Phát hiện Escherichia coli O157 trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi cần có mấy giai đoạn?
Cho tôi hỏi: Việc phát hiện Escherichia coli O157 trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi cần có mấy giai đoạn?-Câu hỏi của anh Thịnh (Hà Nội).
<subquestion>Việc phát hiện Escherichia coli O157 trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi cần có mấy giai đoạn?</subquestion>
Tại Mục 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7686:2007 có quy định việc phát hiện Escherichia coli O157 cần có 4 giai đoạn liên tiếp. Cụ thể như sau:

Nguyên tắc:
- Tăng sinh phần mẫu thử đã đồng nhất trong canh thang đậu tương trypton cải biến có chứa novobioxin (mTSB + N) có ủ ấm ở 41,5oC ± 1oC trong 6 h và ủ tiếp từ 12 h đến 18 h.
- Tách và cô đặc các vi sinh vật bằng các hạt từ miễn dịch được phủ bằng các kháng thể với E.coli O157.
- Phân lập bằng cách cấy truyền các hạt từ miễn dịch có dính các vi khuẩn lên thạch MacConkey sorbitol telurit xefixim (CT-SMAC) và môi trường thạch phân lập chọn lọc thứ hai do người sử dụng tự chọn vi sinh vật.
- Khẳng định các khuẩn lạc âm tính với sorbitol từ CT-SMAC và các khuẩn lạc điển hình của E.coli O157 trên môi trường thạch phân lập thứ hai, từ việc sinh indol và kết dính với kháng huyết thanh E.coli O157.
CHÚ THÍCH: Về các đặc trưng tiếp theo của các khuẩn lạc phân lập dương tính có thể thu được bằng cách, ví dụ như gửi chúng đến phòng thử nghiệm chuẩn thích hợp để khẳng định.

Phát hiện Escherichia coli O157 trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi cần có mấy giai đoạn? (Hình từ Internet)
<subquestion>Cách tiến hành thử nghiệm phát hiện Escherichia coli O157 trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi được thực hiện như thế nào?</subquestion>
Tại Mục 12 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7686:2007 có quy định tiến hành thử nghiệm phát hiện Escherichia coli O157 trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi được thực hiện như sau:
(1) Phần mẫu thử và huyền phù ban đầu
Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) và tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm.
CHÚ THÍCH: Các phần khác của TCVN 6507 (ISO 6887), xem Thư mục tài liệu tham khảo.
Nhìn chung, để chuẩn bị huyền phù ban đầu, cho x g hoặc x ml phần mẫu thử vào 9x ml hoặc 9x g canh thang đậu tương trypton cải biến có novobioxin (mTSB + N) (5.1), đã được làm ấm sơ bộ trong tủ ấm (6.4) ở 41,5oC để thu được tỷ lệ của phần mẫu thử và mTSB + N là 1/10 (khối lượng/thể tích hoặc thể tích/thể tích).
Nên sử dụng các túi nhu động có mắt lưới để giảm việc gây nhiễu của thực phẩm dạng hạt gắn bộ thử hút miễn dịch (9.3).
(2) Tăng sinh
Ủ huyền phù ban đầu đã chuẩn bị theo 9.1, ở 41,5oC trong 6 h, rồi ủ tiếp 12 h đến 18 h (tức là tổng thời gian từ 18 h đến 24 h).
Việc tách từ miễn dịch và cấy lên đĩa thạch chọn lọc sau khi ủ 6 h có thể cho các kết quả dương tính giả, sau khi ủ tiếp 18 h có thể trở thành âm tính.
(3) Tách bằng từ miễn dịch (IMS)
- Khái quát
Sau khi ủ từ 12 h đến 18 h thì cứ sau 6 h có thể tiến hành IMS, nếu cần.
Các chỉ dẫn dưới đây là để hướng dẫn chung và có thể chưa hoàn chỉnh đến mọi chi tiết. Do đó, cần tuân theo các hướng dẫn của nhà sản xuất liên quan đến cách tiến hành và phương pháp sử dụng các bộ thử bắt giữ miễn dịch và thiết bị cần thiết.
- Bắt giữ miễn dịch
CẢNH BÁO - Sử dụng kỹ thuật vô trùng để tránh mọi nhiễm bẩn từ bên ngoài và việc tạo bọt khí. Thực hiện thủ tục này trong tủ an toàn, nếu có sẵn. Mang găng tay bảo vệ.
