title: A Tanács 98/57/EK irányelve (1998. július 20.) a Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. elleni védekezésről

eurovoc_concepts:
food inspection
fruit vegetable
plant disease
plant health control
potato
protection of plant life

text: 03/23. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 375 31998L0057 1998. 8. 21. AZ EURÓPAI KÖZÖSSÉGEK HIVATALOS LAPJA L 235/1 A TANÁCS 98/57/EK IRÁNYELVE (1998. július 20. ) a Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. elleni védekezésről AZ EURÓPAI UNIÓ TANÁCSA, tekintettel az Európai Közösséget létrehozó szerződésre és külö- nösen annak 43. cikkére, tekintettel a Bizottság javaslatára (1), tekintettel az Európai Parlament véleményére (2), tekintettel a Gazdasági és Szociális Bizottság véleményére (3), mivel a Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. nevű káro- sító szervezet korábban Pseudomonas solanacearum (Smith)-ként volt ismert; mivel a jövőben valószínűleg Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. lesz a károsító szervezet általánosan elfo- gadott neve; mivel a Tanácsnak figyelembe kell vennie a tudo- mányos fejlődést ebben az irányelvében; mivel a burgonya- és a paradicsomtermesztés fontos helyet foglal el a Közösség mezőgazdaságában; mivel a burgonya- és a paradicsomtermés hozamát a károsító szervezetek folyama- tosan veszélyeztetik; mivel a burgonya- és a paradicsomtermesztés károsító szerve- zetek elleni védelme révén nemcsak szinten lehet tartani a termőképességet, hanem a mezőgazdasági termelékenységet is növelni lehet; mivel a károsító szervezeteknek az egyes tagállamokba való behurcolását megakadályozó növényvédelmi intézkedéseknek csak korlátozott hatása lenne, ha e szervezetek ellen nem véde- keznének egyidejűleg és módszeresen az egész Közösségben és nem akadályoznák meg ezek elterjedését; (1) HL C 124. , 1997. 4. 21. , 12. o. és HL C 108. , 1998. 4. 7. , 85. o. (2) HL C 14. , 1998. 1. 19. , 34. o. (3) HL C 206. , 1997. 7. 7. , 57. o. mivel a burgonyát és a paradicsomot károsító szervezetek et al. , a egyike a Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi burgonya barnarothadásának, valamint a burgonya és a paradi- csom baktériumos hervadásának kórokozója; mivel a Közösség bizonyos térségeiben már előfordultak a kórokozó által kivál- tott megbetegedések, és fertőzési források; léteznek még elszigetelt mivel a burgonya- és a paradicsomtermesztés a Közösség egész területén állandó veszélynek van kitéve, ha nem kerül sor e kultúrák vonatkozásában hatékony intézkedésekre a károsító szervezet lokalizálására és földrajzi elterjedésének meghatározá- sára, előfordulásának és elterjedésének megelőzésére, valamint – előfordulása esetén – továbbterjedésének megakadályozására és az ellene való védekezésre a felszámolás szándékával; mivel ennek érdekében bizonyos intézkedéseket kell foganatosí- tani a Közösségen belül; mivel a tagállamoknak lehetővé kell tenni, hogy amennyiben nem akadályozzák a burgonya és a paradicsom Közösségen belüli szabad mozgását, szükség esetén további, vagy még szigorúbb intézkedéseket hozzanak, ha a termékek károsító szervezeteinek a növények vagy növényi Közösségbe történő behurcolása és a Közösségen belüli elterje- dése elleni védekezési intézkedésekről szóló, 1976. december 21-i 77/93/EGK tanácsi irányelv (4) másképp nem rendeli; mivel a tagállamok kötelesek értesíteni a többi tagállamot és a Bizott- ságot minden ilyen jellegű intézkedésről; mivel az intézkedéseknek figyelembe kell venniük, hogy módszeres hatósági vizsgálatokra van szükség a kórokozó loka- lizálására; mivel a vizsgálatok keretében ellenőrzést és – tekin- tettel arra, hogy bizonyos környezeti feltételek mellett a megbe- tegedés látens marad és nem észlelhető sem a fejlődő burgo- nyanövényeken, sem pedig a betárolt burgonyagumókon – bizonyos esetekben mintavételt és laboratóriumi vizsgálatokat is kell végezni; mivel a legfontosabb tényező nem a kóroko- zónak a fejlődőkultúrában való elszaporodása, hanem a kór- okozó felszíni vizek és a burgonyafélékhez tartozó egyes vad növényfajok útján is terjedhet, és ezért a burgonya- és a paradi- csomkultúrák kórokozóval történő öntözése ezeknek a kultúráknak a megfertőzését eredményezheti; mivel a kórokozó képes áttelelni árvakelésű burgonya és paradicsom növényekben, és ezek az egyik tenyészidőről a másikra átvitt fertőzés forrásai lehetnek; mivel a kórokozó terjed fertőzött burgonyával vagy olyan ültető, betakarító, illetve anyagkezelő eszközökkel, szállító- és tárolóedényekkel történő érintkezése útján is, amelyek fertőzött burgonyával való korábbi érintke- zésük során a károsítóval szennyeződtek; fertőzött vízzel (4) HL L 26. , 1977. 1. 31. , 20. o. A legutóbb a 98/2/EK bizottsági irány- elvvel (HL L 15. , 1998. 1. 21. , 34. o. ) módosított irányelv. 376 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 03/23. kötet mivel a kórokozó elterjedése csökkenthető, illetve megakadá- lyozható ezen eszközök fertőtlenítésével; mivel a vetőburgonya minden ilyen szennyeződése a kórokozó elterjedésének súlyos jár; mivel a vetőburgonya látens fertőzöttsége kockázatával úgyszintén a kórokozó elterjedésének súlyos kockázatával jár, és ez megelőzhető olyan hivatalosan elismert program kere- tében termesztett vetőburgonya felhasználásával, amelynek során laboratóriumi vizsgálat alapján megállapították a vetőbur- gonya fertőzésmentességét; mivel a Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. európai körülmények közötti biológiájára és járványtanára vonatkozó jelenlegi tudományos ismeretek hiányosak, és néhány tenyész- időn belül várhatóan szükségessé válik a javasolt intézkedések felülvizsgálata; mivel a laboratóriumi vizsgálatok eljárásait várhatóan szintén javítani kell a jövőbeni kutatási eredmények tükrében, különös tekintettel a vizsgálati módszerek érzékeny- ségére és specificitására, a lehető legoptimálisabb vizsgálati módszerek kiválasztása és egységesítése érdekében; mivel az általános intézkedések részletes meghatározására, vala- mint a kórokozónak a területükre történő behurcolásának megakadályozására a tagállamok által tett további, illetve még szigorúbb intézkedésekhez tagállamok szorosan együttműködjenek a Bizottsággal a Növény-egészség- ügyi Állandó Bizottság (a továbbiakban: „a bizottság”) keretén belül, célszerű, hogy a ELFOGADTA EZT AZ IRÁNYELVET: 1. cikk Ez az irányelv a tagállamok a Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. , korábbi nevén Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith (a továbbiakban: „károsító”) ellen meghozandó intézkedé- seire alkalmazandó, a károsító szervezetnek az I. melléklet 1. szakaszában felsorolt gazdanövények (a továbbiakban: „felsorolt növényanyag”) vonatkozásában történő: 2. cikk fenyegető egyéb lehetséges (1) A tagállamok módszeres hatósági vizsgálatok keretében évente megvizsgálják a károsító szervezet előfordulását a terüle- tükről származó felsorolt növényanyagban. A felsorolt növény- anyag termesztését szennyező források meghatározására a tagállamok kockázati elemzést végeznek, és – hacsak a felmérés tanúsága szerint nincs tény- leges veszélye a károsító szervezet elterjedésének – a felsorolt növényanyag termőterületein célirányos hatósági vizsgálatok keretében megvizsgálják a károsító szervezet előfordulását a felsorolt növényanyagon kívüli növényekben, beleértve a burgonyafélékhez tartozó vad gazdanövényeket is, valamint a felsorolt növényanyag öntözésére vagy permetezéséhez használt felszíni vizekben, továbbá a felsorolt növényanyaggal foglal- kozó ipari feldolgozó- vagy csomagolóüzemek által kibocsátott és a felsorolt növényanyag öntözésére vagy permetezéséhez használt folyékony hulladékban. A célirányos vizsgálatok körét a felmért kockázat alapján kell meghatározni. A hatósági vizs- gálatok keretében a tagállamok vizsgálhatják a károsító szer- így például vezet előfordulását más anyagokban, termőkö- zegben, feldolgozó- vagy csomagolóüze- talajban vagy ipari mekből származó szilárd hulladékokban is. Az (1) bekezdésben foglalt hatósági vizsgálatokat az aláb- (2) biak szerint kell elvégezni: a) a felsorolt növényanyag vonatkozásában az I. melléklet II. szakasza 1. pontjának megfelelően; és b) a felsorolt növényanyagon kívüli gazdanövények, illetve a vizek vonatkozásában, beleértve a folyékony hulladékot is, megfelelő módszerek alkalmazásával, és szükség szerint mintavétellel, melyet hatósági vagy hatóságilag ellenőrzött laboratóriumi vizsgálatnak vetnek alá; c) szükség szerint egyéb anyagok vonatkozásában a megfelelő módszerek alkalmazásával. a) lokalizálására és földrajzi elterjedésének meghatározására; b) előfordulásának és elterjedésének megakadályozására; és c) előfordulása esetén, továbbterjedésének megakadályozására és az ellene való védekezésre, a felszámolás szándékával. illetékes hivatalos szervek A 77/93/EGK irányelv szerinti megalapozott tudományos és statisztikai elvek, valamint a káro- sító szervezet biológiája alapján meghatározzák a hatósági ellenőrzések keretében folytatott vizsgálatok, valamint a minta- vételek számának, eredetének, rétegezésének és időzítésének további részleteit, figyelembe véve a felsorolt növényanyagnak, illetve adott esetben a károsító szervezet egyéb gazdanövé- nyeinek az érintett tagállamon belüli sajátos termesztési rend- szereit. 03/23. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 377 (3) Az (1) bekezdésben foglalt hatósági vizsgálatok részle- teiről és eredményeiről a tagállamok évente értesítik a többi tagállamot és a Bizottságot az I. melléklet II. szakasza 2. pont- jának megfelelően. Az értesítéseket minden év június 1-jéig kell megküldeni, kivéve a vetőgumóként felhasznált burgonyáról szóló értesítést, amelyet szeptember 1-jéig küldenek meg a tagállamok. A kultúrnövények vizsgálati eredményeiről szóló részletes értesítés mindig az előző évre vonatkozik. A részletes értesítést a tagállamok a bizottságnak is megküldhetik. a tagállamok illetékes hivatalos szervei saját növénytermesz- tésük vonatkozásában származó növény a) megtiltják valamennyi olyan kultúrnövényből, tételből vagy szállítmányból gumó mozgását, amelyekből a mintákat vették, kivéve, ha mozgásuk hatósági ellenőrzés mellett történik, és ha megállapították, hogy nem elterjedésének tényleges áll veszélye; fenn a károsító szervezet és A 77/93/EGK irányelv 16a. cikkében rögzített eljárásnak (4) megfelelően a tagállamok megállapítják: b) lépéseket tesznek a károsító szervezet vélt előfordulása eredetének megállapítására; – a (2) bekezdés első albekezdésének b) pontjában meghatáro- zott vizsgálatra és laboratóriumi vizsgálatokra vonatkozó eljárást. A 77/93/EGK irányelv 16a. cikkében rögzített eljárásnak (5) megfelelően a tagállamok megállapíthatják: – a (2) bekezdés első albekezdésének c) pontjában meghatáro- zott vizsgálatra vonatkozó eljárást, – a (2) bekezdés második albekezdésében meghatározott rész- letes előírásokra vonatkozó szabályokat az előírások betartá- sának összehasonlíthatósága érdekében. 3. cikk A tagállamok gondoskodnak arról, hogy az illetékes hivatalos szerveik értesüljenek a károsító szervezet területükön vélt vagy bizonyított jelenlétéről. c) a károsító szervezet elterjedésének megakadályozására további megfelelő óvintézkedéseket hoznak a becsült kockázat mértéke alapján, különös tekintettel a felsorolt növényanyag termesztésére és az a) pont hatálya alá nem tartozó azon vetőburgonya-tételek mozgására, ahonnan az a) pontban említett mintákat vették. (3) A károsító szervezet előfordulásának olyan gyanúja esetén, amikor fennáll a felsorolt növényanyag vagy a felszíni vizek szennyeződésének az egyik tagállamból vagy tagállamba történő átvitelének veszélye, az a tagállam, amelyben az előfor- dulás gyanúját jelentették, a megállapított kockázat alapján haladéktalanul közli az érintett tagállammal vagy tagállamokkal a vélt előfordulással kapcsolatos részletes adatokat, és az emlí- tett tagállamok kötelesek megfelelően együttműködni a veszély elhárítására. Az értesített tagállam vagy tagállamok elrendelik a (2) bekezdés c) pontja szerinti óvintézkedéseket, és megteszik az (1) és (2) bekezdés szerint szükséges további intézkedéseket. A 77/93/EGK irányelv 16a. cikkében rögzített eljárásnak (4) megfelelően a tagállamok megállapíthatják: 4. cikk – a (2) bekezdés c) pontjában foglalt intézkedéseket. (1) A károsító szervezet előfordulásának gyanúja esetén, a gyanú igazolása vagy eloszlatása céljából az érintett tagállam illetékes hivatalos szervei gondoskodnak a hatósági vagy ható- ságilag ellenőrzött laboratóriumi vizsgálatok, a felsorolt nö- vényanyagra vonatkozóan a II. mellékletben meghatározott módszernek a III. melléklet 1. pontjában foglalt feltételek szerint, vagy – minden egyéb esetben – bármely más hivata- losan elfogadott módszer alkalmazásával történő végrehajtá- sáról. Amennyiben a gyanú beigazolódik, a III. melléklet 2. pontjában foglalt követelmények az irányadók. (2) Amíg a károsító szervezet előfordulásának (1) bekezdés szerinti gyanúja be nem igazolódik vagy eloszlatásra nem kerül, minden olyan gyanús esetben, ahol i. a károsító szervezet által okozott megbetegedés tüneteit észlelték, és a II. melléklet I. szakaszának 1. pontjában és a II. szűrővizsgálat vagy szakaszban meghatározott gyors -vizsgálatok eredménye pozitív volt; vagy ii. a II. melléklet szakaszának 2. pontjában és a III. szakaszban meghatározott szűrővizsgálat vagy -vizsgálatok eredménye pozitív volt, I. 5. cikk Amennyiben a felsorolt növényanyagra a II. mellékletben (1) meghatározott hatósági vagy hatóságilag ellenőrzött laborató- riumi vizsgálat vagy – minden egyéb esetben – bármely más hivatalosan elfogadott módszer megerősíti a károsító szervezet jelenlétét az ezen irányelvben foglaltak szerint vett mintában, a tagállam illetékes hivatalos szervei megfelelő tudományos elvek, a károsító szervezet biológiája, valamint gazdanövényeinek