Utjecaj eikosanoida na kontrakciju i relaksaciju glatkih mišića respiratornog puta

<s>Iskreno zahvaljujem svom mentoru doc. dr. Alešu Fajmutu za svu pomoć, trud, strpljenje, savjetovanje tijekom studija i vođenje u istraživanju i pisanju magistarskog Zahvaljujem svojim roditeljima, prijateljima i kolegama na podršci.</s><s>Priloga 6 - IZJAVA O AVTORSTVU IN ISTOVETNOSTI TISKANE IN ELEKTRONSKE OBLIKE ZAKLJUČNEGA DELA</s>
<s>Podpisan‐i/‐a študent/‐ka Karlo Blažetić izjavljam, da je zaključno delo rezultat mojega samostojnega dela, ki sem ga izdelal/‐a ob pomoči mentor‐ja/‐ice oz. somentor‐ja/‐ice; izjavljam, da sem pridobil/‐a vsa potrebna soglasja za uporabo podatkov in avtorskih del v zaključnem delu in jih v zaključnem delu jasno in ustrezno označil/‐a; na Univerzo v Mariboru neodplačno, neizključno, prostorsko in časovno neomejeno prenašam pravico shranitve avtorskega dela v elektronski obliki, pravico reproduciranja ter pravico ponuditi zaključno delo javnosti na svetovnem spletu preko DKUM; sem seznanjen/a, da bodo dela deponirana/objavljena v DKUM dostopna široki javnosti pod pogoji licence Creative Commons BY‐NC‐ND, kar vključuje tudi avtomatizirano indeksiranje preko spleta in obdelavo besedil za potrebe tekstovnega in podatkovnega rudarjenja in ekstrakcije znanja iz vsebin; uporabnikom se dovoli reproduciranje brez predelave avtorskega dela, distribuiranje, dajanje v najem in priobčitev javnosti samega izvirnega avtorskega dela, in sicer pod pogojem, da navedejo avtorja in da ne gre za komercialno uporabo; dovoljujem objavo svojih osebnih podatkov, ki so navedeni v zaključnem delu in tej izjavi, skupaj z objavo zaključnega dela;</s>
<s>Eikosanoidi su metaboliti arahidonske kiseline.</s><s>Između njih prostaglandini i leukotrieni imaju najvažnije biološke učinke i uloge u organizmu.</s><s>Jedna od tih uloga je kontrakcija/relaksacija glatkih mišića respiratornog sustava.</s><s>Tako je dereguliranjem produkcije eikosanoida moguća bronhokonstrikcija kod astme.</s><s>U ovom radu usredotočujemo se na ovisnost sile glatkih mišića različitih tkiva iz različitih subjekata, čovjeka i životinja o različitim vrstama eikosanoida.</s><s>Opisat ćemo mehanizme nastanka eikosanoida, receptore preko kojih oni djeluju te njihovu funkciju.</s>
<s>Analizirali smo mjerenja kontrakcije i relaksacije glatkih mišića dišnih putova pod utjecajem različitih eikosanoida.</s><s>Među ljudskim tkivima analizirane su sile razvijene u glatkim mišićima bronha, malih dišnih puteva te plućnog parenhima.</s><s>Kod životinjskog modela uzeti su uzorci tkiva glatkih mišića s dušnika miša te zamorca.</s><s>Digitalizacijom mjerenja obradili smo podatke iz različitih znanstvenih članaka.</s><s>Koristeći računalni program Origin 8.5 s alatom Digitizer, digitalizirali smo ovisnosti dišnih putova glatkih mišića različitih organizama o koncentracijama eikosanoida i drugih kontraktilnih agonista te odredili parametre tih ovisnosti prilagođavanjem različitih odabranih matematičkih funkcija (različiti oblici Hill funkcije).</s><s>Napravili smo usporedbu parametara između različitih organizama i između mjerenja različitih autora.</s><s>Nadalje, usporedili smo jačine eikosanoidne kontrakcije s drugim fiziološkim kontraktilnim agonistima i na kraju objasnili je li moguće prenijeti podatke izmjerene na životinjama u fizikalno-matematičke modele, koji simuliraju procese kod ljudi.</s><s>Ključne riječi: prostaglandini, leukotrieni, arahidonska kiselina, bronhokonstrikcija, digitalizacija.</s>
<s>Eikozanoidi so bili odkriti v obliki prostaglandinov (PG) v tridesetih letih prejšnjega stoletja.</s><s>So metaboliti arahidonske kisline (AA), ki je večkrat nenasičena dolgoverižna maščobna kislina z dvajsetimi atomi ogljika (Jakiela, 2013).</s><s>Prisotni so v živalskem in rastlinskem svetu.</s><s>Gre za zelo veliko biološko družino s širokim naborom bioloških učinkov.</s>
<s>Ločimo 4 možne biosintetske poti metabolizma AA.</s><s>Dve najpomembnejši poti sta ciklooksigenazna pot, po kateri se tvorijo prostanoidi, med katere prištevamo tri prostaglandine (PG), prostaciklin (PGI2) in tromboksan (TXA2), ter lipoksigenazna pot, po kateri nastajajo levkotrieni (LT), lipoksini (Lx) in hidroksitetraenojske kisline (HETE) (Vane, et al., 2002).</s><s>Poleg teh so produkti metabolizma AA še eoksini (Pr) in trioksilini (TRX), ki nastajajo po anandaminski poti in s pomočjo citokroma P450 Nesteroidni antirevmatiki oz. nesteroidna protivnetna zdravila (angl. non-steroidal anti-inflammatory drugs; NSAID) znižujejo sintezo prostanoidov preko inhibicije encimov COX-1 in COX-2 in imajo pomembno vlogo pri kontrakciji oziroma relaksaciji gladkih mišičnih celic predvsem dihalnih poti.</s><s>PG so skupina ciklopentatskih maščobnih kislin z dvajsetimi atomi ogljika.</s><s>Najdemo jih v skoraj katerem koli sistemu tkiva in organov.</s><s>Med PG uvrščamo PGE2, PGI2, PGE2 v največji meri nastaja v ledvicah in se veže na receptorje EP1, EP2, EP3, EP4.</s><s>Ima funkcijo povečevanja števila makrofagov, vazokonstrikcije, bronhodilatacije, krčenja maternice in sproščanja nevrotransmiterjev (Hanna, & Hafez, 2018).</s><s>PGI2 nastaja pretežno v epitelijskih celicah srca in žil ter se veže na receptor IP, preko katerega zavira agregacijo trombocitov in uravnava delovanje tumorskega faktorja PGF2α nastaja pretežno v reproduktivnem sistemu in se veže na receptor FP.</s><s>Povzroča vazokonstrikcijo, krčenje bronhijev in krčenje materničnih gladkih mišic.</s><s>PGD2 nastaja predvsem v celicah osrednjega živčnega sistema in možganov in se veže na receptorje DP1, CRTH2 in ima funkcijo pri vazodilataciji, zorenju mastocitov in zorenju bazofilcev in eozinofilcev.</s>
<s>Vsi prostanoidi nastajajo v vseh celicah našega organizma, saj metabolizem arahidonske kisline poteka v prav vsaki celici.</s><s>Količina proizvedene posamezne vrste prostanoidov pa je odvisna od lokalne ekspresije genov za encime, ki so specifični za proizvodnjo posamezne vrste prostanoidov.</s><s>Eden izmed glavnih in ključnih virov prostanoidov pa so levkociti, še posebej pa mastociti in eozinofilci, ter makrofagi.</s><s>Učinkovanje vseh eikozanoidov je podobno učinkovanju hormonov, je deloma parakrino in deloma avtokrino, pri čemer je dolgoživost eikozanoidov v krvnem obtoku in intersticiju veliko krajša kot pri hormonih, saj se eikozanoidi hitro metabolizirajo dalje do biološko neučinkovitih oblik.</s><s>Med levkotriene (LT) prištevamo tri cisteinil (cis) levkotriene (LTC4, LTD4 in LTE4) in LTB4, ki ima drugačne funkcije.</s><s>CisLT so najmočnejši bronhokonstriktorji pri ljudeh in imajo ključno vlogo pri astmatični obstrukciji dihalnih poti.</s><s>Po drugi strani lahko cisLT povečajo proizvodnjo sluzi in povzročajo lokalni edem, kar je značilen znak vnetja.</s>
<s>Glavni namen naloge je bil pridobiti parametre za matematični opis odvisnosti razvite sile od koncentracije eikozanoidov, ki sprožajo kontrakcijo oziroma relaksacijo v gladkih mišičnih celicah dihalnih poti.</s><s>V ta namen smo s programskim orodjem Digitizer Tool v programu Origin 8.5 digitalizirali odvisnosti sil v gladkih mišicah dihalnih poteh različnih organizmov od koncentracij eikozanoidov in drugih kontraktilnih agonistov in s pomočjo prilagajanj matematičnih funkcij (različne oblike Hillovih funkcij, ki sta predstavljeni v enačbah (1) in (2)) določali pramatere teh odvisnosti.</s><s>Pri človeku smo analizirali meritve, izvedene na gladki mišičnini iz bronhov, velikih dihalnih poti in pljučnega parenhima.</s><s>Pri živalih smo analizirali meritve, izvedene na gladki mišičnini iz sapnika miši in morskih prašičkov.</s><s>Na koncu smo izvedli primerjavo teh parametrov med različnimi organizmi in med meritvami različnih avtorjev.</s><s>Na podlagi teh informacij smo ocenili jakost kontraktilnih in relaksacijskih eikozanoidov.</s><s>Iz primerjave parametrov meritev, ki so bile opravljene na človeku in na živalih, pa smo ugotavljali, ali se rezultati med seboj razlikujejo in ali je mogoč prenos podatkov v fizikalno-matematične modele, ki simulirajo kontraktilne/relaksacijske učinke eikozanoidov.</s><s>Parametri razvite sile v odvisnosti od koncentracij cisteinil levkotrienov LTC4 in LTD4 so za gladko mišično tkivo iz sapnika človeka in iz bronhov morskega prašička zelo podobni, zato lahko trdimo, da se rezultati poskusov na živalskih modelih morskega prašička lahko vzporejajo s poskusi na človeškem tkivu.</s><s>Do večjih razlik prihaja pri LTE4, na katerega je gladko mišično tkivo iz bronhov morskih prašičkov mnogo bolj občutljivo kot človeško tkivo iz sapnika.</s><s>Razlika v konstanti polovične zasičenosti je cel velikostni razred.</s><s>Maksimalnih vrednosti razvitih sil med različnimi tkivi ni mogoče natančno primerjati, saj so bili za določitev referenčne maksimalne sile uporabljeni različni agonisti z različnimi koncentracijami.</s><s>Nakloni prilagojenih Hillovih funkcij so primerljivi.</s>
<s>Analiza odvisnosti sile od koncentracij LTC4 in LTD4 v človeškem pljučnem parenhimu (HLP) kaže, da je to tkivo bistveno bolj občutljivo na LTD4 kot na LTC4.</s><s>Konstanta polovične zasičenosti je namreč pri LTD4 za cel velikostni razred manjša.</s><s>Pod vplivom LTD4 se razvije tudi pribl. dvakrat višja maksimalna sila kot pri LTC4.</s><s>To je presenetljivo, saj velja na splošno, da sta kontraktilna učinka LTC4 in LTD4 primerljiva.</s><s>O tem pričajo eksperimenti, izvedeni na človeških bronhih.</s><s>Od prostaglandinov imata kontraktilni učinek PGD2 in PGF2α.</s><s>Poskusi, izvedeni na gladkih mišicah bronhov kažejo, da je to tkivo bolj senzitivno na PGF2α kot na PGD2.</s><s>Pod vplivom PGF2α se razvije tudi pribl. dvakrat višja maksimalna sila kot pod vplivom PGD2.</s><s>Primerjava med človeškima tkivoma bronhov in parenhima kaže, da je parenhim za velikostni razred bolj občutljiv na PGD2 kot bronhi.</s><s>Za PGF2α primerjave ni bilo mogoče izvesti.</s>
<s>Primerjava odziva človeških bronhov na kontraktilne prostaglandine (PGD2 in PGF2α) in cisteinil levkotriene (LTC4, LTD4 in LTE4) kaže, da so maksimalne razvite sile in nakloni odzivov dokaj primerljivi, največja razlika pa je v senzitivnosti kontraktilnega odziva, saj pride do razvoja polovične maksimalne sile v primeru cisteinil levkotrienov pri od 100 do 1000 -krat nižji koncentraciji kot pri prostaglandinih.</s><s>Zato citeinil levkotrienom pripisujemo veliko večjo vlogo pri kontrakciji dihalnih poti.</s><s>Podobno velja, če primerjamo senzitivnost kontraktilnega odziva cisteinil levkotrienov in histamina.</s><s>Do razvoja polovične maksimalne sile v primeru cisteinil levkotrienov pride pri od 1000 do 10000 -krat nižji koncentraciji kot pri histaminu, odziv na supramaksimalne koncentracije pa je podoben.</s><s>Izmed vseh eikozanoidov povzroča najmočnejšo relaksacijo gladkih mišic dihalnih poti PGE2.</s><s>Analizirali smo meritve relaksacijskih učinkov PGE2, pri čemer je bila sila predhodno razvita z različnimi kontraktilnimi agonisti – acetilholinom ali histaminom.</s><s>Analizirali smo tkivo sapnika miši, tkivo majhnih dihalnih poti človeka in tkivo sapnika morskih prašičkov.</s><s>Analiza meritev je pokazala, da je senzitivnost relaksacije v vseh primerih približno enaka, saj koncentracija PGE2, ki privede do zmanjšanja sile meritve najbolj razlikujejo, pa je vrednost sile, ki se razvije pri zelo veliki koncentraciji PGE2 (Fend).</s><s>Najnižja vrednost, ki je celo negativna, je bila dosežena pri sapniku malih dihalnih poteh človeka pa +40,6 %.</s><s>Razlog za tako velike razlike bi lahko bila različna izraženost receptorjev EP2 in EP4 za PGE2 v različnih tkivih, preko katerih deluje PGE2 relaksacijsko, vendar z drugačnimi karakteristikami.</s><s>Zmanjšan relaksacijski učinek PGE2, ki so ga zaznali v gladkih mišicah majhnih dihalnih poti človeka pri visokih koncentracijah PGE2, pa je najverjetneje posledica delovanja in vezave PGE2 na receptor TP (receptor za tromboksane), kar pa pri visokih koncentracijah lahko sproži kontraktilni odziv.</s><s>Združitev relaksacijskega učinka z večjo senzitivnostjo in kontraktilnega učinka z manjšo senzitivnostjo bi tako lahko rezultirala obliko relaksacijskega odziva, ki se zasiči pri nekaj deset procentih maksimalne kontrakcije pri visokih koncentracijah PGE2.</s><s>Glavni zaključek omenjenih analiz je, da obstajajo določene skupne lastnosti in podobnosti v kontraktilnih in relaksacijskih odzivih tkiv živali in človeka, a da je pretirano enačenje učinkov nevarno, še posebej ko se meritve nadalje uporabljajo v kvantitativnih analizah v matematičnih modelih, kjer se napovedujejo učinki zdravilnih učinkovin na produkcijo eikozanoidov in na njihove nadaljnje učinke v smislu bronhokonstrikcije/bronhodilatacije.</s><s>Prav tako obstajajo velike razlike med različnimi tkivi iz dihalnih poti (pljučni parenhim, sapnik, bronhi), ki so izvzeta iz VII</s>
<s>uravnavata agregacijo trombocitov. enakih organizmov (npr. človeka).</s><s>Na podlagi teh ugotovitev podajamo predlog, da se naj za nadaljnjo uporabo v matematičnih modelih uporabljajo odvisnosti sil, ki so specifične za organizem in za tip tkiva, ki se simulira v organizmu.</s><s>Ključne besede: prostaglandini, levkotrieni, arahidonska kislina, bronhokonstrikcija, digitalizacija.</s>
<s>5.8.1 Utjecaj nesteroidnih protuupalnih lijekova na kontrakciju glatkih 5.9 Analiza mjerenja kontrakcije/relaksacije glatkih mišićnih dišnih puteva u ovisnosti od biološki aktivnih eikosanoida 7 Zaključak</s>
<s>Slika 6. Shematski prikaz procesa stimulacije agonista i posljedične kontrakcije Slika 7. Shematski prikaz vezanja PG na receptore te njihov utjecaj na kontrakciju i Slika 8. Shematski prikaz kontrakcije i relaksacije vas deferensa uzrokovane PG-om.</s>
