Pirosekvenciranje
Pirosekvenciranje je metod sekvenciranja DNK (određivanje redoslijeda nukleotida u DNK), zasnovan na principu "sekvenciranja sintezom", u kojem se sekvenciranje izvodi otkrivanjem nukleotida inkorporiranih pomoću DNK-polimeraza. Pirosekvenciranje se oslanja na detekciju svjetlosti na osnovu lančane reakcije kada se oslobodi pirofosfat. Otuda i naziv pirosekvenciranje. Princip pirosekvenciranja prvi je put opisan 1993. godine, , što su otkrili Bertil Pettersson, Mathias Uhlen and Pål Nyrén kombinovanjem metoda sekvenciranja čvrste faze. Koristili sui streptavidinom obložene magnetne kuglice s rekombinantnom DNK-polimerazom kojoj nedostaje 3´ do 5´ egzonukleazna aktivnost (lektoriranje) i detekciju luminescencije pomoću enzima luciferaze svjetlaca. Dodaje se mješavina tri enzima (DNK-polimeraza, ATP sulfurilaza i svjetlačka luciferaza) i nukleotida (dNTP) na jednolančanu DNK koju treba sekvencirati, a ugrađivanje nukleotida je praćeno mjerenjem emitirane svjetlosti. Intenzitet svjetlosti određuje da li je ugrađeno 0, 1 ili više nukleotida, pokazujući na taj način koliko je komplementarnih nukleotida prisutno na lancu šablona. Smjesa nukleotida se uklanja prije dodavanja sljedeće smjese nukleotida. Ovaj proces se ponavlja sa svakim od četiri nukleotida dok se ne odredi sekvenca DNK jednolančanog šablona. Drugi metod za pirosekvencirasnje zasnovan na rastvoru opisali su Mostafa Ronaghi, Mathias Uhlen i Pål Nyren, 1998. godine., [https://www.kth.se/en/bio/research/proteomics/proteomics-researchers/mathias-uhlen-1.67763 U U ovom alternativnom metodu, uvodi se dodatni enzim apiraza, za uklanjanje nukleotida koji nisu ugrađeni u DNK-polimerazu. Ovo je omogućilo da se mešavina enzima uključujući DNK-polimerazu, luciferazu i apirazu doda na početku i zadrži tokom čitave procedure, čime se obezbeđuje jednostavno podešavanje pogodno za automatizaciju. Automatizirani instrument zasnovan na ovom principu na tržište je sljedeće godine uvela kompanija Pyrosequencing. Treća mikrofluidna varijanta metode pirosekvencije opisana je u 2005 šrto su učinili Jonathan Rothberg i saradnici u kompaniji 454 Life Sciences. Ovaj alternativni pristup pirosekvenciranja bio je zasnovan na originalnom principu vezivanja DNK za sekvencioniranje na čvrsti nosač; pokazali su da se sekvenciranje može izvesti na vrlo paralelan način pomoću mikrofabriciranih mikronizova. To je omogućilo visoko propusno sekvenciranje DNK i automatizirani instrument je uveden na tržište. Ovo je postao prvi instrument za sekvenciranje sljedeće generacije koji je započeo novu eru u istraživanju genomike, sa rapidnim padom cijena za sekvenciranje DNK, omogućavajući sekvenciranje cijelog genoma po pristupačnim cijenama.