az adott országon belüli sajátságos termesztési, értékesítési és feldolgozó rendszerei alapján: a) a felsorolt növényanyag vonatkozásában i. vizsgálatot rendelnek el a szennyeződés mértékének és elsődleges forrásának vagy forrásainak meghatározására a IV. mellékletben foglalt rendelkezéseknek megfelelően, és a 4. cikk (1) bekezdése szerint további vizsgálatot folytatnak, legalább az egymással klonális rokonságban álló vetőburgonya-állományokra kiterjedően; és 378 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 03/23. kötet ii. fertőzöttnek minősítik azt a felsorolt növényanyagot, szállítmányt, illetve tételt, amelyből a minta származik, továbbá mindazokat a gépeket, járműveket, edényeket, raktárakat vagy annak részeit, valamint minden egyéb anyagot, beleértve a csomagolóanyagokat is, amelyek érintkezésbe kerültek azzal a felsorolt növényanyaggal, amelyből a minta származik; indokolt esetben fertő- zöttnek minősítik továbbá azt a táblát, védett termesz- tőegységet vagy egyéb termőhelyet, ahonnan a minta- vétel alapjául szolgáló növényanyagot betakarították; a tenyészidőszak során vett minták esetében pedig fertő- zöttnek minősítik a védett kultúráknak azt a tábláját, termőhelyét, illetve adott esetben a védett termesztőegy- ségét, ahonnan a minták származnak; és iii. az V. melléklet 1. pontjában foglalt rendelkezéseknek megfelelően meghatározzák a minősített szennyező- déssel betakarítás előtt vagy után termesztési, öntözési vagy permetezési kapcsolatok során való érintkezés, vagy klonális kapcsolat útján keletkezett valószínű szennyeződés mértékét; és iv. övezetet jelölnek ki a ii. alpont szerint minősített szeny- nyeződés, a iii. alpont szerint meghatározott mértékű valószínű szennyeződés és a károsító szervezet lehet- séges elterjedése alapján, az V. melléklet 2. pontja i. alpontjának megfelelően; b) az a) pontban nem említett olyan termesztett gazdanövé- nyek vonatkozásában, ahol a felsorolt növényanyag termesz- tése veszélyben forog, i. vizsgálatot rendelnek el az a) pont i. alpontjának megfe- lelően; és ii. fertőzöttnek minősítik a károsító szervezetnek azokat a gazdanövényeit, amelyekből a minta származik; és iii. megállapítják a valószínű fertőzés mértékét és övezetet jelölnek ki az a) pont iii. és iv. alpontjának megfelelően a felsorolt növényanyag termesztésének vonatkozásában; c) a felszíni vizek (beleértve a felsorolt növényanyaggal foglal- kozó feldolgozó- vagy csomagolóüzemek által kibocsátott folyékony hulladékot is) és a burgonyafélékhez tartozó olyan vad gazdanövények vonatkozásában, felsorolt növényanyag termesztését a felszíni vízzel történő öntözés, permetezés, illetve a felszíni víz kiáradása veszélyezteti, ahol a i. a fertőzés mértékének megállapítására hatósági ellen- őrzésre is kiterjedő vizsgálatot folytatnak a felszíni vízből és szükség esetén a burgonyafélékhez tartozó vad gazdanövényekből megfelelő időpontokban vett min- tákon; és ii. az i. alpontnak megfelelően végzett vizsgálat alapján a indokolt szolgáló felszíni vizet mintavétel mértékben fertőzöttnek minősítik; és alapjául iii. meghatározzák a valószínű fertőzöttséget és övezetet jelölnek ki a ii. alpont szerint minősített fertőzés és a károsító szervezet valószínű elterjedése alapján, figye- lembe véve az V. melléklet 1. pontjában és 2. pontjának ii. alpontjában foglalt rendelkezéseket. (2) Az V. melléklet 3. pontjában foglalt rendelkezéseknek megfelelően a tagállamok haladéktalanul értesítik a többi tagál- lamot és a Bizottságot az (1) bekezdés a) pontjának ii. alpontja és az (1) bekezdés c) pontjának ii. alpontja szerint minősített fertőzésről, valamint az (1) bekezdés a) pontjának iv. alpontja és – megfelelő esetben – az (1) bekezdés c) pontjának iii. alpontja szerinti övezet kijelölésének részleteiről. Az e bekez- désben meghatározott részletes értesítést a tagállamok a bizott- ságnak is megküldhetik. A tagállamok ugyanakkor megküldik a Bizottságnak az V. melléklet 4. pontjában meghatározott további értesítést. Az ezen albekezdésben előírt részletes értesítést a tagállamok hala- déktalanul megküldik a bizottság tagjainak. (3) A (2) bekezdés szerinti értesítés és az abban foglalt elemek eredményeként az értesítésben megjelölt többi tagállam az (1) bekezdés a) pontjának i. alpontja és – megfelelő esetben – az (1) bekezdés c) pontjának i. alpontja értelmében vizsgálatot indít, és szükség esetén további intézkedéseket tesz az (1) és a (2) bekezdésben foglaltak szerint. 6. cikk (1) A tagállamok elrendelik, hogy az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának ii. alpontja szerint fertőzöttnek minősülő felsorolt növényanyagot tilos elültetni, és – az adott tagállam illetékes hivatalos szerveinek ellenőrzése és jóváhagyása mellett – a VI. melléklet 1. pontjában foglalt valamely rendelkezésnek kell alávetni, meggyőződve arról, hogy nem áll fenn a károsító szer- vezet elterjedésének azonosítható veszélye. A tagállamok elrendelik, hogy az 5. cikk (1) bekezdése a) (2) pontjának iii. alpontja, és c) pontjának iii. alpontja értelmében valószínűleg fertőzöttnek minősülő felsorolt növényanyagot, beleértve az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának iii. alpontja értelmében valószínűleg fertőzöttnek minősülő helyen termesz- tett veszélyeztetett növényanyagot is, tilos elültetni, és az adott tagállam illetékes hivatalos szerveinek ellenőrzése mellett a VI. melléklet 2. pontjában foglaltaknak megfelelően kell felhasz- nálni vagy eltávolítani, meggyőződve arról, hogy nem áll fenn a károsító szervezet elterjedésének azonosítható veszélye. (3) A tagállamok elrendelik, hogy az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának ii. alpontja értelmében fertőzöttnek, vagy az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának iii. alpontja és c) pontjának iii. alpontja értelmében valószínűleg szennyezettnek minősülő gépeket, járműveket, edényeket, raktárakat vagy annak részeit, valamint minden egyéb anyagot, beleértve a csomagoló- anyagokat is, meg kell semmisíteni, vagy megfelelő módszerrel fertőtleníteni kell a VI. melléklet 3. pontjában foglaltak szerint. A fertőtlenítést követően ezeket az anyagokat a továbbiakban nem kell fertőzöttnek tekinteni. 03/23. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 379 (2) és Az (1), (3) bekezdésben foglalt (4) intézkedések sérelme nélkül a tagállamok elrendelik, hogy az 5. cikk (1) bekezdés a) pontja iv. alpontjának és c) pontja iii. alpontjának megfelelően kijelölt övezetben a VI. melléklet 4. 1. és 4. 2. pont- jában foglaltak szerint tenni. A tagállamok évente részletesen értesítik a többi tagállamot és a Bizottságot ezekről az intézkedésekről. A részletes értesítést a tagállamok a bizottságnak is megküldhetik. intézkedéseket kell további 9. cikk A 77/93/EGK irányelv rendelkezéseinek sérelme nélkül, a 95/44/EK (1) irányelv szerinti vizsgálati, tudományos vagy fajta- szelekciós munka céljából a tagállamok eltéréseket engedélyez- hetnek az irányelv 6. és 8. cikkében meghatározott intézkedé- sektől. 7. cikk 10. cikk (1) A tagállamok elrendelik, hogy a vetőburgonyának meg kell felelnie a 77/93/EGK irányelv követelményeinek, és közvet- lenül olyan hivatalosan elismert program keretében termesztett burgonyaanyagból kell származnia, amelyet hatósági vagy ható- ságilag ellenőrzött vizsgálat során a II. mellékletben foglalt a károsító szervezettől mentesnek megfelelő módszerrel találtak. A fent említett vizsgálatot a tagállamok az alábbiak szerint végzik el: Saját növénytermesztésük vonatkozásában a tagállamok további vagy szigorúbb intézkedéseket vezethetnek be a károsító szer- vezet elleni védekezés, vagy elterjedésének megakadályozása érdekében, feltéve hogy ezek az intézkedések összhangban állnak a 77/93/EGK irányelv rendelkezéseivel. A tagállamok részletesen értesítik a többi tagállamot és a Bizott- ságot ezekről az intézkedésekről. A részletes értesítést a tagál- lamok a bizottságnak is megküldhetik. a) amennyiben saját vetőburgonya-termesztésük során a káro- sító szervezet előfordulását állapították meg 11. cikk i. a korábbi szaporítások vizsgálatával, beleértve a kiinduló vegetatívszaporulat-szelekciót és a vetőburgonya teljes vegetatívszaporulat-alapjának módszeres vizsgálatát; vagy ii. amennyiben megállapításra került, hogy nincs klonális kapcsolat, a vetőburgonya teljes vegetatívszaporulat-alap- jának vagy korábbi szaporításainak vizsgálatával, bele- értve a kiinduló vegetatívszaporulat-szelekciót is; és b) egyéb esetekben vagy a kiinduló vegetatívszaporulat- szelekció minden egyes növényének, vagy a vetőburgonya- alapból, vagy a korábbi szaporításokból vett reprezentatív minták vizsgálatával. A 77/93/EGK irányelv 16a. cikkében rögzített eljárásnak (2) megfelelően a tagállamok megállapíthatják: – az (1) bekezdés második albekezdése a) pontjának alkalmazá- sára vonatkozó részletes szabályokat, – az (1) bekezdés második albekezdésének b) pontjában foglalt reprezentatív mintákra vonatkozó szabályokat. 8. cikk Ezen irányelv mellékleteit a Tanács a tudományos vagy műszaki ismeretek fejlődése tükrében a 77/93/EGK irányelv 16a. cikkében foglalt eljárásnak megfelelően módosíthatja. A II. mellékletben meghatározott módszerek és a VI. melléklet 4. 1. és 4. 2. pontjában foglalt intézkedések vonatkozásában a Bizottság jelentést készít a módszerek és az intézkedések felül- vizsgálatáról a szerzett tapasztalatok alapján, és a jelentést 2002. január 1-jéig benyújtja a bizottságnak. 12. cikk A tagállamok hatályba léptetik azokat a törvényi, rende- (1) rendelkezéseket, amelyek szükségesek leti és közigazgatási ahhoz, hogy ennek az irányelvnek 1999. augusztus 21-éig megfeleljenek. Erről haladéktalanul tájékoztatják a Bizottságot. Amikor a tagállamok elfogadják ezeket az intézkedéseket, azokban hivatkozni kell erre az irányelvre, vagy azokhoz hiva- talos kihirdetésük alkalmával ilyen hivatkozást kell fűzni. A hivatkozás módját a tagállamok határozzák meg. (2) A tagállamok haladéktanul közlik a Bizottsággal nemzeti joguknak azokat a főbb rendelkezéseit, amelyeket az irányelv által szabályozott területen fogadtak el. A Bizottság tájékoztatja erről a többi tagállamot. A tagállamok megtiltják a károsító szervezet tartását és keze- lését. (1) HL L 184. , 1995. 8. 3. , 34. o. A legutóbb a 97/46/EK (HL L 204. , 1997. 7. 31. , 43. o. ) bizottsági irányelvvel módosított irányelv. 380 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 03/23. kötet 13. cikk Kelt Brüsszelben, 1998. július 20-án. Ez az irányelv az Európai Közösségek Hivatalos Lapjában való kihirdetésének napján lép hatályba. Ennek az irányelvnek a tagállamok a címzettjei. 14. cikk a Tanács részéről az elnök W. MOLTERER 03/23. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 381 I. MELLÉKLET I. SZAKASZ A Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. 1. cikkben említett gazdanövényeinek felsorolása Solanum tuberosum L. növényei (gumóit is beleértve), a magok kivételével Lycopersicon lycopersicum (L. ) Karsten ex Farw. növényei, termésük és magvaik kivételével Burgonya Paradicsom II. SZAKASZ Vizsgálatok 1. A 2. cikk (2) bekezdésének a) pontjában meghatározott hatósági vizsgálatoknak a károsító szervezet biológiáján és az adott tagállam sajátos termesztési rendszerein kell alapulniuk, továbbá ki kell terjedniük a következőkre: i. burgonya esetében; – a fejlődő növény megfelelő időpontokban végzett szemrevételezéses vizsgálatára, illetve mintavételre vető- vagy egyéb burgonyákból, a tenyészidőszak vagy a raktározás során. A mintákat hatósági vagy hatóságilag ellenőrzött szemlének kell alávetni, a gumók felvágásával, és – vetőburgonyáknál és indokolt esetben egyéb burgonyáknál is, hatósági vagy hatóságilag ellenőrzött laborató- riumi vizsgálatra a II. mellékletben meghatározott módszer segítségével; ii. paradicsom esetében; – legalább a szakmai felhasználás céljából átültetésre kerülő fejlődő növények megfelelő időpontokban végzett szemrevételezéses vizsgálatára. 2. A 2. cikk (3) bekezdésében meghatározott hatósági vizsgálatokról szóló értesítésnek magában kell foglalnia a következőket: i. burgonya vizsgálata esetén: – a vető- és egyéb burgonyákkal beültetett összterület becsült nagysága hektárban, – a minták osztályozása a vetőburgonya kategóriái, áruburgonya és adott esetben régiók szerint, – a vizsgálati céllal vett minták száma és a mintavételek időpontja, – a szabadföldi helyszíni szemlék száma, – a gumók szemrevételezéses vizsgálatainak száma (és a minta nagysága); ii. legalább a szakmai felhasználás céljából átültetésre kerülő fejlődő paradicsomnövények megfelelő időpon- tokban végzett szemrevételezéses vizsgálata esetén: – a növények becsült összmennyisége, – a szemrevételezéses vizsgálatok száma; iii. a burgonyán és a paradicsomon kívüli egyéb gazdanövények – beleértve a burgonyafélékhez tartozó vad gazdanövényeket is – vizsgálata esetén: – fajok, – a minták száma és a mintavételek időpontja, – megfelelő esetben a mintavétel során vizsgált terület vagy folyóvíz, – elemzési módszer; iv. vizek és az ipari feldolgozó- vagy csomagolóüzemek által kibocsátott folyékony hulladék vizsgálata esetén: – a minták száma és a mintavétel időpontja, – terület, folyóvíz vagy az építmény fekvése, ahonnan a mintát vették, – elemzési módszer. 382 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 03/23. kötet II. MELLÉKLET VIZSGÁLATI MÓDSZER A RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL. KÓRMEGHATÁ- ROZÁSÁRA, KIMUTATÁSÁRA ÉS AZONOSÍTÁSÁRA A bemutatott módszer az alábbiakkal kapcsolatos eljárások leírását tartalmazza: A VIZSGÁLATI MÓDSZER HATÁLYA i. a burgonyagumó barnarothadásának, valamint a burgonya- és a paradicsomnövények bakteriális hervadásának kórmeghatározása; ii. a Ralstonia solanacearum kimutatása burgonyagumó-mintákban; iii. a Ralstonia solanacearum azonosítása. A függelékek részletes leírást tartalmaznak a vizsgálati anyagok, azaz a táptalajok, a pufferek, az oldatok és a reagensek készítésére. TARTALOM I. SZAKASZ A vizsgálati módszer alkalmazása 1. A burgonyagumó barnarothadásának, valamint a burgonya- és a paradicsomnövények bakteriális hervadásának kórmeghatározása. 