Cách tiến hành phương pháp enzym để xác định hàm lượng lactoza trong các loại sữa bột theo Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9051-1:2012 như thế nào?
Muốn sử dụng phương pháp enzym để xác định hàm lượng lactoza trong sữa bột, hỗn hợp kem lạnh dạng bột theo TCVN 9051-1:2012 thì làm như thế nào? (Câu hỏi từ anh Ân - Hà Nội).
<subquestion>Cách tiến hành phương pháp enzym để xác định hàm lượng lactoza trong các loại sữa bột, hỗn hợp kem lạnh dạng bột theo Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9051-1:2012 (ISO 5765-1:2002)?</subquestion>
Căn cứ Mục 7 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9051-1:2012 (ISO 5765-1:2002) quy định về cách tiến hành sử dụng phương pháp enzym để xác định hàm lượng lactoza trong các loại sữa bột, hỗn hợp kem lạnh dạng bột.
Theo đó, có thể tiến hành sử dụng phương pháp enzym để xác định hàm lượng lactoza trong các loại sữa bột, hỗn hợp kem lạnh dạng bột như sau:
- Phép thử để kiểm tra quy trình
+ Tiến hành phép thử sau đây để kiểm tra độ thu hồi lactoza khi áp dụng một hoặc một số điều kiện dưới đây:
++ Nếu sử dụng mẻ mới của dung dịch đệm NADP+/ATP/TEA, huyền phù b-galactosidaza và/hoặc HK/G6P-DH;
++ Nếu dung dịch đệm NADP+/ATP/TEA huyền phù b-galactosidaza và/hoặc huyền phù HK/G6P-DH đã được bảo quản trong tủ lạnh quá 2 tuần mà chưa sử dụng;
++ Nếu bắt đầu lại công việc phân tích sau một khoảng thời gian nghỉ;
++ Nếu có điều chỉnh trong khi thực hiện phép thử.
+ Dùng pipet lấy 5,0 ml và 10,0 ml dung dịch chuẩn lactoza cho vào từng bình định mức 100 ml tương ứng. Thêm khoảng 50 ml nước vào mỗi bình. Tiến hành loai protein và xác định.
+ Tính hàm lượng lactoza ngậm một phân tử nước của dung dịch chuẩn lactoza theo công thức tính hàm lượng lactoza, nhưng sử dụng các giá trị sau đây:
V3 là thể tích dung dịch chuẩn lactoza, V3 = 500 ml;
V4 là thể tích dung dịch chuẩn lactoza đã sử dụng, V4 = 5 ml và 10 ml tương ứng;
V5 là thể tích dung dịch chuẩn lactoza đã pha loãng, V5 = 100 ml.
+ Tính đến độ tinh khiết của lactoza ngậm một phân tử nước thì độ thu hồi thu được đối với cả hai dung dịch phải nằm trong dải 100 % ± 2 %.
Nếu độ thu hồi nằm ngoài dải này thì kiểm tra lại thuốc thử, kỹ thuật thao tác, độ chính xác của pipet và điều kiện của máy đo phổ. Cần thực hiện chính xác để thu được kết quả thích hợp. Lặp lại phép thử để kiểm tra quy trình cho đến khi thu được các kết quả thích hợp .
- Chuẩn bị mẫu thử:
+ Chuyển mẫu thử sang hộp đựng có nắp đậy kín khí, có dung tích lớn gấp đôi thể tích mẫu.
+ Đậy ngay nắp hộp.
+ Trộn kỹ mẫu bằng cách lắc và đảo chiều hộp đựng mẫu.
- Phần mẫu thử:
+ Cân khoảng 1g hoặc một lượng lớn hơn của mẫu thử đã chuẩn bị hoặc huyền phù của mẫu thử, chính xác tới 1 mg, cho vào cốc có mỏ 100 ml. Hòa hoặc tao huyền phù mẫu thử trong ít nhất 20 ml nước đã được làm ấm trước đến khoảng từ 40 °C đến 50 °C, sử dụng đũa thuỷ tinh hoặc thiết bị trộn. Chuyển định lượng lượng chứa trong cốc có mỏ sang bình định mức 100 ml. Pha loãng bằng nước đến khoảng 60 ml và trộn.