<s>Slika 15.</s><s>Rezultati mjerenja ovisnosti sile kontrakcije za agoniste LTC4, LTD4, LTE4 kod dušnika zamoraca (simboli) i mjerenja prilagođena Hillovoj funkciji Slika 16.</s><s>Rezultati ovisnosti sile kontrakcije za agoniste LTC4, LTD4, LTE4 kod ljudi – bronhi (simboli) i mjerenja prilagođena Hillovoj funkciji (krivulje). .......43 Slika 17.</s><s>Usporedba ovisnosti sile i koncentracije agonista kod humanog i animalnog tkiva kroz mjerenja prilagođena Hillovoj funkciji gdje crne krivulje Slika 18.</s><s>Rezultati kontrakcije HLP-a – odnos sile uzrokovane različitim Slika 19.</s><s>Rezultati kontrakcije HLP-a uzrokovane različitim koncentracijama agonista Slika 20.</s><s>Odnos sile kontrakcije izazvane različitim koncentracijama agonista PGD2 i Slika 21.</s><s>Omjer sile razvijen u glatkim mišićima dušnika divljeg miša pod utjecajem 10 µM Ach i istodobne prisutnosti različitih koncentracija relaksacijskog Slika 22.</s><s>Odnos sile, razvijene pod utjecajem 1 µM histamina i u prisutnosti različitih koncentracija relaksacijskog agonista PGE2.</s><s>Slika 23.</s><s>Odnos sile, razvijene pod utjecajem 50 µM histamina i u prisutnosti različitih koncentracija relaksacijskog agonista PGE2.</s><s>Slika 24.</s><s>Odnos kontrakcijske sile u ovisnosti o koncentraciji histamina u intervalu od 2 × 10-8 do 10-3 mol/L pod utjecajem različitih vrijednosti koncentracija XII</s>
<s>Tablica 3. CYP450 – ligandi, glavna mjesta proizvodnje, njihovi srodni receptori te Tablica 4. Prenošenje signala između receptora i PG Tablica 5. Prostanoidi – ligandi, glavna mjesta proizvodnje, njihovi srodni receptori te Tablica 6. Biološki učinci LT – agonisti, receptori i njihova efektorna funkcija Tablica 7. Parametri Hillove funkcije, prilagođene ovisnosti razvijene sile mišića uzrokovane leukotrienima kod dušnika zamoraca i bronha ljudi.</s><s>Tablica 8. Parametri Hillove funkcije, prilagođene ovisnosti kontrakcije mišića uzrokovane leukotrienima LTD4 i LTC4 kod ljudi.</s><s>Tablica 9. Rezultati Hillove funkcije, prilagođene ovisnosti kontrakcije HLP-a uzrokovane s PGD2.</s>
<s>Tablica 10.</s><s>Parametri Hillove funkcije prilagođene ovisnosti kontrakcije mišića Tablica 11.</s><s>Rezultati Hill1 funkcije, prilagođene ovisnosti relaksacije glatkih mišića Tablica 12.</s><s>Rezultati Hill1 funkcije, prilagođene ovisnosti relaksacije mišića uzrokovane PGE2.</s>
<s>Tablica 14.</s><s>Parametri Hill1 funkcije, prilagođene ovisnosti relaksacije mišića uzrokovane različitim koncentracijama histamina uz dodatak različitih Tablica 15.</s><s>Parametri Hill1 funkcije (slika nije pokazana), prilagođene ovisnosti relaksacije glatkih mišića uzrokovane PGE2, pod utjecajem 1000 µM Tablica 16.</s><s>Usporedba parametara funkcije Hill1 za PGE2 pri različitim jedinkama.</s>
<s>FEV1 Forsirani ekspiratorni volumen zraka izdahnut u prvoj sekundi HETE Hidroksi-eikosatetraenoiska kiselina HPETE Hidroperoksi-eikozatetraenoiska kiselina Leukotrieni</s>
<s>Eikosanoidi su otkriveni u obliku prostaglandina (PG) tijekom tridesetih godina 20. stoljeća.</s><s>Eikosanoidi su oksigenirani produkti polinezasićenih dugolančanih masnih kiselina, odnosno metaboliti arahidonske kiseline (AA), koja je polinezasićena ω6 masna kiselina s dvadeset ugljikovih atoma.</s><s>Oni su prisutni u životinjskom i biljnom svijetu.</s><s>To je vrlo velika biološka obitelj sa širokim spektrom bioloških učinaka.</s><s>Arahidonati i druge C20 polinezasićene kiseline djeluju kao prekursori za sintezu eikosanoida.</s><s>Degradacija AA u stanici ima dva različita puta: put ciklooksigenaze i put lipoksigenaze.</s>
<s>Metaboliti AA su leukotrieni (LT), prostanoidi, hidroksieikosatetraenoiska (HETE) kiselina, lipoksini (Lx), eoksini (Pr) i trioksilini (TRX).</s><s>Oni igraju važnu ulogu u doživljaju boli, pri povišenoj temperaturi, kontrakciji glatkih mišića i upalnih bolesti poput astme i artritisa.</s><s>Uglavnom djeluju slično kao lokalni hormoni putem receptora povezanih s G-proteinima.</s><s>Biosinteza pojedinih eikosanoida može se potaknuti specifičnim citokinima, faktorima rasta i mnogim drugim stimulansima.</s><s>Tipični učinak vezanja eikosanoida u ciljanim stanicama je inicijacija unutarstaničnih signalnih puteva što može dovesti do promjena u koncentraciji intracelularnog kalcija (Ca2+) ili induciranju stvaranja unutarstaničnog cikličkog adenozin-monofosfata Razlikujemo četiri moguća biosintetska puta mobilizirane AA.</s><s>Dva najvažnija puta su put ciklooksigenaze, gdje se stvaraju PG, prostaciklin (PGI2) i tromboksan (TXA2) putem COX enzima, te put lipoksigenaze, gdje se stvaraju LT i LX kroz LOX enzim.</s><s>Ostatak se ostvaruje preko epoksi gena Citokroma P450 (CYP450) i izoeikozanoidnog Eikosanoidi imaju kratkotrajno vrijeme eliminacije i ponašaju se kao lokalni hormoni s autokrinim i parakrinim učincima.</s><s>Djelovanje se postiže vezanjem na receptore stanične površine, a farmakološki učinak ovisi o gustoći i tipu receptora te vrsti stanice na koju djeluju.</s>
<s>Otkriveni su brojni receptori (DP1, EP1-4, FPA, B, IP...) koji su uglavnom povezani s G-proteinima, a ovisno o vrsti G-proteina, mogući intracelularni učinci su povećanje cAMP-a, cAMP redukcije, aktivacija fosfolipaze ili povećanja razine intracelularnog Tablica 1. Tipovi receptora i uloga eikosanoida Receptor</s>
<s>PGI i TXA2 djeluju na glatke mišiće (krvne žile, gastrointestinalni sustav, respiratorni trakt), trombocite, bubrege, reproduktivne organe, središnji živčani sustav, metabolizam kostiju, oči i, naravno, upale i imunosti.</s><s>Oni također igraju ulogu u nastanku i razvoju neoplazmi.</s><s>U Tablici 1. možemo vidjeti tipove receptora preko kojih djeluju eikosanoidi te su također navedene neke njihove funkcije.</s><s>Kasnije ćemo navedene podatke detaljno opisati u radu.</s><s>Magistarski rad će se velikim dijelom baviti objašnjavanjem utjecaja eikosanoida na kontrakciju i relaksaciju glatkih mišića dišnog sustava.</s><s>Također, usmjeravat ćemo se na objašnjavanje razvoja sile potrebne za kontrakciju i relaksaciju mišića.</s><s>Obradit ćemo čim više postojećih teoretskih radova te matematičkim modelom analizirati razvoj sile kod kontrakcije i relaksacije mišića pri različitim jedinkama.</s><s>Nadalje, objasnit ćemo i povezanost između eikosanoida i razvoja određenih patoloških stanja.</s>
<s>Glavna svrha završnog rada je dobivanje parametara za matematički opis ovisnosti razvijene sile o koncentraciji eikosanoida koji induciraju kontrakciju ili relaksaciju u tkivima glatkih mišića dišnih putova u prisutnosti i odsutnosti aktivnih tvari.</s><s>Na temelju ovih informacija, procjenjivat će se jačina kontraktilnih i relaksacijskih agonista.</s>
<s>Također, svrha ove analize je provjeriti mogu li se podaci izmjereni na životinjama prenijeti na fizikalno-matematičke modele koji simuliraju procese u čovjeku.</s><s>Na životinjama je provedeno mnogo više testiranja, koja su se izvodila sistematično, što olakšava dobivanje informacija o fizikalno-kemijskim ovisnostima koje se zatim koriste u simulaciji procesa kod ljudi.</s>
<s>agonistima utvrditi razlikuju li se parametri matematičkih ovisnosti (funkcija), koje su prilagođene izmjerenim ovisnostima sile, razvijene pod utjecajem različitih eikosanoida kontraktilnih i relaksacijskih agonista te u različitim tkivima – ljudi i životinja</s>
<s>agonistima utvrditi je li moguće prenijeti podatke izmjerene na životinjama u fizikalnomatematičke modele koji simuliraju procese kod ljudi.</s><s>3 Istraživačka pitanja</s>
<s>Tijekom magistarskog rada pokušat ćemo odgovoriti na sljedeća pitanja: Kakve su matematičke ovisnosti razvijene sile u glatkim mišićima dišnih puteva različitih tkiva ljudi i životinja o koncentracijama različitih kontraktilnih i relaksacijsih eikosanoida?</s>
<s>Kakva je usporedba eikosanoida po jačini kontrakcije glatkih mišića i senzitivnosti razvijene sile te kakva je njihova usporedba s ostalim fiziološkim kontraktilnim agonistima?</s>
<s>U kolikoj mjeri se između sebe razlikuju parametri razvijenih sila pod utjecajem kontraktilnih i relaksacijskih eikosaonida u različitim tkivima dišnih puteva kod čovjeka?</s>
<s>U kolikoj mjeri se između sebe razlikuju parametri razvijenih sila pod utjecajem kontraktilnih i relaksacijskih eikosanoida u tkivima čovjeka i životinja?</s><s>4 Istraživačka metodologija</s>
<s>Metodologija istraživanja odnosit će se na potragu i proučavanje stranih izvora literature koja će se baviti osnovnim mehanizmima razumijevanja utjecaja eikosanoida na kontrakciju i opuštanje glatkih mišića dišnih putova te na analizu izmjerenih vrijednosti u smislu prilagođavanja matematičkih ovisnosti izmjerenim vrijednostima i određivanja parametara tih ovisnosti.</s>
<s>slijediti sljedeće ciljeve: kratak opis procesa metabolizma AA u eikosanoide prikupljanje i ekstrakcija podataka o učincima eikosanoida na molekularnoj, staničnoj i fiziološkoj razini</s>
<s>slijediti sljedeće ciljeve: prikupljanje i ekstrakcija informacija o receptorima i poznatim signalnim putovima koji vode do kontrakcije ili relaksacije glatkih mišića dišnih putova prikupljanje i ekstrakcija informacija o drugim kontraktilnim agonistima glatkih mišića dišnih putova uključenima u patofiziologiju astme prikupljanje i ekstrahiranje podataka o tome koji postojeći lijekovi i aktivne tvari koji se testiraju utječu na procese razvoja sila ovisnih o eikosanoidima prikupljanje i ekstrakcija podataka o mjerenjima sile u glatkim mišićima dišnih putova u ovisnosti o koncentraciji eikosanoida i drugih fizioloških kontraktilnih agonista kod ljudi i životinja.</s>
<s>Pomoću alata za digitalizaciju Origin 8.5 digitalizirat ćemo ovisnosti glatkih mišića dišnih putova različitih organizama o koncentracijama eikosanoida i drugih kontraktilnih agonista.</s><s>Nadalje, prilagođavanjem različitih odabranih matematičkih funkcija (različiti oblici Hillovih funkcija) utvrdit ćemo parametre tih ovisnosti u programu Origin 8.5.</s>
<s>Za oblikovanje teorijskog okvira korištena je deskriptivna metoda rada.</s><s>Napravili smo osnovni pregled relevantnih znanstvenih i stručnih resursa koji se adekvatno bave ovom temom.</s><s>Podaci za teorijski dio magistarskog rada dobiveni su izučavanjem domaće i inozemne stručne i znanstvene literature.</s><s>S pretraživačem smo postavili strategiju pretraživanja (Tablica 2) koja se temelji na istraživačkim temama, ključnim riječima, sinonimima i logičnim operatorima (AND ili OR).</s><s>Pretraživanje je provedeno pomoću ključnih riječi na engleskom jeziku kao što su: „Effects of LTD4 AND human airway smooth muscle cell“, „prostaglandins AND smooth muscle cell relaxation“.</s><s>Nakon postavljanja niza pretraživanja sa sinonimima, pretražena je literatura u sljedećim bibliografskim bazama podataka: PubMed, Web of Science, NCBI i ScienceDirect.</s><s>Korišteni su pregledni članci te smo osim toga uključili i druge monografske izvore vezane za temu istraživanja.</s><s>Čitali smo cijele tekstove i prema kriterijima za uključivanje uklonili smo ili uključili literaturu.</s><s>Tablica 2. Strategija pretraživanja literature Kriteriji za uključivanje</s>
<s>Pluća imaju svoje odjeljke za biosintezu eikosanoida.</s><s>Dišni epitel proizvodi i oslobađa eikosanoide u polariziranom uzorku.</s><s>PG-i se pasivno prenose na luminalnu površinu, dok se HETE otpuštaju na bazolateralnoj površini (Jakiela, 2013).</s><s>Poremećaji dišnog sustava popraćeni su poremećajem čvrstih veza epitela i povećanim paracelularnim protjecanjem ili, u konačnici, povećanim ljuštenjem epitelnih stanica uz proliferaciju epitelnih progenitora.</s><s>To se može odraziti i na promjene u lokalnoj koncentraciji eikosanoida.</s><s>Tijekom proliferacije epitelnih stanica povećava se aktivnost COX-2; međutim, ona postaje smanjena u potpuno diferenciranom mukocilijarnom epitelu.</s><s>Pod uvjetima Th2 tipa koji oponašaju interleukin (IL) -4 i IL13, uočena je moćna indukcija 15-HETE aktivnosti dok je 5-LOX prisutan u diferenciranim stanicama.</s>
<s>Th2 tipovi citokina također inhibiraju produkciju PGE2; međutim, ekspresija COX-1 se ne mijenja dok koncentracija transkripcije COX-2 raste.</s><s>Dakle, respiratorni epitel ima i aktivnost obje ciklooksigenaze.</s><s>Međutim, eikosanoidi su također proizvedeni u drugim strukturnim stanicama dišnog trakta.</s><s>Kod bronhijalnih fibroblasta izražen je COX-1 i imaju sposobnost induciranja COX-2.</s><s>Stanice glatkih mišića dišnih puteva također izražavaju sposobnost sinteze prostanoida i aktivno pridonose regulaciji epitelnih stanica koje proizvode PGE2.</s><s>Upalne stanice kao što su eozinofili, makrofazi i neutrofili koji infiltriraju pluća, važan su izvor eikosanoida koji izražavaju aktivni metabolički put biosinteze eikosanoida (Jakiela, 2013).</s><s>Mnoge studije pokazale su da eikosanoidi imaju važnu ulogu kod upalnih procesa.</s><s>Recimo, PGE2 doprinosi redukciji upalnih procesa kod nastanka astme.</s><s>Eozinofili su imunološke stanice koje dovode do upalnih procesa te ih svrstavamo među jedne od medijatora upale koji utječu na kontrakciju glatkih mišića dišnih sustava.</s><s>Ako dođe do promjene broja eozinofila za vrijeme infekcije, odnosno upale, dolazi do jačih i težih simptoma oboljenja.</s>
<s>Postoje tri vrste mišićnog tkiva: poprečno-prugasto, glatko te srčano mišićno tkivo.</s><s>U respiratornim putevima nalazi se glatko mišićno tkivo koje se razlikuje od ostalih jer su izgrađena s mnogo manjim vlaknima (1 – 5 μm).</s><s>Možemo ga pronaći u dušniku (lat. trachea), krvnim žilama, crijevima, mokraćnom mjehuru, miometriju, koži i mišićima oka.</s><s>Glatka mišićna vlakna specijalizirana su za slabe, spore a dugotrajne kontrakcije i inervirana su autonomnim živčanim sustavom (Guyton & Hall, 2012).</s><s>Kontrakcija glatkih mišića je prouzročena putem pomaka miozinskih i aktinskih filamenata jednih preko drugih.</s><s>Energija potrebna za navedeni pomak filamenata je omogućena hidrolizom adenozin-trifofata (ATP) koja se odvija na glavama miozina.</s><s>Glave iz miozinskih filamenata se pričvršćuju i ulaze u interakciju s aktinskim filamentima kako bi stvorile križanja (engl. crossbridges) te, naposljetku, započele ciklus.</s><s>Ciklus križanja uzrokuje pokretanje aktina i miozina što dovodi do kontrakcije glatkih mišića.</s><s>Sila koja se razvija aktivnim procesom križanja može se postići i pasivnim križanjem u primjeru defosforiliranog miozina koji je pripet na aktin.</s><s>To stanje nazivamo zaustavni mostići (engl. latch bridges).</s><s>U tom procesu miozinski laki lanci su defosforilirani što istovremeno mišiće može dovesti u stanje relaksacije.</s><s>Ipak, glatki mišići imaju sposobnost održavanja sile i u toj situaciji zbog zaustavnih mostića.</s><s>Na Slici 1. su prikazane sve tri vrste mišićnog tkiva: poprečno-prugasto, glatko mišićno tkivo te srčano mišićno tkivo.</s>
