UTJECAJ EIKOSANOIDA NA KONTRAKCIJU
I RELAKSACIJU GLATKIH MIŠIĆA
RESPIRATORNOG PUTA
(Magistarski rad)

Maribor, 2020

Karlo Blažetić

UTJECAJ EIKOSANOIDA NA KONTRAKCIJU
I RELAKSACIJU GLATKIH MIŠIĆA
RESPIRATORNOG PUTA
(Magistarski rad)

Maribor, 2020

Karlo Blažetić

Mentor: doc. dr. Aleš Fajmut

ZAHVALA
Iskreno zahvaljujem svom mentoru doc. dr. Alešu Fajmutu za svu pomoć, trud,
strpljenje, savjetovanje tijekom studija i vođenje u istraživanju i pisanju magistarskog
rada.
Zahvaljujem svojim roditeljima, prijateljima i kolegama na podršci.

Priloga 6 - IZJAVA O AVTORSTVU IN ISTOVETNOSTI TISKANE IN ELEKTRONSKE
OBLIKE ZAKLJUČNEGA DELA
UNIVERZA V MARIBORU
Fakulteta za zdravstvene vede
(ime članice UM)

IZJAVA O AVTORSTVU IN ISTOVETNOSTI TISKANE IN ELEKTRONSKE OBLIKE
ZAKLJUČNEGA DELA

Ime in priimek študent‐a/‐ke:   Karlo Blažetić

Študijski program:   bioinformatika

Naslov zaključnega dela: Utjecaj eikosanoida na kontrakciju i relaksaciju glatkih mišića
respiratornog puta
Mentor: doc. dr. Aleš Fajmut
Somentor:

Podpisan‐i/‐a študent/‐ka   Karlo Blažetić

•
izjavljam, da je zaključno delo rezultat mojega samostojnega dela, ki sem ga izdelal/‐a ob
pomoči mentor‐ja/‐ice oz. somentor‐ja/‐ice;
•
izjavljam, da  sem pridobil/‐a  vsa  potrebna  soglasja  za uporabo podatkov in  avtorskih  del v
zaključnem delu in jih v zaključnem delu jasno in ustrezno označil/‐a;
•
na Univerzo v Mariboru neodplačno, neizključno, prostorsko in časovno neomejeno prenašam
pravico shranitve avtorskega dela v elektronski obliki, pravico reproduciranja ter pravico
ponuditi zaključno delo javnosti na svetovnem spletu  preko  DKUM;  sem seznanjen/a, da
bodo dela deponirana/objavljena v DKUM dostopna široki javnosti pod pogoji licence Creative
Commons BY‐NC‐ND, kar vključuje tudi avtomatizirano indeksiranje preko spleta in obdelavo
besedil za potrebe tekstovnega in podatkovnega rudarjenja in ekstrakcije znanja iz vsebin;
uporabnikom se dovoli reproduciranje brez predelave avtorskega dela, distribuiranje, dajanje v
najem in priobčitev javnosti samega izvirnega avtorskega dela, in sicer pod pogojem, da
navedejo avtorja in da ne gre za komercialno uporabo;
•
dovoljujem objavo svojih osebnih podatkov, ki so navedeni v zaključnem delu in tej izjavi,
skupaj z objavo zaključnega dela;
•
izjavljam, da je tiskana oblika zaključnega dela istovetna elektronski obliki zaključnega dela, ki
sem jo oddal/‐a za objavo v DKUM.

Uveljavljam permisivnejšo obliko licence Creative Commons:       CC BY   4.0    (navedite obliko)

Datum in kraj:
20.02.2020
Podpis študent‐a/‐ke:

I

UTJECAJ EIKOSANOIDA NA KONTRAKCIJU I
RELAKSACIJU GLATKIH MIŠIĆA RESPIRATORNOG PUTA
SAŽETAK
Eikosanoidi su metaboliti arahidonske kiseline. Između njih prostaglandini i
leukotrieni imaju najvažnije biološke učinke i uloge u organizmu. Jedna od tih uloga
je kontrakcija/relaksacija glatkih mišića respiratornog sustava. Tako je dereguliranjem
produkcije eikosanoida moguća bronhokonstrikcija kod astme.
U ovom radu usredotočujemo se na ovisnost sile glatkih mišića različitih tkiva iz
različitih subjekata, čovjeka i životinja o različitim vrstama eikosanoida. Opisat ćemo
mehanizme nastanka eikosanoida, receptore preko kojih oni djeluju te njihovu
funkciju.
Analizirali smo mjerenja kontrakcije i relaksacije glatkih mišića dišnih putova pod
utjecajem različitih eikosanoida. Među ljudskim tkivima analizirane su sile razvijene
u glatkim mišićima bronha, malih dišnih puteva te plućnog parenhima. Kod
životinjskog modela uzeti su uzorci tkiva glatkih mišića s dušnika miša te zamorca.
Digitalizacijom mjerenja obradili smo podatke iz različitih znanstvenih članaka.
Koristeći računalni program Origin 8.5 s alatom Digitizer, digitalizirali smo ovisnosti
dišnih putova glatkih mišića različitih organizama o koncentracijama eikosanoida i
drugih kontraktilnih agonista te odredili parametre tih ovisnosti prilagođavanjem
različitih odabranih matematičkih funkcija (različiti oblici Hill funkcije). Napravili
smo usporedbu parametara između različitih organizama i između mjerenja različitih
autora. Nadalje, usporedili  smo jačine eikosanoidne kontrakcije s drugim fiziološkim
kontraktilnim agonistima i na kraju objasnili je li moguće prenijeti podatke izmjerene
na životinjama u fizikalno-matematičke modele, koji simuliraju procese kod ljudi.
Ključne riječi: prostaglandini, leukotrieni, arahidonska kiselina, bronhokonstrikcija,
digitalizacija.

II

EFFECT OF EICOSANOIDS ON THE CONTRACTION AND
RELAXATION OF AIRWAY SMOOTH MUSCLES
ABSTRACT
Eicosanoids are the metabolites of arachidonic acid. Among them prostaglandins and
leukotrienes have the most important biological activities and roles in the human
organism. One of these roles is related to the contraction/relaxation of smooth muscles,
especially
in airways. Their dysregulation in production
may
lead to
bronchoconstriction in asthma.
Here we focus on the relationship of the developed force in airway smooth muscle
cells taken from different tissues and from different subjects, human and animal, with
respect to different eicosanoids. First, the mechanisms of the production of
eicosanoids, their action through receptors and their function is described.
The main goal was to analyse the measurements of the developed force in airway
smooth muscles with respect to different eicosanoids, either contractile or relaxing. In
case of human tissues, we analysed the developed force in smooth muscles of bronchi,
small airways and the pulmonary parenchyma. In case of animals, the analysis was
performed for the smooth muscles of the mouse and guinea pig tracheas.
For this purpose we first digitized measured dependencies of forces versus eicosanoid
concentrations with the Digitizer tool within the computer program Origin 8.5. Then
we fitted these dependencies with different forms of Hill functions and determined the
parameter values within these functions. Further, we compared these parameters
between different organisms and between measurements of different authors. Based
on this information, the strength of contractile and relaxation eicosanoids was
evaluated. Finnaly, by comparing the parameter values obtained from human with
those from animals, we determined, whether the results differed from each other and
whether the data obtained from animals could be transferred to physical-mathematical
models that simulate processes in humans.

Keywords: prostaglandins, leukotrienes, arachidonic acid, bronchoconstriction,
digitization.

III

VPLIV EIKOZANOIDOV NA KRČENJE IN RELAKSACIJO
GLADKIH MIŠIC DIHALNIH POTI
RAZŠIRJENI POVZETEK V SLOVENSKEM JEZIKU
Eikozanoidi so bili odkriti v obliki prostaglandinov (PG) v tridesetih letih prejšnjega
stoletja. So metaboliti arahidonske kisline (AA), ki je večkrat nenasičena dolgoverižna
maščobna kislina z dvajsetimi atomi ogljika (Jakiela, 2013). Prisotni so v živalskem in
rastlinskem svetu. Gre za zelo veliko biološko družino s širokim naborom bioloških
učinkov.
Ločimo 4 možne biosintetske poti metabolizma AA. Dve najpomembnejši poti sta
ciklooksigenazna pot, po kateri se tvorijo prostanoidi, med katere prištevamo tri
prostaglandine (PG), prostaciklin (PGI2) in tromboksan (TXA2), ter lipoksigenazna
pot, po kateri nastajajo levkotrieni (LT), lipoksini (Lx) in hidroksitetraenojske kisline
(HETE) (Vane, et al., 2002). Poleg teh so produkti metabolizma AA še eoksini (Pr) in
trioksilini (TRX), ki nastajajo po anandaminski poti in s pomočjo citokroma P450
(CYP450) .
Nesteroidni antirevmatiki oz. nesteroidna protivnetna zdravila (angl. non-steroidal
anti-inflammatory drugs; NSAID) znižujejo sintezo prostanoidov preko inhibicije
encimov COX-1 in COX-2 in imajo pomembno vlogo pri kontrakciji oziroma
relaksaciji gladkih mišičnih celic predvsem dihalnih poti.
PG so skupina ciklopentatskih maščobnih kislin z dvajsetimi atomi ogljika. Najdemo
jih v skoraj katerem koli sistemu tkiva in organov. Med PG uvrščamo PGE2, PGI2,
PGF2α , PGD2, ter TXA2 in TXB2.
PGE2 v največji meri nastaja v ledvicah in se veže na receptorje EP1, EP2, EP3, EP4.
Ima funkcijo povečevanja števila makrofagov, vazokonstrikcije, bronhodilatacije,
krčenja maternice in sproščanja nevrotransmiterjev (Hanna, & Hafez, 2018).
PGI2 nastaja pretežno v epitelijskih celicah srca in žil ter se veže na receptor IP, preko
katerega zavira agregacijo trombocitov in uravnava delovanje tumorskega faktorja
nekroze (TNF-α).
PGF2α nastaja pretežno v reproduktivnem sistemu in se veže na receptor FP. Povzroča
vazokonstrikcijo, krčenje bronhijev in krčenje materničnih gladkih mišic.

IV

PGD2 nastaja predvsem v celicah osrednjega živčnega sistema in možganov in se veže
na receptorje DP1, CRTH2 in ima funkcijo pri vazodilataciji, zorenju mastocitov in
zorenju bazofilcev in eozinofilcev.
TXA2 in TXB2 nastajata večinoma v trombocitih in se vežeta na receptor TPα, s čimer
uravnavata agregacijo trombocitov.
Vsi prostanoidi nastajajo v vseh celicah našega organizma, saj metabolizem
arahidonske kisline poteka v prav vsaki celici. Količina proizvedene posamezne vrste
prostanoidov pa je odvisna od lokalne ekspresije genov za encime, ki so specifični za
proizvodnjo posamezne vrste prostanoidov. Eden izmed glavnih in ključnih virov
prostanoidov pa so levkociti, še posebej pa mastociti in eozinofilci, ter makrofagi.
Učinkovanje vseh eikozanoidov je podobno učinkovanju hormonov, je deloma
parakrino in deloma avtokrino, pri čemer je dolgoživost eikozanoidov v krvnem
obtoku in intersticiju veliko krajša kot pri hormonih, saj se eikozanoidi hitro
metabolizirajo dalje do biološko neučinkovitih oblik.
Med levkotriene (LT) prištevamo tri cisteinil (cis) levkotriene (LTC4, LTD4 in LTE4)
in LTB4, ki ima drugačne funkcije. CisLT so najmočnejši bronhokonstriktorji pri
ljudeh in imajo ključno vlogo pri astmatični obstrukciji dihalnih poti. Po drugi strani
lahko cisLT povečajo proizvodnjo sluzi in povzročajo lokalni edem, kar je značilen
znak vnetja.
Glavni namen naloge je bil pridobiti parametre za matematični opis odvisnosti razvite
sile od koncentracije eikozanoidov, ki sprožajo kontrakcijo oziroma relaksacijo v
gladkih mišičnih celicah dihalnih poti. V ta namen smo s programskim orodjem
Digitizer Tool v programu Origin 8.5 digitalizirali odvisnosti sil v gladkih mišicah
dihalnih poteh različnih organizmov od koncentracij eikozanoidov in drugih
kontraktilnih agonistov in s pomočjo prilagajanj matematičnih funkcij (različne oblike
Hillovih funkcij, ki sta predstavljeni v enačbah (1) in (2)) določali pramatere teh
odvisnosti. Pri človeku smo analizirali meritve, izvedene na gladki mišičnini iz
bronhov, velikih dihalnih poti in pljučnega parenhima. Pri živalih smo analizirali
meritve, izvedene na gladki mišičnini iz sapnika miši in morskih prašičkov. Na koncu
smo izvedli primerjavo teh parametrov med različnimi organizmi in med meritvami
različnih avtorjev. Na podlagi teh informacij smo ocenili jakost kontraktilnih in

V

relaksacijskih eikozanoidov. Iz primerjave parametrov meritev, ki so bile opravljene
na človeku in na živalih, pa smo ugotavljali, ali se rezultati med seboj razlikujejo in ali
je mogoč prenos podatkov v fizikalno-matematične modele, ki simulirajo
kontraktilne/relaksacijske učinke eikozanoidov.
Parametri razvite sile v odvisnosti od koncentracij cisteinil levkotrienov LTC4 in LTD4
so za gladko mišično tkivo iz sapnika človeka in iz bronhov morskega prašička zelo
podobni, zato lahko trdimo, da se rezultati poskusov na živalskih modelih morskega
prašička lahko vzporejajo s poskusi na človeškem tkivu. Do večjih razlik prihaja pri
LTE4, na katerega je gladko mišično tkivo iz bronhov morskih prašičkov mnogo bolj
občutljivo kot človeško tkivo iz sapnika. Razlika v konstanti polovične zasičenosti je
cel velikostni razred. Maksimalnih vrednosti razvitih sil med različnimi tkivi ni
mogoče natančno primerjati, saj so bili za določitev referenčne maksimalne sile
uporabljeni različni agonisti z različnimi koncentracijami. Nakloni prilagojenih
Hillovih funkcij so primerljivi.
Analiza odvisnosti sile od koncentracij LTC4 in LTD4 v človeškem pljučnem
parenhimu (HLP) kaže, da je to tkivo bistveno bolj občutljivo na LTD4 kot na LTC4.
Konstanta polovične zasičenosti je namreč pri LTD4 za cel velikostni razred manjša.
Pod vplivom LTD4 se razvije tudi pribl. dvakrat višja maksimalna sila kot pri LTC4.
To je presenetljivo, saj velja na splošno, da sta kontraktilna učinka LTC4 in LTD4
primerljiva. O tem pričajo eksperimenti, izvedeni na človeških bronhih.
Od prostaglandinov imata kontraktilni učinek PGD2 in PGF2α. Poskusi, izvedeni na
gladkih mišicah bronhov kažejo, da je to tkivo bolj senzitivno na PGF2α kot na PGD2.
Pod vplivom PGF2α se razvije tudi pribl. dvakrat višja maksimalna sila kot pod
vplivom  PGD2. Primerjava med človeškima tkivoma bronhov in parenhima kaže, da
je parenhim za velikostni razred bolj občutljiv na PGD2 kot bronhi. Za PGF2α
primerjave ni bilo mogoče izvesti.
Primerjava odziva človeških bronhov na kontraktilne prostaglandine (PGD2 in PGF2α)
in cisteinil levkotriene (LTC4, LTD4 in LTE4) kaže, da so maksimalne razvite sile in
nakloni odzivov dokaj primerljivi, največja razlika pa je v senzitivnosti kontraktilnega
odziva, saj pride do razvoja polovične maksimalne sile v primeru cisteinil levkotrienov
pri od 100 do 1000 -krat nižji koncentraciji kot pri prostaglandinih. Zato citeinil

VI

levkotrienom pripisujemo veliko večjo vlogo pri kontrakciji dihalnih poti. Podobno
velja, če primerjamo senzitivnost kontraktilnega odziva cisteinil levkotrienov in
histamina. Do razvoja polovične maksimalne sile v primeru cisteinil levkotrienov
pride pri od 1000 do 10000 -krat nižji koncentraciji kot pri histaminu, odziv na
supramaksimalne koncentracije pa je podoben.
Izmed vseh eikozanoidov povzroča najmočnejšo relaksacijo gladkih mišic dihalnih
poti PGE2. Analizirali smo meritve relaksacijskih učinkov PGE2, pri čemer je bila sila
predhodno razvita z različnimi kontraktilnimi agonisti – acetilholinom ali histaminom.
Analizirali smo tkivo sapnika miši, tkivo majhnih dihalnih poti človeka in tkivo
sapnika morskih prašičkov. Analiza meritev je pokazala, da je senzitivnost relaksacije
v vseh primerih približno enaka, saj koncentracija PGE2, ki privede do zmanjšanja sile
za 50 %, v vseh primerih znaša med 1 in 4 ×10-7 mol/L. Parameter, po katerem se
meritve najbolj razlikujejo, pa je vrednost sile, ki se razvije pri zelo veliki koncentraciji
PGE2 (Fend). Najnižja vrednost, ki je celo negativna, je bila dosežena pri sapniku
morskih prašičkov (Fend= -13,45 %), pri sapniku miši je bila ta vrednost +14,5 %, pri
malih dihalnih poteh človeka pa +40,6 %. Razlog za tako velike razlike bi lahko bila
različna izraženost receptorjev EP2 in EP4 za PGE2 v različnih tkivih, preko katerih
deluje PGE2 relaksacijsko, vendar z drugačnimi karakteristikami. Zmanjšan
relaksacijski učinek PGE2, ki so ga zaznali v gladkih mišicah majhnih dihalnih poti
človeka pri visokih koncentracijah PGE2, pa je najverjetneje posledica delovanja in
vezave PGE2 na receptor TP (receptor za tromboksane), kar pa pri visokih
koncentracijah lahko sproži kontraktilni odziv. Združitev relaksacijskega učinka z
večjo senzitivnostjo in kontraktilnega učinka z manjšo senzitivnostjo bi tako lahko
rezultirala obliko relaksacijskega odziva, ki se zasiči pri nekaj deset procentih
maksimalne kontrakcije pri visokih koncentracijah PGE2.
Glavni zaključek omenjenih analiz je, da obstajajo določene skupne lastnosti in
podobnosti v kontraktilnih in relaksacijskih odzivih tkiv živali in človeka, a da je
pretirano enačenje učinkov nevarno, še posebej ko se meritve nadalje uporabljajo v
kvantitativnih analizah v matematičnih modelih, kjer se napovedujejo učinki
zdravilnih učinkovin na produkcijo eikozanoidov in na njihove nadaljnje učinke v
smislu bronhokonstrikcije/bronhodilatacije. Prav tako obstajajo velike razlike med
različnimi tkivi iz dihalnih poti (pljučni parenhim, sapnik, bronhi), ki so izvzeta iz

VII

enakih organizmov (npr. človeka). Na podlagi teh ugotovitev podajamo predlog, da se
naj za nadaljnjo uporabo v matematičnih modelih uporabljajo odvisnosti sil, ki so
specifične za organizem in za tip tkiva, ki se simulira v organizmu.
Ključne besede: prostaglandini, levkotrieni, arahidonska kislina, bronhokonstrikcija,
digitalizacija.

