk rakke (> 105 rakku 1 milliliitris) või nende fluorestseerumine on väga nõrk, siis tuleb läbi viia uus uuring: — kasutades meetodit, mis põhineb erineval bioloogilisel põhimõttel, või — korrates IF-uuringut teise antiseerumiga või kasutades bakterpelleti 10kordset lahjendust. 3. ELISA-test Meetodi aluseks on Robinson-Smith et al. , 1995. Kasutatakse antiseerumit haigusetekitaja Ralstonia solanacearum jaoks, eelistatult rassile 3/biotüübile 2. Määratakse tiiter, kasutades bakteri Ralstonia solanacearum homoloogse tüve baktersuspensiooni sisaldusega 106 rakku milliliitri kohta. Soovitatav on kasutada NUNC Polysorbi mikrotiitrimise plaate. Testi tuleb kaasata ka negatiivse kartuliekstrakti kontroll ja fosfaatpuhverdatud soolalahuse kontroll (PBS). Positiivse kontrollina kasutatakse Ralstonia solanacearum’i rassi 3/biotüübi 2 baktersuspensiooni sisaldusega 106 rakku milliliitri kohta. Posi- tiivset kontrolli testitakse samamoodi kui uuritavaid proove, kuid eraldi kontrollproovidest mikrotiitrimise plaadil. 3. 1 100–200 µl uuesti suspendeeritud bakterpelletit pipeteeritakse mikrokatsutisse. 3. 2 3. 3 3. 4 3. 5 3. 6 3. 7 3. 8 3. 9 Kuumutatakse neli minutit 100 °C juures. Seejärel asetatakse mikrokatsuti jääle. Lisatakse samaväärne kogus 2kordset karbonaat-kattepuhvrit (5. liide). Segatakse. 100 µl igast proovist mõõdetakse vähemalt kahte mikrotiitrimise plaadiauku. Inkubeeritakse üks tund 37 °C juures või üleöö 4 °C juures. Järsu löögiga raputatakse ekstrakt plaadiaukudest välja. Auke pestakse kolm korda PBS-Tga (5. liide), jättes viimase pesukorra lahuse vähe- malt viieks minutiks plaadiaukudesse. Valmistatakse Ralstonia solanacearum’i antiseerumi sobiv lahjendus blokeerimispuhvrisse (5. liide). Aukudesse mõõdetakse 100 µl antisee- rumit. Inkubeeritakse üks tund 37 °C juures. Järsu löögiga raputatakse antiseerum plaadiaukudest välja. Auke pestakse, nagu on eespool kirjeldatud (3. 4). Valmistatakse leeliselise fosfataaskonjugaadi sobiv lahjendus blokeerimispuhvrisse. Aukudesse mõõdetakse 100 µl konjugaadi lahjendust. Inkubeeritakse üks tund 37 °C juures. Järsu löögiga raputatakse konjugaat plaadiaukudest välja. Auke pestakse, nagu on eespool kirjeldatud (3. 4 ja 3. 6). Valmistatakse leeliseline fosfataassubstraadilahus (5. liide). Mõõdetakse 100 µl aukudesse. Inkubeeritakse 30 minutit kuni üks tund pimedas, toatemperatuuril. 3. 10 Neeldumist mõõdetakse lainepikkusel 409 nm. ELISA-testi tulemuse tõlgendamine ELISA-test on negatiivne, kui proovi optiline tihedus on väiksem kui negatiivse kontrolli 2kordse optilise tiheduse väärtus. ELISA-test on positiivne, kui proovi optiline tihedus on suurem kui negatiivse kontrolli 2kordse optilise tiheduse väärtus. 4. PCR-test Meetodi aluseks on Seal et al. , 1993. Märkus: Kõikides proovide ettevalmistusetappides ja teistes tegevustes, mis seonduvad PCR-tehnikaga, tuleb kasutada filtriga varustatud pipetiotsikuid. Positiivseks kontrolliks valmistatakse Ralstonia solanacearum’i rassi 3/biotüübi 2 baktersuspensioon sisaldusega 106 rakku milliliitri kohta. Testitakse samamoodi kui proovi (proove). 4. 1 100 µl uuesti suspendeeritud bakterpelletit pipetitakse mikrokatsutisse. Teise võimalusena mõõdetakse 90 µl uuesti suspendeeritud bakterpelletist mikrokatsutisse, mis sisaldab 10 µl 0,5 M NaOH. Segatakse mikrokatsutit üles-alla pöörates. 03/23. kd ET Euroopa Liidu Teataja 395 4. 2 4. 3 4. 4 Kuumutatakse neli minutit 100 °C juures. Seejärel asetatakse mikrokatsuti kohe jääle. Valmistatakse vähemalt kaks või vajadusel rohkem 10kordset lahjendust (nt 1/10, 1/100) steriilsesse destilleeritud vette või ultrapuhtasse vette (UPW). Valmistatakse PCR reaktsioonisegu (6. liide) steriilsesse katsutisse, lisades järgmisi komponente järgmises järjestuses: 50 µl reaktsioonikoguse kohta Komponent Kogus Lõplik kontsentratsioon Steriilne destilleeritud vesi või UPW 10 × PCR-puhver d-ATP d-CTP d-GTP d-TTP Praimer OLI-1 (20 µl) Praimer Y-2 (20 µl) Taq-polümeraas (5 U/µl) 30,8–33,8 µl 5,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 2,5 µl 2,5 µl 0,2 µl Kokku 45–48 µl Suurema hulga reaktsioonide puhul 1 × 0,2 mM 0,2 mM 0,2 mM 0,2 mM 1 µM 1 µM 1,0 U Arvutatakse iga komponendi kogus nõutava arvu reaktsioonide jaoks. Segatakse komponendid ja mõõdetakse 45–48 µl segu steriilsetesse PCR katsutitesse. PCR reaktsiooniseguga katsuteid hoitakse jääl. 25 µl reaktsioonikoguse puhul Vähendatakse vastavalt komponentide koguseid. 4. 5 PCR-amplifikatsioon 4. 5. 1 Ei ole kohustuslik: tsentrifuugitakse katsuteid, milles on keedetud proov ja positiivne kontroll. Igasse PCR-reaktsiooniseguga katsutisse lisatakse proovid järgmises järjestuses: 2–5 µl proovi, kontroll veega ja positiivne kontroll. Katsutid asetatakse DNA termotsükleri kuumutusblokile. 4. 5. 2 Järgitakse järgmist menetlust: 1 tsükkel i) 2 minutit 96 °C juures: DNA-ahela denaturatsioon 50 tsüklit ii) 20 sekundit 94 °C juures: denaturatsioon iii) 20 sekundit 68 °C juures: praimerite kinnitumine iv) 30 sekundit 72 °C juures: koopia ekstensioon 1 tsükkel v) 10 minutit 72 °C juures: täiendav pikenemine 1 tsükkel vi) hoitakse 4 °C juures. Märkus: Need tingimused on termotsükleri Perkin Elmer 9600 jaoks. Mõne termotsükleri puhul on vaja PCR katsutitesse lisada mineraalõli ja/või on vaja modifitseerida amplifikatsiooni mõne etapi (ii, iii ja iv) kestust. 4. 5. 3 Katsutid võetakse termotsüklerist välja. Analüüsitakse PCR produkti. Kui ei analüüsita kohe, siis hoitakse katsuteid 4 °C juures samal päeval määramise puhul ning –18 °C juures pikemaajalise säilitamise puhul. 4. 6 PCR-produkti analüüs PCR-fragmendid tuvastatakse elektroforeesil agaroosgeelis ja värvimisega etiidiumbromiidis. 