383 383 2. A Ralstonia solanacearum kimutatása és azonosítása burgonyagumó-mintákban. 385 II. SZAKASZ A burgonyagumó barnarothadásának, valamint a burgonya- és a paradicsomnövények bakteriális hervadásának kórmeghatározása 387 1. Tünetek. 387 2. Gyors szűrővizsgálatok. 387 3. Izolálási eljárás. 388 4. Igazoló vizsgálatok. 388 III. SZAKASZ A Ralstonia solanacearum kimutatása és azonosítása burgonyagumó-mintákban 391 1. A minta előkészítése a vizsgálathoz. 391 2. Immunfluoreszcencia (IF) teszt. 392 3. Enzyme linked Immuno Sorbent Assey (ELISA) teszt. 394 4. Polimeráz láncreakció (PCR™) teszt. 394 5. Szelektív lemeztenyésztéses teszt. 396 6. Bioteszt. 397 7. Dúsítási tesztek. 397 8. Patogenitás vizsgálat. 397 1. függelék Táptalajok Ralstonia solanacearum izolálásához és tenyésztéséhez. 398 2. függelék Anyagok a minta előkészítéséhez. 399 3. függelék Anyagok az IF teszthez. 400 4. függelék A fertőzöttségi szint meghatározása az IF tesztnél. 401 5. függelék Anyagok az ELISA teszthez. 402 6. függelék Anyagok a PCR teszthez. 403 7. függelék Anyagok a szelektív lemeztenyésztéses és dúsítási vizsgálatokhoz. 403 Hivatkozások. 404 03/23. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 383 I. SZAKASZ A VIZSGÁLATI MÓDSZER ALKALMAZÁSA 1. A burgonyagumó barnarothadásának, valamint a burgonya- és a paradicsomnövények bakteriális hervadásának kórmeghatáro- zása A vizsgálati eljárás a barnarothadás jellegzetes vagy gyanított tüneteit mutató burgonyagumó és a bakteriális hervadás jellegzetes vagy gyanított tüneteit mutató burgonya- és paradicsomnövények vizsgálatára szolgál. Tartalmaz egy gyors szűrővizsgálatot, a kóroko- zónak a fertőzött edénynyalábszövetből való izolálását diagnosztikai táptalajokon, valamint pozitív eredmény esetén a tenyészet Ralstonia solanacearum-ként történő azonosítását. Folyamatábra 384 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 03/23. kötet A folyamatábrában szereplő hivatkozások: (1) (2) (3) (4) A tünetek leírását a II. 1. szakasz tartalmazza. A gyors szűrővizsgálatok megkönnyítik a valószínűsített kórisme felállítását. A megfelelő vizsgálatok a következők: – áramlásvizsgálat a szárból vett edénynyalábszövetben (II. 2. szakasz), – vizsgálat poli-ß-hidroxi-butirát szemcsékre (II. 2. szakasz), – IF teszt (III. 2. szakasz), – ELISA teszt (III. 3. szakasz), – PCR teszt (III. 4. szakasz). Bár a kórokozó izolálása a jellegzetes tüneteket mutató növényi anyagból hígításos lemeztenyésztéssel egyszerű, előfordulhat, hogy a fertőzés előrehaladottabb stádiumában a tenyésztés nem jár sikerrel. A beteg szöveten elszapo- rodó szaprofita baktériumok túlnőhetnek a kórokozón, vagy gátolhatják annak szaporodását az izolálásra szolgáló táptalajon. Ha az izolációs teszt negatív, de a betegség tünetei jellegzetesek, akkor az izolálást meg kell ismételni, legcélszerűbben egy szelektív lemeztenyésztéses teszttel. A Ralstonia solanacearum tiszta tenyészete megbízhatóan azonosítható a II. 4. 1. szakaszban leírt tesztek legalább egyi- kének és a patogenitás vizsgálatnak (II. 4. 3. szakasz) az együttes alkalmazásával. A törzs jellemzése nem kötelező, de minden egyes új esetben ajánlott. 03/23. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 385 2. A Ralstonia solanacearum kimutatása és azonosítása burgonyagumó-mintákban Az eljárás lappangó fertőzések kimutatására szolgál burgonyagumókban egy vagy inkább több szűrővizsgálattal, amelyek, ha pozitívak, a kórokozó izolálásával egészülnek ki; ezt jellegzetes telepek izolálása esetén a tiszta tenyészet Pseudomonas solanacearum-ként történő azono- sítása követi. Folyamatábra 386 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 03/23. kötet A folyamatábrában szereplő hivatkozások: (1) A m i n t a m é r e t e A standard mintaméret 200 gumó. A módszer azonban könnyen alkalmazható 200-nál kevesebb gumót tartalmazó mintákra is. (2) S z ű r ő v i z s g á l a t v a g y - v i z s g á l a t o k Egyetlen teszt esetleg nem eléggé érzékeny vagy megbízható ahhoz, hogy a Ralstonia solanacearum-ot a mintában kimutassa. Ezért egynél több teszt ajánlott, és ezeknek a teszteknek célszerűen különböző biológiai elveken kell alapulniuk. (3) I m m u n f l u o r e s z c e n c i a ( I F ) t e s z t Az indirekt IF teszt egy jól megalapozott szűrővizsgálat. Ez előny más olyan tesztekkel szemben, amelyek nincsenek még teljesen kifej- lesztve vagy validálva. A tesztet használják sok más jogilag szabályozott baktériumra, például a Clavibacter michiganensis subsp. sepedo- nicus-ra. Az e módszerben meghatározott értékelési paraméterekkel ez egy érzékeny teszt (az érzékenységi küszöb 103–104 sejt/ml burgonyakivonat-pellet). A vizsgálati eredmény megbízhatóságának kritikus tényezője az antiszérum minősége. Csak magas titerű antiszérum megfelelő (minimum 2 000 a nyers antiszérumra), és minden tesztet az antiszérum titerénél, vagy egy hígítással annak titere alatt kell elvégezni. Az indirekt módszer a célszerűbb. Direkt módszer akkor alkalmazható, ha a teszt érzékenységi szintje és specificitása megegyezik a közvetett módszerével. Az IF teszt előnye, hogy a sejtek festődési morfológiája és fluoreszcencia-intenzitása szubjektíven értelmezhető és információt ad a reakció specificitásáról. A talajból vagy a burgonyaszövetekből származó Ralstonia solanacearum sejtmorfológiáját mutató, szerológiailag rokon baktériumok közötti keresztreakciók gyakoriak. Az IF teszt használható egyedüli szűrővizsgálatként, bár olyan esetekben, amikor keresztreakciók gyanúja áll fenn, egy más biológiai elven alapuló szűrővizsgálatot is el kell végezni. Ilyen esetekben a szelektív lemeztenyésztés a legalkalmasabb teszt. (4) S z e l e k t í v l e m e z t e n y é s z t é s A módosított SMSA táptalajjal és az ebben a módszerben leírt vizsgálati módszerrel ez egy érzékeny és szelektív teszt a Ralstonia sola- nacearum kimutatására. Az eredmény a minta készítését követő 3–6 nap múlva rendelkezésre áll. A kórokozó közvetlenül kitenyész- tésre kerül és könnyen azonosítható. A lehetőségek teljes kihasználása érdekében a vizsgálat a köldöki részek gondos előkészítését igényli a burgonyagumóval kapcsolatos másodlagos baktériumok elkerülése végett, amelyek versengenek a Ralstonia solanacearum-mal a táptalajon és befolyásolhatják a kórokozó fejlődését. Néhány törzs gyengébben szaporodhat, mivel a táptalaj összetevői hatással lehetnek a célorganizmusra. Gondot kell fordítani a Ralstonia solanacearum megkülönböztetésére is más olyan baktériumoktól, amelyek a táptalajon fejlődhetnek. Szelektív lemeztenyésztést használhatunk egyedüli szűrővizsgálatként, feltéve hogy azokban az esetekben, amikor gyanús, hogy a lemezeken lévő más baktériumok a Ralstonia solanacearum fejlődését gátolják és a mintára negatív eredményt kapunk, a mintát valamely más módszer alkalmazásával felülvizsgáljuk annak érdekében, hogy a diagnózist megerősítsük vagy cáfoljuk. Ilyen esetekben az IF teszt a legmegfelelőbb módszer. (5) E L I S A t e s z t Az ELISA teszt általában kevésbé érzékeny, mint az IF teszt (az érzékenységi küszöb 104–105 sejt/ml burgonyakivonat-pellet). A teszt olcsó és gyors, de hátránya, hogy általában gyakrabban ad hamis pozitív eredményeket (keresztreakciók) és hamis negatív eredmé- nyeket (fenolos molekulák gátló hatása a burgonyakivonatban). Az antiszérum specificitására vonatkozó követelmények rendkívül szigorúak. Az ELISA teszt nem alkalmazható egyedüli szűrővizsgálatként. (6) P C R t e s z t A PCR nagyon érzékeny kimutatásra ad lehetőséget, bár a tesztet könnyen gátolják növény- vagy gumókivonat-komponensek, ami hamis negatív eredményhez vezethet. Egyes nemesített burgonyafajták több inhibitort tartalmaznak, mint mások. Ezért ezeket az inhi- bitorokat el kell távolítani. A gátlás csökkenthető hígítással, de ilyenkor a Ralstonia solanacearum populációk is felhígulnak. Nagy gondot kell fordítani a minta és a teszt előkészítésének minden lépésére, hogy a szennyeződést megakadályozzuk, mivel az hamis pozitív vizsgálati eredményekhez vezetne. A hamis pozitív eredmények származhatnak más organizmusok szekvencia-homológiájából is. Mindezek miatt a közvetlen PCR nem használható egyedüli szűrővizsgálatként. (7) D ú s í t á s i t e s z t Burgonyakivonat-pellet minták félig szelektív, mint például módosított SMSA bouillonban történő inkubálása, lehetővé teszi a Ralstonia solanacearum felszaporítását. Talán még fontosabb, hogy ez az eljárás felhígítja az ELISA vagy a PCR teszt potenciális inhibitorait is. A Ralstonia solanacearum-dúsító bouillonban így kimutatható IF, ELISA és PCR tesztekkel. Nem ajánljuk, hogy a közvetlen lemeztenyésztés a dúsított bouillonokból történjék. Ezek a dúsító módszerek még nem eléggé kipróbáltak és teszteltek. Azért szerepelnek itt, mert ígéretesnek tűnnek. A velük kapcsolatos viszonylag kevés tapasztalat miatt azonban nem használhatóak egyedüli kimutatási módsze- rekként. (8) B i o t e s z t A biotesztet Ralstonia solanacearum burgonyakivonat-pelletekből való izolálására használjuk szelektív dúsítással egy gazdanövényben, és e módszer paradicsomnövény és padlizsán esetében is alkalmazható. A teszt optimális inkubálási körülményeket igényel, amelyeket ebben a módszerben határoztak meg. A Ralstonia solanacearum-ra SMSA táptalajon gátló hatást kifejtő baktériumok a legnagyobb való- színűség szerint nem fogják zavarni ezt a tesztet. (9) I g a z o l ó v i z s g á l a t v a g y v i z s g á l a t o k A Ralstonia solanacearum színtenyészete megbízhatóan azonosítható a II. 4. 1 szakaszban leírt tesztek legalább egyikének és a patogenitás vizsgálat (II. 4. 3 szakasz) együttes alkalmazásával. A törzs jellemzése nem kötelező, de minden egyes új esetben ajánlott. 03/23. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 387 A burgonyagumó barnarothadásának, valamint a burgonya- és paradicsomnövények bakteriális hervadásának kórmeghatározása II. SZAKASZ 1. 1. 1. Tünetek T ü n e t e k b u r g o n y á b a n A burgonyanövény. A fertőzés korai szakaszában magas hőmérsékleten nappal a növények teteje felé haladva a levelek hervadása jelentkezik, amit éjszaka regenerálódás követ. A hervadás gyorsan visszafordíthatatlanná válik és a növény elpusztulásához vezet. Az elhervadt növé- nyek keresztirányban átvágott száraiban lévő edénynyalábszövet megbarnulhat és a metszéslapon tejszerű szivárgás jelentkezhet, vagy onnan összenyomással könnyen kipréselhető. Amikor egy elvágott szárat függőlegesen vízbe helyezünk, baktériumnyálka áramlik ki az edénynyalábkötegekből. A burgonyagumó. A burgonyagumókat keresztirányban kell elvágni közel a köldöki részhez (= stolon). A fertőzés korai szakaszában az edénynyalábgyűrű üvegszerű sárgától világosbarnáig terjedő elszíneződése figyelhető meg, és az edénynyalábgyűrűből halvány krémszerű spontán szivárgás jelenik meg néhány perc elteltével, vagy akkor, ha gyenge nyomást gyakorolunk hüvelykujjunkkal a héjra a vágási felülethez közel. Később az edénynyaláb elszíneződés kifejezettebben barnává válik és az elhalás kiterjedhet a parenchymás szövetre is. Előrehaladott szakaszokban a fertőzés a köldöki résztől és a szemektől kifelé tör előre, és vörösesbarna, kissé bemélyedő elváltozásokat eredményezhet a héjon, amelyből baktériumnyálka áramolhat ki, talajrészecskék odatapadását eredményezve. 1. 2. T ü n e t e k p a r a d i c s o m b a n A paradicsomnövény. Az első látható tünet a legfiatalabb levelek petyhüdt megjelenése. A kórokozó részére kedvező környezeti feltételek mellett (talajhőmérséklet kb. 25 °C, telített páratartalom), a növény egyik oldalának vagy a teljes növénynek az epinasztiája vagy elherva- dása következik be néhány napon belül, amely a teljes növény elpusztulásához vezet. Kevésbé kedvező körülmények között (21 °C alatti talajhőmérséklet) nagy számú járulékos gyökér fejlődhet ki a száron. Egy nyálkás fonal figyelhető meg a szár mentén, amely a vaszkuláris rendszer elhalásának a bizonyítéka. Amikor a szárat keresztirányban elvágjuk, akkor a szár elszíneződött barna edénynyalábszövetei fehér vagy sárgás baktériumnyálkát bocsátanak ki magukból cseppek formájában. 2. Gyors szűrővizsgálatok A gyors szűrővizsgálatok megkönnyítik a valószínűsített diagnózis felállítását. A következő tesztek közül egyet vagy többet használunk: Áramlásvizsgálat a szárban A Ralstonia solanacearum hervadó burgonya- vagy paradicsomszárakban való jelenlétét a következő egyszerű valószínűsítő vizsgálattal hatá- rozhatjuk meg: Vágjuk el a szárat közvetlenül a talajszint felett. Helyezzük a metszéslapot egy vízzel teli pohárba. Röviddel ezután baktériumnyálka fog spontán módon kiáramlani az edénynyalábokból. Semmilyen más, burgonya- és paradicsomnövények edénynyalábfertőzését okozó bakté- rium nem mutatja ezt a jelenséget. Poli-β-hidroxi-butirát (PHB) szemcsék kimutatása A Ralstonia solanacearum sejtjeiben lévő PHB szemcsék níluskék „A” vagy szudánfekete „B” festéssel tehetők láthatóvá. Készítsünk kenetet a szivárgó anyagból vagy a szuszpendált szövetből mikroszkópos tárgylemezen, vagy készítsünk kenetet YPGA vagy SPA táptalajon nyert 48 órás tenyészetből (1. függelék). Készítsünk pozitív kontrollkeneteket egy 2-es biológiai változatba/3-as fajtába tartozó törzsből és – ha ezt hasznosnak véljük – egy heterológ törzsből készítsünk negatív kontrollkenetet is. Hagyjuk megszáradni. A lemez alsó felületét néhányszor gyorsan vigyük át lángon, ameddig a kenet nem rögzül. N í l u s k é k t e s z t 1. Öntsünk a rögzített kenetre níluskék „A” 1 %-os vizes oldatot. Inkubáljuk 10 percig 55 °C-on. 2. Öntsük le róla a festékoldatot. Öblítsük le óvatosan folyó csapvízzel. Távolítsuk el a felesleges vizet itatóspapírral. 