VIII

SADRŽAJ
1 Uvod i opis problema......................................................................................... 1
2 Svrha i ciljevi rada ............................................................................................ 3
3 Istraživačka pitanja
........................................................................................... 4
4 Istraživačka metodologija ................................................................................. 5
4.1 Istraživačke metode .................................................................................... 5
4.2 Upotrijebljeni izvori ................................................................................... 6
5 Obrada teme ...................................................................................................... 7
5.1 Eikosanoidi i respiratorni sustav ................................................................. 7
5.2 Mišićno tkivo ............................................................................................. 8
5.3 Arahidonska kiselina (AA) ......................................................................... 9
5.3.1 Distribucija AA ..............................................................................10
5.3.2 Metabolizam AA ............................................................................10
5.4 Metabolički putevi AA ..............................................................................14
5.4.1 Ciklooksigenazni metabolički put ...................................................14
5.4.2 Lipoksigenazni metabolički put ......................................................15
5.4.3 Anandaminski metabolički put .......................................................15
5.4.4 Metabolički put CYP450 ..................................................................17
5.5 Prenosioci signala i receptori .....................................................................18
5.5.1 Uloga Ca2+ pri kontrakciji glatkih mišića ......................................20
5.6 Prostaglandini (PG) ...................................................................................22
5.6.1 Biosinteza prostanoida
...................................................................27
5.6.2 PGE2 .............................................................................................27
5.6.3 PGI2...............................................................................................28
5.6.4 PGD2 .............................................................................................29

IX

5.6.5 PGF2α ............................................................................................30
5.7 Leukotrieni (LT)
........................................................................................31
5.7.1 Biosinteza LT .................................................................................33
5.8 Nesteroidni protuupalni lijekovi ................................................................35
5.8.1 Utjecaj nesteroidnih protuupalnih lijekova na kontrakciju glatkih
mišića dišnog sustava ....................................................................36
5.9 Analiza mjerenja kontrakcije/relaksacije glatkih mišićnih dišnih puteva u
ovisnosti od biološki aktivnih eikosanoida
.................................................39
6 Interpretacija i rasprava ..................................................................................59
7 Zaključak
..........................................................................................................63
Literatura
..............................................................................................................66

X

POPIS SLIKA
Slika 1: Mišićno tkivo
.............................................................................................. 8
Slika 2. Kemijska struktura AA.
............................................................................... 9
Slika 3. Mjesto hidrolize PLA, PLC i PLD te oslobađanje AA. ...............................11
Slika 4. Metabolizam AA po liposigenaznom (LOX) i ciklooksigenaznom (COX) putu
uz opisane enzime koji pretvaraju AA u konačne metabolite. ....................13
Slika 5. Sinteza anandamina.
...................................................................................16
Slika 6. Shematski prikaz procesa stimulacije agonista i posljedične kontrakcije
glatkog mišićnog tkiva. .............................................................................22
Slika 7. Shematski prikaz vezanja PG na receptore te njihov utjecaj na kontrakciju i
relaksaciju. ................................................................................................25
Slika 8. Shematski prikaz kontrakcije i relaksacije vas deferensa uzrokovane PG-om.

..................................................................................................................26
Slika 9. Kemijska struktura PGE2.
...........................................................................28
Slika 10. Kemijska struktura PGI2.
..........................................................................29
Slika 11. Kemijska struktura PGD2. ........................................................................30
Slika 12. Kemijska struktura PGF2α.
........................................................................31
Slika 13. Biosinteza CisLT-a putem AA i njihova uloga u raznim bolestima. AA
katalizira 5-LOX enzim.
............................................................................34
Slika 14. Interakcija lijekova i LT ...........................................................................38
Slika 15. Rezultati mjerenja ovisnosti sile kontrakcije za agoniste LTC4, LTD4, LTE4
kod dušnika zamoraca (simboli) i mjerenja prilagođena Hillovoj funkciji
(krivulje). ..................................................................................................42
Slika 16. Rezultati ovisnosti sile kontrakcije za agoniste LTC4, LTD4, LTE4 kod ljudi
– bronhi (simboli) i mjerenja prilagođena Hillovoj funkciji (krivulje). .......43
Slika 17. Usporedba ovisnosti sile i koncentracije agonista kod humanog i animalnog
tkiva kroz mjerenja prilagođena Hillovoj funkciji gdje crne krivulje
predstavljaju uzorak ljudi dok crvena zamorce. .........................................45
Slika 18. Rezultati kontrakcije HLP-a – odnos sile uzrokovane različitim
koncentracijama agonista LTD4 i LTC4. ....................................................47

XI

Slika 19. Rezultati kontrakcije HLP-a uzrokovane različitim koncentracijama agonista
PGD2.
........................................................................................................48
Slika 20. Odnos sile kontrakcije izazvane različitim koncentracijama agonista PGD2 i
PGF2α na kontrakciju mišića ljudskih bronha. ............................................50
Slika 21. Omjer sile razvijen u glatkim mišićima dušnika divljeg miša pod utjecajem
10 µM Ach i istodobne prisutnosti različitih koncentracija relaksacijskog
agonista PGE2. ..........................................................................................52
Slika 22. Odnos sile, razvijene pod utjecajem 1 µM histamina i u prisutnosti različitih
koncentracija relaksacijskog agonista PGE2.
..............................................53
Slika 23. Odnos sile, razvijene pod utjecajem 50 µM histamina i u prisutnosti različitih
koncentracija relaksacijskog agonista PGE2.
..............................................55
Slika 24. Odnos kontrakcijske sile u ovisnosti o koncentraciji histamina u intervalu od
2 × 10-8 do 10-3 mol/L pod utjecajem različitih vrijednosti koncentracija
relaksacijskog agonista PGE2 (0 µM (kontrola); 0,01 µM; 0,1 µM, 1 µM). 57

XII

POPIS TABLICA
Tablica 1. Tipovi receptora i uloga eikosanoida........................................................ 2
Tablica 2. Strategija pretraživanja literature ............................................................. 6
Tablica 3. CYP450 – ligandi, glavna mjesta proizvodnje, njihovi srodni receptori te
njihove funkcije ....................................................................................17
Tablica 4. Prenošenje signala između receptora i PG
...............................................20
Tablica 5. Prostanoidi – ligandi, glavna mjesta proizvodnje, njihovi srodni receptori te
njihova efektorska funkcija ...................................................................24
Tablica 6. Biološki učinci LT – agonisti, receptori i njihova efektorna funkcija
.......32
Tablica 7. Parametri Hillove funkcije, prilagođene ovisnosti razvijene sile mišića
uzrokovane leukotrienima kod dušnika zamoraca i bronha ljudi.
...........41
Tablica 8. Parametri Hillove funkcije, prilagođene ovisnosti kontrakcije mišića
uzrokovane leukotrienima LTD4 i LTC4 kod ljudi.
................................46
Tablica 9. Rezultati Hillove funkcije, prilagođene ovisnosti kontrakcije HLP-a
uzrokovane s PGD2.
..............................................................................48
Tablica 10. Parametri Hillove funkcije prilagođene ovisnosti kontrakcije mišića
ljudskih bronha uzrokovane s PGD2 i PGF2α. ........................................49
Tablica 11. Rezultati Hill1 funkcije, prilagođene ovisnosti relaksacije glatkih mišića
dušnika divljeg miša uzrokovane s PGE2. .............................................51
Tablica 12. Rezultati Hill1 funkcije, prilagođene ovisnosti relaksacije mišića
uzrokovane PGE2.
.................................................................................53
Tablica 13. Rezultati Hill1 funkcije, prilagođene ovisnosti relaksacije mišića
uzrokovane PGE2.
.................................................................................55
Tablica 14. Parametri Hill1 funkcije, prilagođene ovisnosti relaksacije mišića
uzrokovane različitim koncentracijama histamina uz dodatak različitih
koncentracija PGE2 (0,01 µM, 0,1 µM i 1 µM). ....................................56
Tablica 15. Parametri Hill1 funkcije (slika nije pokazana), prilagođene ovisnosti
relaksacije glatkih mišića uzrokovane PGE2, pod utjecajem 1000 µM
histamina. .............................................................................................56
Tablica 16. Usporedba parametara funkcije Hill1 za PGE2 pri različitim jedinkama.
 ...............................................................................................................58

XIII
POPIS ČESTO UPOTREBLJAVANIH KRATICA
AA                 Arahidonska kislina
ASM              Glatki mišići respiratornog sustava / Airway smooth muscle
ATP               Adenozin trifosfat
cAMP
 Ciklični adenozin monofosfat
Ca2+                Ion kalcija
cisLT            Cisteinil leukotrieni
COX-1

Enzim ciklooksigenaza 1
COX-2

Enzim ciklooksigenaza 2
CYP450                 Citokrom P450
FEV1              Forsirani ekspiratorni volumen zraka izdahnut u prvoj sekundi
HETE             Hidroksi-eikosatetraenoiska kiselina
HPETE           Hidroperoksi-eikozatetraenoiska kiselina
IP3                   Inozitol trisfosfat
LT
Leukotrieni
LTC4
Leukotrien C4
LTA4
Leukotrien A4
LTD4
Leukotrien D4
LOX              Enzim lipoksigenaza
Lx                   Lipoksini
NSAID
Nesteroidni protuupalni lijekovi
Pr                    Eoksini
PG
Prostaglandini
PGD2
Prostaglandin D2
PGES             Enzim sintaza prostaglandina E2

XIV
PGE2
Prostaglandin E2
PGH2               Prostaglandin H2
PGI2             Prostaglandin I2 (prostaciklin)
PLA2               Fosfolipaza A2
PLC                Fosfolipaza C
PLD                Fosfolipaza D
TXA2              Tromboksan A2
TXB2
Tromboksan B2
VSMC            Glatke mišićne stanice krvnih žila / Vascular smooth muscle cells

1
1 Uvod i opis problema
Eikosanoidi su otkriveni u obliku prostaglandina (PG) tijekom tridesetih godina 20.
stoljeća. Eikosanoidi su oksigenirani produkti polinezasićenih dugolančanih masnih
kiselina, odnosno metaboliti arahidonske kiseline (AA), koja je polinezasićena ω6
masna kiselina s dvadeset ugljikovih atoma. Oni su prisutni u životinjskom i biljnom
svijetu. To je vrlo velika biološka obitelj sa širokim spektrom bioloških učinaka.
Arahidonati i druge C20 polinezasićene kiseline djeluju kao prekursori za sintezu
eikosanoida. Degradacija AA u stanici ima dva različita puta: put ciklooksigenaze i
put lipoksigenaze.
Metaboliti AA su leukotrieni (LT), prostanoidi, hidroksieikosatetraenoiska (HETE)
kiselina, lipoksini (Lx), eoksini (Pr) i trioksilini (TRX). Oni igraju važnu ulogu u
doživljaju boli, pri povišenoj temperaturi, kontrakciji glatkih mišića i upalnih bolesti
poput astme i artritisa. Uglavnom djeluju slično kao lokalni hormoni putem receptora
povezanih s G-proteinima. Biosinteza pojedinih eikosanoida može se potaknuti
specifičnim citokinima, faktorima rasta i mnogim drugim stimulansima. Tipični
učinak vezanja eikosanoida u ciljanim stanicama je inicijacija unutarstaničnih
signalnih puteva što može dovesti do promjena u koncentraciji intracelularnog kalcija
(Ca2+) ili induciranju stvaranja unutarstaničnog cikličkog adenozin-monofosfata
(cAMP).
Razlikujemo četiri moguća biosintetska puta mobilizirane AA. Dva najvažnija puta su
put ciklooksigenaze, gdje se stvaraju PG, prostaciklin (PGI2) i tromboksan (TXA2)
putem COX enzima, te put lipoksigenaze, gdje se stvaraju LT i LX kroz LOX enzim.
Ostatak se ostvaruje preko epoksi gena Citokroma P450  (CYP450) i izoeikozanoidnog
puta.
Eikosanoidi imaju kratkotrajno vrijeme eliminacije i ponašaju se kao lokalni hormoni
s autokrinim i parakrinim učincima. Djelovanje se postiže vezanjem na receptore
stanične površine, a farmakološki učinak ovisi o gustoći i tipu receptora te vrsti stanice
na koju djeluju.
Otkriveni su brojni receptori (DP1, EP1-4, FPA, B, IP...) koji su uglavnom povezani s
G-proteinima, a ovisno o vrsti G-proteina, mogući intracelularni učinci su povećanje

2
cAMP-a, cAMP redukcije, aktivacija fosfolipaze ili povećanja razine intracelularnog
Ca2+.
Tablica 1. Tipovi receptora i uloga eikosanoida
Receptor
Ligand
Funkcija
Leukotrien B4
receptori, npr.
BLT1 i BLT2
LTB4; 12-HHT, 12-
HETE, 15-HETE
Kemotaksija neutrofila, održavanje
epitelne barijere (BLT2)
Cistenil LT
receptori, npr.
CisLT1 i CisLT2
LTC4, LTD4, LTE4
Bronhokonstrikcija (CisLT1),
vaskularna propusnost, izlučivanje
sluzi, kemotaksija i oslobađanje
medijatora (mieloidne stanice)
Prostanoidni
receptori, npr. EP1,
EP2, EP3, EP4, TP,
DP1, FP, i IP
PGE2, TxA2, PGD2,
PGF2, PGI2
Protuupalni (EP2, EP4, IP) ili
proupalni: bronho- i
vazokonstrikcija (EP1, EP3, TP, FP)
Cisteinil
leukotrienski
receptor GPR17
LTC4, LTD4, LTE4
Ishemija-reperfuzija ozljede,
izražena na glija stanicama i
makrofazima
Preuzeto i prerađeno od: Sanak (2016)
PGI i TXA2 djeluju na glatke mišiće (krvne žile, gastrointestinalni sustav, respiratorni
trakt), trombocite, bubrege, reproduktivne organe, središnji živčani sustav,
metabolizam kostiju, oči i, naravno, upale i imunosti. Oni također igraju ulogu u
nastanku i razvoju neoplazmi. U Tablici 1. možemo vidjeti tipove receptora preko
kojih djeluju eikosanoidi te su također navedene neke njihove funkcije. Kasnije ćemo
navedene podatke detaljno opisati u radu.
Magistarski rad će se velikim dijelom baviti objašnjavanjem utjecaja eikosanoida na
kontrakciju i relaksaciju glatkih mišića dišnog sustava. Također, usmjeravat ćemo se
na objašnjavanje razvoja sile potrebne za kontrakciju i relaksaciju mišića.
Obradit ćemo čim više postojećih teoretskih radova te matematičkim modelom
analizirati razvoj sile kod kontrakcije i relaksacije mišića pri različitim jedinkama.
Nadalje, objasnit ćemo i povezanost između eikosanoida i razvoja određenih
patoloških stanja.

3
2 Svrha i ciljevi rada
Glavna svrha završnog rada je dobivanje parametara za matematički opis ovisnosti
razvijene sile o koncentraciji eikosanoida koji induciraju kontrakciju ili relaksaciju u
tkivima glatkih mišića dišnih putova u prisutnosti i odsutnosti aktivnih tvari. Na
temelju ovih informacija, procjenjivat će se jačina kontraktilnih i relaksacijskih
agonista.
Također, svrha ove analize je provjeriti mogu li se podaci izmjereni na životinjama
prenijeti na fizikalno-matematičke modele koji simuliraju procese u čovjeku. Na
životinjama je provedeno mnogo više testiranja, koja su se izvodila sistematično, što
olakšava dobivanje informacija o fizikalno-kemijskim ovisnostima koje se zatim
koriste u simulaciji procesa kod ljudi.
Ciljevi završnog rada:
-
usporediti jačine eikosanoidne kontrakcije s drugim fiziološkim kontraktilnim
agonistima
-
utvrditi razlikuju li se parametri matematičkih ovisnosti (funkcija), koje su
prilagođene izmjerenim ovisnostima sile, razvijene pod utjecajem različitih
eikosanoida kontraktilnih i relaksacijskih agonista te u različitim tkivima – ljudi i
životinja
-
utvrditi je li moguće prenijeti podatke izmjerene na životinjama u fizikalno-
matematičke modele koji simuliraju procese kod ljudi.

4
3 Istraživačka pitanja
Tijekom magistarskog rada pokušat ćemo odgovoriti na sljedeća pitanja:
-
Kakve su matematičke ovisnosti razvijene sile u glatkim mišićima dišnih puteva
različitih tkiva ljudi i životinja o koncentracijama različitih kontraktilnih i
relaksacijsih eikosanoida?
-
Kakva je usporedba eikosanoida po jačini kontrakcije glatkih mišića i senzitivnosti
razvijene sile te kakva je njihova usporedba s ostalim fiziološkim kontraktilnim
agonistima?
-
U kolikoj mjeri se između sebe razlikuju parametri razvijenih sila pod utjecajem
kontraktilnih i relaksacijskih eikosaonida u različitim tkivima dišnih puteva kod
čovjeka?
-
U kolikoj mjeri se između sebe razlikuju parametri razvijenih sila pod utjecajem
kontraktilnih i relaksacijskih eikosanoida u tkivima čovjeka i životinja?

5
4 Istraživačka metodologija
Metodologija istraživanja odnosit će se na potragu i proučavanje stranih izvora
literature koja će se baviti osnovnim mehanizmima razumijevanja utjecaja eikosanoida
na kontrakciju i opuštanje glatkih mišića dišnih putova te na analizu izmjerenih
vrijednosti u smislu prilagođavanja matematičkih ovisnosti izmjerenim vrijednostima
i određivanja parametara tih ovisnosti.
4.1 Istraživačke metode
Početna faza završnog rada bit će pregled već postojeće literature. U ovoj ćemo fazi
slijediti sljedeće ciljeve:
-
kratak opis procesa metabolizma AA u eikosanoide
-
prikupljanje i ekstrakcija podataka o učincima eikosanoida na molekularnoj,
staničnoj i fiziološkoj razini
-
prikupljanje i ekstrakcija informacija o receptorima i poznatim signalnim putovima
koji vode do kontrakcije ili relaksacije glatkih mišića dišnih putova
-
prikupljanje i ekstrakcija informacija o drugim kontraktilnim agonistima glatkih
mišića dišnih putova uključenima u patofiziologiju astme
-
prikupljanje i ekstrahiranje podataka o tome koji postojeći lijekovi i aktivne tvari
koji se testiraju utječu na procese razvoja sila ovisnih o eikosanoidima
-
prikupljanje i ekstrakcija podataka o mjerenjima sile u glatkim mišićima dišnih
putova u ovisnosti o koncentraciji eikosanoida i drugih fizioloških kontraktilnih
agonista kod ljudi i životinja.
Pomoću alata za digitalizaciju Origin 8.5 digitalizirat ćemo ovisnosti glatkih mišića
dišnih putova različitih organizama o koncentracijama eikosanoida i drugih
kontraktilnih agonista. Nadalje, prilagođavanjem različitih odabranih matematičkih
funkcija (različiti oblici Hillovih funkcija) utvrdit ćemo parametre tih ovisnosti u
programu Origin 8.5.

6
4.2  Upotrijebljeni izvori
Za oblikovanje teorijskog okvira korištena je deskriptivna metoda rada. Napravili smo
osnovni pregled relevantnih znanstvenih i stručnih resursa koji se adekvatno bave
ovom temom. Podaci za teorijski dio magistarskog rada dobiveni su izučavanjem
domaće i inozemne stručne i znanstvene literature.
S pretraživačem smo postavili strategiju pretraživanja (Tablica 2) koja se temelji na
istraživačkim temama, ključnim riječima, sinonimima i logičnim operatorima (AND
ili OR). Pretraživanje je provedeno pomoću ključnih riječi na engleskom jeziku kao
što su: „Effects of LTD4 AND human airway smooth muscle cell“, „prostaglandins
AND smooth muscle cell  relaxation“. Nakon postavljanja niza pretraživanja sa
sinonimima, pretražena je literatura u sljedećim bibliografskim bazama podataka:
PubMed, Web of Science, NCBI i ScienceDirect. Korišteni su pregledni članci te smo
osim toga uključili i druge monografske izvore vezane za temu istraživanja. Čitali smo
cijele tekstove i prema kriterijima za uključivanje uklonili smo ili uključili literaturu.
Tablica 2. Strategija pretraživanja literature
Kriteriji za uključivanje
Tema:
Utjecaj eikosanoida na kontrakciju i relaksaciju glatkih mišića
respiratornog puta
Jezik:
Vremensko
razdoblje:
Dostupnost
literature:
Engleski jezik
Do 2019.

U cijelom tekstu
Kriteriji za isključivanje
Podudaranja koja se ne odnose na temu i ne zadovoljavaju kriterije za uključivanje su
duplikati.

7
5 Obrada teme
5.1 Eikosanoidi i respiratorni sustav
Pluća imaju svoje odjeljke za biosintezu eikosanoida. Dišni epitel proizvodi i oslobađa
eikosanoide u polariziranom uzorku. PG-i se pasivno prenose na luminalnu površinu,
dok se HETE otpuštaju na bazolateralnoj površini (Jakiela, 2013).
Poremećaji dišnog sustava popraćeni su poremećajem čvrstih veza epitela i povećanim
paracelularnim protjecanjem ili, u konačnici, povećanim ljuštenjem epitelnih stanica
uz proliferaciju epitelnih progenitora. To se može odraziti i na promjene u lokalnoj
koncentraciji eikosanoida. Tijekom proliferacije epitelnih stanica povećava se
aktivnost COX-2; međutim, ona postaje smanjena u potpuno diferenciranom
mukocilijarnom epitelu. Pod uvjetima Th2 tipa koji oponašaju interleukin (IL) -4 i IL-
13, uočena je moćna indukcija 15-HETE aktivnosti dok je 5-LOX prisutan u
diferenciranim stanicama.
Th2 tipovi citokina također inhibiraju produkciju PGE2; međutim, ekspresija COX-1
se ne mijenja dok koncentracija transkripcije COX-2 raste. Dakle, respiratorni epitel
ima i aktivnost obje ciklooksigenaze. Međutim, eikosanoidi su također proizvedeni u
drugim strukturnim stanicama dišnog trakta. Kod bronhijalnih fibroblasta izražen je
COX-1 i imaju sposobnost induciranja COX-2. Stanice glatkih mišića dišnih puteva
također izražavaju sposobnost sinteze prostanoida i aktivno pridonose regulaciji
epitelnih stanica koje proizvode PGE2. Upalne stanice kao što su eozinofili, makrofazi
i neutrofili koji infiltriraju pluća, važan su izvor eikosanoida koji izražavaju aktivni
metabolički put biosinteze eikosanoida (Jakiela, 2013).
Mnoge studije pokazale su da eikosanoidi imaju važnu ulogu kod upalnih procesa.
Recimo, PGE2 doprinosi redukciji upalnih procesa kod nastanka astme. Eozinofili su
imunološke stanice koje dovode do upalnih procesa te ih svrstavamo među jedne od
medijatora upale koji utječu na kontrakciju glatkih mišića dišnih sustava. Ako dođe do
promjene broja eozinofila za vrijeme infekcije, odnosno upale, dolazi do jačih i težih
simptoma oboljenja.

