	Стая в дома на граф дьо Невер. Валентина уважава своя съпруг, но все така силно обича Раул. Внезапно при нея се вмъква Раул, за да я види за последен път, преди да напусне завинаги Париж. Дочува се шум от приближаването на много хора и Валентина скрива своя любим в съседната стая. Влизат граф дьо Сен-Бри заедно с голяма група католици. Сен-Бри разказва, че великият херцог дьо Гиз е наредил днес в деня на свети Вартоломей да бъде унищожен врага. Всички хугеноти начело с техния вожд адмирал Колини трябва да бъдат убити през тази нощ. Католиците със задоволство посрещат тази новина. Само граф дьо Невер се противопоставя. Той заявява, че католиците не са палачи и те трябва да водят честен бой. Страхувайки се да не бъде издаден планът на хугенотите, Сен-Бри нарежда да затворят Невер за едно денонощие. Духовниците освещават оръжията на заговорниците и поставят бял кръст на шапките им. Всеки, който няма този знак, трябва да умре през нощта. Заговорниците тръгват. Разтревоженият Раул, който е чул всичко, иска да отиде да предупреди хугенотите. Валентина го спира. Тя се страхува за него и му признава, че го обича. Опиянен от радост, Раул за миг забравя всичко друго и грабва в обятията си Валентина. Отеква камбанен звън. Започва клането. Раул се опомня и изтичва навън.