title: Směrnice Komise 96/54/es ze dne 30. července 1996, kterou se po dvacáté druhé přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek

eurovoc_concepts:
approximation of laws
chemical product
dangerous substance
labelling
packaging

text: 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 31996L0054 30. 9. 1996 ÚŘEDNÍ VĚSTNÍK EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ 173 L 248/1 SMĚRNICE KOMISE 96/54/ES ze dne 30. července 1996, kterou se po dvacáté druhé přizpůsobuje technickému pokroku směrnice Rady 67/548/EHS o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek KOMISE EVROPSKÝCH SPOLEČENSTVÍ, s ohledem na Smlouvu o založení Evropského společenství, směrnici Rady ohledem na s dne 27. června 1967 o sbližování právních a správních předpisů týkajících se klasifikace, balení a označování nebezpečných látek (1), naposledy pozměněnou směrnicí Komise 94/96/ES (2), a zejména na článek 28 uvedené směrnice, 67/548/EHS ze vzhledem k tomu, že příloha V směrnice 67/548/EHS stanoví metody pro stanovení fyzikálně-chemických vlastností, toxicity a ekotoxicity látek a přípravků; že je nezbytné přizpůsobení této přílohy technickému pokroku; vzhledem k tomu, že příloha VI směrnice 67/548/EHS ob- sahuje obecná kritéria pro klasifikaci a označování nebezpeč- ných látek a přípravků; že je třeba zavést kritéria pro látky a přípravky nebezpečné pro zdraví, pokud jsou vdechovány; že kritéria pro senzibilizující látky a přípravky je třeba změnit; že je třeba zavést kritéria pro označování plynových lahví urče- ných pro propan, butan a zkapalněný zemní plyn (LPG); vzhledem k tomu, že opatření této směrnice jsou v souladu se stanoviskem Výboru pro přizpůsobení technickému pokroku směrnic o odstranění technických překážek obchodu na úseku nebezpečných látek a přípravků, současných vědeckých a vzhledem k tomu, že příloha I směrnice Rady 67/548/EHS obsahuje seznam nebezpečných látek, jejich klasifikaci, označo- vání a v případě potřeby jejich charakterizaci prostřednictvím koncentračních limitů a jiných parametrů umožňujících zhod- jejich rizika pro zdraví člověka a životní prostředí; nocení že seznam nebezpečných látek v příloze I vyžaduje úpravu technických poznatků; že podle v důsledku toho je nezbytné změnit úvod přílohy I tak, aby obsahoval poznámky týkající se označování přípravků a novou skupinu organických látek v tabulce B; že seznam nebezpeč- ných látek v příloze I obsahuje látky, pro které byly poskytnuty Rakousku a Švédsku v aktu o přistoupení Rakouska, Finska a Švédska specifické dočasné odchylky týkající se klasifikace a označování; že akt o přistoupení zabezpečuje přezkoumání požadavků na klasifikaci a označování těchto látek; že proto byla přezkoumána klasifikace některých těchto látek; PŘIJALA TUTO SMĚRNICI: Článek 1 Směrnice 67/548/EHS se mění takto: 1. Příloha I se mění takto: vzhledem k tomu, že příloha III směrnice 67/548/EHS ob- spojená sahuje s nebezpečnými látkami a přípravky; že je potřeba zavést věty udávající nebezpečnost určitých látek a přípravků pro zdraví; seznam vět udávajících zvláštní rizika a) V předmluvě se poznámka 4 nahrazuje tímto: „Poznámka 4 (1) Úř. věst. L 196, 16. 8. 1967, s. 1. (2) Úř. věst. L 381, 31. 12. 1994, s. 1 Přípravky obsahující tyto látky musí být klasifikovány jako zdraví škodlivé s větou R 65, pokud splňují kritéria v příloze VI části 3. 2. 3. “; 174 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 b) doplňuje se poznámka 5, která zní: „Poznámka 5 Koncentrační limity pro plynné přípravky jsou vyjádřeny v objemových procentech“; c) v tabulce B v předmluvě přílohy I směrnice 67/548/EHS se vkládá tato klasifikace pro organické látky: d) odpovídající položky uvedené směrnice se nahrazují po- ložkami přílohy I této směrnice; e) poprvé se vkládají položky přílohy II této směrnice; f) zrušují se položky s těmito čísly: 008-002-00-3 612-045-00-9 648-011-00-5 648-025-00-1 648-157-00-X 648-158-00-5 648-159-00-0 649-192-00-3 g) položky v příloze III uvedené směrnice se mění tak, že se nahrazují odkazy na všechny odkazy na „R 22“ „R 65“. 3. Příloha V část B se mění takto: a) záhlaví a obecný úvod k části B: Metody pro stanovení toxicity se nahrazuje textem v příloze IV A této směrnice; b) za kapitolu B. 1 a) se vkládá text v příloze IV B této směrnice; c) kapitola B. 6 se nahrazuje textem v příloze IV C této směrnice; d) kapitola B. 7 se nahrazuje textem v příloze IV D této směrnice; e) doplňuje se text v příloze IV E této směrnice. 4. Příloha VI se mění a zní způsobem uvedeným v příloze V této směrnice. Článek 2 Aniž je dotčen odstavec 2, 1. státy uvedou v účinnost právní a správní předpisy nezbytné pro dosažení souladu s touto směrnicí nejpozději do 31. května 1998. Člen- ské státy o nich neprodleně uvědomí Komisi. členské Nejpozději do 31. října 1997 členské státy uvedou 2. v účinnost právní a správní předpisy nezbytné k dosažení souladu s přílohou V body F, I a J této směrnice. Členské státy o nich neprodleně uvědomí Komisi. Předpisy podle odstavců 1 a 2 přijaté členskými státy 3. musí obsahovat odkaz na tuto směrnici nebo musí být takový odkaz učiněn při jejich úředním vyhlášení. Způsob odkazu si stanoví členské státy. Článek 3 2. V příloze III se vkládá nová věta, která zní: Tato směrnice vstupuje v platnost dvacátým dnem po vyhlášení v Úředním věstníku Evropských společenství. 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 175 Článek 4 Tato směrnice je určena členským státům. V Bruselu dne 30. července 1996. Za Komisi Ritt BJERREGAARD členka Komise 176 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 177 ANEXO I — BILAG I — ANHANG I — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I — ANNEX I — ANNEXE I — ALLEGATO I — BIJLAGE I — ANEXO I — LIITE I — BILAGA I 178 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 179 180 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 181 182 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 183 184 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 185 186 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 187 188 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 189 190 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 191 192 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 193 194 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 195 196 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 197 198 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 199 200 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 201 202 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 203 204 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 205 206 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 207 208 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 209 210 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 211 212 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 213 214 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 215 216 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 217 218 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 219 220 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 221 222 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 223 224 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 225 226 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 227 228 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 229 230 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 231 232 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 233 234 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 235 236 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 237 238 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 239 240 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 241 242 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 243 244 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 245 246 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 247 248 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 249 250 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 251 252 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 253 254 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 255 256 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 257 258 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 259 260 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 261 262 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 263 264 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 265 266 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 267 268 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 269 270 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 271 272 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 273 274 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 275 276 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 277 278 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 279 280 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 281 282 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 283 284 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 285 286 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 287 288 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 289 290 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 291 292 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 293 294 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 295 296 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 297 298 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 299 300 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 301 ANEXO II — BILAG II — ANHANG II — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II — ANNEX II — ANNEXE II — ALLEGATO II — BIJLAGE II — ANEXO II — LIITE II — BILAGA II 302 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 303 304 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 305 306 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 307 308 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 309 310 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 311 312 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 313 314 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 315 316 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 317 318 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 319 320 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 321 322 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 323 324 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 325 326 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 327 328 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 329 330 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 331 332 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 333 334 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 335 336 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 337 338 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 339 340 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 341 342 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 343 344 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 345 346 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 347 348 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 349 350 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 351 352 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 353 354 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 355 356 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 357 358 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 359 ANEXO III — BILAG III — ANHANG III — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ III — ANNEX III — ANNEXE III — ALLEGATO III — BIJLAGE III — ANEXO III — LIITE III — BILAGA III Indexové číslo 360 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 361 PŘÍLOHA IV A „ČÁST B: METODY STANOVENÍ TOXICITY A JINÝCH ÚČINKŮ NA ZDRAVÍ OBECNÝ ÚVOD: ČÁST B A. VYSVĚTLIVKY Pro účely obecného úvodu je použito toto číslování: B. 15 Zkouška na genové mutace u Saccharomyces cerevisiae B. 16 Zkouška na mitotickou rekombinaci u Saccharomyces cerevisiae B. 17 Zkouška na genové mutace v savčích buňkách in vitro B. 18 Zkouška na poškození a reparaci DNA – neplánovanou syntézu DNA – v savčích buňkách in vitro B. 19 Zkouška na výměnu sesterských chromatid in vitro B. 20 Zkouška na recesivní letální mutace vázané na pohlaví u Drosophila melanogaster B. 21 Zkoušky na transformace savčích buněk in vitro B. 22 Dominantní letální zkouška na hlodavcích B. 23 Cytogenetická analýza savčích zárodečných buněk in vivo B. 24 Spot test na myších B. 25 Zkouška na dědičnou translokaci u myší B. 26 Zkouška subchronické orální toxicity: 90denní opakovaná orální aplikace na hlodavcích B. 27 Zkouška subchronické orální toxicity: 90denní opakovaná orální aplikace na nehlodavcích B. 28 Studie subchronické dermální toxicity: 90denní opakovaná kožní aplikace na hlodavcích B. 29 Studie subchronické inhalační toxicity: 90denní opakovaná inhalační expozice na hlodavcích B. 30 Zkouška chronické toxicity B. 31 Zkouška teratogenity na hlodavcích a nehlodavcích B. 32 Zkouška karcinogenity B. 33 Kombinovaná zkouška chronické toxicity a karcinogenity B. 34 Jednogenerační zkouška toxicity pro reprodukci B. 35 Dvougenerační zkouška toxicity pro reprodukci B. 36 Studie toxikokinetiky B. OBECNÉ DEFINICE TERMÍNŮ POUŽITÝCH VE ZKUŠEBNÍCH METODÁCH UVEDENÝCH V TÉTO PŘÍLOZE i) Akutní toxicita zahrnuje nepříznivé účinky, které se projeví v daném časovém období (obvykle 14 dnů) po podání jedné dávky látky. ii) Zřejmá toxicita je obecný termín popisující zřetelné příznaky toxicity po podání zkoušené látky. Tyto příznaky by měly být dostatečně zřetelné pro hodnocení nebezpečnosti a měly by být tak silné, že při zvýšení podané dávky lze předpokládat vyvolání silných příznaků toxicity a pravděpodobnou mortalitu. iii) Dávka je množství podané zkoušené látky. Dávka se vyjadřuje jako hmotnost zkoušené látky (v gramech nebo miligramech) nebo jako hmotnost zkoušené látky na jednotku hmotnosti pokusného zvířete (např. v miligramech na kilogram tělesné hmotnosti) nebo jako konstantní koncentrace v potravě (v ppm nebo v miligramech na kilogram potravy). iv) Diskriminující dávka je nejvyšší ze čtyř fixních úrovní dávek, které lze podat, aniž by vyvolaly mortalitu vyvolanou látkou (včetně humánního utracení). 