title: Direktiva Vijeća 98/57/EZ od 20. srpnja 1998. o suzbijanju bakterije Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al .

text:
               03/Sv. 002

               HR

               Službeni list Europske unije

               84

         31998L0057

               L 235/1

               SLUŽBENI LIST EUROPSKE UNIJE

               20.07.1998.

      DIREKTIVA VIJEĆA 98/57/EZ
   od 20. srpnja 1998.
   o suzbijanju bakterije Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.
   VIJEĆE EUROPSKE UNIJE,
   uzimajući u obzir Ugovor o osnivanju Europske zajednice, a posebno njegov članak 43.,
   uzimajući u obzir prijedlog Komisije (1),
   uzimajući u obzir mišljenje Europskog parlamenta (2),
   uzimajući u obzir mišljenje Gospodarskog i socijalnog odbora (3),
   budući da je štetni organizam Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. ranije bio poznat pod nazivom Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith; budući da će naziv Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. vjerojatno postati opće prihvaćenim nazivom za taj organizam; budući da bi ovom Direktivom trebalo uzeti u obzir navedeni razvoj u području znanosti;
   budući da proizvodnja krumpira i rajčica zauzima značajno mjesto u poljoprivredi Zajednice; budući da štetni organizmi neprestano ugrožavaju prinos krumpira i rajčice;
   budući da bi se zaštitom proizvodnje krumpira i rajčica od takvih štetnih organizama ne samo održavali proizvodni kapaciteti, već bi se i povećala poljoprivredna proizvodnost;
   budući da bi zaštitne mjere za sprečavanje unošenja štetnih organizama u državno područje jedne države članice imale samo ograničeni učinak ako se takve organizme ne bi istodobno i metodički suzbijalo u čitavoj Zajednici te sprečavalo njihovo širenje;
   budući da je jedan od organizama štetnih za krumpir i rajčicu, Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., patogeni uzročnik smeđe truleži gomolja krumpira i bakterijskog venuća krumpira i rajčice; budući da je u nekim dijelovima Zajednice izbila bolest koju uzrokuje taj patogeni organizam i još uvijek postoje određeni ograničeni izvori zaraze;
   budući da za uzgoj krumpira i rajčica postoji znatan rizik u čitavoj Zajednici ako se za ove kulture ne poduzmu učinkovite mjere za otkrivanje tog organizma i utvrđivanje njegove rasprostranjenosti s ciljem sprečavanja njegove pojave i širenja te, ako se otkrije, za sprečavanje njegova širenja i suzbijanje s ciljem iskorjenjivanja;
   budući da je zbog osiguranja tog cilja potrebno u Zajednici poduzeti određene mjere; budući da je pored toga državama članicama potrebno omogućiti da prema potrebi poduzmu dodatne ili strože mjere, pod uvjetom da to ne ometa kretanje krumpira i rajčica u Zajednici, osim u mjeri u kojoj je to utvrđeno Direktivom Vijeća 77/93/EEZ od 21. prosinca 1976. o mjerama zaštite za sprečavanje unošenja u Zajednicu organizama štetnih za bilje ili biljne proizvode i njihovog širenja unutar Zajednice (4); budući da je o takvim mjerama potrebno obavijestiti druge države članice i Komisiju;
   budući da je tim mjerama potrebno uzeti u obzir da su za otkrivanje toga patogenog organizma potrebna sustavna službena istraživanja; budući da bi takva istraživanja trebala uključivati inspekcijske postupke i, prema potrebi, postupke za uzorkovanje i testiranje s obzirom da u određenim okolišnim uvjetima bolest može može ostati latentna i nezapažena kako u nasadima krumpira, tako i u uskladištenim gomoljima krumpira; budući da širenje toga patogenog organizma u nasadima krumpira nije najvažniji čimbenik s obzirom da se taj patogeni organizam može širiti putem površinskih voda i određenih s njima povezanih samoniklih biljaka iz porodice Solanaceae, zbog čega navodnjavanje nasada krumpira i rajčica zaraženom vodom predstavlja rizik zaraze tih kultura; budući da taj patogeni organizam može također preživjeti zimu u samoniklom krumpiru i rajčicama, koji mogu predstavljati izvor prijenosa zaraze iz jedne sezone u drugu; budući da se taj patogeni organizam širi i putem doticaja sa zaraženim krumpirom i opremom za sadnju, vađenje i obradu krumpira ili spremnicima za prijevoz i skladištenje koji su kontaminirani tim organizmom pri prethodnom doticaju sa zaraženim krumpirom;
   budući da se širenje toga patogenog organizma može smanjiti ili spriječiti raskuživanjem takvih predmeta; budući da svaka zaraza sjemenskog krumpira predstavlja značajan rizik od širenja tog patogenog organizma; na sličan način veliki rizik od širenja tog patogenog organizma predstavlja i latentna zaraza sjemenskog krumpira, što se može spriječiti uporabom sjemenskog krumpira proizvedenog u okviru službeno odobrenih programa, u okviru kojih je izvršeno testiranje sjemenskog krumpira i utvrđeno da nije zaražen;
   budući da su postojeće spoznaje o biologiji i epidemiologiji bakterije Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. u europskim uvjetima nepotpune te da se može pretpostaviti da će za nekoliko sezona trebati ponovno pregledati predložene mjere; na sličan se način s obzirom na daljnja istraživanja može očekivati unapređenje postupka testiranja, a posebno u pogledu osjetljivosti i specifičnosti testnih metoda, s ciljem odabira i normizacije najboljih raspoloživih testnih metoda;
   budući da je za utvrđivanje pojedinosti takvih općih mjera, kao i strožih ili dodatnih mjera koje mogu poduzeti države članice radi sprečavanja unosa tog patogenog organizma u njihovo državno područje, poželjna bliska suradnja država članica s Komisijom u okviru Stalnog odbora za biljno zdravstvo (dalje u tekstu: „Odbor”),
   DONIJELO JE OVU DIREKTIVU:
   Članak 1.
   Ova se Direktiva odnosi na mjere koje treba poduzeti u svakoj državi članici protiv bakterije Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., prethodno poznate pod nazivom Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith (dalje u tekstu: „organizam”), kako bi se s obzirom na biljke domaćine organizma iz Priloga 1. odjeljka I. (dalje u tekstu: „popisani biljni materijal”):

               (a)

               locirao i utvrdila njegova rasprostranjenost;

               (b)

               spriječila njegova pojava i širenje; i

               (c)

               ako se organizam otkrije, spriječilo njegovo širenje i suzbio s ciljem iskorjenjivanja.

         Članak 2.
   1.   Države su članice dužne provoditi sustavna godišnja službena istraživanja za otkrivanje organizma na popisanom biljnom materijalu podrijetlom s njihova državnog područja. Za otkrivanje drugih mogućih izvora zaraze koji ugrožavaju proizvodnju popisanog biljnog materijala države su članice dužne vršiti procjenu rizika i, osim ako tom procjenom nije utvrđen nikakav rizik od širenja organizma, a u područjima za proizvodnju popisanog biljnog materijala, provoditi ciljana službena ispitivanja za otkrivanje organizma na biljkama koje ne spadaju u popisani biljni materijal, uključujući samonikle biljke domaćine iz porodice Solanaceae te u površinskim vodama koje se koriste za navodnjavanje ili prskanje popisanog biljnog materijala i otpadnim vodama koje se ispuštaju iz pogona za industrijsku preradu ili pakiranje u kojima se obrađuje popisani biljni materijal, a koje se potom koriste za navodnjavanje ili prskanje popisanog biljnog materijala. Opseg tih ciljanih istraživanja utvrđuje se sukladno utvrđenom riziku. Države članice smiju također provoditi sustavna službena istraživanja za otkrivanje organizma na materijalu poput supstrata za uzgoj, zemlji i krutom otpadu iz pogona za industrijsku preradu ili pakiranje.
   2.   Službena istraživanja koja su predviđena stavkom 1. provode se:

               (a)

               za popisani biljni materijal u skladu s pojedinostima iz Priloga I. odjeljka II. točke 1.; i,

               (b)

               za biljke domaćine koje ne spadaju u popisani biljni materijal i za vodu, uključujući otpadne vode, u skladu s odgovarajućim metodama, a prema potrebi se uzimaju uzorci na kojima se provodi službeno laboratorijsko ispitivanje ili laboratorijsko ispitivanje pod službenim nadzorom;

               (c)

               prema potrebi, za ostali materijal u skladu s odgovarajućim metodama.

         Dodatne pojedinosti o postupcima inspekcijskih pregleda te o broju, podrijetlu, razvrstavanju i vremenu uzorkovanja za ta istraživanja utvrđuju nadležna službena tijela u skladu s Direktivom 77/93/EEZ, i to na temelju pouzdanih znanstvenih i statističkih načela i biologije organizma te uzimajući u obzir posebnosti sustava proizvodnje popisanog biljnog materijala i, prema potrebi, drugih biljaka domaćina organizma u odnosnoj državi članici.
   3.   O pojedinostima i rezultatima službenih istraživanja koja su predviđena stavkom 1. svake je godine potrebno obavijestiti ostale države članice i Komisiju u skladu s odredbama Priloga I. odjeljka II. točke 2. Te se obavijesti dostavljaju do 1. lipnja, osim za krumpir upotrijebljen za sjeme na vlastitim poljoprivrednim gospodarstvima, za koji se obavijesti dostavljaju do 1. rujna. Pojedinosti i rezultati za usjeve odnose se na proizvodnju iz prethodne godine. Pojedinosti tih obavijesti smiju se podnijeti Odboru.
   4.   Sljedeća se odredba donosi u skladu s postupkom iz članka 16.a Direktive 77/93/EEZ:

               —

               odgovarajuće metode istraživanja i laboratorijskog ispitivanja predviđene u stavku 2. prvom podstavku točki (b).

         5.   Sljedeće je odredbe moguće donijeti u skladu s postupkom iz članka 16.a Direktive 77/93/EEZ:

               —

               odgovarajuće metode istraživanja iz stavka 2. podstavka prvog točke (c),

               —

               dodatne pojedinosti o istraživanjima iz stavka 2. podstavka drugog s ciljem osiguranja usporedive razine pouzdanosti između država članica.

         Članak 3.
   Države su članice dužne osigurati da se slučajevi sumnje na pojavu ili potvrđene pojave organizma u njezinom državnom području prijave vlastitim nadležnim službenim tijelima.
   Članak 4.
   1.   U svakom slučaju sumnje na zarazu nadležna službena tijela odnosne ili odnosnih država članica moraju osigurati izvršenje službenog laboratorijskog ispitivanja ili laboratorijskog ispitivanja pod službenim nadzorom za popisani biljni materijal uporabom odgovarajuće metode iz Priloga II. i u skladu s uvjetima iz Priloga III. točke 1. ili, u svim ostalim slučajevima, bilo koje druge službeno odobrene metode, a s ciljem potvrđivanja ili pobijanja sumnje na pojavu organizma. U slučaju potvrde sumnje primjenjuju se zahtjevi iz Priloga III. točke 2.
   2.   Do potvrde ili pobijanja sumnje na pojavu organizma iz stavka 1. u svim slučajevima sumnje na pojavu organizma u kojima:

               i.

               su zabilježeni simptomi bolesti koju uzrokuje organizam, a brzim testom(-ovima) probira iz Priloga II. odjeljka I. točke 1. i odjeljka II. dobiven je pozitivan rezultat; ili

               ii.

               je brzim testom(-ovima) probira iz Priloga II. odjeljka I. točke 2. i odjeljka III. dobiven pozitivan rezultat,

         nadležna službena tijela država članica dužna su za vlastitu proizvodnju:

               (a)

               zabraniti kretanje bilja i gomolja iz svih nasada, partija ili pošiljki iz kojih su uzeti uzorci, osim pod njihovim nadzorom i pod uvjetom da je dokazano da ne postoji prepoznatljivi rizik od širenja organizma;

               (b)

               poduzeti mjere za utvrđivanje izvora sumnje na zarazu;

               (c)

               uvesti primjerene dodatne sigurnosne mjere na temelju razine procijenjenog rizika, a posebno u vezi s proizvodnjom popisanog biljnog materijala i prijevozom partija sjemenskog krumpira, osim onih navedenih u točki (a), proizvedenog na mjestu proizvodnje na kojemu su prikupljeni uzorci iz točke (a), a s ciljem sprečavanja širenja organizma.

