Polimerazna lančana reakcija
Polimerazna lančana reakcija (eng. polymerase chain reaction: PCR), jeste lančana reakcija umnožavanja polimerazom. Lančana sinteza polimerazom, amplifikacija polimerazom ili polimerazna amplifikacija, uobičajeno PCR, samo su neki od oblika prevoda izvornog naziva tehnike koja je doslovno izazvala revoluciju u oblasti molekulske genetike i biologije uopće. Polazna količina DNK, koja je decenijama predstavljala ograničavajući faktor u istraživanjima, svela se na potrebu prisustva samo jedne dobro očuvane molekule a mukotrpne procedure izolacije i prečišćavanja dijelova genoma postale su jednostavnije. Pred istraživačima su se naglo otvorile nove mogućnosti. Pored toga, gotovo da ne postoji društvena djelatnost koju ova tehnika nije direktno ili indirektno dotakla i zauvijek izmijenila. Glavni “krivci” za ovakvu pometnju su Kary Mullis i njegovi suradnici iz Odjela za humanu genetiku Korporacije Cetus. U časopisu Science 1985. godine objavili su rad u kojem prvi put opisuju tehniku specifičnog umnožavanja fragmenta DNK in vitro kataliziranog enzimom DNK polimeraza porijeklom iz Escherichia coli. U istom časopisu 1988. godine isti tim naučnika publicira rad u kome umjesto navedene polimeraze E. coli uvode termostabilnu DNK polimerazu I izolovanu iz bakterije Thermus aquaticus (Taq). Unatoč brojnim modifikacijama, raznovrsnim primjenama i automatizaciji procesa lančane sinteze polimerazom, osnovne odrednice ove tehnike utemeljene 1985. godine i 1988. godine nisu se značajnije izmijenile. Osnovne premise na kojim se zasniva PCR su slijedeće. U nativnom stanju DNK je dvostruki heliks koji se, sastoji se od dva antiparalelna polinukleotidna lanca međusobno povezana vodikovim vezama; nukleotidi jednog polinukleotidnog lanca su međusobno povezani kovalentnom vezom između dezoksiriboze jednog nukleotida i fosfatne grupe susjednog nukleotida, a vodikove veze koje održavaju dva polinukleotidna lanca zajedno uvijek se formiraju između komplementarnih baza, tj. adenin (A) se uvijek veže za timin (T), a citozin (C) za guanin (G). Vodikove veze su energetski slabe i lako se remete zagrijavanjem (denaturacija), dok su kovalentne veze stabilne i pri zagrijavanju se održavaju, a hlađenje dovodi do ponovnog uspostavljanja vodikovih veza između komplementarnih baza (renaturacija). DNK replikaciju in vivo inicira RNK Pol I sintetizirajući kratke RNK sekvence, time kreirajući supstrat za DNK Pol I (slobodnu –OH–grupu dezoksiriboze na 3’–kraju), a na optimalnoj temperaturi, DNK Pol I katalizira ugradnju slobodnih dezoksiribonukleotid–3–fosfata na postojeći oligonukleotidni lanac sa slobodnom –OH–grupom na 3’–kraju, kada je isti vodikovim vezama povezan za matricu. Pošavši od ovih premisa, Mullis je pretpostavio da može postići umnožavanje specifičnog dijela DNK molekule koji leži između dva regiona čija je sekvenca poznata. Selekcija specifičnog dijela DNK molekule postiže se primjenom oligonukleotidnih prajmera, kratkih DNK sekvenci (20–30 nukleotida) koje su komplementarne krajevima definirane sekvence. U tipičnoj PCR reakciji učestvuju dva prajmera sintetizirana u 5’3’–pravcu, tako da se na njihovom 3’–kraju nalazi dezoksiriboza sa slobodnom –OH–grupom i obično se obilježavaju