Dirigirana mutageneza
Dirigirana mutageneza je proces kontrolisane i usmjerene indukcije poželjnih mutacija. Mutanti su osnovni preduslov za svaku studiju o genetskoj promjenljivosti. Do sada su uglavnom kreirani mutagenima hemijske ili fizičke prirode koji mijenjaju strukturu DNK. Inducirana mutageneza je veoma uspješna, ali ipak ima i niz nedostataka. Prije svega, svaki gen u organizmu može biti promijenjen, a da je pri tome frekvencija mutacija u genu od interesa veoma niska. Čak i kada se izoluje gen sa željenim fenotipom, to nije garancija da se mutacija desila baš u ciljanom genu. Unaprijeđenjem tehnika molekularne biologije, izolacija i proučavanje pojedinačnih gena ne samo da je moguće nego je postalo i rutinska operacija. Umjesto masovne indukcije mutageneze mnogih ćelija ili organizama (a zatim analiziranja hiljada ili miliona potomaka kako bi se pronašao traženi mutant), sada je moguće posebno promijeniti bilo koju bazu u kloniranoj DNK sekvenci. Jedna od možda najinteresantnijih oblasti genske manipulacije je proteinsko inženjerstvo, odnosno izmjena strukture proteina promjenom kodirajuće genske sekvence. Ova manipulacija proteinima je postala moguća primjenom tehnika in vitro mutageneze. Bolje razumijevanje strukture i funkcije proteina omogućilo je da se tačno odredi položaj aminokiselina koje su dio sadržaja u proteinskoj sekvenci. Na taj način moguće je izazvati promjenu na ovim mjestima i ispitivati njene efekte. Željeni efekti mogu se ogledati u promjeni katalitičke aktivnosti enzima, unaprijeđenju hranljivog statusa proteina ili unaprijeđenju stabilnosti proteina koji se upotrebljavaju u industriji i medicini. Tehnike in vitro mutageneze omogućavaju indukciju pojedinačne mutacije unutar genske sekvence, a poznate su i kao oligonukleotid-dirigovane ili dirigovana mutageneza. Najjednostavniji primjer ciljane mutageneze je metod izgradnje jedne začetnice (prajmera). Ovaj metod podrazumijeva pokretanje in vitro DNK sinteze sa hemijski dobijenim oligonukleotidom koji nosi jednu izmijenjenu bazu u odnosu na komplementarnu sekvencu. Za uspješnost primjene ovog postupka potrebno je da DNK (koja će biti mutirana) bude u jednolančanom obliku što je omogućeno kloniranjem gena u M13 baziranih vektora.< Nakon vezanja jednolančane DNK matrice i oligonukleotida koji nosi mutaciju za matricu, slijedi kopiranje matrice uz pomoć DNK polimeraze. Iako je mjesto mutacije na oligonukleotidu neusklađeno sa matricom, granični dijelovi sekvence obezbjeđuju stabilnu povezanost. Na ovaj način proizvodi se dvolančana DNK koja, nakon replikacije daje dvije molekule kćeri, od kojih jedna sadrži željenu mutaciju. Frekvencija mutiranih kopija u poređenju sa divljim tipom može biti niska. U cilju izdvajanja mutanata, može se primijeniti hibridizacija nukleinskih kiselina sa radioaktivno obilježenim nukleotidom kao probom. U odgovarajućim uslovima (temperatura i koncentracija kationa), pozitivan signal će se javiti samo u hibridnim molekulama sa mutiranim klonom. Molekula DNK koja sadrži jedan mutirani i jedan nemutirani lanac će replikacijom neminovno dati i mutirane i nemutirane molekule. Poželjno je da se spriječi umnožavanje nemutiranih kopija za što su razvijene različite strategije. Dobijanjem promijenjenih gena dirigovanom mutagenezom, protein se proizvodi upotrebom ekspresijskog sistema. Obično se koristi vektor koji sadrži lac promotor, tako da transkripcija može biti kontrolisana dodatkom isopropil-tiogalaktozida. S druge strane, PL promotor može biti korišten sa termosenzitivnim cI represorom, pri čemu je ekspresija mutiranog gena spriječena na 30 C, ali se odvija pri 42 C. Mutirani protein se analizira poređenjem sa proteinom divljeg tipa. Na ovaj način, biosintezom proteina se može upravljati induciranjem prefinjenih strukturnih promjena koje se ispoljavaju u izmijenjenim funkcionalnim karakteristikama. Očito je da primjena tehnika ciljane mutageneze ima veliki potencijal za višestruku upotrebu koji tek treba istražiti.