         3.   U slučajevima sumnje na zarazu u kojima postoji rizik od kontaminacije popisanog biljnog materijala ili površinskih voda iz drugih država članica ili u druge države članice, država članica u kojoj je prijavljena sumnja na zarazu dužna je u skladu s utvrđenim rizikom i bez odlaganja obavijestiti ostale uključene države članice o pojedinostima te sumnje na zarazu, a odnosne su države članice dužne uspostaviti primjerenu međusobnu suradnju. Države članice obaviještene na taj način dužne su poduzeti sigurnosne mjere u skladu sa stavkom 2. točkom (c) i, prema potrebi, dodatne mjere u skladu sa stavcima 1. i 2.
   4.   Sljedeću je odredbu moguće donijeti u skladu s postupkom iz članka 16.a Direktive 77/93/EEZ:

               —

               mjere navedene u stavku 2. točki (c).

         Članak 5.
   1.   Ako službeno laboratorijsko ispitivanje ili laboratorijsko ispitivanje pod službenim nadzorom, koristeći odgovarajaću metodu za popisani biljni materijal u Prilogu II. ili, u svim ostalim slučajevima, bilo koju drugu službeno odobrenu metodu, potvrdi prisutnost organizma u uzorku uzetom u skladu s ovom Direktivom, nadležna službena tijela države članice, uzimajući u obzir pouzdana znanstvena načela, biologiju organizma i posebnosti sustava proizvodnje, trgovine i prerade bilja domaćina tog organizma u odnosnoj državi članici, dužna su:

               (a)

               za popisani biljni materijal;

                           i.

                           provesti istraživanje radi utvrđivanja opsega i primarnog(-ih) izvora zaraze u skladu s odredbama Priloga IV., uz dodatno ispitivanje u skladu s člankom 4. stavkom 1. barem na svim klonski srodnim zalihama sjemenskog krumpira, i

                           ii.

                           označati kao zaražen navedeni biljni materijal, pošiljku i/ili partiju iz koje je uzet uzorak, kao i strojeve, vozila, posude, skladišta ili njihove dijelove te sve ostale predmete, uključujući materijal za pakiranje, koji su bili u doticaju s popisanim biljnim materijalom iz kojeg je uzet uzorak; također se, prema potrebi, označavaju kao zaražena polja, jedinice za proizvodnju zaštićenih nasada i mjesta proizvodnje na kojima je prikupljen popisani biljni materijal iz kojeg je uzet uzorak; za uzorke uzete tijekom sezone rasta označavaju se kao zaražena polja, mjesta proizvodnje i, prema potrebi, jedinice za proizvodnju zaštićenih nasada iz kojih je uzet uzorak, i

                           iii.

                           u skladu s odredbama Priloga V. točke 1. utvrditi opseg vjerojatne zaraze putem doticaja prije ili nakon prikupljanja ljetine, tijekom proizvodnje, navodnjavanja ili prskanja, ili putem klonske srodnosti s utvrđenom zarazom, i

                           iv.

                           odrediti sigurnosno područje na temelju oznake zaraze iz točke ii., utvrditi opseg vjerojatne zaraze iz točke iii. i moguće širenje organizma u skladu s odredbama iz Priloga V. točke 2. podtočke i.;

               (b)

               za usjeve biljaka domaćina koji nisu navedeni u točki (a) ako se proizvodnja popisanog biljnog materijala smatra rizičnom,

                           i.

                           provoditi istraživanja u skladu s točkom (a) podtočkom i.; i

                           ii.

                           označiti kao zaražene biljke domaćine organizma iz kojih je uzet uzorak; i

                           iii.

                           utvrditi vjerojatnost zaraze i odrediti sigurnosno područje vezano uz proizvodnju popisanog biljnog materijala u skladu s točkom (a) podtočkama iii. i iv.;

               (c)

               za površinske vode (uključujući otpadne vode iz pogona za industrijsku preradu ili pakiranje u kojima se obrađuje popisani biljni materijal) i s njima povezane samonikle biljke iz porodice Solanaceae ako se proizvodnja popisanog biljnog materijala smatra rizičnom uslijed navodnjavanja, prskanja ili poplava uzrokovanih površinskim vodama,

                           i.

                           provesti istraživanje, uključujući službeno istraživanje u odgovarajućem vremenskom razdoblju na uzorcima površinskih voda i, ako su prisutne, samoniklih biljaka domaćina iz porodice Solanaceae radi utvrđivanja opsega zaraze; i

                           ii.

                           označiti kao zaražene površinske vode iz kojih su uzeti uzorci, i to u odgovarajućem opsegu i na temelju istraživanja iz točke i.; i

                           iii.

                           utvrditi vjerojatnost zaraze i odrediti sigurnosno područje na temelju oznake zaraze iz točke ii. te mogućeg širenja organizma uzimajući u obzir odredbe Priloga V. točke 1. i točke 2. podtočke ii.

         2.   U skladu s odredbama Priloga V. točke 3. države su članice dužne odmah obavijestiti ostale države članice i Komisiju o svakoj zarazi utvrđenoj sukladno stavku 1. točki (a) podtočki ii. i stavku 1. točki (c) podtočki ii. te o pojedinostima ograničavanja sigurnosnog područja sukladno stavku 1. točki (a) podtočki iv. i, prema potrebi, stavku 1. točki (c) podtočki iii. Pojedinosti obavijesti iz ovog stavka mogu se dostaviti Odboru.
   Države su članice dužne istodobno dostaviti Komisiji dodatnu obavijest iz Priloga V. točke 4. Pojedinosti obavijesti iz ovog stavka odmah se dostavljaju članovima Odbora.
   3.   Na temelju obavijesti iz stavka 2. i u njoj navedenih elemenata, ostale države članice koje su navedene u obavijesti provode istraživanje u skladu sa stavkom 1. točkom (a) podtočkom i. i, ovisno o slučaju, stavkom 1. točkom (c) podtočkom i. te, prema potrebi, poduzimaju daljnje radnje u skladu sa stavcima 1. i 2.
   Članak 6.
   1.   Države su članice dužne propisati da se popisani biljni materijal označen kao zaražen u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom ii. ne smije saditi i da se pod nadzorom i uz odobrenje njihovih nadležnih službenih tijela na njega primijeni jedna od odredaba iz Priloga VI. točke 1. kako bi se utvrdilo da ne postoji prepoznatljivi rizik od širenja organizma.
   2.   Države su članice dužne propisati da se popisani biljni materijal označen kao vjerojatno zaražen u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom iii. i točkom (c) podtočkom iii., uključujući popisani biljni materijal za koji je utvrđen rizik i koji je proizveden na mjestima proizvodnje za koja je utvrđena vjerojatna zaraza u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom iii., ne smije saditi i da se pod nadzorom njihovih nadležnih službenih tijela na primjeren način iskoristi ili zbrine, kako je utvrđeno u Prilogu VI. točki 2., kako bi se utvrdilo da ne postoji prepoznatljivi rizik od širenja organizma.
   3.   Države su članice dužne propisati da se svi strojevi, vozila, posude, skladišta ili njihovi dijelovi te svi ostali predmeti, uključujući materijal za pakiranje, koji su označeni kao zaraženi u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom ii. ili kao vjerojatno zaraženi u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom iii. i točkom (c) podtočkom iii., unište ili raskuže primjenom odgovarajućih metoda iz Priloga VI. točke 3. Nakon raskuživanja ni jedan se od tih predmeta više ne smatra zaraženim.
   4.   Ne dovodeći u pitanje mjere koje se provode u skladu sa stavcima 1., 2. i 3., države su članice dužne propisati da se u sigurnosnom području ograničenom sukladno članku 5. stavku 1. točki (a) podtočki iv. i točki (c) podtočki iii. provodi niz mjera iz Priloga VI. stavaka 4.1. i 4.2. Pojedinosti tih mjera svake se godine službeno priopćavaju drugim državama članicama i Komisiji. Pojedinosti tih obavijesti mogu se dostaviti Odboru.
   Članak 7.
   1.   Države su članice dužne propisati da sjemenski krumpir mora ispuniti zahtjeve Direktive 77/93/EEZ i potjecati izravno od krumpira koji je proizveden u okviru službeno odobrenog programa te za koji je službenim testiranjem ili testiranjem pod službenim nadzorom utvrđeno da nije zaražen organizmom uporabom odgovarajuće metode iz Priloga II.
   Država članica provodi gore navedeno testiranje:

               (a)

               u slučajevima potvrđenog(-ih) otkrića organizma u vlastitoj proizvodnji sjemenskog krumpira,

                           i.

                           testiranjem prethodnih generacija, uključujući početni stupanj klonske selekcije i sustavno testiranje klonova osnovnog sjemenskog krumpira; ili

                           ii.

                           u slučajevima u kojima je utvrđeno da nema klonske srodnosti, testiranjem svih klonova osnovnog sjemenskog krumpira ili prethodnih generacija, uključujući početni stupanj klonske selekcije, i

               (b)

               u ostalim slučajevima, na svakoj biljci početne klonske selekcije ili na reprezentativnim uzorcima osnovnog sjemenskog krumpira ili prethodnih generacija.

         2.   Sljedeće je odredbe moguće donijeti u skladu s postupkom iz članka 16.a Direktive 77/93/EEZ:

               —

               detaljna pravila za primjenu stavka 1. podstavka drugog točke (a),

               —

               pravila koja se odnose na reprezentativne uzorke predviđena u stavku 1. podstavka drugog točke (b).

         Članak 8.
   Države su članice dužne zabraniti čuvanje i raspolaganje organizmom.
   Članak 9.
   Ne dovodeći u pitanje odredbe Direktive 77/93/EEZ, države članice smiju odobriti odstupanja od mjera iz članaka 6. i 8. ove Direktive u skladu s odredbama navedenim u Direktivi 95/44/EZ (5) u eksperimentalne ili znanstvene svrhe te za rad u području selekcije sorti.
   Članak 10.
   U odnosu na vlastitu proizvodnju države članice smiju donijeti dodatne ili strože mjere potrebne za suzbijanje organizma ili za sprečavanje njegova širenja ako je to u skladu s odredbama Direktive 77/93/EEZ.
   Pojedinosti takvih mjera službeno se priopćavaju drugim državama članicama i Komisiji. Pojedinosti tih obavijesti mogu se dostaviti Odboru.
   Članak 11.
   Izmjene Priloga ovoj Direktivi, koje je potrebno izvršiti imajući u vidu razvoj znanstvenih ili tehničkih spoznaja, donose se u skladu s postupkom iz članka 16.a Direktive 77/93/EEZ. U pogledu metoda iz Priloga II. i mjera iz stavaka 4.1. i 4.2. Priloga VI. ove Direktive, Komisija je dužna pripremiti izvješće kojim se te metode i mjere pregledavaju s obzirom na stečeno iskustvo i dostaviti ga Odboru do 1. siječnja 2002.
   Članak 12.
   1.   Države članice donose zakone i druge propise potrebne za usklađivanje s ovom Direktivom s učinkom od 21. kolovoza 1999. One o tome odmah obavješćuju Komisiju.
   Kada države članice donesu ove mjere, te mjere prilikom njihove službene objave sadržavaju uputu na ovu Direktivu ili se uz njih navodi takva uputa. Načine tog upućivanja određuju države članice.
   2.   Države članice Komisiji odmah dostavljaju tekst glavnih odredaba nacionalnog prava koji donesu u području na koje se odnosi ova Direktiva. Komisija o tome obavješćuje druge države članice.
   Članak 13.
   Ova Direktiva stupa na snagu na dan objave u Službenom listu Europskih zajednica.
   Članak 14.
   Ova je Direktiva upućena državama članicama.

      Sastavljeno u Bruxellesu 20. srpnja 1998.

            Za Vijeće

            Predsjednik

         W. MOLTERER

      (1)  SL C 124, 21.4.1997., str. 12. i

      SL C 108, 7.4.1998., str. 85.

      (2)  SL C 14, 19.1.1998., str. 34.

      (3)  SL C 206, 7.7.1997., str. 57.

      (4)  SL L 26, 31.1.1977., str. 20. Direktiva kako je zadnje izmijenjena Direktivom Komisije 98/2/EZ (SL L 15, 21.1.1998., str. 34.).

      (5)  SL L 184, 3.8.1995., str. 34. Direktiva kako je zadnje izmijenjena Direktivom Komisije 97/46/EZ (SL L 204, 31.7.1997., str. 43.).
   PRILOG I.
   ODJELJAK I.

      Popis biljaka domaćina bakterije
      Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.
      iz članka 1.

               Biljke (uključujući gomolje), osim sjemena u botaničkom smislu, vrste Solanum tuberosum L.