362 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 v) Dávkování je obecný termín zahrnující dávku, častost a trvání podávání látky. vi) LD50 (střední letální dávka) je statisticky vypočtená jednotlivá dávka látky, u níž lze očekávat, že způsobí uhynutí 50 % zvířat, kterým byla podána. Hodnota LD50 se vyjadřuje v hmotnosti zkoušené látky na jednotku hmotnosti pokusného zvířete (v miligramech na kilogram). vii) LC50 (střední letální koncentrace) je statisticky vypočtená koncentrace látky, u níž lze očekávat, že způsobí během expozice nebo do určité doby po expozici uhynutí 50 % zvířat exponovaných určitou dobu. Hodnota LC50 se vyjadřuje jako hmotnost zkoušené látky ve standardním objemu vzduchu (v miligramech na litr). viii) NOAEL je anglická zkratka pro ‚no observed adverse effect level‘ (hladina bez pozorovaného nepříznivého účinku) a odpovídá nejvyšší úrovni dávky nebo expozice, při které nejsou pozorovány žádné nepříznivé nálezy související s podáním látky. ix) Subchronická toxicita nebo toxicita při opakované dávce zahrnuje nepříznivé účinky, které se projeví u pokusných zvířat jako důsledek opakovaného denního podávání chemické látky nebo opakované expozice chemické látce po dobu představující krátký úsek očekávané délky života pokusných zvířat. x) Maximální tolerovaná dávka (MTD) je nejvyšší úroveň dávky, která u zvířat vyvolá známky toxicity, aniž by měla během zkoušky, ve které je použita, větší vliv na přežití zvířat. xi) Kožní dráždivostí se rozumí vyvolání zánětlivých změn na kůži po aplikaci zkoušené látky. xii) Oční dráždivostí se rozumí vyvolání změn v oku po aplikaci zkoušené látky na povrch oka. xiii) Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida) je imunologicky vyvolaná reakce kůže na látku. xiv) Poleptání kůže je vyvolání nevratného poškození kožní tkáně po aplikaci zkoušené látky po dobu od 3 min do 4 h. xv) Toxikokinetika je studie absorpce, distribuce, metabolismu a vylučování zkoušených látek. xvi) Absorpce je proces, kterým podaná látka vstupuje do těla. xvii) Vylučování je proces, kterým jsou podaná látka a/nebo její metabolity vyloučeny z těla. xviii) Distribuce je proces, kterým je absorbovaná látka a/nebo její metabolity rozděleny v těle. xix) Metabolismus je proces, kterým je podaná látka v těle strukturně měněna enzymatickými nebo neenzymatickými reakcemi. B. 1 Akutní toxicita při opakované dávce/subchronická a chronická toxicita Akutní toxické účinky látky a její orgánovou nebo systémovou toxicitu lze zhodnotit za použití různých zkoušek (metody B. 1 – B. 5), které po podání jediné dávky poskytnou předběžné údaje o toxicitě. V závislosti na toxicitě látky lze zvážit použití limitní zkoušky pro stanovení LD50, třebaže v inhalačních studiích není uvedena žádná limitní zkouška, protože nebylo možné definovat jedinou limitní hodnotu pro jednorázovou inhalační expozici. Měly by být upřednostněny metody, při nichž se používá co nejméně zvířat a které minimalizují jejich utrpení, například metoda fixní dávky (metoda B. 1 a)) a metoda stanovení tříd akutní toxicity (metoda B. 1 b)). U zkoušek na úrovni 1 může závěry získané z první studie doplnit studie na jiném druhu. V takovém případě může být použita standardní zkušební metoda nebo může být metoda upravena pro menší počet zvířat. 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 363 Zkouška toxicity při opakované aplikaci (metody B. 7, B. 8 a B. 9) zahrnuje posouzení toxických účinků v důsledku opakované expozice. Důraz se klade na pečlivé klinické pozorování zvířat s cílem získat co nejvíce informací. Tyto zkoušky by měly pomoci zjistit cílové orgány toxicity a toxické a netoxické dávky. Od dlouhodobých studií se požaduje další hlubší analýza těchto aspektů (metody B. 26 – B. 30 a B. 33). B. II Mutagenita – Genotoxicita Mutagenitou se rozumí vyvolání trvalých, přenosných změn množství nebo struktury genetického materiálu buněk nebo organismů. Tyto změny, ‚mutace‘, se mohou týkat jediného genu nebo segmentu genů, skupin genů nebo celých chromosomů. Účinky na celé chromosomy mohou vyvolat strukturní a/nebo numerické změny. Mutagenní aktivita látky se posuzuje zkouškami a/nebo na strukturní chromosomové aberace v savčích buňkách (metoda B. 10). in vitro na genové (bodové) mutace v bakteriích (metoda B. 13/14) Přijatelné jsou také postupy in vivo, např. test mikrojader (metoda B. 12) nebo analýza metafází buněk kostní dřeně (metoda B. 11). Neexistují-li však žádné kontraindikace, důrazně se doporučují metody in vitro. Dodatečné studie mutagenního potenciálu látky nebo provedení předběžných zkoušek karcinogenity mohou být nezbytné pro látky vyráběné ve velkých množstvích nebo pro provedení následného hodnocení rizika a mohou být použity k několika účelům: pro potvrzení výsledků získaných v základní sadě zkoušek, pro zkoumání ukazatelů, které nebyly studovány v základní sadě zkoušek, pro zahájení nebo rozšíření studií in vivo. Pro tyto účely zahrnují metody B. 15 až B. 25 eukaryotické systémy in vivo a in vitro a rozšířenou řadu biologických ukazatelů. Tyto zkoušky poskytují informace o bodových mutacích a o jiných ukazatelích u organismů složitějších než bakterie používané pro základní sadu zkoušek. Obecně platí, že je-li zvažován program dalších studií mutagenity, měl by být navržen tak, aby poskytl příslušné doplňující informace o mutagenním a/nebo karcinogenním potenciálu látky. Výběr studií, které mohou být vhodné pro daný případ, závisí na mnoha faktorech, včetně chemických a fyzikálních látky, výsledků základních bakteriálních a cytogenetických zkoušek, metabolického profilu látky, výsledků vlastností dalších studií toxicity a známých způsobů použití látky. Pevné schéma výběru zkoušek je tedy nevhodné, s ohledem na velký počet faktorů, které mohou vyžadovat zvážení. Některé obecné principy strategie zkoušení nacházejí v metodických návodech pro hodnocení rizika, specifickým okolnostem. jsou stanoveny ve směrnici 93/67/EHS, ale přesné strategie zkoušení se tak, aby vyhovovaly jsou však pružné a lze je upravit Metody pro další vyšetřování účinku: jsou nicméně níže seskupeny na základě jejich hlavního analyzovaného genetického Studie zkoumající genové (bodové) mutace a) Studie přímé nebo zpětné mutace u eukaryotických mikroorganismů (Saccharomyces cerevisiae) (metoda B. 15). b) Studie přímých mutací v savčích buňkách in vitro (metoda B. 17). c) Zkouška na recesivní letální mutace vázané na pohlaví u Drosophila melanogaster (metoda B. 20). d) Zkouška na somatické mutace buněk in vivo, spot test na myších (metoda B. 24). Studie zkoumající chromosomové aberace a) Cytogenetické studie na savcích in vivo; měla by být vzata v úvahu analýza metafáze buněk kostní dřeně, pokud nebyla zařazena do základního vyšetření (metoda B. 11). Kromě toho může být provedena také cytogenetická analýza zárodečných buněk in vivo (metoda B. 23). b) Cytogenetická studie na savčích buňkách in vitro, pokud nebyla zařazena do základního vyšetření (B. 10). c) Dominantní letální zkouška na hlodavcích (metoda B. 22). d) Zkouška na dědičnou translokaci u myší (metoda B. 25). 364 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 Genotoxické účinky – účinky na DNA Genotoxicita, která je dána potenciálně škodlivými účinky na genetický materiál, jenž není nezbytně spojen s mutagenitou, se může projevit jako indukované poškození DNA bez přímého důkazu mutace. Pro zkoumání těchto jevů mohou být vhodné následující metody používající eukaryotické mikroorganismy nebo buňky savců: a) Mitotická rekombinace u Saccharomyces cerevisiae (metoda B. 16). b) Poškození a reparace DNA – neplánovaná syntéza DNA v savčích buňkách – in vitro (metoda B. 18). c) Výměna sesterských chromatid v savčích buňkách – in vitro (metoda B. 19). Alternativní metody vyšetřování karcinogenního potenciálu látky vyvolat změny morfologie a chování Zkoušky na transformaci savčích buněk umožňují měřit schopnost v buněčných kulturách, u nichž se předpokládá, že souvisejí s maligní transformaci – in vivo (metoda B. 21). Použity mohou být různé typy buněk a různá kritéria transformace. Posouzení rizika dědičných účinků u savců Existuje několik metod umožňujících měřit u savců dědičné účinky vyvolané genetickými (bodovými) mutacemi, např. zkouška na specifické umístění genů v chromosomu u myší pro měření mutace zárodečných buněk v první generaci (nezařazeno do této přílohy), nebo pro chromosomové aberace, např. zkouška na přenosné translokace u myší (metoda B. 25). Tyto metody lze použít pro odhad možného genetického rizika, které látka představuje pro člověka. Vzhledem ke složitosti těchto zkoušek a k vysokému nezbytnému počtu zvířat, zejména pro zkoušku na specifické umístění genů v chromosomu, je však nezbytné dobré zdůvodnění před provedením těchto studií. B. III Karcinogenita Chemické látky mohou být považovány za genotoxické nebo negenotoxické karcinogeny v závislosti na předpokláda- ném mechanismu působení. Předběžné informace o genotoxickém karcinogenním potenciálu látky lze získat ze studií mutagenity/genotoxicity. Dodatečné informace lze získat ze zkoušek toxicity při opakované aplikaci a ze zkoušek subchronické a chronické toxicity. Zkouška toxicity při opakované aplikaci, metoda B. 7, a dlouhodobější studie toxicity při opakované dávce zahrnují dávce, např. hyperplasie určitých tkání, které mohou být předmětem zájmu. Tyto studie a toxikokinetické informace mohou pomoci určit chemické látky s karcinogenním potenciálem, u nichž může být nezbytné další hlubší zkoumání tohoto aspektu pomocí zkoušky karcinogenity (metoda B. 32) nebo často v kombinované studii chronické toxicity/karcinogenity (metoda B. 33). posouzení histopatologických změn pozorovaných při zkouškách toxicity při opakované B. IV Toxicita pro reprodukci Toxicitu pro reprodukci lze zjišťovat různými způsoby, např. poškozením reprodukčních funkcí nebo schopnosti samců a samic, tj. ‚vlivy na plodnost‘, nebo vyvoláním nedědičných škodlivých účinků na potomstvo, tj. ‚vývojovou toxicitou‘, které zahrnují také teratogenitu a účinky v průběhu laktace. Pro studie teratogenity jako součásti zkoušení vývojové toxicity je zkušební metoda (metoda B. 31) primárně zaměřena na orální podávání. V závislosti na fyzikálních vlastnostech zkoušené látky nebo na pravděpodobném způsobu expozice člověka mohou být použity také jiné způsoby podávání. V takových případech by měla být zkušební metoda vhodně upravena s ohledem na příslušné části 28denních zkušebních metod. Je-li nezbytná třígenerační zkouška reprodukce (plodnosti), může být popsaná metoda dvougenerační zkoušky repro- dukce (metoda B. 35) rozšířena tak, aby pokrývala třetí generaci. B. V Neurotoxicita Neurotoxicitu lze zjišťovat různými způsoby, např. funkčními změnami a/nebo strukturními a biochemickými změnami centrálního a periferního nervového systému. Předběžné příznaky neurotoxicity lze zjistit zkouškami akutní toxicity. Zkouška toxicity při opakované dávce, metoda B. 7, zahrnuje posouzení neurotoxických účinků a důraz se klade na potřebu pečlivého klinického pozorování zvířat s cílem získat co nejvíce informací. Metoda by měla pomoci zjistit chemické látky s neurotoxickým potenciálem, u nichž může být nezbytné další hlubší vyšetřování tohoto aspektu. Kromě toho je důležité zvážit schopnost látek vyvolat specifické neurotoxické účinky, které nemusí být odhaleny jinými studiemi toxicity. Například u určitých organických sloučenin fosforu bylo pozorováno, že vyvolávají pozdní neu- rotoxicitu, a posuzují se metodami B. 37 a B. 38 po jednorázovém nebo opakovaném podání. 