4. 6. 1 Valmistatakse sobiv agaroosgeel, keetes ettevaatlikult agaroosi tris-atsetaat-elektroforeesipuhvris (TAE). 396 4. 6. 2 ET Euroopa Liidu Teataja 03/23. kd Sulatatud agaroos jahutatakse temperatuurini 50–60 °C, valatakse elektroforeesivanni ning asetatakse paigale kamm. Agaroos jäetakse tahkestuma. 4. 6. 3 Kamm eemaldatakse. Geelile kallatakse TAE-puhver nii, et geel oleks 2–3 mm puhvrikihiga kaetud. 4. 6. 4 Parafilmile mõõdetakse 3 µl täitepuhvri tilgad. Lisatakse proovidest, positiivsest kontrollist ja kontrollist veega saadud 12 µl PCR produkti ja segatakse puhvriga pipetiotsikus sisse-välja liigutades. Etteantud koguseid võib muuta vastavalt agaroosgeeli aukude suurusele. 4. 6. 5 Ettevaatlikult täidetakse geeliaugud. Võrdluseks lisatakse vähemalt ühte geeliauku ka vastav DNA-marker. 4. 6. 6 Juhtmed ühendatakse toiteallika ja elektroforeesiseadmete külge. Elektroforees peaks kulgema 5–8 V/cm, kuni esimene osa indikaatorjoo- nest on 1 cm kaugusel geeli servast. 4. 6. 7 Toiteallikas lülitatakse välja. Juhtmed ühendatakse elektroforeesiseadmetelt lahti. Ettevaatlikult eemaldatakse geel. Seda leotatakse 30–45 minutit etiidiumbromiidi lahuses. Märkus: Iga kord, kui töötatakse etiidiumbromiidiga, tuleb kanda ühekordselt kasutatavaid kummikindaid, sest see aine on tugev muta- geen! 4. 6. 8 Eemaldatakse värvaine, leotades geeli destilleeritud vees 10–15 minutit. 4. 6. 9 Vaadeldakse amplifitseerunud DNA-lõike UV-valgustusallikaga. Ralstonia solanacearum’i PCR produkti pikkus, kasutades praimereid OLI-1 ja Y-2, on 288 baaspaari (bp). Võrreldakse DNA-markeri ja positiivse kontrolli PCR produkti pikkustega. Märkus: Kontroll veega peab igal juhul andma negatiivse tulemuse. Positiivse tulemuse puhul korratakse testi. 4. 6. 10 Geel fotografeeritakse, kui nõutakse püsiregistrit. 4. 6. 11 Amplifitseeritud fragmendi usaldatavust kinnitatakse restriktsiooniensüümi analüüsiga (REA). 4. 7 Restriktsiooniensüümi analüüs (REA) 4. 7. 1 4. 7. 2 Mõõdetakse 8,5 µl PCR produkti (4. 5. 3) uude mikrokatsutisse. Lisatakse 1 µl 10kordset ensüümipuhvrit ja 0,5 µl restriktsiooniensüümi Ava II. Segatakse pipetiotsikus sisse-välja liigutades. Kui tilgad jäävad mikrokatsuti seintele, tsentrifuugitakse mikrotsentrifuugis. Inkubeeritakse üks tund 37 °C juures. 4. 7. 3 Lahustunud PCR-fragmenti analüüsitakse elektroforeesil agaroosgeelis, nagu on kirjeldatud eespool (4. 6). PCR-testi tulemuse tõlgendamine PCR-test on negatiivne, kui ei avastata iseloomulikku 288 bp fragmenti, kuid avastatakse vastav fragment positiivsel Ralstonia solanacearum’i kontrolltüvel. PCR-test on positiivne, kui avastatakse 288 bp fragment, mille REA-analüüs on identne positiivse Ralstonia solanacearum’i kontrolltüve omaga. 5. Bakterite kasvatamine selektiivsöötmel Meetodi aluseks on Elphinstone et al. , 1996. 5. 1 Testi läbiviimiseks tehakse uuritava proovi lahjenduste väljakülv söötmeplaatidele, nt: i) valmistatakse bakterpelletist vähemalt kaks 10kordset lahjendust pelletipuhvrisse, nimelt 1/10 ja 1/100, või vajadusel rohkem. Pipeti- takse kindel kogus (50–100 µl) uuesti suspendeeritud bakterpelletist ja selle lahjendustest modifitseeritud SMSA-selektiivsöötmele (7. liide) ning suspensioon lükatakse klaasspaatli abil agarplaadil laiali. Vajadusel tõmmatakse külviaasaga (mahuga 10 µl) agarplaadile külvijälg. Külvide vahel steriliseeritakse külviaas leegis kuumutamisega; ii) pipetitakse kindel kogus (50–100 µl) uuesti suspendeeritud bakterpelletist modifitseeritud SMSA-selektiivsöötmele ning suspensioon lükatakse klaasspaatli abil agarplaadil laiali. Spaatliga viirutatakse veel vähemalt üle kahe modifitseeritud SMSA-söötmeplaadi. 5. 2 5. 3 Kasutades eespool kirjeldatud meetodit, tehakse eraldi väljakülvid modifitseeritud SMSA-söötmele virulentse Ralstonia solanacearum’i rassi 3/ biotüübi 2 suspensioonist, mille sisaldus on 106 rakku milliliitri kohta ja mis on positiivseks kontrolliks. Söötmeplaate inkubeeritakse 28 °C juures. Kui tulemus on negatiivne, inkubeeritakse edasi, kokku kuni 6 päeva. Virulentse Ralstonia solana- cearum’i kolooniad on piimjasvalged, lamedad, ebaühtlase kujuga, fluidaalsed, keskelt veripunase värvusega, servast iseloomulike spiraalsete keerdudega. 5. 4 Iseloomuliku morfoloogiaga kolooniad puhastatakse, külvates need uuesti üldsöötmele (1. liide). 03/23. kd ET Euroopa Liidu Teataja 397 5. 5 Identifitseeritakse puhaskultuurid (III jao punkt 4. 1) ja kinnitatakse Ralstonia solanacearum’i kultuur patogeensustesti abil (II jao punkt 4. 3). Selektiivsöötme testi tulemuste tõlgendamine Selektiivsöötme testi tulemus on negatiivne, kui pärast kuuepäevast inkubeerimist ei ole välja kasvanud ühtki bakterkolooniat või kui ei ole isoleeritud tüüpilisi Ralstonia solanacearum’i kolooniaid, tingimusel et teised bakterkolooniad ei pärsi Ralstonia solanacearum’i kasvu ning et tüüpilised Ralstonia solanacearum’i kolooniad on kasvanud vaid positiivsetel kontrollplaatidel. Selektiivsöötme testi tulemus on positiivne, kui eraldatakse tüüpilised Ralstonia solanacearum’i kolooniad. 6. 6. 1 6. 2 6. 3 6. 4 6. 5 6. 6 7. 7. 1 7. 2 7. 3 8. Biotest Meetodi aluseks on Janse, 1988. Iga proovi kohta võetakse kümme tundlikust sordist tomati või baklažaani testtaime, millel on välja kasvanud 3. pärisleht. Testtaimi ei tohi kasta 24 tundi enne nakatamist. 