               Krumpir

               Biljke, osim plodova i sjemena, vrste Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex Farw.

               Rajčica

         ODJELJAK II.

      Istraživanja

   1.   Službena istraživanja iz članka 2. stavka 2. točke (a) temelje se na biologiji organizma i posebnostima proizvodnih sustava u odnosnoj državi članici, a obuhvaćaju:

               i.

               u slučaju krumpira,

                           —

                           u odgovarajućem vremenskom razdoblju, vizualni pregled nasada u fazi rasta i/ili uzorkovanje sjemenskog i drugog krumpira u sezoni rasta ili u skladištu. Na tim se uzorcima vrši službeni vizualni pregled ili vizualni pregled pod službenim nadzorom rezanjem gomolja, i

                           —

                           u slučaju sjemenskog krumpira i prema potrebi drugog krumpira, službeno laboratorijsko ispitivanje ili laboratorijsko ispitivanje pod službenim nadzorom primjenom metode iz Priloga II.,

               ii.

               u slučaju rajčica,

                           —

                           u odgovarajućem vremenskom razdoblju, barem vizualni pregled presadnica u fazi rasta za proizvodnju namijenjenu tržištu.

         2.   Obavijest o službenim istraživanjima iz članka 2. stavka 3. obuhvaća:

               i.

               za istraživanja na krumpiru,

                           —

                           procjenu ukupne površine zasađene sjemenskim i drugim krumpirom u hektarima,

                           —

                           razvrstavanje po kategorijama sjemenskog i merkantilnog krumpira i, prema potrebi, po regijama,

                           —

                           broj uzoraka za testiranje i vrijeme uzorkovanja,

                           —

                           broj vizualnih pregleda na terenu,

                           —

                           broj vizualnih pregleda gomolja (i veličina uzorka);

               ii.

               za istraživanja na presadnicama rajčice barem u fazi rasta za proizvodnju namijenjenu tržištu,

                           —

                           procjenu ukupnog broja biljaka,

                           —

                           broj vizualnih pregleda;

               iii.

               za istraživanja biljaka domaćina, osim krumpira i rajčice, uključujući samonikle biljke domaćine iz porodice Solanaceae,

                           —

                           vrstu,

                           —

                           broj uzoraka i vrijeme uzorkovanja,

                           —

                           područje/rijeku iz kojih su uzeti uzorci, ovisno o slučaju,

                           —

                           analitičku metodu;

               iv.

               za istraživanja voda i otpadnih voda iz pogona za industrijsku preradu ili pakiranje,

                           —

                           broj uzoraka i vrijeme uzorkovanja,

                           —

                           područje/rijeku/lokaciju pogona iz kojih su uzeti uzorci, ovisno o slučaju,

                           —

                           analitičku metodu.

         PRILOG II.
   PLAN TESTIRANJA ZA DIJAGNOSTICIRANJE, OTKRIVANJE I IDENTIFIKACIJU BAKTERIJE RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

   PODRUČJE PRIMJENE PLANA TESTIRANJA
   Ovim se planom testiranja opisuju različiti postupci koji se koriste za:

               i.

               dijagnosticiranje smeđe truleži na gomoljima krumpira i bakterijskog venuća biljaka krumpira i rajčice;

               ii.

               otkrivanje bakterije Ralstonia solanacearum u uzorcima gomolja krumpira;

               iii.

               identifikaciju bakterije Ralstonia solanacearum.

         U dodacima su navedene pojedinosti za pripremanje materijala za testiranje, odnosno hranjivih podloga, pufera, otopina, reagensa.
   SADRŽAJ:

               ODJELJAK I.:

                  Primjena plana testiranja …

               92

               1. Dijagnosticiranje smeđe truleži na gomoljima krumpira i bakterijskog venuća biljaka krumpira i rajčice …

               92

               2. Otkrivanje i identifikacija bakterije Ralstonia solanacearum u uzorcima gomolja krumpira …

               94

               ODJELJAK II.:

                  Dijagnosticiranje smeđe truleži na gomoljima krumpira i bakterijskog venuća biljaka krumpira i rajčice …

               96

               1. Simptomi …

               96

               2. Brzi test(ovi) probira …

               96

               3. Postupak izolacije …

               97

               4. Potvrdni test(ovi) …

               97

               ODJELJAK III.:

                  Otkrivanje i identifikacija bakterije Ralstonia solanacearum u uzorcima gomolja krumpira …

               100

               1. Pripremanje uzorka za testiranje …

               100

               2. Test imunofluorescencije (IF) …

               101

               3. Imunoenzimski test (ELISA) …

               103

               4. Test lančane reakcije polimerazom (PCRTM) …

               103

               5. Test razmaza na selektivnoj hranjivoj podlozi …

               105

               6. Biološki test …

               106

               7. Testovi obogaćivanja …

               106

               8. Testovi patogenosti …

               106

                  Dodatak 1.:

               Hranjive podloge za izolaciju i uzgoj bakterije Ralstonia solanacearum …

               107

                  Dodatak 2.:

               Materijali za pripremanje uzorka …

               108

                  Dodatak 3.:

               Materijali za test imunofluorescencije …

               109

                  Dodatak 4.:

               Utvrđivanje stupnja zaraženosti u testu imunofluorescencije …

               110

                  Dodatak 5.:

               Materijali za test ELISA …

               111

                  Dodatak 6.:

               Materijali za test PCR …

               112

                  Dodatak 7.:

               Materijal za testiranje s razmazom na selektivnoj hranjivoj podlozi i za test(-ove) obogaćivanja …

               112

               Reference …

               113

         ODJELJAK I.

      PRIMJENA PLANA TESTIRANJA

   1.   Dijagnosticiranje smeđe truleži na gomoljima krumpira i bakterijskog venuća biljaka krumpira i rajčice

   Postupak testiranja namijenjen je za gomolje krumpira sa simptomima koji su tipični ili koji upućuju na smeđu trulež te za biljke krumpira i rajčice sa simptomima koji su tipični ili koji upućuju na bakterijsko venuće. Postupak uključuje brzi test probira, izolaciju patogenog organizma iz zaraženog žilnog tkiva na diagnostičkoj podlozi i, u slučaju pozitivnog rezultata, identifikaciju kulture kao bakterije Ralstonia solanacearum.

      Dijagram toka

      Napomene uz dijagram toka:

               (1)

               Opis simptoma naveden je u odjeljku II.1.

               (2)

               Brzi testovi probira olakšavaju vjerojatnu dijagnozu.
               Primjereni testovi su:

                           —

                           test eksudacije na žilnom tkivu stabljike (odjeljak II.2.),

                           —

                           test za zrnca poli-β-hidroksibutirata (odjeljak II.2.),

                           —

                           test imunofluorescencije (odjeljak III.2.),

                           —

                           test ELISA (odjeljak III.3.),

                           —

                           test PCR (odjeljak III.4.).

               (3)

               Iako je izolacija patogenog organizma iz biljnog materijala s tipičnim simptomima razrjeđivanjem i razmazivanjem kulture jednostavan postupak, postupak kultivacije u uznapredovalim stadijima zaraze može pretrpjeti neuspjeh. Saprofitske bakterije, koje rastu na oboljelom tkivu, mogu brojčano prerasti ili inhibirati patogen na podlozi za izolaciju. Ako je test izolacije negativan, a simptomi bolesti tipični, potrebno je ponoviti postupak izolacije, po mogućnosti testom razmaza na selektivnoj hranjivoj podlozi.

               (4)

               Pouzdana identifikacija čiste kulture bakterije Ralstonia solanacearum dobiva se barem jednim od testova navedenih u odjeljku II.4.1. u kombinaciji s testom patogenosti (odjeljak II.4.3.). Karakterizacija soja je neobvezna, ali se preporučuje za svaki novi slučaj.

         2.   Otkrivanje i identifikacija bakterije Ralstonia solanacearum u uzorcima gomolja krumpira

   Postupak se koristi za otkrivanje latentne zaraze u gomoljima krumpira uporabom jednog ili, po mogućnosti, više testova probira, koji se u slučaju pozitivnog rezultata dopunjuju izolacijom patogena; nakon toga, u slučaju izolacije tipičnih kolonija, slijedi identifikacija čiste kulture kao bakterije Ralstonia solanacearum.

      Dijagram toka

      Napomene uz dijagram toka:

               (1)

               Veličina uzorka
               Standardna veličina jest 200 gomolja. Međutim, postupak se može primijeniti na odgovarajući način i na uzorcima manjim od 200 gomolja.

               (2)

               Test(ovi) probira
               Samo jedan test ne mora nužno biti dovoljno osjetljiv ili pouzdan za otkrivanje bakterije Ralstonia solanacearum u uzorku. Zbog toga se preporučuje obaviti više testova te bi se ti testovi po mogućnosti trebali temeljiti na različitim biološkim načelima.

               (3)

               Test imunofluorescencije (IF)
               Test imunofluorescencije je općeprihvaćeni test probira. To mu daje prednost pred ostalim testovima koji još nisu u potpunosti razvijeni ili potvrđeni. Koristi se za brojne druge karantenske bakterije, npr. Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Uzimajući u obzir parametre za očitavanje navedene u ovoj metodi, radi se o osjetljivom testu (prag osjetljivosti je 10(3-104 stanica na ml peleta krumpirovog ekstrakta).
               Kritični faktor pouzdanosti rezultata testa jest kvaliteta antiseruma. Prihvatljiv je samo antiserum s visokim titrom (barem 2 000 za sirovi antiserum), a sve je testove potrebno vršiti na titru antiseruma ili na jednoj razini razrjeđenja ispod tog titra. Poželjna je neizravna metoda. Moguće je koristiti izravnu metodu ako je razina osjetljivosti i specifičnosti testa jednaka razini neizravne metode.
               Prednost testa imunofluorescencije je subjektivno interpretiranje morfologije bojanja stanica i intenziteta fluorescencije, koji pružaju informacije o specifičnosti reakcije. Česte su unakrsne reakcije sa serološki srodnim bakterijama prisutnim u tlu ili povezanim s tkivima krumpira, a sa staničnom morfologijom bakterije Ralstonia solanacearum. Test imunofluorescencije može se koristiti kao jedini test probira iako je u slučaju sumnje na unakrsne reakcije potrebno izvršiti dodatni test probira koji se temelji na različitom biološkom načelu. U takvim je slučajevima najprikladniji test razmaza na selektivnoj hranjivoj podlozi.

               (4)

               Test razmaza na selektivnoj hranjivoj podlozi
               S modificiranom hranjivom podlogom SMSA i testnim postupkom navedenim u ovoj metodi, ovaj je test osjetljiv i selektivan za otkrivanje bakterije Ralstonia solanacearum. Rezultat je dostupan u roku od 3 – 6 dana od pripremanja uzorka. Patogen se dobiva izravno u kulturi i jednostavno se identificira. Kako bi se potpuno iskoristio potencijal ovog testa, potrebno je pomno pripremiti područje hiluma kako bi se izbjegla pojava sekundarnih bakterija povezanih s gomoljem krumpira, koje se na hranjivoj podlozi natječu s bakterijom Ralstonia solanacearum i mogu utjecati na razvoj patogena. Neki se sojevi slabo razvijaju budući da sastojci hranjive podloge mogu utjecati na ciljni organizam. Također je potrebno razlučiti bakteriju Ralstonia solanacearum od drugih bakterija koje se mogu razviti na hranjivoj podlozi. Test razmaza na selektivnoj hranjivoj podlozi može se koristiti kao jedini test probira pod uvjetom da se u slučaju sumnje da druge bakterije inhibiraju rast bakterije Ralstonia solanacearum na hranjivoj podlozi i negativnog rezultata testa uzorak ponovno testira uporabom drugog testa kako bi se dijagnoza potvrdila ili odbacila. U takvim je slučajevima najprikladniji test imunofluorescencije.

               (5)

               Test ELISA
               Test ELISA općenito je manje osjetljiv od testa imunofluorescencije (prag osjetljivosti je 104-105 stanica na ml peleta krumpirovog ekstrakta). Ovaj je test jeftin i brz, ali uglavnom osjetljiviji na lažne pozitivne rezultate (unakrsne reakcije) i lažne negativne rezultate (inhibicija fenolnim molekulama u ekstraktu krumpira). Zahtjevi za specifičnost antiseruma vrlo su visoki. Test ELISA ne može se koristiti kao jedini test probira.