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 365 B. VI Imunotoxicita Imunotoxicitu lze zjistit různými způsoby, například imunosupresí a/nebo zvýšením odpovědi imunitního systému vedoucím k hypersenzitivitě nebo navozené autoimunitě. Zkouška toxicity při opakované dávce, metoda B. 7, zahrnuje imunotoxických účinků. Metoda by měla pomoci odhalit chemické látky s imunotoxickým potenciálem, posouzení u nichž může být nezbytné další hlubší zkoumání tohoto aspektu. B. VII Toxikokinetika interpretaci a vyhodnocení údajů o toxicitě. Tyto studie jsou určeny k objasnění Toxikokinetické studie pomáhají při určitých aspektů toxicity zkoušené chemické látky a výsledky mohou pomoci při plánování dalších studií toxicity. Nepředpokládá se, že by bylo ve všech případech nezbytné stanovit všechny parametry. Pouze ve vzácných případech bude nezbytné provést úplnou řadu toxikokinetických studií (studií absorpce, vylučování, distribuce a metabolismu). Pro určité sloučeniny mohou být vhodné změny této řady nebo může stačit studie s jedinou dávkou (metoda B. 36). Údaje o chemické struktuře (SAR) a fyzikálněchemických vlastnostech mohou též poskytnout informaci o absorpčních charakteristikách u plánovaného způsobu podání a o možnostech metabolického zpracování a distribuce látky též v toxicity a z toxikokinetických studií. tkáních. Mohou toxikokinetických předešlých parametrech existovat studií údaje o z C. CHARAKTERIZACE ZKOUŠENÉ LÁTKY Složení zkoušené látky, včetně hlavních nečistot, a její relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti, včetně stálosti, by měly být známy před zahájením jakékoli studie toxicity. Fyzikálně-chemické vlastnosti zkoušené látky poskytují důležité informace pro výběr způsobu podávání, pro návrh každé jednotlivé studie a pro manipulaci se zkoušenou látkou a její uchovávání. Zahájení studie by měl předcházet vývoj analytické metody pro kvalitativní a kvantitativní stanovení zkoušené látky (pokud možno včetně hlavních nečistot) v dávkovacím médiu a v biologickém materiálu. Veškeré informace týkající se identifikace, fyzikálně-chemických vlastností, čistoty a chování zkoušené látky by měly být obsaženy v protokolu o zkoušce. D. PÉČE O ZVÍŘATA Při zkoušení toxicity jsou důležité přísná kontrola podmínek prostředí a správná péče o zvířata. i) Podmínky chovu Podmínky chovu v prostorech nebo klecích pro pokusná zvířata by měly vyhovovat testovacím druhům. Pro potkany, myši a morčata jsou vhodnými podmínkami teplota místnosti 22 ±3 °C a relativní vlhkost 30 až 70 %; pro králíky se doporučuje teplota 20 ±3 °C a relativní vlhkost 30 až 70 %. Některé experimentální techniky jsou zvláště citlivé na vliv teploty a v takových případech jsou v popisu zkušební metody uvedeny podrobnosti o vhodných podmínkách. Při všech sledováních toxických účinků by měly být za- znamenávány údaje o teplotě a vlhkosti a měly by být zahrnuty do závěrečné zprávy o studii. Osvětlení by mělo být umělé a mělo by se střídat 12 h světla a 12 h tmy. Podrobnosti o světelném režimu by měly zaznamenány a uvedeny v konečné zprávě studie. Není-li v metodě uvedeno jinak, měla by být zvířata chována jednotlivě nebo umístěna v klecích po malých skupinách stejného pohlaví; jsou-li zvířata v klecích po skupinách, nemělo by být chováno v jedné kleci více než pět zvířat. Ve zprávách o experimentech na zvířatech je důležité uvést typ použité klece a počet zvířat chovaných v každé kleci jak během expozice chemické látce, tak během kterékoli další doby pozorování. ii) Podmínky krmení Strava by měla splňovat veškeré požadavky výživy pro příslušný testovací druh. Pokud jsou zkoušené látky podávány v potravě, může být nutriční hodnota snížena interakcí látky s některou složkou potravy. Možnost takové reakce by měla být zohledněna při interpretaci výsledků zkoušky. Může být použita konvenční laboratorní strava s neomezeným přístupem k pitné vodě. Výběr potravy se může řídit potřebou zajistit vhodné přimíchání zkoušené látky, pokud je podávána touto metodou. Příměsi v potravě, jejichž vliv na toxicitu je znám, nesmí být přítomny v koncentracích, ve kterých by se vliv projevil. 366 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 E. OCHRANA ZVÍŘAT Při vypracovávání zkušebních metod byla náležitá pozornost věnována ochraně zvířat. Některé příklady jsou ve stručnosti uvedeny níže, tento seznam však není vyčerpávající. Přesné znění a/nebo podmínky je třeba vyhledat v textu metod: — Pro stanovení akutní orální toxicity by měly být uváženy dvě metody, ‚metoda fixní dávky‘ a ‚metoda stanovení tříd akutní toxicity‘. V ‚metodě fixní dávky‘ se nepoužívá uhynutí jako specifický ukazatel a používá se v ní méně zvířat. V ‚metodě stanovení tříd akutní toxicity‘ se používá v průměru o 70 % zvířat méně než v metodě B. 1 stanovení akutní orální toxicity. Obě tyto alternativní metody mají za následek menší utrpení a bolest než klasická metoda. — Počet použitých zvířat je omezen na vědecky přijatelné minimum: v metodách B. 1 a B. 3 se ke zkoušení použije pouze 5 zvířat stejného pohlaví pro jednu úroveň dávky; pro stanovení senzibilizace kůže maximalizační zkouškou na morčatech (metoda B. 6) se použije pouze 10 zvířat (a pouze 5 pro negativní kontrolní skupinu); počet zvířat potřebných pro pozitivní kontrolu při zkoušení mutagenity in vivo se rovněž snižuje (metody B. 11 a B. 12). — Bolest a utrpení zvířat během zkoušek jsou minimalizovány. Je třeba humánně utratit zvířata vykazující závážné a přetrvávající známky utrpení; nesmějí se podávat zkoušené látky, o nichž je známo, že způsobují zřetelnou bolest a utrpení v důsledku žíravých a dráždivých vlastností látky (metody B. 1, B. 2 a B. 3). — Zkoušení s nepřiměřeně vysokými dávkami se omezuje zaváděním limitních zkoušek, a to nikoli pouze při zkouškách akutní toxicity (metody B. 1, B. 2 a B. 3), ale rovněž při zkouškách mutagenity in vivo (metody B. 11 a B. 12). — Strategie zkoušení dráždivosti nyní umožňuje neprovádět zkoušku, nebo ji omezit na studii s jedním zvířetem, lzeli to dostatečné vědecky zdůvodnit. Toto vědecké zdůvodnění může být založeno na fyzikálněchemických vlastnostech látky, na výsledcích založených na jiných již provedených zkouškách nebo na výsledcích spolehlivě validovaných zkoušek in vitro. Bylali například studie akutní toxicity nanesením na kůži provedena s dávkou látky odpovídající v limitní zkoušce (metoda B. 3) a nebyla pozorována žádná kožní dráždivost, může být další zkoušení kožní dráždivosti (metoda B. 4) zbytečné; materiály, které ve studii kožní dráždivosti (metoda B. 4) vykazují nepochybné žíravé účinky nebo silné podráždění kůže, nesmějí být dále zkoušeny na oční dráždivost (metoda B. 5). F. ALTERNATIVNÍ ZKOUŠKY Vědeckým cílem Evropské unie je vývoj a validace alternativních metod, které mohou poskytnout stejnou úroveň informací jako současné zkoušky na zvířatech, při nichž se však použije méně zvířat, způsobí méně utrpení nebo se v nich použití zvířat zcela vypouští. Hned po svém uvedení do praxe musí být tyto metody použity, kdykoli je to možné, pro charakterizaci nebezpečnosti a následnou klasifikaci a označování látek z hlediska jejich nebezpečnosti. G. HODNOCENÍ A INTERPRETACE Při hodnocení a interpretaci zkoušek musí být vzaty v úvahu určité meze, nakolik lze výsledky studií na zvířatech a in vitro extrapolovat na člověka, a proto lze pro potvrzení výsledků zkoušení použít poznatky o nepříznivých účincích na člověka, pokud jsou k dispozici. Tyto výsledky lze použít pro klasifikaci a označování nových a existujících chemických látek z hlediska účinků na lidské zdraví, na základě jejich skutečných vlastností zjištěných a kvantifikovaných těmito metodami. Odpovídající kritéria pro klasifikaci a označování uvedená v příloze VI se vztahují také na ukazatele zahrnuté v těchto zkušebních metodách, které jsou uvedené v protokolech o zkoušce. Tyto výsledky lze také použít pro studie hodnocení rizika nových a existujících chemických látek; vhodné zkušební strategie pro tyto účely jsou uvedeny v příslušných pokynech. H. ODKAZY NA LITERATURU Tyto metody jsou většinou vyvinuty v rámci programu OECD pro zkušební pokyny a měly by být prováděny v souladu s principy správné laboratorní praxe, aby bylo zajištěno co nejširší ‚vzájemné uznávání údajů‘. Další podobnější informace lze získat v pokynech OECD a v příslušné literatuře publikované jinde. “ 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 367 PŘÍLOHA IV B „B. 1 b) AKUTNÍ TOXICITA (ORÁLNÍ) – METODA STANOVENÍ TŘÍD AKUTNÍ TOXICITY 1. METODA 1. 1 Úvod Metoda stanovení tříd akutní toxicity poskytuje informace jak pro účely hodnocení nebezpečnosti, tak pro účely a klasifikace látek z hlediska nebezpečnosti. V metodě se používají tří fixní dávky podávané v přiměřených odstupech, aby bylo možné látku zatřídit na základě výsledků studie. Kromě toho postup popsaný v této zkušební metodě umožňuje výběr tří doplňkových fixních dávek, které lze použít jako alternativní dávky v určitých bodech rozhodovacího procesu, nebo pro další zkoušení. Použití některé z těchto doplňkových dávek lze uvážit v případě, že by mohlo být žádoucí nebo nezbytné další zpřesnění. Metoda využívá pevně stanovené počáteční dávky a není určena pro výpočet přesné hodnoty LD50, umožňuje však stanovení rozsahu expozice, v němž se předpokládá letalita, protože uhynutí části zvířat zůstává hlavním ukazatelem zkoušky. Výsledky zkoušky by měly umožnit klasifikaci podle kritérií v příloze VI. Vzhledem k sekvenční postupu by mohlo být trvání zkoušky delší než u postupu popsaného v metodě B. 1. Hlavní výhodou této metody je, že vyžaduje menší počet zvířat než metody akutní toxicity (orální) (B. 1. ) a alternativní metody fixní dávky (B. 1 a)). Viz také obecný úvod, část B. 1. 2 Definice Viz obecný úvod, část B. 1. 3 Podstata zkušební metody Látka se podává orálně skupině pokusných zvířat v jedné ze stanovených dávek. Látka se zkouší postupně, tři zvířata stejného pohlaví. Není nezbytné provádět předběžnou přičemž při každém kroku se použijí orientační studii. Absence nebo výskyt úhynu zvířat, jimž byla látka podána v prvním kroku, určuje další krok, tj. — další zkoušení není zapotřebí, — další krok se provede se stejnou dávkou, ale se zvířaty druhého pohlaví, — další krok se provede s nejbližší vyšší nebo nižší úrovní dávky. 1. 4 Popis zkušební metody 1. 4. 1 Příprava Náhodně se vyberou zdravá mladá dospělá zvířata, označí se tak, aby bylo možné jednotlivá zvířata identifikovat, a chovají se v klecích alespoň 5 dnů před zahájením zkoušky, aby si mohla zvyknout na laboratorní podmínky. Zvířata mohou být v klecích ve skupinách podle pohlaví a dávky, ale počet zvířat v kleci musí umožňovat zřetelné pozorování každého zvířete. Zkoušená látka se podává zvířatům v jedné dávce žaludeční sondou nebo vhodnou intubační kanylou. Zkoušená látka se podle potřeby rozpustí nebo suspenduje ve vhodném vehikulu. Je-li to možné, doporučuje se zvážit použití vodného roztoku/suspense, potom použití roztoku/emulze v oleji (např. v kukuřičném oleji) a nakonec roztoku v jiných vehikulech. Pro nevodná vehikula musí být známa jejich toxická charakteristika a pokud není známa, musí být stanovena před zkouškou. Zvířata by měla být před podáním dávky hladovět (např. přes noc u potkana a 3 – 4 h u myši), voda se však ponechává. 368 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 1. 4. 2 Zkušební podmínky 1. 4. 2. 1 Po ku sná z vířa t a Nejsou-li důvody proti tomu, upřednostňuje se z hlodavců potkan. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Na začátku studie by měly být odchylky hmotnosti zvířat minimální a neměly by překročit ±20 % střední hmotnosti pro každé pohlaví. 1. 4. 2. 2 Po če t a p o h l aví Pro každý krok se používají tři zvířata jednoho pohlaví. V úvodním kroku může být použito kterékoli pohlaví. 1. 4. 2. 