sa F (forward) i R (reverse). Na temperaturi od 95 oC pucaju vodikove veze koje održavaju dvolančanu strukturu molekule čiji se dio umnožava (template DNA = matrica) te se ona denaturiše. Spuštanjem temperature stvaraju se uvjeti za renaturaciju, ali i za formiranje hibridnih molekula matrica–prajmer. DNK Pol I pronalazi takve hibride i pod odgovarajućim uvjetima katalizira vezivanje fosfatne grupe dezoksinukleotid–3–fosfata za 3’–OH–grupu dezoksiriboze prajmera prema konstanti komplementarnosti. Rezultat je sintetiziran naspramni lanac komplementaran matrici koji može poslužiti kao matrica drugom prajmeru. Ovaj ciklus denaturacije zagrijavanjem, renaturacije hlađenjem i sinteze naspramnog lanca može se ponavljati a svaki novosintetizirani lanac postaje matrica u narednom ciklusu. Također, sa porastom broja ciklusa eksponencijalno raste broj molekula specifično umnožavanog dijela DNK. Teorijski broj molekula ciljane sekvence koja se sastoji od sekvence prajmera i dijela DNK molekule između prajmerskih sekvenci, iznosi 2n–2n (n = broj ciklusa) za svaku molekulu DNK matrice. Također teorijski, od jedne jedine molekule se, u 30 ciklusa, može dobiti 230–2*30 = 1.073.741.764 ciljanih fragmenata. Ponavljanje ciklusa može biti efikasno sve dok ne nastane deficit neke od komponenti (prajmera, nukleotid–3–fosfata ili enzima). Ovisno od svrhe reakcije, veličine umnožavanog dijela DNK i željene koncentracije, tipična PCR reakcija se odvija u 30–40 ciklusa. Jedna od prvih DNK molekula koju je Mullis uspio umnožiti na ovaj način je dio gena veličine 110 bp koji kodira sitezu –globina. Ovaj fragment sadrži mjesta tačkastih mutacija u šestom kodonu gena koje dovode do promjene normalnog –globina (A) u S karakterističan za anemiju srpastih ćelija i A u C karakterističan za intracelularnu kristalizaciju hemoglobina i hemolizu. Ova procedura je značajno skratila i pojednostavila identifikaciju dva tipa mutacija koje dovode do ozbiljnih poremećaja hemoglobina. Tako je PCR tehnika već u začetku zauvijek osigurala svoje mjesto u svijetu molekularnogenetičkih istraživanja. Tipična reakcija enzimatske amplifikacije DNK fragmenta odvija se u plastičnim tubicama sa poklopcem volumena 200 l. Plastika je termostabilna a zid tubice dovoljno tanak da omogući brzo i ravnomjerno zagrijavanje smjese. Volumen reakcije se kreće od 25 do 100 l, ovisno o primjeni. Ovdje je naveden jedan primjer smjese i programa PCR reakcije. Tab. 3.6.1: Elementi i uvjeti tipične PCR reakcije Sastojci smjese Temperaturni režim Prajmer – F 0.25 M Prajmer – R 0.25 M MgCl2 1.5 mM dATP 0.2 nM dTTP 0.2 nM dCTP 0.2 nM dGTP 0.2 nM PCR pufer x 1 Taq DNK Pol2.5 u DNK 50–100 ng dH2O do 50 l 95oC 3 min Denaturacija 95oC 30 sec – Denaturacija 55oC 30 sec – Vezivanje prajmera 72oC 1 min – Sinteza komplementarnog lanca 35 ciklūsâ Prvi Mullisovi rezultati nisu bili idealni. Pored znatne količine fragmenta gena –globina veličine 110 bp bilo je tu i dosta neželjenih produkata sinteze a i sama procedura je bila dugotrajna i mukotrpna. Smjese matrice, prajmera, nukleotida i enzima su se ručno prenosile sa jedne temperature na drugu a nakon svakog ciklusa denaturacije u rashlađen rastvor se morala dodavati nova količina DNK Pol I E. coli što je mijenjalo