               (6)

               Test PCR
               Test PCR potencijalno je vrlo osjetljiv iako ga vrlo lako inhibiraju sastojci ekstrakta biljke ili gomolja, što dovodi do lažno negativnih rezultata. Neki kultivari krumpira sadrže više inhibitora od drugih. Zbog toga je te inhibitore potrebno ukloniti. Inhibicija se može smanjiti razrjeđivanjem, no time se razrjeđuju i populacije bakterije Ralstonia solanacearum. Potrebno je vrlo pažljivo provoditi sve faze pripreme uzorka i testa kako bi se spriječila kontaminacija koja može dovesti do lažno pozitivnih rezultata. Lažno pozitivni rezultati mogu nastati i uslijed homologije sekvence drugih organizama. Zbog toga se izravni test PCR ne može koristiti kao jedini test probira.

               (7)

               Test obogaćivanja
               Inkubacija uzoraka peleta krumpirovog ekstrakta u poluselektivnom bujonu, poput modificiranog bujona SMSA, omogućava množenje bakterije Ralstonia solanacearum. Vjerojatno je još važnija činjenica da se na taj način razrjeđuju i mogući inhibitori testa ELISA ili PCR. Bakteriju Ralstonia solanacearum. moguće je otkriti u bujonu za obogaćivanje testovima imunofluorescencije, ELISA i PCR. Ne preporučuje se pripremanje razmaza neposredno iz bujona za obogaćivanje. Ti postupci obogaćivanja nisu još temeljito provjereni i ispitani. Ovdje se navode zbog svog značajnog potencijala. Međutim, upravo zbog nedostatka iskustva u tom pogledu, ti se postupci ne mogu koristiti kao jedina metoda detekcije.

               (8)

               Biološki test
               Biološki se test koristi za izolaciju bakterije Ralstonia solanacearum iz peleta krumpirovog ekstrakta selektivnim obogaćivanjem u biljci domaćinu i može se vršiti na biljkama rajčice ili patlidžana. Test zahtijeva optimalne uvjete inkubacije u skladu sa specifikacijama u okviru ove metode. Bakterije koje inhibiraju razvoj bakterije Ralstonia solanacearum na podlozi SMSA vjerojatno neće ometati izvođenje ovog testa.

               (9)

               Potvrdni test(ovi)
               Pouzdana identifikacija čiste kulture bakterije Ralstonia solanacearum postiže se barem jednim od testova navedenih u odjeljku II.4.1. u kombinaciji s testom patogenosti (odjeljak II.4.3.). Karakterizacija soja je neobvezna, ali se preporučuje za svaki novi slučaj.

         ODJELJAK II.

      Dijagnosticiranje smeđe truleži na gomoljima krumpira i bakterijskog venuća biljaka krumpira i rajčice

   1.   Simptomi

   1.1   Simptomi kod krumpira

      Biljka krumpira. Rana faza zaraze je venuće listova prema vrhu biljke pri visokim dnevnim temperaturama, uz oporavak biljke tijekom noći. Venuće brzo postaje nepovratno i završava odumiranjem biljke. Žilno tkivo poprečno prerezanih stabljika uvenulih biljaka može dobiti smeđu boju, a na površini prereza vidljiv je mliječni iscjedak ili se isti lako može istisnuti. Kada se prerezanu stabljiku postavi okomito u vodu, iz žilnih snopova počinju teći sluzave niti.

      Gomolj krumpira. Gomolje krumpira treba poprečno prerezati u blizini hiluma. Rana faza zaraze je promjena boje žilnog prstena od staklasto žute do svijetlo smeđe, odakle nakon nekoliko minuta spontano počinje izlaziti blijedi kremasti iscjedak ili nakon laganog pritiska palcima na koru u blizini prereza. S vremenom žilno tkivo postaje izrazito smeđe, a nekroza se može proširiti i na parenhimsko tkivo. U uznapredovalim fazama zaraza izbija prema van od hiluma i okaca, pri čemu mogu nastati crvenkasto-smeđa uleknuća na kori, iz kojih može poteći bakterijski iscjedak na koji se lijepe čestice zemlje.
   1.2   Simptomi kod rajčica

      Biljka rajčice. Prvi vidljivi simptom je uvenuli izgled najmlađih listova. U okolišnim uvjetima povoljnima za patogen (temperatura tla od oko 25 °C uz zasićenost vlagom) u roku od nekoliko dana dolazi do epinastije i venuća jedne strane ili čitave biljke, što vodi do njezina potpunog uvenuća. U manje povoljnim uvjetima (temperatura tla niža od 21 °C) na stabljici se može razviti veći broj adventivnih korjena. Duž stabljike je moguće zamijetiti nabrekle pruge, što je dokaz nekroze žilnog sustava. Ako se stabljika poprečno prereže, iz žilnog tkiva stabljike, čija je boja promijenjena u smeđu, počinju izlaziti kapljice bijelog ili žućkastog bakterijskog iscjetka.
   2.   Brzi testovi probira

   Brzi testovi probira olakšavaju vjerojatnu dijagnozu. Koristiti jedan ili više sljedećih testova:

      Test eksudacije na stabljici

   Prisutnost bakterije Ralstonia solanacearum u uvelim stabljikama krumpira ili rajčice moguće je procijeniti putem sljedećeg jednostavnog testa vjerojatnosti:
   Prerezati stabljiku tik iznad površine tla. Staviti prerezanu površinu presjeka u čašu s vodom. Nakon kraćeg vremena iz žilnih snopova spontano će izlaziti sluzave niti bakterijskog iscjetka. Nijedna druga bakterija koja uzrokuje zarazu žilnog tkiva biljaka krumpira ili rajčice ne dovodi do te pojave.

      Otkrivanje zrnaca poli-β-hidroksibutirata (PHB)

   Zrnca PHB u stanicama bakterije Ralstonia solanacearum postaju vidljiva nakon bojanja bojilom Nile Blue A ili Sudan black B.
   Pripremiti razmaz iscjetka ili suspendiranog tkiva na mikroskopskom staklu ili razmaz 48-satne kulture na YPGA ili SPA (Dodatak 1.). Pripremiti razmaze soja biovar 2/biotip 3 za pozitivnu kontrolu i, prema potrebi, razmaz heterolognog soja za negativnu kontrolu. Ostaviti razmaze da se osuše. Brzo provući donju površinu stakla nekoliko puta iznad plamena kako bi se razmaz fiksirao.

      Test s bojilom Nile blue

               (1)

               Fiksirani razmaz preliti 1-postotnom vodenom otopinom bojila Nile blue A.
               Inkubirati 10 minuta na temperaturi od 55 °C.

               (2)

               Ocijediti otopinu za bojenje. Kratko isprati pod laganim mlazom tekuće vode. Ukloniti višak vode upijajućim papirom.

               (3)

               Preliti 8-postotnu vodenu otopinu octene kiseline preko razmaza.
               Inkubirati 1 minutu na sobnoj temperaturi.

               (4)

               Isprati pod laganim mlazom tekuće vode. Osušiti upijajućim papirom.

               (5)

               Ponovno navlažiti kapljicom vode. Prekriti zaštitnim staklom.

               (6)

               Analizirati obojeni razmaz pomoću epifluorescentnog mikroskopa na 450 nm u imerzijskom ulju uz povećanje od 1 000.
               Potrebno je obratiti pozornost na svijetlo narančasta fluorescentna zrnca PHB-a. Također promotriti na dnevnom svjetlu kako bi se osiguralo da se zrnca nalaze u stanicama te da je morfologija stanica tipična za bakteriju Ralstonia solanacearum.

      Test s bojilom Sudan black

               (1)

               Fiksirani razmaz preliti 0,3-postotnom otopinom bojila Sudan black B u 70-postotnom etanolu. Inkubirati 10 minuta na sobnoj temperaturi.

               (2)

               Ocijediti otopinu za bojenje. Kratko isprati u tekućoj vodi. Ukloniti višak vode upijajućim papirom.

               (3)

               Kratko potopiti razmaz u ksilolu. Osušiti upijajućim papirom.
               Oprez! Ksilol je škodljiv proizvod. Raditi u digestoru.

               (4)

               Razmaz preliti 0,5-postotnom (m/v) vodenom otopinom safranina i ostavi 10 sekundi na sobnoj temperaturi.
               Oprez! Safranin je škodljiv proizvod. Raditi u digestoru.

               (5)

               Isprati pod laganim mlazom tekuće vode. Osušiti upijajućim papirom. Prekriti zaštitnim staklom.

               (6)

               Analizirati obojeni razmaz pomoću optičkog mikroskopa koristeći s prenesenim svjetlom u imerzijskom ulju i uz povećanje od 1 000.
               Zrnca PHB-a u stanicama bakterije Ralstonia solanacearum obojene su modro-crno. Stanične stijenke obojene su ružičasto.

      Ostali testovi

   Ostali prikladni testovi probira su test imunofluorescencije (odjeljak III.2), test ELISA (odjeljak III.3) i test PCR (odjeljak III.4).
   3.   Postupak izolacije

   3.1.   Ukloniti iscjedak ili dijelove tkiva promijenjene boje iz žilnog prstena u gomolju krumpira ili iz žilnog snopa u stabljici biljke krumpira ili rajčice. Suspendirati u manjoj količini sterilne destilirane vode ili u 50 mM fosfatnog pufera. Ostaviti 5 – 10 minuta.
   3.2.   Pripremiti niz decimalnih razrjeđenja suspenzije, npr. 1/10 i 1/100 ili više, ovisno o potrebi.
   3.3.   Prenijeti standardnu količinu suspenzije i razrjeđenja na univerzalnu hranjivu podlogu (NA, YPGA i SPA, Dodatak 1.) i/ili na Kelmanovu tetrazolij-podlogu (Dodatak 1.) i/ili selektivnu hranjivu podlogu SMSA (Dodatak 7.). Razmazati ili iscrtati odgovarajućom tehnikom nanošenja razrjeđenja na podlogu. Ovisno o potrebi, pripremiti posebne pločice za svaku upotrijebljenu hranjivu podlogu s razrijeđenom staničnom suspenzijom kulture virulentnog soja bakterije Ralstonia solanacearum biovar 2/biotip 3 za pozitivnu kontrolu.
   3.4.   Inkubirati podloge tri dana na temperaturi od 28 °C. Ako je rast usporen, inkubacija može trajati i do šest dana, no kolonije na pločicama SMSA često postaju atipične i odumiru.
   Na univerzalnoj hranjivoj podlozi virulentni izolati bakterije Ralstonia solanacearum stvaraju plosnate i nepravilne tekuće kolonije biserno bijele boje, često s karakterističnim spiralama u sredini.
   Na Kelmanovoj tetrazolij-podlozi tipične kolonije virulentnih izolata bakterije Ralstonia solanacearum kremaste su boje te plosnate, nepravilne i tekuće s krvavo crvenim spiralama u sredini. Nevirulentni oblici bakterije Ralstonia solanacearum stvaraju maslaste tamnocrvene kolonije.
   Na podlozi SMSA tipične kolonije virulentnih izolata bakterije Ralstonia solanacearum mliječno su bijele boje, plosnate, nepravilne i tekuće, a s krvavo crvenim obojenjem u sredini.
   Nevirulentni oblici bakterije Ralstonia solanacearum stvaraju manje tekuće kolonije, koje na podlozi SMSA poprimaju boju u rasponu od potpuno ružičaste do crvene.
   3.5.   Pročistiti kolonije s tipičnom morfologijom precjepljivanjem na univerzalnoj hranjivoj podlozi. Potrebno je izbjegavati redovito precjepljivanje budući da može dovesti do gubitka virulentnosti.
   4.   Potvrdni test(ovi)

   4.1.   Identifikacija bakterije Ralstonia solanacearum

   Čiste kulture bakterije Ralstonia solanacearum identificiraju se putem barem jednog od sljedećih postupaka:

      Hranidbeni i enzimatski testovi

      Napomena: U svaki je korišteni test potrebno uključiti odgovarajuće kontrolne sojeve.
   Sustavno su prisutne ili odsutne sljedeće fenotipske osobine bakterije Ralstonia solanacearum:

               Fluorescentni pigment

               –

               Inkluzije PHB-a

               +

               Oksidacijski/fermentacijski (O/F) test

               O+/F–

               Katalaza

               +

               Test oksidacije prema Kovacu

               +

               Redukcija nitrata

               +

               Iskorištenje citrata

               +

               Rast na 40 °C

               –

               Rast u 1-postotnoj otopini NaCl

               +

               Rast u 2-postotnoj otopini NaCl

               –

               Arginin dihidrolaza

               –

               Pretvaranje želatine u tekućinu

               –

               Hidroliza škroba

               –

               Hidroliza ezulina

               –

               Stvaranje levana

               –

         Podloge i metode navedene su u Lelliott & Stead (1987.).