3 Úrovn ě d áv e k Úroveň dávky, která se použije jako výchozí, se zvolí z jedné ze tří fixních úrovní dávek, tj. 25, 200 a 2 000 mg na kg tělesné hmotnosti. Výchozí úroveň dávky by měla být taková, aby s co největší pravděpo- dobností vyvolala uhynutí alespoň u některých zvířat, jimž byla dávka podána. V závislosti na výchozí dávce lze použít některý z diagramů postupu popsaných v příloze I. Pro výběr pohlaví a výchozí dávky by měly být využity veškeré dostupné informace, včetně informací získaných ze vztahu struktury a účinku. Pokud informace naznačují, že je mortalita při nejvyšší úrovni dávky (2 000 mg na kg tělesné hmotnosti) nepravděpodobná, měla by být provedena limitní zkouška. Nejsou-li o látce, která má být zkoumána, žádné informace, doporučuje se z důvodů ochrany zvířat použít výchozí dávku 200 mg na kg tělesné hmotnosti. V některých případech může být žádoucí získat přesnější informace, než by bylo možné po provedení zkoušky se třemi fixními úrovněmi dávek ve výši 25, 200 a 2 000 mg na kg tělesné hmotnosti. V těchto případech lze zvážit další zkoušení při doplňkových fixních dávek ve výši 5, 50 nebo 500 mg na kg tělesné hmotnosti. Nemají se podávat dávky, o kterých je známo, že vzhledem ke svým leptavým nebo velmi dráždivým účinkům způsobují značnou bolest a utrpení. Časový interval mezi fázemi zkoušení závisí na rychlosti nástupu, trvání a závažnosti toxických příznaků. Zkoušení na zvířatech druhého pohlaví nebo aplikace další dávky by měla být odložena, dokud nebude jisté, že zvířata, jimž byla podána předchozí dávka, přežila. 1. 4. 2. 4 L imit ní z kou ška Limitní zkoušku je možné provést při jediné úrovni dávky ve výši 2 000 mg na kg tělesné hmotnosti na třech zvířatech každého pohlaví. Pokud látka vyvolá mortalitu, je nutné provést další zkoušku při dávkách 200 mg na kg (nebo 500 mg na kg) tělesné hmotnosti. 1. 4. 2. 5 D o ba p oz o rov á ní Zvířata by měla být obvykle pozorována 14 dnů, kromě případů, kdy musí být vyloučena ze studie a humánně utracena z důvodů ochrany zvířat nebo jsou nalezena uhynulá. Doba pozorování by však neměla být pevně stanovena. Měla by být stanovena podle toxických reakcí, doby jejich nástupu a délky zotavovacího období, a může být tedy podle potřeby prodloužena. Doba, kdy se příznaky toxicity objeví a zmizí, je důležitá, zejména jdeli o opožďování toxických příznaků. Veškerá pozorování jsou systematicky zaznamenávána, přičemž zá- znamy se vedou pro každé zvíře. 1. 4. 3 Postup Po období hladovění by měla být zvířata před podáním zkoušené látky zvážena. Po podání látky mohou být zvířata ponechána bez potravy po dobu dalších 3 – 4 h. Pokud se dávka podává po částech v průběhu určité doby, může být v závislosti na délce této doby nezbytné poskytnout zvířatům potravu a vodu. Maximální objem tekutiny, která může být podána najednou, závisí na velikosti pokusného zvířete. U hlodavců by objem obvykle neměl přesáhnout 1 ml na 100 g tělesné hmotnosti, v případě vodných roztoků však lze uvážit i 2 ml na 100 g tělesné hmotnosti. Rozdíly v podávaném objemu by měly být minimalizovány úpravou koncentrace tak, aby byl podáván stálý objem na všech úrovních dávek. Jestliže není možné podání v jediné dávce, může být dávka podávána v menších částech po dobu nepřekračující 24 h. Podrobnosti zkušebního postupu jsou popsány v příloze I. 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 369 1. 4. 3. 1 Obe cná p o zo rová ní Pečlivé klinické pozorování se provádí nejméně dvakrát v den podání látky nebo častěji, pokud to vyžaduje reakce zvířat, a poté nejméně jednou denně. Zvířata, která jsou nalezena v agónii, nebo zvířata, která se trápí nebo trpí bolestí, by měla být humánně utracena. Zvířata utracená z humánních důvodů jsou hodnocena stejně jako zvířata uhynulá při zkoušce. Pokud jsou zvířata z humánních důvodů utracena nebo nalezena mrtvá, měla by být doba uhynutí co nejpřesněji zaznamenána. Další pozorování je nezbytné, pokud zvířata vykazují příznaky toxicity. Pozorování zahrnují změny kůže, srsti, očí, sliznic, a rovněž změny dýchání, krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Zvláštní pozornost je třeba věnovat tremoru, křečovým jevům, slinění, průjmu, letargii, spánku a kómatu. Veškerá pozorování se systematicky zaznamenávají, přičemž záznamy se vedou pro každé zvíře zvlášť. 1. 4. 3. 2 T ěl e s n á h m o tn o s t Všechna zvířata by měla být zvážena krátce před podáním zkoušené látky a poté nejméně jednou týdně. Změny hmotnosti by měly být vypočteny a zaznamenávány. Na konci zkoušky se přežívající zvířata před usmrcením zváží. 1. 4. 3. 3 P it va U všech pokusných zvířat, včetně uhynulých a vyřazených ze zkoušky, by měla být provedena pitva. U každého zvířete se zaznamenají všechny makroskopické patologické změny. Je možno uvážit mikroskopické vyšetření orgánů vykazujících známky makroskopické patologie u zvířat, která přežila 24 nebo více hodin, aby se získaly užitečné informace. 2. ÚDAJE Měly by být uvedeny údaje pro každé jednotlivé zvíře. Navíc by měly být všechny údaje shrnuty do tabulky, přičemž se u každé experimentální skupiny uvede počet použitých zvířat, počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, počet zvířat uhynulých v průběhu zkoušky nebo počet zvířat utracených z humánních důvodů, doba uhynutí jednotlivých zvířat, popis, nástup, časový průběh a vratnost toxických účinků a pitevní nálezy. Obecné pokyny pro interpretaci výsledků pro klasifikaci jsou uvedeny v příloze 2. 3. ZPRÁVY Protokol o zkoušce Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto informace: Pokusná zvířata: — druh/kmen; — mikrobiologický stav zvířat, je-li znám; — počet, stáří a pohlaví zvířat; — původ, podmínky chovu, strava atd. ; — hmotnost jednotlivých zvířat na začátku zkoušky, dále v týdenních intervalech a na konci zkoušky. Zkušební podmínky: — zdůvodnění volby vehikula, není-li použita voda; — podrobné údaje o způsobu podání zkoušené látky, včetně podávaných objemů a době podání; — podrobné údaje o stravě a o kvalitě vody (včetně druhu/zdroje, zdroje vody); — zdůvodnění výběru výchozí dávky. 370 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 Výsledky: — tabulky údajů o reakcích každého zvířete podle pohlaví a úrovně dávky (tj. počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, včetně uhynutí, povahy, závažnosti a trvání účinků); — nástup a časový průběh příznaků toxicity a jejich vratnost pro každé zvíře; — popřípadě pitevní a histopatologické nálezy pro každé zvíře. Rozbor výsledků. Závěry. 4. LITERATURA Metoda je analogická metodě OECD TG 423. 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 371 PŘÍLOHA 1 ZKUŠEBNÍ POSTUP 1. Jak je uvedeno v bodu 1. 4. 2. 3, měla by být výchozí dávka taková, aby pravděpodobně vyvolala uhynutí alespoň některých zvířat, jimž byla látka podána. Pro výběr výchozí dávky lze použít tyto informace: — údaje o fyzikálně-chemických vlastnostech; — vztah struktury a účinku; — všechny údaje z jiných zkoušek toxicity; a — předpokládané použití zkoušené látky. 2. Příslušné schéma postupu zkoušky je pro každou výchozí dávku uvedeno v příloze. V závislosti na počtu humánně utracených nebo uhynulých zvířat se ve zkušebním postupu pokračuje podle šipek. 3. Jestliže podání výchozí dávky 25 nebo 200 mg na kg tělesné hmotnosti povede k uhynutí pouze jednoho zvířete druhého pohlaví, ve zkoušce se obvykle nepokračuje. Pokud však přitom nejsou u ostatních pěti zvířat pozorovány žádné toxické příznaky, měla by být při pitvě uvážena možnost, že uhynutí nesouviselo s podáním látky. V takovém případě by měla zkouška pokračovat podáním nejbližší vyšší dávky. 4. Jestliže podání dávky 2 000 mg na kg tělesné hmotnosti povede k uhynutí u jednoho zvířete každého pohlaví, předpokládá se, že hodnota LD50 je vyšší než 2 000 mg na kg tělesné hmotnosti. Protože však jde o hraniční výsledek, měly by být pečlivě zváženy reakce zbývajících dvou zvířat každého pohlaví a výskyt zřetelných, výrazných toxických příznaků u těchto zvířat může mít za důsledek klasifikaci odpovídající hodnotě LD50 ve výši 2 000 mg na kg tělesné hmotnosti nebo méně, nebo může být důvodem pro další zkoušení na stejné úrovni dávky. 5. Postup umožňuje zkoušení za použití tří doplňkových fixních dávek (varianta 2). Této varianty je možno použít k výběru alternativní dávky v daném bodu rozhodovacím procesu nebo k dalšímu zkoušení po dokončení vlastní zkoušky (varianta 1). Zkušební postup podle varianty 1 je vyznačen tučnými šipkami, zatímco pro postup podle varianty 2 jsou použity tenké šipky. 372 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 a) Zkušební postup s výchozí dávkou 25 mg na kg tělesné hmotnosti 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 373 b) Zkušební postup s výchozí dávkou 200 mg na kg tělesné hmotnosti 374 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 c) Zkušební postup s výchozí dávkou 2 000 mg na kg tělesné hmotnosti 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 375 PŘÍLOHA 2 INTERPRETACE VÝSLEDKŮ NA ZÁKLADĚ ZKOUŠKY PODLE VARIANTY 1 Šedé rámečky pod rámečkem ‚ukončení zkoušení‘ v diagramech v této příloze představují mezní hodnoty pro klasifikaci. Při zkušebním postupu podle varianty 1 se pokračuje v postupu označeném příslušnou šipkou až k šedému rámečku. a) Interpretace výsledků na základě zkoušky podle varianty 1 Výchozí dávka: 25 mg na kg tělesné hmotnosti 376 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 b) Interpretace výsledků na základě zkoušky podle varianty 1 Výchozí dávka: 200 mg na kg tělesné hmotnosti 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 377 c) Interpretace výsledků na základě zkoušky podle varianty 1 Výchozí dávka: 2 000 mg na kg tělesné hmotnosti 378 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 “PŘÍLOHA IV C „B. 6 SENZIBILIZACE KŮŽE 1. METODA 1. 1 Úvod Poznámky: Citlivost zkoušek a jejich schopnost zjistit látky s možným senzibilizačním účinkem na lidskou kůži mají v systému klasifikace toxicity v oblasti veřejného zdraví velký význam. Neexistuje jediná zkušební metoda, která by vhodným způsobem identifikovala všechny látky s potenciálním senzibilizačním účinkem na lidskou kůži a která by byla relevantní pro všechny látky. Při výběru zkoušky musí být zváženy faktory, jako jsou fyzikální vlastnosti látky, včetně schopnosti pronikat kůží. Byly vyvinuty dva typy zkoušek na morčatech: zkoušky s adjuvanty, ve kterých je alergický stav umocněn rozpuštěním nebo suspendováním zkoušené látky ve Freundově kompletním adjuvantu (FCA), a zkoušky bez adjuvantů. Zkoušky s adjuvantem jsou pravděpodobně přesnější v předpovědi pravděpodobného senzibilizačního účinku na lidskou kůži než metody bez použití Freundova kompletního adjuvantu, a proto se jim dává přednost. Maximalizační zkouška na morčatech (Guinea Pig Maximisation Test – GPMT) s adjuvantem. Ačkoli lze použít několik dalších metod pro zjištění schopnosti reakci kůže, je zkouška GMPT upřednostňovanou technikou s adjuvantem. je velmi rozšířená zkouška látky vyvolat senzibilizační U mnoha skupin chemických látek jsou zkoušky bez adjuvantu (dává se přednost Bühlerově zkoušce) považovány za méně citlivé. V určitých případech lze zdůvodnit Bühlerovu zkoušku s povrchovou aplikací spíše než intradermální injekci používanou v maximalizační zkoušce na morčatech. Pro použití Bühlerovy zkoušky by mělo být uvedeno vědecké zdůvodnění. V této metodě jsou popsány maximalizační zkoušky na morčatech (GPMT) a Bühlerova zkouška. Jiné metody lze použít za předpokladu, že jsou spolehlivě validované a odborně odůvodněné. Pokud je z uznávané screeningové zkoušky získán pozitivní výsledek, může být zkoušená látka označena za potenciální senzibilizátor a nemusí být nezbytné provést další zkoušku na morčatech. Jestliže však má taková zkouška negativní výsledek, musí být zkouška na morčatech provedena za použití postupu popsaného v této zkušební metodě. Viz také obecný úvod, část B. 1. 2 Definice Senzibilizace kůže: (alergická kontaktní dermatitida) je imunologicky zprostředkovaná kožní reakce na látku. U člověka mohou být reakce charakterizovány svěděním, zarudnutím kůže, otoky, pupenci, puchýřky, bulami nebo jejich kombinací. U jiných živočišných druhů se mohou reakce lišit a může být zjištěno pouze zarudnutí kůže nebo otok. Indukční expozice: experimentální expozice subjektu zkoušené látce se záměrem navodit stav přecitlivělosti. Indukční období: období nejméně jednoho týdne po indukční expozici, během něhož se může rozvinout stav přecitlivělosti. Provokační expozice: experimentální expozice subjektu dříve vystaveného zkoušené látce po indukčním období s cílem stanovit, zda je reakce subjektu přecitlivělá. 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 379 1. 3 Referenční látky Citlivost a spolehlivost použité zkušební metody by měla být posouzena každých šest měsíců za použití látek, o kterých je známo, že mají mírné až středně silné senzibilizační účinky na kůži. U správně provedené zkoušky vyvolávají mírné/střední senzibilizátory zpravidla nejméně 30 % reakci při metodě s adjuvanty a nejméně 15 % reakci při metodě bez adjuvantů. Přednostně jsou používány tyto látky: Čísla CAS Čísla EINECS Názvy podle EINECS Obecné názvy 101-86-0 202-983-3 2-hexyl3fenylprop-2enal maldehyd) (hexylcinna- 2-hexyl3fenylprop-2enal cinnamaldehyd) (hexyl- 149-30-4 205-736-8 2sulfanylbenzothiazol kaptax 94-09-7 202-303-5 benzokain nordkain Za určitých okolností mohou být při dostatečném zdůvodnění použity jiné kontrolní uvedená kritéria. látky splňující výše 1. 