volumen reakcije i koncentraciju sastojaka. Pored toga, tehnika je bila efikasna samo za fragmente < 200 bp. Uvođenjem DNK Pol I izolovane iz termofilne bakterije T. aquaticus (Taq DNK Pol I) 1988. postupak je znatno skraćen, a umnožavanje fragmenta je postalo znatno specifičnije i efikasnije. U prvim istraživanjima, čiji su rezultati objavljeni nakon uvođenja Taq DNK polimeraze, uspješno je umnožen fragment veličine 2.000 bp. Istovremeno su se otvorile i mogućnosti za automatizaciju i napravljene su prve PCR mašine (thermocycler) na kojim se mogla isprogramirati temperatura, trajanje određene faze i broj ciklusa. Prve mašine su bile obični termoblokovi sa otvorenim vrhom tako da su zagrijane smjese evaporirale i ponovo kondenzirale u vrhu tubice. Problem evaporacije je riješen prekrivanjem vodenog rastvora kapljicom mineralnog ulja, ali je istovremeno unesen drugi problem – ulje je bilo nepoželjno u procedurama koje slijede i moralo se ukloniti. Trajno rješenje problema postignuto je uvođenjem “vrućeg poklopca” (hot lid) pa je temperatura na vrhu tubice sada znatno viša, tako da smjesa ne evaporira a čitava procedura teče u jednom homogenom sistemu. U godinama koje su uslijedile, oko PCR tehnike je nastala čitava jedna industrija. Velike kompanije su započele bespoštednu utrku na usavršavanju različitih komponenti PCR procesa jer je postalo jasno da će kompanija koja osvoji PCR osvojiti ogromno tržište. Kompeticija je bila žestoka, strahoviti su iznosi bili u opticaju a kao pobjednici su izašli Applied Biosystems, Gibco–Life Technologies i Cetus korporacija koja je i vlasnik patenta. Najbitniji rezultati ove utrke su potpuno programirane PCR mašine koje u svakom momentu mogu precizno kontrolirati fizičke parametre procesa te usavršavanje rekombinantne tehnike za dobijanje Taq DNK polimeraze. PCR tehnika je kontinuirano usavršavana i postignuta je tako visoka specifičnost vezivanja prajmera i izbora umnožavanog regiona da kod umnožavanja dijelova bakterijske DNK ponekad nije neophodno ekstrahovati DNK. U reakcionu smjesu kao matrica se dodaju cijele ćelije. Visoka temperatura denaturacije izaziva lizu ćelije, oslobađa “golu” bakterijsku DNK, a pod odgovarajućim temperaturnim uvjetima, prajmeri i polimeraza pronalaze svoj cilj. Danas je PCR široko prihvaćena i primijenjena tehnika. Postala je nezamjenjiva u gotovo svim pravcima fundamentalnih, ali i primijenjenih istraživanja u sferi molekularne biologije i graničnih znanosti. Evo nekoliko primjera fundamentalne primjene koju je iniciralo otkriće PCR. Razvoj PCR je donio definitivnu prevlast Sangerovoj metodi sekvencioniranja DNK putem terminalizacije sintetiziranog lanca dideoksinukleotidima koji nemaju 3’–OH grupu. Primjenom RNK zavisne DNK polimeraze (reverzna transkriptaza) u PCR tehnici nastao je tzv. RT–PCR a sa njim i mogućnost pravljenja DNK kopija raznih RNK molekula. RT–PCR postao je nezamjenjiv u istraživanju RNK virusa i moćno sredstvo genetike razvića i funkcionalne genetike . Precizna kontrola nad fizičkim i biohemijskim parametrima PCR reakcije omogućava uvođenje dirigovanih mutacija u nativne i generirane DNK molekule. Uvođenje nesavršeno komplementarnih prajmera u PCR reakciju okosnica je tehnike nazvane site direct