MTX còn cạnh tranh với emzym Thymidylate synthetase trong vòng 24 giờ sau uống làm giảm folat và thymidylat cần thiết cho sự tổng hợp RNA và DNA trong pha S của chu kỳ tế bào sinh tổng hợp DNA bị ức chế và gián phân bị ngừng lại.