3. Öntsük a kenetre ecetsav 8 %-os vizes oldatát. Inkubáljuk egy percig szobahőmérsékleten. 4. Öblítsük le óvatosan folyó csapvízzel. Itassuk szárazra itatóspapírral. 5. Nedvesítsük meg újra egy csepp vízzel. Tegyünk rá fedőlemezt. 6. Vizsgáljuk meg a megfestett kenetet epifluoreszcens mikroszkóppal 450 nm hullámhosszon, olajimmerzióval, 1 000-szeres nagyítással. Figyeljük meg a PHB szemcsék ragyogó narancsszínű fluoreszkálását. Figyeljük meg normál fénynél is, hogy meggyőződjünk arról, hogy a szemcsék intracellulárisak és a sejtmorfológia a Ralstonia solanacearum-ra jellemző. 388 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 03/23. kötet S z u d á n f e k e t e t e s z t 1. Öntsünk a rögzített kenetre 0,3 %-os szudánfekete „B” 70 %-os etil-alkoholos oldatát. Inkubáljuk 10 percig szobahőmérsékleten. 2. Öntsük le a festékoldatot. Öblítsük le rövid ideig csapvízzel. Távolítsuk el a vízfelesleget. A vízfelesleget itatóspapírral itassuk le. 3. Merítsük a kenetet rövid ideig xilolba. Itassuk szárazra itatóspapírral. Vigyázat! A xilol veszélyes anyag. Dolgozzunk vegyifülkében. 4. Öntsünk a rögzített kenetre 0,5 %-os (m/v) vizes szafraninoldatot, és hagyjuk 10 másodpercig szobahőmérsékleten. Vigyázat! A szafranin veszélyes anyag. Dolgozzunk vegyifülkében. 5. Öblítsük le óvatosan folyó csapvízzel. Itassuk szárazra szűrőpapíron. Tegyünk rá fedőlemezt. 6. Vizsgáljuk meg a megfestett kenetet átmenő fényű olajimmerziós fénymikroszkóppal 1 000-szeres nagyításnál. A PHB szemcsék a Ralstonia solanacearum sejtekben kékesfeketére színeződnek. A sejtfal rózsaszínűre festődik. E g y é b t e s z t e k Megfelelő szűrővizsgálat még az IF teszt (III. 2. szakasz), az ELISA teszt (III. 3. szakasz) és a PCR teszt (III. 4. szakasz). 3. 3. 1. 3. 2. 3. 3. 3. 4. Izolálási eljárás Távolítsuk el a szivárgásos vagy elszíneződött szövetet tartalmazó részeket a burgonyagumó edénynyalábgyűrűjéből vagy a burgonya- és paradicsomnövények szárának edénynyalábereiből. Szuszpendáljuk kis térfogatú steril desztillált vízben vagy 50 mM foszfátpufferben. Hagyjuk 5–10 percig állni. Készítsünk a szuszpenzióból tízes léptékű hígítássorozatot, pl. 1/10 és 1/100 vagy még többet, amennyit megfelelőnek ítélünk. Vigyük át a szuszpenzió egy standard térfogatát és a hígításokat egy általános tápközegre (NA, YPGA és SPA, 1. függelék) és/vagy Kelman- féle tetrazólium közegbe (1. függelék) és/vagy SMSA szelektív közegbe (7. függelék). Terítsük szét vagy szélesszük megfelelő hígításos lemeztenyésztéses technikával. Ha hasznosnak ítéljük meg, készítsünk külön lemezeket minden egyes alkalmazott közegből a Ralstonia sola- nacearum virulens, 2-es biológiai változatba/3-as fajtába tartozó törzsének hígított sejtszuszpenzió-tenyészetével mint pozitív kontrollal. Inkubáljuk a lemezeket három napig 28 °C hőmérsékleten. Az inkubálási idő meghosszabbítható 6 napra, ha a szaporodás lassú, de az SMSA lemezeken a telepek gyakran rendellenessé válnak és elhalnak. Az általánosan használt folyadékszerű telepekben fejlődnek, gyakran jellegzetes spirálokkal. táptalajokon a Ralstonia solanacearum virulens izolátumai gyöngyházfényű fehér, lapos, szabálytalan és A Kelman-féle tetrazóliumos táptalajon a Ralstonia solanacearum fertőző izolátumainak jellegzetes telepei krémszerű, lapos, szabálytalan és folyadékszerű megjelenésűek, közepükön vérvörös színű spirálokkal. A Ralstonia solanacearum avirulens formái vajszerű, mélyvörös tele- peket képeznek. SMSA táptalajon a Ralstonia solanacearum virulens izolátumainak jellegzetes telepei tejfehér, lapos, szabálytalan és folyadékszerű megjele- nésűek és közepükön vérvörös színűek. A Ralstonia solanacearum avirulens formái kevésbé folyadékszerű telepek, amelyek teljesen rózsaszíntől vörösig terjedő színűek az SMSA táptalajon. 3. 5. Tisztítsuk a jellegzetes morfológiájú telepeket egy általános táptalajra való továbboltással. Kerüljük a rendszeres továbboltást, amely viru- lencia-csökkenést idézhet elő. 4. Igazoló vizsgálat vagy vizsgálatok 4. 1. A Ralstonia solanacearum azonosítása A Ralstonia solanacearum színtenyészeteinek azonosítása a következő eljárások legalább egyikének alkalmazásával történik: T á p l á l k o z á s i é s e n z i m a t i k u s t e s z t e k Megjegyzés: Minden egyes alkalmazott tesztnek tartalmaznia kell a megfelelő kontroltörzseket. 03/23. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 389 A Ralstonia solanacearum következő fenotípusos tulajdonságai általánosan jelen vannak vagy hiányoznak: fluoreszcens pigment PHB zárványok Oxidációs/Fermentációs (O/F) teszt kataláz Kovács-féle oxidáz nitrát-redukció citrát-felhasználás szaporodás 40 °C-on szaporodás 1 %-os NaCl oldatban szaporodás 2 %-os NaCl oldatban arginin-dihidroláz zselatin-elfolyósítás keményítő-hidrolízis eszkulin-hidrolízis levan-képződés – + O+/F- + + + + – + – – – – – – A táptalajok és a módszerek leírása: Lelliott & Stead (1987) I F t e s z t Készítsünk 106 sejt/ml-es szuszpenziót a tenyészetből és a kontrolltörzsből. Készítsünk az antiszérumból kétszeres hígítási sort. Alkal- mazzuk az IF eljárást (III. 2. szakasz). A tenyészet IF titerének meg kell egyeznie a pozitív kontroll titerével. E L I S A t e s z t Készítsünk > 106 sejt/ml-es szuszpenziót a tenyészetből és a kontrolltörzsből. Alkalmazzuk az ELISA eljárást (III. 3. szakasz). A tenyészet ELISA értékének meg kell egyeznie a pozitív kontroll értékével. P C R t e s z t Készítsünk 106 sejt/ml-es szuszpenziót a tenyészetből és a kontrolltörzsből. Alkalmazzuk a PCR eljárást (III. 4. szakasz). A tenyészet PCR termékének mérete és restrikciós enzimanalízisének (REA) mintázata meg kell, hogy egyezzen a pozitív kontroll megfelelő értékeivel. F l u o r e s z c e n s i n - s i t u h i b r i d i z á c i ó ( F I S H ) Készítsünk 106 sejt/ml-es szuszpenziót a tenyészetből és a kontrolltörzsből. Alkalmazzuk az FISH-eljárást (van Beuningen et al. , 1995) az OLI-1 PCR primerrel (Seal et al. , 1993). A tenyészetnek ugyanazt a reakciót kell mutatnia, mint a pozitív kontrollnak. F e h é r j e m e g h a t á r o z á s A denaturált teljes sejtfehérjéket poliakrilamidgél-elektroforézissel (PAGE) választjuk el (Stead, 1992a). Z s í r s a v - m e g h a t á r o z á s ( F A P ) Szaporítsuk a kultúrát és egy pozitív kontrolltörzset 48 órán át 28 °C-on triptikáz szója agaron, és alkalmazzuk a FAP-eljárást (Janse, 1991; Stead, 1992a; Stead, l992b). A tenyészet profiljának azonosnak kell lennie a pozitív kontroll profiljával. A meghatározott körülmé- nyek mellett a jellemző zsírsavak a 14:0 3OH, a 16:0 2OH, a 16:1 2OH és a 18:1 2OH. 4. 2. A törzs jellemzése A törzs jellemzése nem kötelező, de ajánlott minden egyes új esetben a következők legalább egyikének felhasználásával: 390 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 03/23. kötet B i o v a r i á n s - m e g h a t á r o z á s A Ralstonia solanacearum biovariánsokra (biológiai változatokra) van elkülönítve három hexóz-alkoholból és három cukorból történő savképző képessége alapján (Hayward, 1964 és 1994): – maltóz – laktóz – cellobióz – mannitol – szorbitol – dulcitol hasznosítása 1 – – – – – – 2 + + + – – – Biovariáns 3 + + + + + + 4 – – – + + + 5 + + + + – – További tesztekkel a 2-es biovariáns szubfenotípusokra osztható (Hayward, 1994. ): trehalóz-hasznosítás inozitol-hasznosítás D-ribóz hasznosítás pektin-bontó aktivitás F a j t a m e g h a t á r o z á s 2-es biovariáns 2-A biovariáns 2-T biovariáns – + – + – – + + + alacsony alacsony magas A fajta (Buddenhagen et al. , 1962) paradicsomnövényekben vagy padlizsánban és dohánynövényekben végzett patogenitás teszttel, valamint dohányleveleken végzett túlérzékenységi reakció (HR) teszttel (Lozano és Sequeira, 1970) határozható meg: Reakció: – paradicsom-/padlizsánnövényben – dohánynövényekben – dohánylevelekben 1 hervadás hervadás elhalás (48 óra) és hervadás (7–8 nap) Fajta (*) 2 nincs reakció nincs reakció HR (12–24 óra) 3 hervadás nincs reakció klorózis (2–8 nap) (*) A 4. fajtát (kórokozó gyömbéren és néhány más gazdanövényen) és az 5. fajtát (kórokozó csak eperfán) nem tartalmazza. A patogenitás teszttel vagy a dohányon végzett túlérzékenységi teszttel történő fajtameghatározás nem teljesen megbízható, és e módszerek helyett az a biovariánsból és az eredeti természetes gazdanövényből származtatható. A tenyészet tovább jellemezhető az alábbi módszer segítségével: Genom-ujjlenyomat A Ralstonia solanacearum komplexben a törzsek molekuláris differenciálását az RFLP elemzéssel (Cook et al. , 1989) végezhetjük. Ismétlődő szekvenciájú PCR [REP-, ERIC- & BOX-PCR (Louws et al. , 1995; Smith et al. , 1995]. 4. 3. Patogenitás teszt Ez a teszt a Ralstonia solanacearum diagnózisának megerősítésére és a Ralstonia solanacearum-ként azonosított tenyészetek virulenciájának felmérésére szolgál. Készítsünk 106 sejt/ml koncentrációjú oltóanyagot a tenyészetből és egy pozitív kontrolltörzsből. Oltsunk be 5–10 paradicsom- vagy padli- zsánnövényt célszerűen a harmadik valódi levél állapotában vagy ennél idősebb állapotban (III. 6. szakasz). Inkubáljuk két hétig 22 °C és 28 °C közötti hőmérsékleten és magas relatív páratartalom mellett napi öntözéssel. Figyeljük meg a hervadást és/vagy epinasztiát, klorózist és a satnyulást. A tüneteket mutató növényekből az izolálást a következőképpen végezzük el: – Távolítsunk el egy szövetrészt a szárból az oltási pont fölött két cm-re lévő helyről. – Aprítsuk szét és szuszpendáljuk kis térfogatú steril desztillált vízben vagy 50 mM foszfátpufferben. Ezután oltsuk lemezre, inkubáljuk és vizsgáljuk meg a Ralstonia solanacearum jellegzetes telepeit. 03/23. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 391 A RALSTONIA SOLANACEARUM KIMUTATÁSA ÉS AZONOSÍTÁSA BURGONYAGUMÓ-MINTÁKBAN Megjegyzés: A standard mintaméret 200 burgonyagumó. Az eljárás azonban jól alkalmazható 200-nál kevesebb burgonyagumóból álló mintákra is. III. SZAKASZ 1. A minta előkészítése vizsgálathoz Megjegyzés: Az ebben az eljárásban nyert burgonyakivonat-pelleteket használhatjuk a Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus kimutatá- sára is. Tetszőlegesen választható minta-előkészítés a teszthez, amennyiben szükségesnek tartjuk: i. Inkubáljuk a mintát 25–30 °C-on két hétig a kisszámú Ralstonia solanacearum populáció elszaporodásának elősegítése érdekében. ii. Mossuk le a burgonyagumókat folyó víz alatt megfelelő fertőtlenítőszerekkel és mosószerekkel. Szárítsuk meg levegőn a burgonya- gumókat. 1. 1. Távolítsuk el tiszta és fertőtlenített szikével vagy gyümölcskéssel a burgonyagumó köldöki részénél a héjat úgy, hogy a vaszkuláris szövetek éppen láthatóvá váljanak. Óvatosan vágjunk ki egy kis (3–5 mm átmérőjű) kúpos magot az edénynyaláb szövetből a köldöki résznél. Tartsuk a nem edénynyaláb szövet mennyiségét minimális szinten. Dolgozzuk fel a mintában lévő összes burgonyagumót. Megjegyzés: Ebben az állapotban elvégezhető a burgonyagumók szemrevételezéses vizsgálata (II. 1. szakasz). Tegyük félre a tüneteket mutató vagy erősen rothadt burgonyagumókat, és vizsgáljuk azokat külön (II. szakasz). 1. 2. Gyűjtsük össze a köldöki részeket zárt tartályban. A köldöki részeket célszerű azonnal feldolgozni. Ha ez nem lehetséges, azokat legfeljebb 24 órán át, vagy 4 °C-on legfeljebb 72 órán át tároljuk. 1. 3. Dolgozzuk fel a köldöki részeket a következő eljárások egyikével: i. Tegyük a köldöki részeket egy megfelelő tartályba. Adjunk hozzá megfelelő mennyiségű oldópuffert (II. függelék) úgy, hogy az a köldöki részeket elfedje. Aprítsuk a köldöki részeket Waring Blender vagy Ultra Thurrax készülékben éppen a teljes homogenitás eléréséig. Kerüljük az ennél tovább történő homogenizálást. Hagyjuk az eldörzsölt szövetrészt 15–30 percig beáztatva. ii. Tegyük a köldöki részeket egy megfelelő tartályba. Adjunk hozzá megfelelő mennyiségű oldópuffert úgy, hogy az a köldöki részeket elfedje. Helyezzük a tartályt rotációs rázógépre. Inkubáljuk 50–100 fordulat/percnél 4 órán át 20–22 °C hőmérsékleten, vagy 16–24 órán át 4 °C hőmérsékleten. iii. Vigyük át a köldöki részeket egy erős, eldobható macerációs tasakba (pl. 105 mm × 150 mm-es méretű, sugárzással sterilizált Stoma- cher tasakba). Gondosan zúzzuk össze a köldöki részeket megfelelő szerszám, pl. egy kalapács segítségével addig, amíg a teljes homogenitást elérjük. Adjunk hozzá megfelelő térfogatú oldópuffert úgy, hogy az a köldöki részeket ellepje. Hagyjuk az eldörzsölt szövetrészt 15–30 percig ülepedni. 1. 4. A baktériumok kivonása a feldolgozott köldöki részekből a következő eljárások egyikével: i. Öntsük le az eldörzsölt szövetrészt óvatosan egy centrifugacsőbe, az üledéket pedig hagyjuk a tartályban vagy a tasakban. Ha a leöntött eldörzsölt szövetrész zavaros, centrifugáljuk legfeljebb 180 g-nél 10 percig 10 °C alatti hőmérsékleten. Centrifugáljuk a leöntött eldörzsölt szövetrészt vagy az első centrifugálási lépés felülúszóját 7 000 g-vel 15 percig vagy 10 000 g-vel 10 percig 10 °C alatti hőmérsékleten. Öntsük le a felülúszót a pellet felzavarása nélkül. ii. Szűrjük az eldörzsölt szövetrészt egy 40–100 µm pórusméretű szűrőrendszerrel. Fokozzuk a szűrés hatékonyságát vákuumszivattyú alkalmazásával. Gyűjtsük össze a szűrletet centrifugacsőben. Öblítsük ki a szűrőt az oldópufferral. Centrifugáljuk a szűrletet 7 000 g-vel 15 percig vagy 10 000 g-vel 10 percig 10 °C alatti hőmérsékleten. Öntsük le a felülúszót a pellet felzavarása nélkül. 392 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 03/23. kötet 1. 5. Szuszpendáljuk újra a pelletet 1 ml pellet-pufferban (2. függelék). Osszuk két egyenlő részre és tegyük mindegyik részt egy-egy kémcsőbe. Egy kémcsövet használjunk a teszteléshez. A tesztelés alatt konzerváljuk a kivonat maradékát 4 °C-on. Tegyünk 10–25 % (v/v) steril glicerint a másik kémcsőbe. Vortex-szel keverjük. Tároljuk – 18 °C-on (hetekig) vagy – 70 °C-on (hónapokig). 