<s>AA je hidrofobna molekula proizvedena hidrolizom membranskih fosfolipida i tretira se kao prekursor eikosanoida.</s><s>Sintetizira se od linolne kiseline koja je esencijalna omega-6 nezasićena masna kiselina.</s><s>Linolna kiselina je polinezasićena masna kiselina koja se koristi u biosintezi AA, a time i nekih PG, LT i TXA.</s><s>Desaturacijom linolna kiselina se pretvara u γ-linolnu kiselinu, zatim u dihomo-γ-linolnu kiselinu (DGLA) te na njen lanac od 20 ugljikovih atoma s četiri dvostruke veze dok se ω-6 odnosi na položaj prve dvostruke veze od posljednjeg, omega-ugljikovog atoma.</s><s>AA ima prosječnu masu od 304.467 g/mol.</s><s>Zbog prisutnosti svojih četiriju dvostrukih veza u cis-položaju (što znači da su svi vodikovi atomi na istoj strani dvostrukih veza), spoj ima određeni stupanj fleksibilnosti za interakciju s proteinima.</s><s>Čak i pri niskoj temperaturi pomaže u održavanju fluidnosti staničnih membrana.</s><s>Četiri dvostruke veze također omogućuju interakciju s molekulama kisika što dovodi do bioaktivnih molekula uključujući eikosanoide i izoprostane putem enzimatskih i neenzimatskih mehanizama.</s>
<s>Kao što je već navedeno, AA je prirodno ugrađena u strukturne fosfolipide unutar stanične membrane ili je pohranjena u lipidnom korpusu imunoloških stanica.</s><s>U većem postotku nalazi se u mišićnim stanicama, mozgu, jetri, slezeni te retini odnosno mrežnici.</s><s>Razine AA u stanicama poput trombocita su, na primjer, oko 5 mM.</s><s>Nakon aktivacije AA taj se postotak kasnije može raspodijeliti između staničnog unosa i albuminskih proteina.</s>
<s>Na staničnoj razini postoje tri glavne obitelji enzima fosfolipaze koje mogu djelovati na fosfolipide kako bi se oslobodila esterificirana AA.</s><s>Fosfolipaza A2 (PLA2) posreduje hidrolizu sn-2 položaja na fosfolipidnom trupu te daje slobodnu molekulu AA izravno u jednom koraku.</s><s>Spomenuti sn-2 položaj označava poziciju esterne veze na fosfolipidnom trupu.</s><s>Djelovanje PLA2 se izvodi u jednom koraku dok je djelovanje fosfolipaze C (PLC) ili fosfolipaze D (PLD) složenije i reakcija se odvija u nekoliko koraka.</s><s>Otpuštena AA postaje supstrat jednog od četiriju enzima za sintezu eikosanoida.</s><s>Enzimi PLC i PLD također mogu generirati slobodnu AA – prikazano na Slici 3.</s>
<s>U dva uzastopna koraka, PLC enzim katalizira fosfolipide koji stvaraju AA kroz stvaranje diacilglicerola (DAG) djelovanjem diacilglicerol-lipaze i lipidnih produkata koji sadrže arahidonat djelovanjem lipida monoacilglicerola (Kano, et al., 2009).</s><s>Aktivnost PLD-a opisana je u biljkama, ali postoje dokazi o aktivnostima PLD-a u višim eukariotima kao što su ljudi.</s>
<s>Preuzeto i prerađeno od: Hanna & Hafez (2018) Slika 3. Mjesto hidrolize PLA, PLC i PLD te oslobađanje AA.</s><s>PLA2 posreduje u hidrolizi položaja sn -2 esterne veze na fosfolipidnoj strukturi čime se dobije slobodna AA.</s><s>PLA2 prekida kemijske veze i direktno oslobađa AA dok to PLC i PLD čine indirektno.</s><s>Kao što je već opisano, ekspresija i aktivacija enzima PLA2 može biti odgovor na širok raspon staničnih aktivacijskih signala ovisnih o receptorima koji zahtijevaju G povezani transduktivni protein kao što su „toll-like“ receptor 4 (TLR4) te purinergijski receptori.</s><s>Aktivacijski signali su stimulacija upale na kalcij-ionofore, melitin (pčelinji otrov) i tumorski agensi.</s><s>Tri su moguća ishoda za slobodnu i funkcionalnu AA: može se raspršiti drugim stanicama ako je slobodna u krvi, zatim se može ponovno uključiti u fosfolipide ili se može metabolizirati.</s><s>Slobodna AA u stanici ima važnu ulogu u staničnoj apoptozi jer njezina akumulacija koja nastaje kao posljedica inhibicije arahidonil CoA transferaze može potaknuti aktivaciju sfingomijelinaze, enzima koji potiče degradaciju sfingolipida (koji igraju važnu ulogu u regulaciji stanica i staničnom ciklusu) fosfokolina i ceramida.</s><s>Slobodna AA u stanici se može metabolizirati enzimatskim reakcijama te može proći kroz četiri vrste enzimskih puteva: COX, LOX, put CYP450 i anandamidne puteve.</s><s>Navedeni metabolički putevi opisat će se u nastavku teksta.</s><s>Iako eikosanoidi imaju kratko vrijeme poluživota, oni pridonose mnogim biološkim aktivnostima.</s>
<s>Oni imaju presudnu ulogu u reguliranju humoralne imunosti i intenziteta upale putem vezanja na G-protein povezane receptore koji se nalaze na drugim stanicama.</s><s>Prvo, kada su tkiva upaljena ili ozlijeđena, osim boli i edema, AA metaboliti pojačavaju upalne signale kako bi privukli leukocite, proinflamatorne citokine i imunološke stanice da pomognu u rezistenciji i čišćenju patogena.</s><s>Drugo, uravnotežuju inducirane upalne signale tako što proizvode razgradne metabolite kako bi djelovali kao zaštita domaćina jer upala djeluje ugrožavajuće ako se ne kontrolira na odgovarajući način (Dennis & Norris, 2015).</s><s>AA se u stanicama metabolizira putem enzima LOX na HETE i hidroperoksi eikozatetraenoisku kiselinu (HPETE) ili se pomoću dvije izoforme COX metabolizira u PGH2 putem kratkotrajnog intermedijera PGG2 koji sadrži hidroperoksil.</s><s>Nesteroidni protuupalni lijekovi blokiraju sintezu PGG2 (Slika 4.).</s><s>PGH2 spontano se preuređuje ili se enzimatski izomerizira, oksidira ili reducira kako bi se dobio biološki aktivni PG-izomer, od kojih su neki prikazani na Slici 4. Preuzeto i prerađeno od: Vane, et al. (2002) Slika 4. Metabolizam AA po liposigenaznom (LOX) i ciklooksigenaznom (COX) putu uz opisane enzime koji pretvaraju AA u konačne metabolite.</s><s>Sudbina arahidonske kiseline u stanicama kao što je metabolizirana lipoksigenazama u HETE i HPETE ili ciklooksigenazama PGH2 preko kratkotrajnog intermedijernog PGG2 koji sadrži hidroperoksil.</s><s>Protuupalni lijekovi (NSAID) blokiraju sintezu PGG2.</s><s>PGH2 se spontano reorganizira ili je enzimski izomeriziran, oksidiran ili reduciran kako bi se dobili bioaktivni izomeri prostaglandina, od kojih su neki prikazani 5.4 Metabolički putevi AA</s>
<s>Postoje dvije izoforme enzima COX ili takozvane PGH sintaze (PGHS) koje reagiraju na slobodnu AA i proizvode prostanoide.</s><s>Prostanoidi nastaju iz ukupnog prekurzora Prva izoforma enzima je COX-1 koji je konstitutivno izražen u svim tkivima, koji inducira akutnu upalu kao odgovor na kratku izloženost stimulaciji lipopolisaharida (LPS) i također usmjerava stanicu na promicanje ili suzbijanje biosinteze LTa (Naraba, COX-1 preferira povezivanje i kolokalizaciju na perinuklearnoj membrani ili ER, s TXA2 sintazom, PGF sintazom i još dva izoenzima PGD sintaze, stvarajući TXA2, PGF2α i PGD2.</s><s>Druga izoforma enzima, COX-2, inducirajuća je izoforma pronađena u makrofagima, bubregu i mozgu, a regulirana je upalnim stimulansima kao što su bakterijski endotoksini, citokini, hormoni i faktori rasta.</s><s>COX-2 preferira povezivanje s PGI sintazom i tri PGE sintaze (cPGES, mPGES-1 i mPGES-2) koje proizvode PGI2 i PGE2.</s><s>U mozgu i srcu otkrivena je nova izoforma, enzimatski aktivna, spajana varijanta COX-1, to je COX-3, iako njezinu funkciju tek treba razjasniti.</s><s>Obje ciklooksigenaze su strukturno slične, ali aktivno mjesto COX-2 odgovara velikim supstratima.</s><s>Kao rezultat supstitucije izoleucina za valin na položaju 523 obje uvode dvije O2 molekule u AA kako bi se formirao ciklički 9,11 endoperoksid, 15 hidroperoksid spoj.</s><s>Tako stvorena struktura, PGG2, je nestabilna molekula koja se brzo pretvara u PGH2 kroz reakciju ovisnu o glutataciji.</s><s>Daljnje enzimatske sintaze pridonose stvaranju prostaglandina (PGE2, PGD2, PGF2α), prostaciklina (PGI2) i tromboksana (TXA2, odnosno TXB2, koji je konačni i stabilni oblik), kao što je navedeno (Slika 4.), preko izomera PG sintaze.</s><s>Proizvodnja prostanoida ovisi o ekspresiji ovih enzima na mjestu upale.</s><s>Na primjer, trombociti čine prije svega TXA2, dok endotelne stanice generiraju PGI2, prema sadržaju enzima razmatranog tkiva.</s><s>5.4.2 Lipoksigenazni metabolički put</s>
<s>Enzimi lipoksigenaze (LOX) također djeluju na slobodni arahidonat.</s><s>U tom metaboličkom putu, oksigenacija se može odvijati na mnogim različitim položajima AA, na C-5, C-8, C-12 ili C-15, uvođenjem kisikova atoma kroz niz lipoksigenaznih enzima kisikom uvedenih na ugljikov atom, na primjer, 5-LOX, 8-LOX, 12-LOX itd.</s><s>Proizvodi koji su dobiveni iz LOX-a su HPETE (5-HPETE, 8-HPETE, 12-HPETE, 15-HPETE).</s><s>5-HPETE je odgovoran za proizvodnju LT i lipoksina (Chavis, et al., 2000).</s><s>Proizvodnja LT zahtijeva 5-LOX enzim kako bi se proizvela 5-hidroperoksi eikozatetraenoiska kiselina (5-HPETE) koja se pod utjecajem 5-LOX pretvori u LTA4.</s><s>Dva različita enzima djeluju na LTA4.</s><s>Jedan enzim je LTA4 hidrolaza (LTA4H) koja koristi molekule vode kako bi se dobio diol, LTB4.</s><s>LTB4 inducira upalu putem svojih kemotaktičkih i degranulacijskih djelovanja na polimorfonuklearne limfocite (PMN).</s><s>Drugi ezim je glutation S-transferaza odnosno LTC sintaza (LTC4S), enzim koji dodaje glutation LTA4 za generiranje prvog leukotriena (LTC4) između familije cisteinil-leukotriena (cisLT).</s><s>Daljnja konverzija LTC4 izvan stanice vodi u proizvodnju drugih dvaju cisteinil-leukotriena (LTD4 i LTE4).</s><s>BLT1 i BLT2 receptori mogu prepoznati LTB4 i mapirani su na 14q11.2 - q12 i na 14q12, respektivno.</s><s>CisLT1 i CisLT2 receptori mogu se vezati na peptidoleukotriene i ti receptori se nalaze na 5.4.3 Anandaminski metabolički put</s>
<s>Biosinteza anandamida odvija se kroz enzimatske puteve koji uključuju prisutnost visokih razina AA i etanolamina kao što možemo vidjeti na Slici 5. Dolazi do reverzibilne reakcije koja je katalizirana enzimom hidrolaze masne kiseline čiji je prirodni reaktant anandamid za proizvodnju AA i etanolamina.</s><s>U slučaju oštećenja tkiva, na primjer hepatektomije jetre, razine AA i etanolamina dramatično se povećavaju, što dovodi do preokretanja djelovanja hidrolaze masne kiseline da se dobije anandamid.</s><s>Poslije se ustanovilo da su ligandi za CB1 i CB2 (kanabinoidni receptor) odgovorni za regeneraciju jetre i proliferaciju stanica.</s><s>Biosinteza anandamida događa se kroz enzimatske puteve koji uključuju prisutnost visokih razina AA i etanolamina, katalizirane enzimom FAAH masne kiseline amidhidrolaze (Izzo & Deutsch, 2011).</s>
<s>Preuzeto i prerađeno od: Hanna & Hafez (2018) Slika 5. Sinteza anandamina.</s><s>Biosinteza anandamida odvija se putem enzimatskih putova koji uključuju prisutnost visokih razina AA i etanolamina, kataliziranih enzimom hidrolaze FAAH masnih kiselina.</s><s>Anandamid se smatra ligandom za CB1 i CB2 koji su odgovorni za regeneraciju jetre i staničnu proliferaciju 5.4.4 Metabolički put CYP450</s>
<s>CYP450 enzimi koji sadrže željezo izraženi su uglavnom u jetri i drugim tkivima te se koriste za uklanjanje toksina.</s><s>Metabolički put CYP450 sastoji se od dvaju enzima CYP450 epoksigenaze i ω hidroksilaze.</s><s>Derivati epoksida javljaju se umetanjem atoma kisika na ugljik vezan na jednu od dvostrukih veza AA pomoću enzima CYP450 epoksigenaze.</s><s>Proizvodi četiri regioizomera epoksikosatogenske kiseline (EET), 5autokrini i parakrini medijatori.</s><s>Reakcija hidroksiliranja wP450 hidroksilazom U Tablici 3. je vidljivo da EET i HETE nastaju u bubrezima te se vežu na receptore PPAR γ i α.</s><s>EET ima vazodilatatorsku funkciju, inhibira transport natrija i sudjeluje u angiogenezi, dok HETE ima vazokonstriktorsku funkciju.</s><s>Tablica 3. CYP450 – ligandi, glavna mjesta proizvodnje, njihovi srodni receptori te njihove funkcije</s>
<s>Postoje različiti receptori koji utječu na kontrakciju i relaksaciju glatkih mišića.</s><s>U ovom poglavlju opisat ćemo navedeno.</s><s>Tromboksani (Tx), PGI2, PGE2, PGF2α i PGD2 metaboliti se smatraju ligandima za TP, IP, EP, FP i DP receptore.</s><s>EP receptori dijele se u četiri različita podtipa koje označujemo kao EP1, EP2, EP3 i EP4.</s><s>Na navedene receptore veže se PGE2.</s><s>PGD2 se veže na DP i CRTH2 receptore.</s><s>Nadalje, PGF2α se veže na FP receptore te naposljetku se PGI2 veže na IP i TPα receptore.</s><s>EP1 receptori su lokalizirani u glatkim mišićnim stanicama dušnika kod zamoraca, kao i kod štakora, miševa te kod ljudi u plućnom tkivu.</s><s>U dišnim putevima, vaskularnim glatkim mišićima, epitelnim stanicama, mastocitima, alveolarnim makrofazima i kod osjetilnih živaca izražavaju se EP2 receptori.</s><s>Nadalje, EP3 receptori se distribuiraju u različitim organima i tkivima, uključujući epitelne stanice dišnih putova i glatkih mišića krvnih žila te postoje u tri alternativno odvojene izoforme.</s><s>Za EP4 receptore znamo da su lokalizirani na ljudskim alveolarnim makrofazima i glatkim mišićnim stanicama dišnog sustava (Clarke, et al., 2009).</s><s>Vezanje PGE2 na EP2, EP4, zatim PGI2 na IP, te PGD2 na DP1 receptore, koji su povezani s Gs skupinom proteina, aktivira AC, što vodi do povećanja intracelularne koncentracije cAMP.</s><s>Vezanje PGE2 na EP1 i PGF2α na FP, koji su povezani s Gproteinom aktivira metabolizam fosfatidilinozitola što dovodi do stvaranja inozitoltrisfosfata (IP3) koji mobilizira unutarstanični kalcij (Ca2+) iz ER odnosno SR.</s><s>Osim signalizirajući kroz Gq, FP receptor se spaja s malim G-proteinom rodopsinom (Rho) preko Gq nezavisnog mehanizma.</s><s>Gq protein sadrži podjedinicu Gqα koja je vezana za kompleks Gq-Gβγ.</s><s>Gqβγ se zatim disocira na svoje sastojke Gq i Gβγ koji djeluju na regulaciju staničnih signala.</s><s>Gq posebno potiče stanične signalne putove koji uključuju PLC, IP3 i mobilizaciju Ca2+ u stanici.</s><s>Vezanje TXA2 odnosno TXB2 na TP receptor aktivira dvije vrste G-proteina, Gq (Gq, Gll, G15, G16) i G13 (G12, G13) obitelji što rezultira aktivacijom PLC.</s><s>Osim toga, TP se također može aktivirati PLC-om preko Gh, kao i AC putem Gi i Gs.</s><s>Obje TP izoforme aktiviraju PLC, ali TPα stimulira AC dok ga TPβ inhibira.</s><s>EP3 izoforme mogu se povezati s Gi ili G12 koji vodi do povišenja unutarstaničnog Ca2+, inhibicije cAMP i aktivacije malog G-proteina iz obitelji Rho.</s><s>DP2 odnosno CRTH2 se spaja s Gi-tipom G proteina kako bi došlo do inhibicije sinteze cAMP i podizanja unutarstaničnog Ca2+.</s>