      Test imunofluorescencije

   Pripremiti suspenziju od 106 stanica po ml iz kulture i kontrolnog(-ih) soja(-eva). Pripremiti niz dvostrukih razrjeđenja antiseruma. Provesti test imunofluorescencije (odjeljak III.2.). IF titar kulture mora biti jednak titru pozitivne kontrole.

      Test ELISA

   Pripremiti suspenziju od > 106 stanica po ml iz kulture i kontrolnog(-ih) soja(-eva). Provesti test ELISA (odjeljak III.3.). Vrijednost kulture ELISA mora biti jednaka vrijednosti pozitivne kontrole.

      Test PCR

   Pripremiti suspenziju od 106 stanica po ml iz kulture i kontrolnog(-ih) soja(-eva). Provesti test PCR (odjeljak III.4.). Produkt kulture PCR mora biti jednake veličine i imati isti uzorak analize restrikcijskog enzima (REA) kao produkt pozitivne kontrole.

      Fluorescentna hibridizacija in-situ (FISH)

   Pripremiti suspenziju od 106 stanica po ml iz kulture i kontrolnog(-ih) soja(-eva). Provesti test FISH (van Beuningen et al, 1995) s početnicom OLI-1 PCR (Seal et al, 1993.). Kultura mora reagirati jednako kao pozitivna kontrola.

      Profiliranje bjelančevina

   Denaturirane bjelančevine cijelih stanica razdvajaju se postupkom elektroforeze u poliakrilamidnom gelu – PAGE (Stead, 1992a.).

      Profiliranje masnih kiselina (FAP)

   Uzgajati kulturu i soj za pozitivnu kontrolu 48 sati na temperaturi od 28 °C u triptikaza-soja-agaru i provesti postupak FAP (Janse, 1991.; Stead, 1992a; Stead, 1992b). Profil kulture mora biti jednak profilu pozitivne kontrole. U navedenim uvjetima karakteristične masne kiseline su 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH i 18:1 2OH.
   4.2.   Karakterizacija soja

   Karakterizacija soja nije obvezna, ali se preporuča za svaki novi slučaj primjenom barem jednog od sljedećih postupaka:

      Određivanje biovara

      Ralstonia solanacearum dijeli se na biovare na temelju sposobnosti stvaranja kiseline iz tri heksozna alkohola i tri šećera (Hayward, 1964 & 1994):

               Biovar

               1

               2

               3

               4

               5

               Iskorištenje:

                           —

                           maltoze

               –

               +

               +

               –

               +

                           —

                           laktoze

               –

               +

               +

               –

               +

                           —

                           celobioze

               –

               +

               +

               –

               +

                           —

                           manitola

               –

               –

               +

               +

               +

                           —

                           sorbitola

               –

               –

               +

               +

               –

                           —

                           dulcitola

               –

               –

               +

               +

               –

   Dodatnim se testovima biovar 2 dijeli na podfenotipove (Hayward, 1994.):

               biovar 2

               biovar 2-A

               biovar 2- T

               iskorištenje trehaloze

               –

               +

               +

               iskorištenje inozitola

               +

               –

               +

               iskorištenje D-riboze

               –

               –

               +

               pektolitička aktivnost

               niska

               niska

               visoka

      Određivanje biotipa

   Biotip (Buddenhagen et al., 1962.) se može utvrditi na temelju testa patogenosti kod biljaka rajčice ili patlidžana i kod biljaka duhana te pomoću testa hipersenzitivne reakcije (HR) na listovima duhana (Lozano i Sequeira, 1970.):

               Biotip (1)

               1

               2

               3

               Reakcija kod:

                           —

                           biljaka rajčice/patlidžana

               venuće

               nema reakcije

               venuće

                           —

                           biljaka duhana

               venuće

               nema reakcije

               nema reakcije

                           —

                           listova duhana

               nekroza (48 sati) i venuće (7 – 8 dana)

               HR (12 – 24 sati)

               kloroza (2 – 8 dana)

         Određivanje biotipa testom patogenosti ili testom hipersenzitivnosti na duhanu nije nužno visokopouzdano te se umjesto toga biotip može odrediti na temelju biovara i prirodnog domaćina izvora.
   Kultura se može dodatno karakterizirati sljedećim postupcima:

                  Određivanjem genomskog otiska

         Molekularna diferencijacija sojeva u kompleksu bakterije Ralstonia solanacearum može se postići:

               RFLP analizom (Cook et al, 1989.)

               Ponavljajućim slijedom PCR [REP-, ERIC- & BOX-PCR (Louws et al, 1995; Smith et al, 1995.)]

         4.3   Test patogenosti

   Ovim se testom potvrđuje dijagnoza bakterije Ralstonia solanacearum i ocjenjuje virulentnost kultura identificiranih kao Ralstonia solanacearum.

   Pripremiti inokulum 106 stanica po ml iz kulture i pozitivnog kontrolnog soja. Inokulirati 5 – 10 biljaka rajčice ili patlidžana, poželjno u fazi trećeg pravog lista ili u kasnijoj fazi (odjeljak III.6.). Inkubirati najviše dva tjedna na temperaturi 22 – 28 °C i visokoj relativnoj vlažnosti uz svakodnevno zalijevanje. Promatrati pojavu venuća i/ili epinastije, kloroze, zaostajanja u rastu.
   Postupak izolacije iz biljaka sa simptomima vrši se na sljedeći način:

               —

               Izdvojiti dio tkiva sa stabljike 2 cm iznad mjesta inokulacije.

               —

               Smrviti i suspendirati u manjoj količini sterilne destilirane vode ili u 50 mM fosfatnog pufera. Razmazati na hranjivu podlogu, inkubirati i pratiti razvoj tipičnih kolonija bakterije Ralstonia solanacearum.

         ODJELJAK III.

      OTKRIVANJE I IDENTIFIKACIJA BAKTERIJE RALSTONIA SOLANACEARUM U UZORCIMA GOMOLJA KRUMPIRA

      Napomena: Standardna veličina uzorka jest 200 gomolja. Međutim, postupak se može primijeniti na odgovarajući način i na uzorcima manjima od 200 gomolja.
   1.   Pripremanje uzorka za testiranje

      Napomena: Pelet ekstrakta krumpira dobiven ovim postupkom može se koristiti i za otkrivanje bakterije Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.
   Mogući postupci obrade prije testiranja ako se smatraju korisnima:

               i.

               Inkubitrati uzorak na 25 – 30 °C do dva tjedna kako bi se potaklo razmnožavanje manjih populacija bakterije Ralstonia solanacearum.

               ii.

               Isprati gomolje pod tekućom vodom prikladnim sredstvima za dezinfekciju i deterdžentima. Osušiti gomolje na zraku.

         1.1.   Čistim i sterilnim skalpelom ili nožem za povrće odstraniti koru gomolja na području hiluma tako da žilna tkiva postanu vidljiva. Pomno izrezati malu stožastu jezgru (promjera 3 – 5 mm) žilnog tkiva na području hiluma. Količina nežilnog tkiva treba biti što je manja moguća. Obraditi sve gomolje u uzorku.

      Napomena: U ovoj je fazi moguće izvršiti vizualni pregled gomolja (odjeljak II.1.). Odvojiti sve gomolje sa simptomima ili vrlo trule gomolje i testirati zasebno (odjeljak II.).
   1.2.   Staviti hilume gomolja u zatvorenu posudu. Poželjno ih je odmah obraditi. Ako to nije moguće, čuvati ih najviše 24 sata, odnosno najviše 72 sata na 4 °C.
   1.3.   Obraditi hilume gomolja jednim od sljedećih postupaka:

               i.

               Staviti hilume u prikladnu posudu.
               Dodati dovoljnu količinu pufera za maceraciju (Dodatak 2.) da prekrije hilume.
               Samljeti hilume u mješalici Waring ili Ultra Thurrax do potpune homogenizacije. Izbjeći prekomjernu homogenizaciju.
               Ostaviti macerat da se namače 15 – 30 minuta.

               ii.

               Staviti hilume u prikladnu posudu.
               Dodati dovoljnu količinu pufera za maceraciju da prekrije hilume.
               Postaviti posudu na rotacijsku tresilicu.
               Inkubirati pri 50 – 100 okretaja u minuti tijekom 4 sata na temperaturi od 20 – 22 °C ili 16 – 24 sata na temperaturi od 4 °C.

               iii.

               Staviti hilume u čvrstu vrećicu za maceraciju za jednokratnu uporabu (npr. vrećica Stomacher veličine 105 mm × 150 mm, sterilizirana zračenjem).
               Pažljivo zdrobiti hilume prikladnim instrumentom, npr. batom, do potpune homogenizacije.
               Dodati dovoljnu količinu pufera za maceraciju da prekrije hilume.
               Ostaviti macerat 15 – 30 minuta da se nataloži.

         1.4.   Ekstrahirati bakterije iz obrađenih hiluma jednim od sljedećih postupaka:

               i

               Pažljivo pretočiti macerat u epruvetu za centrifugiranje te ostaviti ostatak u posudi ili vrećici. Ako je pretočeni macerat mutan, centrifugirati 10 minuta na najviše 180 g na temperaturi nižoj od 10 °C.
               Centrifugirati pretočeni macerat ili supernatant iz prvog centrifugiranja 15 minuta na 7 000 g ili 10 minuta na 10 000 g na temperaturi nižoj od 10 °C.
               Odliti supernatant bez miješanja peleta.

               ii.

               Filtrirati macerat pomoću filterskog sustava veličine pora 40 – 100 μm. Filtriranje se ubrzava pomoću vakuumske crpke.
               Prikupiti filtrat u epruvetu za centrifugiranje.
               Isprati filter puferom za maceraciju.
               Centrifugirati filtrat 15 minuta na 7 000 g ili 10 minuta na 10 000 g na temperaturi nižoj od 10 °C.
               Odliti supernatant bez miješanja peleta.

         1.5   Resuspendirati pelet u 1 ml peletnog pufera (Dodatak 2.).
   Podijeliti na dva jednaka dijela i staviti svaki dio u mikroepruvetu.
   Za testiranje se koristi jedna mikroepruveta. Ostatak ekstrakta čuvati na 4 °C tijekom testiranja.
   U drugu mikroepruvetu dodati 10 – 25 % (v/v) sterilnog glicerola. Snažno promiješati. Pohraniti na temperaturi od – 18 °C (tjednima) ili – 70 °C (mjesecima).
   2.   Test imunofluorescencije

   Koristiti antiserum za bakteriju Ralstonia solanacearum, po mogućnosti protiv biotipa 3/biovara 2. Odrediti titar suspenzije od 106 stanica po ml homolognog soja bakterije Ralstonia solanacearum pomoću odgovarajućeg razrjeđenja fluorescein izotiocijanat (FITC) konjugata sukladno uputama proizvođača. IF titar sirovog antiseruma mora iznositi barem 1:2 000.
   Koristiti predmetna stakalca s više jažica, po mogućnosti s 10 jažica promjera barem 6 mm.
   Na svakom predmetnom stakalcu koristiti kontrolu FITC konjugata. Test je potrebno ponoviti s uključenom kontrolom PBS ako se u kontroli FITC opaze bilo koje pozitivne stanice.
   Pripremiti posebna stakalca za pozitivnu kontrolu sa suspenzijom od 106 stanica po ml soja odgovarajućeg biotipa/biovara bakterije Ralstonia solanacearum. Za svaki niz testova koristiti po jedno stakalce.
   2.1.   Pripremiti testna stakalca jednim od sljedećih postupaka:

               i.

               Za pelete s relativno malo škroba:

                           U jedan red jažica pipetom odmjeriti standardnu količinu (za jažicu promjera 6 mm primjerena količina je 15 μl – za veće jažice povećati količinu) resuspendiranog peleta. Preostali se red može koristiti za ponavljanje ili za drugi uzorak, kako je prikazano na slici 1.

               ii.

               Za druge pelete:

                           Pripremiti decimalna razrjeđenja, odnosno u omjerima 1/10, 1/100 i 1/1000, resuspendiranog peleta u peletnom puferu. U jedan red jažica pipetom odmjeriti standardnu količinu (za jažicu promjera 6 mm primjerena količina jest 15 μl – za veće jažice povećati količinu) resuspendiranog peleta i svakog od navedenih razrjeđenja. Preostali se red može koristiti za ponavljanje ili za drugi uzorak, kako je prikazano na slici 2.