4 Podstata zkušební metody Pokusným zvířatům je nejdříve aplikována zkoušená látka intradermálními injekcemi a/nebo epidermální aplikací (indukční expozice). Po období klidu 10 až 14 dnů (indukční období), v průběhu kterého se může rozvinout reakce pokusných zvířat na provokační expozici je porovnáván s rozsahem a stupněm reakce u kontrolních zvířat, která podstoupí negativní expozici v průběhu indukce a je jim aplikována provokační dávka. je zvířatům aplikována provokační dávka. Rozsah a stupeň kožní imunitní reakce, 1. 5 Popis zkušebních metod Pokud je považováno za nezbytné odstranit zkoušenou látku, použije se voda nebo vhodné rozpouštědlo, aniž by se změnila stávající reakce nebo integrita pokožky. 1. 5. 1 Maximalizační zkouška na morčatech (GPMT) 1. 5. 1. 1 Př ípr ava Zdravá mladá dospělá albinotická morčata se aklimatizují na laboratorní podmínky nejméně 5 dnů před zahájením zkoušky. Před zkouškou se provede náhodný výběr zvířat a zvířata se přiřadí do experimentálních a kontrolních skupin. Srst se odstraní stříháním, holením nebo chemickou depilací, v závislosti na použité zkušební metodě. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k poškození kůže. Zvířata se zváží před zahájením zkoušky a na konci zkoušky. 1. 5. 1. 2 Zku šebn í podmín ky 1. 5. 1. 2. 1 Pokusná zvířata Použijí se běžně používané laboratorní kmeny albinotických morčat. 1. 5. 1. 2. 2 Počet a pohlaví Použít lze samce i samice. Použité samice musí být nullipary a nesmí být březí. Experimentální skupina se skládá nejméně z 10 zvířat a kontrolní skupina nejméně z 5 zvířat. Použije-li se méně než 20 experimentálních a 10 kontrolních morčat a není možné dojít k závěru, že je zkoušená látka senzibilizující, doporučuje se zkoušení na dalších zvířatech, aby byl celkový počet nejméně 20 experimentál- ních a 10 kontrolních zvířat. 380 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 1. 5. 1. 2. 3 Úrovně dávek Koncentrace zkoušené látky použitá pro každou indukční expozici by měla být taková, aby ji zvířata systémově dobře snášela, a měla by být nejvyšší koncentrací vyvolávající mírné až střední podráždění kůže. Koncentrace použitá při provokační expozici by měla odpovídat nejvyšší dávce, která nevyvolává podráždění. V případě potřeby mohou být vhodné koncentrace stanoveny předběžnou studií na dvou nebo třech zvířatech. Pro tento účel by mělo být zváženo použití zvířat, kterým bylo podáno Freundovo kompletní adjuvans (FCA). 1. 5. 1. 3 Po st u p 1. 5. 1. 3. 1 Indukce Den 0 – experimentální skupina Tři dvojice intradermálních injekcí o objemu 0,1 ml se podají symetricky podle střední oblasti zbavené srsti. linie do lopatkové Injekce 1: Freundovo kompletní adjuvans (FCA) smísené s vodou nebo fyziologickým roztokem v poměru 1: 1 obj. Injekce 2: zkoušená látka ve vhodném vehikulu ve zvolené koncentraci. Injekce 3: zkoušená látka ve zvolené koncentraci připravené ve směsi s FCA a vodou nebo fyziologickým roztokem v poměru 1: 1 obj. Pro injekci 3 se látky rozpustné ve vodě rozpustí před smísením s FCA ve vodné fázi. Látky rozpustné v lipidech nebo nerozpustné látky se před smísením s vodnou fází suspendují v FCA. Konečná koncentrace zkoušené látky musí být stejná jako koncentrace použitá v injekci 2. Injekce 1 a 2 se aplikují blízko sebe a co nejblíže hlavě, zatímco injekce 3 se podává směrem ke kaudální části zkušební plochy. Den 0 – kontrolní skupina Tři dvojice subkutánních injekcí o objemu 0,1 ml se podají na stejná místa jako u experimentálních zvířat. Injekce 1: Freundovo kompletní adjuvans (FCA) smísené s vodou nebo fyziologickým roztokem v poměru 1: 1 obj. Injekce 2: neředěné vehikulum. Injekce 3: 50 % (m/V) směs vehikula se směsí FCA a vody nebo fyziologickém roztoku v poměru 1: 1 obj. 5. – 7. den – experimentální a kontrolní skupiny Přibližně dvacet čtyři hodin před povrchovou indukční aplikací, jestliže látka není dráždivá pro kůži, se po důkladném ostříhání a/nebo oholení nanese na zkušební plochu 0,5 ml 10 % natriumdodecylsulfátu ve vazelíně za účelem vyvolání místního podráždění. 6. – 8. den – experimentální skupina Zkušební plocha se opět zbaví srsti. Filtrační papír (2 × 4 cm) se plně napustí zkoušenou látkou ve vhodném vehikulu, přiloží se na zkušební plochu a udržuje se ve styku s kůží pomocí okluzivního obvazu po dobu 48 h. Výběr vehikula by měl být zdůvodněn. Pevné látky se jemně rozetřou a vpraví do vhodného vehikula. Kapaliny lze aplikovat přímo, je-li to vhodné. 6. – 8. den – kontrolní skupina Zkušební plocha se opět zbaví srsti. Na zkušební plochu se podobným způsobem nanese samotné vehikulum a udržuje se ve styku s kůží pomocí okluzivního plátku po dobu 48 h. 1. 5. 1. 3. 2 Provokace 20. – 22. den – experimentální a kontrolní skupiny Boky pokusných i kontrolních zvířat se zbaví srsti. Na jeden bok zvířete se aplikuje zkoušená látka v plátku nebo v komůrce a na druhý bok se může popřípadě umístit plátek nebo komůrka obsahující pouze vehikulum. Plátky se fixují ve styku s kůží pomocí okluzivního obvazu po dobu 24 h. 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 381 1. 5. 1. 3. 3 Pozorování a hodnocení: experimentální a kontrolní skupiny — přibližně 21 h po odstranění plátku se provokační plocha očistí, důkladně ostříhá a/nebo oholí a v případě potřeby depiluje; — přibližně po 3 h (přibližně 48 h od začátku aplikace provokační dávky) se pozoruje kožní reakce a zaznamená se podle stupnice uvedené v doplňku; — přibližně 24 h po tomto pozorování se provede druhé pozorování (72 h) a opět se zaznamená reakce kůže. Doporučuje se provádět pozorování ‚naslepo‘ u pokusných i kontrolních zvířat. Pokud je to nezbytné pro objasnění výsledků získaných při první provokaci, měla by být přibližně jeden týden po první provokaci zvážena druhá provokace (tj. opakovaná provokace), v případě potřeby s novou kontrolní skupinou. Opakovaná provokace může být provedena také na původní kontrolní skupině. Pozorování a zaznamenávání všech kožních reakcí a neobvyklých nálezů, včetně systémových reakcí, které jsou důsledkem indukčních a provokačních postupů, by měla být prováděna podle stupnice Magnussona/- Kligmana (viz doplněk). Pro objasnění nejasných reakcí mohou být provedeny jiné postupy, např. histopato- logické vyšetření nebo měření tloušťky kožní řasy. 1. 5. 2 Bühlerova zkouška 1. 5. 2. 1 Př ípr ava Zdravá mladá dospělá albinotická morčata se aklimatizují na laboratorní podmínky nejméně 5 dnů před zahájením zkoušky. Před zkouškou se provede náhodný výběr zvířat a zvířata se přiřadí do experimentálních a kontrolních skupin. Srst se odstraní stříháním, holením nebo chemickou depilací, v závislosti na použité Je třeba dbát na to, aby nedošlo k poškození kůže. Zvířata se zváží před zahájením zkušební metodě. zkoušky a na konci zkoušky. 1. 5. 2. 2 Zku šebn í podmín ky 1. 5. 2. 2. 1 Pokusná zvířata Používají se běžně používané laboratorní kmeny albinotických morčat. 1. 5. 2. 2. 2 Počet a pohlaví Použít lze samce i samice. Použité samice musí být nullipary a nesmí být březí. Experimentální skupina se skládá nejméně z 20 zvířat a kontrolní skupina nejméně z 10 zvířat. 1. 5. 2. 2. 3 Úrovně dávek Koncentrace zkoušené látky použitá pro každou indukční expozici by měla být tou nejvyšší koncentrací, která vyvolá mírné, ne však silné podráždění kůže. Koncentrace použitá při provokační expozici by měla odpovídat nejvyšší koncentraci, která nevyvolává podráždění. V případě potřeby mohou být vhodné koncentrace stanoveny předběžným pokusem na dvou nebo třech zvířatech. Pro zkoušené látky rozpustné ve vodě je vhodné používat jako vehikulum vodu nebo nedráždivé zředěné roztoky povrchově aktivní látky. Pro ostatní zkoušené látky se upřednostňuje roztok 80 % alkoholu ve vodě pro indukci a aceton pro provokaci. 1. 5. 2. 3 Po st u p 1. 5. 2. 3. 1 Indukce Den 0 – experimentální skupina Jeden bok se zbaví srsti (důkladně se ostříhá). Zkušební plátek by měl být důkladně napuštěn zkoušenou látkou ve vhodném vehikulu (výběr vehikula musí být zdůvodněn; tekuté zkoušené látky mohou být podle potřeby aplikovány neředěné). Zkušební plátek se přiloží na zkušební plochu a po dobu 6 h se udržuje ve styku s kůží okluzivním plátkem nebo komůrkou a vhodným obvazem. 382 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 Systém s plátkem musí být okluzivní. Vhodný je bavlněný polštářek, může být kruhový nebo čtvercový, ale měl by mít velikost přibližně 4 – 6 cm2. Pro zajištění okluze je vhodné použít vhodnou fixaci. Jsou-li použity obvazy, mohou být nezbytné dodatečné expozice. Den 0 – kontrolní skupina Jeden bok se zbaví srsti (důkladně se ostříhá). Na zkušební plochu se nanese vehikulum podobným způsobem jako u experimentální skupiny. Zkušební plátek se po dobu 6 h udržuje ve styku s kůží pomocí okluzivního plátku nebo komůrky a vhodného obvazu. Pokud je možné prokázat, že kontrolní skupina podrobená negativní expozici není nezbytná, lze použít neexponovanou kontrolní skupinu. 6. – 8. a 13. – 15. den – experimentální a kontrolní skupina Provede se stejná aplikace jako v den 0 na stejnou zkušební plochu (v případě potřeby zbavenou srsti) na tentýž bok, a to 6. – 8. den a opět 13. – 15. den. 1. 5. 2. 3. 2 Provokace 27. – 29. den – experimentální a kontrolní skupina Neošetřený bok pokusných a kontrolních zvířat se zbaví srsti (důkladně se ostříhá). Okluzivní plátek nebo komůrka obsahující příslušné množství zkoušené látky v nejvyšší nedráždivé koncentraci se aplikuje na zadní část neošetřeného boku pokusných a kontrolních zvířat. Na přední část neošetřeného boku pokusných a kontrolních zvířat se popřípadě aplikuje okluzivní plátek nebo komůrka jen s vehikulem. Plátky nebo komůrky se po dobu 6 h fixují ve styku s kůží pomocí vhodného obvazu. 1. 5. 2. 3. 3 Pozorování a hodnocení — Přibližně 21 h po odstranění plátku se provokační plocha zbaví srsti; — přibližně po třech hodinách (přibližně 30 h po aplikaci provokačního plátku) se pozorují kožní reakce a zaznamenají se podle stupnice uvedené v doplňku; — přibližně 24 h po 30hodinovém pozorování (přibližně 54 h po aplikaci provokačního plátku) se opět pozorují kožní reakce a zaznamenají se. Doporučuje se provádět pozorování ‚naslepo‘ u pokusných i kontrolních zvířat. Pokud je to nezbytné pro objasnění výsledků získaných při první provokaci, měla by být přibližně jeden týden po první provokaci zvážena druhá provokace (tj. opakovaná provokace), v případě potřeby s novou kontrolní skupinou. Opakovaná provokace může být provedena také na původní kontrolní skupině. Pozorování a zaznamenávání všech kožních reakcí a neobvyklých nálezů, včetně systémových reakcí, které jsou důsledkem indukčních a provokačních postupů, by měla být prováděna podle stupnice Magnussona/- Kligmana (viz doplněk). Pro objasnění sporných reakcí mohou být provedeny jiné postupy, např. histopato- logické vyšetření nebo měření tloušťky kožní řasy. 2. ÚDAJE (GMPT A BÜHLEROVA ZKOUŠKA) Údaje se shrnou do tabulky, přičemž se pro každé zvíře uvedou kožní reakce při každém pozorování. 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 383 3. ZPRÁVY (GMPT A BÜHLEROVA ZKOUŠKA) Pokud byla před zkouškou na morčatech provedena screeningová zkouška (např. zkouška regionálních lymfatických uzlin (LLNA), zkouška ztluštění ucha u myší (MEST)), musí být s výsledky získanými se zkoušenými a referenčními látkami uveden popis této zkoušky nebo odkaz na tuto zkoušku, včetně podrobných informací o postupu. Protokol o zkoušce (GMPT a Bühlerova zkouška) Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto informace: Pokusná zvířata — použitý kmen morčat; — počet, stáří a pohlaví zvířat; — původ, podmínky chovu, strava atd. ; — hmotnost jednotlivých zvířat na začátku zkoušky. Zkušební podmínky: — technika přípravy místa aplikace; — podrobné informace o materiálech použitých při aplikaci a technice aplikace; — výsledek předběžné studie a závěr týkající se indukčních a provokačních koncentrací, které byly při zkoušce použity; — podrobné údaje o přípravě, aplikaci a odstranění zkoušené látky; — zdůvodnění volby vehikula, — koncentrace vehikula a zkoušené látky použité pro indukční a provokační expozice a celkové množství látky použité pro indukci a provokaci. Výsledky: — souhrn výsledků poslední kontroly citlivosti a spolehlivosti (viz 1. 3), včetně informací o použité látce, koncentraci a vehikulu; — posuzování jednotlivých zvířat, včetně systému klasifikace; — podrobný popis charakteru a stupně pozorovaných účinků; — všechny histopatologické nálezy. Rozbor výsledků. Závěry. 4. LITERATURA Metoda je analogická metodě OECD TG 406. 384 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 Doplněk TABULKA: Stupnice Magnussona/Kligmana pro hodnocení kožních reakcí na provokační expozici 0 = žádná viditelná změna 1 = slabé nebo skvrnité zarudnutí kůže 2 = mírné a splývající zarudnutí kůže 3 = intenzivní zarudnutí a zduření kůže“ 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 385 PŘÍLOHA IV D „B. 7 ORÁLNÍ TOXICITA (28DENNÍ OPAKOVANÁ APLIKACE) 1. METODA 1. 