100 µl uuesti suspendeeritud bakterpelletit jagatakse testtaimede vahel. Suspensiooni süstitakse taimevarde idulehtede kõrguselt ja veel mõnesse kohta. Samal viisil nakatatakse ka 10 taime virulentse Ralstonia solanacearum’ibiotüübi 2/rassi 3suspensiooniga 106 rakku milliliitri kohta, mis on positiivseks kontrolliks, ning negatiivseks kontrolliks nakatatakse taimi pelletipuhvriga. Positiivsed kontrolltaimed tuleb teistest taimedest isoleerida, et vältida ristnakatumist. Testtaimi kasvatatakse kuni 4 nädalat 22–28 °C ja kõrge suhtelise niiskuse juures, kastes iga päev. Jälgitakse närbumise, kloroosi ja/või kängumise tundemärke. Haigestunud taimed isoleeritakse (II jagu). Identifitseeritakse iseloomuliku morfoloogiaga puhaskultuurid (II jao punkt 4. 1) ja kinnitatakse Ralstonia solanacearum’i kultuurid patogeensustestiga (II jao punkt 4. 3). Vajadusel võib kontrollida infektsiooni puudumist nendes testtaimedes, millel ei esine haigustunnuseid. Igalt testtaimelt eemaldatakse inokuleerimiskohast 2 cm kõrguselt 1 cm pikkune varrelõik. Varrelõigu kude homogeniseeritakse matseratsioonipuhvris. Valmistatakse lahjendused ja tehakse väljakülvid söötmeplaatidele (III jao punkt 5). Positiivse tulemuse korral identifitseeritakse iseloomuliku morfoloo- giaga puhaskultuurid (II jao punkt 4. 1) ja kinnitatakse Ralstonia solanacearum’i kultuurid patogeensustestiga (II jao punkt 4. 3). Biotesti tulemuse tõlgendamine Biotesti tulemus on negatiivne, kui testtaimed ei ole saastunud Ralstonia solanacearum’i kultuuriga, tingimusel et eespool nimetatud bakter on avastatud positiivsetes kontrolltaimedes. Biotest on positiivne, kui testtaimed on Ralstonia solanacearum’i kultuuriga saastunud. Rikastussöötme testid Meetodi aluseks on Elphinstone et al. , 1996. 100 µl uuesti suspendeeritud bakterpelletit mõõdetakse 3 ml modifitseeritud SMSA-söötmesse (7. liide). Inkubeeritakse 28 °C juures 48 tundi ja mitte kauem kui 72 tundi, kusjuures katsuti kork on lõdvalt peal, et tagada õhu juurdepääs. Suletakse katsuti kork ja loksutatakse. Alikvooti kasutatakse IF-uuringus (käesoleva jao punkt 2), ELISA-testis (käesoleva jao punkt 3) ja/või PCR-testis (käesoleva jao punkt 4). Patogeensustest Vaata II jao punkt 4. 3. 398 ET Euroopa Liidu Teataja 03/23. kd Kasvusöötmed haigusetekitaja Ralstonia solanacearum isoleerimiseks ja kultiveerimiseks 1. liide T oi te a g a r (NA ) Toiteagar (Difco) Destilleeritud vesi 23 g 1 liiter Valmistatakse sööde 0,5-liitriste kogustena 1-liitrilistes kolbides. Koostisained lahustatakse. Steriliseeritakse autoklaavimisel 121 °C juures 15 minutit. Jahutatakse 50 °C-ni. Valatakse plaatidele. Pär mie kstr akti g a glükoosp ep toonaga r Pärmiekstrakt (Difco) Bacto peptoon (Difco) D(+)-glükoos (monohüdraatne) Bacto agar (Difco) Destilleeritud vesi 5 g 5 g 10 g 15 g 1 liiter Valmistatakse sööde 0,5-liitriste kogustena 1-liitrilistes kolbides. Koostisained lahustatakse. Steriliseeritakse autoklaavimisel 121 °C juures 15 minutit. Jahutatakse 50 °C-ni. Valatakse plaatidele. Sahh ar oos-pe ptoona g ar (SPA ) Sahharoos Peptoon K2HPO4 MgSO4 × 7H2O Bacto agar (Difco) Destilleeritud vesi 20 g 5 g 0,5 g 0,25 g 15 g 1 liiter Valmistatakse sööde 0,5-liitriste kogustena 1-liitrilistes kolbides. Koostisained lahustatakse. Vajadusel reguleeritakse pH 7,2–7,4ni. Steriliseeritakse autoklaavimisel 121 °C juures 15 minutit. Jahutatakse 50 °C-ni. Valatakse plaatidele. K e lmani te tra sooliu msööde Kasaminohapped (Difco) Bacto peptoon (Difco) Dekstroos Bacto agar (Difco) Destilleeritud vesi 1 g 10 g 5 g 15 g 1 liiter Valmistatakse sööde 0,5-liitriste kogustena 1-liitrilistes kolbides. Koostisained lahustatakse. Steriliseeritakse autoklaavimisel 121 °C juures 15 minutit. Jahutatakse 50 °C-ni. Läbi steriilse filtri 50 mg/l. lisatakse trifenüültetrasooliumkloriidi (Sigma) vesilahust, nii et lõplik kontsentratsioon lahuses on Valatakse plaatidele. 03/23. kd ET Euroopa Liidu Teataja 399 2. liide Proovi ettevalmistamiseks vajalikud materjalid Mat se r at si ooni puh v e r : 50 mM fosfaa tpuh v er , pH 7, 0 Seda puhvrit kasutatakse mugulakoe leotamiseks. Na2HPO4 KH2PO4 Destilleeritud vesi 4,26 g 2,72 g 1 liiter Lahustatakse koostisained ja kontrollitakse pH. Mõõdetakse välja sobivad kogused. Steriliseeritakse autoklaavimisel 121 °C juures 15 minutit. Kui viiakse läbi otsest PCR-testi, siis on soovitav lisada 5 %list polüvinüülpürrolidooni-40000 MWT (PVP-40), et vähen- dada ekstraktis esinevaid aromaatseid aineid, mis pärsivad amplifikatsiooni. Kui kartulite nabasüdamike homogeniseerimiseks kasutatakse mikserit või homogenisaatorit Ultra Turrax, on soovitav lisada matseratsioonipuhvrisse deflokulanti, vahutamisvastast toimeainet või antioksüdanti. Lubrooli helbed Vahutamisvastane aine DC Silicone Tetranaatriumpürofosfaat 0,5 g/liiter 1,0 ml/liiter 1,0 g/liiter Autoklaavitakse eraldi. Lisatakse soovitud kontsentratsioonis. B a kte r p e ll e ti pu h v e r ; 10 mM f osfa a tpu h v e r , pH 7, 2 Seda puhvrit kasutatakse suspendeerimiseks ja kartulite basaalsete tippude ja bakterpelletite lahjendamiseks. Na2HPO4 × 12 H2O NaH2PO4 × 2 H2O Destilleeritud vesi 2,7 g 0,4 g 1 liiter Lahustatakse koostisained ja kontrollitakse pH. Mõõdetakse välja sobivad kogused. Steriliseeritakse autoklaavimisel 121 °C juures 15 minutit. 400 ET Euroopa Liidu Teataja 03/23. kd 3. liide IF-uuringuks vajalikud materjalid IF -p uh v er : 10 mM fosf a a tpu h v ri li sa n di g a ke edusoolalah us (PBS), pH 7,2 Seda puhvrit kasutatakse antiseerumi lahjendamiseks. Na2HPO4 × 12 H2O NaH2PO4 × 2 H2O NaCl Destilleeritud vesi 2,7 g 0,4 g 8,0 g 1 liiter Lahustatakse koostisained ja kontrollitakse pH. Mõõdetakse välja sobivad kogused. Steriliseeritakse autoklaavimisel 121 °C juures 15 minutit. IF-p uh ver T wee ni g a Seda puhvrit kasutatakse objektiklaaside pesemiseks. IF-puhvrile lisatakse 0,1 % Tween 20. 