+ Khi xác định khối lượng phần mẫu thử cần lấy, phải xem xét đến các yếu tố sau đây:
++ Phần mẫu thử phải đại diện cho toàn bộ mẫu thử;
++ Hàm lượng lactoza trong cuvet đo phổ tốt nhất là trong khoảng từ 5 mg đến 100 mg;
++ Độ hấp thụ (A2) của dung dịch trong cuvet đo phổ đối với glucoza trong mẫu thử, nên trong khoảng từ 0,1 đến 0,4;
++ Nếu phần khối lượng lactoza trong phần mẫu thử nhỏ hơn 0,2 % thì cần nhiều hơn 1 g phần mẫu thử. Khi đó, thể tích chất béo, protein và các chất khác kết tủa trong bước loại protein có thể có ảnh hưởng đáng kể đến thể tích phần mẫu thử.
- Phép thử mẫu trắng: Tiến hành phép thử mẫu trắng lặp lại hai lần. Tiến hành theo quy định loại protein và xác định sử dụng tất cả các thuốc thử thay cho phần mẫu thử.
- Loại protein:
+ Thêm theo thứ tự dưới đây, vào dung dịch thử hoặc huyền phù mẫu thử đựng trong bình định mức một vạch 100 ml:
++ 5,0 ml dung dịch kali hexacyanoferat(ll);
++ 5,0 ml dung dịch kẽm sulfat và;
++ 10,0 ml dung dịch natri hydroxit, khuấy kỹ sau mỗi lần thêm.
Thêm nước đến vạch 100 ml và trộn kỹ. Sau khi thu được hỗn hợp, để yên 30 min. Không làm xáo trộn lượng chứa trong bình định mức trước khi lọc.
+ Lọc phần nổi phía trên qua giấy Iọc, loại bỏ phần địch lọc đầu tiên.
- Tiến hành xác định theo sơ đồ trong Bảng 1, chú ý để đưa dung dịch đệm xitrat, dung dịch đệm NADP+/ATP/TEA và nước về nhiệt độ phòng (từ 20 °C đến 25 °C) trước khi sử dụng.

- Tính các độ hấp thụ:
+ Nếu sau 15 min ủ mà độ hấp thụ không tăng thì tính độ hấp thụ A, của lượng chứa trong từng cuvet để sử dụng trong phép tính, dùng công thức sau:
A = At – A0 (1)
Trong đó:
A0 là độ hấp thụ đo được trước khi thêm huyền phù HK/G6P-DH;
At là độ hấp thụ đo được sau khi ủ trong khoảng thời gian 15 min.
+ Nếu sau 15 min mà phản ứng vẫn chưa dừng thì tính độ hấp thụ A của lượng chứa trong từng cuvet để sử dụng trong phép tính (xem 8.1), dùng công thức sau:
A = (At – A0) - (At – At-5) (2)
Trong đó:
A0 là độ hấp thụ đo được trước khi thêm huyền phù HK/G6P-DH;
At là độ hấp thụ đo được sau khi ủ trong khoảng thời gian t min;
A(t-5) là độ hấp thụ đo được sau khi ủ trong khoảng thời gian (t-5) min.
- Kiểm tra xác nhận: Nếu giá trị hấp thụ A vượt quá 0,500 thì lặp lại quy trình quy định trên và sử dụng dung dịch pha loãng thích hợp của dịch lọc.

Cách tiến hành phương pháp enzym để xác định hàm lượng lactoza trong các loại sữa bột theo Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9051-1:2012 như thế nào? (Hình từ Internet)
<subquestion>Cách tính và biểu thị kết quả hàm lượng lactoza trong các loại sữa bột, hỗn hợp kem lạnh dạng bột khi tiến hành phương pháp enzym?</subquestion>
Căn cứ Mục 8 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9051-1:2012 (ISO 5765-1:2002) quy định về cách tính và biểu thị kết quả hàm lượng lactoza trong các loại sữa bột, hỗn hợp kem lạnh dạng bột khi tiến hành phương pháp enzym.
