3、核酸、蛋白电流
核酸电泳实验
琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化dna片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的dna片段。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的dna条带，用于以后的克隆操作。
实验原理：当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶eb染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng的dna条带，从而可以确定dna片段在凝胶中的位置。
通常采用水平装置在强度和方向恒定的电场下进行琼脂糖电泳。dna电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于dna分子的大小。琼脂糖凝胶分离dna片度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的dna片段。
一般情况下，分离小于0.5kb的dna片段所需胶浓度是1.2-1.5%，分离大于10kb的dna分子所需胶浓度为0.3-0.7%，dna片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。
一、设备
水平式电泳装置，电泳仪，台式高速离心机， 恒温水浴锅， 微量移液枪， 微波炉或电炉，紫外透射仪，照相支架， 照相机及其附件。
二、试剂
1、5×tbe电泳缓冲液。
2、6×电泳载样缓冲液。
3、溴化乙锭(eb)溶液母液:将eb配制成10mg/ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。
三、琼脂糖凝胶的制备
1、取5×tbe缓冲液20ml加水至200ml，配制成0.5×tbe稀释缓冲液，待用。
2、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入50ml 0.5×tbe稀释缓冲液，放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发。
3、灌胶：
（1）将有机托盘放入制胶模具上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。
（2）向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(eb)溶液使其终浓度为0.5μg/ml(也可不把eb加入凝胶中，而是电泳后再用0.5μg/ml的eb溶液浸泡染色)。
（3）将琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡。
（4）待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5×tbe稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起，阻碍缓冲液进入样品槽中，所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。
4、加样：取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。若dna含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
5、电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80v，电流在40ma以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。
6、染色：未加eb的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的eb溶液中，室温下染色20-25分钟。
7、观察和拍照：
在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有eb的电泳胶板。dna存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损伤眼睛。
sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)
实验原理：
sds-page是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。  
sds是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。sds蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。
试剂和器材：
试剂：
1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/l的tris-hcl(ph6.8)，5ml 50%甘油，2ml 10%的sds，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。
2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。
3. ph8.9分离胶缓冲液： tris 36.3g ，加1mol/l hcl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调ph8.9，定容至100ml，4℃保存。
4. ph6.7浓缩胶缓冲液：tris 5.98g ，加1mol/l hcl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调ph6.7，定容至100ml，4℃保存。
5. temed（四乙基乙二胺）原液
6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）
7. ph8.3 tris-甘氨酸电极缓冲液：称取tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调ph8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。
8. 考马斯亮蓝g250染色液：称100mg考马斯亮蓝g250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。
实验操作
（一）样品制备
将蛋白质样品与5x样品缓冲液（20ul＋5ul）在一个eppendorf管中混合。放入100℃加热 5－10min，取上清点样。
（二）分离胶及浓缩胶的制备
1 将玻璃板、样品梳、spacer用洗涤剂洗净，用ddh2o 冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；
2 将两块洗净的玻璃板之间加入spacer，按照bio-rad mini Ⅱ/Ⅲ说明书提示装好玻璃板；
3 按如下体积配制10％分离胶8.0 ml，混匀；
ddh2o　3.0 ml  
1.0 mol/ltris-hcl ph=8.8　2.1 ml  
30% acr-bis　2.8 ml  
10% sds　80 ul  
10%ap　56 ul  
temed 　6 u
4 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合；
5 按如下体积配制6％浓缩胶3.0 ml，混匀；ddh2o 1.0 mol/ltris-hclph=6.8 30% acr-bis
2.0 ml 400 ul 600 ul  
10% sds 10% ap temed  
36ul 24ul 4ul
6 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；
7 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20 μl;
8 稳压200v，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 min～1hr.
9 卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色1～2 hr；加入脱色液，置于80 rpm脱色摇床上，每20 min更换一次脱色液（10 ml 冰乙酸；45 ml乙醇；45 ml蒸馏水）至完全脱净。
免疫荧光实验
免疫荧光技术（immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位。
一、基本原理：
免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
二、应用范围：
其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。
三、基本实验步骤：
1、细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，pbs洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用pbs离心洗涤（1000rpm，5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
2、固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的pbs中4℃保存3个月。pbs洗涤3×5 min。
3、通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min。通透后用pbs洗涤3×5 min。
4、封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min。
5、一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。pbst漂洗3次，每次冲洗5min。
6、二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h。pbst漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。
7、封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。
四、注意事项：
1、染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。
2、荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。
3、二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。
4、整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的nan３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
5、洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。
6、加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白fc受体，降低和防止非特异性染色。
7、dapi染色30s，用pbs充分清洗3次。
8、抗淬灭剂可拿来直接封片，20微升即可，之后片子可保留更长时间。
9、荧光共聚焦显微镜观察或荧光相差显微镜观察。
五、荧光物质：
1、荧光色素
许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：
(1)异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，fitc）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490–495nm，最大发射光波长520–530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
(2)四乙基罗丹明（rhodamine，rib200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。
(3)四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，tritc）
最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与fitc的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。
2、其他荧光物质
（1）酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-d半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。
（2）镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（eu3 ）、铽（tb3 ）、铈（ce3 ）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以eu3 应用最广。eu3
螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。
六、常见荧光素的特性：
1、fitc：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm，发射光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光（图1a）。
2、rb200：橘红色粉末， 吸收光570nm，发射光595~600nm，橘红色荧光。
3、tritc：紫红色粉末，吸收550nm，发射光620nm，橙红色荧光（图1b）。
4、镧系：eu、tb
5、pe：吸收光490~560nm，发射光595nm，红色荧光。
6、dapi是一种能够与dna强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。因为dapi可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的细胞核的染色（图1c）。
7、其它：酶作用后产生荧光物质。