2. IF teszt Használjunk Ralstonia solanacearum – célszerűen a 3-as fajta/2-es biovariáns – elleni antiszérumot. Határozzuk meg titerét a Ralstonia solana- cearum homológ törzséből származó 106 sejt/ml-es szuszpenzión a fluoreszcein-izotiocianát (FITC) konjugátum megfelelő hígításával a gyártó ajánlásai szerint. A nyers antiszérumnak legalább 1: 2 000-es IF titerűnek kell lennie. Használjunk több mintahelyes mikroszkóp-tárgylemezeket célszerűen 10, legalább 6 mm átmérőjű ablakkal. Minden vizsgálandó tesztlemez tartalmazzon egy FITC konjugátum kontrollt. A tesztet meg kell ismételni egy PBS kontrollt tartalmazó változattal, ha pozitív sejt figyelhető meg az FITC kontrollban. Készítsünk külön pozitív kontroll-lemezeket Ralstonia solanacearum megfelelő fajtájú/biovariánsú törzséből készült 106 sejt/ml-es szuszpen- ziójával. A vizsgálatok minden egyes sorozatában használjunk egy ilyen lemezt. 2. 1. A tesztlemezeket a következő eljárások egyikével készítsük el: i. Viszonylag kevés keményítőt tartalmazó pelletek esetén: 2. 2. 2. 3. Pipettázzunk egy kimért állandó térfogatot az újraszuszpendált pelletből az ablakok egy sorozatára (15 µl megfelelő 6 mm-es ablakát- mérőhöz – nagyobb ablakokhoz használjunk arányosan nagyobb térfogatot). A fennmaradó sor ismétlésként vagy egy második minta- ként használható, amint azt az 1. ábra mutatja. ii. Más pelletek esetén: Készítsünk tízes hígítási sorozatot (1/10, 1/100 és 1/1 000) az újraszuszpendált pelletből pelletpufferben. Pipettázzunk egy kimért állandó térfogatot az újraszuszpendált pelletből az ablakok egy sorozatára (15 µl megfelelő 6 mm-es ablakátmérőhöz – nagyobb abla- kokhoz használjunk arányosan nagyobb térfogatot). A fennmaradó sor ismétlésként vagy egy második mintaként használható, amint azt a 2. ábra mutatja. Hagyjuk a cseppeket megszáradni. Rögzítsük a baktériumsejteket a lemezhez hevítéssel, lánggal vagy 95 %-os etil-alkohollal. IF eljárás i. Tesztlemez elkészítése a 2. 1. i. pontban leírt eljárás szerint: Készítsük el az antiszérum kétszeres hígításainak sorozatát IF pufferben (3. függelék): 1/4 titer (T/4), 1/2 titer (T/2), a titer (T) és a titer kétszerese (2T). ii. Tesztlemez elkészítése a 2. 1. ii. pontban leírt eljárás szerint: Készítsük el az antiszérum egy munkahígítását (WD) IF pufferben. A munkahígítás az antiszérum optimális specificitású hígítása és rendszerint a titer felével egyenértékű. 1. ábra A tesztlemez elkészítése a 2. 1. i. és a 2. 3. i. pontok szerint 03/23. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 393 2. ábra A tesztlemez elkészítése a 2. 1. ii. és a 2. 3. ii. pontok szerint 2. 3. 1. Rendezzük el a tárgylemezeket nedves itatóspapíron. Borítsuk a tesztablakokat az antiszérum hígításával (hígításaival). Az FITC ablakokra vigyünk fel PBS-t. Az ablakokra felvitt antiszérum térfogatának meg kell egyeznie az alkalmazott kivonat térfogatával. 2. 3. 2. Inkubáljuk fedett állapotban 30 percig szobahőmérsékleten. 2. 3. 3. 2. 3. 4. Rázzuk le az antiszérumcseppeket a tárgylemezről, és öblítsük le a lemezeket óvatosan IF pufferral. Mossuk 5 percig IF puffer-Tween-ben, ezt követően pedig 5 percig IF pufferben (3. függelék). Óvatosan távolítsuk el a felesleges nedvességet. Rendezzük el a lemezeket nedves itatóspapíron. Borítsuk a tesztablakokat és az FITC ablakot a FITC konjugátumnak a titer meghatározá- sához használt hígításával. Az ablakokra felvitt konjugátum térfogatának meg kell egyeznie az alkalmazott antiszérum térfogatával. 2. 3. 5. Inkubáljuk fedett állapotban 30 percig szobahőmérsékleten. 2. 3. 6. 2. 3. 7. Rázzuk le a konjugátum-cseppeket a lemezről. Öblítsük le és mossuk az előzőeknek megfelelően (2. 3. 3. ). Óvatosan távolítsuk el a felesleges nedvességet. Pipettázzunk 5–10 µl 0,1 M foszfátpufferes glicerint (3. függelék) vagy hasonló „montírozót” minden egyes ablakra, és helyezzünk fel fedőlemezt. 2. 4. Az IF teszt eredményeinek értékelése Vizsgáljuk meg a tesztlemezeket epifluoreszcens mikroszkóppal az FITC gerjesztésére alkalmas szűrőkkel, olajimmerzió alkalmazásával 500–1 000-szeres nagyításban. Vizsgáljuk meg az ablakokat a két merőleges átmérő, valamint a kerület mentén. Először a pozitív kontroll tárgylemezt ellenőrizzük. A sejteknek fényesen kell fluoreszkálniuk, és teljes mértékű festődést kell mutatniuk. Megjegyzés: A tesztet meg kell ismételni, ha a festődés rendellenes. Olvassuk le a tesztlemezeket. Először a fluoreszkáló sejtek hiányát figyeljük meg az FITC kontrollablakokban. Az FITC kontrollban lévő fluoreszkáló sejtek a konjugátum nem specifikus kötődését, autofluoreszcenciát vagy fertőzést jeleznek. Megjegyzés: Ismételjük meg a tesztet, ha ilyent észlelünk. Figyeljük meg a Ralstonia solanacearum jellegzetes morfológiájával rendelkező, fényesen fluoreszkáló sejteket a tesztablakokban. A fluoresz- cencia intenzitásának meg kell egyeznie a pozitív kontroltörzs által ugyanazon antiszérum-hígításnál adottal. A nem teljesen festődött vagy gyengén fluoreszkáló sejteket figyelmen kívül kell hagyni, kivéve ha sok ilyen sejt van (lásd az IF teszt eredményeinek értelmezését). Az IF teszt eredményeinek értelmezése: i. Ha nem találunk jellegzetes morfológiával rendelkező fényesen fluoreszkáló sejteket, akkor az IF teszt negatív. ii. Ha találunk jellegzetes morfológiával rendelkező fényesen fluoreszkáló sejteket, akkor meghatározzuk a mikroszkóp látómezejébe eső sejtek számának középértékét és kiszámítjuk az újraszuszpendált pellet 1 ml-ében lévő sejtek számát (N) (4. függelék). Kb. 103 sejt/ml újraszuszpendált pelletnek megfelelő populáció tekinthető az IF teszt kimutatási határának. – Olyan minták esetében, ahol az N > 103 sejt/ml újraszuszpendált pellet, az IF tesztet pozitívnak tekintjük. – Olyan minták esetében, ahol az N < 103 sejt/ml újraszuszpendált pellet, az IF tesztet pozitívnak tekinthetjük. 394 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 03/23. kötet iii. Ha nagyszámú (105 > sejt/ml) nem teljes vagy gyenge fluoreszcenciát mutató sejt látható az antiszérum titerénél, akkor egy második tesztet kell elvégezni: – vagy egy más biológiai elven alapuló tesztet kell elvégezni, vagy – az IF tesztet kell megismételni egy második antiszérummal vagy a pellet tízszeres hígításával. 3. ELISA teszt Robinson-Smith et al. , 1995 alapján. Használjunk a Ralstonia solanacearum – célszerűen a 3-as fajta/2-es biovariáns – elleni antiszérumot. Határozzuk meg a titerét a Ralstonia solanacearum homológ törzséből származó 106 sejt/ml-es szuszpenzión. A NUNC-Polysorb mikrotitráló lemezek használata ajánlott. A teszt tartalmazzon negatív burgonyakivonat-kontrollt és foszfátpufferes sóoldat (PBS) kontrollt. Pozitív kontrolként használjunk a Ralstonia solanacearum megfelelő fajtájú/megfelelő biovariánsba tartozó törzséből származó 106 sejt/ml koncentrációjú szuszpenziót. Ezt hasonló módon vizsgáljuk, mint a mintát (mintákat), de jól különítsük el a mintáktól a mikrotitráló lemezen. 3. 1. Pipettázzuk az újraszuszpendált pellet 100–200 µl-ét kémcsőbe. Hevítsük 4 percig 100 °C-on. A kémcsövet tegyük jégre. 3. 2. 3. 3. 3. 4. 3. 5. 3. 6. 3. 7. 3. 8. 3. 9. Adjunk hozzá dupla erősségű karbonátos bevonó puffert egyenlő térfogatban (5. függelék). Vortex-szel keverjük. 100 µl-es azonos térfogatú (aliquot) részeket adjunk a mikrotitráló lemez legalább két vájulatába. Inkubáljuk egy órán át 37 °C-on vagy egy éjszakán át 4 °C-on. Öntsük ki a kivonatokat a vájulatokból. Mossuk ki a vájulatokat háromszor PBS-Tween-nel (5. függelék) úgy, hogy az utolsó mosóoldatot legalább 5 percig a vájulatokban hagyjuk. Készítsük el a Ralstonia solanacearum antiszérum megfelelő hígítását blokkoló pufferben (5. függelék). Tegyük az antiszérum-hígítás 100 µl- ét a vájulatokba. Inkubáljuk egy órán át 37 °C-on. Öntsük ki a konjugátumot a mintatartó vájulatokból. Mossuk ki a vájulatokat úgy, mint az előbb (3. 4. pont). Készítsük el az alkalikus foszfatáz konjugátum megfelelő hígítását blokkolópufferben. Vigyük a konjugátum-hígítás 100 µl-ét a vájulatokba. Inkubáljuk egy órán át 37 °C-on. Öntsük ki a konjugátumot a mintatartó vájulatokból. Mossuk ki a vájulatokat úgy, mint az előbb (3. 4. és 3. 6. pont). Készítsük el az alkalikus foszfatáz szubsztrát oldatot (5. függelék). Adjunk 100 µl-t a vájulatokba. Inkubáljuk 30 perc és 1 óra közötti időtartamig sötétben, szobahőmérsékleten. 3. 10. Olvassuk le az abszorbanciát 409 nm-nél. Az ELISA teszt értékelése: Az ELISA teszt negatív, ha a minta optikai sűrűsége (OD) kisebb, mint a negatív kontroll optikai sűrűségének kétszerese (< 2× negatív kontroll OD). Az ELISA teszt pozitív, ha a minta optikai sűrűsége (OD) nagyobb, mint a negatív kontroll optikai sűrűségének kétszerese (> 2× negatív kontroll OD). 4. PCR teszt Seal et al. , 1993 alapján. Megjegyzés: A minta előkészítése és a PCR-rel kapcsolatos egyéb műveletek minden fázisa során szűrős pipettahegyeket kell használni. Készítsünk a Ralstonia solanacearum 3-as típusba/2-es biovariánsba tartozó törzséből 106 sejt/ml koncentrációjú szuszpenziót és ezt hasz- náljuk pozitív kontrollként. Ezt a mintával (mintákkal) megegyező módon vizsgáljuk. 4. 1. Pipettázzunk 100 µl újraszuszpendált pelletet egy kémcsőbe. Egy alternatív módszer szerint vigyünk át 90 µl újraszuszpendált pelletet 10 µl 0,5 M NaOH-ot tartalmazó kémcsőbe. Elegyítsük a kémcső többszöri átfordításával. 03/23. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 395 4. 2. 4. 3. 4. 4. Hevítsük négy percig 100 °C-on. A kémcsövet tegyük azonnal jégre. Készítsünk legalább két tízszeres hígítást – pl. 1/10 és 1/100 – vagy többet, ha azt hasznosnak ítéljük meg, steril desztillált vagy ultratiszta vízben (UPW). Készítsük el a PCR reakcióelegyet (6. függelék) steril csőbe, a következő komponensek következő sorrendben történő hozzáadásával: Egy 50 µl-es reakció-térfogathoz: Komponens Mennyiség Végkoncentráció Steril desztillált víz vagy UPW 10×PCR puffer d-ATP d-CTP d-GTP d-TTP OLI-1 primer (20 µM) Y-2 primer (20 µM) Taq polimeráz (5 U/µl) 30,8 µl – 33,8 µl 5,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 1,0 µl 2,5 µl 2,5 µl 0,2 µl Össztérfogat 45 µl – 48 µl További reakciókhoz: 1× 0,2 mM 0,2 mM 0,2 mM 0,2 mM 1 µM 1 µM 1,0 U Számítsuk ki minden egyes komponens mennyiségét a szükséges számú reakcióhoz. Elegyítsük a komponenseket és vigyünk át 45 µl – 48 µl elegyet steril PCR csövekbe. Tartsuk a PCR reakció-elegyet tartalmazó csöveket jégen. 25 µl-es reakciótérfogathoz: Arányosan csökkentsük a komponensek mennyiségét. 4. 5. PCR amplifikáció 4. 5. 1. Szabadon választható: Pulzus-centrifugáljuk a csöveket a benne lévő forralt mintával és pozitív kontrollal. Meghatározott sorrendben hozzáadunk 2–5 µl mintát (mintákat), vízkontrollt és pozitív kontrollt a PCR reakcióelegyet tartalmazó csövekbe. Helyezzük a csöveket a PCR gép hevítő blokkjába. 4. 5. 2. Futtassuk a következő programokat: 1 ciklus: i. 2 percig 96 °C-on: a templát denaturálása. 50 ciklus: ii. 20 másodpercig 94 °C-on: denaturálás iii. 20 másodpercig 68 °C-on: a primerek kapcsolódása iv. 30 másodpercig 72 °C-on: a kiegészítő szál (másolat) felépülése 1 ciklus: v. 10 másodpercig 72 °C-on: további felépülés. 1 ciklus: i. 4 °C-on tartás. Megjegyzés: Ezek a paraméterek a Perkin Elmer 9600 típusú készülékre vonatkoznak. Más thermal cycler-ek esetében szükség lehet ásvány- olaj-borításra a PCR reakciós csövek esetében és/vagy a DNS-sokszorozási profil ii. , iii. és a iv. lépései időtartamának módosítá- sára. 4. 5. 3. Vegyük ki a csöveket a PCR gépből. Elemezzük a PCR terméket. Ha ez nem azonnal történne, akkor a csöveket 4 °C-on tároljuk ugyanazon a napon történő felhasználásra, vagy hosszabb ideig történő tárolás esetén tartsuk –18 °C-on. 4. 6. A PCR termék elemzése A PCR fragmentumokat agarózgél-elektroforézissel és etidium-bromid festéssel mutatjuk ki. 4. 6. 1. Készítsünk megfelelő agarózgélt úgy, hogy az agarózt trisz-acetát-elektroforézis (TAE) pufferben óvatosan forrásig melegítjük. 396 4. 6. 2. HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 03/23. kötet Hűtsük le a megolvadt agarózt 50–60 °C-ra, öntsük az elektroforézis-egység formájába és helyezzük be a fésűt. Hagyjuk az oldatot megszi- lárdulni. 4. 6. 3. Vegyük ki a fésűt. Merítsük alá a gélt a TAE-ban úgy, hogy azt a puffer éppen fedje (2–3 mm-es rétegben). 4. 6. 4. 4. 6. 5. 4. 6. 6. Helyezzünk 3 µl-nyi cseppecskét a feltöltő pufferből parafilmre. Adjunk hozzá 12 µl PCR terméket az egyik mintából, a pozitív kontrollt vagy a vízkontrollt, és elegyítsük őket pipettahegybe történő kíméletes felszívással a betöltés előtt. Az adott térfogatok módosíthatók az agarózgélben lévő lyukak befogadóképességének megfelelően. Gondosan töltsük meg a gél mintatartó vájulatait. Helyezzünk be referenciaként egy megfelelő DNS markert legalább az egyik mintatartó vájulatba. Kapcsoljuk össze az elektromos tápegység és az elektroforézis-berendezés vezetékeit. Futtassuk a gélt 5–8 V/cm térerősség mellett addig, amíg a jelölő indikátor frontvonala a gél végétől számított 1 cm távolságon belülre kerül. 4. 6. 7. Kapcsoljuk ki az elektromos tápegységet. Kapcsoljuk le a vezetékeket az elektroforézis-egységről. Óvatosan emeljük le a gélt. Áztassuk etidium-bromid oldatban 30–45 percig. Megjegyzés: Viseljünk mindig eldobható kesztyűt akkor, amikor etidium-bromiddal dolgozunk, mert erősen mutagén! 4. 6. 8. Áztassuk desztillált vízben 10–15 percig. 4. 6. 9. Szemrevételezéssel figyeljük meg a felerősített DNS fragmentumot (fragmentumokat) ultraibolya (UV) átvilágítás mellett. A Ralstonia solana- cearum PCR terméke az OLI-1 és Y-2 primer-készlettel 288 bp hosszúságú. Vizsgáljuk a DNS markerrel és a pozitív kontrollal szemben. Megjegyzés: A vízkontrollnak minden egyes esetben negatívnak kell lennie. Ha pozitív, ismételjük meg a tesztet. 4. 6. 10. Fényképezzük le a gélt, ha az eredményt tartósan meg kívánjuk őrizni. 4. 6. 11. Restrikciós enzim analízissel (REA) igazoljuk a felerősített fragmentum hitelességét. 4. 7. Restrikciós enzim analízis (REA) 4. 