Theo đó, Hàm lượng lactoza, wL được tính theo công thức sau:

Trong đó:
- wL là hàm lượng lactoza, tính bằng phần trăm khối lượng;
- A1 là độ hấp thụ của phép thử mẫu hoặc chất chuẩn về lactoza và glucoza;
- A2 là độ hấp thụ của phép thử mẫu hoặc chất chuẩn về glucoza;
- A3 là độ hấp thụ của phép thử mẫu trắng về lactoza và glucoza;
- A4 là độ hấp thụ của phép thử mẫu trắng về glucoza;
- Mr là khối lượng phân tử của lactoza, đối với lactoza dạng khan thì Mr = 342,30 và lactoza ngậm một phân tử nước thì Mr = 360,31;
- K là hệ số hấp thụ phân tử của NADPH ở 340 nm (K = 6,3 x 106 cm2/mol);
- / là chiều dài đường quang lý thuyết của cuvet, tính bằng centimet (1 cm);
- V1 là tổng thể tích của chất lỏng trong cuvet đo quang, tính bằng mililit (3,30 ml);
- V2 là thể tích dịch lọc hoặc dung dịch pha loãng của dịch lọc được cho vào cuvet đo phổ (1,00 ml), tính bằng mililit (ml);
- V3 là thể tích của dung dịch được chuẩn bị trong bước loại protein (100 ml), tính bằng mililit (ml);
- V4 là thể tích của dịch lọc được lấy để pha loãng, tính bằng mililit (ml);
- V5 là thể tích được lấy để pha loãng dung dịch thử, tính bằng mililit (ml);
- m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g).
Nếu giá trị (A2 – A4) là giá trị âm thì mới được tính đến.
Lưu ý: Nếu khối lượng phần mẫu thử lớn hơn 1 g thì thể tích có thể được tính như sau: V3 = 100-P
Trong đó:
- P là thể tích phần kết tủa, tính bằng mililit. Có thể tính giá trị P từ thành phần gần đúng của phần mẫu thử theo công thức
P = 1,1 x (gam chất béo) + 0,73 x (gam protein) + 0,65 X (gam tinh bột) + 0,55 x (gam tro hòa tan)
<subquestion>Thuốc thử sử dụng khi tiến hành các phép phân tích enzym phải theo nguyên tắc nào về thực hành phòng thí nghiệm tốt GLP?</subquestion>
Căn cứ Phụ lục A ban hành kèm theo Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9051-1:2012 (ISO 5765-1:2002) quy định về nguyên tắc thực hành phòng thí nghiệm tốt GLP khi tiến hành các phép phân tích enzym khi sử dụng thuốc thử.
Theo đó, sử dụng thuốc thử khi tiến hành các phép phân tích enzym phải theo các nguyên tắc về thực hành phòng thí nghiệm tốt GLP như sau:
- Chỉ sử dụng các enzym thuộc loại quy định (hoạt tính cụ thể, nồng độ, chất nhiễm bẩn với hoạt tính enzym, dung môi).
- Chỉ sử dụng các coenzym quy định (loại tinh khiết, dạng muối hoặc axit, chất nhiễm bẩn).
- Tất cả các thuốc thử không kể enzym và coenzym phải là loại tinh khiết phân tích.
- Nước dùng để pha chế các dung dịch enzym và các thuốc thử khác phải là nước được cất hai lần bằng dụng cụ thủy tinh.
- Nước dùng để pha chế các dung dịch mẫu phải là nước được cất bằng dụng cụ thủy tinh hoặc đã loại ion.
- Bảo quản các thuốc thử, các dung dịch/huyền phù enzym theo chỉ dẫn (thường khoảng từ 2 °C đến 8 °C).
- Không làm đông lạnh các huyền phù enzym.
- Khi đã quá hạn sử dụng của các loại thuốc thử thì phải loại bỏ hoặc kiểm tra hiệu quả của thuốc thử bằng cách kiểm tra các dung dịch chuẩn có các hàm lượng chất phân tích khác nhau. Các độ hấp thụ thu được phải tỷ lệ thuận với các nồng độ.
- Các dung dịch đệm được lấy ra từ tủ lạnh phải được làm ấm đến nhiệt độ phòng trước khi bổ sung vào các hỗn hợp phân tích.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9051-1:2012 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9051-1:2012 TCVN 9051-1:2012