1 Úvod Viz obecný úvod, část B. 1. 2 Definice Viz obecný úvod, část B. 1. 3 Podstata zkušební metody Zkoušená látka se denně orálně podává v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat; každé skupině se podává jedna úroveň dávky 28 dnů. V průběhu období podávání se zvířata každý den pečlivě pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která v průběhu zkoušky uhynula nebo byla utracena, i zvířata, která do konce zkoušky přežila, se pitvají. Tato metoda klade větší důraz na neurologické účinky jako na specifické výsledné účinky; důraz je kladen na potřebu pečlivého klinického pozorování zvířat, aby bylo získáno co nejvíce informací. Metoda by měla odhalit chemické látky s neurotoxickým potenciálem, u nichž může být nezbytné další hlubší zkoumání tohoto aspektu. Metoda může upozornit na imunologické účinky a toxicitu pro reprodukční orgány. 1. 4 Popis zkušební metody 1. 4. 1 Příprava Zdravá mladá dospělá zvířata se náhodně přiřadí do kontrolních a experimentálních skupin. Klece by měly být uspořádány tak, aby byl vliv umístění klecí minimalizován. Jednotlivá zvířata se jednoznačně identifikují a umístí se do klecí nejméně pět dnů před začátkem studie, aby si mohla zvyknout na laboratorní podmínky. Zkoušená látka se podává sondou nebo v potravě či v pitné vodě. Metoda orálního podání závisí na účelu studie a na fyzikálně-chemických vlastnostech látky. Zkoušená látka se podle potřeby rozpustí nebo suspenduje ve vhodném vehikulu. Je-li to možné, doporučuje se zvážit použití vodného roztoku/suspense, potom použití roztoku/emulze v oleji (např. kukuřičný olej) a nakonec roztoku v jiných vehikulech. Pro nevodná vehikula by měla být známa jejich toxická charakteristika. Měla by být určena stálost zkoušené látky ve vehikulu. 1. 4. 2 Zkušební podmínky 1. 4. 2. 1 Po ku sná z vířa t a Dává se přednost potkanům, ale lze použít i kmeny mladých zdravých dospělých zvířat. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Podávání mělo začít co nejdříve po odstavení a v každém případě dříve, než zvířata dosáhnou stáří devíti týdnů. jiného druhu hlodavců. Použity by měly být běžně používané látky by Na začátku studie by měly být odchylky hmotnosti zvířat minimální a neměly by překročit ±20 % střední hmotnosti pro každé pohlaví. Provádí-li se studie opakovaného orálního podávání látky jako předběžná studie pro dlouhodobou studii, měla by být v obou studiích použita nejlépe zvířata stejného kmene a stejného původu. 1. 4. 2. 2 Po če t a p o h l aví Pro každou úroveň dávek se použije nejméně 10 zvířat (pět samic a pět samců). Pokud se budou zvířata usmrcovat v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou usmrcena před koncem studie. 386 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 Kromě toho může být satelitní skupině 10 zvířat (pět zvířat každého pohlaví) podávána vysoká úroveň dávky po dobu 28 dnů a 14 dnů po podávání se pozoruje vratnost, přetrvávání nebo zpožděný výskyt toxických účinků. Používá se také satelitní skupina 10 kontrolních zvířat (pět zvířat každého pohlaví). 1. 4. 2. 3 Úrovn ě d áv e k Obecně by měly být použity nejméně tři experimentální skupiny a jedna kontrolní skupina. S výjimkou podávání zkoušené látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako se zvířaty v experimentální skupině. Pokud se při podávání zkoušené látky používá vehikulum, podává se kontrolní skupině v nejvyšším použitém objemu. Pokud se po posouzení jiných údajů neočekávají žádné účinky při dávce 1 000 mg na kg tělesné hmotnosti, může být provedena limitní zkouška. Nejsou‑li dostupné žádné vhodné údaje, může být provedena předběžná studie pro stanovení rozmezí dávek, které mají být použity. Při výběru úrovní dávek by měly být zohledněny veškeré existující údaje o toxických a toxikokinetických vlastnostech, které jsou pro zkoušenou látku nebo příbuzné materiály dostupné. Nejvyšší úroveň dávky má vyvolat toxické účinky, ne však uhynutí nebo velké utrpení. Dále by měla být zvolena sestupná řada úrovní dávek s cílem prokázat účinky související s dávkou a nepřítomnost nepříznivých účinků při nejnižší úrovni dávky (NOAEL). Často je pro stanovení sestupných úrovní dávek optimální dvoj- až čtyřnásobný interval mezi dávkami a je vhodnější přidat čtvrtou experimentální skupinu, než použít velmi velké intervaly (odpovídající např. faktoru většímu než 10). U látek podávaných v potravě nebo v pitné vodě je důležité zajistit, aby množství použité zkoušené látky neovlivňovalo normální výživu nebo vodní rovnováhu. Podává-li se zkoušená látka v potravě, může se použít buď konstantní koncentrace (v ppm) nebo konstantní dávkování vzhledem k tělesné hmotnosti zvířete; použitá možnost musí být specifikována. Aplikuje-li se látka sondou, mělo by se tak stát každý den přibližně ve stejnou dobu, a dávkování by mělo být podle potřeby upraveno tak, aby bylo konstantní vzhledem k tělesné hmotnosti zvířete. Pokud je studie opakovaným podáváním prováděna jako předběžná studie k dlouhodobé studii, měla by být v obou studiích použita stejná potrava. 1. 4. 2. 4 L imit ní z kou ška Pokud zkouška provedená podle postupů popsaných v této studii při jedné dávce nejméně 1 000 mg na kg tělesné hmotnosti na den nebo v případě podávání v potravě nebo v pitné vodě v odpovídající koncentraci (na základě stanovení tělesné hmotnosti) nevyvolá pozorovatelné toxické účinky a pokud se na základě údajů o látkách s podobnou strukturou nepředpokládá toxicita, není úplná studie za použití tří úrovní dávek nutná. Limitní zkouška se použije s výjimkou případu, kdy údaje o expozici člověka naznačují, že je nezbytné použití vyšší úrovně dávek. 1. 4. 2. 5 D o ba p oz o rov á ní Doba pozorování by měla být 28 dnů. Zvířata v satelitní skupině určené pro následná pozorování by měla být po dalších nejméně 14 dnů bez aplikace, aby se zachytil zpožděný výskyt, přetrvávání nebo zotavení z toxických účinků. 1. 4. 3 Postup Zkoušená látka se podává zvířatům sedm dnů v týdnu po dobu 28 dnů. Pokud se látka podává pět dnů v týdnu, musí to být zdůvodněno. Pokud se zkoušená látka podává sondou, podává se zvířatům v jediné dávce za použití žaludeční sondy nebo vhodné intubační kanyly. Maximální objem tekutiny, který lze podat najednou, závisí na velikosti pokusného zvířete. Objem by neměl překročit 1 ml na 100 g tělesné hmotnosti, s výjimkou vodných roztoků, kdy lze použít 2 ml na 100 g tělesné hmotnosti. S výjimkou dráždivých nebo žíravých látek, u kterých se ve vyšších koncentracích stupňují účinky, by měly být rozdíly ve zkušebním objemu minimalizo- vány úpravou koncentrace tak, aby byl při všech úrovních dávek podáván konstantní objem. 1. 4. 3. 1 Obe cná p o zo rová ní Všeobecné klinické pozorování by se mělo provádět nejméně jednou denně, nejlépe ve stejnou dobu (stejné doby) a s uvážením doby očekávaného maxima účinku po podání látky. Zaznamenává se zdravotní stav zvířat. Nejméně dvakrát denně se provede prohlídka všech zvířat za účelem zjištění morbidity a mortality. Zvířata v agónii a zvířata, která se trápí nebo trpí bolestí, se ihned vyřadí, humánně utratí a pitvají. 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 387 Před prvním podáním látky a dále nejméně jednou týdně se provede důkladné klinické vyšetření všech zvířat (za účelem individuálního porovnání). Toto pozorování by se mělo provádět mimo chovnou klec ve standardním pozorovacím prostoru a nejlépe pokaždé ve stejnou dobu. Pozorování by měla být pečlivě zaznamenávána, nejlépe za použití systému bodování explicitně definovaného ve zkušební laboratoři. Mělo by se usilovat o to, aby byly rozdíly ve zkušebních podmínkách co nejmenší a aby vyšetření prováděly nejlépe osoby, které nejsou o zařazení do skupiny informovány. Vyšetření by mělo mimo jiné zahrnovat změny kůže, srsti, očí a sliznic, výskyt sekretů a exkretů a vegetativních funkcí (slzení, zježení srsti, velikost zornic, nezvyklé dýchání). Zaznamenávat by se měly změny chůze, polohy a reakce na manipulaci, dále přítomnost klonických a tonických pohybů, stereotypů v chování (např. vytrvalých čistících pohybů nebo opakovaného kroužení) nebo bizarního chování (např. sebepoškozování, pohybu pozpátku). Ve čtvrtém týdnu podávání látky se otestují reakce na různé smyslové podněty (např. sluchové, zrakové, proprioceptivní) a změří se síla úchopu a motorické aktivity. Další podrobné informace o postupech, které je možno použít, jsou uvedeny v literatuře (viz obecný úvod, část B). funkčních poruch ve čtvrtém týdnu podávání látky lze případně vynechat, pokud je studie Pozorování prováděna jako předběžná pro následnou subchronickou (90denní) studii. V takovém případě je pozorování funkčních poruch zahrnuto do dlouhodobé studie. Dostupnost údajů o pozorovaných funkčních poruchách ze studie opakovaného podávání dávky může na druhé straně usnadnit výběr úrovní dávek pro následnou subchronickou studii. Pozorování funkčních poruch lze výjimečně vynechat u skupin, které vykazují příznaky toxicity v takové míře, že by zkoušky významně narušily jejich funkční stav. 1. 4. 3. 2 T ěl e s n á h m o tn o s t a s p o t ře b a p o t r av y / vo dy Všechna zvířata by se měla nejméně jednou týdně zvážit. Měření spotřeby potravy a vody by se mělo provádět nejméně jednou týdně. Pokud se látka podává v pitné vodě, měla by se nejméně jednou týdně měřit spotřeba vody. 1. 4. 3. 3 Hem atolo g ická v yšet ř ení Na konci zkoušky by měla být provedena tato hematologická vyšetření: stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů, počtu trombocytů a stanoví se protrombinový čas. Krevní vzorky by se měly odebírat z určeného místa těsně před usmrcením zvířat nebo v jeho průběhu a měly by se skladovat za vhodných podmínek. 1. 4. 3. 4 Klin ická b ioch emická vy šet řen í Klinické biochemické analýzy za účelem vyšetření hlavních toxických účinků na tkáně a zejména na játra a ledviny se provedou na krevních vzorcích odebraných všem zvířatům před utracením nebo v jeho průběhu (kromě zvířat nalezených v agónii a/nebo zvířat utracených v průběhu zkoušky). Před odebráním krevních vzorků se doporučuje ponechat zvířata přes noc bez potravy (1). Vyšetření plazmy a séra zahrnuje stanovení sodíku, draslíku, glukosy, celkového cholesterolu, močoviny, kreatininu, celkových bílkovin a albuminu, nejméně dvou enzymů indikujících účinky na jaterní buňky (jako alaninaminotransferasa, aspartátaminotransferasa, alkalická fosfatasa, gama glutamyltranspeptidasa a sorbitoldehydrogenasa). Stanovení dalších enzymů (jaterního nebo jiného původu) a žlučových kyselin může za určitých okolností poskytnout užitečné informace. (1) Vyšetření na lačno je žádoucí pro řadu měření v séru a plazmě, zvláště pro měření glukosy. Hlavním důvodem pro toto doporučení je to, že u nehladovějících zvířat je vyšší variabilita výsledků, která by mohla maskovat méně výrazné změny a ztížit interpretaci. Na druhé straně by hladovění přes noc mohlo mít vliv na celkový metabolismus a při podávání v potravě by zasáhlo do pravidelnosti expozice zkoušené látce. Pokud se odebírá krev na lačno, je třeba provést biochemické vyšetření až po pozorování funkčních poruch ve 4. týdnu zkoušky. 388 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 Dále je možné v průběhu posledního týdne studie provést následující analýzy moči za použití časově definovaného sběru: vzhled, objem, osmolalita nebo specifická hmotnost, pH, bílkoviny, glukosa a krev/krvinky. Dále by se mělo uvážit vyšetření indikátorů celkového poškození tkání v séru. Další vyšetření by mělo být provedeno, pokud mohou známé vlastnosti zkoušené látky ovlivnit odpovídající metabolické profily, včetně vápníku, fosforu, triglyceridů na lačno, specifických hormonů, methemoglobinu a cholinesterasy. Tyto profily je třeba identifikovat pro látky určitých skupin nebo případ od případu. Obecně je třeba postupovat pružně v závislosti na druhu a na pozorovaných a/nebo předpokládaných účincích dané látky. Pokud nejsou údaje o dosavadních výchozích hodnotách dostatečné, mělo by se zvážit stanovení hematologic- kých a klinických biochemických parametrů před začátkem zkoušky. 1. 4. 3. 