7. 1. 4. 7. 2. Vigyük át a PCR termék (4. 5. 3. ) 8,5 µl-ét egy új kémcsőbe. Adjunk hozzá 1 µl 10×-es enzim-puffert és 0,5 µl AvaII restrikciós enzimet. Elegyítsük a pipettahegybe történő kíméletes felszívással. Ha cseppek maradnak a cső falán, pulzus-centrifugáljuk egy mikrocentrifugában. Inkubáljuk egy órán át 37 °C-on. 4. 7. 3. Elemezzük a feltárt PCR fragmentumot agarózgél-elektroforézissel, mint az előbb (4. 6). A PCR teszt eredményeinek értékelése: A PCR teszt negatív, ha a jellegzetes 288 bp méretű fragmentum nem mutatható ki, és a fragmentum a Ralstonia solanacearum pozitív kont- rolltörzsénél kimutatható. A PCR teszt pozitív, ha a 288 bp méretű fragmentum kimutatható és a felerősített fragmentum restrikciós enzim analízise azonos ered- ményt ad, mint a Ralstonia solanacearum pozitív kontrolltörzse esetében. 5. Szelektív lemeztenyésztéses teszt Elphinstone et al. , 1996 alapján. 5. 1. A tesztet egy megfelelő hígítású lemeztenyésztéses technikával végezzük, pl. : i. Az újraszuszpendált pelletből pelletpufferben készítsünk legalább két tízes léptékű hígítást – 1/10 és 1/100 – vagy többet, ha ezt hasz- nosnak tartjuk. Pipettázzuk az újraszuszpendált pellet mért szabványos térfogatát (50–100 µl) és minden hígítást egy módosított SMSA szelektív táptalajra (7. függelék), és terítsük szét üvegpálca segítségével a táptalaj teljes felületén. Ha hasznosnak tekintjük, végezzük el az újraszuszpendált pellet 10 µl-es kacsnyi mennyiségének hígításos szélesztését. A kacsot az egyes szélesztések között lángon húzzuk át. ii. Vigyük át az újraszuszpendált pellet egy mért standard térfogatát (50–100 µl) a módosított SMSA szelektív közegbe és terítsük szét üvegpálcával a táptalaj teljes felületén. Szélesszük az oltópálcán levő anyagot a kacs lelángolása nélkül legalább két másik módosított SMSA lemezre. 5. 2. 5. 3. Pozitív kontrollként – ugyanazzal a hígításos lemeztenyésztéses technikával – a Ralstonia solanacearum virulens 3-as típusú/2-es biovariá- nsba tartozó törzséből készült 106 sejt/ml-es szuszpenziót vigyük fel módosított SMSA lemezek egy külön sorozatára. Inkubáljuk a lemezeket 28 °C-on. A lemezek értékelését három nap elmúltával kezdjük meg. Ha az eredmény negatív, inkubáljuk tovább, összesen hat napig. A Ralstonia solancearum virulens izolátumainak telepei tejfehérek, laposak, szabálytalanok és elfolyósodottak, közepükön vérvörös elszíneződéssel, és belső csíkokat és spirálokat mutatnak. 5. 4. A jellegzetes morfológiájú telepeket egy általános táptalajra történő továbboltással tisztítsuk (1. függelék). 03/23. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 397 5. 5. Azonosítsuk a színtenyészeteket (II. szakasz, 4. 1. ) és igazoljuk a Ralstonia solanacearum tenyészeteket patogenitás teszttel (II. szakasz, 4. 3. ). A szelektív lemeztenyésztési eredmények értékelése A szelektív lemeztenyésztési teszt negatív, ha hat nap elteltével nem izolálhatóak baktériumtelepek, vagy nem izolálhatók a Ralstonia sola- nacearum-ra jellemző telepek, feltéve hogy más baktériumok telepei általi gátló hatás nem gyanítható és hogy a Ralstonia solanacearum-ra jellemző telepek a pozitív kontrollokban megtalálhatók. A szelektív lemeztenyésztési teszt pozitív, ha a Ralstonia solanacearum-ra jellemző telepeket izoláltunk. 6. Bioteszt Janse, 1988 alapján 6. 1. 6. 2. 6. 3. 6. 4. 6. 5. 6. 6. Használjunk a fogékony paradicsom- és padlizsán-csíranövényekből 10 tesztnövényt, ahol minden egyes minta a harmadik valódi levél állapotában van. A beoltást megelőző 24 órában ne öntözzük a tesztnövényeket. Osszunk el 100 µl újraszuszpendált pelletet a tesztnövények között. Oltsuk be a szárakat a sziklevelek között, továbbá egy vagy több másik helyen. Oltsunk be ugyanazzal a technikával 10 csíranövényt pozitív kontrollként a Ralstonia solanacearum virulens 2-es biovariánsba/3-as fajtába tartozó törzséből készült 106 sejt/ml koncentrációjú szuszpenziójával és negatív kontrollként pelletpufferrel. A keresztszennyeződés elkerü- lése érdekében különítsük el a pozitív kontroll növényeket a többi növénytől. Növesszük a tesztnövényeket tovább a negyedik hétig 22 °C–28 °C hőmérsékleten, és magas relatív páratartalom mellett napi öntözéssel. Figyeljük meg a növényeken az elhalás, epinasztia, klorózis és/vagy satnyulás jelentkezését. Izoláljunk a fertőzött növényekből (II. szakasz). Azonosítsuk a jellemző morfológiát (II. 4. 1. ) mutató tiszta tenyészeteket és igazoljuk a Rals- tonia solanacearum tenyészeteket patogenitás teszttel (II. 4. 3. ). Ha hasznosnak tartjuk, ellenőrizzük a fertőzés hiányát olyan tesztnövények tételeinél, amelyek a fertőzés egyetlen jelét sem mutatták. Távo- lítsuk el minden egyes tesztnövényből a szár egy centiméteres részét az oltási pont fölött két centiméterre lévő helyről. Homogenizáljuk a szöveteket oldópufferben. Végezzük el a hígított pelletek lemeztenyésztését (III. 5. 1. szakasz). Ha ez pozitív, azonosítsuk a jellegzetes morfológiájú színtenyészeteket (III. 4. 1. szakasz) és igazoljuk a Ralstonia solanacearum tenyészeteket patogenitás teszttel (II. 4. 3. ). A bioteszt eredményeinek értelmezése A bioteszt negatív, ha a tesztnövények nem fertőzöttek Ralstonia solanacearum-mal, és feltéve hogy a Ralstonia solanacearum a pozitív kontrollokban kimutatható. A bioteszt pozitív, ha a tesztnövények Ralstonia solanacearum-mal fertőzöttek. 7. Dúsítási tesztek 7. 1. 7. 2. 7. 3. Elphinstone et al. , 1996 alapján Adjunk hozzá az újraszuszpendált pelletből 100 µl-t a módosított SMSA bouillon 3 ml-éhez (7. függelék). Inkubáljuk 48 órán át – de 72 óránál semmiképpen sem hosszabb ideig – 28 °C-on, a cső kupakját lazán illesztve a levegőztetés végett. Szorítsuk meg a kupakot és Vortex-szel keverjük a cső tartalmát. Osszuk el azonos térfogatú (aliquot) részekre az IF teszthez (e szakasz, 2. ), az ELISA teszthez (e szakasz, 3. ) és/vagy a PCR teszthez (e szakasz, 4. ). 8. Patogenitás vizsgálat Lásd a II. 4. 3. szakaszt. 398 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 03/23. kötet 1. függelék Táptalajok Ralstonia solanacearum izolálásához és tenyésztéséhez T á pa g a r (N A ) Tápagar (Difco) Desztillált víz 23 g 1 liter Készítsünk a közegből 1 literes térfogatokat egyliteres palackokban. Oldjuk fel az összetevőket. Sterilizáljuk autoklávban 121 °C-on 15 percig. Hűtsük 50 °C-ra. Öntsük lemezekre. É le sztő-pepton-g lükóz ag ar (YPG A) Élesztőkivonat (Difco) Bacto pepton (Difco) D(+)-glükóz (monohidrát) Bacto agar (Difco) Desztillált víz 5 g 5 g 10 g 15 g 1 liter Készítsünk a táptalajból ½ literes térfogatokat egyliteres palackokban. Oldjuk fel az összetevőket. Sterilizáljuk autoklávban 121 °C-on 15 percig. Hűtsük 50 °C-ra. Öntsük lemezekre. Szac ha róz -pe pton aga r (SPA) Szacharóz Pepton K2HPO4 MgSO4·7H2O Bacto agar (Difco) Desztillált víz 20 g 5 g 0,5 g 0,25 g 15 g 1 liter Készítsünk a táptalajból ½ literes térfogatokat egyliteres palackokban. Oldjuk fel az összetevőket. Állítsuk be a pH-t 7,2–7,4-re, ha szükséges. Sterilizáljuk autoklávban 121 °C-on 15 percig. Hűtsük 50 °C-ra. Öntsük lemezekre. K e l ma n - fé le te t r a z ól i u mo s t á p t a l a j Kazaminosavak (Difco) Bacto pepton (Difco) Dextróz Bacto agar (Difco) Desztillált víz 1 g 10 g 5 g 15 g 1 liter Készítsünk a táptalajból ½ literes térfogatokat egyliteres palackokban. Oldjuk fel az összetevőket. Sterilizáljuk autoklávban 121 °C-on 15 percig. Hűtsük 50 °C-ra. Adjuk hozzá trifenil-tetrazólium-klorid (Sigma) sterilszűrőn át sterilre szűrt vizes oldatát az 50 mg/l végkoncentráció elérése céljából. Öntsük lemezekre. 03/23. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 399 2. függelék Anyagok a minta-előkészítéshez K i ny e rő p uf fe r: 50 mM f oszfá t pu ff e r , pH 7, 0 Ezt a puffert használjuk a szövet macerációjára (felpuhítására). Na2HPO4 KH2PO4 Desztillált víz 4,26 g 2,72 g 1 liter Oldjuk fel az alkotórészeket és ellenőrizzük a pH-t. Ha szükséges, osszuk azonos térfogatú (aliquot) részekre. Sterilizáljuk autoklávban 121 °C-on 15 percig. 5 % polivinilpirolidon-40 000 MOLWT (PVP-40) hozzáadása akkor ajánlott, amikor közvetlen PCR tesztet végzünk a kivonatban lévő aromás molekulák okozta amplifikációgátlás előfordulásának csökkentésére. Diszpergálószer, habzásgátló vagy antioxidáns hozzáadása akkor ajánlott, ha a burgonyasejtszövet felpuhítására a Waring Blender vagy az Ultra Turrax homogenizálási eljárást használjuk. Lubrol pelyhek DC Silicone habzásgátló Tetranátrium-pirofoszfát 0,5 g/liter 1,0 ml/liter 1,0 g/liter Kezeljük autoklávban külön. Adjuk a kívánt koncentrációhoz. Pelletpu ffe r: 10 mM foszfá tp u ffe r , pH 7,2 Ez a puffer a burgonyahajtások és pelletek újraszuszpendálásához és hígításához használatos. Na2HPO4·12H2O NaH2PO4·2H2O Desztillált víz 2,7 g 0,4 g 1 liter Oldjuk fel az alkotórészeket és ellenőrizzük a pH-t. Ha szükséges, osszuk aliquot részekre. Sterilizáljuk autoklávban 121 °C-on 15 percig. 400 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 03/23. kötet 3. függelék Anyagok az IF teszthez IF pu ffer : 10 mM fosz fátp uffe r es sóolda t (PB S) , pH 7, 2 Ez a puffer az antiszérum hígítására szolgál. Na2HPO4·12H2O NaH2PO4·2H2O NaCl Desztillált víz 2,7 g 0,4 g 8,0 g 1 liter Oldjuk fel az alkotórészeket és ellenőrizzük a pH-t. Ha szükséges, osszuk aliquot részekre. Sterilizáljuk autoklávban 121 °C-on 15 percig. IF puff er -Twe en Ezt a puffert a lemezek mosására használjuk. Adjunk 0,1 % Tween 20-at az IF pufferhez. 0, 1 M fosz fá tpu f fe re s g li ce r i n , pH 7, 6 Ez a puffer „ragasztó” folyadékként szolgál az IF lemez ablakokon a fluoreszcencia megnövelésére. Na2HPO4·12H2O NaH2PO4·2H2O Glicerin Desztillált víz 3,2 g 0,15 g 50 ml 100 ml 03/23. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 401 4. függelék A fertőzöttségi szint meghatározása az IF tesztnél A több mintahelyes tárgylemez ablakfelületének nagysága (S) ¼ πD2 4 ahol D = az ablak átmérője Az objektív mező felülete (s) ¼ πd2 4 ahol d = a mező átmérője Számítsuk ki a d értékét közvetlen méréssel vagy a következő képletből: s ¼ πi2 G2K2 ×4 ahol i = mezőkoefficiens (az okulár típusától függően 8–24 között változik), K = cső-koefficiens (l vagy 1,25), G = nagyítás: 100×, 40× stb. objektív. a (2)-ből r d ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃ 4s π (1) (2) (3) (4) a (3)-ból v u u t d ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ 4 × πi2 G2K2 × 4 ¼ i GK π Számoljuk meg a jellegzetes fluoreszkáló sejteket látómezőnként (c). Számítsuk ki a jellegzetes fluoreszkáló sejtek számát az ablakban (C). C ¼ c S s Számítsuk ki a jellegzetes fluoreszkáló sejtek számát 1 ml pelletben (N). N ¼ C × 1 000 × F y Ahol y = a pellet térfogata az ablakban, F = pellethígítási tényező. 402 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 03/23. kötet 5. függelék Anyagok az ELISA teszthez K e t t ő s e r ő s s é g ű k a r b o n á t b e v o n ó p u f f e r , p H 9 , 6 Na2CO3 NaHCO3 Desztillált víz 6,36 g 11,72 g 1 liter Oldjuk fel az alkotórészeket és ellenőrizzük a pH-t. Ha szükséges, osszuk aliquot részekre. Sterilizáljuk autoklávban 121 °C-on 15 percig. Nátrium-szulfit 0,2 %-os végkoncentrációban hozzáadható antioxidánsként, ha a kivonat jelentősebb mennyiségben aromás vegyületeket tartalmaz. 1 0 × F o s z f á t p u f f e r e s s ó o l d a t ( P B S ) , p H 7 , 4 NaCl KH2PO4 Na2HPO4·12H2O KCl Desztillált víz 80 g 2 g 29 g 2 g 1 liter Oldjuk fel az alkotórészeket és ellenőrizzük a pH-t. Ha szükséges, osszuk aliquot részekre. Sterilizáljuk autoklávban 121 °C-on 15 percig. F o s z f á t p u f f e r e s s ó o l d a t - T w e e n ( P B S - T ) 10 × PBS 10 % Tween 20 Desztillált víz 100 ml 5 ml 895 ml B l o k k o l ó ( e l l e n a n y a g ) p u f f e r ( f r i s s e n k e l l k é s z í t e n i ) 10 × PBS Polivinilpirolidon-44 000 MOLWT (PVP-44) 10 % Tween 20 Tejpor Desztillált víz A l k a l i k u s f o s z f a t á z s z u b s z t r á t o l d a t , p H 9 , 8 Dietanol-amin Desztillált víz 10 ml 2,0 g 0,5 g 0,5 g 100 ml-re 97 ml 800 ml Keverjük össze és állítsuk be a pH-t 9,8-re tömény HCl-val. Egészítsük ki 1 literre desztillált vízzel. Adjunk hozzá 0,2 g MgCl2-ot. Oldjunk fel két 5 mg-os foszfatáz szubsztrát tablettát (Sigma) 15 ml oldathoz. 03/23. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 403 6. függelék Anyagok a PCR teszthez O l i g o n u k l e o t i d p r i m e r s z e k v e n c i a OLI-1 primer 5’-GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC-3’ Y-2 primer Az anyagokra vonatkozóan lásd Seal et al. (1993). 5’-CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’ 7. függelék Anyagok a szelektív lemeztenyésztéses és dúsítási vizsgálatokhoz S MS A sz e lektí v köze g (Engelbrecht, 1994, módosította Elphinstone et al. , 1996) Alaptáptalaj Kazaminosavak (Difco) Bacto pepton (Difco) Glicerin Agar (Difco) Desztillált víz 1 g 10 g 5 ml 15 g 1 liter Készítsünk a közegből 1/2 literes térfogatokat egyliteres palackokban. Oldjuk fel az összetevőket és ellenőrizzük a pH-t. Autoklávozás előtt szükség esetén állítsuk a pH-t 6,5-re. A Ralstonia solanacearum nem fog jól szaporodni a táptalajon pH > 7,0 esetén. Sterilizáljuk autoklávban 121 °C-on 15 percig. Hűtsük 50 °C-ra. Adjuk hozzá a következő összetevőket (mindegyik a Sigma cégtől származik), hogy elérjük a meghatározott végkoncent- rációkat: Kristályibolya Polimixin B szulfát Bacitracin (*) Klóramfenikol Penicillin-G Tetrazólium sók 5 mg/liter 100 mg/liter 25 mg/liter 5 mg/liter 0,5 mg/liter 50 mg/liter (kb. 600 000 egység) (kb. 1 250 egység) (kb. 825 egység) Sigma P-1004 Sigma B-0125 Sigma C-3175 Sigma P-3032 Oldjuk fel az összetevőket 70 %-os etanolban a megadott koncentrációkra a készített közeg térfogatának megfelelően. Néhány összetevő, mint pl. a polimixin B és a klóramfenikol enyhe melegítést és rázást igényel. S MS A bou i llon (Elpinstone et al. , 1996) Ugyanúgy készítsük el, mint az SMSA közeget, de hagyjuk ki belőle az agart és a tetrazóliumot. Osszunk szét 3 ml-es aliquot részeket 30 ml-es eldobható Universal csövekbe. (*) Amennyiben szükséges, a szennyező szaprofita baktériumok számának csökkentése érdekében a bacitracin koncentrációja megemelhető 300 ppm-re, anélkül hogy ez a Ralstonia solanacearum kórokozó kimutatását befolyásolná. 