larsenico ( as )  un metalloide associato a diverse rocce , specialmente a minerali contenenti solfuro , rivelandosi molto mobile nellambiente : lerosione delle rocce converte infatti i solfuri di as in ossido arsenioso che entra nel ciclo ambientale contaminando i corpi idrici e , attraverso la catena alimentare , distribuendosi diffusamente in tutto il regno vegetale e animale .
si tratta quindi di un elemento ubiquitario , gi naturalmente presente nei suoli , nelle acque , nei sedimenti e negli organismi .
dallavvento della metallurgia , ai livelli di fondo dellas ambientale si sono aggiunti quelli antropogenici , in quanto esso rappresenta anche un sottoprodotto nellestrazione dei metalli , mentre il contributo antropogenico recente alle concentrazioni di as ambientale  derivato soprattutto dalluso di pesticidi a base di suoi composti .
va perci sottolineato come la concentrazione di as nella crosta terrestre presenti notevoli variazioni geografiche , anche dipendenti dal tipo di rocce , ed  nota limportanza di conoscere i processi che controllano la mobilit e la speciazione dellas nei suoli , nelle acque e nel biota .
spesso , infatti , la forma o specie chimica di un determinato elemento chimico  importante quanto la sua quantit e ci vale in particolar modo per las , in quanto la pericolosit per luomo delle sue diverse forme varia in modo davvero considerevole ( sharma e sohn , 2009 ) .
la valenza sanitaria del problema  ancora pi evidente dal quadro che ci viene fornito dalla dinamica delle diverse forme chimiche dellas in ambiente acquatico marino .
las disciolto in acqua di mare si trova infatti prevalentemente in forma di arsenato [ as(v ) ] , mentre larsenito [ as(iii ) ] , potenzialmente pi tossico e cancerogeno , rappresenta raramente pi del 20% ( neff , 1997 ) dellarsenico totale ( astot ) .
oltre alle forme inorganiche , las in ambiente marino  presente in varie forme organiche , a partire da quelle mono- , di- e tri - metilate ( figura 1 ) .
le alghe marine assorbono facilmente larsenato dallacqua ed in esse si riscontra la presenza di diversi composti organici arseno - ribosidici .
tali composti , spesso indicati col termine generico di arsenozuccheri ( figura 1 ) , rappresentano un anello importante nel ciclo biochimico dellas in ambiente marino ( kirby et al . , 2005 ) .
costituiscono infatti la forma prevalente di as nelle alghe ( circa  della frazione di as ) , ma sono presenti in quantit significative anche nei molluschi marini , in particolare nei gasteropodi erbivori ( circa  della frazione di astot ) e , viceversa , sono presenti in bassissime concentrazioni nei pesci .
gli studi sulla tossicit degli arsenozuccheri risultano quindi numerosi e di grande interesse anche in ambito europeo , per il crescente uso alimentare delle alghe , consolidato invece per tradizione nei paesi asiatici .
tuttavia , nonostante la notevole mole di dati bibliografici , non ci sono ancora informazioni definitive sulla eventuale tossicit di questi composti ( francesconi , 2010 ) .
gli animali acquatici marini ( pesci , crostacei e molluschi acquatici ) hanno invece una capacit limitata di bioconcentrare arsenico inorganico ( asinorg ) dallacqua marina , mentre possono bioaccumulare e biotrasformare
tutti i tessuti , sia degli invertebrati che dei pesci marini , contengono infatti concentrazioni molto elevate di as ( neff , 1997 ) , ma questo si trova per lo pi nella forma organica .
gli organismi marini sembra infatti che abbiano affrontato evolutivamente il problema sfruttando la ricca chimica organica dellas , per trasformare le forme inorganiche in una gamma di composti organici , fondamentalmente atossici ( francesconi e edmonds , 1998 ) .
il composto pi abbondante  larsenobetaina , con quantit residuali di arsenocolina ( figura 1 ) . in tutta la copiosa bibliografia scientifica disponibile ( francesconi , 2010 ) , larsenobetaina e larsenocolina sono considerate non tossiche , sebbene la prima sia stata molto pi studiata e ne sia stata verificata linerzia metabolica , mentre sullarsenocolina ( che , comunque costituisce generalmente meno dell1% dellastot presente in organismi marini ) esistono ancora lacune conoscitive .