5 P it va U všech pokusných zvířat zařazených do studie by měla být provedena celková, podrobná pitva, zahrnující pečlivé zkoumání vnějšího povrchu těla, všech otvorů a dutiny lebeční, hrudní a břišní a jejich obsahu. Játra, ledviny, nadledvinky, varlata, nadvarlata, brzlík, slezina, mozek a srdce všech zvířat by měly být zbaveny všech ulpělých tkání a co nejdříve po sekci se ve vlhkém stavu zváží, aby nedošlo k vyschnutí. srdce, brzlík, Následující tkáně by měly být přechovány v nejvhodnějším fixačním médiu s ohledem na typ tkáně a plánovaná následná histopatologická vyšetření: všechny tkáně s lézemi, mozek (reprezentativní oblasti, včetně hemisfér, mozečku a mostu), mícha, žaludek, tenké i tlusté střevo (včetně Peyerových plátů), játra, ledviny, nadledvinky, (konzervované naplněním fixačním roztokem slezina, a plíce a ponořením), gonády a přídatné pohlavní orgány (např. děloha, prostata), močový měchýř, lymfatické uzliny (přednostně jedna pro oblast aplikace a jedna vzdálená pro pokrytí systémových účinků), periferní nerv ischiadicus nebo n. tibialis), nejlépe v blízkosti svalu, řez kostní dřeně (nebo čerstvý nátěr z nasáté kostní (n. dřeně). Podle klinických nebo jiných nálezů může být nezbytné zkoumat tkáně. Všechny orgány považované za možné cílové orgány pro působení zkoušené látky by měly být uchovány. štítná žláza, průdušnice i další 1. 4. 3. 6 His to p atol og i cká v yše tř ení U všech zvířat kontrolní skupiny a skupiny, které byla podána vysoká dávka, by mělo být provedeno celkové histologické vyšetření uchovaných orgánů a tkání. Toto vyšetření by mělo být rozšířeno na zvířata všech ostatních dávkových skupin, pokud jsou u skupiny s vysokou dávkou pozorovány změny orgánů vyvolané zkoušenou dávkou. Všechny makroskopické léze by měly být zkoumány. V případě použití satelitní skupiny by mělo být provedeno histopatologické vyšetření tkání a orgánů, na kterých byly pozorovány účinky u exponovaných skupin. 2. ÚDAJE Měly by být uvedeny údaje pro každé jednotlivé zvíře. Navíc by měly být všechny údaje shrnuty do tabulky, přičemž se uvede u každé experimentální skupiny počet zvířat na začátku zkoušky, počet zvířat nalezených uhynulých v průběhu zkoušky nebo utracených z humánních důvodů a dobu úmrtí nebo humánního utracení, počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, popis toxických příznaků, včetně doby nástupu, trvání a závažnosti každého toxického účinku, počet zvířat vykazujících léze, typ lézí a procento zvířat vykazujících každý typ léze. Číselné výsledky by měly být pokud možno vyhodnoceny vhodnou a obecně uznávanou statistickou metodou. Statistická metoda by měla být zvolena již při plánování studie. 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 389 3. ZPRÁVY Protokol o zkoušce Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto informace: Pokusná zvířata: — použitý druh/kmen; — počet, stáří a pohlaví zvířat; — původ, podmínky chovu, strava atd. ; — hmotnost jednotlivých zvířat na začátku zkoušky, dále v týdenních intervalech a na konci zkoušky. Zkušební podmínky: — zdůvodnění volby vehikula, není-li použita voda; — zdůvodnění výběru úrovní dávek; — podrobné údaje o složení látky nebo úpravě potravy, o dosažené koncentraci, stálosti a homogenitě přípravku; — podrobné údaje o způsobu podání zkoušené látky; — popřípadě přepočet koncentrace zkoušené látky v potravě/pitné vodě (ppm) na skutečnou denní dávku (mg na kg tělesné hmotnosti); — podrobné údaje o stravě a kvalitě vody. Výsledky: — tělesná hmotnost/změny tělesné hmotnosti; — spotřeba potravy a popřípadě spotřeba vody; — údaje o toxických reakcích podle pohlaví a úrovně dávky, včetně příznaků toxicity; — charakter, závažnost a trvání klinických projevů (zda byly vratné nebo nevratné); — posouzení reaktivity na smyslové podněty, úchopové síly a motorické aktivity; — hematologické vyšetření s příslušnými výchozími hodnotami (normami); — klinická biochemická vyšetření s příslušnými výchozími hodnotami; — tělesná hmotnost při usmrcení a údaje o hmotnosti orgánů; — pitevní nálezy; — podrobný popis všech histopatologických nálezů; — údaje o absorpci, pokud jsou dostupné; — popřípadě statistické zpracování výsledků. Rozbor výsledků. Závěry. 4. LITERATURA Metoda je analogická metodě OECD TG 407. “ 390 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 „B. 37 POZDNÍ NEUROTOXICITA ORGANICKÝCH SLOUČENIN FOSFORU PO AKUTNÍ EXPOZICI PŘÍLOHA IV E 1. METODA 1. 1 Úvod Při posouzení a hodnocení toxických účinků látek je důležité vzít v úvahu schopnost určitých skupin látek vyvolat specifické typy neurotoxicity, které nemohou být zjištěny jinými studiemi toxicity. U určitých organic- kých sloučenin fosforu byla pozorována pozdní neurotoxicita; tyto látky mají být podrobeny zkoumání touto metodou. Screeningové zkoušky in vitro lze použít pro vyhledání látek, které mohou vyvolat pozdní polyneuropatii; negativní nález ze zkoušek in vitro však neposkytuje důkaz, že látka nemá schopnost vyvolat pozdní neu- rotoxicitu. Viz obecný úvod, část B. 1. 2 Definice Mezi ‚organické sloučeniny fosforu‘ patří neutrální organické estery, thioestery nebo anhydridy kyseliny fosforečné, fosfonové nebo amidofosforečné nebo příslušných kyselin thiofosforečných, thiofosfonových nebo amidothio- fosforečných, nebo jiné látky, které mohou způsobit pozdní neurotoxicitu pozorovanou u některých látek této skupiny. Pozdní neurotoxicita je syndrom projevující se pozdním počátkem ataxie, distální axonopatií v míše a periferním nervu a dále inhibicí a stárnutím specifické esterasy – NTE (neuropathy target esterase) v nervové tkáni. 1. 3 Referenční látky Referenční podmínkách reakce pokusných druhů podstatně nezměnila. látka může být zkoušena v pozitivní kontrolní skupině s cílem prokázat, že se v laboratorních Příkladem široce používané EINECS 2011035, název podle CAS: tris(2methylfenyl)fosfát), známá také pod názvem triokresylfosfát (TOCP). s pozdním toxickým účinkem je tri-o-tolyl-fosfát (CAS 78308, látky 1. 4 Podstata zkušební metody Zkoušená látka se podává orálně v jediné dávce slepicím domácím, chráněným před možnými akutními cholinergními účinky. Zvířata se pozorují po dobu 21 dnů, zaznamenává se abnormální chování, ataxie a peréza. Biochemická vyšetření, zejména inhibice NTE (neropathy target esterase), se provádějí u slepic náhodně vybraných z každé skupiny, obvykle 24 a 48 h po podání látky. Dvacet jedna dnů po podání látky se zbývající slepice usmrtí a provede se histopatologické vyšetření vybraných nervových tkání. 1. 5 Popis zkušební metody 1. 5. 1 Příprava Provede se náhodný výběr mladých zdravých dospělých slepic, které nejsou ovlivněny virovými onemocněními a farmakologickou léčbou a mají normální chůzi, přiřadí se do experimentální a kontrolní skupiny a nejméně 5 dnů před zahájením studie se aklimatizují na laboratorní podmínky. Používají se dostatečně velké klece nebo ohrady umožňující volný pohyb slepic a snadné pozorování chůze. Zkoušená látka se obvykle podává orálně sondou, želatinovými tobolkami nebo srovnatelnou metodou. Kapaliny se podávají neředěné nebo rozpuštěné ve vhodném vehikulu, jako je např. kukuřičný olej, pevné látky by se měly nechat rozpustit, protože velké dávky pevných látek v želatinových tobolkách by se nemusely dostatečně vstřebat. Toxické vlastnosti nevodných vehikul by měly být známy před zkouškou, a pokud nejsou známy, měly by být předem určeny. 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 391 1. 5. 2 Zkušební podmínky 1. 5. 2. 1 Po ku sná z vířa t a Doporučuje se mladá nosnice kura domácího (Gallus gallus domesticus), stará 8 – 12 měsíců. Používají se plemena o standardní velikosti a slepice by měly být chovány za podmínek umožňujících volný pohyb. 1. 5. 2. 2 Po če t a p o h l aví Kromě experimentální skupiny by měla být použita kontrolní skupina s vehikulem a pozitivní kontrolní skupina. S výjimkou podání zkoušené látky se s kontrolní skupinou zachází stejně jako s experimentální skupinou. V každé skupině by měl být použit dostatečný počet slepic, aby aspoň šest slepic mohlo být usmrceno pro (tři v první a tři v druhý den po podání) a šest přežilo 21denní pozorování biochemické vyšetření patologických příznaků. Pozitivní kontrolní skupina může být zkoušena souběžně nebo mohou být použity údaje z nedávno použité kontrolní skupiny. Měla by zahrnovat nejméně šest slepic, kterým se podá látka, o níž je známo, že vyvolává pozdní neurotoxicitu, tři slepice pro biochemické vyšetření a tři slepice pro histopatologické vyšetření. Do- poručuje se periodicky doplňovat historické údaje. Nové pozitivní kontrolní údaje by měly být doplněny, pokud provádějící laboratoř v průběhu testu změní některý základní prvek zkoušky (např. plemeno, stravu, podmínky chovu). 1. 5. 2. 3 Úrovn ě d áv e k Měla by se provést předběžná studie za použití vhodného počtu slepic a skupin s různými úrovněmi dávek, aby bylo možné stanovit úroveň, která má být použita v hlavní studii. Pro stanovení přiměřené dávky v hlavní je v této předběžné studii nezbytná určitá letalita. Aby se však zabránilo úhynu vlivem akutních studii cholinergních účinků, lze použít atropin nebo jiný ochranný přípravek, o kterém je známo, že nemá vliv na pozdní neurotoxické reakce. Pro odhad nejvyšší neletální dávky zkoušených látek lze použít řadu metod (viz metoda B. 1 a)). Při výběru dávky mohou být užitečné také dosavadní údaje o slepicích nebo jiné toxikologické informace. Úroveň dávky zkoušené látky v hlavní studii by měla být co nejvyšší, přičemž se berou v úvahu výsledky předběžné studie výběru dávky a horní limit dávky 2 000 mg na kg tělesné hmotnosti. Případný úhyn by neměl narušit dostatečný počet zvířat pro biochemická vyšetření (šest) a pro histologická vyšetření (šest) po 21 dnech. Aby se zabránilo úmrtí vlivem akutních cholinergních účinků, použije se atropin nebo jiný ochranný přípravek, o kterém je známo, že nemá vliv na pozdní neurotoxické účinky. 1. 5. 2. 4 L imit ní z kou ška Pokud zkouška provedená podle postupů popsaných v této studii při jedné dávce nejméně 2 000 mg na kg tělesné hmotnosti na den nevyvolá pozorovatelné toxické účinky a pokud se na základě údajů o látkách s podobnou strukturou nepředpokládá toxicita, není úplná studie za použití vyšší dávky nezbytná. Limitní zkouška se provádí s výjimkou případu, kdy údaje o expozici člověka naznačují, že je nezbytné použití vyšší úrovně dávek. 1. 5. 2. 5 D o ba p oz o rov á ní Doba pozorování by měla být 21 dnů. 1. 5. 3 Postup Po podání přípravku chránícího před uhynutím na následky akutního cholinergního účinku se podá zkoušená látka v jedné dávce. 1. 5. 3. 1 Obe cná p o zo rová ní Pozorování by měla začít okamžitě po podání. Všechny slepice se pečlivě několikrát denně pozorují v průběhu prvních dvou dnů a poté nejméně jednou denně po dobu 21 dnů nebo do plánovaného usmrcení. Veškeré příznaky toxicity by měly být zaznamenány, včetně doby nástupu, typu, závažnosti a trvání abnormálního chování. Ataxie by měla být hodnocena podle nejméně čtyřstupňové pořadové stupnice a zaznamenává se paréza. Nejméně dvakrát týdně se slepice určené s patologickými příznaky vyjmou z klecí a podrobí zkoušce nucené motorické aktivity, jako např. stoupání po žebříku, aby se usnadnilo posouzení sebemenších toxických účinků. Zvířata v agónii a zvířata, která se trápí nebo trpí bolestí, se ihned vyřadí, humánně utratí a pitvají. 392 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 1. 5. 3. 2 T ěl e s n á h m o tn o s t Všechny slepice se zváží těsně před podáním zkoušené látky a poté nejméně jednou týdně. 1. 5. 3. 3 B io ch emi cká v yš et ření Šest slepic náhodně vybraných z každé experimentální skupiny a kontrolní skupiny s vehikulem a tři slepice z pozitivní kontrolní skupiny (pokud se zkouška souběžně provádí s touto skupinou) se usmrtí v prvních dnech po podání látky, mozek a lumbální mícha se vypreparují a vyšetří se na inhibici NTE. Dále může být rovněž vhodné vypreparovat n. ischiadicus a analyzovat jeho tkáň na inhibici aktivity NTE. Zpravidla se usmrtí tři slepice z kontrolní skupiny a z každé experimentální skupiny po 24 h a další tři po 48 h, zatímco tři slepice z pozitivní kontrolní skupiny se usmrtí po 24 h. Pokud pozorování klinických příznaků toxicity naznačuje, že se toxická látka v organismu vstřebává velmi pomalu (to lze často posoudit pozorováním doby nástupu cholinergních příznaků), může být vhodnější odebrat vzorek tkáně dvakrát ze tří zvířat mezi 24 až 72 h po podání látky. Na těchto vzorcích tkáně mohou být provedeny také analýza acetylcholinesterasy (AChE), je-li to považováno za vhodné. In vivo však může nastat spontánní reaktivace AChE, což může vést k podcenění látky jako inhibitoru AChE. 1. 5. 3. 4 P it va Pitva všech zvířat (usmrcených podle plánu a utracených v agónii) by měla zahrnovat posouzení stavu mozku a míchy. 1. 5. 3. 5 His to p atol og ické vy šet řen í Nervová tkáň zvířat, která přežila dobu pozorování a nebyla použita pro biochemické studie, by měla být mikroskopicky vyšetřena. Tkáně by měly být fixovány in situ za použití perfúzních technik. Odebírá se mozeček (střední podélný řez), prodloužená mícha, mícha a periferní nervy. Řezy míchy by měly být odebrány z horní krční části, střední hrudní a lumbosakrální oblasti. Měly by být odebrány řezy distální části n. tibialis a jeho větví k m. gastrocnemius a z n. ischiadicus. Řezy se barví vhodnými barvivy na myelin a axony. 