8
5.2 Mišićno tkivo
Postoje tri vrste mišićnog tkiva: poprečno-prugasto, glatko te srčano mišićno tkivo.
U respiratornim putevima nalazi se glatko mišićno tkivo koje se razlikuje od ostalih
jer su izgrađena s mnogo manjim vlaknima (1 – 5 μm). Možemo ga pronaći u dušniku
(lat. trachea), krvnim žilama, crijevima, mokraćnom mjehuru, miometriju, koži i
mišićima oka. Glatka mišićna vlakna specijalizirana su za slabe, spore a dugotrajne
kontrakcije i inervirana su autonomnim živčanim sustavom (Guyton & Hall, 2012).
Kontrakcija glatkih mišića je prouzročena putem pomaka miozinskih i aktinskih
filamenata jednih preko drugih. Energija potrebna za navedeni pomak filamenata je
omogućena hidrolizom adenozin-trifofata (ATP) koja se odvija na glavama miozina.
Glave iz miozinskih filamenata se pričvršćuju i ulaze u interakciju s aktinskim
filamentima kako bi stvorile križanja (engl. crossbridges) te, naposljetku, započele
ciklus. Ciklus križanja uzrokuje pokretanje aktina i miozina što dovodi do kontrakcije
glatkih mišića. Sila koja se razvija aktivnim procesom križanja može se postići i
pasivnim križanjem u primjeru defosforiliranog miozina koji je pripet na aktin. To
stanje nazivamo zaustavni mostići (engl. latch bridges). U tom procesu miozinski laki
lanci su defosforilirani što istovremeno mišiće može dovesti u stanje relaksacije. Ipak,
glatki mišići imaju sposobnost održavanja sile i u toj situaciji zbog zaustavnih mostića.
Na Slici 1. su prikazane sve tri vrste mišićnog tkiva: poprečno-prugasto, glatko
mišićno tkivo te srčano mišićno tkivo.

Preuzeto od: BioNinja (n.d.)
Slika 1: Mišićno tkivo

9
5.3  Arahidonska kiselina (AA)
AA je hidrofobna molekula proizvedena hidrolizom membranskih fosfolipida i tretira
se kao prekursor eikosanoida. Sintetizira se od linolne kiseline koja je esencijalna
omega-6 nezasićena masna kiselina. Linolna kiselina je polinezasićena masna kiselina
koja se koristi u biosintezi AA, a time i nekih PG, LT i TXA. Desaturacijom linolna
kiselina se pretvara u γ-linolnu kiselinu, zatim u dihomo-γ-linolnu kiselinu (DGLA) te
na kraju u AA. Kemijska formula AA je C20H32O2, 20 : 4 (ω-6), gdje se 20 : 4 odnosi
na njen lanac od 20 ugljikovih atoma s četiri dvostruke veze dok se ω-6 odnosi na
položaj prve dvostruke veze od posljednjeg, omega-ugljikovog atoma. AA ima
prosječnu masu od 304.467 g/mol. Zbog prisutnosti svojih četiriju dvostrukih veza u
cis-položaju (što znači da su svi vodikovi atomi na istoj strani dvostrukih veza), spoj
ima određeni stupanj fleksibilnosti za interakciju s proteinima. Čak i pri niskoj
temperaturi pomaže u održavanju fluidnosti staničnih membrana. Četiri dvostruke
veze također omogućuju interakciju s molekulama kisika što dovodi do bioaktivnih
molekula uključujući eikosanoide i izoprostane putem enzimatskih i neenzimatskih
mehanizama.

Preuzeto od: Hanna & Hafez (2018)
Slika 2. Kemijska struktura AA. AA prikazana kao kemijska struktura na kojoj su
vidljive četiri cis-dvostruke veze.

10
5.3.1 Distribucija AA
Kao što je već navedeno, AA je prirodno ugrađena u strukturne fosfolipide unutar
stanične membrane ili je pohranjena u lipidnom korpusu imunoloških stanica. U većem
postotku nalazi se u mišićnim stanicama, mozgu, jetri, slezeni te retini odnosno
mrežnici. Razine AA u stanicama poput trombocita su, na primjer, oko 5 mM. Nakon
aktivacije AA taj se postotak kasnije može raspodijeliti između staničnog unosa i
albuminskih proteina.
5.3.2 Metabolizam AA
Na staničnoj razini postoje tri glavne obitelji enzima fosfolipaze koje mogu djelovati
na fosfolipide kako bi se oslobodila esterificirana AA.
Fosfolipaza A2 (PLA2) posreduje hidrolizu sn-2 položaja na fosfolipidnom trupu te
daje slobodnu molekulu AA izravno u jednom koraku. Spomenuti sn-2 položaj
označava poziciju esterne veze na fosfolipidnom trupu. Djelovanje PLA2 se izvodi u
jednom koraku dok je djelovanje fosfolipaze C (PLC) ili fosfolipaze D (PLD) složenije
i reakcija se odvija u nekoliko koraka. Otpuštena AA postaje supstrat jednog od četiriju
enzima za sintezu eikosanoida. Enzimi PLC i PLD također mogu generirati slobodnu
AA – prikazano na Slici 3.
U dva uzastopna koraka, PLC enzim katalizira fosfolipide koji stvaraju AA kroz
stvaranje diacilglicerola (DAG) djelovanjem diacilglicerol-lipaze i lipidnih produkata
koji sadrže arahidonat djelovanjem lipida monoacilglicerola (Kano, et al., 2009).
Aktivnost PLD-a opisana je u biljkama, ali postoje dokazi o aktivnostima PLD-a u
višim eukariotima kao što su ljudi.

11

Preuzeto i prerađeno od: Hanna & Hafez (2018)
Slika 3. Mjesto hidrolize PLA, PLC i PLD te oslobađanje AA. PLA2 posreduje u
hidrolizi položaja sn -2 esterne veze na fosfolipidnoj strukturi čime se dobije slobodna AA.
PLA2 prekida kemijske veze i direktno oslobađa AA dok to PLC i PLD čine indirektno.
Kao što je već opisano, ekspresija i aktivacija enzima PLA2 može biti odgovor na širok
raspon staničnih aktivacijskih signala ovisnih o receptorima koji zahtijevaju G
povezani transduktivni protein kao što su „toll-like“ receptor 4 (TLR4) te purinergijski
receptori. Aktivacijski signali su stimulacija upale na kalcij-ionofore, melitin (pčelinji
otrov) i tumorski agensi. Tri su moguća ishoda za slobodnu i funkcionalnu AA: može
se raspršiti drugim stanicama ako je slobodna u krvi, zatim se može ponovno uključiti
u fosfolipide ili se može metabolizirati.
Slobodna AA u stanici ima važnu ulogu u staničnoj apoptozi jer njezina akumulacija
koja nastaje kao posljedica inhibicije arahidonil CoA transferaze može potaknuti
aktivaciju sfingomijelinaze, enzima koji potiče degradaciju sfingolipida (koji igraju
važnu ulogu u regulaciji stanica i staničnom ciklusu) fosfokolina i ceramida.
Slobodna AA u stanici se može metabolizirati enzimatskim reakcijama te može proći
kroz četiri vrste enzimskih puteva: COX, LOX, put CYP450 i anandamidne puteve.
Navedeni metabolički putevi opisat će se u nastavku teksta.

12
Iako eikosanoidi imaju kratko vrijeme poluživota, oni pridonose mnogim biološkim
aktivnostima.
Oni imaju presudnu ulogu u reguliranju humoralne imunosti i intenziteta upale putem
vezanja na G-protein povezane receptore koji se nalaze na drugim stanicama.
Prvo, kada su tkiva upaljena ili ozlijeđena, osim boli i edema, AA metaboliti
pojačavaju upalne signale kako bi privukli leukocite, proinflamatorne citokine i
imunološke stanice da pomognu u rezistenciji i čišćenju patogena.
Drugo, uravnotežuju inducirane upalne signale tako što proizvode razgradne
metabolite kako bi djelovali kao zaštita domaćina jer upala djeluje ugrožavajuće ako
se ne kontrolira na odgovarajući način (Dennis & Norris, 2015).
AA se u stanicama metabolizira putem enzima LOX na HETE i hidroperoksi
eikozatetraenoisku kiselinu (HPETE) ili se pomoću dvije izoforme COX metabolizira
u PGH2 putem kratkotrajnog intermedijera PGG2 koji sadrži hidroperoksil.
Nesteroidni protuupalni lijekovi blokiraju sintezu PGG2 (Slika 4.). PGH2 spontano se
preuređuje ili se enzimatski izomerizira, oksidira ili reducira kako bi se dobio biološki
aktivni PG-izomer, od kojih su neki prikazani na Slici 4.

13

Preuzeto i prerađeno od: Vane, et al. (2002)
Slika 4. Metabolizam AA po liposigenaznom (LOX) i ciklooksigenaznom (COX)
putu uz opisane enzime koji pretvaraju AA u konačne metabolite. Sudbina
arahidonske kiseline u stanicama kao što je metabolizirana lipoksigenazama u HETE i HPETE
ili ciklooksigenazama PGH2 preko kratkotrajnog intermedijernog PGG2 koji sadrži
hidroperoksil. Protuupalni lijekovi (NSAID) blokiraju sintezu PGG2. PGH2 se spontano
reorganizira ili je enzimski izomeriziran, oksidiran ili reduciran kako bi se dobili bioaktivni
izomeri prostaglandina, od kojih su neki prikazani

14
5.4 Metabolički putevi AA
5.4.1 Ciklooksigenazni metabolički put
Postoje dvije izoforme enzima COX ili takozvane PGH sintaze (PGHS) koje reagiraju
na slobodnu AA i proizvode prostanoide. Prostanoidi nastaju iz ukupnog prekurzora
PGH2.
Prva izoforma enzima je COX-1 koji je konstitutivno izražen u svim tkivima, koji
inducira akutnu upalu kao odgovor na kratku izloženost stimulaciji lipopolisaharida
(LPS) i također usmjerava stanicu na promicanje ili suzbijanje biosinteze LTa (Naraba,
et al., 1998).
COX-1 preferira povezivanje i kolokalizaciju na perinuklearnoj membrani ili ER, s
TXA2 sintazom, PGF sintazom i još dva izoenzima PGD sintaze, stvarajući TXA2,
PGF2α i PGD2. Druga izoforma enzima, COX-2, inducirajuća je izoforma pronađena u
makrofagima, bubregu i mozgu, a regulirana je upalnim stimulansima kao što su
bakterijski endotoksini, citokini, hormoni i faktori rasta. COX-2 preferira povezivanje
s PGI sintazom i tri PGE sintaze (cPGES, mPGES-1 i mPGES-2) koje proizvode PGI2
i PGE2. U mozgu i srcu otkrivena je nova izoforma, enzimatski aktivna, spajana
varijanta COX-1, to je COX-3, iako njezinu funkciju tek treba razjasniti. Obje
ciklooksigenaze su strukturno slične, ali aktivno mjesto COX-2 odgovara velikim
supstratima. Kao rezultat supstitucije izoleucina za valin na položaju 523 obje uvode
dvije O2 molekule u AA kako bi se formirao ciklički 9,11 endoperoksid, 15
hidroperoksid spoj. Tako stvorena struktura, PGG2, je nestabilna molekula koja se brzo
pretvara u PGH2 kroz reakciju ovisnu o glutataciji. Daljnje enzimatske sintaze
pridonose stvaranju prostaglandina (PGE2, PGD2, PGF2α), prostaciklina (PGI2) i
tromboksana (TXA2, odnosno TXB2, koji je konačni i stabilni oblik), kao što je
navedeno (Slika 4.), preko izomera PG sintaze. Proizvodnja prostanoida ovisi o
ekspresiji ovih enzima na mjestu upale. Na primjer, trombociti čine prije svega TXA2,
dok endotelne stanice generiraju PGI2, prema sadržaju enzima razmatranog tkiva.

15
5.4.2 Lipoksigenazni metabolički put
Enzimi lipoksigenaze (LOX) također djeluju na slobodni arahidonat. U tom
metaboličkom putu, oksigenacija se može odvijati na mnogim različitim položajima
AA, na C-5, C-8, C-12 ili C-15, uvođenjem kisikova atoma kroz niz lipoksigenaznih
enzima kisikom uvedenih na ugljikov atom, na primjer, 5-LOX, 8-LOX, 12-LOX itd.
Proizvodi koji su dobiveni iz LOX-a su HPETE (5-HPETE, 8-HPETE, 12-HPETE,
15-HPETE). 5-HPETE je odgovoran za proizvodnju LT i lipoksina (Chavis, et al.,
2000). Proizvodnja LT zahtijeva 5-LOX enzim kako bi se proizvela 5-hidroperoksi
eikozatetraenoiska kiselina (5-HPETE) koja se pod utjecajem 5-LOX pretvori u LTA4.
Dva različita enzima djeluju na LTA4. Jedan enzim je LTA4 hidrolaza (LTA4H) koja
koristi molekule vode kako bi se dobio diol, LTB4. LTB4 inducira upalu putem svojih
kemotaktičkih i degranulacijskih djelovanja na polimorfonuklearne limfocite (PMN).
Drugi ezim je glutation S-transferaza odnosno LTC sintaza (LTC4S), enzim koji
dodaje glutation LTA4 za generiranje prvog leukotriena (LTC4) između familije
cisteinil-leukotriena (cisLT). Daljnja konverzija LTC4 izvan stanice vodi u
proizvodnju drugih dvaju cisteinil-leukotriena (LTD4 i LTE4). BLT1 i BLT2 receptori
mogu prepoznati LTB4 i mapirani su na 14q11.2 - q12 i na 14q12, respektivno. CisLT1
i CisLT2 receptori mogu se vezati na peptidoleukotriene i ti receptori se nalaze na
Xq13.2-q21.1 i 13q14.2 (Izumi, et al., 2002).
5.4.3 Anandaminski metabolički put
Biosinteza anandamida odvija se kroz enzimatske puteve koji uključuju prisutnost
visokih razina AA i etanolamina kao što možemo vidjeti na Slici 5. Dolazi do
reverzibilne reakcije koja je katalizirana enzimom hidrolaze masne kiseline čiji je
prirodni reaktant anandamid za proizvodnju AA i etanolamina. U slučaju oštećenja
tkiva, na primjer hepatektomije jetre, razine AA i etanolamina dramatično se
povećavaju, što dovodi do preokretanja djelovanja hidrolaze masne kiseline da se
dobije anandamid. Poslije se ustanovilo da su ligandi za CB1 i CB2 (kanabinoidni
receptor) odgovorni za regeneraciju jetre i proliferaciju stanica.
Biosinteza anandamida događa se kroz enzimatske puteve koji uključuju prisutnost
visokih razina AA i etanolamina, katalizirane enzimom FAAH masne kiseline amid-
hidrolaze (Izzo & Deutsch, 2011).

16

Preuzeto i prerađeno od: Hanna & Hafez (2018)
Slika 5. Sinteza anandamina. Biosinteza anandamida odvija se putem enzimatskih putova
koji uključuju prisutnost visokih razina AA i etanolamina, kataliziranih enzimom hidrolaze
FAAH masnih kiselina. Anandamid se smatra ligandom za CB1 i CB2 koji su odgovorni za
regeneraciju jetre i staničnu proliferaciju

17
5.4.4 Metabolički put CYP450
CYP450 enzimi koji sadrže željezo izraženi su uglavnom u jetri i drugim tkivima te se
koriste za uklanjanje toksina. Metabolički put CYP450 sastoji se od dvaju enzima
CYP450 epoksigenaze i ω hidroksilaze. Derivati epoksida javljaju se umetanjem atoma
kisika na ugljik vezan na jednu od dvostrukih veza AA pomoću enzima CYP450
epoksigenaze. Proizvodi četiri regioizomera epoksikosatogenske kiseline (EET), 5-
EET, 6-EET, 8-EET, 9-EET, 11-EET, 12-EET, 14-EET i 15-EET koji djeluju kao
autokrini i parakrini medijatori. Reakcija hidroksiliranja wP450 hidroksilazom
proizvodi 16-, 17-, 18-, 19-, 20- HETE.
U Tablici 3. je vidljivo da EET i HETE nastaju u bubrezima te se vežu na receptore
PPAR γ i α. EET ima vazodilatatorsku funkciju, inhibira transport natrija i sudjeluje u
angiogenezi, dok HETE ima vazokonstriktorsku funkciju.
Tablica 3. CYP450 – ligandi, glavna mjesta proizvodnje, njihovi srodni receptori
te njihove funkcije
CYP450
Ligand
Mjesto
proizvodnje
Receptor
Efektorska funkcija
EETs

PPARα
Vazodilatator

Antiinflamatorna i angiogenska
funkcija

Inhibira Na+ transport

Bubrezi
PPARγ

HETE
Bubrezi

Vazokonstriktor
Preuzeto i prerađeno od: Hanna & Hafez (2018)

18
5.5  Prenosioci signala i receptori
Postoje različiti receptori koji utječu na kontrakciju i relaksaciju glatkih mišića. U
ovom poglavlju opisat ćemo navedeno. Tromboksani (Tx), PGI2, PGE2, PGF2α i PGD2
metaboliti se smatraju ligandima za TP, IP, EP, FP i DP receptore. EP receptori dijele
se u četiri različita podtipa koje označujemo kao EP1, EP2, EP3 i EP4. Na navedene
receptore veže se PGE2. PGD2 se veže na DP i CRTH2 receptore. Nadalje, PGF2α se
veže na FP receptore te naposljetku se PGI2 veže na IP i TPα receptore.
EP1 receptori su lokalizirani u glatkim mišićnim stanicama dušnika kod zamoraca, kao
i kod štakora, miševa te kod ljudi u plućnom tkivu. U dišnim putevima, vaskularnim
glatkim mišićima, epitelnim stanicama, mastocitima, alveolarnim makrofazima i kod
osjetilnih živaca izražavaju se EP2 receptori. Nadalje, EP3 receptori se distribuiraju u
različitim organima i tkivima, uključujući epitelne stanice dišnih putova i glatkih
mišića krvnih žila te postoje u tri alternativno odvojene izoforme. Za EP4 receptore
znamo da su lokalizirani na ljudskim alveolarnim makrofazima i glatkim mišićnim
stanicama dišnog sustava (Clarke, et al., 2009).
Vezanje PGE2 na EP2, EP4, zatim PGI2 na IP, te PGD2 na DP1 receptore, koji su
povezani s Gs skupinom proteina, aktivira AC, što vodi do povećanja intracelularne
koncentracije cAMP. Vezanje PGE2 na EP1 i PGF2α na FP, koji su povezani s G-
proteinom aktivira metabolizam fosfatidilinozitola što dovodi do stvaranja inozitol-
trisfosfata (IP3) koji mobilizira unutarstanični kalcij (Ca2+) iz ER odnosno SR.
Osim signalizirajući kroz Gq, FP receptor se spaja s malim G-proteinom rodopsinom
(Rho) preko Gq nezavisnog mehanizma. Gq protein sadrži podjedinicu Gqα koja je
vezana za kompleks Gq-Gβγ. Gqβγ se zatim disocira na svoje sastojke Gq i Gβγ koji
djeluju na regulaciju staničnih signala. Gq posebno potiče stanične signalne putove
koji uključuju PLC, IP3 i mobilizaciju Ca2+ u stanici.
Vezanje TXA2 odnosno TXB2 na TP receptor aktivira dvije vrste G-proteina, Gq (Gq,
Gll, G15, G16) i G13 (G12, G13) obitelji što rezultira aktivacijom PLC. Osim toga,
TP se također može aktivirati PLC-om preko Gh, kao i AC putem Gi i Gs. Obje TP
izoforme aktiviraju PLC, ali TPα stimulira AC dok ga TPβ inhibira. EP3 izoforme mogu

19
se povezati s Gi ili G12 koji vodi do povišenja unutarstaničnog Ca2+, inhibicije cAMP
i aktivacije malog G-proteina iz obitelji Rho.
DP2 odnosno CRTH2 se spaja s Gi-tipom G proteina kako bi došlo do inhibicije sinteze
cAMP i podizanja unutarstaničnog Ca2+.
Neki, ali ne i svi prostanoidni receptori pokazuju sposobnost dimeriziranja, što može
promijeniti afinitet ili sklonost ligandnih signalnih putova. Dakle, iako se DP1 / DP2
dimeri ne pojavljuju, pod sličnim uvjetima IP i TP receptori mogu se povezati u oblik
homo- i heterodimera.
TPα-TPβ heterodimeri povećavaju odgovor na aktivaciju slobodnih radikala
kataliziranih izoprostana. Nadalje, dimerizacija IP i TPα omogućuje stvaranje cAMP
kroz TP aktivaciju receptora. Štoviše, aktivacija EP1 receptora pokazuje da moduliraju
β2-adrenoreceptorsku funkciju bronhijalnih dišnih putova putem stvaranja
heterodimernog kompleksa (Ricciotti & FitzGerald, 2011). Svaki receptor je kodiran
različitim genom, a neke su varijante i izoforme dobivene pomoću alternativnog
spajanja eksona u njihovoj C-terminalnoj regiji nakon sedme transmembranske
domene.
Zabilježena je kromosomska lokalizacija miša i ljudskih gena za prostanoidne
receptore. Geni koji kodiraju mišje DP, EP1, EP3, EP4, FP, IP i TP receptore mapirani
su na kromosome 14, 8, 3, 15, 3, 7 i 10. Geni koji kodiraju ljudske EP1, EP3, EP4, FP,
IP i TP receptore mapirani su na kromosomske trake (19p13.1, 1p31.2, 5p13.1, 1p31.1,
19q13.3 i 19p13.3).
Prema transdukciji signala kroz receptore, koji su vezani G-proteinima, ti receptori se
mogu svrstati u tri skupine: relaksantne receptore, kontraktilne receptore i inhibitorske
receptore. Prva skupina uključuje IP, DP, EP2 i EP4 receptore te relaksantne receptore
koji povećavaju koncentraciju cAMP i induciraju relaksaciju glatkih mišića (Ushikubi,
et al., 1995). DP receptor također ima i kontraktilnu funkciju. Navedeni receptor
izražen u različitim stanicama dovodi do različitih učinaka.
Druga grupa obuhvaća TP, FP i EP1 receptore koji su kontraktilni receptori, koji
posreduju Ca2+ mobilizaciju i izazivaju kontrakciju glatkih mišića.