         2.2.   Ostaviti da se kapljice osuše. Fiksirati stanice bakterija na staklo zagrijavanjem, plamenom ili 95-postotnim etanolom.
   Postupak za test imunofluorescencije

               i.

               U skladu s pripremom testnih stakalaca iz točke 2.1. podtočke i.:

                           Pripremiti niz dvostrukih razrjeđenja antiseruma u IF puferu (Dodatak 3.):

                                       1/4 titra (T/4), 1/2 titra (T/2), titar (T) i dvostruki titar (2T).

               ii

               U skladu s pripremom testnih stakalaca iz točke 2.1. podtočke ii.:

                           Pripremiti radno razrjeđenje antiseruma u IF puferu. Radno razrjeđenje je razrjeđenje antiseruma optimalne specifičnosti te obično iznosi pola titra.

                              Slika 1.

                              Priprema testnog stakalca u skladu s točkom 2.1. podtočkom i. i točkom 2.3. podtočkom i.

                           Standardno razrjeđenje resuspendiranog peleta
                           T = titar

                                       FITC

                                       T/4

                                       T/2

                                       T

                                       2T

                                       => dvostruka razrjeđenja antiseruma

                                       Uzorak 1

                                       •1

                                       •2

                                       •3

                                       •4

                                       •5

                                       Duplikat uzorka 1 ili uzorka 2

                                       •6

                                       •7

                                       •8

                                       •9

                                       •10

                              Slika 2.

                              Priprema testnog stakalca u skladu s točkom 2.1. podtočkom ii. i točkom 2.3. podtočkom ii.

                                       FITC

                                       Standardno razrjeđenje antiseruma

                                       Čisto

                                       Čisto

                                       1/10

                                       1/100

                                       1/1000

                                       => Decimalno razrjeđenje resuspendiranog peleta

                                       Uzorak 1

                                       •1

                                       •2

                                       •3

                                       •4

                                       •5

                                       Duplikat uzorka 1 ili uzorka 2

                                       •6

                                       •7

                                       •8

                                       •9

                                       •10

         2.3.1.   Posložiti stakalca na navlaženi upijajući papir.
   Testne jažice prekriti razrjeđenjem(-ima) antiseruma. Nanijeti PBS na jamice s FITC-om. Obujam antiseruma koji se stavlja u jažice mora biti jednak obujmu stavljenog ekstrakta.
   2.3.2.   Inkubirati pokriveno 30 minuta na sobnoj temperaturi.
   2.3.3.   Otresti sa stakalaca kapljice antiseruma i pažljivo ih isprati IF puferom. Ispirati pet minuta u IF puferu-Tween i potom još pet minuta u IF puferu (Dodatak 3.). Pažljivo ukloniti višak vlage.
   2.3.4.   Posložiti stakalca na navlaženi upijajući papir. Prekriti testne jažice i jažicu s FITC-om razrjeđenjem konjugata FITC korištenog za određivanje titra. Obujam konjugata koji se stavlja u jažice mora biti jednak obujmu stavljenog antiseruma.
   2.3.5.   Inkubirati pokriveno 30 minuta na sobnoj temperaturi.
   2.3.6.   Otresti kapljice konjugata sa stakalca. Isprati i oprati na prethodno opisani način (2.3.3.). Pažljivo ukloniti višak vlage.
   2.3.7.   U svaku jažicu pipetom odmjeriti 5 – 10 μl 0,1 M glicerola s fosfatnim puferom (Dodatak 3.) ili sličan pokrivni pufer i i staviti pokrovno stakalce.
   2.4.   Očitavanje testa imunofluorescencije
   Pregledavati testna stakalca pod epifluorescentnim mikroskopom s filterima primjerenima za ekscitaciju FITC-a, u imerzijskom ulju uz povećanje 500 – 1 000. Pregledavati jažice duž dvaju promjera pod pravim kutom i duž vanjskog ruba.
   Najprije je potrebno pregledati stakalce za pozitivnu kontrolu. Stanice moraju biti svijetlo fluorescentne i potpuno obojane.

      Napomena: u slučaju odstupanja kod obojenosti test je potrebno ponoviti.

   Pregledati testna stakalca. Prvo je potrebno utvrditi da u jažicama za FITC kontrolu nema fluorescentnih stanica. Prisutnost fluorescentnih stanica u FITC kontroli upućuje na nespecifično vezivanje konjugata, autofluorescenciju ili kontaminaciju.

      Napomena: u tom je slučaju test potrebno ponoviti.

   U testnim jamicama tražiti svijetle fluorescentne stanice s morfologijom karakterističnom za bakteriju Ralstonia solanacearum. Intenzitet fluorescencije mora biti jednak onom zamijećenom kod soja za pozitivnu kontrolu pri jednakom razrjeđenju antiseruma. Stanice s nepotpunim obojenjem ili slabom fluorescencijom ne uzimaju se u obzir, osim ako su prisutne u velikom broju (vidjeti: Tumačenje rezultata testa imunofluorescencije).

      Tumačenje rezultata testa imunofluorescencije:

               i.

               Test imunofluorescencije je negativan ako nisu prisutne svijetle fluorescentne stanice karakteristične morfologije.

               ii.

               Ako su prisutne svijetle fluorescentne stanice karakteristične morfologije, odrediti prosječan broj stanica po mikroskopskom vidnom polju i izračunati broj stanica (N) po ml resuspendiranog peleta (Dodatak 4.).
               Populacija od oko 103 stanica po ml resuspendiranog peleta smatra se granicom detekcije za test imunofluorescencije,

                           —

                           za uzorke s N > 103 stanica po ml resuspendiranog peleta test imunofluorescencije smatra se pozitivnim,

                           —

                           za uzorke s N < 103 stanica po ml resuspendiranog peleta test imunofluorescencije može se smatrati pozitivnim.

               iii.

               Ako je pri titru antiseruma prisutan velik broj (> 105 stanica po ml) stanica nepotpune ili slabe fluorescencije, potrebno je obaviti drugi test:

                           —

                           test koji se temelji na različitom biološkom načelu, ili

                           —

                           ponovljeni test imunofluorescencije s drugim antiserumom ili deseterostrukom dilucijom peleta.

         3.   Test ELISA

   Temelji se na Robinson-Smith et al., 1995.
   Koristiti antiserum za bakteriju Ralstonia solanacearum, po mogućnosti protiv biotipa 3/biovara 2. Odrediti titar na suspenziji od 106 stanica po ml homolognog soja bakterije Ralstonia solanacearum.
   Preporučuje se uporaba mikrotitarskih pločica NUNC-Polysorb.
   Koristiti negativnu kontrolu s ekstraktom krumpira i kontrolu s fosfatnim puferom sa solju (PBS).
   Koristiti pozitivnu kontrolu sa suspenzijom od > 106 stanica po ml soja odgovarajućeg biotipa/biovara bakterije Ralstonia solanacearum. Testiranje se vrši na jednak način kao i za uzorke, ali potpuno odvojeno od uzoraka na mikrotitarskoj pločici.
   3.1.   U mikroepruvetu pipetom odmjeriti 100 – 200 μl resuspendiranog peleta.
   Zagrijavati 4 minute na teperaturi od 100 °C. Staviti mikroepruvetu u led.
   3.2.   Dodati jednaku količinu karbonatnog pufera za oblaganje dvostruke jačine (Dodatak 5.). Snažno promiješati.
   3.3.   Staviti alikvote od 100 μl u svaku od barem dvije jažice na mikrotitarskoj pločici. Inkubirati jedan sat na 37 °C ili preko noći na 4 °C.
   3.4.   Ukloniti ekstrakte iz jažica. Triput isprati jažice otopinom PBS-Tween (Dodatak 5.), a posljednju otopinu za ispiranje ostaviti u jažicama barem pet minuta.
   3.5.   Pripremiti odgovarajuće razrjeđenje antiseruma bakterije Ralstonia solanacearum u blokirajućem puferu (Dodatak 5.). Dodati 100 μl razrjeđenja antiseruma u svaku jažicu.
   Inkubirati jedan sat na 37 °C.
   3.6.   Ukloniti antiserum iz jažica. Isprati jažice na gore opisani način (3.4.).
   3.7.   Pripremiti odgovarajuće razrjeđenje konjugata alkalne fosfataze u blokirajućem puferu. Dodati 100 μl razrjeđenja konjugata u svaku jažicu.
   Inkubirati jedan sat na 37 °C.
   3.8.   Ukloniti konjugat iz jažica. Isprati jažice na gore opisani način (3.4. i 3.6.).
   3.9.   Pripremiti razrjeđenje supstrata alkalne fosfataze (Dodatak 5.). Dodati 100 μl u svaku jažicu. Inkubirati 30 minuta do jednog sata u zatamnjenom prostoru na sobnoj temperaturi.
   3.10.   Očitati apsorbanciju pri 409 nm.

      Tumačenje testa ELISA:

   Test ELISA je negativan ako je optička gustoća (OG) uzorka < 2 × OG negativne kontrole.
   Test ELISA je pozitivan ako je optička gustoća (OG) uzorka > 2 × OG negativne kontrole.
   4.   Test PCR

   Temelji se na Seal et al., 1993.

      Napomena: U svim fazama pripremanja uzorka i drugim postupcima koji uključuju PCR potrebno je koristiti pipete s filterom u vršku.
   Za pozitivnu kontrolu pripremiti suspenziju od 106 stanica po ml iz soja biotipa 3/biovara 2 bakterije Ralstonia solanacearum. Testiranje se vrši na jednak način kao i za uzorke.
   4.1.   Pipetom odmjeriti u mikroepruvetu 100 μl resuspendiranog peleta.
   Alternativno je moguće staviti 90 μl resuspendiranog peleta u mikroepruvetu koja sadrži 10 μl 0,5 M NaOH. Promiješati uzastopnim preokretanjem mikroepruvete.
   4.2.   Zagrijavati četiri minute na 100 °C. Mikroepruvetu odmah staviti u led.
   4.3.   Pripremiti barem dva decimalna razrjeđenja, npr. 1/10 i 1/100, a po potrebi i više, u sterilnoj destiliranoj vodi ili ultra čistoj vodi.
   4.4.   U sterilnoj epruveti pripremiti reakcijsku smjesu za PCR (Dodatak 6.) dodavanjem sljedećih reagensa u navedenom redoslijedu:

      Za 50 μl reakcijske smjese:

               Reagens

               Količina

               Konačna koncentracija

               Sterilna destilirana voda ili ultra čista voda

               30,8 μl – 33,8 μl

               10 × PCR pufer

               5,0 μl

               1 ×

               d-ATP

               1,0 μl

               0,2 mM

               d-CTP

               1,0 μl

               0,2 mM

               d-GTP

               1,0 μl

               0,2 mM

               d-TTP

               1,0 μl

               0,2 mM

               Početnica OLI-1 (20 μM)

               2,5 μl

               1 μΜ

               Početnica Y-2 (20 μM)

               2,5 μl

               1 μΜ

                  taq polimeraza (5U/μl)

               0,2 μl

               1,0 U

               Ukupni obujam

               45 μl – 48 μl

      Za veći broj reakcija:

   Izračunati količinu svakog reagensa za potreban broj reakcija.
   Pomiješati reagense i staviti 45 – 48 μl smjese u sterilne epruvete za PCR.
   Čuvati epruvete s reakcijskom smjesom za PCR u ledu.

      Za 25 μl reakcijske smjese:

   Proporcionalno smanjiti količine reagensa.
   4.5.   PCR umnožavanje
   4.5.1.   Neobvezno: impulsno centrifugirati epruvete s prokuhanim uzorcima i pozitivnom kontrolom.
   U epruvete s reakcijskom smjesom za PCR navedenim redoslijedom dodati 2 – 5 μl uzorka(-aka), vodene kontrole i pozitivne kontrole. Staviti epruvete u blok za zagrijavanje DNA-termociklera.
   4.5.2.   Provesti sljedeći program:
   1 ciklus od:
   i.   2 minute na 96 °C: denaturacija kalupa
   50 ciklusa od:
   ii.   20 sekundi na 94 °C: denaturacija
   iii.   20 sekundi na 68 °C: sparivanje početnica
   iv.   30 sekundi na 72 °C: produljivanje kopije
   1 ciklus od:
   v.   10 minuta na 72 °C: dodatno produljivanje
   1 ciklus od:

               vi.

               držati se na 4 °C.