0 , 1 M fosfa a t p u h v r i li sa n di g a g l ü t se r o ol, pH 7, 6 Seda puhvrit kasutatakse kattevedelikuna fluorestseerumise suurendamiseks IF-objektiklaaside aknaväljades. Na2HPO4 × 12 H2O NaH2PO4 × 2 H2O Glütserool Destilleeritud vesi 3,2 g 0,15 g 50 ml 100 ml 03/23. kd ET Euroopa Liidu Teataja 401 (1) (2) (3) (4) 4. liide Nakatuvuse taseme määramine IF-uuringus Mitmekohalise objektiklaasi aknavälja pindala (S) ¼ πD2 4 kus D = akna diameeter Objektiivi välja pinna pindala (s) ¼ πd2 4 kus d = välja diameeter d saadakse kas otsesel mõõtmisel või järgmiste valemite abil: s ¼ πi2 G2K2 × 4 kus i = välja koefitsient (sõltub okulaari tüübist ja on 8–24), K = toru koefitsient (1 või 1,25), G = objektiivi suurendus (100×, 40× jne). valemist (2) ﬃﬃﬃﬃﬃ 4s π d ¼ r valemist (3) d ¼ v u u t ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ 4 × πi2 G2K2 × 4 ¼ i GK π Loendatakse tüüpiliste fluorestseerivate rakkude arv välja kohta (c). Arvutatakse tüüpiliste fluorestseerivate rakkude arv akna kohta (C). C ¼ c S s Arvutatakse tüüpiliste fluorestseerivate rakkude arv milliliitri pelleti kohta (N). N ¼ C × 1 000 × F y kus y = bakterpelleti maht aknas, F = bakterpelleti lahjendusfaktor. 402 ET Euroopa Liidu Teataja 03/23. kd 5. liide ELISA-testiks vajalikud materjalid K a h e k o r d n e k a r b o n a a t - k a t t e p u h v e r , p H 9 , 6 Na2CO3 NaHCO3 Destilleeritud vesi 6,36 g 11,72 g 1 liiter Lahustatakse koostisained ja kontrollitakse pH. Mõõdetakse välja sobivad kogused. Steriliseeritakse autoklaavimisel 121 °C juures 15 minutit. Kui kartuliekstrakt sisaldab suurel hulgal aromaatseid ühendeid, siis võib lisada 0,2 %lise lõppkontsentratsiooniga naatriumsulfitit, mis toimib antioksüdandina. 1 0 m M f o s f a a t p u h v r i l i s a n d i g a k e e d u s o o l a l a h u s ( P B S ) , p H 7 , 4 NaCl KH2PO4 Na2HPO4 × 12 H2O KCl Destilleeritud vesi 80 g 2 g 29 g 2 g 1 liiter Lahustatakse koostisained ja kontrollitakse pH. Mõõdetakse välja sobivad kogused. Steriliseeritakse autoklaavimisel 121 °C juures 15 minutit. F o s f a a t p u h v r i l i s a n d i g a s o o l a l a h u s T w e e n i g a ( P B S - T ) 10 × PBS 10 % Tween 20 Destilleeritud vesi 100 ml 5 ml 895 ml B l o k e e r i v ( a n t i k e h a ) p u h v e r ( p u h v e r t u l e b v a l m i s t a d a v a h e t u l t e n n e t ö ö a l u s t a m i s t ) 10 × PBS Polüvinüülpürrolidoon-44000 MWT (PVP-44) 10 % Tween 20 Piimapulber Destilleeritud vesi L e e l i s e l i n e f o s f a t a a s s u b s t r a a d i l a h u s , p H 9 , 8 Dietanoolamiin Destilleeritud vesi 10 ml 2,0 g 0,5 g 0,5 g kuni 100 ml 97 ml 800 ml Segatakse ja reguleeritakse kontsentreeritud HCl-ga pH 9,8ni. Maht täiendatakse destilleeritud veega 1 liitrini. Lisatakse 0,2 g MgCl2. Kaks fosfataassubstraadi 5 mg tabletti (Sigma) lahustatakse 15 ml lahuses. 03/23. kd ET Euroopa Liidu Teataja 403 6. liide PCR-testiks vajalikud materjalid O l i g o n u k l e o t i i d n e p r a i m e r i j ä r j e s t u s Praimer OLI1 S' GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC' Praimer Y2 S' Materjalid vt Seal et al. (1993). CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT' 7. liide Selektiivsöötmeteks ja rikastussöötmeteks vajalikud materjalid S MS A -sel ekti i vsööde (Engelbrecht, 1994, muudetud Elphinstone et al. , 1996), kuid agar ja tetrasooliumsoolad tuleb välja jätta. Põhisööde Kasaminohapped (Difco) Bacto peptoon (Difco) Glütseriin Agar (Difco) Destilleeritud vesi 1 g 10 g 5 ml 15 g 1 liiter Valmistatakse sööde 0,5-liitriste kogustena 1-liitrilistes kolbides. Lahustatakse koostisained ja kontrollitakse pH. Vajadusel korrigeeritakse pH 6,5ni enne autoklaavimist. Ralstonia solana- cearum ei kasva hästi söötmel, mille pH > 7,0. Steriliseeritakse autoklaavimisel 121 °C juures 15 minutit. Jahutatakse 50 °C-ni. Lisatakse järgmised ained (kõik Sigmast), et saada täpselt määratud lõppkontsentratsioonid: Kristallviolett Polümüksiin-B-sulfaat Batsitratsiin (*) Klooramfenikool Penitsilliin-G Tetrasooliumsoolad 5 mg/l 100 mg/l 25 mg/l 5 mg/l 0,5 mg/l 50 mg/l (ligikaudu 600 000 ühikut) (ligikaudu 1 250 ühikut) (ligikaudu 825 ühikut) Sigma P-1004 Sigma B-0125 Sigma C-3175 Sigma P-3032 Koostisained lahustatakse 70 %lises etanoolis etteantud kontsentratsioonideni valmistatava söötme mahu jaoks. Mõned ained, nt polümüksiin B ja klooramfenikool, vajavad kerget soojendamist ja loksutamist. S MS A-p u lj ong (Elphinstone et al. , 1996). Valmistatakse nagu SMSA-selektiivsööde, kuid agar jäetakse välja. Jagatakse kolme milliliitri kaupa 30 ml Universal-katseklaasidesse. (*) Vajadusel võib batsitratsiini kontsentratsiooni tõsta 300 ppm-ni, mis vähendab saprofüütsete bakterite hulka, mõjutamata haiguseteki- taja Ralstonia solanacearum kasvu. 404 ET Euroopa Liidu Teataja 03/23. kd Viited Buddenhagen, I. W. ; Sequeira, L. and Kelman, A. 1962. Description of races in Ralstonia solanacearum. Phyto- pathology 52, 726. Cook, D. ; Elizabeth B. and Sequeira L. , 1989. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphism with DNA probes that specify virulence and hypersensitive respons. Molecular Plant-Microbe Interactions 2, 113–121. Dinesen I. G. and DeBoer, S. H. 1995. Extraction of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus from compo- site samples of potato tubers. American Potato Journal 72, 133–142. Elphinstone, J. G. ; Hennessy, J. ; Wilson, J. and Stead, D. E. 1996. Sensitivity of different methods for the detection of Ralstonia solanacearum (Smith) Smith in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26. Engelbrecht, M. C. 1994. Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Ralstonia solanacearum. ACIAR Bacterial Wilt Newsletter 10, 3–5. Hayward, A. C. 1964. Characteristics of Ralstonia solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27, 265–277. Hayward, A. C. 1994. Systematic and phylogeny of Ralstonia solanacearum and related bacteria. In: Bacterial Wilt: the disease and its causative agent, Ralstonia solanacearum (eds. A. C. Hayward and G. L. Hartman) CAB International Oxford, 127–135. Janse, J. D. 1988. A detection method for Ralstonia solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. EPPO Bulletin 18, 343–351. Janse, J. D. 1991. Infra- and intraspecific classification of Ralstonia solanacearum strains using whole cell fatty acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14, 335–345. Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity in Ralstonia solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 64, 293–695. Lelliot, R. A. and Stead, D. E. , 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. (T. F. Preece ed. ) Blackwell Scientific Publications, Oxford. 216 pp. Louws, F. J. ; Fulbright, D. W. ; Stephens, C. T. and De Bruijn, F. J. , 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85, 528– 536. Lozano, J. C. and Sequeira, L. , 1970. Differentiation of races of Ralstonia solanacearum by a leaf infiltration technique. Phytopathology 60, 838. Mirza, M. S. ; Rademaker, J. W. L. ; Janse, J. D. and Akkermans, A. D. L. 1993, Specific 16S ribosomal RNA targeted oligonucleotide probe against Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Canadian Journal of Micro- biology 39, 1029–1034. Robinson-Smith, A. ; Jones, P. ; Elphinstone, J. G. and Forde, S. M. D. , 1995. Production of antibodies to Ralstonia solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67–79. Seal, S. E. ; Jackson, L. A. ; Young, J. P. W. and Daniels, M. J. , 1993. Differentiation of Ralstonia solanacearum, P. syzygii, P. picketti and the blood disease bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonu- cleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. Journal of General Microbiology 139, 1587–1594. Smith, J. J. ; Offord, L. C. ; Holderness, M. and Saddler, G. S. , 1995. Genetic diversity of Burkholderia solana- cearum (synonym Ralstonia solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61, 4262– 4268. Stead, D. E. , 1992a. Techniques for detecting and identifying plant pathogenic bacteria. In: Techniques for rapid detection of plant pathogens (eds. J. M. Duncan and L. Torrance). Blackwell Scientific Publications, Oxford, 76–111. Stead, D. E. , 1992b. Grouping of plant pathogenic and some other Ralstonia spp. using cellular fatty acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42, 281–295. Van Beuningen, A. ; Derks, H. and Janse J. D. , 1995. Detection and identification of Clavibacter michiga- nensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in-situ hybridisation (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Züchtungsforschung 2, 266–269. 03/23. kd ET Euroopa Liidu Teataja 405 III LISA 1. Iga haigusjuhtumi kahtluse korral, mille puhul on saadud loetletud taimses materjalis kiirtesti positiivne tulemus vastavalt II lisas esitatud asjakohasele meetodile, või kõigil muudel juhtudel, kasutades muud ametlikult heakskiidetud meetodit, ning oodates tulemuste kinnitamist või ümberlükkamist, tuleb kuni eespool nimetatud meetodi lõpuleviimi- seni kinni pidada ja nõuetekohaselt säilitada: — võimaluse korral terve partii või selle osa (millest proov on võetud) etiketiga varustatud originaalpakendis, — võimaluse korral proovide järelejäänud osa, — kõik järelejäänud ekstraktid ja kiirtestideks valmistatud lisamaterjalid, nt immunofluorestsents-objektiklaasid, ning — kõik asjakohased dokumendid. 2. Organismi olemasolu kinnituse puhul tuleks alles hoida ja nõuetekohaselt säilitada: — lõikes 1 määratletud materjal, — vajaduse korral mugula- või taimeekstraktiga nakatatud tomati- või baklažaanitaime proov ning organismi isolee- ritud kultuur — vähemalt ühe kuu jooksul pärast teatamist vastavalt artikli 5 lõikele 2. 406 ET Euroopa Liidu Teataja 03/23. kd IV LISA Artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktis i osutatud uurimisel võetakse vajaduse korral arvesse järgmised tegurid: i) tootmiskohad, — kus kasvatatakse või on kasvatatud kartuleid, mis on klooni kaudu seotud kartulitega, mis on osutunud organis- miga saastunuks, — kus kasvatatakse või on kasvatatud tomateid, mis on samast algallikast kui tomatid, mis on osutunud organismiga saastunuks, — kus kasvatatakse või on kasvatatud kartuleid või tomateid, mis on ametliku kontrolli all organismi oletatava esine- mise tõttu, — kus kasvatatakse või on kasvatatud kartuleid, mis on klooni kaudu seotud kartulitaimedega, mis on kasvatatud organismiga saastunuks osutunud tootmiskohtades, — kus kasvatatakse kartuleid või tomateid ja mis asetsevad saastunud tootmiskoha naabruses, k. a sellised tootmis- kohad, kus tootmisseadmeid ja -rajatisi kasutatakse ühiselt vahetult või ühise tööettevõtja vahendusel, — kus kastmiseks või niisutamiseks kasutatakse pinnavett, mille lähtekohas on organismi esinemine kinnitatud või milles oletatakse organismi esinemist, — kus kastmiseks või niisutamiseks kasutatakse pinnavett, mille lähtekohaks on tootmiskohtade üldised veevõtu- kohad ning milles on organismi esinemine kinnitatud või milles oletatakse organismi esinemist, — mis on või mis on olnud üle ujutatud pinnaveega, milles on organismi esinemine kinnitatud või milles oletatakse organismi esinemist, ning ii) organismiga saastunud pinnavesi, mida on kasutatud tootmiskoha kastmiseks ja niisutamiseks või mis on üle ujutanud põllud ja tootmiskohad. 