Việc sử dụng thiết bị tách bằng từ tính (6.12) và các hạt từ miễn dịch được phủ kháng thể (5.7), cần thực hiện quy trình bắt giữ/tách dưới đây:
Trộn dịch cấy tăng sinh (9.2) và để cho nguyên liệu thô lắng xuống. Cho 20 µl các hạt từ miễn dịch đã chuẩn bị (5.7) ở nhiệt độ phòng vào ống nghiệm bằng chất dẻo kiểu Eppendoft (6.13). Lấy 1 ml dịch lỏng phía trên dịch cấy tăng sinh, nếu có thể, tránh hết các hạt thực phẩm hoặc chất béo, cho vào ống nghiệm bằng chất dẻo kiểu Eppendoft.
Trộn huyền phù trên máy trộn quay (6.14) với tốc độ khoảng từ 12 vòng/min đến 20 vòng/min trong 10 min.
- Tách
Đặt từng ống nghiệm bằng chất dẻo kiểu Eppendoft (xem 9.3.2) vào giá từ (6.12) và để cho các hạt từ dính kết dựa vào nam châm bằng cách dịch chuyển nhẹ nhàng giá từ qua lại 180o.
Mở nắp cẩn thận mà không làm nhiễu loạn các hạt trên thành ống. Dùng pipet Pasteur vô trùng mới (6.10) cho mỗi mẫu và với ống nghiệm vẫn còn trong giá từ, loại bỏ dung dịch bằng cách hút từ từ dịch lỏng từ dưới đáy ống nghiệm.
Thêm 1 ml dung dịch đệm rửa vô trùng (5.8) và đậy nắp. Lấy nam châm ra khỏi giá. Trộn phần chứa trong ống bằng cách đảo nhẹ nhàng giá qua 180o và đặt nam châm trở lại giá.
Chú ý để tránh làm nhiễm bẩn chéo khi bổ sung dung dịch đệm mới.
Tiến hành như trên, sử dụng pipet Pasteur mới cho mỗi mẫu để loại bỏ dịch rửa. Lặp lại quy trình rửa vài lần.
Lấy ra khỏi thiết bị tách từ tính và cho 100 µl dung dịch đệm rửa vô trùng (5.8) vào ống nghiệm và hòa lại các hạt từ tính.
CHÚ THÍCH: Quy trình này có thể gặp phải khó khăn đối với các sản phẩm chất béo hoặc phomat tươi.
(4) Cấy lên đĩa thạch chọn lọc và nhận dạng các khuẩn lạc E.coli O157
- Cấy lên đĩa
Sử dụng ống hút kiểu cơ học (6.11), chuyển 50 µl các hạt từ tính đã hòa lại và đã rửa (9.3.3) vào đĩa thạch MacConkey sorbitol telurit (5.2) đã làm khô sơ bộ và 50 µl vào đĩa môi trường phân lập thứ hai (5.3) đã làm khô sơ bộ.
Dùng vòng cấy vô trùng (6.10) ria cấy các hạt này để thu được nhiều khuẩn lạc tách biệt rõ trên khắp đĩa thạch.
Ủ ấm (theo 6.3) môi trường CT-SMAC (5.2) ở 37oC trong 18 h đến 24 h và ủ môi trường thạch chọn lọc thứ hai ở nhiệt độ khuyến cáo và thời gian quy định.
Tùy thuộc vào kiểu loại mẫu thực phẩm và hệ vi khuẩn của mẫu, mà việc ủ canh thang tăng sinh trong 20 h đến 24 h có thể làm tăng việc mọc dày các vi khuẩn khác trên các đĩa thạch chọn lọc làm cho việc phát hiện ra các khuẩn lạc E.coli O157 gặp phải khó khăn. Việc nuôi cấy các đĩa thạch chọn lọc với các dung dịch pha loãng của IMS hoặc các thể tích nhỏ hơn 50 µl trên một đĩa, có thể làm tăng cơ hội thu được các khuẩn lạc tách biệt của E.coli O157, nhưng chú ý rằng điều này cũng có thể làm tăng giới hạn phát hiện.
- Thừa nhận các khuẩn lạc E.coli O157 điển hình
Các khuẩn lạc điển hình là trong suốt và gần như không màu, có viền ngoài màu vàng nâu nhạt và đường kính xấp xỉ 1 mm khi ở trên thạch CT-SMAC.
Kiểm tra các khuẩn lạc điển hình của E.coli O157 trên môi trường thạch phân lập chọn lọc thứ hai theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.