404 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 03/23. kötet Hivatkozások Buddenhagen, I. W. ; Sequeira, L. and Kelman, A. , 1962. Description of races in Pseudomonas solanacearum. Phytopathology 52, 726. Cook, D. ; Elizabeth B. and Sequeira L. , 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphism with DNA probes that specify virulence and hypersensitive respons. Molecular Plant-Microbe Interactions 2, 113–121. Dinesen I. G. and DeBoer, S. H. , 1995. Extraction of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus from compo- site samples of potato tubers. American Potato Journal 72, 133–142. Elphinstone, J. G. ; Hennessy, J. ; Wilson, J. and Stead, D. E. , 1996. Sensitivity of different methods for the detection of Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26. Engelbrecht, M. C. , 1994. Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. ACIAR Bacterial Wilt Newsletter 10, 3–5. Hayward, A. C. , 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27, 265– 277. Hayward, A. C. , 1994. Systematic and phylogeny of Pseudomonas solanacearum and related bacteria. In: Bacterial Wilt: the disease and its causative agent, Pseudomonas solanacearum (eds. A. C. Hayward and G. L. Hartman) CAB International Oxford, 127–135. Janse, J. D. , 1988. A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. EPPO Bulletin 18, 343–351. Janse, J. D. , 1991. Infra- and intraspecific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatty acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14, 335–345. Kelman, A. , 1954. The relationship of pathogenicity in Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 64, 293–695. Lelliot, R. A. and Stead, D. E. , 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. (T. F. Preece ed. ) Blackwell Scientific Publications, Oxford. 216 pp. Louws, F. J. ; Fulbright, D. W. ; Stephens, C. T. and De Bruijn, F. J. , 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85, 528– 536. Lozano, J. C. and Sequeira, L. , 1970. Differentiation of races of Pseudomonas solanacearum by a leaf infiltra- tion technique. Phytopathology 60, 838. Mirza, M. S. ; Rademaker, J. W. L. ; Janse, J. D. and Akkermans, A. D. L. , 1993. Specific 16S ribosomal RNA targeted oligonucleotide probe against Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Canadian Journal of Micro- biology 39, 1029–1034. Robinson-Smith, A. ; Jones, P. ; Elphinstone, J. G. and Forde, S. M. D. , 1995. Production of antibodies to Pseu- domonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67–79. Seal, S. E. ; Jackson, L. A. ; Young, J. P. W. and Daniels, M. J. , 1993. Differentiation of Pseudomonas solanacearum, P. syzygii, P. picketti and the blood disease bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligo- nucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. Journal of General Microbiology 139, 1587–1594. Smith, J. J. ; Offord, L. C. ; Holderness, M. and Saddler, G. S. , 1995. Genetic diversity of Burkholderia solana- cearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61, 4262–4268. Stead, D. E. , 1992a. Techniques for detecting and identifying plant pathogenic bacteria. In: Techniques for rapid detection of plant pathogens (eds. J. M. Duncan and L. Torrance). Blackwell Scientific Publications, Oxford, 76–111. Stead, D. E. , 1992b. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42, 281–295. Van Beuningen, A. ; Derks, H. and Janse J. D. , 1995. Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in-situ hybridisation (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Züchtungsforschung 2, 266–269. 03/23. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 405 III. MELLÉKLET 1. A károsító szervezet minden olyan vélt előfordulása esetén, amikor a felsorolt növényanyagra vonatkozóan a II. mellékletben meghatározott módszer vagy, minden egyéb esetben, bármely más hatóságilag elfogadott módszer szerint végzett szűrővizsgálat vagy -vizsgálatok eredménye pozitív, és még várni kell a gyanú igazolására vagy eloszla- tására az említett módszer alapján, az eljárás befejezéséig vissza kell tartani és megfelelően meg kell őrizni: – ahol csak lehet, azt a tételt, illetve annak megfelelő egységét, amelyből a mintát vették, eredeti csomagolásában és címkéjével, – ahol csak lehet, a minták maradékait, – a kivonatok maradékait és a szűrővizsgálathoz készített további anyagokat, pl. immunfluoreszcenciás lemezeket, valamint – a tárgyra vonatkozó valamennyi dokumentumot. 2. Amennyiben a károsító szervezet jelenléte beigazolódik, legalább az 5. cikk (2) bekezdésének megfelelő értesítési eljá- rást követő egy hónapig vissza kell tartani és megfelelően meg kell őrizni: – az 1. pontban meghatározott anyagokat, és – megfelelő esetben, a gumó vagy a növény kivonatával beoltott, fertőzött paradicsomból vagy padlizsánból vett mintát, valamint – a károsító szervezet izolált tenyészetét. 406 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 03/23. kötet IV. MELLÉKLET Az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának i. alpontjában meghatározott vizsgálat adott esetben az alábbi elemeket foglalja magában: i. azokat a termőhelyeket: – ahol olyan burgonyával klonális kapcsolatban álló burgonyát termesztenek, vagy termesztettek, amelyről megállapí- tották, hogy a károsító szervezettel fertőzött, – ahol olyan paradicsomot termesztenek, illetve termesztettek, amely ugyanabból a forrásból származik, mint a kóro- kozóval fertőzöttnek talált paradicsom, – ahol olyan burgonyát vagy paradicsomot termesztenek, illetve termesztettek, amelyet hatósági ellenőrzés alá kellett helyezni a károsító szervezet előfordulásának gyanúja miatt, – ahol olyan burgonyával klonális kapcsolatban álló burgonyát termesztenek, illetve termesztettek, amelyet a károsító szervezettel fertőzött termőhelyen termesztettek, – ahol burgonyát vagy paradicsomot termesztenek, és amely fertőzött termőhelyek közelében található, beleértve azokat a termőhelyeket is, amelyek közvetlenül vagy – közös vállalkozó útján – közvetve ugyanazokat a mezőgaz- dasági berendezéseket és létesítményeket használják, – ahol bármely olyan forrásból származó felszíni vizet használnak öntözés vagy permetezés céljára, amelynél fennáll vagy beigazolódott a károsító szervezettel való fertőzöttség gyanúja, – ahol olyan forrásból származó felszíni vizet használnak öntözés vagy permetezés céljára, amelyet olyan termő- helyeken is használnak, ahol fennáll vagy beigazolódott a károsító szervezettel való fertőzöttség gyanúja, – amelyet olyan felszíni víz öntött el, amelynél fennáll vagy beigazolódott a károsító szervezettel való fertőzöttség gyanúja; valamint ii. olyan táblák vagy más termőhelyek öntözésére vagy permetezéséhez használt, illetve ezeket elöntő felszíni vizeket, ahol fennáll vagy beigazolódott a károsító szervezettel való fertőzöttség gyanúja. 03/23. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 407 1. Az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának iii. alpontja és c) pontjának iii. alpontja szerinti valószínű fertőzés mértékének meghatározása adott esetben magában foglalja az alábbi elemeket: V. MELLÉKLET – az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának ii. alpontja szerint fertőzöttnek minősülő termőhelyen termesztett felsorolt növényanyag, – az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának ii. alpontja szerint fertőzöttnek minősülő felsorolt növényanyaggal termelési láncolat során kapcsolatba kerülő termőhely vagy -helyek, beleértve azokat is, amelyek közvetlenül vagy – közös vállalkozó útján – közvetve ugyanazokat a mezőgazdasági berendezéseket és létesítményeket használják, – az a felsorolt növényanyag, amelyet az előző bekezdésben meghatározott termőhelyen termesztettek, vagy amely jelen volt ilyen termőhelyen abban az időszakban, amikor az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának ii. alpontja értel- mében fertőzöttnek minősülő növényanyag szintén jelen volt az első francia bekezdésben említett termőhelyen, – azok a raktárak, ahol a fenti termőhelyekről származó felsorolt növényanyagot tárolják, – mindazok a gépek, járművek, edények, raktárak, vagy azok részei, valamint minden egyéb eszköz, beleértve a csomagolóanyagokat is, amelyek érintkezésbe kerülhettek az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának ii. alpontja értel- mében fertőzöttnek minősülő felsorolt növényanyaggal, – minden olyan felsorolt növényanyag, amelyet az előző francia bekezdésben felsorolt építményekben vagy eszkö- zökben tároltak, vagy azokkal érintkezésbe kerültek azelőtt, hogy sor került volna ezeknek az építményeknek, illetve eszközöknek a tisztítására és fertőtlenítésére, – az 5. cikk (1) bekezdése a) pontja i. alpontjának megfelelően végzett vizsgálat és laboratóriumi teszt nyomán, burgonya esetében azok a gumók, illetve növények, amelyek egyenes- vagy oldalági klonális kapcsolatban állnak az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának ii. alpontja értelmében fertőzöttnek minősülő felsorolt növényanyaggal, illetve a paradicsom esetében azok a növények, amelyek ugyanabból a forrásból származnak, mint az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának ii. alpontja értelmében fertőzöttnek minősülő felsorolt növényanyag, és amelyek – még ha a károsító szervezet kimutatására irányuló vizsgálat negatív eredményt mutatott is – klonális kapcsolat útján valószínűleg maguk is szennyeződhetnek, – az előző francia bekezdésben felsorolt növényanyag termőhelye vagy -helyei, – az olyan felsorolt növényanyag-termőhely, amelynek öntözésére vagy permetezéséhez az 5. cikk (1) bekezdése c) pontjának ii. alpontja értelmében fertőzöttnek minősülő vizet használtak, – az olyan felszíni vízzel elárasztott földeken termesztett felsorolt növényanyag, amelyről megállapították, hogy a károsító szervezettel fertőzött. 2. A fertőzés valószínű elterjedésének az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának iv. alpontja és az 5. cikk (1) bekezdése c) pontjának iii. alpontja szerinti meghatározása kiterjed az alábbiakra: i. az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának iv. alpontjában foglalt esetekben, az alábbi szempontokra: – a felsorolt növényanyag egyéb termőhelyeinek közelsége, – vetőburgonya-állomány közös termesztése és felhasználása, – a felsorolt növényanyag öntözésére vagy permetezéséhez felszíni vizet használó termőhelyek esetében annak vizsgálata, hogy fennáll, illetve fennállt-e az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának ii. alpontja értelmében fertő- zöttnek minősülő termőhelyekről való felszíni lefolyás, illetve ilyen termőhely árvíz általi elöntése következtében a felszíni víz szennyeződésének veszélye; ii. olyan esetekben, amikor az 5. cikk (1) bekezdése c) pontjának ii. alpontja értelmében valamely felszíni víz fertő- zöttnek minősül: – a felsorolt növényanyag olyan termőhelyei, amelyek fertőzöttnek minősülő felszíni víz közelében találhatók vagy amelyeket ilyen víz kiáradása fenyeget, – fertőzöttnek minősülő felszíni vízzel kapcsolatban álló bármely különálló öntözővíz-tározó. 408 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 03/23. kötet 3. Az 5. cikk (2) bekezdése első albekezdésében említett értesítés részleteinek ki kell terjedniük a következőkre: – a károsító szervezet előfordulása gyanújának 4. cikk szerinti jelentésének, az 5. cikk szerinti mintavételnek, vala- mint a károsító szervezet jelenléte 5. cikk szerinti beigazolódásának dátuma, – a fertőzöttségi értesítés részleteinek leírása és az övezet kijelölése. 4. Az 5. cikk (2) bekezdésének második albekezdésében említett további értesítés részleteinek ki kell terjedniük a követ- kezőkre: – valamennyi fertőzöttnek minősített burgonyaszállítmány vagy -tétel esetében a 77/93/EGK irányelv 7. és 8. cikkében előírt bizonyítványok, útlevélszám, a burgonyatermesztők, a gyűjtőraktárak és szállítóközpontok regiszt- rációs száma, – valamennyi fertőzöttnek minősített paradicsomszállítmány vagy -tétel esetében a 77/93/EGK irányelv 7. és 8. cikkében előírt bizonyítványok, valamint az útlevélszám, a 77/93/EGK irányelv V. melléklet A. rész I. 2. 2. szaka- szában felsorolásnak megfelelően, – a vetőburgonya-készleteknél, és lehetőség szerint minden egyéb esetben a fajta neve és kategóriája, – a Bizottság által a károsító szervezet igazolt felbukkanására vonatkozóan kért minden egyéb információ. 03/23. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 409 1. A 6. cikk (1) bekezdésére nézve az alábbi intézkedések az irányadók: VI. MELLÉKLET – elégetés, vagy – állati takarmányként való felhasználás olyan hőkezelést követően, hogy ne állhasson fenn a károsító szervezet túlé- lésének veszélye, – a fertőzött anyag mély elföldelése egy olyan hulladéklerakó telepen, ahol nem áll fenn a mezőgazdasági termőterü- letre való elszivárgás vagy olyan vízforrásokkal való érintkezés veszélye, amelyeket mezőgazdasági területek öntö- zésére használhatnak, vagy – ipari feldolgozás azonnali elszállítással közvetlenül egy olyan feldolgozóüzembe, ahol az ezen irányelv VII. mellék- letében foglalt rendelkezéseknek megfelelő, hatóságilag elfogadott hulladékfeldolgozó berendezések működnek, vagy – egyéb olyan eljárás, amellyel kapcsolatban megbizonyosodtak arról, hogy nem áll fenn a károsító szervezet tovább- terjedésének tényleges veszélye; ezekről az intézkedésekről haladéktalanul értesíteni kell a Bizottságot és a többi tagállamot. 