<s>Neki, ali ne i svi prostanoidni receptori pokazuju sposobnost dimeriziranja, što može promijeniti afinitet ili sklonost ligandnih signalnih putova.</s><s>Dakle, iako se DP1 / DP2 dimeri ne pojavljuju, pod sličnim uvjetima IP i TP receptori mogu se povezati u oblik homo- i heterodimera.</s>
<s>TPα-TPβ heterodimeri povećavaju odgovor na aktivaciju slobodnih radikala kataliziranih izoprostana.</s><s>Nadalje, dimerizacija IP i TPα omogućuje stvaranje cAMP kroz TP aktivaciju receptora.</s><s>Štoviše, aktivacija EP1 receptora pokazuje da moduliraju β2-adrenoreceptorsku funkciju bronhijalnih dišnih putova putem stvaranja heterodimernog kompleksa (Ricciotti & FitzGerald, 2011).</s><s>Svaki receptor je kodiran različitim genom, a neke su varijante i izoforme dobivene pomoću alternativnog spajanja eksona u njihovoj C-terminalnoj regiji nakon sedme transmembranske domene.</s>
<s>Zabilježena je kromosomska lokalizacija miša i ljudskih gena za prostanoidne receptore.</s><s>Geni koji kodiraju mišje DP, EP1, EP3, EP4, FP, IP i TP receptore mapirani IP i TP receptore mapirani su na kromosomske trake (19p13.1, 1p31.2, 5p13.1, 1p31.1, Prema transdukciji signala kroz receptore, koji su vezani G-proteinima, ti receptori se mogu svrstati u tri skupine: relaksantne receptore, kontraktilne receptore i inhibitorske receptore.</s><s>Prva skupina uključuje IP, DP, EP2 i EP4 receptore te relaksantne receptore koji povećavaju koncentraciju cAMP i induciraju relaksaciju glatkih mišića (Ushikubi, et al., 1995).</s><s>DP receptor također ima i kontraktilnu funkciju.</s><s>Navedeni receptor izražen u različitim stanicama dovodi do različitih učinaka.</s><s>Druga grupa obuhvaća TP, FP i EP1 receptore koji su kontraktilni receptori, koji posreduju Ca2+ mobilizaciju i izazivaju kontrakciju glatkih mišića.</s><s>Posljednja skupina uključuje EP3 receptor koji je inhibitorni receptor te kao takav sudjeluje pri smanjenju koncentracije cAMP i inhibira relaksaciju glatkih mišića.</s><s>Opisani proces sekundarnog prenošenja signala možemo grafički vidjeti u Tablici 4. Tablica 4. Prenošenje signala između receptora i PG RAZRED PODSKUPINA G SKUPINA PROTEINA SEKUNDARNI PRENOSIOCI SIGNALA PGE2</s>
<s>Preuzeto i prerađeno od: Ricciotti & FitzGerald (2011) 5.5.1 Uloga Ca2+ pri kontrakciji glatkih mišića Glatki mišići respiratornog sustava igraju važnu ulogu pri fiziologiji disanja.</s><s>Omogućuju protok zraka, preveniraju ulazak udahnutih otrovnih para i spojeva.</s><s>Do problema dolazi kada dišni putevi izazivaju patološku opstrukciju za protok zraka uslijed pretjerane kontrakcije mišića respiratornog sustava.</s><s>Do patološke kontrakcije dolazi uslijed aktiviranja specifičnih membranskih receptora ili indirektnim neuralnim putevima te otpuštanjem medijatora bronhokonstrikcije.</s><s>Kontrakcija mišića ovisi i o razini i učinkovitosti Ca2+. (Nuttle, et al., 1996).</s><s>Štoviše, kontraktilni agensi kao što je acetilkolin (ACh) induciraju regenerativna i propagirajuća Ca2+ osciliranja, čija funkcionalna uloga još nije u potpunosti shvaćena.</s><s>Pri kolinergičnoj stimulaciji s ACH dolazi do kontraktilnih agonističkih receptora povezanih s Gq-tipom G-proteina, odgovornog za aktivaciju b1 izoforme PLC (PLCb1), koja zatim hidrolizira fosfatidilinozitol 4,5-bisfosfat (PIP2) i tako proizvodi dva druga sekundarna prenosioca IP3 i DAG.</s><s>IP3 difuzijom prolazi kroz citosol i veže se na svoj specifični receptor (IP3R) koji se nalazi na SR-u, čime mobilizira IP3– osjetljivi „bazen“ intracelularno pohranjenog Ca2+ dok DAG aktivira proteinsku kinazu C (PKC), koja utječe na osjetljivost kontraktilnog aparata na Ca2+.</s><s>Brzo i prolazno povišenje koncentracije citosolnog Ca2+ induciranog s IP3 odgovorno je za uzastopnu popunjenost četiriju Ca2+ veznih mjesta kalmodulina (CaM).</s><s>Kompleks Ca2+-CaM zauzvrat otvara i aktivira enzimatsku domenu kinaze lanca miozina (MLCK) koja fosforilira specifični aminokiselinski ostatak (serin 19) regulatorne podjedinice miozina lakog lanca (MLC20).</s><s>MLCK je prekomjerno izražen u stanicama glatkog mišićnog tkiva respiratornog sustava astmatičnih pacijenata (Ma X et al., 2002).</s><s>Stimulacija β-adrenoceptora potakne proizvodnju cikličnog adenozinmonofosfata (cAMP) koja dovodi do aktivacije PKA.</s><s>Posljedično dolazi do fosforilacije MLCK čime se smanjuje afinitet vezanja Ca2+-CaM na MLCK i time se smanji aktivnost MLCK i kontrakcije glatkih mišića respiratornog sustava (engl.</s><s>Airway smooth muscle (ASM)).</s><s>MLC20 fosforilacija je doista neophodna za pokretanje cross-bridge ciklusa, tj. kretanje glava miozina duž aktinskih filamenata.</s><s>Uz IP3, oslobađanje Ca2+ iz SR je moguće putem Ca2+ samog koji aktivira rianodinske receptore (RyR).</s><s>Nadalje, Ca2+ može protjecati uzduž plazmatske membrane kroz kanale koji uključuju Ca2+ kanale tipa SOCC, ROCC i VOCC) (engl. store; receptor; voltage operated Ca2+ channels).</s><s>Aktivacija VOCC-a je, međutim, obično spriječena vanjskim ionskim strujama uglavnom zbog otvaranja K+ kanala.</s><s>ASM kontraktilni odgovori također ovise o mehanizmima senzibilizacije Ca2+, posredovanih lakim miozinskim lancem fosfata (engl.</s><s>Myosin light chain phosphatase (MLCP)) inhibicijom induciranom putem DAG / PKC / CPI-17 i Rho / Rho kinazom (ROK).</s><s>RhoA je aktiviran putem zamjenskog faktora nukletoida gvanina (engl. guanine nucleotide exchange factor (GEF)).</s><s>Mostovi aktomiozina, pogonjeni ATP hidrolizom kataliziranom miozinskom ATP-azom, odgovorni su za razvoj napetosti.</s>
<s>Preuzeto i prerađeno od: Pelaia, et al. (2008) Slika 6. Shematski prikaz procesa stimulacije agonista i posljedične kontrakcije glatkog mišićnog tkiva.</s><s>Putovi prijenosa signala uključeni su u kontrakciju mišića.</s><s>Interakcija kontraktilnih agonista GPCR dovodi do aktivacije PLC (PLCb), koja hidrolizira PIP2, čime se dobivaju dva sekundarna glasnika IP3 i DAG.</s><s>IP3 se veže na svoj receptor (IP3R) na SR, oslobađajući tako Ca2+ koji aktivira miozin koji je lak lanac ovisan o Ca2+ MLCK.</s><s>MLCK fosforilira lagani lanac miozina što dovodi do kontrakcije mišića koja završava MLCPom.</s><s>Osim IP3, oslobađanje Ca2+ iz SR je također stimulirano agonistom induciranom aktivacijom CD38, proizvodeći ciklički (cADPR za koji se pretpostavlja da je u interakciji s receptorima RyR.</s><s>Osim toga, Ca2+ može protjecati kroz plazmatsku membranu kroz kanale, uključujući Ca2+ kanale koji se upravljaju u trgovini (SOCC), kojima upravlja receptor Ca2+ kanali (ROCC) i Ca2+ kanalni kanali napona (VOCC).</s><s>Aktivacija VOCC-a je, međutim, obično spriječena prema van ionskom strujom uglavnom zbog otvaranja K+ kanala s odgođenim ispravljačem (K-DR)</s>
<s>PG su skupina ciklopentanih masnih kiselina s dvadeset ugljikovih atoma.</s><s>Možemo ih naći gotovo u bilo kojem tkivu i organskom sustavu.</s><s>Prvi su se nalazili u prostati, točnije u tekućini prostate te su tako dobili ime.</s><s>PG imaju veliku ulogu u relaksaciji glatkih mišića, krvnom tlaku, motilitetu crijeva, lučenju želučane kiseline i signalnim putevima boli.</s><s>Acetilsalicilna kiselina zaustavlja njihovo stvaranje u organizmu.</s><s>PG-i su posrednici kontrakcije i relaksacije glatkih mišića.</s><s>Pronađeni su tragovi PGF2α u plućima ovaca, čovjeka, majmuna i zamoraca.</s><s>PGD2 i PGF2α imaju izravan kontraktilni učinak na mišiće dišnih putova.</s><s>U Tablici 5. možemo očitati za više liganda mjesto proizvodnje, receptore na koje se vežu te samim time i njihovu funkciju.</s>
<s>PGD2 se najviše proizvodi u stanicama srednjeg živčanog sustava te se veže na receptore DP1, CRTH2 i ima funkciju u vazodilataciji, sazrijevanju mastocita te dozrijevanju bazofila i eozinofila.</s>
<s>PGE2 se proizvodi u bubrezima te se veže na receptore EP1, EP2, EP3, EP4.</s><s>Ima funkciju u povećanju broja makrofaga, vazokonstrikciji, bronhodilataciji, kontrakciji uterusa i oslobađanju neurotransmitera (Hanna & Hafez, 2018).</s><s>PGE2 može imati ulogu relaksatora i konstriktora preko receptora EP3.</s><s>Nadalje, PGE2 ima važnu ulogu u kontrakciji glatkih mišića uterusa (miometrija) tijekom procesa menoreje (Ruan, et al., 2011).</s><s>Također, važno je navesti da PGE2 ima i kontraktilnu ulogu što ovisi o tome u kojoj vrsti stanice djeluje.</s>
<s>PGI2 se proizvodi u epitelnim stanicama srca i žila te se veže na receptor IP preko kojega utječe na inhibiranje agregacije trombocita te na regulaciju TNF-α.</s><s>PGF2 se proizvodi u reproduktivnom sistemu i veže se na receptor FP.</s><s>Izaziva vazokonstrikciju, bronhokonstrikciju i kontrakciju glatkih mišića uterusa.</s><s>TXA2, TXB2 proizvode trombocite i vežu se na receptor TPα preko kojih reguliraju agregaciju trombocita.</s>
<s>Tablica 5. Prostanoidi – ligandi, glavna mjesta proizvodnje, njihovi srodni receptori te njihova efektorska funkcija Prostanoidi</s>
<s>Preuzeto i prerađeno od: Hanna & Hafez (2018) Preuzeto i prerađeno od: Ruan, et al. (2011) Slika 7. Shematski prikaz vezanja PG na receptore te njihov utjecaj na kontrakciju i relaksaciju.</s><s>Uz pomoć PLA2 dolazi do nastanka AA koji se putem COX-a sintetizira u PGG2 odnosno PGH2.</s><s>PGH2 se može konvertirati u različite oblike prostaglandina (PGD2, PGI2, PGE2, PGF2, TXA2).</s><s>Ovisno o tome na koji se receptor veže, prouzročit će kontrakciju ili relaksaciju mišića.</s><s>Ako se PGD2, PGI2 ili PGE2 veže na DP, IP, EP4, EP2 receptor, prouzročit će relaksaciju putem cAMP.</s><s>PGD2 je zasigurno bronhokonstriktor u glatkim mišićima dišnog sustava, ali može i relaksirati glatke mišiće žila.</s><s>Ako se PGE2, PGF2, TXA2 veže na EP2, EP1, FP ili TP receptor, prouzročit će podizanje Ca2+ što uzrokuje kontrakciju.</s><s>PGE2 se može vezati na EP4, EP2 i EP1 receptor te ovisno o tome će uzrokovati relaksaciju ili kontrakciju.</s>
<s>Shematski je prikazan metabolizam AA u stanicama epitela na Slici 7. AA je nastala hidrolizom PLA2 iz fosfolidne membrane te uz pomoć ciklooksigenaze nastane PGH2, koji se može pretvoriti u ostale PG-e.</s><s>U tom procesu kao intermedijarni produkt nastaje PGG2 iz kojeg se tvori PGH2.</s>
<s>PGH2 se konvertira u PGD2, PGI2, PGE2 koji se vežu na receptore DP, IP, EP4, EP2, EP3, što prouzrokuje povišeno stvaranje cAMP koji izaziva relaksaciju glatkih mišića.</s><s>Suprotno navedenom, PGF2 i TXA2 koji se vežu na receptore EP1, FP i TP, prouzrokuju porast koncentracije intracelularnoga Ca2+ što izaziva kontrakciju (Ruan, Slika 8. objašnjava ulogu epitela u regulaciji kontrakcije vas deferens sustava reproduktivnog sustava muškaraca za funkciju spermatogene tekućine.</s><s>Shematski prikaz pokazuje akciju signalnog puta otpuštenog ATP iz neurona koji utječe na kontrakciju ili relaksaciju mišića.</s><s>ATP se otpušta iz neurona i djeluje na receptor P2x prilikom čega se poveća propusnost za prijelaz Ca2+ u citoplazmu što izaziva kontrakciju.</s><s>Nadalje, ATP se može vezati na receptor P2Y, koji u citoplazmi aktivira produkciju signalne molekule IP3 čime se otpušta Ca2+ iz SR, koji aktivira enzim COX za metabolizam AA do PGE2.</s><s>PGE2 se veže na receptor EP2/4, što povećava produkciju cAMP.</s><s>Potonji povećava vodljivost stanične membrane za K+, koji vodi do hiperpolarizacije stanične membrane i time posljedično do relaksacije zbog smanjenja intracelularne koncentracije Ca2+.</s><s>Također, PGE2 može potaknuti lučenje bikarbonatnog iona HCO- putem aktivacije receptora EP2/4 što pomaže u motilitetu spermija.</s>
<s>Preuzeto i prerađeno od: Ruan, et al. (2011) Slika 8. Shematski prikaz kontrakcije i relaksacije vas deferensa uzrokovane PGom.</s><s>Shematski model prikazuje signalne događaje na kojima se temelji djelovanje ATP pobuđenog živca, regulaciji kontrakcije vas deferensa i pokretljivosti spermija pod utjecajem epitela sa i bez PGE2</s>
<s>Prostanoidi nastaju kada se AA, nezasićena masna kiselina, oslobodi s plazmatske membrane pomoću fosfolipaza i metabolizira sekvencijalnim djelovanjem PGH sintaze ili COX i njihove odgovarajuće sintaze.</s><s>Postoji pet bioaktivnih prostanoida in Uobičajeno svaki tip stanica generira 1 ili 2 dominantna proizvoda koji djeluju kao autokrini i parakrini lipidni medijatori za održavanje lokalne homeostaze u tijelu.</s><s>Tijekom upalnog odgovora razina i profil proizvodnje prostanoida dramatično se mijenjaju.</s>
<s>Proizvodnja prostanoida općenito je vrlo niska u neinflamiranim tkivima, ali se odmah povećava u akutnoj upali prije nego što leukociti odigraju svoju funkciju.</s><s>COX-1 je izražen u većini stanica dok je COX-2 izazvan upalnim stimulansima, hormonima i čimbenicima rasta.</s>
<s>COX izoforme proizvode najprije PGH2 koji je zajednički supstrat za niz specifičnih enzima izomeraze i sintaze koji proizvode PGE2, PGI2, PGD2, PGF2 , i TXA2.</s><s>Dalje u tekstu će zasebno biti opisani pojedini prostanoidi.</s><s>PGE2 je jedan od najzastupljenijih prostanoida proizvedenih u tijelu, najčešće je karakterističan za životinjske vrste i pokazuje raznovrsne biološke aktivnosti.</s><s>Pod fiziološkim uvjetima, PGE2 je važan posrednik mnogih bioloških funkcija, kao što je regulacija imunih odgovora, krvni tlak, gastrointestinalni integritet i plodnost.</s><s>Diferencirana sinteza ili degradacija PGE2 povezana je sa širokim rasponom patoloških stanja.</s><s>U upali, PGE2 je osobito zanimljiv jer je uključen u sve procese koji dovode do klasičnih znakova upale: crvenilo, oteklina i bol (Legler, et al., 2010).</s><s>PGE2 je sintetiziran iz PGH2 pomoću cPGES, mPGES-1 ili mPGES-2. cPGES je konstitutivno i obilno izražen u citosolu različitih tkiva.</s><s>Čini se da je cPGES sposoban pretvoriti PGH2 izvedene derivate.</s><s>Lokalizacija cPGES-a u citosolu može omogućiti povezivanje s proksimalnim COX1 u endoplazmatskom retikulumu preferirajući distalnu COX-2 u perinuklearnoj PGE2 vezanjem na različite EP receptore može regulirati funkciju mnogih tipova stanica, uključujući makrofage, dendritične stanice (DC) te T i B limfocite, što dovodi do protuupalnog učinka.</s><s>Kao proupalni medijator, PGE2 pridonosi regulaciji ekspresijskog profila citokina u DC i ima utjecaj na diferencijaciju T-stanica prema T1 i T2 odgovoru.</s>