(5) Khẳng định
CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng các bộ thử nhỏ nhận dạng bằng sinh hóa bán sẵn để nhận dạng E.coli dương tính indol và âm tính sorbitol và các bộ thử kết dính keo tổng hợp về E.coli O157, với điều kiện là các phép thử thích hợp đã có các chủng âm tính và dương tính biết trước đã được thực hiện để khẳng định tính năng.
- Chọn khuẩn lạc
Từ mỗi đĩa lấy năm khuẩn lạc điển hình, như đã chọn trong 9.4. Nếu như trên đĩa có ít hơn năm khuẩn lạc thì lấy tất cả các khuẩn lạc có mặt để kiểm tra.
Ria cấy từng khuẩn lạc đã chọn lên đĩa thạch dinh dưỡng (5.4) để cho phát triển các khuẩn lạc tách biệt tốt.
Ủ (trong tủ ấm 6.3) các đĩa trong 18 h đến 24 h ở 37oC.
Chỉ sử dụng các khuẩn lạc thuần khiết từ đĩa thạch dinh dưỡng cho các phép thử trong 9.5.2 và 9.5.3.
- Khẳng định bằng sinh hóa: sinh indol
Cấy một khuẩn lạc từ dịch cấy thuần khiết trên đĩa thạch dinh dưỡng (9.5.1) vào ống đựng môi trường trypton/tryptophan (5.5).
Ủ (trong tủ ấm 6.3) ở 37oC trong 24 h.
Thêm 1 ml thuốc thử Kovac’s (5.6) và để yên 10 min ở nhiệt độ phòng.
Việc hình thành màu đỏ chứng tỏ phản ứng dương tính. Màu vàng/nâu chứng tỏ phản ứng âm tính.
- Nhận dạng bằng huyết thanh
+ Khái quát
Chỉ kiểm tra các khuẩn lạc dương tính indol bằng phản ứng huyết thanh của chúng với kháng huyết thanh E.coli O157.
+ Loại bỏ các vi khuẩn phân lập tự kết dính
Cho một giọt dung dịch nước muối (5.9) lên một phiến kính thủy tinh sạch.
Dùng vòng cấy (6.10), trộn trong giọt nước muối này một khuẩn lạc lấy từ đĩa thạch dinh dưỡng (9.5.1) sao cho thu được huyền phù đục và đồng nhất.
Di chuyển phiến kính nhẹ nhàng trong 30 s đến 60 s. Quan sát kết quả thu được dựa vào nền màu đen và dùng kính lúp, nếu cần.
Nếu huyền phù tạo thành các mảng có thể nhìn thấy, thì chủng đó được coi là tự kết dính và không được dùng để kiểm tra tiếp, vì không thể xảy ra phản ứng với kháng huyết thanh cụ thể.
+ Phản ứng kháng huyết thanh E.coli O157
Sử dụng một khuẩn lạc thuần khiết từ thạch dinh dưỡng (9.5.1), hòa trong một giọt nước muối mới như trong 9.5.3.2 và thêm một giọt kháng huyết thanh E.coli O157 (5.10).
Nếu trong vòng 1 min thấy xuất hiện dinh kết, thì phản ứng là dương tính.
+ Nhận dạng dương tính
Các vi khuẩn tách riêng cho phản ứng dương tính với indol và phản ứng với kháng huyết thanh O157 hoặc O157 cộng với kháng huyết thanh H7 được coi là các vi khuẩn dương tính.
(6) Đặc trưng khác
Để nhận dạng các đặc khuẩn lạc dương tính cho việc phát hiện các kháng nguyên roi và các đặc tính gây bệnh, cần gửi các chủng này đến phòng thử nghiệm chuẩn.
<subquestion>Báo cáo thử nghiệm phát hiện Escherichia coli O157 trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi phải ghi rõ thông tin gì?</subquestion>
Tại Mục 12 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7686:2007 có quy định báo cáo thử nghiệm phát hiện Escherichia coli O157 trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi phải ghi rõ thông tin sau:
- Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;
- Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;
- Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;
- Nhiệt độ ủ đã sử dụng;
- Mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;
- Các kết quả thử nghiệm thu được;
Báo cáo kết quả cũng phải nêu rõ nếu các phép thử tiếp theo được thực hiện bởi phòng thử nghiệm chuẩn, hoặc nếu đã thực hiện thì nêu kết quả thu được.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7686:2007 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 7686:2007 TCVN 7686:2007