appare chiaro perci come le determinazioni delle sole concentrazioni dellastot nelle diverse matrici ambientali ( sedimento , acqua e soprattutto biota ) non possano , da un lato , costituire un elemento sufficiente per poter valutare il possibile effetto sugli organismi e la dinamica di tale metalloide nellambiente marino - costiero considerato ( srs et al . , 2003 ; fattorini et al . , 2004 ;
2006 ) e , dallaltro , non essere sufficienti per lo svolgimento di una corretta valutazione del rischio umano per esposizione alimentare a prodotti della pesca contaminati da tale metalloide ( de gieter et al .
bench le forme inorganiche dellas siano pi tossiche di quelle organiche , la quasi totalit dei dati sulla presenza di as negli alimenti , raccolti nel quadro dei controlli ufficiali in ambito europeo , riportano solo lastot , senza fare distinzioni tra le sue varie forme .
poich , proprio nei prodotti della pesca las  prevalentemente presente in forme organiche ,  stata evidenziata la necessit di disporre di dati di speciazione ( efsa , 2009 , 2014 ) , anche in considerazione del fatto che un risk assessment che non tenesse conto di ci , condurrebbe a sovrastimare notevolmente il rischio sanitario .
gli organismi marini presentano infatti concentrazioni notoriamente molto alte di astot , ma con una prevalenza di composti innocui ( come larsenobetaina in pesci , crostacei e molluschi ) , o ritenuti tali ( quali gli arsenozuccheri in molluschi ed alghe ) , bioaccumulati secondo un complesso ciclo bio - geochimico ( figura 2 ) .
i composti dellas presenti negli ambienti acquatici marini sono quindi diverse decine ed  nota la variabilit della capacit dei diversi organismi vegetali e animali , anche in relazione al livello trofico da questi occupato ( kirby e maher , 2002 ) , di bioaccumulare alcuni di questi composti in luogo di altri ( rahman et al . , 2012 ) . in particolare quindi ,  lanalisi selettiva delle forme inorganiche da quelle organiche dellas a rivestire unimportanza cruciale nella valutazione del rischio legato allesposizione a tale elemento attraverso la dieta , in quanto tali diverse forme chimiche presentano notevolissime differenze nella tossicit ( neff , 1997 ; francesconi , 2010 ) .
i composti inorganici dellas sono infatti potenti cancerogeni per luomo e , inoltre ,  ampiamente dimostrato che lesposizione cronica ad essi determina un aumento nel rischio dinsorgenza di numerose altre patologie non tumorali , come ipercheratosi , ipertensione , diabete , nonch disturbi respiratori , neurologici e cardiovascolari ( saha et al . , 1999 ) .
il suo stato di ossidazione : dati di letteratura indicano infatti che las sotto forma di arsenito [ as(iii ) ]  da 10 a 60 volte pi tossico della forma di arsenato [ as(v ) ] e da 70 a 100 volte pi tossico delle specie organiche metilate ( borak e hosgood , 2007 ) .
quali forme chimiche siano implicate , se organiche o inorganiche , rappresenta quindi il fattore determinante per quanto riguarda la valutazione della tossicit , oltre che la biodisponibilit , dellas ( moreda - pieiro et al . , 2012 ) .
ad oggi sarebbero pi di cinquanta le forme di as organico identificate in organismi marini ( francesconi , 2010 ) , nei tessuti dei quali , oltre a tutta la gamma finora descritta , si aggiungono pure i composti lipidici ( sele et al . , 2012 ) .
negli oli di pesce  stata infatti da tempo rilevata una serie di acidi grassi saturi con la porzione terminale dimetil - arsinoil-(figura 1 ) .
