PI4KAP2
Putativni fosfatidilinozitol 4-kinaza-alfoliki protein P2 jest enzim koji je kod ljudi kodiran genom PI4KAP2 sa hromosoma 22. U jednom od istraživanja iz 2002. snaliza ekspresne sekvence (EST) izvedena je na nenormalizovanim, neamplifikovanim bibliotekama cDNK konstruiranih od mrežnjače odraslog čoveka, da bi se ispitao profil ekspresije tkiva i da se doprinese resursima za studije funkcionalne genomike. Konstatira se da retina sadrži tkivo gdje svjetlost počinje svoju transformaciju u vid. Specijalizirane fotoreceptorske ćelije pretvaraju fotone u nervne impulse koji su organizirani kroz složene slojeve nervnih ćelija i prenose se do centara percepcije u mozgu (potiljačni režanj). Nije iznenađujuće da retina ima veliki broj tkivno specifičnih proteina i identificirane su mutacije u genima za mnoge od ovih proteina u širokom spektru nasljednih oštećenja oka [1,2]. Retina takođe ima mnogo zajedničkog sa drugim nervnim tkivima, posebno onima koji su povezani sa sluhom, tako da stanja poput Usherovog sindroma utiču i na sluh i na vid preko mutacija u genima zajedničkim za uho i oko. Analiza ekspresne sekvence (EST) retine je već proizvela hiljade sekvenci u DBEST-u i one su bile instrumentalne u identifikaciji nekoliko lokusa bolesti. Važan primjer za to je otkriće gena koji je defektan u Stargardovoj bolesti, nasljednoj degeneraciji žute pjege. Pored njihove vrijednosti u otkrivanju gena, EST-ovi su suštinski resurs za proučavanje funkcionalne genomike, posebno za izgradnju mikronizova cDNK za upoređivanje nivoa ekspresije gena u bolesti, starenju i razvoju. Iako su mnogi mrežnjačni EST-ovi sekvencirani, nisu svi dostupni kao DNK za dalja istraživanja. Javne baze podataka također sadrže mnoge sekvence lošeg kvaliteta ili kontaminirajućeg porijekla. Osim toga, mnoge biblioteke koje su korištene za EST analizu su pojačane ili oduzete. Ove manipulacije imaju potencijal da smanje sadržaj određenih klonova, poput onih koji slabo rastu u bakterijskim domaćinima. Većina EST-projekata se također koncentrira na 3' čitanja. S obzirom na to da ovo prebacuje podatke prema 3' neprevedenim regijama (3' UTR) gdje su introni vrlo rijetki, to smanjuje šanse za uočavanje novih oblika prerade koji bi doveli do varijanti proteina sa strukturnim i funkcionalnim razlikama. Iz ovih razloga, a da bi se dobili klonov za izgradnju cDNK mikromreža ljudskog oka, konstruisali su neamplificirane biblioteke cDNK od secirane, post mortem ljudske mrežnjače kao dio projekta NEIBank . Opisali su početnu analizu preko 2.200 5' sekvenci očitavanja. Podaci otkrivaju nove, ili ranije neidentifikovane, gene i brojne varijante transkripta s potencijalnim funkcionalnim značajem. Sve sekvence su dostupne preko sajtu NEIBanka. Dvije veličine frakcionirane biblioteke cDNK (označene hd i he) konstruisane su od RNK ljudske retine. Klonovi su nasumično odabrani za sekvenciranje i analizirani uz pomoć bioinformatičkog programa GRIST (GRouping and Identification of Sequence Tags). PCR, Northern blota i drugih tehnika za ispitivanje odabranih novih transkripata. Nakon informatičke analize, 2.200 uzoraka cDNK retine daje 1.254 jedinstvena klastera, potencijalno predstavljajući pojedinačne gene. Opsin bio je najzastupljeniji transkript, a i drugi transkripti retine su istaknuto zastupljeni. Jedan obilni klaster cDNK kodira retbindin, novi transkript poželjan za mrežnjače, koji ima sličnost sekvence sa proteinima koji vezuju riboflavin i čiji je gen na hromosomu 19. Također su uočene varijante transkripta poznatih gena retine, uključujući alternativni egzon u kodirajućoj sekvenci transkripcijskog faktora NRL i preskočeni egzon kodirajuće sekvence u podjedinici γ fosfodiesteraza (PDE6G). Zaključeno je da su nove biblioteke cDNK mrežnjače po kvalitetu povoljne u poređenju sa onima koje su već zastupljene u javnim bazama podataka. Oni su bogati sekvencama specifičnim za mrežnjaču i uključuju obilje cDNK za novi protein, retbindin. Funkcija retbindina ostaje da se utvrdi, ali je kandidat za vezivanje flavinoida ili karotenoida. Analiza višestrukih klonova za visoko eksprimirane gene mrežnjače otkriva nekoliko alternativnih varijanti prerade u kodirajućim i nekodirajućim sekvencama koje mogu imati funkcionalni značaj. Potvrđeni set cDNK retine će doprinijeti neredundantnom setu za konstrukciju mikročipova.