2. Az érintett tagállam vagy tagállamok illetékes hivatalos szerveinek felügyelete mellett a felsorolt növényanyagnak a 6. cikk (2) bekezdése szerinti megfelelő felhasználása vagy elhelyezése, a kellő ellenőrzés biztosítása érdekében az ille- tékes hivatalos szervek között megfelelő információcserével, továbbá a burgonya csomagolása vagy az első és a második francia bekezdésben említett hulladékfeldolgozó berendezésekben történő feldolgozása a tagállam illetékes hivatalos szervének jóváhagyásával és a következők szerint történhet: i. burgonyagumók tekintetében: – közvetlen szállításra és fogyasztásra szánt áruként megfelelő hulladékfeldolgozó berendezésekkel rendelkező csomagolóüzemekben közvetlen szállításra és felhasználásra való előkészítés, újracsomagolás nélkül, vagy – ipari feldolgozásra szánt áruként való felhasználás, azonnali elszállítással közvetlenül egy megfelelő hulladékfel- dolgozó berendezésekkel rendelkező feldolgozóüzembe, vagy – egyéb felhasználási, illetve elhelyezési mód, az említett illetékes hivatalos szervek jóváhagyásával, meggyőződve arról, hogy nem áll fenn a károsító szervezet továbbterjedésének azonosítható veszélye. Ezekről az intézkedé- sekről haladéktalanul értesíteni kell a Bizottságot és a többi tagállamot. ii. egyéb növényrészek tekintetében, beleértve a növények szárát és levélhulladékát is: – megsemmisítés, vagy – egyéb felhasználási, illetve elhelyezési mód, meggyőződve arról, hogy nem áll fenn a károsító szervezet tovább- terjedésének azonosítható veszélye; ezekről az intézkedésekről értesíteni kell a Bizottságot és a többi tagállamot is. 3. A 6. cikk (3) bekezdésében említett eszközök fertőtlenítésének megfelelő módja a tisztítás és – szükség esetén – fertőt- lenítés, a tagállamok illetékes hivatalos szerveinek felügyelete mellett, meggyőződve arról, hogy nem áll fenn a káro- sító szervezet továbbterjedésének azonosítható veszélye. 4. A tagállamok számára az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának iv. alpontja és c) pontjának iii. alpontja szerint kijelölt, és a 6. cikk (4) bekezdésében említett övezeten belül előírt intézkedéseknek ki kell terjedniük a következőkre: 4. 1. Az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának ii. alpontja értelmében fertőzöttnek minősített termőhelyek esetén: a) a védett kultúrának az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának ii. alpontja értelmében fertőzöttnek minősített tábláján vagy védett termesztőegységén: 410 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 03/23. kötet i. a fertőzötté minősítést követő legalább négy tenyészidőszak során: – gondoskodni kell az árvakelésű burgonya-, illetve paradicsomnövények, valamint a károsító szervezet egyéb gazdanövényeinek, beleértve a burgonyafélékhez tartozó gyomnövényeket is, eltávolításáról, vala- mint – tilos a következő növények ültetése és vetése: – burgonyagumók vagy -növények, – paradicsomnövény és -magok, – a károsító szervezet biológiájának figyelembevételével, – egyéb gazdanövények, – a Brassica fajok növényei, amelyeknél fennáll a károsító szervezet túlélésének tényleges veszélye, – olyan kultúrák, amelyeknél fennáll a károsító szervezet továbbterjedésének azonosítható veszélye; – a burgonya- vagy paradicsomtermesztésnek az előző francia bekezdésben meghatározott időszakot követő első évében, feltéve hogy az adott táblát az ültetést megelőző legalább két egymást követő tenyészidőszakon át mentesnek találták az árvakelésű burgonya-, illetve paradicsomnövényektől, vala- mint a károsító szervezet egyéb gazdanövényeitől, beleértve a burgonyafélékhez tartozó gyomnövé- nyeket is, – burgonyatermesztés esetében hatóságilag tanúsított vetőburgonyát kizárólag árutermelési céllal lehet ültetni, valamint – a 2. cikk (1) bekezdésében foglaltaknak megfelelő hatósági vizsgálatot kell folytatni, laboratóriumi vizsgálatot is beleértve; – a burgonya- vagy paradicsomtermesztésnek az előző francia bekezdésben említett évet követő évében, megfelelő vetésváltást követően, burgonyatermesztés esetén kizárólag hatóságilag tanúsított vetőburgo- nyát lehet ültetni vetőgumó- vagy áruburgonya-termelési céllal, és mind burgonya-, mind pedig paradi- csomtermesztés esetén a 2. cikk (1) bekezdésében meghatározott ellenőrzést el kell végezni, vagy ii. a fertőzötté minősítést követő öt tenyészidőszakon át – intézkedéseket kell hozni az árvakelésű burgonya-, illetve paradicsomnövények, valamint a károsító szervezet egyéb gazdanövényeinek, beleértve a burgonyafélékhez tartozó gyomnövényeket is, eltávolítá- sáról, továbbá – fekete ugarolást kell végezni, és az első három évben az adott táblát – a veszélyességértékelés alapján – vagy parlagon hagyják, vagy gabonafélével vetik be, vagy rét-legelő gazdálkodást folytatnak a növény- állomány gyakori és alacsony vágásával vagy intenzív legeltetéssel, vagy pázsitként hasznosítják, majd a rákövetkező két évben olyan, a károsító szervezet gazdanövényein kívüli növényekkel ültetik be, amelyeknél nincs tényleges veszélye a károsító szervezet túlélésének vagy továbbterjedésének, – a burgonya- vagy paradicsomtermesztésnek az előző francia bekezdésben meghatározott időszakot követő első évében, – burgonyatermesztés esetében hatóságilag tanúsított vetőburgonyát lehet ültetni vetőgumó- vagy áruburgonya-termelési céllal, és a 2. cikk (1) bekezdésében foglaltaknak megfelelő hatósági vizsgálatot kell folytatni, laboratóriumi vizs- gálatot is beleértve; b) egyéb táblák esetén: – a fertőzötté minősítést követő tenyészidőszak évében: – tilos burgonyagumót-, illetve növényt vagy a károsító szervezet egyéb gazdanövényét ültetni, és gondos- kodni kell az árvakelésű burgonya-, illetve paradicsomnövények és a károsító szervezet egyéb gazda- növényeinek, beleértve a burgonyafélékhez tartozó gyomnövényeket is, irtásáról, vagy – burgonyagumók esetén hatóságilag tanúsított vetőburgonyát kizárólag árutermelés céljából lehet ültetni, feltéve hogy az illetékes hivatalos szervek meggyőződtek arról, hogy az árvakelésű burgonya-, illetve paradicsomnövényekkel és a károsító szervezet egyéb gazdanövényeivel, beleértve a burgonyafélékhez tartozó gyomnövényeket is, kapcsolatos kockázatokat sikerült kiküszöbölni. A fejlődő kultúrát megfelelő időközönként meg kell vizsgálni és az árvakelésű burgonyanövényeknél laboratóriumi vizsgálattal kell ellenőrizni a károsító szervezet jelenlétét; továbbá, burgonya esetében ellen-őrizni kell a betakarított gumókat, 03/23. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 411 – az első francia bekezdésben meghatározott évet követő első tenyészidőszak során, – burgonyatermesztés esetében kizárólag hatóságilag tanúsított vetőburgonyát lehet ültetni vetőgumó- vagy áruburgonya-termelési céllal, és – legalábbis az első francia bekezdésben meghatározott évet követő második évben, – burgonyatermesztés esetében kizárólag hatóságilag elismert vetőburgonyát vagy hatóságilag tanúsított vetőburgonyából, hatósági ellenőrzés mellett termesztett vetőburgonyát lehet ültetni vetőgumó- vagy árutermelési céllal, – az előző francia bekezdésekben említett tenyészidőszakok során gondoskodni kell az árvakelésű burgonya-, illetve paradicsomnövények és a károsító szervezetek egyéb gazdanövényeinek, beleértve a burgonyafélékhez tartozó gyomnövényeket is, eltávolításáról, és a 2. cikk (1) bekezdésében foglaltaknak megfelelő hatósági vizsgálatot kell folytatni, továbbá vetőgumók vetőburgonya termelése céljából történő ültetése esetén a gumókat laboratóriumi vizsgálatnak kell alávetni; c) az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának ii. alpontja szerinti fertőzötté minősítést követően azonnal, valamint a rákövetkező tenyészidőszakok mindegyikében, a burgonya vagy paradicsom fertőzöttnek minősített tábláikon való termesztésének a) pont szerinti első megengedett évével bezárólag: – a termőhelyen található és a burgonya- vagy paradicsomtermesztésbe bevont valamennyi gépet és táro- lóegységet meg kell tisztítani és – szükség esetén – megfelelő módszerrel fertőtleníteni kell, a 3. pontban foglaltak szerint, – a károsító szervezet továbbterjedésének megakadályozására hatóságilag ellenőrizni kell az öntözési és permetezési programokat, szükség esetén akár meg is tiltva azokat; d) a védett kultúra termőhelyeinek az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának ii. alpontja szerint fertőzöttnek minősí- tett olyan egységeiben, ahol lehetőség van a termesztő közeg teljes cseréjére: – tilos vetőgumót, burgonyanövényt vagy a károsító szervezet egyéb gazdanövényeit, beleértve a paradi- csomnövényeket és -magokat is, ültetni vagy vetni, kivéve ha az érintett termelőegységben hatósági fel- ügyelet mellett gondoskodtak a károsító szervezet és valamennyi gazdanövényének eltávolításáról, bele- értve legalább a termesztőközeg teljes cseréjét, valamint az említett termelőegység és valamennyi berende- zésének megtisztítását és – szükség esetén – fertőtlenítését, majd ezt követően az illetékes hivatalos szervek hivatalosan engedélyezték a burgonya- vagy paradicsomtermesztést, valamint – burgonyatermesztés esetén kizárólag hatóságilag tanúsított vetőburgonyát vagy ellenőrzött forrásból szár- mazó minigumót, illetve mikronövényt szabad ültetni, – a károsító szervezet továbbterjedésének megakadályozására hatóságilag ellenőrizni kell az öntözési és permetezési programokat, szükség esetén akár meg is tiltva azokat. 4. 2. A 4. 1. pontban foglalt rendelkezések sérelme nélkül, a kijelölt övezeten belül a tagállamok kötelesek: a) azonnali hatállyal, a fertőzötté minősítést követő legalább három tenyészidőszakon át: (aa) amennyiben a kijelölt övezet felállítására az 5. cikk (1) bekezdés a) pontja iv. alpontjának megfelelően került sor; – gondoskodni arról, hogy illetékes hivatalos szerveik felügyelete alá helyezzék a vetőgumó, illetve para- dicsom termesztésére, tárolására vagy kezelésére szolgáló létesítményeket, beleértve a paradicsom vagy burgonya termesztésébe bevont gépeket szerződéses alapon működtető létesítményeket is, – előírni az ilyen létesítményekben működő gépek és tárolóegységek a 3. pontban foglalt rendelkezések szerinti megfelelő módszerekkel történő megtisztítását és szükség esetén fertőtlenítését is, 412 HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 03/23. kötet – előírni, hogy kizárólag hatóságilag tanúsított vagy hatósági ellenőrzés mellett termesztett gumót szabad abban az övezetben ültetni, és az 5. cikk (1) bekezdése a) pontjának iii. alpontja értelmében valószínűleg fertőzöttnek minősített termőhelyeken termesztett vetőburgonyát betakarítás után labo- ratóriumi vizsgálatnak kell alávetni, – előírni, hogy a betakarított vetőburgonyát és áruburgonyát az övezeten belül valamennyi létesít- ményben egymástól elkülönítve kell kezelni, – elvégezni a 2. cikk (1) bekezdésében meghatározott hatósági vizsgálatokat; (ab) amennyiben valamely felszíni vizet az 5. cikk (1) bekezdése c) pontjának ii. alpontja értelmében fertő- zöttnek minősítettek, vagy az V. melléklet 2. pontjának megfelelően a károsító szervezet valószínű továbbterjedésének közegeként jelöltek meg: – megfelelő időpontokban évenkénti vizsgálatot kell folytatni, beleértve a mintavételt a felszíni vízből, valamint a megfelelő vízforrásokban található burgonyafélékhez tartozó gazdanövényekből, továbbá a laboratóriumi vizsgálatot, – a felsorolt növényanyag esetében a II. mellékletben foglalt megfelelő módszer, vagy – egyéb esetekben bármely más hatóságilag elfogadott módszer alkalmazásával, – az öntözési és permetezési programokat hatósági ellenőrzésnek kell alávetni, beleértve a fertőzöttnek minősített vizeknek a felsorolt növényanyag és megfelelő esetben a károsító szervezet egyéb gazda- növényeinek öntözésére vagy permetezéséhez való felhasználásának tilalmát, a károsító szervezet továbbterjedésének megakadályozása érdekében. Ez a tilalom az említett éves vizsgálatok eredmé- nyének tükrében felülvizsgálható, – a károsító szervezettel fertőzött folyékony hulladék kibocsátása esetén hatósági ellenőrzéseket kell végezni a felsorolt növényanyaggal foglalkozó ipari feldolgozó- vagy csomagolóüzemek által kibocsá- tott hulladék kezelésére vonatkozóan; b) szükség esetén egy megfelelő időtartamot felölelő programot kell létrehozni valamennyi vetőburgonya-készlet kicserélésére. 03/23. kötet HU Az Európai Unió Hivatalos Lapja 413 VII. MELLÉKLET A VI. melléklet 1. pontjának negyedik francia bekezdésében említett hatóságilag jóváhagyott hulladékfeldolgozó létesít- ményeknek az alábbi rendelkezéseknek kell megfelelniük úgy, hogy ne állhasson fenn a károsító szervezet elterjedésének kockázata: i. a burgonya és paradicsom feldolgozása során keletkező hulladékot (beleértve a leselejtezett burgonyát, burgonyahéjat és paradicsomot) és a burgonyával, illetve paradicsommal kapcsolatos mindennemű szilárd hulladékot az alábbiaknak megfelelően kell kezelni: – a fertőzött anyag mély elásása egy olyan hulladéklerakó telepen, ahol nem áll fenn a mezőgazdasági termőterületre való elszivárgás vagy olyan vízforrásokkal való érintkezés veszélye, amelyeket mezőgazdasági területek öntözésére használhatnak. A hulladékot közvetlenül a lerakó telepre kell szállítani olyan edényekben, amelyek biztosítják, hogy ne szivároghasson el hulladék, vagy – elégetés; ii. feldolgozás során keletkező folyékony hulladék: elhelyezése előtt a szuszpendált szilárd anyagot tartalmazó folyékony hulladékot át kell szűrni vagy ülepíteni kell a szilárdanyag-tartalom eltávolítására. Az így nyert szilárd anyagokat az i. alpontban foglaltaknak megfelelően kell elhelyezni. A folyékony hulladékot ezután vagy: – hőkezelésnek kell alávetni minimum 70 °C-on legalább 30 percen át, vagy – az anyagot hivatalosan jóváhagyott módon és hatósági ellenőrzés mellett úgy kell elhelyezni, hogy ne merüljön fel annak veszélye, hogy a hulladék kapcsolatba kerül mezőgazdasági területtel vagy olyan vízforrásokkal, amelyeket mezőgazdasági terület öntözésére használhatnak. Ennek részleteit bejelentik a többi tagállamnak és a Bizottságnak