la presenza di arsenolipidi in oli di pesce non sembra tuttavia sollevare problemi di tossicit nelluomo : bench essi vengano assorbiti dal tratto gastrointestinale ,
las  infatti rapidamente escreto sotto forma di metaboliti organici idrosolubili ( prevalentemente composti dimetilati ed arsenobetaina ) . in sintesi , per quanto riguarda le forme organiche dellas ,  sufficientemente assodato come larsenobetaina , che  la forma predominante nei prodotti della pesca , non desti alcuna preoccupazione dal punto di vista tossicologico e che , relativamente agli arsenozuccheri e agli arsenolipidi ( poich vengono nelluomo generalmente metabolizzati in dimetilarsinato ) , non siano attualmente disponibili sufficienti informazioni sulleventualit e grado di una qualche loro tossicit residuale . in un
precedente studio ( piras e mulas , 2011 ) sul contenuto di metalli pesanti e metalloidi in molluschi bivalvi , crostacei e pesci lagunari campionati nellarea dindagine , la laguna di boi cerbus nella parte sud - occidentale della sardegna ( sulcis - iglesiente ) , erano stati rilevati elevati livelli di as ed erano state avanzate stime per la valutazione del rischio da esposizione alimentare .
seguendo lapproccio metodologico armonizzato europeo , che utilizza il parametro tossicologico del provisional tolerable weekly intake fissato dal joint fao / who expert committee on food additives , le concentrazioni di astot riscontrate avrebbero contribuito di 2,15 volte la dose accettabile nella classe det dei bambini e di 1,26 volte in quella dei giovani .
 trattato ovviamente di stime molto prudenziali , nellipotesi estrema che tutto las rilevato avesse gli effetti tossici dellasinorg .
nello scenario di ricerca che si  aperto ,  apparso quindi necessario poter disporre di tecniche analitiche capaci di discriminare , in una consistente gamma di prodotti della pesca , lasinorg dal complesso di composti riferibili alle forme organiche .
i metodi disponibili per lanalisi di speciazione si basano fondamentalmente sulla combinazione di tecniche di separazione con quelle di rivelazione .
, 2002 ; srs et al . , 2003 ; francesconi e kuehnelt , 2004 ) le tecniche di separazione attualmente pi diffuse sono quelle cromatografiche hplc in combinazione ( o hyphenated applications ) con rivelatori di massa icp .
lanalisi di speciazione dellas in campioni marini  stata per generalmente eseguita per ricerche ad hoc e finalit scientifiche ( comunque non nel contesto di piani di monitoraggio / sorveglianza ) , ponendosi come obiettivo soprattutto la differenziazione multipla delle specie organiche dellelemento ( hirata et al . , 2006 ; moreda - pieiro et al . ,
con un approccio che meglio si presta ad obiettivi ed operativit della sanit pubblica , nel presente studio si  invece adottata una particolare procedura di preparazione del campione che permette , sempre attraverso tecnica cromatografia liquida ad alta prestazione - spettrometria di massa a plasma accoppiato induttivamente ( high performance liquid chromatography - inductively coupled plasma mass spectrometry ; hplc - icpms ) , unanalisi di speciazione semplificata , ovvero finalizzata alla sola determinazione dellasinorg .
originariamente sperimentata in campioni di pesci marini ( larsen et al . , 2005 ) ,
dopo unulteriore semplificazione e perfezionamento ,  stata applicata , anche sui molluschi bivalvi e crostacei ( sloth et al . , 2005 )
ed  stata recentemente implementata presso il laboratorio controllo chimico e biomonitoraggio della sezione di ancona dellizs - um , dove sono state svolte le analisi di speciazione del presente studio .
si  quindi voluta sviluppare la ricerca nellarea costiera indagata , con lo scopo di rilevare le frazioni tossiche dellas ( come asinorg / astot x 100 ) su organismi marini sentinella , rappresentati da una diversificata gamma di specie marino - lagunari edibili , ponendo particolare attenzione ad evidenziare eventuali differenze interspecifiche o tra taxa , oltre che tra organismi bentonici ( o a contatto col sedimento ) vs quelli nectonici , ed approfondire le conoscenze sul comportamento dellas in organismi marino - costieri con habitat prossimo ad aree minerarie , come quelle del sulcis - iglesiente , e valutarne limpatto sulla sicurezza alimentare .
utilizzando la sopra riferita procedura di speciazione basata su tecnica accoppiata hplc / icp - ms ( sloth et al . ,
2005 ) , si  studiata la distribuzione dellasinorg ( e sua quantificazione proporzionale sullastot ) in n 80 campioni , riferibili a n 14 specie acquatiche marine eduli ( tabella 1 ) della laguna di boi cerbus pescate / raccolte nel corso di tre calate del : 21 febbraio , 29 aprile e 6 luglio del 2013 .