03/23. kd ET Euroopa Liidu Teataja 407 1. Võimaliku saastuse ulatuse kindlaksmääramiseks artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iii ja punkti 5 lõike 1 punkti c alapunkti iii alusel võetakse vajaduse korral arvesse järgmised tegurid: V LISA — artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel saastunuks osutunud tootmiskohas kasvatatav loetletud taimne materjal, — tootmiskoht või -kohad, mis mõnes tootmislülis on seotud artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel saastunuks osutunud loetletud taimse materjaliga, k. a tootmiskohad, kus tootmisseadmeid ja -rajatisi kasutatakse ühiselt vahe- tult või ühise tööettevõtja vahendusel, — eelmises taandes osutatud tootmiskohas või -kohtades kasvatatud või sellises tootmiskohas või -kohtades olev loetletud taimne materjal ajavahemikul, millal vastavalt artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktile ii saastunuks tunnis- tatud taimne materjal oli esimeses taandes osutatud tootmiskohtades, — eespool nimetatud tootmiskohtadest pärit loetletud taimset materjali käitlevad laod, — seadmed, sõiduk, laev, ladu või nende osad ning mis tahes muud objektid, sealhulgas pakkematerjal, mis on võinud olla kontaktis loetletud taimse materjaliga, mis on tunnistatud saastunuks artikli 5 lõike 1 punkti a ala- punkti ii alusel, — kogu loetletud taimne materjal, mida on hoitud eelmises taandes loetletud objektide sees või nendega kokku- puutes enne nende objektide puhastamist ja desinfitseerimist, — artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti i alusel toimunud uurimise ja kontrollimise tulemusena ilmneb, et klooni kaudu suguluses olevad kartulimugulad või -taimed ja sama päritoluga tomatitaimed võivad artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel osutuda organismiga saastunud loetletud taimseks materjaliks ja saastumine on tõenäo- line taime kloonide kaudu, kuigi testi tulemused on võinud olla negatiivsed, — eelmises taandes osutatud taimse materjali tootmiskoht või -kohad, — loetletud taimse materjali tootmiskoht või -kohad, kus kasutatakse artikli 5 lõike 1 punkti c alapunkti ii alusel organismiga saastunuks osutunud kastmis- ja niisutusvett, — loetletud taimse materjali kasvatamine põldudel, mis on üle ujutatud organismiga saastunud pinnaveega. 2. Organismi võimaliku leviku kindlaksmääramine artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iv ja artikli 5 lõike 1 punkti c ala- punkti iii alusel hõlmab: i) artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktis iv osutatud juhtudel järgmiste asjaolude arvessevõtmist: — loetletud taimse materjali muude kasvatuskohtade lähedust, — seemnekartulivarude ühist tootmist ja kasutamist, — tootmiskohti, kus kasutatakse pinnavett taimse materjali kastmiseks või niisutamiseks juhtudel, kus artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel organismiga saastunuks osutunud tootmiskohtades esineb või on esinenud pinnavee äravoolu või üleujutuse oht; ii) juhtudel, mil pinnavesi on artikli 5 lõike 1 punkti c alapunkti ii alusel tunnistatud organismiga saastunuks: — loetletud taimse materjali tootmiskohti, mis asuvad organismiga saastunuks osutunud pinnavee või üleujutu- sohu lähedal, — iga eraldatud jõgikonda, mis on ühenduses saastunuks tunnistatud pinnaveega. 408 ET Euroopa Liidu Teataja 03/23. kd 3. Artikli 5 lõike 2 esimeses lõigus osutatud teates esitatud andmed hõlmavad: — vajaduse korral kuupäeva, millal on teatavaks tehtud haiguse esinemise kahtlus artikli 4 alusel, proovivõtu kuupäevi ning organismi esinemise kinnitust artikli 5 alusel, — saastunuks tunnistamise asjaolude kirjeldust ja tsooni piiritlemist. 4. Artikli 5 lõike 2 teises lõigus osutatud täiendavas teates esitatud andmed hõlmavad: — iga saastunuks tunnistatud kartulisaadetise või -partii direktiivi 77/93/EMÜ artiklites 7 ja 8 ettenähtud sertifikaate, vastavalt vajadusele kartulitootjate, laomajandite või lähetuskeskuste passi- või registreerimisnumbreid, — saastunuks tunnistatud tomatitaimede saadetise või partii puhul direktiivi 77/93/EMÜ artiklis 7 või 8 ettenähtud sertifikaate ning taimepassi numbrit vastavalt direktiivi 77/93/EMÜ V lisa, A osa, I jao punktis 2. 2 esitatud nõuetele, — seemnekartulivarude puhul ja võimaluse korral kõikidel muudel juhtudel sordi nime ja kategooriat, — muud teavet, mis on seotud kinnitatud haiguspuhanguga ja mida komisjon võib nõuda. 03/23. kd ET Euroopa Liidu Teataja 409 1. Pidades silmas artikli 6 lõiget 1, tuleb anda järgmised korraldused: VI LISA — tuhastamine, või — loomasöödana kasutamine pärast kuumtöötlemist, nii et puudub organismi ellujäämise oht, või — sügavale matmine hävituskohas, kus ei teki imbumise ohtu põllumajandusmaadele või millel puudub kokkupuude veega, mida võidakse kasutada põllumaa kastmiseks, või — tööstuslik töötlemine, toimetades selleks saastunud või nakatumiskahtlusega taimse materjali vahetult ja viivitama- tult töötlemisettevõttesse, kus on ametlikult heakskiidetud jäätmete kõrvaldamise seadmed, mis on kooskõlas käes- oleva direktiivi VII lisas ettenähtud sätetega, või — muud meetmed, tingimusel et on kindlaks tehtud, et ei ole organismi leviku identifitseeritavat ohtu; sellistest meetmetest tuleb viivitamata teatada komisjonile ja teistele liikmesriikidele. 