20
Posljednja skupina uključuje EP3 receptor koji je inhibitorni receptor te kao takav
sudjeluje pri smanjenju koncentracije cAMP i inhibira relaksaciju glatkih mišića.
Opisani proces sekundarnog prenošenja signala možemo grafički vidjeti u Tablici 4.
Tablica 4. Prenošenje signala između receptora i PG
RAZRED PODSKUPINA G SKUPINA PROTEINA SEKUNDARNI PRENOSIOCI SIGNALA

PGE2
EP1
Gq
↑ IP3

EP2
GS
↑ cAMP

EP3
GI,G12,Grho
↓ cAMP,↑Ca2+

EP4
GS
↑ cAMP
PGD2
DP
GS
↑ cAMP

CRTH2
GI
↓ cAMP,↑Ca2+

PGF2α
FPA, FPB
Gq,Grho
↑IP3

PGI2
IP-IP
Gs,Gq,Gi
↑↓cAMP, ↑IP3

IP-TPα
Gs
↑cAMP

TxA2
TPα , TPβ
Gq,Gs(α),Gi (β),Gh,G12/13 IP3 , ↑↓ cAMP, ↑Ca2+
Preuzeto i prerađeno od: Ricciotti & FitzGerald (2011)
5.5.1 Uloga Ca2+ pri kontrakciji glatkih mišića
Glatki mišići respiratornog sustava igraju važnu ulogu pri fiziologiji disanja.
Omogućuju protok zraka, preveniraju ulazak udahnutih otrovnih para i spojeva. Do
problema dolazi kada dišni putevi izazivaju patološku opstrukciju za protok zraka
uslijed pretjerane kontrakcije mišića respiratornog sustava. Do patološke kontrakcije
dolazi uslijed aktiviranja specifičnih membranskih receptora ili indirektnim neuralnim
putevima te otpuštanjem medijatora bronhokonstrikcije.
Kontrakcija mišića ovisi i o razini i učinkovitosti Ca2+. (Nuttle, et al., 1996). Štoviše,
kontraktilni agensi kao što je acetilkolin (ACh) induciraju regenerativna i
propagirajuća Ca2+ osciliranja, čija funkcionalna uloga još nije u potpunosti shvaćena.
Pri kolinergičnoj stimulaciji s ACH dolazi do kontraktilnih agonističkih receptora
povezanih s Gq-tipom G-proteina, odgovornog za aktivaciju b1 izoforme PLC (PLC-

21
b1), koja zatim hidrolizira fosfatidilinozitol 4,5-bisfosfat (PIP2) i tako proizvodi dva
druga sekundarna prenosioca IP3 i DAG. IP3 difuzijom prolazi kroz citosol i veže se
na svoj specifični receptor (IP3R) koji se nalazi na SR-u, čime mobilizira IP3– osjetljivi
„bazen“ intracelularno pohranjenog Ca2+ dok DAG aktivira proteinsku kinazu C
(PKC), koja utječe na osjetljivost kontraktilnog aparata na Ca2+.
Brzo i prolazno povišenje koncentracije citosolnog Ca2+ induciranog s IP3 odgovorno
je za uzastopnu popunjenost četiriju Ca2+ veznih mjesta kalmodulina (CaM).
Kompleks Ca2+-CaM zauzvrat otvara i aktivira enzimatsku domenu kinaze lanca
miozina (MLCK) koja fosforilira specifični aminokiselinski ostatak (serin 19)
regulatorne podjedinice miozina lakog lanca (MLC20). MLCK je prekomjerno izražen
u stanicama glatkog mišićnog tkiva respiratornog sustava astmatičnih pacijenata (Ma
X et al., 2002). Stimulacija β-adrenoceptora potakne proizvodnju cikličnog adenozin-
monofosfata (cAMP) koja dovodi do aktivacije PKA. Posljedično dolazi do
fosforilacije MLCK čime se smanjuje afinitet vezanja Ca2+-CaM na MLCK i time se
smanji aktivnost MLCK i kontrakcije glatkih mišića respiratornog sustava (engl.
Airway smooth muscle (ASM)). MLC20 fosforilacija je doista neophodna za
pokretanje cross-bridge ciklusa, tj. kretanje glava miozina duž aktinskih filamenata.
Uz IP3, oslobađanje Ca2+ iz SR je moguće putem Ca2+ samog koji aktivira rianodinske
receptore (RyR). Nadalje, Ca2+ može protjecati uzduž plazmatske membrane kroz
kanale koji uključuju Ca2+ kanale tipa SOCC, ROCC i VOCC) (engl. store; receptor;
voltage operated Ca2+ channels). Aktivacija VOCC-a je, međutim, obično spriječena
vanjskim ionskim strujama uglavnom zbog otvaranja K+ kanala.
ASM kontraktilni odgovori također ovise o mehanizmima senzibilizacije Ca2+,
posredovanih lakim miozinskim lancem fosfata (engl. Myosin light chain phosphatase
(MLCP)) inhibicijom induciranom putem DAG / PKC / CPI-17 i Rho / Rho kinazom
(ROK). RhoA je aktiviran putem zamjenskog faktora nukletoida gvanina (engl.
guanine nucleotide exchange factor (GEF)). Mostovi aktomiozina, pogonjeni ATP
hidrolizom kataliziranom miozinskom ATP-azom, odgovorni su za razvoj napetosti.
Opisano možemo prikazati na Slici 6.

22

Preuzeto i prerađeno od: Pelaia, et al. (2008)
Slika 6. Shematski prikaz procesa stimulacije agonista i posljedične kontrakcije
glatkog mišićnog tkiva. Putovi prijenosa signala uključeni su u kontrakciju mišića.
Interakcija kontraktilnih agonista GPCR dovodi do aktivacije PLC (PLCb), koja hidrolizira
PIP2, čime se dobivaju dva sekundarna glasnika IP3 i DAG. IP3 se veže na svoj receptor (IP3R)
na SR, oslobađajući tako Ca2+ koji aktivira miozin koji je lak lanac ovisan o Ca2+ MLCK.
MLCK fosforilira lagani lanac miozina što dovodi do kontrakcije mišića koja završava MLCP-
om. Osim IP3, oslobađanje Ca2+ iz SR je također stimulirano agonistom induciranom
aktivacijom CD38, proizvodeći ciklički (cADPR za koji se pretpostavlja da je u interakciji s
receptorima RyR. Osim toga, Ca2+ može protjecati kroz plazmatsku membranu kroz kanale,
uključujući Ca2+ kanale koji se upravljaju u trgovini (SOCC), kojima upravlja receptor Ca2+
kanali (ROCC) i Ca2+ kanalni kanali napona (VOCC). Aktivacija VOCC-a je, međutim, obično
spriječena prema van ionskom strujom uglavnom zbog otvaranja K+ kanala s odgođenim
ispravljačem (K-DR)

5.6 Prostaglandini (PG)
PG su skupina ciklopentanih masnih kiselina s dvadeset ugljikovih atoma. Možemo ih
naći gotovo u bilo kojem tkivu i organskom sustavu. Prvi su se nalazili u prostati,
točnije u tekućini prostate te su tako dobili ime. PG imaju veliku ulogu u relaksaciji
glatkih mišića, krvnom tlaku, motilitetu crijeva, lučenju želučane kiseline i signalnim
putevima boli. Acetilsalicilna kiselina zaustavlja njihovo stvaranje u organizmu. PG-i
su posrednici kontrakcije i relaksacije glatkih mišića. Pronađeni su tragovi PGF2α u

23
plućima ovaca, čovjeka, majmuna i zamoraca. PGD2 i PGF2α imaju izravan
kontraktilni učinak na mišiće dišnih putova.
U Tablici 5. možemo očitati za više liganda mjesto proizvodnje, receptore na koje se
vežu te samim time i njihovu funkciju.
PGD2 se najviše proizvodi u stanicama srednjeg živčanog sustava te se veže na
receptore DP1, CRTH2 i ima funkciju u vazodilataciji, sazrijevanju mastocita te
dozrijevanju bazofila i eozinofila.
PGE2 se proizvodi u bubrezima te se veže na receptore EP1, EP2, EP3, EP4. Ima
funkciju u povećanju broja makrofaga, vazokonstrikciji, bronhodilataciji, kontrakciji
uterusa i oslobađanju neurotransmitera (Hanna & Hafez, 2018). PGE2 može imati
ulogu relaksatora i konstriktora preko receptora EP3. Nadalje, PGE2 ima važnu ulogu
u kontrakciji glatkih mišića uterusa (miometrija) tijekom procesa menoreje (Ruan, et
al., 2011). Također, važno je navesti da PGE2 ima i kontraktilnu ulogu što ovisi o tome
u kojoj vrsti stanice djeluje.
PGI2 se proizvodi u epitelnim stanicama srca i žila te se veže na receptor IP preko
kojega utječe na inhibiranje agregacije trombocita te na regulaciju TNF-α.
PGF2 se proizvodi u reproduktivnom sistemu i veže se na receptor FP. Izaziva
vazokonstrikciju, bronhokonstrikciju i kontrakciju glatkih mišića uterusa.
TXA2, TXB2 proizvode trombocite i vežu se na receptor TPα preko kojih reguliraju
agregaciju trombocita.

24
Tablica 5. Prostanoidi – ligandi, glavna mjesta proizvodnje, njihovi srodni
receptori te njihova efektorska funkcija
Prostanoidi
Ligand
Glavno mjesto
proizvodnje
Receptor
Efektorna funkcija
PGD2
Stanice srednjeg
živčanog sustava
DP1,
CRTH2
Vazodilatacija – inhibira agregaciju
trombocita

Sazrijevanje mastocita

Dozrijevanje bazofila i eozinofila za
odgovor na alergijske reakcije

PGE2
Bubrezi
EP1, EP2,
EP3, EP4

Povećanje broja makrofaga

Kontrakcija uterusa

Vazokonstrikcija
Bronhodilatacija
Povišena tjelesna temperatura

Oslobađanje neurotransmitera

PGI2
Endotelne stanice
srca i žila
IP
Inhibiranje agregacije trombocita

Regulacija TNF-α

PGF2α
Reproduktivni
sistem
FP
Vazokonstrikcija
Bronhokonstrikcija

Kontrakcija mišića uterusa te drugih
glatkih mišića

TXA2, TXB2 Trombociti
Tpα
Regulacija agregacije trombocita
 Preuzeto i prerađeno od: Hanna & Hafez (2018)

25

Preuzeto i prerađeno od: Ruan, et al. (2011)
Slika 7. Shematski prikaz vezanja PG na receptore te njihov utjecaj na
kontrakciju i relaksaciju. Uz pomoć PLA2 dolazi do nastanka AA koji se putem COX-a
sintetizira u PGG2 odnosno PGH2. PGH2 se može konvertirati u različite oblike prostaglandina
(PGD2, PGI2, PGE2, PGF2, TXA2). Ovisno o tome na koji se receptor veže, prouzročit će
kontrakciju ili relaksaciju mišića. Ako se PGD2, PGI2 ili PGE2 veže na DP, IP, EP4, EP2
receptor, prouzročit će relaksaciju putem cAMP. PGD2 je zasigurno bronhokonstriktor u
glatkim mišićima dišnog sustava, ali može i relaksirati glatke mišiće žila. Ako se PGE2, PGF2,
TXA2 veže na EP2, EP1, FP ili TP receptor, prouzročit će podizanje Ca2+ što uzrokuje
kontrakciju. PGE2 se može vezati na EP4, EP2 i EP1 receptor te ovisno o tome će uzrokovati
relaksaciju ili kontrakciju.
Shematski je prikazan metabolizam AA u stanicama epitela na Slici 7. AA je nastala
hidrolizom PLA2 iz fosfolidne membrane te uz pomoć ciklooksigenaze nastane PGH2,
koji se može pretvoriti u ostale PG-e. U tom procesu kao intermedijarni produkt nastaje
PGG2 iz kojeg se tvori PGH2.
PGH2 se konvertira u  PGD2, PGI2, PGE2 koji se vežu na receptore DP, IP, EP4, EP2,
EP3, što prouzrokuje povišeno stvaranje cAMP koji izaziva relaksaciju glatkih mišića.
Suprotno navedenom, PGF2 i TXA2 koji se vežu na receptore EP1, FP i TP,
prouzrokuju porast koncentracije intracelularnoga Ca2+ što izaziva kontrakciju (Ruan,
et al., 2011).

26
Slika 8. objašnjava ulogu epitela u regulaciji kontrakcije vas deferens sustava –
reproduktivnog sustava muškaraca za funkciju spermatogene tekućine. Shematski
prikaz pokazuje akciju signalnog puta otpuštenog ATP iz neurona koji utječe na
kontrakciju ili relaksaciju mišića. ATP se otpušta iz neurona i djeluje na receptor P2x
prilikom čega se poveća propusnost za prijelaz Ca2+ u citoplazmu što izaziva
kontrakciju. Nadalje, ATP se može vezati na receptor P2Y, koji u citoplazmi aktivira
produkciju signalne molekule IP3 čime se otpušta Ca2+ iz SR, koji aktivira enzim COX
za metabolizam AA do PGE2. PGE2 se veže na receptor EP2/4, što povećava produkciju
cAMP. Potonji povećava vodljivost stanične membrane za K+, koji vodi do
hiperpolarizacije stanične membrane i time posljedično do relaksacije zbog smanjenja
intracelularne koncentracije Ca2+. Također, PGE2 može potaknuti lučenje
bikarbonatnog iona HCO- putem aktivacije receptora EP2/4 što pomaže u motilitetu
spermija.

Preuzeto i prerađeno od: Ruan, et al. (2011)
Slika 8. Shematski prikaz kontrakcije i relaksacije vas deferensa uzrokovane PG-
om. Shematski model prikazuje signalne događaje na kojima se temelji djelovanje ATP
pobuđenog živca, regulaciji kontrakcije vas deferensa i pokretljivosti spermija pod utjecajem
epitela sa i bez PGE2

27
5.6.1 Biosinteza prostanoida
Prostanoidi nastaju kada se AA, nezasićena masna kiselina, oslobodi s plazmatske
membrane pomoću fosfolipaza i metabolizira sekvencijalnim djelovanjem PGH
sintaze ili COX i njihove odgovarajuće sintaze. Postoji pet bioaktivnih prostanoida in
vivo: PGE2, PGI2, PGD2 i PGF2α i TXB2.
Uobičajeno svaki tip stanica generira 1 ili 2 dominantna proizvoda koji djeluju kao
autokrini i parakrini lipidni medijatori za održavanje lokalne homeostaze u tijelu.
Tijekom upalnog odgovora razina i profil proizvodnje prostanoida dramatično se
mijenjaju.
Proizvodnja prostanoida općenito je vrlo niska u neinflamiranim tkivima, ali se odmah
povećava u akutnoj upali prije nego što leukociti odigraju svoju funkciju. COX-1 je
izražen u većini stanica dok je COX-2 izazvan upalnim stimulansima, hormonima i
čimbenicima rasta.
COX izoforme proizvode najprije PGH2 koji je zajednički supstrat za niz specifičnih
enzima izomeraze i sintaze koji proizvode PGE2, PGI2, PGD2, PGF2 , i TXA2. Dalje u
tekstu će zasebno biti opisani pojedini prostanoidi.

5.6.2 PGE2
PGE2 je jedan od najzastupljenijih prostanoida proizvedenih u tijelu, najčešće je
karakterističan za životinjske vrste i pokazuje raznovrsne biološke aktivnosti. Pod
fiziološkim uvjetima, PGE2 je važan posrednik mnogih bioloških funkcija, kao što je
regulacija imunih odgovora, krvni tlak, gastrointestinalni integritet i plodnost.
Diferencirana sinteza ili degradacija PGE2 povezana je sa širokim rasponom
patoloških stanja. U upali, PGE2 je osobito zanimljiv jer je uključen u sve procese koji
dovode do klasičnih znakova upale: crvenilo, oteklina i bol (Legler, et al., 2010). PGE2
je sintetiziran iz PGH2 pomoću cPGES, mPGES-1 ili mPGES-2.
cPGES je konstitutivno i obilno izražen u citosolu različitih tkiva. Čini se da je cPGES
sposoban pretvoriti PGH2 izvedene derivate.

28
Lokalizacija cPGES-a u citosolu može omogućiti povezivanje s proksimalnim COX-
1 u endoplazmatskom retikulumu preferirajući distalnu COX-2 u perinuklearnoj
ovojnici (Tanioka, et al., 2000).
PGE2 vezanjem na različite EP receptore može regulirati funkciju mnogih tipova
stanica, uključujući makrofage, dendritične stanice (DC) te T i B limfocite, što dovodi
do protuupalnog učinka. Kao proupalni medijator, PGE2 pridonosi regulaciji
ekspresijskog profila citokina u DC i ima utjecaj na diferencijaciju T-stanica prema T1
i T2 odgovoru.
Štoviše, PGE2 može djelovati na antiinflamatorne akcije pri imunološkim stanicama,
kao što su neutrofili, monociti i prirodne stanice ubojice (NK stanice). PGE2 ima
proinflamatorni i antiinflamatorni utjecaj.

Preuzeto po: Alfa Chemistry (2019)
Slika 9. Kemijska struktura PGE2.

5.6.3 PGI2
PGI2 je jedan od najvažnijih prostanoida koji regulira kardiovaskularnu homeostazu.
Vaskularne stanice uključujući endotelne stanice, glatke vaskularne mišićne stanice
(vascular smooth muscle cells (VSMC)) i endotelne progenitorske stanice, glavni su
izvor PGI2 (Kawabe, et al., 2010).
PGI2 se generira sekvencijalnim djelovanjem enzima COX i PGIS te člana obitelji
CYP450 koja specifično pretvara PGH2 u PGI2.