gli organismi acquatici sono stati campionati nella sola parte edibile ed immediatamente refrigerati a + 4c per massimo 3 giorni e infine trasportati in continuit termica al laboratorio dellizs - um , dove sono stati prontamente congelati a -18c ed in breve tempo liofilizzati .
la stabilit delle specie chimiche durante la movimentazione e lo stoccaggio del campione prima delle analisi  infatti un prerequisito fondamentale per ottenere risultati affidabili , in particolare per le analisi di speciazione , dovendosi evitare , anche in questa fase , che intervengano modifiche nella ripartizione delle varie forme chimiche .
il congelamento in laboratorio dei campioni e la loro liofilizzazione in attesa dellanalisi di speciazione  stata valutata ( dahl et al
lo schema di analisi di speciazione utilizzato ha previsto due procedure autonome : quella per la determinazione della concentrazione di astot ( con tecnica icp - ms ) e , in parallelo , quella per la speciazione dellas ( con tecnica combinata hplc - icp - ms ) .
si  quindi proceduto alle analisi con una dotazione strumentale specifica costituita da : una pre - colonna ed una colonna hplc ( icsep ion-120 , 4,6 mm , lunghezza 120 mm ) , uno strumento per hplc ( perkin elmer flexar liquid chromatography ) ed uno strumento per icpms ( perkin elmer elan drc - ii ) .
laccoppiamento online dellhplc con licpms , attraverso connessione del capillare in uscita dalla colonna cromatografica con la camera di nebulizzazione dellicp - ms ,  stato gestito tramite pc dotato di specifico software ( chromera ) . per lanalisi dellastot ,
i sub - campioni sono stati sottoposti a digestione in microonde con 6 ml di hno3 concentrato e 2 ml di h2o2 al 30% . per lestrazione e lanalisi dellasinorg , i sub - campioni sono stati miscelati con una soluzione 9/1 di hcl
prima della separazione cromatografia gli estratti sono stati centrifugati ( circa 4000 rpm per 10 minuti ) e filtrati (  0,45 mm ) .
tutti i campioni sono stati analizzati in doppio ( il valore riferito  quindi quello medio ) .
relativamente allanalisi statistica dei dati , per i confronti temporali  stato utilizzato il test non parametrico di kruskal - wallis ( o one - way anova by ranks ) e per i confronti tra gruppi di organismi marini ( per habitat e per taxon ) il test , ancora non parametrico , di mann - witney ( o wilcoxon rank - sum test ) .
la tecnica di accoppiamento hplc - icp - ms secondo la procedura della quale ci si  avvalsi ( sloth et al . , 2005 ) , applicata anche ad organismi marini eduli della laguna di boi cerbus , ha confermato che i composti chimici dellas presenti in concentrazione di gran lunga superiore sono quelli organici .
le concentrazioni delle forme inorganiche sono cos basse da non essere rilevabili o , se lo sono , rappresentano frazioni percentuali sullastot che arrivano al massimo all1% , com il caso dei molluschi bivalvi . come si pu rilevare anche dalla tabella 1 , le concentrazioni relativamente maggiori per lasinorg si hanno nei cuori ( cerastoderma glaucum ) , cui seguono
i granchi da moleca ( carcinus aestuarii ) , mentre tutte le altre specie presentano concentrazioni inferiori e tra loro confrontabili .
i risultati del presente studio sono coerenti con quanto riporta la letteratura ( neff , 1997 ; de gieter et al . , 2002 ;
srs et al . , 2003 ; larsen et al . , 2005 ; sloth et al .
, 2005 ; greene e crecelius , 2006 ) che , come si  pi volte rimarcato , riferisce valori assoluti e percentuali molto bassi di asinorg per i prodotti della pesca .
relativamente allanalisi di speciazione dellas adottata in questo studio , va sottolineato come la fase di estrazione rivesta unimportanza decisiva , considerata la necessit di mantenere la distribuzione originale delle specie chimiche presenti nel campione .
ogni conversione delle specie organiche dellas , nettamente predominanti nei prodotti della pesca , in specie inorganiche durante la procedura di pretrattamento del campione comprometterebbe infatti la precisione riferita alla proporzione dellasinorg sul totale .