      Napomena: Ovi su parametri namijenjeni za uređaj Perkin Elmer 9600. Drugi termocikleri mogu zahtijevati pokrovni sloj mineralnog ulja u PCR reakcijskim epruvetama i/ili prilagodbu trajanja ciklusa ii., iii. i iv. u profilu umnožavanja.
   4.5.3.   Ukloniti epruvete iz termociklera. Analizirati PCR produkt. Ako se analiza ne izvrši odmah, potrebno je čuvati epruvete na 4 °C za uporabu istog dana ili na – 18 °C za dulje razdoblje.
   4.6.   Analiza PCR produkta
   Fragmenti PCR otkrivaju se elektroforezom u agaroznom gelu i bojanjem etidijevim bromidom.
   4.6.1.   Pripremiti odgovarajući agarozni gel polaganim zagrijavanjem agaroze do tališta u tris-acetatnom puferu za elektroforezu (TAE).
   4.6.2   Ohladiti rastaljenu agarozu na 50 – 60 °C, uliti u kalup uređaja za elektroforezu i umetnuti češalj. Ostaviti otopinu da se stvrdne.
   4.6.3   Ukloniti češalj. Potopiti gel u TAE na način da bude prekriven samo puferom (2 – 3 mm).
   4.6.4   Nakapati 3 μl pufera za nanošenje na parafilm. Dodati 12 μl PCR produkta iz uzoraka, bilo pozitivne kontrole, bilo vodene kontrole, te prije punjenja promiješati laganim usisavanjem u vrh pipete. Navedene je količine moguće prilagoditi kako bi odgovarale obujmu jažica u agaroznom gelu.
   4.6.5   Pažljivo napuniti jažice u gelu. U barem jednu jažicu dodati odgovarajući DNK marker kao referencu.
   4.6.6   Priključiti žicama uređaj za elektroforezu s napajanjem električne energije. Izvršiti elektroforezu pri naponu 5 – 8 V/cm dok fronta indikatora za praćenje ne bude 1 cm od kraja gela.
   4.6.7   Isključiti dovod električne energije. Odspojiti žice s uređaja za elektroforezu.
   Pažljivo ukloniti gel. Potopiti gel u otopinu etidijevog bromida 30 – 45 minuta.

      Napomena: Prilikom rukovanja etidijevim bromidom, koji je snažan mutagen, čitavo je vrijeme potrebno nositi rukavice za jednokratnu uporabu.
   4.6.8   Ukloniti boju u destiliranoj vodi 10 – 15 minuta.
   4.6.9   Pogledati umnožene fragmente DNK pomoću UV transiluminatora. Duljina PCR produkta bakterije Ralstonia solanacearum s početnicama OLI-1 i Y-2 iznosi 288 bp. Usporediti s DNK markerom i pozitivnom kontrolom.

      Napomena: Vodena kontrola mora biti negativna u svakom slučaju. Ako je pozitivna, test je potrebno ponoviti.
   4.6.10.   Fotografirati gel ako je potreban trajan dokaz.
   4.6.11.   Potvrditi autentičnost umnoženog fragmenta analizom restrikcijskih enzima (REA).
   4.7   Analiza restrikcijskih enzima (REA)
   4.7.1.   Staviti 8,5 μl PCR produkta (4.5.3.) u novu mikroepruvetu. Dodati 1 μl 10x enzimskog pufera i 0,5 μl restrikcijskog enzima Ava II.
   4.7.2   Promiješati laganim usisavanjem u vrh pipete. Ako na stijenkama epruvete ostanu kapljice, impulsno centrifugirati u mikrocentrifugi. Inkubirati jedan sat na 37 °C.
   4.7.3   Analizirati pocijepani fragment PCR elektroforezom u agaroznom gelu na prethodno opisani način (4.6.).

      Tumačenje rezultata testa PCR:

   Test PCR je negativan ako u uzorku nije vidljiv karakteristični fragment duljine 288 bp, ali je isti vidljiv u pozitivnim kontrolama za soj bakterije Ralstonia solanacearum.
   Test PCR je pozitivan ako je u uzorku vidljiv fragment duljine 288 bp, a REA analiza umnoženog fragmenta jednaka je pozitivnoj kontroli soja bakterije Ralstonia solanacearum.
   5.   Test razmaza na selektivnoj hranjivoj podlozi

   Temelji se na Elphinstone et al., 1996.
   5.1   Izvršiti test odgovarajućom tehnikom nanošenja razrjeđenja, npr.:

               i.

               Pripremiti barem dva decimalna razrjeđenja, primjerice 1/10 i 1/100, a prema potrebi i više, resuspendiranog peleta u peletnom puferu. Pipetom odmjeriti standardnu količinu (50 – 100 μl) resuspendiranog peleta i nanijeti svako razrjeđenje na modificiranu selektivnu hranjivu podlogu SMSA (Dodatak 7.) te staklenim štapićem razmazati po čitavoj površini podloge.
               Prema potrebi mikrobiološkom ušicom volumena 10 μl nanijeti razrjeđenje resuspendiranog peleta u crtama. Provući ušicu kroz plamen između svakog pojedinog nanošenja crta.

               ii.

               Odmjeriti standardnu količinu (50 – 100 μl) resuspendiranog peleta na modificiranu selektivnu hranjivu podlogu SMSA te razmazati staklenim štapićem po čitavoj površini podloge. Štapićem napraviti crte na barem dvije dodatne pločice s modificiranom hranjivom podlogom SMSA bez držanja štapića iznad plamena.

         5.2   Istom tehnikom nanošenja razrjeđenja nanijeti na niz zasebnih pločica s modificiranom hranjivom podlogom SMSA suspenziju od 106 stanica po ml virulentnog soja biotipa 3/biovara 2 bakterije Ralstonia solanacearum.
   5.3   Inkubirati pločice na 28 °C. Započeti s očitavanjem pločica nakon tri dana. Ako su negativne, nastaviti s inkubacijom do najviše šest dana. Kolonije virulentnih izolata bakterije Ralstonia solanacearum mliječno su bijele boje, plosnate, nepravilne i tekuće, s krvavo crvenim obojenjem u sredini s unutarnjim prugama ili spiralama.
   5.4   Pročistiti kolonije karakteristične morfologije precjepljivanjem na univerzalnu hranjivu podlogu (Dodatak 1.).
   5.5   Identificirati čiste kulture (odjeljak II. točka 4.1.) i testom patogenosti potvrditi kulture bakterije Ralstonia solanacearum (odjeljak II. točka 4.3.).

      Tumačenje testa razmaza na selektivnoj hranjivoj podlozi:

   Test razmaza na selektivnoj hranjivoj podlozi je negativan ako se nakon šest dana ne izoliraju ikakve bakterijske kolonije ili ako se ne izoliraju kolonije karakteristične za bakteriju Ralstonia solanacearum, pod uvjetom da ne postoji sumnja na inhibiciju od strane kolonija drugih bakterija te ako su u pozitivnoj kontroli identificirane kolonije karakteristične za bakteriju Ralstonia solanacearum.
   Test razmaza na selektivnoj hranjivoj podlozi je pozitivan ako se izoliraju kolonije karakteristične za bakteriju Ralstonia solanacearum.
   6.   Biološki test

   Temelji se na Janse, 1988.
   6.1   Za svaki uzorak upotrijebiti 10 testnih biljaka osjetljivog kultivara rajčice ili patlidžana u fazi trećeg pravog lista. Ne zalijevati biljke 24 sata prije inokulacije.
   6.2   Rasporediti 100 μl resuspendiranog peleta na testne biljke. Inokulirati u stabljiku između supki i na jednom ili više drugih mjesta.
   6.3   Inokulirati istom tehnikom 10 sadnica suspenzijom od 106 stanica po ml virulentnog soja biovara 2/biotipa 3 bakterije Ralstonia solanacearum za pozitivnu kontrolu i peletnim puferom za negativnu kontrolu. Odvojiti biljke za pozitivnu kontrolu od ostalih biljaka kako bi se spriječila unakrsna kontaminacija.
   6.4   Uzgajati biljke do najviše četiri tjedna na temperaturi 22 – 28 °C i uz visoku relativnu vlažnost i svakodnevno zalijevanje. Pratiti pojavu venuća, epinastije, kloroze i/ili zaostajanja u rastu.
   6.5   Pripremiti izolate iz zaraženih biljaka (odjeljak II.). Identificirati čiste kulture karakteristične morfologije (odjeljak II.4.1.) i testom patogenosti potvrditi kulture bakterije Ralstonia solanacearum (odjeljak II.4.3.).
   6.6   Prema potrebi provjeriti odsutnost zaraze na serijama testnih biljaka koje ne pokazuju nikakve znakove zaraze. Ukloniti sa svake testne biljke dio stabljike duljine jedan cm na mjestu koje se nalazi dva cm iznad točke inokulacije. Homogenizirati tkiva u puferu za maceraciju. Pripremiti test razmaza razrjeđenja na hranjivu podlogu (odjeljak III.5.1.). Ako je rezultat pozitivan, identificirati čiste kulture karakteristične morfologije (odjeljak II.4.1.) i testom patogenosti potvrditi kulture bakterije Ralstonia solanacearum (odjeljak II.4.3.).

      Tumačenje rezultata biološkog testa:

   Biološki je test negativan ako testne biljke nisu zaražene bakterijom Ralstonia solanacearum pod uvjetom da su u pozitivnoj kontroli otkrivene bakterije Ralstonia solanacearum.
   Biološki je test pozitivan ako su testne biljke zaražene bakterijom Ralstonia solanacearum.

   7.   Testovi obogaćivanja

   Temelji se na Elphinstone et al., 1996.
   7.1   Odmjeriti 100 μl resuspendiranog peleta u tri ml modificiranog bujona SMSA (Dodatak 7.).
   7.2   Inkubirati 48 sati, ali nikako dulje od 72 sata, na temperaturi od 28 °C u epruveti s labavim čepom kako bi se omogućilo prozračivanje.
   7.3   Dobro zatvoriti čep na epruveti i snažno promiješati. Pripremiti alikvote za test imunofluorescencije (ovaj odjeljak točka 2.), test ELISA (ovaj odjeljak točka 3.) i/ili test PCR (ovaj odjeljak točka 4.)
   8.   Test patogenosti

   Vidjeti odjeljak II.4.3.

      Dodatak 1.
      Hranjive podloge za izolaciju i uzgoj bakterije Ralstonia solanacearum

                     Hranjivi agar (NA)

                              Hranjivi agar (Difco)

                              23 g

                              Destilirana voda

                              1 litra

                        Pripremiti podloge od ½ litre u litarskim bocama.
                  Otopiti sastojke.
                  Sterilizirati u autoklavu 15 minuta na 121 °C.
                  Ohladiti na 50 °C. Izliti na pločice.

                     Agar s kvascem, peptonom i glukozom (YPGA)

                              Ekstrakt kvasca (Difco)

                              5 g

                              Bacto Pepton (Difco)

                              5 g

                              D(+)-glukoza (monohidrat)

                              10 g

                              Bacto Agar (Difco)

                              15 g

                              Destilirana voda

                              1 litra

                        Pripremiti podloge od ½ litre u litarskim bocama.
                  Otopiti sastojke.
                  Sterilizirati u autoklavu 15 minuta na 121 °C.
                  Ohladiti na 50 °C. Izliti na pločice.

                     Agar sa saharozom i peptonom (SPA)

                              Saharoza

                              20 g

                              Pepton

                              5 g

                              K2HPO4

                              0,5 g

                              MgSO4·7H2O

                              0,25 g

                              Bacto Agar (Difco)

                              15 g

                              Destilirana voda

                              1 litra

                        Pripremiti podloge od ½ litre u litarskim bocama.
                  Otopiti sastojke. Po potrebi prilagoditi pH na 7,2 – 7,4.
                  Sterilizirati u autoklavu 15 minuta na 121 °C.
                  Ohladiti na 50 °C. Izliti na pločice.

                     Kelmanova tetrazolij-podloga

                              Casamino kiseline (Difco)

                              1 g

                              Bacto Pepton (Difco)

                              10 g

                              Dekstroza

                              5 g

                              Bacto Agar (Difco)

                              15 g

                              Destilirana voda

                              1 litra

                        Pripremiti podloge od ½ litre u litarskim bocama.
                  Otopiti sastojke. Sterilizirati u autoklavu 15 minuta na 121 °C.
                  Ohladiti na 50 °C.
                  Dodati vodenu otopinu trifenil-tetrazolij klorida (Sigma) steriliziranu filtriranjem, čime se dobiva konačna koncentracija od 50 mg po litri.
                  Izliti na pločice.