29
PGIS se kolokalizira s enzimom COX u endoplazmatskom retikulumu, plazmatskoj
membrani i jezgrenoj membrani. PGIS je najviše izražen u endotelnim stanicama gdje
se povezuje s COX-1.
PGI2 je snažan vazodilatator i inhibitor agregacije trombocita, adhezira leukocite i
proliferira VSMC. PGI2 je također antimitogen i inhibira replikaciju DNA u VSMC.
Ove aktivnosti PGI2 posredovane su specifičnim IP receptorima. Ti receptori nalaze
se u bubrezima, jetri, plućima, trombocitima, srcu i aorti. Delecija IP-a dovodi do
povećane akumulacije leukocita uzrokovanih antigenom u bronhoalveolarnoj tekućini
i peribronhiolarne i perivaskularne upalne infiltracije. PGI2 može promijeniti
ravnotežu unutar imunološkog sustava i inhibirati alergijsku upalu.

Preuzeto po: Royal Society of Chemistry (2019)
Slika 10. Kemijska struktura PGI2.
5.6.4 PGD2
PGD2 je glavni eikosanoid koji je sintetiziran u središnjem živčanom sustavu i
perifernim tkivima. U mozgu, PGD2 je uključen u regulaciju sna i druge aktivnosti
središnjeg živčanog sustava, uključujući percepciju boli.
U perifernim tkivima, PGD2 proizvode uglavnom mastociti, ali i neki leukociti. PGD2
se dalje može metabolizirati u PGF2α. PGD2 je dominantni prostanoid koji se najviše
proizvodi u mastocitima i na to inicira akutne alergijske reakcije tipa I posredovane
preko IgE.

30
PGD2 se nalazi u bronhijalnom sekretu astmatičara zbog kojeg dovodi do
bronhokonstrikcije. PGD2 može igrati ulogu u razvoju ateroskleroze u kontekstu da
dolazi do upaljene tunice intime odnosno sloja unutar žile. PGD2 djelomično proizvodi
H-PGDS koji je izražen u upalnim stanicama te su upalne stanice prisiljene napustiti
krvne žile putem kemotaksije.
PGD2 je predominantno COX produkt iz plućnog parenhima. Inhaliran PGD2 može
biti bronhokonstriktor. Dakle, može se koristiti poput histamina za glatke mišićne
stanice dišnog sustava kod kroničnih plućnih oboljenja (Hardy, et al., 1984).

Preuzeto po: Royal Society of Chemistry (2019)
Slika 11. Kemijska struktura PGD2.
5.6.5 PGF2α
PGF2α sintetiziran je iz PGH2 preko PGF sintaze (PGFS) i veže se na FP receptor, koji
parira s Gq proteinom koji utječe na intracelularnu koncentraciju slobodnog Ca2+.
PGF2α je uglavnom izveden iz COX-1 u ženskom reprodukcijskom sustavu te igra
važnu ulogu u luteolizi, kontrakciji glatkih mišića maternice i inicijaciji poroda. Nove
studije pokazuju da također ima ulogu u kontrakciji arterija, miokardijskoj disfunkciji
te ozljedi. Aplikacija PGF2α dovodi do akutne upale, a različiti NSAID-i inhibiraju
PGF2α biosintezu i in vitro i in vivo. Otvaraju se mnoge mogućnosti za uporabu PGF2α
za dizajn novih lijekova (Sugimoto, et al.,1997).

31
Istraživanja PGF2α i inhibicija PGFS-a bi mogla dovesti do boljeg razumijevanja i
razvoja terapije za astmu, ali su potrebna još detaljnija ispitivanja.

Preuzeto po: Chemical BooK (2019)
Slika 12. Kemijska struktura PGF2α.

5.7 Leukotrieni (LT)
Pokazano je da su cisteinili LT (LTC4, LTD4 i LTE4) najmoćniji bronhokonstriktori
kod ljudi za koje se vjeruje da igraju ključnu ulogu u astmatičnoj opstrukciji dišnih
putova. LT-i mogu privući leukocite u pluća, povećavajući edem pluća. LT-i također
povećavaju proizvodnju sluzi (mukusa) i uzrokuju lokalni edem koji je tipičan znak
upale. Histamin je vjerojatno najpoznatiji upalni posrednik. I za osobe s alergijama,
antihistaminici igraju ključnu ulogu u smanjenju simptoma bolesti. Za ljude s astmom,
važni posrednici uključuju PGD2, faktor aktivacije trombocita, LT i druge kemijske
spojeve koji su uključeni u upalu. Ponekad pacijenti s aspirinskom intolerancijom
imaju povećanu razinu LTE4 u urinu (Dahlén, 2000). U Tablici 6. možemo očitati koji
receptori odgovaraju pojedinim agonistima te koja je njihova funkcija.

32

Tablica 6. Biološki učinci LT – agonisti, receptori i njihova efektorna funkcija
Leukotrieni
Agonist
Receptor
Efektorna funkcija

LTB4
BLT receptor
Kemotaksija leukocita

Sekrecija leukocita, citokina

IgE sinteza

Nuklearna trankripcija (PPARα)

CisLT1
Bronhospazam

Eksudacija plazme

LTC4

Regrutacija eozinofila
LTD4

Vazokonstrikcija
LTE4

Vazodilatacija

Sekrecija mukusa

Kardiodepresor

Proliferacija glatkih mišića

CisLT2
Kontrakcija glatkih mišića
Preuzeto i prerađeno od: Hanna & Hafez (2018)
U Tablici 6. možemo vidjeti da se ligand LTB4 proizvodi u mastoidnim stanicama te
se veže na receptore BLT1, BLT2, PPARα. LTB4 s BLT receptorom utječe na
kemotaksiju leukocita, sekreciju citokina, IgE sintezu te transkripciju u jezgri stanice.
Funkcija mu je kemotaksija neutrofila, vaskularna permeabilnost i proliferacija T-
stanica. Preko vezanja na receptor PPARα, inhibiraju vlastitu sintezu i djeluju kao
negativna povratna petlja na vlastitu proizvodnju. LTC4, LTD4, LTE4 se proizvode u
alveolarnim makrofazima te preko receptora CisLT1, CisLT2 odgovaraju na upalnu
reakciju, odnosno šalju leukocite na ozlijeđeno mjesto. Nadalje, stimuliraju
bronhokonstrikciju i aktiviraju stvaranje sluzi u respiratornom i probavnom sustavu.
LXA4 i LXB4 se vežu na receptor ALX te sudjeluju u cijeljenju rana preko makrofaga,
sudjeluju također u procesu fagocitoze i eferocitoze.
8-HPETE i 12-HPETE se preko receptora PPAR α i γ spajaju s peroksizomom te
aktiviraju receptor koji djeluje kao homeostaza za upalu. Također, reguliraju razinu
kolesterola u jetri.
Postoji studija koja je analizirala ulogu Ca2+ i konstrikciju ljudskih bronhiola putem
LTD4 i signalnog puta (Snetkov, et al., 2001). Koristili su ljudsko plućno tkivo koje su

33
citološkim tehnikama izolirali od pacijenata i nakon izolacije stanica dodali su otopine
i reagense koji bi trebali stimulirati kontrakciju. Nadalje, dodavali su agoniste i
lijekove perfuzijom. Došli su do zaključka da LTD4 ne kontrahira bronhiole u otopini
bez Ca2+. Druga studija proučavala je isto, ali su koristili druge površine za mjerenje
porasta međustaničnog prostora. Rezultati objašnjavaju da se razina Ca2+ poveća uz
prisustvo histamina. Histamin je značajno ukazao na razinu Ca2+. LTD4 je samo malo
povisio razinu Ca2+.
5.7.1 Biosinteza LT
Biosintezu LT-a pokreću stimulansi poput antigena, citokina, imunoloških kompleksa
i mikroba. Prvi korak u ovom postupku je aktivacija PLA2 za oslobađanje
polinezasićene AA sa staničnih membranskih fosfolipida. Ekstracelularni podražaji
translociraju enzim cPLA2 i 5-lipoksigenaze (5-LOX) u perinuklearni prostor
leukocita. FLAp je protein koji aktivira 5-LOX. cPLA2 se odcjepljuje od AA iz
perinuklearne regije membranskih glikofosfolipida te se tada AA oksigenira putem 5-
LOX da se dobije nestabilni prekursor svih bioaktivnih LT-a (LTA4).
LTA4 može biti konjugiran sa smanjenom glutaminacijom LTC4 sintaze (LTC4S) da
se formira LTC4 ili hidroliziran pomoću LTA4 hidrolaze (LTA4H) da se formira LTB4
što se prikazuje na Slici 12. Obje, LTB4 i LTC4, transporter izvozi u izvanstanični
prostor. Nakon izvoza, LTC4 se brzo pretvara u LTD4 γ-glutamil leukotrienazom
posredovanom uklanjanjem glutaminske kiseline i konačno LTD4 se pretvara u LTE4
putem dipeptidaze posredovane uklanjanjem glicina. LTC4, LTD4 i LTE4 zajednički
se nazivaju cisteinil LT (cisLT).

34

Preuzeto i prerađeno od: Obaidur Rahman, et al. (2019)
Slika 13. Biosinteza CisLT-a putem AA i njihova uloga u raznim bolestima. AA
katalizira 5-LOX enzim. Ova reakcija zahtijeva 5-LOX aktivirajući protein (FLAP) koji
aktivira enzim 5-LOX. Rezultat enzimske reakcije je LTA4. LTA4 se putem hidrolaze (LTA4H)
formira u LTB4 ili se konjugira s glutationom pomoću LTC4 sintaze (LTC4S) i stvara LTC4.
LTC4 se metabolizira pomoću γ-glutamiltranspeptidaze u LTD4 koji se nadalje metabolizira
dipeptidazom do LTE4
Za bijele krvne stanice kao što su neutrofili, eozinofili i monociti LTB4 je moćno
kemotaktičko sredstvo. LTB4 pomaže pri migraciji tvari, stimulira difuziju, a također
pomaže u poticanju adhezije od neutrofila do endotela u krvnim žilama, ali nema
utjecaj na većinu drugih glavnih krvnih žila.
Neki od CisLT1 receptorskih antagonista koriste se kao mogućnost liječenja astme.
Nema selektivnog antagonista za CisLT2 receptore. Neselektivni bloker za CisLT1 i
CisLT2 receptore je formiran pod imenom BAY u9773.
Postoje dokazi da CisLT imaju funkciju kontrakcije koronarne arterije te distalne i
plućne arterije kod ljudi. Razvoj selektivnih antagonista receptora CisLT1 omogućio
je novu klasu tretmana za bolesnike s astmom te liječenje za druge upalne bolesti
(Dahlén, 2000).
Montelukast je antagonist LT receptora (LTRA) koji se koristi za liječenje astme i
ublažavanje simptoma sezonskih alergija. Montelukast je CisLT1 antagonist. Blokira
vezanje LTD4, LTC4 i LTE4 na CisLT1 receptor u plućima te u bronhijalnom stablu
vezanjem na njega. Navedeno utječe na smanjenje bronhokonstrikcije i redukciju
upalnih procesa koje inače uzrokuju LT-i (Lipkowitz, et al., 2001).

35
Zafirlukast je također antagonist LT receptora koji se veže na CisLT1 i CisLT2
receptore te na taj način interferira s upalnim putevima koji su uključeni u patogenezu
astme i alergijskog rinitisa. Zafirlukasta inhibira bronhokonstrikciju djelujući na kasne
faze upalnih reakcija u astmi.
Pranlukast je CisLT1 antagonist LT receptora. Pranlukast ima antagonističku aktivnost
protiv LTC4, kao i LTD4 i LTE4. Također smanjuje antigen-induciranu
bronhokonstrikciju, hiperreaktivnost dišnih puteva na acetilkolin i akumulaciju
plućnih eozinofila kod zamoraca (Drazen, et al., 1980).
5.8 Nesteroidni protuupalni lijekovi
Nesteroidni protuupalni lijekovi (NSAID) koriste se za ublažavanje boli te intenziteta
upale. Strukturno su načinjeni od različitih spojeva, ali imaju slična djelovanja:
analgetičko, protuupalno, antipiretsko i antitrombinsko djelovanje. Njihova primjena
započinje 1898. godine, a danas je jedna od najčešće korištenih skupina lijekova u
humanoj i veterinarskoj medicini.
Prema kemijskoj strukturi, NSAID-i se mogu primijeniti na salicilate, kiseline
propionskih derivata, arilne i heteroarilne octene kiseline, antranilate, oksikamine,
fenilpirazole i aniline. Neki od njih sadrže polarnu veznu skupinu kod koje je planarna
skupina pričvršćena na dodatnu lipofilnu skupinu.
Iz navedene kemijske strukture proizlaze (bio)kemijske i farmakološke značajke
NSAID-a:
 Većina NSAID-a sadrži karboksilne kiseline, a sve jake organske kiseline imaju
pH u rasponu od 3 do 5.
 Razlikuju se od lipofilnosti utemeljene na lipofilnoj karoten-arilnoj skupini i
lipofilnim ostacima i supstituentima.
 Kisela skupina je glavna vezna skupina za vezanje proteina. Svi NSAID-i se
povezuju s proteinima jakim ionskim vezama.
 Put uklanjanja većine NSAID-a iz tijela je inaktivacija prilikom glukuronidacije
nakon čega slijedi njihovo izlučivanje iz bubrega.

36
5.8.1 Utjecaj nesteroidnih protuupalnih lijekova na kontrakciju glatkih mišića
dišnog sustava
Tijekom istraživanja astme izazvane intenzivnim vježbanjem, uzorci urina ili ekspirija
pokazali su povećanje koncentracija CisLT što se povezuje s težinom simptoma astme
posredovane bronhokonstrikcijom.
Također dolazi do povećane proizvodnje protuupalnih prostanoida PGE2 i PGD2 do
koje dolazi zbog konstrikcije glatkih mišića respiratornog sustava. Također je
dokazano da ovaj fenotip ovisi o ozljedama epitelnih stanica i povećanoj aktivnosti
djelovanja epitelne 15-LOX. Smanjena biosinteza lipoksina i preopterećenost
izoprostana također su uključeni u astmu induciranu vježbanjem (Hallstrand, 2012).
Astmatska upala je multicelularni proces koji uključuje i bronhijalno tkivo i
infiltrirajuće upalne stanice. U alergijskoj astmi, neposredna imunološka reakcija
aktivira bronhijalne mastocite i dovodi do bronhokonstrikcije, povećanog lučenja
sluzi, edema i kašlja. Svi ovi simptomi svrstavaju se u dvije kategorije medijatora:
prethodno oblikovani medijatori, kao što je histamin, oslobođeni egzocitozom i
medijatori koji nastaju u tijeku biosinteze poput eikosanoida. Nedavne studije o
eikosanoidima u različitim fenotipima astme pokazuju da razine eikosanoida koreliraju
s eozinofilijom periferne krvi i brojem eozinofila sputuma, odnosno iskašljaja.
Međutim, mastociti su također obilan izvor CisLT. LTC4 i LTD4 doprinose
bronhokonstrikciji kod astme. Mastociti također proizvode PGD2 koji stimulira
osjetilna C-vlakna za induciranje refleksa kašlja. Međutim, PGD2 također može
aktivirati tromboksanski receptor TP koji je najmanje specifičan prostanoidni receptor
sposoban za kontrakciju glatkih mišićnih stanica dišnih putova (Maher, et al., 2015).
Preosjetljivost na protuupalne nesteroidne lijekove (NSAID) može izazvati astmu.
Hipersenzitivnost na različite tipove NSAID-a se općenito naziva netolerancija na
aspirin.
Nedavno su objavljena neka važna zapažanja o patofiziologiji ove specifične vrste
astme. Uspjeli su testirati to patološko stanje na mišjem modelu. Potrebno je
senzibilizirati miša sa zajedničkim alergenom od grinja i ukloniti proizvodnju PGE2
mikrosomnom PGE2 sintazom. U tom slučaju aspirin uzrokuje u tim životinjama
degranulaciju mastocita i bronhokonstrikciju. Dolazi do podizanja razine histamina i

37
CisLT (Liu, et al., 2013). Promjene u razini eikosanoida odmah nakon pozitivne
bronhijalne provokacije lizinom i aspirinom su vrlo zanimljive. To može pomoći u
razumijevanju početne reakcije odgovorne za astmatski napad kod pacijenata s
aspirinskom intolerancijom. Biosinteza PGE2 u bronhiju je iznimno osjetljiva na
inhibiciju acetilsalicilnom kiselinom.
Inhalacijska doza u obliku lizina-aspirina od oko 17 mg u prosjeku uzrokuje
bronhokonstrikciju s 20-postotnim smanjenjem forsiranog ekspiratornog volumena
zraka izdahnutim u prvoj sekundi (FEV1). Zanimljivo je da, prema individualnoj
preosjetljivosti na NSAID, manje doze lijeka često izazivaju jače kontrakcije bronha
(Nizankowska-Mogilnicka, et al., 2007).
Nakon stanične aktivacije mastocita ili makrofaga imunoglobulin E (IgE) –
antigenskih kompleksa, ionofora ili drugih podražaja, javlja se kaskadna aktivnost
stanica koja dovodi do biosinteze LT-a. cPLA2 se prebacuje u omotnicu jezgre stanice,
kao i 5-LO. Nakon toga se mogu premjestiti iz jezgrenog ili citoplazmatskog odjeljka.
FLAP, mali rezidentni nuklearni omotni integralni protein, djeluje kao aktivacijski
protein 5-LOX za pretvorbu AA u LTA4. Aktivnost 5-LOX inhibira zileuton (Zyfl).
LTA4 i LTB4 mogu potencijalno biti formirani na obje strane nuklearne ovojnice s
nukleotidnim ili citosolnim lokaliziranim bazenima LO-5 i LTA4H. LTB4 se prenaša
iz stanice preko prijenosnika van stanice pa može djelovati na neutrofile preko vezanja
na BaLT1 receptor kako bi izazvao kemotaksiju.
LTB4 također može djelovati intracelularno na nuklearnom transkripcijskom faktoru
PPAR-α za induciranje ciljnih gena poput onih uključenih u β-oksidaciju što se može
vidjeti na Slici 14.
To bi uzrokovalo negativnu povratnu petlju koja je rezultirala razgradnjom LTB4 čime
se ograničavaju njegove proinflamatorne aktivnosti. LTA4 se također može pretvoriti
u LTC4 pomoću LTC4S, koji se nalazi u jezgrenoj omotnici.
Protein povezan s rezistencijom na više lijekova (MRP1) može olakšati prijenos LTC4
iz stanice, gdje se metabolizira putem izvanstanične lokalizirane g-glutamil
transpeptidaze (GGT) ili g-glutamil leukotrienaze (GGLT) na LTD4. Na stanicama
glatkih mišića dišnih putova (SMC) i postkapilarnih endotelnih stanica venula, LTD4
može aktivirati CisLT1 receptore da uzrokuju bronhokonstrikciju i edem. Klinički

38
važni lijekovi u astmi, montelukast (Singulair) i zafirlukast (Accolate) blokiraju ovaj
stupanj kao blokatori – antagonisti cisLT receptora. LTC4 ili LTD4 također mogu se
vezati na CisLT2 receptore koji se nalaze u različitim tkivima (Drazen, et al., 1999).