tuttavia , relativamente alla specifica procedura utilizzata ed allobiettivo sotteso ,  da ritenersi ammissibile la conversione di composti organici dellas in altri composti organici del medesimo elemento .
la procedura adottata garantisce infatti sul fatto che , dai dati sperimentali disponibili ( sloth et al . , 2005 ) , non sia stata osservata alcuna conversione delle specie madri di as organico in asinorg , mentre sono state rilevate possibili inter - conversioni tra alcuni dei composti organici dellas , precisando che tale eventualit non influenza il contenuto originario di asinorg .
inoltre , col termine di arsenico inorganico ( asinorg ) si intende la somma di as(iii ) e as(v ) poich , durante il trattamento a microonde , avviene la conversione quantitativa della prima forma nella seconda e la frazione di as(iii ) dellacido arsenioso viene tutta ossidata in as(v ) dellacido arsenico .
si consideri a tal proposito che la separazione delle specie inorganiche bersaglio [ somma di as(iii ) + as(v ) ] da quelle organiche rappresenta proprio lobiettivo di speciazione che ci si  posti , come informazione fondamentalmente utile per le finalit del risk assessment in sanit pubblica .
relativamente allanalisi statistica dei dati , lutilizzo del test di kruskal - wallis , al quale si  ricorsi per la valutazione di eventuali trends stagionali , non ha evidenziato differenze statisticamente significative , n sulle concentrazioni di astot ( p=0,2549 ) , n sulle percentuali medie di asinorg sul totale ( p=0,0817 ) , fra le tre calate di pesca / raccolta .
al fine di valutare leventuale influenza degli habitat , le 14 specie sono state raggruppate in due cluster : gli organismi bentonici ( rappresentati da cuori , murici , granchi , ghiozzi , bavose e sogliole ) vs quelli nectonici ( con latterini , salpe , cefali , lotregani , orate e spigole ) .
attraverso lutilizzo del test non parametrico di mann - whitney , la differenza dei livelli medi di astot tra gli organismi bentonici ( 38,535,21 ) vs quelli nectonici ( 4,890,80 )  risultata statisticamente significativa ( p<0,0001 ) .
le stesse specie sono state raggruppate in base al taxon in due nuovi cluster : gli invertebrati ( cuori , murici e granchi ) vs i vertebrati ( le restanti specie , rappresentate da pesci teleostei ) .
sempre ricorrendo al test non parametrico di mann - whitney , anche la differenza dei livelli medi di astot tra gli invertebrati ( 52,567,46 ) vs i vertebrati ( 9,751,33 )  risultata statisticamente significativa ( p<0,0001 ) .
i dati al momento disponibili , non  stato per possibile scomporre il peso attribuibile alla differenza di habitat piuttosto che a quella di taxon ma , plausibilmente , entrambi i fattori sono da ritenersi dei determinanti causali significativi .
relativamente ai livelli medi percentuali di asinorg sul totale tra gli organismi bentonici ( 0,210,04% ) vs quelli nectonici ( 0,020,01% ) , sempre ricorrendo al test non parametrico di mann - whitney , la differenza non  risultata statisticamente significativa ( p=0,1038 ) , mentre la differenza dei livelli medi percentuali di asinorg sul totale tra gli invertebrati ( 0,310,06% ) vs i vertebrati ( 0,030,01% )  risultata statisticamente significativa ( p=0,0002 ) .
tale ultimo riscontro , considerata lampia premessa svolta sulla chimica e sullecologia dellas negli ambienti marini , pu trovare una plausibile ipotesi giustificativa sempre nelle differenze intrinseche , biologiche e filogenetiche , esistenti tra gli invertebrati acquatici ed i pesci , e verosimilmente trovare spiegazione , pur non disponendo col presente studio di evidenze con una sufficiente significativit statistica , anche nelle marcate differenze di habitat tra i due gruppi di organismi indagati
( che vede gli invertebrati occupare permanentemente il benthos , mentre i pesci si presentano naturalmente pi mobili e tendenti ad occupare , seppur in modo differenziato , tutta la colonna dacqua , dominio del necton ) .
si consideri a tale proposito che la maggior attitudine allaccumulo , in termini quantitativi , dellasinorg in ambienti marini da parte degli invertebrati rispetto ai vertebrati  stata descritta ed indagata gi da tempo , presupponendo il fatto che lelemento possa essere accumulato a partire sia dallacqua , che dal cibo o dai sedimenti , secondo meccanismi differenti a seconda dei taxa .