2. ÚDAJE Negativní výsledky získané pro výsledné účinky zvolené v této metodě (biochemická a histopatologická vyšetření a vyšetření změn chování) nevyžadují zpravidla další zkoušení pozdní neurotoxicity. Při dvojznačných nebo neprůkazných výsledcích těchto vyšetření může být nezbytné další sledování. Měly by být uvedeny údaje pro každé jednotlivé zvíře. Navíc by měly být všechny údaje shrnuty do tabulky, přičemž se uvede u každé experimentální skupiny počet zvířat na začátku zkoušky, počet zvířat vykazujících léze, účinky na chování nebo biochemické účinky, typ a závažnost těchto lézí nebo účinků a procento zvířat vykazující každý typ a závažnost léze nebo účinku. Údaje z této studie by měly být vyhodnoceny z hlediska výskytu, závažnosti a korelace účinků na chování a biochemických a histopatologických nálezů a dále jakýchkoli dalších pozorovaných účinků na experimentální a kontrolní skupiny. Číselné výsledky by měly být pokud možno vyhodnoceny vhodnou a obecně uznávanou statistickou metodou. Statistická metoda by měla být zvolena již při plánování studie. 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 393 3. ZPRÁVY Protokol o zkoušce Protokol o zkoušce má pokud možno obsahovat tyto informace: Pokusná zvířata — použité plemeno; — počet a stáří zvířat; — původ, podmínky chovu atd. ; — hmotnost jednotlivých zvířat na začátku zkoušky. Zkušební podmínky: — podrobné údaje o přípravě zkoušené látky, popřípadě o její stálosti a homogenitě; — zdůvodnění volby vehikula; — podrobné údaje o způsobu podání zkoušené látky; — podrobné údaje o stravě a o kvalitě vody; — zdůvodnění výběru úrovní dávek; — specifikace podávaných dávek, včetně podrobných informací o vehikulu, objemu a fyzikální formě podané látky; — identifikace jakéhokoli ochranného přípravku a podrobné informace o jeho podání. Výsledky: — údaje o tělesné hmotnosti; — údaje o toxických reakcích podle skupin, včetně mortality; — charakter, závažnost a trvání klinických projevů (zda byly vratné nebo nevratné); — podrobný popis biochemických vyšetření a nálezů; — pitevní nálezy; — podrobný popis všech histopatologických nálezů; — popřípadě statistické vyhodnocení výsledků. Rozbor výsledků. Závěry. 4. LITERATURA Metoda je analogická metodě OECD TG 418. 394 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 B. 38 POZDNÍ NEUROTOXICITA ORGANICKÝCH SLOUČENIN FOSFORU – 28DENNÍ OPAKOVANÁ EXPOZICE 1. METODA 1. 1 Úvod Při posouzení a hodnocení toxických účinků látek je důležité vzít v úvahu schopnost určitých skupin látek vyvolat specifické typy neurotoxicity, které nemohou být zjištěny jinými studiemi toxicity. U určitých organic- kých sloučenin fosforu byla pozorována pozdní neurotoxicita; tyto látky mají být podrobeny zkoumání touto metodou. Screeningové zkoušky in vitro lze použít pro vyhledání látek, které mohou vyvolat pozdní polyneuropatii; negativní nález ze zkoušek in vitro však neposkytuje důkaz, že látka nemá schopnost vyvolat pozdní neu- rotoxicitu. 28denní zkouška pozdní neurotoxicity poskytuje informace o možném nebezpečí pro zdraví, které by se mohlo projevit z opakovaných expozic během omezeného časového období. Poskytne informace o reakci na dávku a může poskytnout odhad úrovně bez pozorovatelných nepříznivých účinků, což může být užitečné při stanovení kritérií pro bezpečnou expozici člověka. Viz také obecný úvod, část B. 1. 2 Definice Mezi ‚organické sloučeniny fosforu‘ patří neutrální organické estery, thioestery nebo anhydridy kyseliny fosforečné, fosfonové nebo amidofosforečné nebo příslušných kyselin thiofosforečných, thiofosfonových nebo amidothio- fosforečných, nebo jiné látky, které mohou způsobit pozdní neurotoxicitu pozorovanou u některých látek této skupiny. Pozdní neurotoxicita je syndrom projevující se pozdním počátkem ataxie, distální axonopatií v míše a periferním nervu a dále s inhibicí a stárnutím specifické esterasy - NTE (neuropathy target esterase) v nervové tkáni. 1. 3 Podstata zkušební metody Zkoušené látky se podávají denně orálně slepicím domácím po dobu 28 dnů. Zvířata se pozorují nejméně jednou denně, zaznamenává se abnormální chování, ataxie a paréza ještě 14 dnů po poslední dávce. Biochemická vyšetření, zejména inhibice NTE (neropathy target esterase), se provádí u slepic náhodně vybraných z každé skupiny, obvykle 24 a 48 h po podání látky. Dva týdny po poslední dávce se zbývající slepice usmrtí a provede se histopatologické vyšetření vybraných nervových tkání. 1. 4 Popis zkušební metody 1. 4. 1 Příprava Provede se náhodný výběr mladých zdravých dospělých slepic, které nejsou ovlivněny virovými onemocněními a farmakologickou léčbou a mají normální chůzi, přiřadí se do experimentálních a kontrolních skupin a nejméně 5 dnů před zahájením studie se aklimatizují na laboratorní podmínky. Používají se dostatečně velké klece nebo ohrady umožňující volný pohyb slepic a snadné pozorování chůze. Zkoušená látka se podává každý den, 7 dnů v týdnu, nejlépe orálně sondou nebo želatinovými tobolkami. Kapaliny se podávají neředěné nebo rozpuštěné ve vhodném vehikulu, jako je např. kukuřičný olej, pevné látky by se měly nechat rozpustit, protože velké dávky pevných látek v želatinových tobolkách by se nemusely dostatečně vstřebat. Toxické vlastnosti nevodných vehikul by měly být známy před zkouškou, a pokud nejsou známy, měly by být předem určeny. 1. 4. 2 Zkušební podmínky 1. 4. 2. 1 Po ku sná z vířa t a Doporučuje se mladá nosnice kura domácího (Gallus gallus domesticus), stará 8 – 12 měsíců. Používají se plemena o standardní velikosti a slepice by měly být chovány za podmínek umožňujících volný pohyb. 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 395 1. 4. 2. 2 Po če t a p o h l aví Obecně by měly být použity nejméně tři experimentální skupiny a kontrolní skupina s vehikulem. S výjimkou podání zkoušené látky se s kontrolní skupinou s vehikulem zachází stejně jako s experimentální skupinou. V každé skupině by měl být použit dostatečný počet slepic, aby aspoň šest slepic mohlo být usmrceno pro biochemické vyšetření (tři v první a tři v druhý den po podání) a šest přežilo 14denní pozorování patologických příznaků. 1. 4. 2. 3 Úrovn ě d áv e k Při výběru úrovní dávek by měly být vzaty v úvahu tři výsledky akutní zkoušky pozdní neurotoxicity a jakékoli další dostupné údaje o toxicitě a kinetice zkoušené sloučeniny. Nejvyšší úroveň dávky by měla být vybrána s cílem vyvolat toxické účinky, nejlépe pozdní neurotoxicitu, ne však uhynutí nebo zjevné utrpení. Dále by měla být zvolena sestupná řada dávek s cílem prokázat, že existuje závislost účinku na dávce a že nejnižší dávka nevyvolává žádné projevy toxicity. 1. 4. 2. 4 L imit ní z kou ška Pokud zkouška provedená podle postupů popsaných v této studii při jedné dávce nejméně 1 000 mg na kg tělesné hmotnosti a den nevyvolá pozorovatelné toxické účinky a pokud se na základě údajů o látkách s podobnou strukturou nepředpokládá toxicita, není úplná studie za použití vyšší dávky nezbytná. Limitní zkouška se provádí s výjimkou případu, kdy údaje o expozici člověka naznačují, že je nezbytné použití vyšší úrovně dávek. 1. 4. 2. 5 D o ba p oz o rov á ní Všechna zvířata by měla být pozorována nejméně jednou denně po dobu expozice a 14 dnů po ní, až do provedení pitvy podle plánu. 1. 4. 3 Postup Zvířatům se podává zkoušená látka sedm dnů v týdnu po dobu 28 dnů. 1. 4. 3. 1 Obe cná p o zo rová ní Pozorování by měla začít okamžitě po podání. Všechny slepice se pečlivě pozorují jednou denně každý den z 28 dnů expozice a 14 dnů po expozici nebo do plánovaného usmrcení. Veškeré příznaky toxicity by měly být zaznamenány, včetně doby nástupu, typu, závažnosti a trvání. Pozorování má zahrnovat abnormality chování, ale nemá se na ně omezovat. Ataxie by měla být hodnocena podle nejméně čtyřstupňové pořadové stupnice a zaznamenává se paréza. Nejméně dvakrát týdně se slepice s patologickými příznaky vyjmou z klecí a podrobí zkoušce nucené motorické aktivity, jako např. stoupání po žebříku, aby se usnadnilo posouzení sebemenších toxických účinků. Zvířata v agónii a zvířata, která se trápí nebo trpí bolestí, se ihned vyřadí, humánně utratí a pitvají. 1. 4. 3. 2 T ěl e s n á h m o tn o s t Všechny slepice se zváží těsně před prvním podáním zkoušené látky a poté nejméně jednou týdně. 1. 4. 3. 3 B io ch emi cká v yš et ření Šest slepic náhodně vybraných z každé experimentální skupiny a kontrolní skupiny s vehikulem a tři slepice z pozitivní kontrolní skupiny se usmrtí v prvních dnech po podání poslední dávky, mozek a lumbální mícha se vypreparují a vyšetří se na inhibici NTE. Dále může být vhodné vypreparovat n. ischiadicus a analyzovat jeho tkáň na inhibici aktivity NTE. Zpravidla se usmrtí tři slepice z kontrolní skupiny a z každé experimentální skupiny po 24 h a další tři po 48 h od poslední dávky. Pokud údaje z akutní studie nebo z jiných studií (např. toxikokinetických) naznačují, že jsou vhodné jiné doby usmrcení po poslední dávce než tyto doby, měly by být použity a zdůvodnění by mělo být uvedeno v dokumentaci. 396 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 Na těchto vzorcích tkáně mohou být provedeny také analýza acetylcholinesterasy (AChE), je-li to považováno za vhodné. In vivo však může nastat spontánní reaktivace AChE, což může vést k podcenění látky jako inhibitoru AChE. 1. 4. 3. 4 P it va Pitva všech zvířat (usmrcených podle plánu a utracených v agónii) by měla zahrnovat posouzení stavu mozku a míchy. 1. 4. 3. 5 His to p atol og ické vy šet řen í Nervová tkáň zvířat, která přežila dobu pozorování a nebyla použita pro biochemické studie, by měla být mikroskopicky vyšetřena. Tkáně by měly být fixovány in situ za použití perfúzních technik. Odebírá se mozeček (střední podélný řez), prodloužená mícha, mícha a periferní nervy. Řez míchy by měl být proveden z horní krční části, střední hrudní a lumbosakrální oblasti. Měly by být odebrány řezy distální části n. tibialis a jeho větví k m. gastrocnemius a z n. ischiadicus. Řezy se barví vhodnými barvivy na myelin a axony. Nejprve by mělo být provedeno mikroskopické vyšetření fixované tkáně všech zvířat kontrolní skupiny a skupiny s vysokou dávkou. Pokud se u skupiny s vysokou dávkou projeví účinky, mělo by být mikroskopické vyšetření provedeno také na slepicích ze skupiny se střední a nízkou dávkou. 2. ÚDAJE Negativní výsledky získané touto metodou (biochemická a histopatologická vyšetření a vyšetření změn chování) nevyžadují zpravidla další zkoušení pozdní neurotoxicity. Při dvojznačných nebo neprůkazných výsledcích těchto vyšetření může být nezbytné další sledování. Měly by být uvedeny údaje pro každé jednotlivé zvíře. Navíc by měly být všechny údaje shrnuty do tabulky, přičemž se u každé experimentální skupiny uvede počet zvířat na začátku zkoušky, počet zvířat vykazujících léze, účinky na chování nebo biochemické účinky, typ a závažnost těchto lézí nebo účinků a procento zvířat vykazující každý typ a závažnost léze nebo účinku. Údaje z této studie by měly být vyhodnoceny z hlediska výskytu, závažnosti a korelace účinků na chování a biochemických a histopatologických nálezů a dále jakýchkoli dalších pozorovaných účinků na experimentální a kontrolní skupiny. Číselné výsledky by měly být pokud možno vyhodnoceny vhodnou a obecně uznávanou statistickou metodou. Statistická metoda by měla být zvolena již při plánování studie. 3. ZPRÁVY Protokol o zkoušce Protokol o zkoušce obsahuje pokud možno tyto informace: Pokusná zvířata: — použité plemeno; — počet a stáří zvířat; — původ, podmínky chovu atd. ; — hmotnost jednotlivých zvířat na začátku zkoušky. Zkušební podmínky: — podrobné údaje o přípravě zkoušené látky, popřípadě o její stálosti a homogenitě; — zdůvodnění volby vehikula; — podrobné údaje o způsobu podání zkoušené látky; — podrobné údaje o stravě a o kvalitě vody; — zdůvodnění výběru úrovní dávek; — specifikace podávaných látek, včetně podrobných informací o vehikulu, objemu a fyzikální formě podané látky; — zdůvodnění jiných časů odběru pro biochemické vyšetření, není-li použito 24 a 48 h. 13/sv. 17 CS Úřední věstník Evropské unie 397 Výsledky: — údaje o tělesné hmotnosti; — údaje o toxických reakcích podle skupin, včetně mortality; — úroveň bez pozorovatelných nepříznivých účinků; — charakter, závažnost a trvání klinických projevů (zda byly vratné nebo nevratné); — podrobný popis biochemických vyšetření a nálezů; — pitevní nálezy; — podrobný popis všech histopatologických nálezů; — popřípadě statistické vyhodnocení výsledků. Rozbor výsledků. Závěry. 4. LITERATURA Metoda je analogická metodě OECD TG 419. “ 398 CS Úřední věstník Evropské unie 13/sv. 17 Obecné požadavky na klasifikaci a označování nebezpečných látek a přípravků Viz směrnice Komise 2001/59/ES, Úř. věst. L 332, 28. 12. 2000, s. 81. PŘÍLOHA V