Preuzeto i prerađeno od: Funk (2001)
Slika 14. Interakcija lijekova i LT.
Za detaljniji opis slike gledaj tekst

39
5.9 Analiza mjerenja kontrakcije/relaksacije glatkih mišićnih dišnih
puteva u ovisnosti od biološki aktivnih eikosanoida
Glavna svrha ovog rada je dobiti parametre za matematički opis ovisnosti razvijenih
sila na koncentraciju eikosanoida koji induciraju kontrakciju ili relaksaciju u glatkim
mišićnim stanicama dišnih putova u prisutnosti i odsutnosti aktivnih tvari. Na temelju
tih podataka procjenjuje se jačina kontraktilnih agonista.
Daljnji cilj je usporediti snagu eikosanoidne kontrakcije s drugim fiziološkim
kontraktilnim agonistima, kao što su histamin i acetilkolin (Ach). Jedan od ciljeva
magistarskog rada je također utvrditi jesu li parametri izmjerenih ovisnosti različiti za
različite organizme i je li moguće mjerenje ovisnosti sile na životinjama
implementirati u modele za opis stanja čovjeka.
Iz objavljenih in vitro te ex vivo mjerenja koja su provedena na životinjskim i ljudskim
tkivima respiratornog sustava uz pomoć alata Digitize u programu OriginLab dobivena
je matematička ovisnost sile koja najbolje odgovara mjerenjima ovisno o apsolutnim
koncentracijama pojedinačnih bronhokonstriktora i bronhodilatatora. Grafovi su
prikazani pretežno u logaritamskoj skali.
Mjerene vrijednosti sile, ovisno o koncentracijama bronhokonstriktora, prilagođene su
Hillovoj funkciji oblika:
𝐹=
𝐹
𝑚𝑎𝑥[𝐶]𝑛
𝐾𝑛+ [𝐶]𝑛,

(1)

gdje Fmax predstavlja najveću razvijenu silu, koja je teoretski razvijena u
supramaksimalnoj koncentraciji agonista ([C]), K je njegova koncentracija kod do
polovine razvijene sile u usporedbi s maksimumom (tzv. konstanta poluzasićenog
stanja EC50), n je Hillov koeficijent odnosno strmina krivulje. Takozvana rastuća
Hillova funkcija pretežno se koristi za analizu konstrikcije dok se padajuća Hill1
funkcija koristi za analizu relaksacije što se prikazuje jednadžbom:
𝐹= 𝐹
𝑠𝑡𝑎𝑟𝑡+ (𝐹
𝑒𝑛𝑑−𝐹
𝑠𝑡𝑎𝑟𝑡)
[𝐶]𝑛
𝐾𝑛+ [𝐶]𝑛,

(2)
gdje su Fstart i Fend limitne veličine sile kod niske odnosno visoke koncentracije
agonista ([C]). Ova funkcija može se koristiti i za padajuću (Fstart > Fend) i rastuću

40
(Fstart < Fend) zavisnost. Hillova funkcija (1) je poseban primjer funkcije (2) s
vrijednošću Fstart=0 i Fend=Fmax.  U nastavku magistarskog rada usporedit će se podaci
prikupljeni iz više različitih studija kako bi se analiziralo postavljene hipoteze.
Prva studija koja će se analizirati je studija M. Muccitellija (Muccitelli, et al., 1987)
koja je provela in vitro istraživanje s LT-om, histaminom, metakolinom i antigenima
na zamorcima i ljudskim dišnim sustavima. Kod zamoraca su se prikupljali podaci sa
seciranog tkiva dušnika dok su kod čovjeka izbor tkiva za analizu bili bronhi. U
nastavku teksta prvo ćemo opisati pripremu tkiva za prikupljanje i obradu podataka za
analizu.
Tkiva dušnika su uklonjena kod odraslih mužjaka albino zamoraca, nakon čega su
pažljivo odrezana od masnog i vezivnog tkiva i izrezana u spiralne trake. Svako tkivo
je smješteno u 10 ml vodene kupke, naposljetku povezano te analizirano na Grass
modelu VFO3C za snimanje izometričke napetosti. Tkiva dušnika su bila uronjena u
modificiranu otopinu, tzv. Krebs-Henseleitovu. Pripravci su stavljeni pod 2 g pasivne
napetosti i ekvilibrirani za 60 minuta, tijekom kojih su bili isprani svakih 15 minuta s
novim puferom. Prije početka eksperimenta, svaki dušnik je prethodno obrađen
meklofenaminskom kiselinom da inhibira otpuštanje bronhoaktivnih PG-a kao
odgovor na kontrakciju tkiva (Hedqvist & Dahlén, 1985; Orehek, et al., 1975).
Također, dodan je i l-serin borat (45 mM), inhibitor γ-glutamil transpeptidaze, da se
inhibira konverzija LTC4 u LTD4. Generirane su kumulativne krivulje uzastopnim
povećanjem koncentracije agonista u otopini s metodom Van Rossum, pri čemu je
svaka koncentracija ostala u kontaktu s tkivom sve dok odgovor nije postigao plato.
Samo jedna krivulja je generirana sa svakim tkivom. Na samom kraju eksperimenta,
maksimalno učinkovita koncentracija bilo metaholina (10 μM) ili karbahola (10 µM)
dodana je u svaku otopinu te su odgovori inducirani agonistom izraženi u postotku
referentne maksimalne kontrakcije putem bilo metaholina (10 μM) ili karbahola (10
µM) (Muccitelli, et al., 1987)
Ljudsko plućno tkivo dobiveno je od donora organa. Od devet uzoraka pet je bilo od
muškaraca i četiri od žena. Donori nisu imali poznate respiratorne poremećaje.

41
Bronhiji su uklonjeni iz pluća i pažljivo postavljeni na mikroskopska stakla putem
sonde dok se unutar bronha vršila disekcija pluća parenhima i vaskularnog tkiva.
Bronhiji su suspendirani ispod 1,5 g pasivne napetosti.
Samo jedna koncentracijska krivulja agonista je generirana po tkivu. Nadodao se
karbahol (10 µM) te su vrijednosti izražene kao postotak ove referentne kontrakcije.
Dodana je meklofenaminska kiselina (1 µM) za inhibiranje stvaranja produkata
ciklooksigenaze i za preusmjeravanje AA kroz lipoksigenazni put čime se povećavaju
količine LT-a. Rezultati analize podataka mjerenja Muccitellija i suradnika
(Muccitelli, et al., 1987) za kontrakciju glatke muskulature dišnih puteva kod zamorca
i ljudi su prikazani u tablicama 7. i 8. te na slikama 15., 16. i 17.
Tablica 7. Parametri Hillove funkcije, prilagođene ovisnosti razvijene sile mišića
uzrokovane leukotrienima kod dušnika zamoraca i bronha ljudi. Analiza se
temelji na mjerenjima u referenci (Muccitelli, et al., 1987)

Zamorci – dušnik
Ljudi – bronhi

LTD4
Fmax [%]
60,1
87,4
K [mol/l]
2,83 × 10-9
5,20 × 10-9
n
0,88
0,78

LTC4
Fmax [%]
90,4
78,6
K [mol/l]
2,23 × 10-8
7,27 × 10-9
n
0,62
0,73

LTE4
Fmax [%]
65,5
60,9
K [mol/l]
6,16 × 10-9
8,84 × 10-8
n
1,42
0,95
Na Slici 15., koja prikazuje kontrakcijsku silu agonista na respiratorno tkivo (dušnik)
zamorca simboli su podijeljeni kao izmjerene vrijednosti u obliku ●LTD4, ■LTE4,
▲LTC4, odnosno kao isprekidane linije koje prikazuju ovisnost s prilagođenom
Hillovom funkcijom. Rezultati na y-osi izraženi su kao postotak maksimalne sile koja
je bila izazvana, dok su na x-osi vrijednosti koncentracije agonista LTD4, LTE4 i LTC4.
Koncentracija agonista ([C]) izražena je u mol/L.
Slika 15. govori u prilog najvećoj kontrakciji pri LTC4 (Fmax=90,4 %) dok kod LTD4
(Fmax = 60,1 %) i LTE4 (Fmax = 65,5 %) zauzima slične vrijednosti. Strmina krivulje je

42
kod LTE4 blago uvećana (n = 1,42) dok je kod LTC4 (n = 0,62) i LTD4 (n = 0,95)
manja.
Kontrakcija dušnika kod zamoraca je najsenzitivnija na LTD4 (K = 2,83 × 10-9 mol/L),
za LTC4 je koncentracija poluzasićenosti jedan red veličine veća (K = 2,23 × 10-8
mol/L) od LTD4, a za LTE4 koncentracija poluzasićenosti je negdje između LTD4 i
LTC4 (K = 6,16 × 10-9 mol/L).

Slika 15. Rezultati mjerenja ovisnosti sile kontrakcije za agoniste LTC4, LTD4,
LTE4 kod dušnika zamoraca (simboli) i mjerenja prilagođena Hillovoj funkciji
(krivulje). Sila je izražena u % maksimalne sile koja je prouzročena karbaholom (10 µM).
Izmjerene vrijednosti dobivene su iz reference Muccitelli, et al. (1987), putem digitalizacije

43

Slika 16. Rezultati ovisnosti sile kontrakcije za agoniste LTC4, LTD4, LTE4 kod
ljudi – bronhi (simboli) i mjerenja prilagođena Hillovoj funkciji (krivulje). Sila je
izražena u % maksimalne sile koja je prouzročena karbaholom (10 µM). Izmjerene vrijednosti
dobivene su iz reference Muccitelli, et al. (1987), putem digitalizacije
Na Slici 16., koja prikazuje kontrakcijsku silu agonista na respiratorno tkivo (bronhi)
čovjeka, simboli su podijeljeni kao ●LTD4,  ■LTE4, ▲LTC4 što zapravo označava
izmjerene vrijednosti, odnosno kao isprekidane linije koje prikazuju prilagođenu
Hillovu funkciju. Koncentracija agonista izražena je u mol/L. Rezultati na y-osi su
izraženi kao postotak maksimalne sile kontrakcije dok su na x-osi vrijednosti
koncentracije ([C]) agonista za LTD4, LTE4 i LTC4. Koncentracija agonista ([C])
izražena je u mol/L. Strmina krivulje kod LTE4 (n  =  0,95) je naglašenija dok je kod
LTD4 (n  =  0,78) i LTC4 (n = 0,73) slabije izražena. U ovoj analizi LTD4 (Fmax = 87,4
%) je uzrokovao najveću kontrakcijsku silu te nakon njega LTC4 (Fmax = 78,6 %) pa
naposljetku najmanju vrijednost LTE4 (Fmax = 60,9 %). Kontrakcija bronha kod ljudi
najosjetljivija je na LTD4  i LTC4, koji imaju vrlo slične konstante poluzasićenosti (K
= 5,2 x 10-9 mol/L i K = 7,27 × 10-9 mol/L). Ljudski bronhi najmanje su osjetljivi na
LTE4 (K = 8,84 × 10-9 mol/L).
Također, možemo pokazati navedene rezultate kao zajednički graf humanog i
animalnog tkiva s legendom prikazanom na grafu što vidimo na Slici 17.

44
Crno iscrtano obilježava ovisnosti sile o koncentraciji agonista za čovjeka dok crveno
iscrtano za zamorce. Sve krivulje dobivene su prilagođavanjem Hillove funkcije
mjerenju.
Animalni model za LTD4  kod dušnika zamorca pokazuje da je maksimalna sila
kontrakcije (Fmax = 60,1 %) nešto manja nego kod humanog modela bronha (Fmax =
87,4 %). Ovisnost sile o agonistu za animalni model (K = 2,83×10-9 mol/L) malo je
senzitivnija negoli za humani model (K = 5,20 × 10-9 mol/L). Strmina krivulje je slična
pri animalnom (n = 0,88) i humanom tkivu (n = 0,78).
Pri animalnom modelu za LTC4 dolazi do veće sile (Fmax = 90,4 %) nego pri humanom
modelu LTC4 (Fmax = 78,6 %). Ovisnost sile o LTC4 za humani model (K = 7,27 × 10-
9 mol/L) je senzitivnija negoli za animalni model (K = 2,23 × 10-8 mol/L). Strmina
krivulje je pri animalnom (n = 0,62) malo manja negoli kod humanog tkiva (n = 0,73).
Animalni (Fmax = 65,5 %) i humani (Fmax = 60,9 %) model za LTE4 imaju slične
vrijednosti postizanja maksimalne sile kontrakcije. Blago je povećana sila kod
animalnog modela za LTE4. Senzitivnost ovisnosti sile na LTE4 je kod animalnog
modela (K = 6,16 × 10-9 mol/L) mnogo veća negoli kod humanog modela (K = 8,84 ×
10-8 mol/L) te je i strmina krivulje pri animalnom (n = 1,42) veća negoli kod humanog
tkiva (n = 0,95).

45

Slika 17. Usporedba ovisnosti sile i koncentracije agonista kod humanog i
animalnog tkiva kroz mjerenja prilagođena Hillovoj funkciji gdje crne krivulje
predstavljaju uzorak ljudi dok crvena zamorce. Sila je izražena u % maksimalne sile
koja je prouzročena karbaholom (10 µM). Krivulje se temelje na analizi izmjerenih vrjednosti
u referenci Muccitelli, et al. (1987)
U istraživanju koje je proveo Ravasi s suradnicima (Ravasi, et al., 2000), koristile su
se izolirane stanice ljudskog plućnog parenhima (human lung parenchyma, HLP) te su
testirali njihovu kontrakciju u postavljenim uvjetima. Izolirali su HLP te su dokazali
da membrana u stanicama HLP-a sadrži dva CisLT receptora s visoko afinitetnim
stranama za vezanje s različitim farmakološkim profilima (Ravasi, et al., 2000).
HLP trake su postavljene na početnu napetost od 1 g, isprane puferom, a zatim sa 40
mM serin-borata i 3 mM L-cistenila da inhibiraju LTC4 i LTD4 metabolizam.
Kontraktilni odgovor na koncentraciju LTC4 ili LTD4 izražen je kao postotak
maksimalnog odgovora na 300 mM PGF2α. Rezultati analize grafova iz ove studije su
sljedeći:

46
Tablica 8. Parametri Hillove funkcije, prilagođene ovisnosti kontrakcije mišića
uzrokovane leukotrienima LTD4 i LTC4 kod ljudi. Analiza se temelji na mjerenjima
u referenci (Ravasi, et al., 2000)
Ljudi HLP
LTC4
Fmax [%]
112,5
K  [mol/L]
9,42×10-8
n
0,68
  LTD4
Fmax [%]
190,3
K  [mol/L]
6,54 ×10-9
n
1,02
Rezultati na y-osi, vidljivi na Slici 18., izraženi su kao postotak maksimalne sile
kontrakcije za 300 mM PGF2α dok su na x-osi vrijednosti koncentracija agonista
●LTD4 i ▲LTC4 izražene u jedinici mol/L. U ovom slučaju u plućnom parenhimu
veću kontrakcijsku silu proizvede LTD4  (Fmax = 190,3 %) dok je kod LTC4 (Fmax  =
112,5 %) sila kontrakcije nešto manja.
Kontrakcija mišića HLP senzitivnija je na LTD4 (K =  6,54×10-9 mol/L) negoli na LTC4
(K = 9,42 × 10-8 mol/L). Strmina krivulje okomitija je kod LTD4 (n = 1,02) dok je kod
LTC4 nešto manja (n = 0,68).
Uspoređujući ovo istraživanje s prethodnim (tablice 7. i 8.) možemo reći da je strmina
krivulje najizraženija pri HLP-u (n = 1,02), nakon toga kod bronha ljudi (n = 0,73)
kada govorimo o LTC4 te zatim kod dušnika zamoraca (n = 0,62).
Situacija je nešto drukčija za LTD4, pri dušniku zamoraca je strmina krivulje najveća
(n = 0,88), kod HLP je strmina manja (n = 0,68) dok se vrijednosti za ljudske bronhe
(n  = 0,78) nalaze između dva navedena rezultata. Što se tiče senzitivnosti kontrakcije
LTC4, ta je najveća kod dušnika zamoraca (K = 6,16 × 10-9 mol/L), malo manja je kod

47
HLP-a (K = 6,54×10-9 mol/L), i naposljetku je najmanja senzitivnost kod bronha
čovjeka (K = 8,84×10-8 mol/L).
Pri LTD4 možemo vidjeti da je senzitivnost razvijene sile najveća kod dušnika
zamoraca (K = 2,83×10-9), zatim kod bronha čovjeka (K = 5,20 × 10-9) te najmanja kod
HLP-a (K =  6,54 × 10-9). Razlike u osjetljivosti tkiva na LTD4 su mnogo manje nego
kod LTC4 te nema većih razlika u osjetljivosti na kontrakciju između ljudi i životinja
pod utjecajem LTD4.
Fmax se ne može izravno uspoređivati jer referentni Fmax (100 %) ne znači u svim
slučajevima isto. Referentna kontrakcija uzrokovana je različitim agonistima radi
određivanja referentne vrijednosti.

Slika 18. Rezultati kontrakcije HLP-a – odnos sile uzrokovane različitim
koncentracijama agonista LTD4 i LTC4. Sila je izražena u % maksimalne kontrakcije
koja je razvijena pod utjecajem stimulacije s 300 mM PGF2α. Izmjerene vrijednosti dobivene
su iz reference Ravasi, et al. (2000), putem digitalizacije
M. J. B. Finney sa suradnicima napisao je znanstveni članak na temu kontrakcije
glatkog mišićnog tkiva respiratornog sustava čovjeka (Finney, et al., 1985). U
istraživanju koje je proveo, koristio je odstranjeni plućni parenhim čovjeka putem
biopsije ili uslijed operativnog zahvata. Navedeni parenhim dobiven je iz perifernih
dišnih puteva glatkog mišićnog tkiva.

48
Za doseg maksimalne kontrakcije tkivo je kontrahirano s 20 µM karbakola i dodatkom
noradrenalina (Finney, et al., 1985). U studiji su uspoređivani efekti kontrakcije
između histamina, lijeka Sigma (karbamilkolin-klorid) te PGD2.
Iz navedenog članka preuzeti su i obrađeni podaci. Izolirano je prikazana kontrakcija
mišića uzrokovana PGD2. Krivulja je konstruirana kao odnos % maksimalne razvijene
sile od molarne koncentracije PGD2 koja je označena kao mjerena vrijednost prikazana
■. Mjerenjem je prilagođena Hillova funkcija u vidu krivulje.
Tablica 9. pokazuje da je maksimalna vrijednost izraženosti kontrakcije Fmax = 74,9
%. Koncentracija kod poluzasićenog stanja iznosi K = 4,48 ×10-7 mol/L, dok je strmina
krivulje n =  0,81.
Tablica 9. Rezultati Hillove funkcije, prilagođene ovisnosti kontrakcije HLP-a
uzrokovane s PGD2. Analiza se temelji na mjerenjima u referenci (Finney, et al., 1985)

Vrijednost
Fmax [%]
74,9
K [mol/L]
4,48 × 10-7
n
0,81

Slika 19. Rezultati kontrakcije HLP-a uzrokovane različitim koncentracijama
agonista PGD2. Sila je izražena u % maksimalne kontrakcije koja je razvijena pod utjecajem
stimulacije s 20 µM karbakolom. Izmjerene vrijednosti dobivene su iz reference Finney, et al.
(1985), putem digitalizacije

49
Nadalje, opisali smo istraživanje (Black, et al., 2006) o kontrakciji glatkih mišića
bronha čovjeka koji su prethodno bili izloženi bolusu karbakola u količini od 500 µM
(za postizanje referentne maksimalne kontrakcije) i poslije toga agonistima PGF2α i
PGD2. Analiza je vidljiva na Slici 20. na kojoj y-os predstavlja postotak maksimalne
kontrakcije pri dodatku 500 µM karbakola te na x-osi koncentracija agonista PGF2α i
PGD2. Rezultati mjerenja za PGD2 prikazani su simbolom ■ dok je crna krivulja
rezultat prilagođene Hillove funkcije (jednadžba 1). PGF2α je prikazan Hillovom
prilagođenom krivuljom prikazanom crvenom linijom s vrijednostima u obliku
simbola ● što se može vidjeti na Slici 20.
U ovom slučaju veću kontrakcijsku silu proizvede PGF2α (Fmax = 91,8 %) dok je kod
PGD2 (Fmax = 54,7 %) maksimalna sila kontrakcije manja što možemo vidjeti u Tablici
10. Kontrakcija mišića bronha kod čovjeka senzitivnija je na PGF2α (K = 5,71 × 10-7
mol/L) negoli na PGD2 (K = 1,98 × 10-6 mol/L). Krivulja je strmija kod PGF2α (n =
0,88) dok je strmina kod PGD2 nešto manja (n = 0,71).
Tablica 10. Parametri Hillove funkcije prilagođene ovisnosti kontrakcije mišića
ljudskih bronha uzrokovane s PGD2 i PGF2α. Analiza se temelji na mjerenjima u
referenci (Black, et al., 2006)

PGD2
PGF2α
Fmax [%]
54,7
91,8
K [mol/L]
1,98×10-6
5,71×10-7
n
0,71
0,88

50

Slika 20. Odnos sile kontrakcije izazvane različitim koncentracijama agonista
PGD2 i PGF2α na kontrakciju mišića ljudskih bronha. Sila je izražena kao %
maksimalne kontrakcije izazvane s 500 µM karbakola. Izmjerene vrijednosti dobivene su iz
reference Black, et al. (2006), putem digitalizacije
Uspoređeni su dobiveni podaci prikupljeni iz analize za PGD2 kod ljudskih bronha
(Slika 20., Tablica 10.) te ljudskog parenhima (HLP) (Slika 19., Tablica 9.).
Maksimalna sila kontrakcije veća je kod parenhima (Fmax = 74,9 %) negoli kod bronha
(Fmax = 54,7 %). Krivulja je strmija pri parenhimu (n = 0,71) negoli kod bronha (n =
0,81).
Senzitivnost na PGD2 je najveća kod HLP (K = 4,48 × 10-7 mol/L) (Tablica 9.) te je
manja kod glatkih mišića ljudskih bronha (K = 1,98 × 10-6 mol/L) (Tablica 10.). Pri
usporedbi PGD2 s PGF2α, jači konstriktor je PGF2α  (Fmax = 91,87 %) kod glatkih mišića
ljudskih bronha. Također senzitivnost na PGF2α je veća (K = 5,71 × 10-7 mol/L)  nego
kod PGD2 (K = 1,98 × 10-6 mol/L) pri tom tipu tkiva (Tablica 10.).
Nadalje, obrađeno je istraživanje koje je opisivalo proces relaksacije glatkih mišića
dušnika divljeg miša te štetnost hiperkontrakcije na epitelu (Fortner, et al., 2001).
Hipoteza koja je postavljena u navedenom istraživanju dovodi u pitanje ulogu PGE2
kao glavnog medijatora epitelnog tkiva. Za istraživanje, tkivo je pripremljeno tako da
se dušnik divljeg miša kontrahirao s otopinom od 10 µM Ach te je time izražen
postotak sile maksimalne kontrakcije bez dodatka PGE2 (Fortner, et al., 2001). PGE2