infatti , non solo le alghe , ma anche i molluschi ed i crostacei ( ma scarsamente o per nulla i pesci ) sono ritenuti capaci di accumulare arseniato direttamente dallacqua di mare ( maher e butler , 1988 ) , secondo modelli di assorbimento proporzionale alla sua concentrazione , almeno fino ad un valore soglia ( oltre il quale lassorbimento di arseniato sarebbe inibito o , comunque , indipendente dalla sua concentrazione nellacqua marina ) .
quando invece lelemento si accumula attraverso il cibo , le differenze di concentrazione tra le diverse specie marine ( e nelle stesse specie in ambienti diversi ) possono essere direttamente correlate alla dieta , tenuto conto che lassorbimento dellastot per via alimentare risulta essere la modalit pi efficiente e che , in tale forma di assunzione , i composti organici dellelemento vengono assimilati a preferenza dellasinorg ( maher e butler , 1988 ) .
le forme organiche dellarsenico , come ampiamente  stato riferito nella premessa , si ritiene siano infatti il prodotto della mesofauna associata ad alghe e bioti nei loro habitat naturali ( edmonds e francesconi , 1987 ) .
un altro aspetto da considerare , anche se il fenomeno del bioaccumulo dellelemento si verifica a tutti i livelli trofici ,  il fatto che non viene rilevata la sua biomagnificazione verso i livelli alti della catena alimentare ( maher e butler , 1988 ) .
a ci si aggiunga come siano i sedimenti marini a rappresentare il pi grande serbatoio di asinorg nei sistemi acquatici e che le concentrazioni di tale forma chimica dellelemento possano diventare elevate in alcuni estuari e aree costiere adiacenti a zone industriali o ad aree minerarie e metallurgiche ( maher e butler , 1988 ) .
nei sedimenti marini las si trova infatti soprattutto in forma inorganica , come arsenato o arsenito , associato principalmente agli
ossidi / idrossidi di ferro e manganese ( sharma e sohn , 2009 ) e , anche nei bassi fondali lagunari , i sedimenti non sono stati descritti capaci di svolgere un ruolo primario nel condizionare la qualit dellacqua sovrastante in relazione ai tenori di asinorg . per contro ,
le correlazioni delle concentrazioni di asinorg nei tessuti di organismi bentonici , bivalvi in particolare , rispetto a quelle dei sedimenti hanno consentito di dimostrare ( maher e butler , 1988 ) la capacit di tali organismi acquatici di ingerire una frazione di particolato legata allasinorg nei sedimenti medesimi .
i risultati di questo preliminare studio che , ai fini di un corretto risk assessment , rappresentano un utile contributo alla conoscenza dei livelli naturali e della speciazione chimica dellas negli organismi marini eduli presenti in zone costiere prossime a siti industriali e ad aree minerarie dismesse , nel contempo suggeriscono la necessit di uno sviluppo delle indagini sulla portata del fenomeno e sulle sue implicazioni nelle dinamiche ambientali e sul destino metabolico dellarsenico inorganico nei diversi organismi marini eduli ivi presenti .
 the boi cerbus lagoon , facing a mining and industrial site in sardinia ( italy ) , is an important fishing area for the local population . 
 previous studies showed high concentrations of total arsenic ( astot ) in fish , molluscs and crustaceans sampled in the lagoon , and a possible exceeding of the provisional tolerable weekly intake set by the joint fao / who expert committee on food additives by some local consumer groups . 
 however , the percentage of inorganic as ( asinorg ) should be known for a correct assessment of potential risk , as its toxicity is much higher than that of the organic forms . 
 eighty samples of 14 different species of fish , molluscs and crustaceans , sampled in the boi cerbus lagoon in 3 different seasons ( winter , spring and summer ) , were analysed for astot by inductively coupled plasma mass spectrometry ( icp - ms ) and asinorg by high performance liquid chromatography - icp - ms . 
 all the data obtained from the analysis were statistically processed to evaluate significant differences based on season , taxon and habitat , in preparation for a subsequent risk assessment . 
Introduzione
Materiali e Metodi
Risultati
Discussione
Conclusioni