<s>Štoviše, PGE2 može djelovati na antiinflamatorne akcije pri imunološkim stanicama, kao što su neutrofili, monociti i prirodne stanice ubojice (NK stanice).</s><s>PGE2 ima proinflamatorni i antiinflamatorni utjecaj.</s>
<s>PGI2 je jedan od najvažnijih prostanoida koji regulira kardiovaskularnu homeostazu.</s><s>Vaskularne stanice uključujući endotelne stanice, glatke vaskularne mišićne stanice (vascular smooth muscle cells (VSMC)) i endotelne progenitorske stanice, glavni su PGI2 se generira sekvencijalnim djelovanjem enzima COX i PGIS te člana obitelji CYP450 koja specifično pretvara PGH2 u PGI2.</s><s>PGIS se kolokalizira s enzimom COX u endoplazmatskom retikulumu, plazmatskoj membrani i jezgrenoj membrani.</s><s>PGIS je najviše izražen u endotelnim stanicama gdje se povezuje s COX-1.</s>
<s>PGI2 je snažan vazodilatator i inhibitor agregacije trombocita, adhezira leukocite i proliferira VSMC.</s><s>PGI2 je također antimitogen i inhibira replikaciju DNA u VSMC.</s><s>Ove aktivnosti PGI2 posredovane su specifičnim IP receptorima.</s><s>Ti receptori nalaze se u bubrezima, jetri, plućima, trombocitima, srcu i aorti.</s><s>Delecija IP-a dovodi do povećane akumulacije leukocita uzrokovanih antigenom u bronhoalveolarnoj tekućini i peribronhiolarne i perivaskularne upalne infiltracije.</s><s>PGI2 može promijeniti ravnotežu unutar imunološkog sustava i inhibirati alergijsku upalu.</s><s>Preuzeto po: Royal Society of Chemistry (2019) Slika 10.</s><s>Kemijska struktura PGI2.</s>
<s>PGD2 je glavni eikosanoid koji je sintetiziran u središnjem živčanom sustavu i perifernim tkivima.</s><s>U mozgu, PGD2 je uključen u regulaciju sna i druge aktivnosti središnjeg živčanog sustava, uključujući percepciju boli.</s><s>U perifernim tkivima, PGD2 proizvode uglavnom mastociti, ali i neki leukociti.</s><s>PGD2 se dalje može metabolizirati u PGF2α.</s><s>PGD2 je dominantni prostanoid koji se najviše proizvodi u mastocitima i na to inicira akutne alergijske reakcije tipa I posredovane preko IgE.</s>
<s>PGD2 se nalazi u bronhijalnom sekretu astmatičara zbog kojeg dovodi do bronhokonstrikcije.</s><s>PGD2 može igrati ulogu u razvoju ateroskleroze u kontekstu da dolazi do upaljene tunice intime odnosno sloja unutar žile.</s><s>PGD2 djelomično proizvodi H-PGDS koji je izražen u upalnim stanicama te su upalne stanice prisiljene napustiti krvne žile putem kemotaksije.</s>
<s>PGD2 je predominantno COX produkt iz plućnog parenhima.</s><s>Inhaliran PGD2 može biti bronhokonstriktor.</s><s>Dakle, može se koristiti poput histamina za glatke mišićne stanice dišnog sustava kod kroničnih plućnih oboljenja (Hardy, et al., 1984).</s><s>Preuzeto po: Royal Society of Chemistry (2019) Slika 11.</s><s>Kemijska struktura PGD2.</s>
<s>PGF2α sintetiziran je iz PGH2 preko PGF sintaze (PGFS) i veže se na FP receptor, koji parira s Gq proteinom koji utječe na intracelularnu koncentraciju slobodnog Ca2+.</s><s>PGF2α je uglavnom izveden iz COX-1 u ženskom reprodukcijskom sustavu te igra važnu ulogu u luteolizi, kontrakciji glatkih mišića maternice i inicijaciji poroda.</s><s>Nove studije pokazuju da također ima ulogu u kontrakciji arterija, miokardijskoj disfunkciji te ozljedi.</s><s>Aplikacija PGF2α dovodi do akutne upale, a različiti NSAID-i inhibiraju PGF2α biosintezu i in vitro i in vivo.</s><s>Otvaraju se mnoge mogućnosti za uporabu PGF2α za dizajn novih lijekova (Sugimoto, et al.,1997).</s><s>Istraživanja PGF2α i inhibicija PGFS-a bi mogla dovesti do boljeg razumijevanja i razvoja terapije za astmu, ali su potrebna još detaljnija ispitivanja.</s>
<s>Pokazano je da su cisteinili LT (LTC4, LTD4 i LTE4) najmoćniji bronhokonstriktori kod ljudi za koje se vjeruje da igraju ključnu ulogu u astmatičnoj opstrukciji dišnih putova.</s><s>LT-i mogu privući leukocite u pluća, povećavajući edem pluća.</s><s>LT-i također povećavaju proizvodnju sluzi (mukusa) i uzrokuju lokalni edem koji je tipičan znak upale.</s><s>Histamin je vjerojatno najpoznatiji upalni posrednik.</s><s>I za osobe s alergijama, antihistaminici igraju ključnu ulogu u smanjenju simptoma bolesti.</s><s>Za ljude s astmom, važni posrednici uključuju PGD2, faktor aktivacije trombocita, LT i druge kemijske spojeve koji su uključeni u upalu.</s><s>Ponekad pacijenti s aspirinskom intolerancijom imaju povećanu razinu LTE4 u urinu (Dahlén, 2000).</s><s>U Tablici 6. možemo očitati koji receptori odgovaraju pojedinim agonistima te koja je njihova funkcija.</s><s>Tablica 6. Biološki učinci LT – agonisti, receptori i njihova efektorna funkcija Leukotrieni</s>
<s>Preuzeto i prerađeno od: Hanna & Hafez (2018) U Tablici 6. možemo vidjeti da se ligand LTB4 proizvodi u mastoidnim stanicama te se veže na receptore BLT1, BLT2, PPARα.</s><s>LTB4 s BLT receptorom utječe na kemotaksiju leukocita, sekreciju citokina, IgE sintezu te transkripciju u jezgri stanice.</s><s>Funkcija mu je kemotaksija neutrofila, vaskularna permeabilnost i proliferacija Tstanica.</s><s>Preko vezanja na receptor PPARα, inhibiraju vlastitu sintezu i djeluju kao negativna povratna petlja na vlastitu proizvodnju.</s><s>LTC4, LTD4, LTE4 se proizvode u alveolarnim makrofazima te preko receptora CisLT1, CisLT2 odgovaraju na upalnu reakciju, odnosno šalju leukocite na ozlijeđeno mjesto.</s><s>Nadalje, stimuliraju bronhokonstrikciju i aktiviraju stvaranje sluzi u respiratornom i probavnom sustavu.</s><s>LXA4 i LXB4 se vežu na receptor ALX te sudjeluju u cijeljenju rana preko makrofaga, sudjeluju također u procesu fagocitoze i eferocitoze.</s><s>8-HPETE i 12-HPETE se preko receptora PPAR α i γ spajaju s peroksizomom te aktiviraju receptor koji djeluje kao homeostaza za upalu.</s><s>Također, reguliraju razinu kolesterola u jetri.</s>
<s>Postoji studija koja je analizirala ulogu Ca2+ i konstrikciju ljudskih bronhiola putem LTD4 i signalnog puta (Snetkov, et al., 2001).</s><s>Koristili su ljudsko plućno tkivo koje su citološkim tehnikama izolirali od pacijenata i nakon izolacije stanica dodali su otopine i reagense koji bi trebali stimulirati kontrakciju.</s><s>Nadalje, dodavali su agoniste i lijekove perfuzijom.</s><s>Došli su do zaključka da LTD4 ne kontrahira bronhiole u otopini bez Ca2+.</s><s>Druga studija proučavala je isto, ali su koristili druge površine za mjerenje porasta međustaničnog prostora.</s><s>Rezultati objašnjavaju da se razina Ca2+ poveća uz prisustvo histamina.</s><s>Histamin je značajno ukazao na razinu Ca2+.</s><s>LTD4 je samo malo povisio razinu Ca2+.</s>
<s>Biosintezu LT-a pokreću stimulansi poput antigena, citokina, imunoloških kompleksa i mikroba.</s><s>Prvi korak u ovom postupku je aktivacija PLA2 za oslobađanje polinezasićene AA sa staničnih membranskih fosfolipida.</s><s>Ekstracelularni podražaji translociraju enzim cPLA2 i 5-lipoksigenaze (5-LOX) u perinuklearni prostor leukocita.</s><s>FLAp je protein koji aktivira 5-LOX. cPLA2 se odcjepljuje od AA iz perinuklearne regije membranskih glikofosfolipida te se tada AA oksigenira putem 5LOX da se dobije nestabilni prekursor svih bioaktivnih LT-a (LTA4).</s><s>LTA4 može biti konjugiran sa smanjenom glutaminacijom LTC4 sintaze (LTC4S) da se formira LTC4 ili hidroliziran pomoću LTA4 hidrolaze (LTA4H) da se formira LTB4 što se prikazuje na Slici 12.</s><s>Obje, LTB4 i LTC4, transporter izvozi u izvanstanični prostor.</s><s>Nakon izvoza, LTC4 se brzo pretvara u LTD4 γ-glutamil leukotrienazom posredovanom uklanjanjem glutaminske kiseline i konačno LTD4 se pretvara u LTE4 putem dipeptidaze posredovane uklanjanjem glicina.</s><s>LTC4, LTD4 i LTE4 zajednički se nazivaju cisteinil LT (cisLT).</s>
<s>Preuzeto i prerađeno od: Obaidur Rahman, et al. (2019) Slika 13.</s><s>Biosinteza CisLT-a putem AA i njihova uloga u raznim bolestima.</s><s>AA katalizira 5-LOX enzim.</s><s>Ova reakcija zahtijeva 5-LOX aktivirajući protein (FLAP) koji aktivira enzim 5-LOX.</s><s>Rezultat enzimske reakcije je LTA4.</s><s>LTA4 se putem hidrolaze (LTA4H) formira u LTB4 ili se konjugira s glutationom pomoću LTC4 sintaze (LTC4S) i stvara LTC4.</s><s>LTC4 se metabolizira pomoću γ-glutamiltranspeptidaze u LTD4 koji se nadalje metabolizira dipeptidazom do LTE4</s>
<s>Za bijele krvne stanice kao što su neutrofili, eozinofili i monociti LTB4 je moćno kemotaktičko sredstvo.</s><s>LTB4 pomaže pri migraciji tvari, stimulira difuziju, a također pomaže u poticanju adhezije od neutrofila do endotela u krvnim žilama, ali nema utjecaj na većinu drugih glavnih krvnih žila.</s><s>Neki od CisLT1 receptorskih antagonista koriste se kao mogućnost liječenja astme.</s><s>Nema selektivnog antagonista za CisLT2 receptore.</s><s>Neselektivni bloker za CisLT1 i CisLT2 receptore je formiran pod imenom BAY u9773.</s><s>Postoje dokazi da CisLT imaju funkciju kontrakcije koronarne arterije te distalne i plućne arterije kod ljudi.</s><s>Razvoj selektivnih antagonista receptora CisLT1 omogućio je novu klasu tretmana za bolesnike s astmom te liječenje za druge upalne bolesti Montelukast je antagonist LT receptora (LTRA) koji se koristi za liječenje astme i ublažavanje simptoma sezonskih alergija.</s><s>Montelukast je CisLT1 antagonist.</s><s>Blokira vezanje LTD4, LTC4 i LTE4 na CisLT1 receptor u plućima te u bronhijalnom stablu vezanjem na njega.</s><s>Navedeno utječe na smanjenje bronhokonstrikcije i redukciju upalnih procesa koje inače uzrokuju LT-i (Lipkowitz, et al., 2001).</s><s>Zafirlukast je također antagonist LT receptora koji se veže na CisLT1 i CisLT2 receptore te na taj način interferira s upalnim putevima koji su uključeni u patogenezu astme i alergijskog rinitisa.</s><s>Zafirlukasta inhibira bronhokonstrikciju djelujući na kasne faze upalnih reakcija u astmi.</s>
<s>Pranlukast je CisLT1 antagonist LT receptora.</s><s>Pranlukast ima antagonističku aktivnost protiv LTC4, kao i LTD4 i LTE4.</s><s>Također smanjuje antigen-induciranu bronhokonstrikciju, hiperreaktivnost dišnih puteva na acetilkolin i akumulaciju plućnih eozinofila kod zamoraca (Drazen, et al., 1980).</s><s>5.8 Nesteroidni protuupalni lijekovi</s>
<s>Nesteroidni protuupalni lijekovi (NSAID) koriste se za ublažavanje boli te intenziteta upale.</s><s>Strukturno su načinjeni od različitih spojeva, ali imaju slična djelovanja: analgetičko, protuupalno, antipiretsko i antitrombinsko djelovanje.</s><s>Njihova primjena započinje 1898. godine, a danas je jedna od najčešće korištenih skupina lijekova u humanoj i veterinarskoj medicini.</s>
<s>Prema kemijskoj strukturi, NSAID-i se mogu primijeniti na salicilate, kiseline propionskih derivata, arilne i heteroarilne octene kiseline, antranilate, oksikamine, fenilpirazole i aniline.</s><s>Neki od njih sadrže polarnu veznu skupinu kod koje je planarna skupina pričvršćena na dodatnu lipofilnu skupinu.</s><s>Iz navedene kemijske strukture proizlaze (bio)kemijske i farmakološke značajke  Većina NSAID-a sadrži karboksilne kiseline, a sve jake organske kiseline imaju  Razlikuju se od lipofilnosti utemeljene na lipofilnoj karoten-arilnoj skupini i lipofilnim ostacima i supstituentima.</s>
<s> Kisela skupina je glavna vezna skupina za vezanje proteina.</s><s>Svi NSAID-i se povezuju s proteinima jakim ionskim vezama.  Put uklanjanja većine NSAID-a iz tijela je inaktivacija prilikom glukuronidacije nakon čega slijedi njihovo izlučivanje iz bubrega.</s><s>5.8.1 Utjecaj nesteroidnih protuupalnih lijekova na kontrakciju glatkih mišića dišnog sustava</s>
<s>Tijekom istraživanja astme izazvane intenzivnim vježbanjem, uzorci urina ili ekspirija pokazali su povećanje koncentracija CisLT što se povezuje s težinom simptoma astme posredovane bronhokonstrikcijom.</s>
<s>Također dolazi do povećane proizvodnje protuupalnih prostanoida PGE2 i PGD2 do koje dolazi zbog konstrikcije glatkih mišića respiratornog sustava.</s><s>Također je dokazano da ovaj fenotip ovisi o ozljedama epitelnih stanica i povećanoj aktivnosti djelovanja epitelne 15-LOX.</s><s>Smanjena biosinteza lipoksina i preopterećenost izoprostana također su uključeni u astmu induciranu vježbanjem (Hallstrand, 2012).</s><s>Astmatska upala je multicelularni proces koji uključuje i bronhijalno tkivo i infiltrirajuće upalne stanice.</s><s>U alergijskoj astmi, neposredna imunološka reakcija aktivira bronhijalne mastocite i dovodi do bronhokonstrikcije, povećanog lučenja sluzi, edema i kašlja.</s><s>Svi ovi simptomi svrstavaju se u dvije kategorije medijatora: prethodno oblikovani medijatori, kao što je histamin, oslobođeni egzocitozom i medijatori koji nastaju u tijeku biosinteze poput eikosanoida.</s><s>Nedavne studije o eikosanoidima u različitim fenotipima astme pokazuju da razine eikosanoida koreliraju s eozinofilijom periferne krvi i brojem eozinofila sputuma, odnosno iskašljaja.</s><s>Međutim, mastociti su također obilan izvor CisLT.</s><s>LTC4 i LTD4 doprinose bronhokonstrikciji kod astme.</s><s>Mastociti također proizvode PGD2 koji stimulira osjetilna C-vlakna za induciranje refleksa kašlja.</s><s>Međutim, PGD2 također može aktivirati tromboksanski receptor TP koji je najmanje specifičan prostanoidni receptor sposoban za kontrakciju glatkih mišićnih stanica dišnih putova (Maher, et al., 2015).</s><s>Preosjetljivost na protuupalne nesteroidne lijekove (NSAID) može izazvati astmu.</s><s>Hipersenzitivnost na različite tipove NSAID-a se općenito naziva netolerancija na aspirin.</s>
<s>Nedavno su objavljena neka važna zapažanja o patofiziologiji ove specifične vrste astme.</s><s>Uspjeli su testirati to patološko stanje na mišjem modelu.</s><s>Potrebno je senzibilizirati miša sa zajedničkim alergenom od grinja i ukloniti proizvodnju PGE2 mikrosomnom PGE2 sintazom.</s><s>U tom slučaju aspirin uzrokuje u tim životinjama degranulaciju mastocita i bronhokonstrikciju.</s><s>Dolazi do podizanja razine histamina i CisLT (Liu, et al., 2013).</s><s>Promjene u razini eikosanoida odmah nakon pozitivne bronhijalne provokacije lizinom i aspirinom su vrlo zanimljive.</s><s>To može pomoći u razumijevanju početne reakcije odgovorne za astmatski napad kod pacijenata s aspirinskom intolerancijom.</s><s>Biosinteza PGE2 u bronhiju je iznimno osjetljiva na inhibiciju acetilsalicilnom kiselinom.</s>