2. Artikli 6 lõikes 2 osutatud loetletud taimse materjali asjakohane kasutamine või hävitamine vastavate liikmesriikide vastutavate ametiasutuste kontrolli all koos vastutavate ametiasutuste infovahetusega, et tagada pidev kontroll ja selle liikmesriigi vastutavate ametiasutuste heakskiit, kus kartulid pakendatakse või neid töödeldakse esimeses ja teises taandes osutatud jäätmete kõrvaldamise seadmete jaoks, on järgmine: i) kartulimugulate puhul: — kasutamine tarbimiseks ettenähtud söögikartulina, mis on pakendatud kohtades, kus on vastavad jäätmete kõrvaldamise seadmed, nii et kartul on valmis otsetarnimiseks ja kasutamiseks ümber pakendamata ning on ette nähtud selliseks otsetarnimiseks ja kasutamiseks, või — kasutamine tööstuslikuks töötlemiseks ettenähtud söögikartulina, mis tuleb otse ja viivitamata tarnida töötlemisettevõttesse, kus on nõuetekohased jäätmete kõrvaldamise seadmed, või — muu kasutamine või kõrvaldamine, tingimusel et ei esine organismi leviku identifitseeritavat ohtu ning selle on heaks kiitnud kõnealused vastutavad ametiasutused. Sellistest meetmetest tuleb viivitamata teatada komisjonile ja teistele liikmesriikidele; ii) teiste taimeosade, k. a varre- ja leheprahi puhul, — hävitamine, või — muu kasutamine või kõrvaldamine, tingimusel et ei esine organismi leviku identifitseeritavat ohtu; sellistest meetmetest tuleb teatada komisjonile ja teistele liikmesriikidele. 3. Artikli 6 lõikes 3 osutatud objektide saastusest puhastamise asjakohased meetodid on puhastamine ja vajaduse korral desinfitseerimine nii, et ei ole organismi leviku identifitseeritavat ohtu, ning seda tehakse liikmesriikide vastutavate ametiasutuste järelevalve all. 4. Liikmesriikide rakendatavad meetmed artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktis iv ja punkti c alapunktis iii kehtestatud ja artikli 6 lõikes 4 osutatud piiritletud tsooni(de)s on järgmised. 4. 1. Nendel juhtudel, kui tootmiskohad on tunnistatud organismiga saastunuks artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel: a) kaitstud tootmisalade põldudel või põlluosadel, mis on tunnistatud saastunuks artikli 5 lõike 1 punkti a ala- punkti ii alusel, kas 410 ET Euroopa Liidu Teataja 03/23. kd i) vähemalt nelja kasvatusaasta jooksul pärast saastunuks tunnistamise aastat, — võetakse meetmed isekülvanud kartuli- ja tomatitaimede ja muude organismi peremeestaimede, seal- hulgas maavitsaliste sugukonda kuuluva umbrohu kõrvaldamiseks, ning — ei panda maha, istutata ega külvata järgmist: — kartulimugulaid või -taimi, — tomatitaimi ja -seemneid, — võttes arvesse organismi bioloogiat, — teisi organismi peremeestaimi, — ristõieliste taimeliike, mille puhul on identifitseeritav organismi ellujäämise oht, — teisi põllukultuure, millel on identifitseeritav oht organismiga nakatuda; — esimesel kartuli või tomati kasvuaastal, mis järgneb eelmises taandes määratletud ajavahemikule, ja tingimusel, et põld on vähemalt kahel järjestikusel kasvuaastal enne taimede istutamist olnud vaba isekülvanud kartuli- ja tomatitaimedest ja muudest peremeestaimedest, sh maavitsaliste sugukonda kuuluvatest umbrohtudest, tuleb: — kartulite puhul kasutada ametlikult sertifitseeritud seemnekartulit üksnes söögikartuli tootmiseks, ja — viia läbi ametlik uuring koos artikli 2 lõikes 1 määratletud katsetega, — eelmises taandes osutatud kartuli- või tomatikasvatushooajale ja asjakohasele külvikordade tsüklile järgneval hooajal pannakse ametlikult sertifitseeritud seemnekartul maha kas seemne- või söögikartuli tootmiseks ning kartulite ja tomatite puhul viiakse läbi artikli 2 lõikes 1 määratletud ametlik uuring, või ii) saastunuks tunnistamise aastale järgneva viie kasvatusaasta jooksul: — võetakse meetmed isekülvanud kartuli- ja tomatitaimede ja muude organismi peremeestaimede, sh maavitsaliste sugukonda kuuluva umbrohu kõrvaldamiseks, ning — tuleb esimese kolme aasta jooksul põld vastavalt identifitseeritavale ohule kas sööti jätta või külvata sinna teravilja või säilitada püsikarjamaana, mida sagedasti madalalt niidetakse või kasutatakse inten- siivselt karjatamiseks, või kasvatada rohuseemet ja kahe järgneva aasta jooksul järgneb muude kui organismi peremeestaimede kasvatamine, mille puhul ei ole organismi ellujäämise või leviku identifit- seeritavat ohtu, — esimesel kartuli- või tomatikasvatushooajal, mis järgneb eelmises taandes määratletud ajavahemikule, — kasutatakse kartuli puhul ametlikult sertifitseeritud seemnekartulit seemne- või söögikartuli tootmi- seks, ning viiakse läbi ametlik uuring koos artikli 2 lõikes 1 määratletud katsetega; b) muudel põldudel: — saastunuks tunnistamise aastale järgneval kasvatusaastal: — ei või põllule maha panna või istutada kartulimugulaid või -taimi või muid organismi peremeestaimi ning tuleb võtta meetmed, et kõrvaldada isekülvanud kartuli- või tomatitaimed ja muud organismi peremeestaimed, sh maavitsaliste sugukonda kuuluv umbrohi, või — kartulimugulate puhul tohib ametlikult sertifitseeritud seemnekartulit kasutada üksnes söögikartuli tootmiseks, tingimusel et vastutavad ametiasutused on veendunud, et isekülvanud kartuli- ja tomatitai- mede ja muude organismi peremeestaimede, sh maavitsaliste sugukonda kuuluva umbrohu oht on kõrvaldatud. Kasvavat kultuuri kontrollitakse asjakohaste ajavahemike järel ning isekülvanud kartuli- taimedel kontrollitakse organismi esinemist; lisaks kontrollitakse kartuli puhul koristatud mugulaid; 03/23. kd ET Euroopa Liidu Teataja 411 — esimeses taandes määratletud aastale järgneval esimesel kasvuaastal: — kasutatakse kartulite puhul üksnes ametlikult sertifitseeritud seemnekartulit seemne- või söögikartuli tootmiseks, — vähemalt esimeses taandes määratletud aastale järgneval teisel kasvuaastal: — kasutatakse kartulite puhul üksnes ametlikult sertifitseeritud seemnekartulit või ametliku kontrolli all ametlikult sertifitseeritud seemnekartulist kasvatatud seemnekartulit seemne- või söögikartuli tootmi- seks, — igal