51
je dodan egzogeno te putem receptora EP2 relaksira glatke mišiće dušnika što je
prikazano na Slici 21.
Na slici 21 y os predstavlja postotak maksimalne sile kontrakcije koja je uzrokovana s
10 µM Ach u zavisnosti od različitih koncentracija PGE2, koje su prikazane na x osi.
Vrijednosti mjerenja su prikazane simbolom ■ i prilagođena funkcija Hill1 (jednadžba
2) je prikazana kao krivulja. Tablica 11 pokazuje parametre funkcije Hill1: početnu
vrijednost sile kod najmanje vrijednosti koncentracije PGE2 (Fstart = 98 %) te završnu
vrijednost kod najveće koncentracije PGE2 (Fend = 14,5 %). Također, iz tablice
možemo očitati senzitivnost (K = 2,71×10-7 mol/L) i strminu krivulje (n = 0,87).
Analiza je izrađena po Hill1 funkciji.
Tablica 11. Rezultati Hill1 funkcije, prilagođene ovisnosti relaksacije glatkih
mišića dušnika divljeg miša uzrokovane s PGE2. Analiza se temelji na mjerenjima u
referenci (Fortner, et al., 2001)

Vrijednost
Fstart [%]
98,1
Fend [%]
14,5
K [mol/L]
2,71 × 10-7
n
0,87

52

Istraživanje koje je proveo J. Safholm (Safholm, et al., 2015) dovelo je do nekoliko
zaključaka prilikom istraživanja bazalne sile napetosti mišića malih dišnih puteva
čovjeka. U izoliranim malim dišnim putevima ljudi, PGE2 može izazvati relaksaciju
mišića putem EP4 receptora, ali je manje moćan i djelotvoran nego agonist β-receptora
formoterol (Safholm, et al., 2015). Smanjeni  relaksacijski učinak PGE2, koji je
otkriven u glatkim mišićima malih dišnih puteva čovjeka pri visokim koncentracijama
PGE2, najvjerojatnije je posljedica djelovanja i vezanja PGE2 na TP receptor
(tromboksanski receptor), koji u visokim koncentracijama pokreće zasićenost
relaksacije s nekih 10 % Fmax.
Analizirali smo kumulativno dodavanje PGE2 pri prethodno izazvanoj kontrakciji s
histaminom u vrijednosti od 1 µM.
Analiza je napravljena putem Hill1 funkcije (Jednadžba 2.). Rezultati su prikazani u
obliku Tablice 12. i Slike 22. Na Slici 22. prikazan je odnos relaksacijskog učinka
PGE2 prikazanog simbolom ■ na x-osi te kontrakcije izazvane histaminom na y-osi.
Tablica 12. pokazuje parametre funkcije Hill1: početna vrijednost sile kod najmanje
vrijednosti koncentracije PGE2 (Fstart = 100 %) te završnu vrijednost kod najveće
Slika 21. Omjer sile razvijen u glatkim mišićima dušnika divljeg miša pod
utjecajem 10 µM Ach i istodobne prisutnosti različitih koncentracija
relaksacijskog agonista PGE2. Simboli predstavljaju izmjerene vrijednosti, a krivulja je
prilagođena ovisnosti prema jednadžbi (2). Vrijednost od 100 % predstavlja silu koju uzrokuje
isključivo 10 µM Ach. Izmjerene vrijednosti dobivene su iz reference Fortner, et al. (2001),
putem digitalizacije

53
koncentracije PGE2 (Fend = 40,6 %). Također, iz tablice se može očitati senzitivnost
(K = 4,19 × 10-7 mol/L) i strmina krivulje (n = 0,48).
Tablica 12. Rezultati Hill1 funkcije, prilagođene ovisnosti relaksacije mišića
uzrokovane PGE2. Analiza se temelji na mjerenjima u referenci (Safholm, et al., 2015)

Vrijednost
Fstart [%]
100
Fend [%]
40,6
K [mol/L]
4,19 × 10-7
n
0,48

U istraživanju G. Braunsteina (1988) postavila se hipoteza da kontrakcija glatkih
mišića respiratornog sustava ovisi o proizvodnji relaksacijskog produkta iz epitela
dušnika zamoraca (Braunstein, et al., 1988). Tijekom kontrakcije otpušta se PGE2.
Istraživanje se provodilo u dva preparata od čega je jedan tkivo s netaknutim epitelom,
Slika 22. Odnos sile, razvijene pod utjecajem 1 µM histamina i u prisutnosti
različitih koncentracija relaksacijskog agonista PGE2. Izmjerene vrijednosti
dobivene su iz reference Safholm, et al. (2015), putem digitalizacije

54
a drugi preparat gdje su sastrugane epitelne stanice. Dakle, predviđeno je da se
usporedi učinak na relaksaciju glatkih mišića postignut eksterno dodanim PGE2 i
učinak metabolita AA, koje su dodali u oba primjera – netaknuti epitel i sastrugani
epitel. AA je izazvala relaksaciju kod netaknutog tkiva dok je kod tkiva bez epitela
izazvala kontrakciju. Istraživanje je pokazalo da se tonus glatkih mišića može smanjiti
odstranjenjem epitela. Kao stimule kontrakcije upotrijebili su histamin i indometacin.
Relaksacija pod utjecajem PGE2 u preparatu s odstranjenim epitelom koji se stimulirao
histaminom je uvijek bila slabija u usporedbi s kontroliranim preparatom koji sadrži
netaknuti epitel. Slični rezultati pojavili su se i kod pokusa na zečevima (Braunstein,
et al., 1988).
Preparati bez epitelnog sloja nisu imali velik utjecaj na spazmogenost uzrokovanu
indometacinom. Također je važno naglasiti da indometacin poveća spazmogenu
sposobnost histamina (Braunstein, et al., 1988).
U ovoj studiji (Braunstein, et al., 1988) potvrđena je hipoteza da postoji povezanost
između epitela i derivatima AA proizvedenih po COX putu prostanoida s reakcijom
na glatko mišićno tkivo. U ovom radu napravljeno je više različitih analiza mjerenja
utjecaja PGE2 na relaksaciju.
Prvo su obrađeni i analizirani podaci za ovisnost sile kontrakcije F uz stimulaciju s 50
µM histamina u prisutnosti različitih koncentracija PGE2. Na Slici 23. prikazan je
odnos relaksacijskog učinka PGE2 prikazanog simbolom ■ na x-osi te kontrakcije
izazvane histaminom na y-osi koje su napravljene po Hill1 funkciji (2).
Tablica 13. pokazuje parametre funkcije Hill1: početnu vrijednost sile kod najmanje
vrijednosti koncentracije PGE2 (Fstart = 100 %) te završnu vrijednost kod najveće
koncentracije PGE2 (Fend = -13,45 %). Također, iz tablice se može očitati senzitivnost
(1,024 × 10-7 mol/L) i strmina krivulje (n = 1,17).

55
Tablica 13. Rezultati Hill1 funkcije, prilagođene ovisnosti relaksacije mišića
uzrokovane PGE2. Analiza se temelji na mjerenjima u referenci (Braunstein, et al., 1988)

Vrijednost
Fstart [%]
100
Fend [%]
-13,45
K [mol/L]
1,02 × 10-7
n
1,17

Druga analiza sastoji se od podataka dobivenih od tkiva dušnika s odstranjenim
epitelom. Na Slici 24. prikazano je dodavanje PGE2 u različitim vrijednostima 0.01,
0.1 te 1 µM te se proučavala kontrakcija potaknuta različitim koncentracijama
histamina.
Dakle, analizirala se ovisnost sile kontrakcije mišića o koncentraciji histamina uz
dodatak različitih koncentracija PGE2. Fmax  je najveći pri koncentraciji PGE2 0,01 µM
Slika 23. Odnos sile, razvijene pod utjecajem 50 µM histamina i u prisutnosti
različitih koncentracija relaksacijskog agonista PGE2. Izmjerene vrijednosti
dobivene su iz reference Braunstein, et al. (1988), putem digitalizacije

56
i kod kontrole, gdje se upotrijebio samo histamin te se očitava u vrijednosti od 100 %
što se prikazuje u Tablici 14.
Tablica 14. Parametri Hill1 funkcije, prilagođene ovisnosti relaksacije mišića
uzrokovane različitim koncentracijama histamina uz dodatak različitih
koncentracija PGE2 (0,01 µM, 0,1 µM i 1 µM). Analiza se temelji na mjerenjima u
referenci (Braunstein, et al., 2015)
PARAMETRI
0,01 µM PGE2
0,1 µM PGE2
1 µM PGE2
Fmax [%]
100
75,92
45,89
K [mol/L]
6,42 × 10-6
8,67 × 10-6
1,63 × 10-5
n
1,18
1,33
1,75

Navedeno iz Tablice 14. se prikazuje u obliku Slike 24. Analiza je započeta u
programu Origin gdje su se obradili podaci iz članka te dobile vrijednosti Fmax, K i n
putem Hillove funkcije (Tablica 14.). Nakon toga podaci obrađeni su za jednu
koncentraciju histamina i to je 1000 µM. Sakupljene su vrijednosti razvijene sile za
sve koncentracije PGE2 (0,01 µM, 0,1 µM i 1 µM) kako bi se putem Hill1 funkcije
(Jednadžba 2.) dobile vrijednosti Fstart, Fend, K i n (slika nije pokazana). Dobivene
vrijednosti prikazane su u Tablici 15.
Tablica 15. Parametri Hill1 funkcije (slika nije pokazana), prilagođene ovisnosti
relaksacije glatkih mišića uzrokovane PGE2, pod utjecajem 1000 µM histamina.
Analiza se temelji na mjerenjima u referenci (Braunstein, et al., 2015)
Parametar
Vrijednost
Fstart [%]
100
Fend [%]
44,42
K [mol/L]
1 × 10-7
n
1,81

Iz Slike 24. se iščitava isto kao i iz Tablice 14., prilikom veće koncentracije PGE2
dolazi do manje kontrakcije glatkih mišića dok je kod najmanje koncentracije PGE2
vidljiva najveća kontrakcija pod utjecajem različitih koncentracija histamina. Krivulja
sile u zavisnosti od koncentracije histamina iscrtana crnom bojom i simbolom ■
predstavlja kontrolu (kod koncentracije PGE2 0 µM). Krivulja iscrtana plavom bojom

57
i simbolom ● predstavlja mjerenje kod koncentracije PGE2 od 0,01 µM. Krivulja
iscrtana zelenom bojom i simbolom ▲ predstavlja mjerenje kod koncentracije PGE2
od 0,1 µM. Krivulja iscrtana crvenom bojom i simbolom ★ predstavlja mjerenje kod
koncentracije PGE2 od 1 µM.
Strmina krivulje najveća je kod koncentracije PGE2 od 1µM (n = 1,75) zatim kod 0.1
(n = 1,33) µM i naposljetku 0.01 µM (n = 1,18).
Što se tiče senzitivnosti, najveća osjetljivost je postignuta kod kontrole, zatim kod  0,01
µM PGE2 (K = 6,42 × 10-6 mol/L), nešto manja kod 0,1 µM PGE2 (K = 8,67 × 10-6
mol/L) te najmanja osjetljivost kod 1 µM PGE2 (K =  1,63 × 10-5 mol/L).

Slika 24. Odnos kontrakcijske sile u ovisnosti o koncentraciji histamina u intervalu od 2 ×
10-8 do 10-3 mol/L pod utjecajem različitih vrijednosti koncentracija relaksacijskog
agonista PGE2 (0 µM (kontrola); 0,01 µM; 0,1 µM, 1 µM). Krivulje se temelje na analizi
izmjerenih vrijednosti u referenci Braunstein, et al. (2015)

58
Tablica 16. Usporedba parametara funkcije Hill1 za PGE2 pri različitim
jedinkama. Analiza se temelji na mjerenjima u referenci Braunstein, et al. (2015)

DUŠNIK
DIVLJEG
MIŠA
MALI DIŠNI PUTEVI
ČOVJEKA
DUŠNIK
ZAMORCA
Fstart [%]
98,1
100
100
Fend [%]
14,52
40,6
-13,45
K [mol/L]
2,71 × 10-7
4,19 × 10-7
1,02 × 10-7
n
0,87
0,48
1,17
Uspoređeni su podaci dobiveni od različitih jedinki pri kojima su vršene analize za
različita tkiva. Do najveće relaksacije zbog dodavanja PGE2 dolazi kod dušnika
zamoraca (Fend =  -13,45 %) pri kojoj je strmina krivulje (n =  1,17) najveća što se
može očitati iz Tablice 15. Najslabije izražena relaksacija je postignuta kod analize
izvedene na čovjeku (Fend =  40,6 %) gdje je i strmina krivulje najmanja (n = 0,48).
Nadalje, rezultati analize kod divljeg miša (Fend =  14,52 %) su između vrijednosti za
čovjeka i zamorca što vidimo i po strmini krivulje (n =  0,87). Osjetljivost je najveća
kod analize za dušnik zamorca (K = 1,02 × 10-7 mol/L). Nadalje, dušnik divljeg miša
(K = 2,71 × 10-7 mol/L) nalazi se između vrijednosti za dušnik zamorca i male dišne
puteve čovjeka čija se osjetljivost pokazala najmanjom (K = 4,19 × 10-7 mol/L).
Vrijednosti senzitivnosti pri analizi su poprilično slične te među njima nema većih
razlika. Sve su vrijednosti u istom redu veličine. Velika je razlika u vrijednostima Fend,
gdje je kod miševa i zamorca došlo do snažne relaksacije. Kod ljudi relaksacija usprkos
visokoj vrijednosti relaksacijskog agonista PGE2 nije savršena već doseže najmanje 40
% maksimalno razvijene sile pod utjecajem kontraktilnog histaminskog agonista.

59
6 Interpretacija i rasprava
Istraživanje razvoja sile kod glatkih mišićnih stanica uzrokovane eikosanoidima je vrlo
bitno zbog razvoja novih lijekova te zbog razumijevanja same fiziologije kontrakcije
i relaksacije mišića koje bi bile korisne u drugim poljima biomedicine. Svrha ovog
magistarskog rada je dobivanje parametara za matematički opis ovisnosti razvijene sile
o koncentraciji eikosanoida koji induciraju kontrakciju ili relaksaciju u tkivima glatkih
mišića dišnih putova u prisutnosti i odsutnosti aktivnih tvari. Također, svrha ove
analize je provjeriti mogu li se podaci izmjereni na životinjama prenijeti na fizikalno-
matematičke modele koji simuliraju procese u čovjeku. Na temelju obrađenih
podataka došlo se do sljedećih zaključaka.
Kod prvih analiza zanimao nas je učinak LT na razvoj sile koja je bila razvijena
karbakolom. Kada se govori o stimulaciji animalnog i humanog tkiva s LTE4 pri čemu
je maksimalna kontrakcija (Fmax = 100 %) izazvana s 10 µM karbakola, može se reći
da rezultati variraju (Muccitelli, et al., 1987). Kod animalnog tkiva dušnika Fmax iznosi
65,5 % dok je kod bronha čovjeka Fmax = 60,9 %. Dakle, dolazi do veće kontrakcije
glatkih mišića kod animalnog tkiva. Bronhi čovjeka (K = 6,16 × 10-9 mol/L) senzitivniji
su negoli dušnik zamorca (K = 8,84 × 10-8 mol/L) dok je strmina pri animalnom tkivu
(n = 1,42) veća negoli kod ljudi (n = 0,95). Utvrđeno je kako je maksimalna sila
kontrakcije za LTD4 pri dušniku zamorca (Fmax = 60,1 %) manja negoli kod humanog
bronha (Fmax = 87,4 %). Također, može se primijetiti kako je senzitivnost veća za
animalno tkivo (K = 2,83 × 10-9 mol/L) negoli kod humanog (K = 5,20 × 10-9 mol/L)
iako su vrijednosti slične odnosno usporedive. Strmina krivulje je poprilično slična
između bobe vrste tkiva iako je blago veća strmina kod animalnog tkiva (n = 0,78)
negoli kod humanog tkiva (n = 0,88). Sila kontrakcije za LTC4 kod tkiva zamorca
(Fmax = 90,4 %) je veća negoli kod bronha čovjeka (Fmax = 78,6 %). Strmina krivulje
naglašenija je kod humanog tkiva (n = 0,73) dok je pri animalnom tkivu nešto blaža (n
= 0,62). Senzitivnost kontrakcije je za animalno tkivo (K = 2,23 × 10-8 mol/L) manja
negoli za humano tkivo (K = 7,27 × 10-9 mol/L). Rezultati za LTC4, LTD4 i LTE4 kod
animalnog i humanog tkiva su usporedivi s obzirom na to da su izvedeni u istim
uvjetima. Iako su uzorci tkiva uzeti iz različitog dijela dišnog sustava, možemo
korelirati podatke, odnosno možemo reći da su vrijednosti između animalnog i

60
humanog slične što govori u prilog tome da je moguće primijeniti parametre
istraživanja s animalnog modela na humanom modelu.
Uspoređivani su i podaci HLP-a s tkivom dušnika zamorca i s bronhima čovjeka
(Ravasi, et al., 2000). Zanimao nas je učinak LT-a na razvoj sile stimuliran s 300 mM
PGF2α. Fmax se nije mogao usporediti izravno jer maksimalna sila nije uvijek bila ista.
Također, Fmax iz prijašnjeg eksperimenta ne može se usporediti s ovim podatkom Fmax.
Došlo se do zaključka da je strmina krivulje za LTC4 najizraženija pri HLP-u (n =
1,02), zatim kod bronha ljudi (n = 0,73) te naposljetku kod dušnika zamoraca (n =
0,62). Senzitivnost je najveća kod dušnika zamoraca (K = 6,16 × 10-9 mol/L), zatim
kod HLP-a (K = 6,54 × 10-9 mol/L), te naposljetku kod bronha čovjeka (K = 8,84 × 10-
8 mol/L). Podaci za senzitivnost pri HLP i pri dušniku zamorca su vrlo slični s malim
odstupanjima te se nalaze u istom redu veličine što potvrđuje hipotezu da je za
navedene modele moguće prenijeti podatke izmjerene na životinjama u fizikalno-
matematičke modele, koji simuliraju procese kod ljudi. Logično je da će vrijednosti za
ljudske bronhe odstupati s obzirom na to da je tkivo okruženo hrskavicom te je
potrebna veća sila za razvoj mišićne kontrakcije. LTD4 pri dušniku zamorca pokazao
je najveću strminu krivulje (n = 0,88) između navedenih uzoraka. Kod HLP-a je
strmina manja (n = 0,68) dok se vrijednosti za ljudske bronhe (n  = 0,78) nalaze između
dvaju navedenih rezultata.
Također, prikazana je kontrakcija perifernih glatkih mišića parenhima respiratornog
sustava čovjeka uzrokovana s PGD2 čija je maksimalna kontrakcija (Fmax = 100 %)
provedena s 20 µM karbakola (Finney, et al., 1985). Maksimalna izražena vrijednost
kontrakcije je Fmax = 74,9 %. Koncentracija kod poluzasićenog stanja iznosi K = 4,48
×10-7 mol/L dok je strmina krivulje n = 0,81.
Nadalje, opisana je kontrakcija glatkih mišića bronha čovjeka koji su prethodno bili
izloženi bolusu karbakola u količini od 500 µM i agonistima PGF2α i PGD2 kojima je
analiziran razvoj sile (Black, et al., 2006). Kontrakcija mišića bronha kod čovjeka
senzitivnija je na PGF2α (K = 5,71 × 10-7 mol/L) negoli na PGD2 (K = 1,98 × 10-6
mol/L). Krivulja je strmija kod PGF2α (n = 0,88) dok je kod strmina PGD2 nešto manja
(n = 0,71).

