6、共聚焦显微镜免疫荧光分析
免疫荧光实验
免疫荧光技术（immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位。
一、基本原理：
免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
二、应用范围：
其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。
三、基本实验步骤：
1、细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，pbs洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用pbs离心洗涤（1000rpm，5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
2、固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的pbs中4℃保存3个月。pbs洗涤3×5 min。
3、通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min。通透后用pbs洗涤3×5 min。
4、封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min。
5、一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。pbst漂洗3次，每次冲洗5min。
6、二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h。pbst漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。
7、封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。
四、注意事项：
1、染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。
2、荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。
3、二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。
4、整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的nan３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
5、洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。
6、加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白fc受体，降低和防止非特异性染色。
7、dapi染色30s，用pbs充分清洗3次。
8、抗淬灭剂可拿来直接封片，20微升即可，之后片子可保留更长时间。
9、荧光共聚焦显微镜观察或荧光相差显微镜观察。
五、荧光物质：
1、荧光色素
许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：
(1)异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，fitc）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490–495nm，最大发射光波长520–530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
(2)四乙基罗丹明（rhodamine，rib200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色荧光。
(3)四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，tritc）
最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与fitc的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。
2、其他荧光物质
（1）酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-d半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。
（2）镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（eu3 ）、铽（tb3 ）、铈（ce3 ）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以eu3 应用最广。eu3
螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。
六、常见荧光素的特性：
1、fitc：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm，发射光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光（图1a）。
2、rb200：橘红色粉末， 吸收光570nm，发射光595~600nm，橘红色荧光。
3、tritc：紫红色粉末，吸收550nm，发射光620nm，橙红色荧光（图1b）。
4、镧系：eu、tb
5、pe：吸收光490~560nm，发射光595nm，红色荧光。
6、dapi是一种能够与dna强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。因为dapi可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的细胞核的染色（图1c）。
7、其它：酶作用后产生荧光物质。
常用动物模型
一、桡骨缺损模型：
实验动物：新西兰兔或日本大白兔
实验操作：
1. 动物麻醉：生理盐水与鹿眠灵按照1:24 稀释25倍后，约0.6-0.8ml/kg剂量肌肉注射。
2. 兔桡骨缺损模型的建立：
（1）双侧前肢备皮后，将兔置于腹卧位，四肢外展固定于手术台上，强力碘消毒双侧前肢，铺无菌巾。
（2）沿前臂桡骨中下段纵切长约3-3.5cm的切口，钝性分离皮下组织、筋膜、肌肉；
（3）分离切开骨膜后，沿骨膜下分离暴露桡骨；
（4）以距桡骨远端约1cm为远端切割点，往近侧20mm为近端切割点，画样并切割；
（5）取出桡骨中下段20mm 的节段性骨缺损，修整肢体两侧断端并压迫止血。
3. 材料植入：
（1）缺损处经生理盐水冲洗，去除血凝块。
（2）将不同组别的材料分别植入缺损处，注意材料与骨断端处应无肌肉或其他软组织嵌入。
（3）空白对照组为缺损不作任何处置。
（4）分层缝合创口，对合皮肤，强力碘消毒。
（5）在术后1周内，每只兔每天肌注青霉素40万单位。
注意事项：
1.钝性分离时，尽可能不破坏皮层及肌层的静脉血供，注意避免伤及动脉。
2.电钻磨取骨缺损时，将周围骨膜一并摘取。
3.实验动物须随机分组，每只兔左右桡骨分别植入不同材料，最好交叉设计。
二、颅骨缺损
（待续…）
三、胫骨平台缺损
（待续…）