kasvuaastal, millele on osutatud eelmistes taanetes, võetakse meetmed, et kõrvaldada isekülvanud kartuli- ja tomatitaimed ja muud organismi peremeestaimed, sh maavitsaliste sugukonda kuuluv umbrohi, ning viiakse läbi artikli 2 lõikes 1 määratletud ametlik uuring ning juhtudel, kui seemnekartul pannakse maha seemnekartuli tootmiseks, viiakse läbi mugulate kontroll; c) kohe pärast saastunuks tunnistamist vastavalt artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktile ii ning igal järgmisel kasvuaastal, sh esimesel lubatud kartuli- või tomatikasvatushooajal, tuleb põldudel, mis on tunnistatud saastu- nuks vastavalt lõigus a määratletule: — kõik tootmiskohas ja kartuli- või tomatikasvatusel kasutatud masinad ja ladustamisrajatised puhastada ja vajadusel desinfitseerida, kasutades nõuetekohaseid meetodeid, mida on kirjeldatud punktis 3, — ametlikult kontrollida kastmis- ja niisutamiskavasid ja vajadusel need keelata, et vältida organismi levikut; d) artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti ii alusel saastunuks tunnistatud kaitstud tootmisala osal, kus on võimalik kasvusubstraadi täielik vahetus: — on kartulimugulate või -taimede või muude organismi peremeestaimede, sh tomatitaimede ja -seemnete mahapanek, istutamine või külvamine lubatud, kui kõnealusel tootmisala osal on kehtestatud ametlikud järelevalvemeetmed organismi kõrvaldamiseks ja kõikide organismi peremeestaimede kõrvaldamiseks, sh täielikuks kasvusubstraadi vahetamiseks ja tootmisala osa ja kõikide seadmete põhjalikuks puhastamiseks ning vajadusel desinfitseerimiseks, ning millele seejärel on vastutavad ametiasutused andnud loa toota kartuleid või tomateid, ning — kasvatatakse kartuleid ametlikult sertifitseeritud seemnekartulist või väikestest mugulatest või mikrotaime- dest, mis on saadud kontrollitud allikatest, — kontrollitakse ametlikult kastmis- ja niisutamiskavasid ja vajadusel need keelatakse, et vältida organismi levikut. 4. 2 Ilma et see piiraks punktis 4. 1 määratletud meetmeid, peavad liikmesriigid piiritletud tsoonis: a) viivitamata ja vähemalt kolme kasvatushooaja jooksul pärast saastunuks tunnistamist: aa) juhtudel, kui piiritletud tsoon on kindlaks määratud artikli 5 lõike 1 punkti a alapunkti iv alusel: — tagama oma vastutavate ametiasutuste järelevalve kartulimugulate või tomatite kasvatus-, ladustamis- või käitlemisruumides ning lepingu alusel kasutatavate kartuli- või tomatikasvatusseadmete ruumides, — nõudma seadmete ja ladude puhastamist ja vajadusel desinfitseerimist sellistes ruumides, kasutades asjakohaseid meetodeid, mis on määratletud punktis 3, 412 ET Euroopa Liidu Teataja 03/23. kd — nõudma ainult sertifitseeritud seemnekartuli või sellise seemnekartuli mahapanemist, mida on kasva- tatud ametliku kontrolli all vastavas piirkonnas, ning pärast saagikoristust selle seemnekartuli kontrol- limist, mis on kasvatatud artikli 5 lõike 1 punkti a alapunktile iii alusel tõenäoliselt saastunuks tunnis- tatud kohtades, — nõudma, et koristatud kartuliseemnevarusid hoitakse söögikartulist eraldi kõikides ruumides selles tsoonis, — viima läbi artikli 2 lõikes 1 määratletud ametliku uuringu, ab) juhtudel, kui pinnavesi on saastunuks tunnistatud artikli 5 lõike 1 punkti c alapunkti ii alusel või on organismi võimaliku leviku allikaks vastavalt V lisa punktile 2: — viima läbi iga-aastase uuringu asjakohasel ajal, sh proovide võtmise pinnaveest ja vastavatest orga- ja tegema katsed nismi maavitsalistest peremeestaimedest, mis on seotud vastavate veeallikatega, kooskõlas: — II lisas esitatud asjakohase meetodiga loetletud taimse materjali puhul, või — mõne muu ametlikult heakskiidetud meetodiga teistel juhtudel, — kehtestama kastmis- ja niisutuskavade ametliku kontrolli, sh keelama saastunuks tunnistatud vee kasutamise loetletud taimse materjali ja vajadusel muude peremeestaimede kastmiseks ja niisutami- seks, et vältida organismi levikut. Selle keelu võib uuesti läbi vaadata, toetudes iga-aastasel uuringul saadud tulemustele, — juhtudel, kui vedelate jäätmete äravoolukohad on saastunud, tuleb kehtestada ametlik kontroll loet- letud taimset materjali kasutava töötleva tööstuse või pakendamiskohtade jäätmete kõrvaldamise jaoks; b) kehtestama vajaduse korral kava kõikide seemnekartuli varude asendamiseks asjakohase ajavahemiku jooksul. 03/23. kd ET Euroopa Liidu Teataja 413 VII LISA Ametlikult heakskiidetud jäätmete kõrvaldamise seadmed, millele on osutatud VI lisa lõike 1 neljandas taandes, peavad vastama järgmistele tingimustele, et vältida organismi leviku ohtu: i) kartulite ja tomatite töötlemisjäätmed (k. a väljapraagitud kartulid, kartulikoored ja tomatid) ning muud kartulite ja tomatitega seotud tahked jäätmed tuleb hävitada kas — sügavale matmisega töötlemispaigas, kus puudub vee imbumise oht põllumajandusmaale või kokkupuude veega, mida võidakse kasutada põllumajandusmaa kastmiseks. Jäätmed tuleb toimetada otse töötlemispaika sellistel tingi- mustel, et ei ole ohtu jäätmete kadumiseks, või — tuhastamisega; ii) vedelate jäätmete töötlemine: enne äravoolu tuleb hõljuvaineid sisaldavad vedelad jäätmed filtreerida või setitada selliste ainete eemaldamiseks. Need ained tuleb hävitada vastavalt lõigus i sätestatule. Vedelad jäätmed tuleb seejärel kas: — enne hävitamist kuumutada vähemalt 70 oC-ni vähemalt 30 minuti jooksul või — hävitada muul ametlikult heakskiidetud viisil või ametliku järelevalve all, nii et ei ole ohtu jäätmete kokkupuuteks põllumajandusmaaga või veega, mida võidakse kasutada põllumajandusmaade kastmiseks. Nende meetmete üksik- asjadest teavitatakse teisi liikmesriike ja komisjoni