<s>Inhalacijska doza u obliku lizina-aspirina od oko 17 mg u prosjeku uzrokuje bronhokonstrikciju s 20-postotnim smanjenjem forsiranog ekspiratornog volumena zraka izdahnutim u prvoj sekundi (FEV1).</s><s>Zanimljivo je da, prema individualnoj preosjetljivosti na NSAID, manje doze lijeka često izazivaju jače kontrakcije bronha (Nizankowska-Mogilnicka, et al., 2007).</s>
<s>Nakon stanične aktivacije mastocita ili makrofaga imunoglobulin E (IgE) antigenskih kompleksa, ionofora ili drugih podražaja, javlja se kaskadna aktivnost stanica koja dovodi do biosinteze LT-a. cPLA2 se prebacuje u omotnicu jezgre stanice, kao i 5-LO.</s><s>Nakon toga se mogu premjestiti iz jezgrenog ili citoplazmatskog odjeljka.</s><s>FLAP, mali rezidentni nuklearni omotni integralni protein, djeluje kao aktivacijski protein 5-LOX za pretvorbu AA u LTA4.</s><s>Aktivnost 5-LOX inhibira zileuton (Zyfl).</s><s>LTA4 i LTB4 mogu potencijalno biti formirani na obje strane nuklearne ovojnice s nukleotidnim ili citosolnim lokaliziranim bazenima LO-5 i LTA4H.</s><s>LTB4 se prenaša iz stanice preko prijenosnika van stanice pa može djelovati na neutrofile preko vezanja na BaLT1 receptor kako bi izazvao kemotaksiju.</s><s>LTB4 također može djelovati intracelularno na nuklearnom transkripcijskom faktoru PPAR-α za induciranje ciljnih gena poput onih uključenih u β-oksidaciju što se može vidjeti na Slici 14.</s>
<s>To bi uzrokovalo negativnu povratnu petlju koja je rezultirala razgradnjom LTB4 čime se ograničavaju njegove proinflamatorne aktivnosti.</s><s>LTA4 se također može pretvoriti u LTC4 pomoću LTC4S, koji se nalazi u jezgrenoj omotnici.</s><s>Protein povezan s rezistencijom na više lijekova (MRP1) može olakšati prijenos LTC4 iz stanice, gdje se metabolizira putem izvanstanične lokalizirane g-glutamil transpeptidaze (GGT) ili g-glutamil leukotrienaze (GGLT) na LTD4.</s><s>Na stanicama glatkih mišića dišnih putova (SMC) i postkapilarnih endotelnih stanica venula, LTD4 može aktivirati CisLT1 receptore da uzrokuju bronhokonstrikciju i edem.</s><s>Klinički važni lijekovi u astmi, montelukast (Singulair) i zafirlukast (Accolate) blokiraju ovaj stupanj kao blokatori – antagonisti cisLT receptora.</s><s>LTC4 ili LTD4 također mogu se vezati na CisLT2 receptore koji se nalaze u različitim tkivima (Drazen, et al., 1999).</s>
<s>5.9 Analiza mjerenja kontrakcije/relaksacije glatkih mišićnih dišnih puteva u ovisnosti od biološki aktivnih eikosanoida Glavna svrha ovog rada je dobiti parametre za matematički opis ovisnosti razvijenih sila na koncentraciju eikosanoida koji induciraju kontrakciju ili relaksaciju u glatkim mišićnim stanicama dišnih putova u prisutnosti i odsutnosti aktivnih tvari.</s><s>Na temelju tih podataka procjenjuje se jačina kontraktilnih agonista.</s><s>Daljnji cilj je usporediti snagu eikosanoidne kontrakcije s drugim fiziološkim kontraktilnim agonistima, kao što su histamin i acetilkolin (Ach).</s><s>Jedan od ciljeva magistarskog rada je također utvrditi jesu li parametri izmjerenih ovisnosti različiti za različite organizme i je li moguće mjerenje ovisnosti sile na životinjama implementirati u modele za opis stanja čovjeka.</s><s>Iz objavljenih in vitro te ex vivo mjerenja koja su provedena na životinjskim i ljudskim tkivima respiratornog sustava uz pomoć alata Digitize u programu OriginLab dobivena je matematička ovisnost sile koja najbolje odgovara mjerenjima ovisno o apsolutnim koncentracijama pojedinačnih bronhokonstriktora i bronhodilatatora.</s><s>Grafovi su prikazani pretežno u logaritamskoj skali.</s><s>Mjerene vrijednosti sile, ovisno o koncentracijama bronhokonstriktora, prilagođene su Hillovoj funkciji oblika:</s>
<s>𝑚𝑎𝑥Š𝐶Ć𝑛 gdje Fmax predstavlja najveću razvijenu silu, koja je teoretski razvijena u supramaksimalnoj koncentraciji agonista (ŠCĆ), K je njegova koncentracija kod do polovine razvijene sile u usporedbi s maksimumom (tzv. konstanta poluzasićenog stanja EC50), n je Hillov koeficijent odnosno strmina krivulje.</s><s>Takozvana rastuća Hillova funkcija pretežno se koristi za analizu konstrikcije dok se padajuća Hill1 funkcija koristi za analizu relaksacije što se prikazuje jednadžbom: 𝑠𝑡𝑎𝑟𝑡)</s>
<s>Š𝐶Ć𝑛 gdje su Fstart i Fend limitne veličine sile kod niske odnosno visoke koncentracije agonista (ŠCĆ).</s><s>Ova funkcija može se koristiti i za padajuću (Fstart > Fend) i rastuću (Fstart < Fend) zavisnost.</s><s>Hillova funkcija (1) je poseban primjer funkcije (2) s vrijednošću Fstart=0 i Fend=Fmax.</s><s>U nastavku magistarskog rada usporedit će se podaci prikupljeni iz više različitih studija kako bi se analiziralo postavljene hipoteze.</s><s>Prva studija koja će se analizirati je studija M. Muccitellija (Muccitelli, et al., 1987) koja je provela in vitro istraživanje s LT-om, histaminom, metakolinom i antigenima na zamorcima i ljudskim dišnim sustavima.</s><s>Kod zamoraca su se prikupljali podaci sa seciranog tkiva dušnika dok su kod čovjeka izbor tkiva za analizu bili bronhi.</s><s>U nastavku teksta prvo ćemo opisati pripremu tkiva za prikupljanje i obradu podataka za analizu.</s>
<s>Tkiva dušnika su uklonjena kod odraslih mužjaka albino zamoraca, nakon čega su pažljivo odrezana od masnog i vezivnog tkiva i izrezana u spiralne trake.</s><s>Svako tkivo je smješteno u 10 ml vodene kupke, naposljetku povezano te analizirano na Grass modelu VFO3C za snimanje izometričke napetosti.</s><s>Tkiva dušnika su bila uronjena u modificiranu otopinu, tzv. Krebs-Henseleitovu.</s><s>Pripravci su stavljeni pod 2 g pasivne napetosti i ekvilibrirani za 60 minuta, tijekom kojih su bili isprani svakih 15 minuta s novim puferom.</s><s>Prije početka eksperimenta, svaki dušnik je prethodno obrađen meklofenaminskom kiselinom da inhibira otpuštanje bronhoaktivnih PG-a kao odgovor na kontrakciju tkiva (Hedqvist & Dahlén, 1985; Orehek, et al., 1975).</s><s>Također, dodan je i l-serin borat (45 mM), inhibitor γ-glutamil transpeptidaze, da se inhibira konverzija LTC4 u LTD4.</s><s>Generirane su kumulativne krivulje uzastopnim povećanjem koncentracije agonista u otopini s metodom Van Rossum, pri čemu je svaka koncentracija ostala u kontaktu s tkivom sve dok odgovor nije postigao plato.</s><s>Samo jedna krivulja je generirana sa svakim tkivom.</s><s>Na samom kraju eksperimenta, maksimalno učinkovita koncentracija bilo metaholina (10 μM) ili karbahola (10 µM) dodana je u svaku otopinu te su odgovori inducirani agonistom izraženi u postotku referentne maksimalne kontrakcije putem bilo metaholina (10 μM) ili karbahola (10 Ljudsko plućno tkivo dobiveno je od donora organa.</s><s>Od devet uzoraka pet je bilo od muškaraca i četiri od žena.</s><s>Donori nisu imali poznate respiratorne poremećaje.</s><s>Bronhiji su uklonjeni iz pluća i pažljivo postavljeni na mikroskopska stakla putem sonde dok se unutar bronha vršila disekcija pluća parenhima i vaskularnog tkiva.</s><s>Bronhiji su suspendirani ispod 1,5 g pasivne napetosti.</s><s>Samo jedna koncentracijska krivulja agonista je generirana po tkivu.</s><s>Nadodao se karbahol (10 µM) te su vrijednosti izražene kao postotak ove referentne kontrakcije.</s><s>Dodana je meklofenaminska kiselina (1 µM) za inhibiranje stvaranja produkata ciklooksigenaze i za preusmjeravanje AA kroz lipoksigenazni put čime se povećavaju količine LT-a.</s><s>Rezultati analize podataka mjerenja Muccitellija i suradnika (Muccitelli, et al., 1987) za kontrakciju glatke muskulature dišnih puteva kod zamorca Tablica 7. Parametri Hillove funkcije, prilagođene ovisnosti razvijene sile mišića uzrokovane leukotrienima kod dušnika zamoraca i bronha ljudi.</s><s>Analiza se temelji na mjerenjima u referenci (Muccitelli, et al., 1987) Zamorci – dušnik</s>
<s>Na Slici 15., koja prikazuje kontrakcijsku silu agonista na respiratorno tkivo (dušnik) zamorca simboli su podijeljeni kao izmjerene vrijednosti u obliku ●LTD4, ■LTE4, ▲LTC4, odnosno kao isprekidane linije koje prikazuju ovisnost s prilagođenom Hillovom funkcijom.</s><s>Rezultati na y-osi izraženi su kao postotak maksimalne sile koja je bila izazvana, dok su na x-osi vrijednosti koncentracije agonista LTD4, LTE4 i LTC4.</s><s>Koncentracija agonista (ŠCĆ) izražena je u mol/L. Slika 15. govori u prilog najvećoj kontrakciji pri LTC4 (Fmax=90,4 %) dok kod LTD4 manja.</s>
<s>Kontrakcija dušnika kod zamoraca je najsenzitivnija na LTD4 (K = 2,83 × 10-9 mol/L), za LTC4 je koncentracija poluzasićenosti jedan red veličine veća (K = 2,23 × 10-8 mol/L) od LTD4, a za LTE4 koncentracija poluzasićenosti je negdje između LTD4 i Slika 15.</s><s>Rezultati mjerenja ovisnosti sile kontrakcije za agoniste LTC4, LTD4, LTE4 kod dušnika zamoraca (simboli) i mjerenja prilagođena Hillovoj funkciji (krivulje).</s><s>Sila je izražena u % maksimalne sile koja je prouzročena karbaholom (10 µM).</s><s>Izmjerene vrijednosti dobivene su iz reference Muccitelli, et al. (1987), putem digitalizacije Slika 16.</s><s>Rezultati ovisnosti sile kontrakcije za agoniste LTC4, LTD4, LTE4 kod ljudi – bronhi (simboli) i mjerenja prilagođena Hillovoj funkciji (krivulje).</s><s>Sila je izražena u % maksimalne sile koja je prouzročena karbaholom (10 µM).</s><s>Izmjerene vrijednosti dobivene su iz reference Muccitelli, et al. (1987), putem digitalizacije Na Slici 16., koja prikazuje kontrakcijsku silu agonista na respiratorno tkivo (bronhi) čovjeka, simboli su podijeljeni kao ●LTD4, ■LTE4, ▲LTC4 što zapravo označava izmjerene vrijednosti, odnosno kao isprekidane linije koje prikazuju prilagođenu Hillovu funkciju.</s><s>Koncentracija agonista izražena je u mol/L. Rezultati na y-osi su izraženi kao postotak maksimalne sile kontrakcije dok su na x-osi vrijednosti koncentracije (ŠCĆ) agonista za LTD4, LTE4 i LTC4.</s><s>Koncentracija agonista (ŠCĆ) izražena je u mol/L. Strmina krivulje kod LTE4 (n = 0,95) je naglašenija dok je kod %) je uzrokovao najveću kontrakcijsku silu te nakon njega LTC4 (Fmax = 78,6 %) pa naposljetku najmanju vrijednost LTE4 (Fmax = 60,9 %).</s><s>Kontrakcija bronha kod ljudi najosjetljivija je na LTD4 i LTC4, koji imaju vrlo slične konstante poluzasićenosti (K Također, možemo pokazati navedene rezultate kao zajednički graf humanog i animalnog tkiva s legendom prikazanom na grafu što vidimo na Slici 17.</s><s>Crno iscrtano obilježava ovisnosti sile o koncentraciji agonista za čovjeka dok crveno iscrtano za zamorce.</s><s>Sve krivulje dobivene su prilagođavanjem Hillove funkcije mjerenju.</s>
<s>Animalni model za LTD4 kod dušnika zamorca pokazuje da je maksimalna sila kontrakcije (Fmax = 60,1 %) nešto manja nego kod humanog modela bronha (Fmax = senzitivnija negoli za humani model (K = 5,20 × 10-9 mol/L).</s><s>Strmina krivulje je slična Pri animalnom modelu za LTC4 dolazi do veće sile (Fmax = 90,4 %) nego pri humanom krivulje je pri animalnom (n = 0,62) malo manja negoli kod humanog tkiva (n = 0,73). vrijednosti postizanja maksimalne sile kontrakcije.</s><s>Blago je povećana sila kod animalnog modela za LTE4.</s><s>Senzitivnost ovisnosti sile na LTE4 je kod animalnog 10-8 mol/L) te je i strmina krivulje pri animalnom (n = 1,42) veća negoli kod humanog Slika 17.</s><s>Usporedba ovisnosti sile i koncentracije agonista kod humanog i animalnog tkiva kroz mjerenja prilagođena Hillovoj funkciji gdje crne krivulje predstavljaju uzorak ljudi dok crvena zamorce.</s><s>Sila je izražena u % maksimalne sile koja je prouzročena karbaholom (10 µM).</s><s>Krivulje se temelje na analizi izmjerenih vrjednosti u referenci Muccitelli, et al. (1987)</s>
<s>U istraživanju koje je proveo Ravasi s suradnicima (Ravasi, et al., 2000), koristile su se izolirane stanice ljudskog plućnog parenhima (human lung parenchyma, HLP) te su testirali njihovu kontrakciju u postavljenim uvjetima.</s><s>Izolirali su HLP te su dokazali da membrana u stanicama HLP-a sadrži dva CisLT receptora s visoko afinitetnim stranama za vezanje s različitim farmakološkim profilima (Ravasi, et al., 2000).</s><s>HLP trake su postavljene na početnu napetost od 1 g, isprane puferom, a zatim sa 40 mM serin-borata i 3 mM L-cistenila da inhibiraju LTC4 i LTD4 metabolizam.</s><s>Kontraktilni odgovor na koncentraciju LTC4 ili LTD4 izražen je kao postotak maksimalnog odgovora na 300 mM PGF2α.</s><s>Rezultati analize grafova iz ove studije su sljedeći:</s>
<s>Tablica 8. Parametri Hillove funkcije, prilagođene ovisnosti kontrakcije mišića uzrokovane leukotrienima LTD4 i LTC4 kod ljudi.</s><s>Analiza se temelji na mjerenjima Ljudi HLP</s>
<s>Rezultati na y-osi, vidljivi na Slici 18., izraženi su kao postotak maksimalne sile kontrakcije za 300 mM PGF2α dok su na x-osi vrijednosti koncentracija agonista ●LTD4 i ▲LTC4 izražene u jedinici mol/L. U ovom slučaju u plućnom parenhimu veću kontrakcijsku silu proizvede LTD4 (Fmax = 190,3 %) dok je kod LTC4 (Fmax = 112,5 %) sila kontrakcije nešto manja.</s>
<s>Kontrakcija mišića HLP senzitivnija je na LTD4 (K = 6,54×10-9 mol/L) negoli na LTC4 Uspoređujući ovo istraživanje s prethodnim (tablice 7. i 8.) možemo reći da je strmina krivulje najizraženija pri HLP-u (n = 1,02), nakon toga kod bronha ljudi (n = 0,73) kada govorimo o LTC4 te zatim kod dušnika zamoraca (n = 0,62).</s><s>Situacija je nešto drukčija za LTD4, pri dušniku zamoraca je strmina krivulje najveća (n = 0,78) nalaze između dva navedena rezultata.</s><s>Što se tiče senzitivnosti kontrakcije HLP-a (K = 6,54×10-9 mol/L), i naposljetku je najmanja senzitivnost kod bronha Pri LTD4 možemo vidjeti da je senzitivnost razvijene sile najveća kod dušnika HLP-a (K = 6,54 × 10-9).</s><s>Razlike u osjetljivosti tkiva na LTD4 su mnogo manje nego kod LTC4 te nema većih razlika u osjetljivosti na kontrakciju između ljudi i životinja pod utjecajem LTD4.</s>
<s>Fmax se ne može izravno uspoređivati jer referentni Fmax (100 %) ne znači u svim slučajevima isto.</s><s>Referentna kontrakcija uzrokovana je različitim agonistima radi određivanja referentne vrijednosti.</s>