61
Mogu se usporediti podaci za HLP (Ravasi, et al., 2000) i za periferne glatke mišiće
ljudskih bronha uzrokovane s PGD2 (Black, et al., 2006) s obzirom na to da su tkiva iz
topografski slične anatomske sredine. S druge strane, teško ih je usporediti jer se ne
radi o istim stimulansima kontrakcije niti o istim agonistima. Fmax je veći za HLP kod
LTC4 (Fmax = 112,5 %) i LTD4 (Fmax = 190,3 %) negoli kod perifernih glatkih mišića
dišnog sustava kod ljudskih bronha gdje su vrijednosti za PGD2 (Fmax =  54,7 %) i
PGF2α (Fmax = 91,8 %) manje.
Analizirani su i parametri Hill1 funkcije, prilagođene ovisnosti relaksacije mišića
uzrokovane različitim koncentracijama PGE2 kod tkiva dušnika zamorca s
odstranjenim epitelom (Braunstein, et al., 1988). Pokazano je da prilikom veće
koncentracije PGE2 dolazi do manje kontrakcije glatkih mišića dok je kod najmanje
koncentracije PGE2 vidljiva najveća kontrakcija pod utjecajem histamina. Strmina
krivulje pokazala se najvećom kod koncentracije PGE2 od 1µM (n = 1,75) zatim kod
0.1 (n = 1,33) µM te kao najmanja pri 0.01 µM (n = 1,18). Senzitivnost najveće
vrijednosti je postignuta pri koncentraciji od 0,01 µM PGE2 (K = 6,42 × 10-6 mol/L)
dok je nešto manja pri 0,1 µM PGE2 (K = 8,67 × 10-6 mol/L ). Najmanja senzitivnost
vidljiva je pri koncentraciji od 1 µM PGE2 (K = 1,63 × 10-5 mol/L). Završno je
analiziran utjecaj PGE2 na različite jedinke kod različitih tkiva te su se navedeni podaci
međusobno uspoređivali.
Kod dušnika zamorca (Braunstein, et al., 1988) pri dodavanju PGE2 dolazi do najveće
relaksacije (Fend  =  -13,45 %). Pri analizi napravljenoj na glatkim mišićima malih
dišnih puteva kod čovjeka (Safholm, et al., 2015) dolazi do najslabije relaksacije (Fend
=  40,6). Rezultati analize podataka (Fortner, et al., 2001) kod dušnika divljeg miša
(Fend = 14,52) su između vrijednosti za zamorca i čovjeka što je vidljivo na parametru
Fend. Vrijednosti su zapravo slične iz razloga što se njihova senzitivnost nalazi u istom
redu veličine što govori u prilog tome da je moguće primijeniti parametre istraživanja
s animalnog modela na humanom modelu.
Na osnovi rezultata analize ne može se sa sigurnošću reći i zaključiti da su svi rezultati
usporedivi. Rezultati za leukotriene LTC4, LTE4 i LTD4 jesu. Također, može se reći
da su rezultati usporedbe PGE2 pri različitim koncentracijama također usporedivi.

62
Iako su analize napravljene u različitim uvjetima, pri različitim jedinkama, svejedno
možemo potvrditi neke sličnosti između animalnog i humanog tkiva – funkciju,
odnosno fiziologiju samih uzoraka. Glatko mišićno tkivo čovjeka te dušnik zamorca
razvijaju skoro istu maksimalnu silu kontrakcije u prisutnosti LTE4. Senzitivnost i
nagib krivulje za LTD4 i LTC4 su vrlo sličnih vrijednosti te možemo reći da se testovi
na životinjskim modelima mogu primijeniti kao model za ljudski. Nadalje, rezultati
analize za HLP i dušnik zamorca gdje smo promatrali učinak LT-a na razvoj sile
stimuliran s 300 mM PGF2α imaju usporedive vrijednosti s obzirom na to da je
postignuta senzitivnosti istog reda veličine s malim odstupanjima u vrijednostima.
Analize kod PGD2 za HLP i glatko mišićno tkivo bronha čovjeka nisu usporedive zbog
uporabe različitih agonista te različitog tkiva.
Došli smo do zaključka da prilikom veće koncentracije PGE2 dolazi do manje
kontrakcije glatkih mišića dok je kod najmanje koncentracije PGE2 vidljiva najveća
kontrakcija pod utjecajem histamina. Pri dodavanju PGE2 kod dušnika zamorca dolazi
do najveće relaksacije. Rezultati analize podataka kod dušnika divljeg miša su između
vrijednosti za zamorca i čovjeka. Dakle, kod glatkih mišića malih dišnih puteva kod
čovjeka dolazi do najslabije relaksacije. Vrijednosti senzitivnosti kod sva tri modela
su jako slične, pogotovo za dušnik zamorca i divljeg miša što je i očekivano s obzirom
na to da se analiza radila na istoj vrsti tkiva te među istim redom sisavaca.
Teže je dokazati korisnost animalnih modela za upotrebu na humanim modelima s
obzirom na različite razvoje sile kontrakcije i relaksacije pri navedenima. Mogu se
utvrditi povezanosti između ljudskih i životinjskih modela za razvoj sile u kontrakciji
glatkih mišića dišnih putova iako postoje i ograničenja jer se istraživanja provode na
različitim tkivima i u različitim uvjetima.

63
7 Zaključak
Iz završnog rada možemo ustanoviti da modeliranje pomaže pri eksperimentalnim
opažanjima koja razvijaju dublje razumijevanje o utjecaju eikosanoida na kontrakciju
i relaksaciju glatkih mišića respiratornog sustava. Ovakvi fizikalno-matematički
pristupi modeliranja ključni su za daljnji napredak u području istraživanja eikosanoida
te njihovog utjecaja.
Pomoću fizikalno-matematičkih modela, znanstvenici bi mogli lakše simulirati način
razvoja sile kontrakcije i relaksacije glatkih mišića respiratornog puta čovjeka. Neki
od dobivenih parametara matematičkih ovisnosti (funkcija), koje su prilagođene
izmjerenim ovisnostima sile, odnosno razvijene pod utjecajem različitih eikosanoida
kontraktilnih i relaksacijskih agonista kod životinja, mogli bi se primijeniti za ljudske
studije s obzirom na slične rezultate modeliranja.
Pri analizi razvoja sile kod glatkog mišićnog tkiva dušnika čovjeka te bronha zamoraca
dobiveni se rezultati mogu korelirati zbog sličnih vrijednosti parametara razvoja sile
koja ovisi o koncentraciji cisteinil-leukotriena LTC4 i LTD4. Dakle, navedeni modeli
su usporedivi dok to ne možemo tvrditi za LTE4 gdje dolazi do mnogo većih
odstupanja modela. Bronhi zamoraca su puno osjetljiviji na LTE4 negoli tkivo dušnika
čovjeka. Razlika u konstanti pola zasićenja je cijeli red veličine, dok se maksimalne
vrijednosti sile razvijene između različitih tkiva ne mogu točno usporediti jer su za
određivanje referentne maksimalne sile korišteni različiti agonisti s različitim
koncentracijama.
Što se tiče analize razvoja sile pri ovisnosti sile od koncentracije LTC4 i LTD4 pri
plućnom parenhimu čovjeka (HLP), vidljivo je da je to tkivo puno osjetljivije na LTD4
negoli na LTC4 jer je konstanta polovične zasićenosti kod LTD4 za cijelu veličinu reda
manja. Provedeni eksperimenti raznih znanstvenika govore u prilog tome da su
općenito kontraktilni učinci za LTC4 i LTD4 usporedivi odnosno sličnih vrijednosti te
je upravo iz tog razloga iznenađujuće da se pri ovoj analizi očitava dva puta veća
razvijena maksimalna sila kontrakcije pod utjecajem LTD4 negoli kod LTC4.
Kada govorimo o prostaglandinima, možemo reći da su PGD2 i PGF2α oni s
kontraktilnim učinkom. Maksimalna sila kontrakcije pod utjecajem PGF2α je dva puta

64
veća negoli kod PGD2 što govori u prilog tome da je ljudsko tkivo bronha osjetljivije
na PGF2α negoli na PGD2. Usporedba između bronha i HLP kaže da je parenhim (HLP)
za cijeli red veličine osjetljiviji na PGD2. Za PGF2α usporedbu nije bilo moguće izvesti.
Analiza usporedbe odgovora ljudskih bronha na kontraktilne utjecaje prostaglandina
(PGD2 i PGF2α) i cistenil-leukotriena (LTC4, LTD4 i LTE4) pokazala je da su
maksimalna sila i nagib krivulje kod odgovora na navedeno poprilično usporedivi. Kod
opisa osjetljivosti na kontraktilni odgovor dolazi do najveće razlike. Kod leukotriena
dolazi do razvoja polovično razvijene maksimalne sile kod 100 do 1000 puta niže
koncentracije negoli kod prostaglandina. Upravo zbog navedenog puno veću ulogu pri
kontrakciji dišnih putova čovjeka pripisujemo leukotrienima. Kada govorimo o
polovičnom razvoju maksimalne sile pod utjecajem leukotriena i histamina, tada do
razvoja sile u primjeru leukotriena dolazi kod 1000 do 10000 puta niže koncentracije
negoli kod histamina. Odaziv na supramaksimalne koncentracije je sličan.
Nadalje, u smislu relaksacije analizirana su tkiva dušnika miša i zamoraca te tkiva
malih dišnih puteva čovjeka. U ovoj analizi ispitan je utjecaj PGE2 koji je između svih
eikosanoida najjači relaksant glatkih mišića dišnih putova. Kako bi se ispitala sama
relaksacija, tkivo je prethodno bilo kontrahirano acetilkolinom ili histaminom.
Koncentracija PGE2 koja je dovela do 50 % smanjenja sile je u svim primjerima
iznosila između 1 i 4 × 10-7 mol/L što pokazuje da je osjetljivost tkiva na relaksaciju
pod utjecajem PGE2 kod svih tkiva približno slična. Najveća razlika kod analize
prepoznaje se u očitavanju parametra Fend koji predstavlja razinu kontrakcije kod
visokih koncentracija relaksanta PGE2. Najniža vrijednost, koja je negativna,
postignuta je u dušniku zamorca (Fend = -13,45 %), dok je kod dušnika miša ta
vrijednost bila + 14,5 %, a u manjim dišnim putevima čovjeka + 40,6 %. Razlog za to
mogao bi biti da se PGE2 kod visokih koncentracija veže na receptor za tromboksan
(TP) što rezultira kontraktilnim odgovorom. To bi objasnilo zašto je u ovoj analizi
smanjen relaksacijski učinak PGE2 kod malih dišnih putova čovjeka. Također postoje
različiti receptori vezanja PGE2 kao što su EP2 i EP4, koji imaju različite karakteristike
prijenosa signala relaksacije, što bi također moglo objasniti kako je došlo do velike
razlike u vrijednostima.

65
Glavni zaključak navedenih i opisanih analiza je da postoje podudaranja i sličnosti pri
kontrakcijskim i relaksacijskim odgovorima kod ljudskog i životinjskog modela.
Pretjerano izjednačavanje modela može biti nesigurno, posebice kada se mjerenja dalje
upotrebljavaju u kvantitavnim analizama kod matematičkih modela koji služe za
modeliranje i predviđanje učinka lijekova s primarnim osvrtom na proizvodnju
eikosanoida te njihovog utjecaja na bronhokonstrikciju i bronhorelaksaciju. Izvršene
analize izvođene su na različitim tipovima tkiva, koje se izuzetno razlikuju histološki
i morfološki, zbog čega se patološki i fiziološki procesi kontrakcije i relaksacije mogu
nešto drugačije odvijati. Na temelju tih nalaza predlažemo da se za daljnju upotrebu u
matematičkim modelima koriste ovisnosti sila koje su specifične za organizam i vrstu
tkiva koje će se simulirati.

66
Literatura
Alfa Chemistry, 2019. Ent-pge2. [Online] Avaialble at: https://www.alfa-
chemistry.com/cas_65085-69-0.htm [Accessed 17.2.2019].
BioNinja, n.d. Types of muscles. [Online] Avaialble at: http://ib.bioninja.com.au/
higher-level/topic-11-animal-physiology/112-movement/types-of-muscles.html
[Accessed 2. 1. 2019].
Black, J. L., Armour, C. L. Vincenc, K. S., & Johnson, P. R., 1986. A comparison of
the contractile activity of PGD2 and PGF2a on human isolated bronchus.
Prostaglandins, 32(1), pp. 25-31.
Braunstein, G. et al., 1988. Evidence that the histamine sensitivity and responsiveness
of guinea-pig isolated trachea are modulated by epithelial prostaglandin E2
production. British Journal of Pharmacology, 5(1), pp. 300–308.
Chavis, C. et al., 2000. Lipoxins and other arachidonate derived mediators in bronchial
asthma. Thorax, 55(Suppl 2), pp. S38–S41.
Chemical BooK, 2019. CB51270458. [Online] Avaialble at: https://www.chemical
book.com/ChemicalProductProperty_EN_CB51270458.html [Accessed 17.2.2019].
Clarke, D. L. et al., 2008. Lipid metabolites as regulators of airway smooth muscle
function. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics, 22(5), pp. 426–435
Dahlén, S. E., 2000. Pharmacological characterization of leukotriene receptors.
American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 161(2 Pt 2), pp. 41-45.
Dennis, E. A., & Norris, P. C., 2015. Eicosanoid storm in infection and inflammation.
Nature Reviews. Immunology, 15(8), pp. 511-523.
Drazen, J. M., Israel, E., & O'Byrne, P. M., 1999. Treatment of asthma with drugs
modifying the leukotriene pathway. The New England Journal of Medicine, 340(3),
pp. 197-206.
Drazen, J. M. et al., 1980. Slow reacting substances of anaphylaxis: identification of
leukotrienes C-1 and D from human and rat sources. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, 77(6), pp. 3710–3714.
Finney, M. J. B., Karlsson, J. A., Persson, C. G. A., & Draco, A. B., 1985. Effects of
bronchoconstrictors and bronchodilators on a novel human small airway preparation.
British Journal of Pharmacology, 85(1), pp. 29-36.

67
Fortner, C. N., Breyer, R. M., & Paul, R. J., 2001. EP2 receptors mediate airway
relaxation to substance P, ATP, and PGE2. American Journal of Physiology. Lung
Cellular and Molecular Physiology, 281(2), pp. L469–L474.
Funk, C. D., 2001. Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology.
Science, 294(5548), pp. 1871-1875.
Guyton, A. C., & Hall, J. E., 2012. Medicinska fiziologija. 12th ed. Zagreb: Medicinska
naklada.
Hallstrand, T. S., 2012. New insights into pathogenesis of exercise-induced
bronchoconstriction. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology, 12(1),pp.
42-48.
Hanna, V. S. & Hafez, E. 2018. Synopsis of arachidonic acid metabolism: a review.
Journal of Advanced Research, 11, pp. 23–32.
Hardy, C. C., Robinson, C., Tattersfield, A. E. & Holgate, S. T., 1984. The
bronchoconstrictor effect of inhaled prostaglandin D2 in normal and asthmatic man.
The New England Journal of Medicine, 311(4), pp. 209-213.
Hedqvist, P., & Dahlén, S. E., 1985. Pulmonary and vascular effects of leukotrienes:
involement in asthma and inflation. In: S. B., F. Berti, G. C. Folco & G. P. Velo, eds.
drugs affecting leukotrienes and other eicosanoid pathways. Boston: Springer, pp.  87-
101.
Izumi, T. et al., 2002. Leukotriene receptors: classification, gene expression and signal
transduction. The Journal of Biochemistry, 132(1), pp. 1-6.
Izzo, A. A. & Deutsch, D. G., 2011. Unique pathway for anandamide synthesis and
liver regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, 108(16), pp. 6339-6340.
Jakiela, B., 2013. Eicosanoid biosynthesis during mucociliary and mucous metaplastic
differentiation of bronchial epithelial cells. Prostaglandins & Other Lipid Mediators,
106, pp. 116-123.
Kano, M. et al., 2009. Enndocannabinoid-mediated control of synaptic transmission.
Physiological Reviews, 89(1), pp. 309-380.
Kawabe, J., Ushikubi, F., & Hasebe, N., 2010. Prostacyclin in vascular diseases.
Circulation Journal, 74(5),pp. 836-843.

68
Legler, D. F., Bruckne, M., Uetz-von Allmen, E., & Krause, P., 2010. PG E2 at new
glance: novel insights in functional diversity offer therapeutic chances. The
International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 42(2), pp. 198-201.
Lipkowitz, M. A. & Navarra, T., 2011. History of allergy and immunology. In: The
encyclopedia of allergies. 2nd ed. New York: Facts on File, p. 167.
Liu, T., Laidlaw, T. M., Katz, H. R., & Boyce, J. A., 2013. PG E2 deficiency causes a
phenotype of aspirin sensitivity that depends on platelets and cysteinyl leukotrienes.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,
110(42), pp. 16987-16992.
Maher, S. A. et al., 2015. PG D2 and the role of the DP1, DP2 and TP receptors in the
control of airway reflex events. The European Respiratory Journal, 45(4),pp. 1108-
1118.
Muccitelli, R. M. et al., 1987. Is the guinea pig trachea a good in vitro model of human
large and central airways? Comparison on leukotriene-, methacholine-, histamine- and
antigen-induced contractions. Journal of Pharmacology and Experimental
Therapeutics, 24(2), pp. 467-473.
Naraba, H. et al., 1998. Segregated coupling of phospholipases A2, cyclooxygenases,
and terminal prostanoid synthases in different phases of prostanoid biosynthesis in rat
peritoneal macrophages. Journal of Immunology, 160(6), pp. 2974-2982.
Nizankowska-Mogilnicka, E. et al., 2007. EAACI/GA2LEN guideline: aspirin
provocation tests for diagnosis of aspirin hypersensitivity. Allergy, 62(10), pp. 1111–
1118.
Nuttle, L. C., & Farley, J. M., 1996. Frequency modulation of acetylcholine-induced
oscillations in Ca++ and Ca(++)-activated Cl- current by cAMP in tracheal smooth
muscle. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 277(2),pp.
753–760.
Obaidur Rahman, S. et al., 2019. A novel therapeutic potential of cysteinyl
leukotrienes and their receptors modulation in the neurological complications
associated with Alzheimer's disease. European Journal of Pharmacology, 842, pp.
208-220.
Orehek, J., Douglas, J. S. & Bouhuys. A., 1975. Contractile responses of the guinea-
pig trachea in vitro: modification by prostaglandin synthesis-inhibiting drugs. The
Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 194(3), pp. 554-564.

69
Pelaia, G. et al., 2008. Molecular mechanisms underlying airway smooth muscle
contraction and proliferation: implications for asthma. Respiratory Medicine. 102(8),
pp. 1173-1781.
Ravasi, S. et al., 2000. A kinetic binding study to evaluate the pharmacological profile
of a specific leukotriene C4 binding site not coupled to contraction in human lung
parenchyma. Molecular Pharmacology, 57(6), pp. 1182-1189.
Ricciotti, E., & FitzGerald, G. A., 2011. Prostaglandins and inflammation.
Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 31(5), pp. 986-1000.
Royal Society of Chemistry, 2019. ChemSpider: searach and share chemistry.
[Online] Avaialble at: http://www.chemspider.com/ [Accessed 17.2.2019].
Ruan, Y. C., Zhou, W., & Chang, H. C., 2011. Regulation of smooth muscle
contraction by the epithelium: role of prostaglandins. Physiology, (26), pp.156-170.
Safholm,
J.
et
al.,
2015.
Prostaglandin
E2
inhibits
mast
cell–
dependentbronchoconstriction in human small airways throughthe E prostanoid
subtype 2 receptor. The Journal of Allergy and Clinical Immunology, 136(5), pp. 1232-
1239.
Sanak, M. 2016. Eicosanoid mediators in the airway inflammation of asthmatic
patients: what is new? Allergy, Asthma & Immunology Research, 8(6), pp. 481-490.
Snetkov, V. A. et al., 2001. Mechanisms of leukotriene D4-induced constriction in
human small bronchioles. British Journal of Pharmacology, 133(2), pp 243-252.
Sugimoto, Y. et al., 1997. Failure of parturition in mice lacking the PG F receptor.
Science, 277(5326), pp.  681-683.
Tanioka, T. et al., 2000. Molecular identification of cytosolic PG E2 synthase that is
functionally coupled with cyclooxygenase-1 in immediate PG E2 biosynthesis. The
Journal of Biological Chemistry, 275(42), pp. 32775-32782.
Ushikubi, F., Hirata, M., & Narumiya, S., 1995. Molecular biology of prostanoid
receptors; an overview. Journal of Lipid Mediators and Cell Signalling, 12(2-3), pp.
343-359.
Vane, J. R., Botting, R., Emery, P., & Hawkey, C. J. eds., 2002. Clinician’s manual
on COX-2 inhibition. 2nd ed. London: Science Press.