Marcksl1
MARCKS-liki protein 1 je protein koji je kod ljudi kodiran genom Marcksl1 sa hromosoma 4. Epitelni natrijski kanal (ENaC) regulra krvni pritisak finim podešavanjem reapsorpcije natrija iz distalnog nefrona. U prethodnim radovima, grupa istraživača je 2020. pokazala da ENaC kanali reguliraju anionski fosfolipidni fosfati, uključujući fosfatidilinozitol 4,5-bisfosfat (PIP2). Regulacija ENaC-a zavisna od PIP2 je posredovana miristoiliranim alaninom bogatim protein kinazom C supstratom, kkao što je protein-1 (MLP-1). MLP-1 se vezuje za njega i predstavlja reverzibilni izvor PIP2 na plazmamembrani. Ispitivali su MLP-1 regulaciju ENaC u ćelijama DCT-15 klonirane ćelijske linije distalnih izuvijanih tubula. Divlji tip MLP-1 radi sa prividnom molekulskom masom od 52 kDa, uprkos tome što ima predviđenu molekulsku masu od 21 kDa. Prirodni MLP-1 sastoji se od nekoliko različitih strukturnih elemenata: efektorski domen koji je visoko pozitivno naelektrisan, sekvestrira PIP2, sadrži serine koji su meta PKC-a i kontrolira povezanost MLP-1 sa membranom, domen miristoilacije koji promovira povezanost s membranom i domen višestruke homologije 2 prethodno nepoznate funkcije. Da bismo dalje ispitali MLP-1 u DCT-15 ćelijama, konstruisali smo nekoliko MLP-1 mutanata: WT, protein divljeg tipa pune dužine; S3A, tri supstitucije u efektorskom domenu za sprečavanje fosforilacije; S3D je oponašao konstitutivnu fosforilaciju zamjenom tri serina aspartatima, i GA je zamijenio glicin na mjestima miristoilacija sa alaninom, tako da GA nije mogao biti miristoiliran. Svaki mutant je označen ili NH2-terminalnim 3XFLAG ili COOH-terminalnim mCherry ili V5. Transfekcija sa MLP mutantima modificirala je aktivnost ENaC u DCT-15 ćelijama: aktivnost je bila najveća u S3A, a najniža u S3D, a aktivnost nakon transfekcije sa bilo kojim konstruktom bila je značajno drugačija od WT. U Western blotovima, kada su transficirani sa 3XFLAG-označenim MLP-1 mutantima, ekspresija pune dužine MLP-1 na 52 kDa povećala se u mutantnim S3A-MLP-1-transficiranim DCT-15 ćelijama i smanjila se u S3D-MLP-1 -transficirane DCT-15 ćelije. Također otkrivene su i Northern blot trake niže molekulne mase, koje odgovaraju potencijalnim pretpostavljenim produktima cijepanja kalpaina. Konfokusna slika pokazuje da se različiti mutanti lokaliziraju u različitim subćelijskim odjeljcima, u skladu s njihovom preferiranom lokacijom u membrani ili u citosolu. Aktivacija protein-kinaze C povećava fosforilaciju endogenog MLP-1 i smanjuje aktivnost ENaC. Dobijeni rezultati ukazuju na komplikovanu ulogu proteolitske obrade u MLP-1 regulaciji ENaC.