<s>Slika 18.</s><s>Rezultati kontrakcije HLP-a – odnos sile uzrokovane različitim koncentracijama agonista LTD4 i LTC4.</s><s>Sila je izražena u % maksimalne kontrakcije koja je razvijena pod utjecajem stimulacije s 300 mM PGF2α.</s><s>Izmjerene vrijednosti dobivene su iz reference Ravasi, et al. (2000), putem digitalizacije M. J. B. Finney sa suradnicima napisao je znanstveni članak na temu kontrakcije glatkog mišićnog tkiva respiratornog sustava čovjeka (Finney, et al., 1985).</s><s>U istraživanju koje je proveo, koristio je odstranjeni plućni parenhim čovjeka putem biopsije ili uslijed operativnog zahvata.</s><s>Navedeni parenhim dobiven je iz perifernih dišnih puteva glatkog mišićnog tkiva.</s>
<s>Za doseg maksimalne kontrakcije tkivo je kontrahirano s 20 µM karbakola i dodatkom noradrenalina (Finney, et al., 1985).</s><s>U studiji su uspoređivani efekti kontrakcije između histamina, lijeka Sigma (karbamilkolin-klorid) te PGD2.</s><s>Iz navedenog članka preuzeti su i obrađeni podaci.</s><s>Izolirano je prikazana kontrakcija mišića uzrokovana PGD2.</s><s>Krivulja je konstruirana kao odnos % maksimalne razvijene sile od molarne koncentracije PGD2 koja je označena kao mjerena vrijednost prikazana ■.</s><s>Mjerenjem je prilagođena Hillova funkcija u vidu krivulje.</s><s>Tablica 9. pokazuje da je maksimalna vrijednost izraženosti kontrakcije Fmax = 74,9 %.</s><s>Koncentracija kod poluzasićenog stanja iznosi K = 4,48 ×10-7 mol/L, dok je strmina Tablica 9. Rezultati Hillove funkcije, prilagođene ovisnosti kontrakcije HLP-a uzrokovane s PGD2.</s><s>Analiza se temelji na mjerenjima u referenci (Finney, et al., 1985) Vrijednost</s>
<s>Slika 19.</s><s>Rezultati kontrakcije HLP-a uzrokovane različitim koncentracijama agonista PGD2.</s><s>Sila je izražena u % maksimalne kontrakcije koja je razvijena pod utjecajem stimulacije s 20 µM karbakolom.</s><s>Izmjerene vrijednosti dobivene su iz reference Finney, et al. (1985), putem digitalizacije</s>
<s>Nadalje, opisali smo istraživanje (Black, et al., 2006) o kontrakciji glatkih mišića bronha čovjeka koji su prethodno bili izloženi bolusu karbakola u količini od 500 µM (za postizanje referentne maksimalne kontrakcije) i poslije toga agonistima PGF2α i PGD2.</s><s>Analiza je vidljiva na Slici 20. na kojoj y-os predstavlja postotak maksimalne kontrakcije pri dodatku 500 µM karbakola te na x-osi koncentracija agonista PGF2α i PGD2.</s><s>Rezultati mjerenja za PGD2 prikazani su simbolom ■ dok je crna krivulja rezultat prilagođene Hillove funkcije (jednadžba 1).</s><s>PGF2α je prikazan Hillovom prilagođenom krivuljom prikazanom crvenom linijom s vrijednostima u obliku simbola ● što se može vidjeti na Slici 20.</s><s>U ovom slučaju veću kontrakcijsku silu proizvede PGF2α (Fmax = 91,8 %) dok je kod PGD2 (Fmax = 54,7 %) maksimalna sila kontrakcije manja što možemo vidjeti u Tablici 10.</s><s>Kontrakcija mišića bronha kod čovjeka senzitivnija je na PGF2α (K = 5,71 × 10-7 Tablica 10.</s><s>Parametri Hillove funkcije prilagođene ovisnosti kontrakcije mišića ljudskih bronha uzrokovane s PGD2 i PGF2α.</s><s>Analiza se temelji na mjerenjima u PGD2</s>
<s>Slika 20.</s><s>Odnos sile kontrakcije izazvane različitim koncentracijama agonista PGD2 i PGF2α na kontrakciju mišića ljudskih bronha.</s><s>Sila je izražena kao % maksimalne kontrakcije izazvane s 500 µM karbakola.</s><s>Izmjerene vrijednosti dobivene su iz reference Black, et al. (2006), putem digitalizacije Uspoređeni su dobiveni podaci prikupljeni iz analize za PGD2 kod ljudskih bronha Maksimalna sila kontrakcije veća je kod parenhima (Fmax = 74,9 %) negoli kod bronha usporedbi PGD2 s PGF2α, jači konstriktor je PGF2α (Fmax = 91,87 %) kod glatkih mišića ljudskih bronha.</s><s>Također senzitivnost na PGF2α je veća (K = 5,71 × 10-7 mol/L) nego Nadalje, obrađeno je istraživanje koje je opisivalo proces relaksacije glatkih mišića dušnika divljeg miša te štetnost hiperkontrakcije na epitelu (Fortner, et al., 2001).</s><s>Hipoteza koja je postavljena u navedenom istraživanju dovodi u pitanje ulogu PGE2 kao glavnog medijatora epitelnog tkiva.</s><s>Za istraživanje, tkivo je pripremljeno tako da se dušnik divljeg miša kontrahirao s otopinom od 10 µM Ach te je time izražen postotak sile maksimalne kontrakcije bez dodatka PGE2 (Fortner, et al., 2001).</s><s>PGE2 je dodan egzogeno te putem receptora EP2 relaksira glatke mišiće dušnika što je prikazano na Slici 21.</s>
<s>Na slici 21 y os predstavlja postotak maksimalne sile kontrakcije koja je uzrokovana s 10 µM Ach u zavisnosti od različitih koncentracija PGE2, koje su prikazane na x osi.</s><s>Vrijednosti mjerenja su prikazane simbolom ■ i prilagođena funkcija Hill1 (jednadžba 2) je prikazana kao krivulja.</s><s>Tablica 11 pokazuje parametre funkcije Hill1: početnu vrijednost sile kod najmanje vrijednosti koncentracije PGE2 (Fstart = 98 %) te završnu vrijednost kod najveće koncentracije PGE2 (Fend = 14,5 %).</s><s>Također, iz tablice Analiza je izrađena po Hill1 funkciji.</s>
<s>Tablica 11.</s><s>Rezultati Hill1 funkcije, prilagođene ovisnosti relaksacije glatkih mišića dušnika divljeg miša uzrokovane s PGE2.</s><s>Analiza se temelji na mjerenjima u referenci (Fortner, et al., 2001)</s>
<s>Istraživanje koje je proveo J. Safholm (Safholm, et al., 2015) dovelo je do nekoliko zaključaka prilikom istraživanja bazalne sile napetosti mišića malih dišnih puteva čovjeka.</s><s>U izoliranim malim dišnim putevima ljudi, PGE2 može izazvati relaksaciju mišića putem EP4 receptora, ali je manje moćan i djelotvoran nego agonist β-receptora formoterol (Safholm, et al., 2015).</s><s>Smanjeni relaksacijski učinak PGE2, koji je otkriven u glatkim mišićima malih dišnih puteva čovjeka pri visokim koncentracijama PGE2, najvjerojatnije je posljedica djelovanja i vezanja PGE2 na TP receptor (tromboksanski receptor), koji u visokim koncentracijama pokreće zasićenost relaksacije s nekih 10 % Fmax.</s>
<s>Analiza je napravljena putem Hill1 funkcije (Jednadžba 2.).</s><s>Rezultati su prikazani u obliku Tablice 12. i Slike 22.</s><s>Na Slici 22. prikazan je odnos relaksacijskog učinka PGE2 prikazanog simbolom ■ na x-osi te kontrakcije izazvane histaminom na y-osi.</s><s>Tablica 12. pokazuje parametre funkcije Hill1: početna vrijednost sile kod najmanje vrijednosti koncentracije PGE2 (Fstart = 100 %) te završnu vrijednost kod najveće Slika 21.</s><s>Omjer sile razvijen u glatkim mišićima dušnika divljeg miša pod utjecajem 10 µM Ach i istodobne prisutnosti različitih koncentracija relaksacijskog agonista PGE2.</s><s>Simboli predstavljaju izmjerene vrijednosti, a krivulja je prilagođena ovisnosti prema jednadžbi (2).</s><s>Vrijednost od 100 % predstavlja silu koju uzrokuje isključivo 10 µM Ach.</s><s>Izmjerene vrijednosti dobivene su iz reference Fortner, et al. (2001), putem digitalizacije</s>
<s>histaminom u vrijednosti od 1 µM. koncentracije PGE2 (Fend = 40,6 %).</s><s>Također, iz tablice se može očitati senzitivnost Tablica 12.</s><s>Rezultati Hill1 funkcije, prilagođene ovisnosti relaksacije mišića uzrokovane PGE2.</s><s>Analiza se temelji na mjerenjima u referenci (Safholm, et al., 2015) Vrijednost</s>
<s>U istraživanju G. Braunsteina (1988) postavila se hipoteza da kontrakcija glatkih mišića respiratornog sustava ovisi o proizvodnji relaksacijskog produkta iz epitela dušnika zamoraca (Braunstein, et al., 1988).</s><s>Tijekom kontrakcije otpušta se PGE2.</s><s>Istraživanje se provodilo u dva preparata od čega je jedan tkivo s netaknutim epitelom, Slika 22.</s><s>Odnos sile, razvijene pod utjecajem 1 µM histamina i u prisutnosti različitih koncentracija relaksacijskog agonista PGE2.</s><s>Izmjerene vrijednosti dobivene su iz reference Safholm, et al. (2015), putem digitalizacije a drugi preparat gdje su sastrugane epitelne stanice.</s><s>Dakle, predviđeno je da se usporedi učinak na relaksaciju glatkih mišića postignut eksterno dodanim PGE2 i učinak metabolita AA, koje su dodali u oba primjera – netaknuti epitel i sastrugani epitel.</s><s>AA je izazvala relaksaciju kod netaknutog tkiva dok je kod tkiva bez epitela izazvala kontrakciju.</s><s>Istraživanje je pokazalo da se tonus glatkih mišića može smanjiti odstranjenjem epitela.</s><s>Kao stimule kontrakcije upotrijebili su histamin i indometacin.</s><s>Relaksacija pod utjecajem PGE2 u preparatu s odstranjenim epitelom koji se stimulirao histaminom je uvijek bila slabija u usporedbi s kontroliranim preparatom koji sadrži netaknuti epitel.</s><s>Slični rezultati pojavili su se i kod pokusa na zečevima (Braunstein, Preparati bez epitelnog sloja nisu imali velik utjecaj na spazmogenost uzrokovanu indometacinom.</s><s>Također je važno naglasiti da indometacin poveća spazmogenu sposobnost histamina (Braunstein, et al., 1988).</s><s>U ovoj studiji (Braunstein, et al., 1988) potvrđena je hipoteza da postoji povezanost između epitela i derivatima AA proizvedenih po COX putu prostanoida s reakcijom na glatko mišićno tkivo.</s><s>U ovom radu napravljeno je više različitih analiza mjerenja utjecaja PGE2 na relaksaciju.</s>
<s>Prvo su obrađeni i analizirani podaci za ovisnost sile kontrakcije F uz stimulaciju s 50 µM histamina u prisutnosti različitih koncentracija PGE2.</s><s>Na Slici 23. prikazan je odnos relaksacijskog učinka PGE2 prikazanog simbolom ■ na x-osi te kontrakcije izazvane histaminom na y-osi koje su napravljene po Hill1 funkciji (2).</s><s>Tablica 13. pokazuje parametre funkcije Hill1: početnu vrijednost sile kod najmanje vrijednosti koncentracije PGE2 (Fstart = 100 %) te završnu vrijednost kod najveće koncentracije PGE2 (Fend = -13,45 %).</s><s>Također, iz tablice se može očitati senzitivnost Tablica 13.</s><s>Rezultati Hill1 funkcije, prilagođene ovisnosti relaksacije mišića uzrokovane PGE2.</s><s>Analiza se temelji na mjerenjima u referenci (Braunstein, et al., 1988) Vrijednost</s>
<s>Druga analiza sastoji se od podataka dobivenih od tkiva dušnika s odstranjenim epitelom.</s><s>Na Slici 24. prikazano je dodavanje PGE2 u različitim vrijednostima 0.01, 0.1 te 1 µM te se proučavala kontrakcija potaknuta različitim koncentracijama histamina.</s>
<s>Dakle, analizirala se ovisnost sile kontrakcije mišića o koncentraciji histamina uz dodatak različitih koncentracija PGE2.</s><s>Fmax je najveći pri koncentraciji PGE2 0,01 µM Slika 23.</s><s>Odnos sile, razvijene pod utjecajem 50 µM histamina i u prisutnosti različitih koncentracija relaksacijskog agonista PGE2.</s><s>Izmjerene vrijednosti dobivene su iz reference Braunstein, et al. (1988), putem digitalizacije i kod kontrole, gdje se upotrijebio samo histamin te se očitava u vrijednosti od 100 % što se prikazuje u Tablici 14.</s>
<s>Tablica 14.</s><s>Parametri Hill1 funkcije, prilagođene ovisnosti relaksacije mišića uzrokovane različitim koncentracijama histamina uz dodatak različitih koncentracija PGE2 (0,01 µM, 0,1 µM i 1 µM).</s><s>Analiza se temelji na mjerenjima u referenci (Braunstein, et al., 2015)</s>
<s>Navedeno iz Tablice 14. se prikazuje u obliku Slike 24.</s><s>Analiza je započeta u programu Origin gdje su se obradili podaci iz članka te dobile vrijednosti Fmax, K i n putem Hillove funkcije (Tablica 14.).</s><s>Nakon toga podaci obrađeni su za jednu koncentraciju histamina i to je 1000 µM.</s><s>Sakupljene su vrijednosti razvijene sile za sve koncentracije PGE2 (0,01 µM, 0,1 µM i 1 µM) kako bi se putem Hill1 funkcije (Jednadžba 2.) dobile vrijednosti Fstart, Fend, K i n (slika nije pokazana).</s><s>Dobivene vrijednosti prikazane su u Tablici 15.</s>
<s>Tablica 15.</s><s>Parametri Hill1 funkcije (slika nije pokazana), prilagođene ovisnosti relaksacije glatkih mišića uzrokovane PGE2, pod utjecajem 1000 µM histamina.</s><s>Analiza se temelji na mjerenjima u referenci (Braunstein, et al., 2015) Parametar</s>
<s>Iz Slike 24. se iščitava isto kao i iz Tablice 14., prilikom veće koncentracije PGE2 dolazi do manje kontrakcije glatkih mišića dok je kod najmanje koncentracije PGE2 vidljiva najveća kontrakcija pod utjecajem različitih koncentracija histamina.</s><s>Krivulja sile u zavisnosti od koncentracije histamina iscrtana crnom bojom i simbolom ■ predstavlja kontrolu (kod koncentracije PGE2 0 µM).</s><s>Krivulja iscrtana plavom bojom i simbolom ● predstavlja mjerenje kod koncentracije PGE2 od 0,01 µM.</s><s>Krivulja iscrtana zelenom bojom i simbolom ▲ predstavlja mjerenje kod koncentracije PGE2 od 0,1 µM.</s><s>Krivulja iscrtana crvenom bojom i simbolom ★ predstavlja mjerenje kod koncentracije PGE2 od 1 µM.</s>
<s>Strmina krivulje najveća je kod koncentracije PGE2 od 1µM (n = 1,75) zatim kod 0.1 Što se tiče senzitivnosti, najveća osjetljivost je postignuta kod kontrole, zatim kod 0,01 Slika 24.</s><s>Odnos kontrakcijske sile u ovisnosti o koncentraciji histamina u intervalu od 2 × 10-8 do 10-3 mol/L pod utjecajem različitih vrijednosti koncentracija relaksacijskog agonista PGE2 (0 µM (kontrola); 0,01 µM; 0,1 µM, 1 µM).</s><s>Krivulje se temelje na analizi izmjerenih vrijednosti u referenci Braunstein, et al. (2015) Tablica 16.</s><s>Usporedba parametara funkcije Hill1 za PGE2 pri različitim jedinkama.</s><s>Analiza se temelji na mjerenjima u referenci Braunstein, et al. (2015) DUŠNIK</s>
<s>Uspoređeni su podaci dobiveni od različitih jedinki pri kojima su vršene analize za različita tkiva.</s><s>Do najveće relaksacije zbog dodavanja PGE2 dolazi kod dušnika može očitati iz Tablice 15.</s><s>Najslabije izražena relaksacija je postignuta kod analize Nadalje, rezultati analize kod divljeg miša (Fend = 14,52 %) su između vrijednosti za čovjeka i zamorca što vidimo i po strmini krivulje (n = 0,87).</s><s>Osjetljivost je najveća kod analize za dušnik zamorca (K = 1,02 × 10-7 mol/L).</s><s>Nadalje, dušnik divljeg miša (K = 2,71 × 10-7 mol/L) nalazi se između vrijednosti za dušnik zamorca i male dišne puteve čovjeka čija se osjetljivost pokazala najmanjom (K = 4,19 × 10-7 mol/L).</s><s>Vrijednosti senzitivnosti pri analizi su poprilično slične te među njima nema većih razlika.</s><s>Sve su vrijednosti u istom redu veličine.</s><s>Velika je razlika u vrijednostima Fend, gdje je kod miševa i zamorca došlo do snažne relaksacije.</s><s>Kod ljudi relaksacija usprkos visokoj vrijednosti relaksacijskog agonista PGE2 nije savršena već doseže najmanje 40 % maksimalno razvijene sile pod utjecajem kontraktilnog histaminskog agonista.</s><s>6 Interpretacija i rasprava</s>
<s>Istraživanje razvoja sile kod glatkih mišićnih stanica uzrokovane eikosanoidima je vrlo bitno zbog razvoja novih lijekova te zbog razumijevanja same fiziologije kontrakcije i relaksacije mišića koje bi bile korisne u drugim poljima biomedicine.</s><s>Svrha ovog magistarskog rada je dobivanje parametara za matematički opis ovisnosti razvijene sile o koncentraciji eikosanoida koji induciraju kontrakciju ili relaksaciju u tkivima glatkih mišića dišnih putova u prisutnosti i odsutnosti aktivnih tvari.</s><s>Također, svrha ove analize je provjeriti mogu li se podaci izmjereni na životinjama prenijeti na fizikalnomatematičke modele koji simuliraju procese u čovjeku.</s><s>Na temelju obrađenih podataka došlo se do sljedećih zaključaka.</s><s>Kod prvih analiza zanimao nas je učinak LT na razvoj sile koja je bila razvijena karbakolom.</s><s>Kada se govori o stimulaciji animalnog i humanog tkiva s LTE4 pri čemu je maksimalna kontrakcija (Fmax = 100 %) izazvana s 10 µM karbakola, može se reći da rezultati variraju (Muccitelli, et al., 1987).</s><s>Kod animalnog tkiva dušnika Fmax iznosi 65,5 % dok je kod bronha čovjeka Fmax = 60,9 %.</s><s>Dakle, dolazi do veće kontrakcije glatkih mišića kod animalnog tkiva.</s><s>Bronhi čovjeka (K = 6,16 × 10-9 mol/L) senzitivniji su negoli dušnik zamorca (K = 8,84 × 10-8 mol/L) dok je strmina pri animalnom tkivu kontrakcije za LTD4 pri dušniku zamorca (Fmax = 60,1 %) manja negoli kod humanog bronha (Fmax = 87,4 %).</s><s>Također, može se primijetiti kako je senzitivnost veća za iako su vrijednosti slične odnosno usporedive.</s><s>Strmina krivulje je poprilično slična između bobe vrste tkiva iako je blago veća strmina kod animalnog tkiva (n = 0,78) negoli kod humanog tkiva (n = 0,88).</s><s>Sila kontrakcije za LTC4 kod tkiva zamorca naglašenija je kod humanog tkiva (n = 0,73) dok je pri animalnom tkivu nešto blaža (n animalnog i humanog tkiva su usporedivi s obzirom na to da su izvedeni u istim uvjetima.</s><s>Iako su uzorci tkiva uzeti iz različitog dijela dišnog sustava, možemo korelirati podatke, odnosno možemo reći da su vrijednosti između animalnog i humanog slične što govori u prilog tome da je moguće primijeniti parametre istraživanja s animalnog modela na humanom modelu.</s><s>Uspoređivani su i podaci HLP-a s tkivom dušnika zamorca i s bronhima čovjeka (Ravasi, et al., 2000).</s><s>Zanimao nas je učinak LT-a na razvoj sile stimuliran s 300 mM PGF2α.</s><s>Fmax se nije mogao usporediti izravno jer maksimalna sila nije uvijek bila ista.</s><s>Također, Fmax iz prijašnjeg eksperimenta ne može se usporediti s ovim podatkom Fmax.</s><s>Došlo se do zaključka da je strmina krivulje za LTC4 najizraženija pri HLP-u (n = 1,02), zatim kod bronha ljudi (n = 0,73) te naposljetku kod dušnika zamoraca (n = 8 mol/L).</s><s>Podaci za senzitivnost pri HLP i pri dušniku zamorca su vrlo slični s malim odstupanjima te se nalaze u istom redu veličine što potvrđuje hipotezu da je za navedene modele moguće prenijeti podatke izmjerene na životinjama u fizikalnomatematičke modele, koji simuliraju procese kod ljudi.</s><s>Logično je da će vrijednosti za ljudske bronhe odstupati s obzirom na to da je tkivo okruženo hrskavicom te je potrebna veća sila za razvoj mišićne kontrakcije.</s><s>LTD4 pri dušniku zamorca pokazao je najveću strminu krivulje (n = 0,88) između navedenih uzoraka.</s><s>Kod HLP-a je strmina manja (n = 0,68) dok se vrijednosti za ljudske bronhe (n = 0,78) nalaze između dvaju navedenih rezultata.</s>
<s>Također, prikazana je kontrakcija perifernih glatkih mišića parenhima respiratornog sustava čovjeka uzrokovana s PGD2 čija je maksimalna kontrakcija (Fmax = 100 %) provedena s 20 µM karbakola (Finney, et al., 1985).</s><s>Maksimalna izražena vrijednost kontrakcije je Fmax = 74,9 %.</s><s>Koncentracija kod poluzasićenog stanja iznosi K = 4,48 Nadalje, opisana je kontrakcija glatkih mišića bronha čovjeka koji su prethodno bili izloženi bolusu karbakola u količini od 500 µM i agonistima PGF2α i PGD2 kojima je analiziran razvoj sile (Black, et al., 2006).</s><s>Kontrakcija mišića bronha kod čovjeka mol/L).</s><s>Krivulja je strmija kod PGF2α (n = 0,88) dok je kod strmina PGD2 nešto manja Mogu se usporediti podaci za HLP (Ravasi, et al., 2000) i za periferne glatke mišiće ljudskih bronha uzrokovane s PGD2 (Black, et al., 2006) s obzirom na to da su tkiva iz topografski slične anatomske sredine.</s><s>S druge strane, teško ih je usporediti jer se ne radi o istim stimulansima kontrakcije niti o istim agonistima.</s><s>Fmax je veći za HLP kod dišnog sustava kod ljudskih bronha gdje su vrijednosti za PGD2 (Fmax = 54,7 %) i Analizirani su i parametri Hill1 funkcije, prilagođene ovisnosti relaksacije mišića uzrokovane različitim koncentracijama PGE2 kod tkiva dušnika zamorca s odstranjenim epitelom (Braunstein, et al., 1988).</s><s>Pokazano je da prilikom veće koncentracije PGE2 dolazi do manje kontrakcije glatkih mišića dok je kod najmanje koncentracije PGE2 vidljiva najveća kontrakcija pod utjecajem histamina.</s><s>Strmina krivulje pokazala se najvećom kod koncentracije PGE2 od 1µM (n = 1,75) zatim kod vrijednosti je postignuta pri koncentraciji od 0,01 µM PGE2 (K = 6,42 × 10-6 mol/L) analiziran utjecaj PGE2 na različite jedinke kod različitih tkiva te su se navedeni podaci međusobno uspoređivali.</s>
<s>Kod dušnika zamorca (Braunstein, et al., 1988) pri dodavanju PGE2 dolazi do najveće relaksacije (Fend = -13,45 %).</s><s>Pri analizi napravljenoj na glatkim mišićima malih dišnih puteva kod čovjeka (Safholm, et al., 2015) dolazi do najslabije relaksacije (Fend = 40,6).</s><s>Rezultati analize podataka (Fortner, et al., 2001) kod dušnika divljeg miša (Fend = 14,52) su između vrijednosti za zamorca i čovjeka što je vidljivo na parametru Fend.</s><s>Vrijednosti su zapravo slične iz razloga što se njihova senzitivnost nalazi u istom redu veličine što govori u prilog tome da je moguće primijeniti parametre istraživanja s animalnog modela na humanom modelu.</s>
<s>Na osnovi rezultata analize ne može se sa sigurnošću reći i zaključiti da su svi rezultati usporedivi.</s><s>Rezultati za leukotriene LTC4, LTE4 i LTD4 jesu.</s><s>Također, može se reći da su rezultati usporedbe PGE2 pri različitim koncentracijama također usporedivi.</s><s>Iako su analize napravljene u različitim uvjetima, pri različitim jedinkama, svejedno možemo potvrditi neke sličnosti između animalnog i humanog tkiva – funkciju, odnosno fiziologiju samih uzoraka.</s><s>Glatko mišićno tkivo čovjeka te dušnik zamorca razvijaju skoro istu maksimalnu silu kontrakcije u prisutnosti LTE4.</s><s>Senzitivnost i nagib krivulje za LTD4 i LTC4 su vrlo sličnih vrijednosti te možemo reći da se testovi na životinjskim modelima mogu primijeniti kao model za ljudski.</s><s>Nadalje, rezultati analize za HLP i dušnik zamorca gdje smo promatrali učinak LT-a na razvoj sile stimuliran s 300 mM PGF2α imaju usporedive vrijednosti s obzirom na to da je postignuta senzitivnosti istog reda veličine s malim odstupanjima u vrijednostima.</s><s>Analize kod PGD2 za HLP i glatko mišićno tkivo bronha čovjeka nisu usporedive zbog uporabe različitih agonista te različitog tkiva.</s><s>Došli smo do zaključka da prilikom veće koncentracije PGE2 dolazi do manje kontrakcije glatkih mišića dok je kod najmanje koncentracije PGE2 vidljiva najveća kontrakcija pod utjecajem histamina.</s><s>Pri dodavanju PGE2 kod dušnika zamorca dolazi do najveće relaksacije.</s><s>Rezultati analize podataka kod dušnika divljeg miša su između vrijednosti za zamorca i čovjeka.</s><s>Dakle, kod glatkih mišića malih dišnih puteva kod čovjeka dolazi do najslabije relaksacije.</s><s>Vrijednosti senzitivnosti kod sva tri modela su jako slične, pogotovo za dušnik zamorca i divljeg miša što je i očekivano s obzirom na to da se analiza radila na istoj vrsti tkiva te među istim redom sisavaca.</s><s>Teže je dokazati korisnost animalnih modela za upotrebu na humanim modelima s obzirom na različite razvoje sile kontrakcije i relaksacije pri navedenima.</s><s>Mogu se utvrditi povezanosti između ljudskih i životinjskih modela za razvoj sile u kontrakciji glatkih mišića dišnih putova iako postoje i ograničenja jer se istraživanja provode na različitim tkivima i u različitim uvjetima.</s><s>7 Zaključak</s>
<s>Iz završnog rada možemo ustanoviti da modeliranje pomaže pri eksperimentalnim opažanjima koja razvijaju dublje razumijevanje o utjecaju eikosanoida na kontrakciju i relaksaciju glatkih mišića respiratornog sustava.</s><s>Ovakvi fizikalno-matematički pristupi modeliranja ključni su za daljnji napredak u području istraživanja eikosanoida te njihovog utjecaja.</s>
<s>Pomoću fizikalno-matematičkih modela, znanstvenici bi mogli lakše simulirati način razvoja sile kontrakcije i relaksacije glatkih mišića respiratornog puta čovjeka.</s><s>Neki od dobivenih parametara matematičkih ovisnosti (funkcija), koje su prilagođene izmjerenim ovisnostima sile, odnosno razvijene pod utjecajem različitih eikosanoida kontraktilnih i relaksacijskih agonista kod životinja, mogli bi se primijeniti za ljudske studije s obzirom na slične rezultate modeliranja.</s><s>Pri analizi razvoja sile kod glatkog mišićnog tkiva dušnika čovjeka te bronha zamoraca dobiveni se rezultati mogu korelirati zbog sličnih vrijednosti parametara razvoja sile koja ovisi o koncentraciji cisteinil-leukotriena LTC4 i LTD4.</s><s>Dakle, navedeni modeli su usporedivi dok to ne možemo tvrditi za LTE4 gdje dolazi do mnogo većih odstupanja modela.</s><s>Bronhi zamoraca su puno osjetljiviji na LTE4 negoli tkivo dušnika čovjeka.</s><s>Razlika u konstanti pola zasićenja je cijeli red veličine, dok se maksimalne vrijednosti sile razvijene između različitih tkiva ne mogu točno usporediti jer su za određivanje referentne maksimalne sile korišteni različiti agonisti s različitim koncentracijama.</s>
<s>Što se tiče analize razvoja sile pri ovisnosti sile od koncentracije LTC4 i LTD4 pri plućnom parenhimu čovjeka (HLP), vidljivo je da je to tkivo puno osjetljivije na LTD4 negoli na LTC4 jer je konstanta polovične zasićenosti kod LTD4 za cijelu veličinu reda manja.</s><s>Provedeni eksperimenti raznih znanstvenika govore u prilog tome da su općenito kontraktilni učinci za LTC4 i LTD4 usporedivi odnosno sličnih vrijednosti te je upravo iz tog razloga iznenađujuće da se pri ovoj analizi očitava dva puta veća razvijena maksimalna sila kontrakcije pod utjecajem LTD4 negoli kod LTC4.</s><s>Kada govorimo o prostaglandinima, možemo reći da su PGD2 i PGF2α oni s kontraktilnim učinkom.</s><s>Maksimalna sila kontrakcije pod utjecajem PGF2α je dva puta veća negoli kod PGD2 što govori u prilog tome da je ljudsko tkivo bronha osjetljivije na PGF2α negoli na PGD2.</s><s>Usporedba između bronha i HLP kaže da je parenhim (HLP) za cijeli red veličine osjetljiviji na PGD2.</s><s>Za PGF2α usporedbu nije bilo moguće izvesti.</s><s>Analiza usporedbe odgovora ljudskih bronha na kontraktilne utjecaje prostaglandina (PGD2 i PGF2α) i cistenil-leukotriena (LTC4, LTD4 i LTE4) pokazala je da su maksimalna sila i nagib krivulje kod odgovora na navedeno poprilično usporedivi.</s><s>Kod opisa osjetljivosti na kontraktilni odgovor dolazi do najveće razlike.</s><s>Kod leukotriena dolazi do razvoja polovično razvijene maksimalne sile kod 100 do 1000 puta niže koncentracije negoli kod prostaglandina.</s><s>Upravo zbog navedenog puno veću ulogu pri kontrakciji dišnih putova čovjeka pripisujemo leukotrienima.</s><s>Kada govorimo o polovičnom razvoju maksimalne sile pod utjecajem leukotriena i histamina, tada do razvoja sile u primjeru leukotriena dolazi kod 1000 do 10000 puta niže koncentracije negoli kod histamina.</s><s>Odaziv na supramaksimalne koncentracije je sličan.</s><s>Nadalje, u smislu relaksacije analizirana su tkiva dušnika miša i zamoraca te tkiva malih dišnih puteva čovjeka.</s><s>U ovoj analizi ispitan je utjecaj PGE2 koji je između svih eikosanoida najjači relaksant glatkih mišića dišnih putova.</s><s>Kako bi se ispitala sama relaksacija, tkivo je prethodno bilo kontrahirano acetilkolinom ili histaminom.</s><s>Koncentracija PGE2 koja je dovela do 50 % smanjenja sile je u svim primjerima iznosila između 1 i 4 × 10-7 mol/L što pokazuje da je osjetljivost tkiva na relaksaciju pod utjecajem PGE2 kod svih tkiva približno slična.</s><s>Najveća razlika kod analize prepoznaje se u očitavanju parametra Fend koji predstavlja razinu kontrakcije kod visokih koncentracija relaksanta PGE2.</s><s>Najniža vrijednost, koja je negativna, postignuta je u dušniku zamorca (Fend = -13,45 %), dok je kod dušnika miša ta vrijednost bila + 14,5 %, a u manjim dišnim putevima čovjeka + 40,6 %.</s><s>Razlog za to mogao bi biti da se PGE2 kod visokih koncentracija veže na receptor za tromboksan (TP) što rezultira kontraktilnim odgovorom.</s><s>To bi objasnilo zašto je u ovoj analizi smanjen relaksacijski učinak PGE2 kod malih dišnih putova čovjeka.</s><s>Također postoje različiti receptori vezanja PGE2 kao što su EP2 i EP4, koji imaju različite karakteristike prijenosa signala relaksacije, što bi također moglo objasniti kako je došlo do velike razlike u vrijednostima.</s>
<s>Glavni zaključak navedenih i opisanih analiza je da postoje podudaranja i sličnosti pri kontrakcijskim i relaksacijskim odgovorima kod ljudskog i životinjskog modela.</s><s>Pretjerano izjednačavanje modela može biti nesigurno, posebice kada se mjerenja dalje upotrebljavaju u kvantitavnim analizama kod matematičkih modela koji služe za modeliranje i predviđanje učinka lijekova s primarnim osvrtom na proizvodnju eikosanoida te njihovog utjecaja na bronhokonstrikciju i bronhorelaksaciju.</s><s>Izvršene analize izvođene su na različitim tipovima tkiva, koje se izuzetno razlikuju histološki i morfološki, zbog čega se patološki i fiziološki procesi kontrakcije i relaksacije mogu nešto drugačije odvijati.</s><s>Na temelju tih nalaza predlažemo da se za daljnju upotrebu u matematičkim modelima koriste ovisnosti sila koje su specifične za organizam i vrstu tkiva koje će se simulirati.</s>