      Dodatak 2.
      Materijali za pripremanje uzoraka

                     Pufer za maceraciju: 50 mM fosfatnog pufera, pH 7,0

                  Ovaj se pufer koristi za maceraciju tkiva.

                              Na2HPO4

                              4,26 g

                              KH2PO4

                              2,72 g

                              Destilirana voda

                              1 litra

                        Otopiti sastojke i provjeriti pH. Razdijeliti na alikvote prema potrebi.
                  Sterilizirati u autoklavu 15 minuta na 121 °C.
                  Preporučuje se dodavanje 5 % polivinilpirolidona–40 000 MWT (PVP-40) za izravni PCR test kako bi se smanjila učestalost inhibicije umnožavanja aromatskim molekulama u ekstraktu.
                  Preporučuje se dodavanje deflokulanta, sredstva protiv pjenjenja ili antioksidansa u okviru postupka homogenizacije mješalicom Waring ili Ultra Turrax za maceraciju jezgri tkiva krumpira.

                              Pahuljice Lubrol

                              0,5 g po litri

                              DC silikon protiv pjenjenja

                              1,0 ml po litri

                              Tetranatrijev pirofosfat

                              1,0 g po litri

                        Zasebno sterilizirati u autoklavu. Dodavati do željene koncentracije.

                     Peletni pufer: 10 mM fosfatnog pufera, pH 7,2

                  Ovaj se pufer koristi za resuspendiranje i razrjeđivanje hiluma i peleta krumpira.

                              Na2HPO4·12H2O

                              2,7 g

                              NaH2PO4·2H2O

                              0,4 g

                              Destilirana voda

                              1 litra

                        Otopiti sastojke i provjeriti pH. Razdijeliti na alikvote prema potrebi.
                  Sterilizirati u autoklavu 15 minuta na 121 °C.

      Dodatak 3.
      Materijali za test imunofluorescencije

                     IF pufer: 10 mM fosfatnog pufera sa solju (PBS), pH 7,2

                  Ovaj se pufer koristi za razrjeđivanje antiseruma.

                              Na2HPO4·12H2O

                              2,7 g

                              NaH2PO4·2H2O

                              0,4 g

                              NaCl

                              8,0 g

                              Destilirana voda

                              1 litra

                        Otopiti sastojke i provjeriti pH. Razdijeliti na alikvote prema potrebi.
                  Sterilizirati u autoklavu 15 minuta na 121 °C.

                     Pufer IF-Tween

                  Ovaj se pufer koristi za ispiranje objektnih stakalaca. Dodati 0,1 % Tween 20 u IF pufer.

                     0,1 M Glicerol s fosfatnim puferom pH 7,6

                  Ovaj se pufer koristi kao tekućina za prekrivanje jažica objektnih stakalaca za imunofluorescenciju za pojačanje fluorescencije.

                              Na2HPO4.·12H2O

                              3,2 g

                              NaH2PO4·2H2O

                              0,15 g

                              Glicerol

                              50 ml

                              Destilirana voda

                              100 ml

      Dodatak 4.
      Utvrđivanje stupnja zaraženosti u testu imunofluorescencije

                  Površina (S) jažice staklaca s više jažica

                  gdje je D = promjer jažice

                  (1)

                  Površina (s) polja objektiva

                  gdje je d = promjer polja

                  (2)

                  Izračunati d izravnim mjerenjem ili pomoću sljedećih jednadžbi:

                  gdje je
                  i= koeficient polja (ovisi o vrsti okulara i iznosi od 8 do 24),
                  K= koeficijent tubusa (1 ili 1,25),
                  M= povećanje objektiva (100x, 40x itd.).

                  (3)

                  iz (2)

                  (4)

                  iz (3)

                  Utvrditi broj tipičnih fluorescentnih stanica po polju (c).
                  Izračunati broj tipičnih fluorescentnih stanica po jažici (C).

                  Utvrditi broj tipičnih fluorescentnih stanica po ml peleta (N)

                  gdje je
                  y= obujam peleta u jažici,
                  F= faktor razrjeđenja peleta.

      Dodatak 5.
      Materijali za test ELISA

                     Karbonatni pufer za oblaganje dvostruke jačine, pH 9,6

                              Na2CO3

                              6,36 g

                              NaHCO3

                              11,72 g

                              Destilirana voda

                              1 litra

                        Otopiti sastojke i provjeriti pH. Razdijeliti na alikvote prema potrebi.
                  Sterilizirati u autoklavu 15 minuta na 121 °C.
                  Moguće je dodati natrijev sulfit u konačnoj koncentraciji od 0,2 % kao antioksidans ako ekstrakt sadrži visoki udio aromatskih molekula

                     10 × fosfatni pufer sa solju (PBS), pH 7,4

                              NaCl

                              80 g

                              KH2PO4

                              2 g

                              Na2HPO4·12H2O

                              29 g

                              KCl

                              2 g

                              Destilirana voda

                              1 litra

                        Otopiti sastojke i provjeriti pH. Razdijeliti na alikvote prema potrebi.
                  Sterilizirati u autoklavu 15 minuta na 121 °C.

                     Fosfatni pufer sa solju-Tween (PBS-T)

                              10 × PBS

                              100 ml

                              10 % Tween 20

                              5 ml

                              Destilirana voda

                              895 ml

                     Blokirajući pufer (za protutijela) (mora biti svježe pripremljen)

                              10 × PBS

                              10 ml

                              Polivinilpirolidon-44000 MWT (PP-44)

                              2,0 g

                              10 % Tween 20

                              0,5 g

                              Mlijeko u prahu

                              0,5 g

                              Destilirana voda

                              do 100 ml

                     Otopina supstrata alkalne fosfataze, pH 9,8

                              Dietanolamin

                              97 ml

                              Destilirana voda

                              800 ml

                        Promiješati i prilagoditi pH na 9,8 koncentriranom HCl.
                  Dopuniti destiliranom vodom do jedne litre.
                  Dodati 0,2 g MgCl2.
                  Rastopiti dvije tablete supstrata fosfataze (Sigma) od 5 mg u 15 ml otopine.

      Dodatak 6.
      Materijali za test PCR

         Slijed oligonukleotidnih početnica

                  Početnica OLI-1

                  5′-GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC-3′

                  Početnica Y-2

                  5′-CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3′

            Za materijale vidjeti et al (1993.).

      Dodatak 7.
      Materijali za testove razmaza na selektivnoj hranjivoj podlozi i testove obogaćivanja

         Selektivna hranjiva podloga SMSA (Engelbrecht, 1994., kako je prilagođena u Elphinstone et al., 1996.), ali bez agara i tetrazolijevih soli.

                  Osnovna podloga

                  Casamino kiseline (Difco)

                  1 g

                  Bacto Pepton (Difco)

                  10 g

                  Glicerol

                  5 ml

                  Agar (Difco)

                  15 g

                  Destilirana voda

                  1 litra

            Pripremiti podloge od ½ litre u litarskim bocama.
      Otopiti sastojke i provjeriti pH. Prema potrebi prilagoditi pH na 6,5 prije sterilizacije autoklavom. Bakterije Ralstonia solanacearum ne rastu dobro na podlozi s pH > 7,0.
      Sterilizirati u autoklavu 15 minuta na 121 °C.
      Ohladiti na 50 °C.
      Dodati sljedeće sastojke (svi Sigma) kako bi se dobile potrebne konačne koncentracije:

                  Kristal violet

                  5 mg po litri

                  Polimiksin-B-sulfat

                  100 mg po litri

                  (oko 600 000 jedinica)

                  Sigma P-1004

                  Bacitracin (2)

                  25 mg po litri

                  (oko 1 250 jedinica)

                  Sigma B-0125

                  Kloramfenikol

                  5 mg po litri

                  Sigma C-3175

                  Penicilin-G

                  0,5 mg po litri

                  (oko 825 jedinica)

                  Sigma P-3032

                  Tetrazolijeve soli

                  50 mg po litri

            Otopiti sastojke u 70-postotnom etanolu do navedenih koncentracija za obujam pripremljene podloge. Neke je sastojke, npr. polimiksin-B i kloramfenikol, potrebno lagano zagrijati i protresti.

         Bujon SMSA (Elphinstone et al., 1996.)
      Pripremiti na isti način kao i selektivnu hranjivu podlogu, ali bez agara.
      Razdijeliti na alikvote od po tri ml u 30-mililitarske epruvete Universal za jednokratnu uporabu.

      Reference
      Buddenhagen, I.W.; Sequeira, L. and Kelman, A., 1962. Description of races in Pseudomonas solanacearum. Phytopathology 52, 726.
      Cook, D.; Elizabeth B. and Sequeira L., 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphism with DNA probes that specify virulence and hypersensitive respons. Molecular Plant-Microbe Interactions 2, 113—121.
      Dinesen I.G. and DeBoer, S.H., 1995. Extraction of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus from composite samples of potato tubers. American Potato Journal 72, 133—142.
      Elphinstone, J.G.; Hennessy, J.; Wilson, J. and Stead, D.E., 1996. Sensitivity of different methods for the detection of Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26.
      Engelbrecht, M.C., 1994. Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. ACIAR Bacterial Wilt Newsletter 10, 3—5.
      Hayward, A.C., 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27, 265—277.
      Hayward, A.C., 1994. Systematic and phylogeny of Pseudomonas solanacearum and related bacteria. In: Bacterial Wilt: the disease and its causative agent, Pseudomonas solanacearum (eds. A.C. Hayward and G.L. Hartman) CAB International Oxford, 127—135.
      Janse, J.D., 1988. A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. EPPO Bulletin 18, 343—351.
      Janse, J.D., 1991. Infra- and intraspecific classification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatty acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14, 335—345.
      Kelman, A., 1954. The relationship of pathogenicity in Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 64, 293—695.
      Lelliot, R.A. and Stead, D.E., 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. (T.F. Preece ed.) Blackwell Scientific Publications, Oxford. 216 pp.
      Louws, F.J.; Fulbright, D.W.; Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85, 528—536.
      Lozano, J.C. and Sequeira, L., 1970. Differentiation of races of Pseudomonas solanacearum by a leaf infiltration technique. Phytopathology 60, 838.
      Mirza, M.S.; Rademaker, J.W.L.; Janse, J.D. and Akkermans, A.D.L., 1993. Specific 16S ribosomal RNA targeted oligonucleotide probe against Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Canadian Journal of Microbiology 39, 1029—1034.
      Robinson-Smith, A.; Jones, P.; Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D., 1995. Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67—79.
      Seal, S.E.; Jackson, L.A.; Young, J.P.W. and Daniels, M.J., 1993. Differentiation of Pseudomonas solanacearum, P. syzygii, P. picketti and the blood disease bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. Journal of General Microbiology 139, 1587—1594.
      Smith, J.J.; Offord, L.C.; Holderness, M. and Saddler, G.S., 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61, 4262—4268.
      Stead, D.E., 1992a. Techniques for detecting and identifying plant pathogenic bacteria. In: Techniques for rapid detection of plant pathogens (eds. J.M. Duncan and L. Torrance). Blackwell Scientific Publications, Oxford, 76—111.
      Stead, D.E., 1992b. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42, 281—295.
      Van Beuningen, A.; Derks, H. and Janse J.D., 1995. Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in-situ hybridisation (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe. Züchtungsforschung 2, 266—269.

      (1)  Biotip 4 (patogen na đumbiru i na nekoliko drugih biljaka domaćina) i biotip 5 (patogen samo na dudu) nisu uključeni.

      (2)  Po potrebi se povećanjem koncentracije bacitracina do 300 ppm može smanjiti kontaminacija saprofitskim bakterijama bez da se time smanji mogućnost izolacije bakterije Ralstonia solanacearum.
   PRILOG III.
   1.   Za svaki je slučaj sumnje na zarazu, za koji je dobiven pozitivan rezultat testom(-ovima) probira za popisani biljni materijal u skladu s odgovarajućom metodom iz Priloga II. ili, u svim ostalim slučajevima, u skladu s bilo kojom drugom službeno odobrenom metodom, što dovršenjem navedene metode treba potvrditi ili pobiti, potrebno zadržati i na primjeren način pohraniti:

               —

               ako je moguće, partiju ili njezin dio (iz kojeg je uzet uzorak) u originalnoj ambalaži s etiketom,

               —

               ako je moguće, preostali dio uzoraka,

               —

               sav preostali ekstrakt i dodatno pripremljeni materijal za testove probira, npr. stakalca za test imunofluorescencije, i

               —

               svu pripadajuću dokumentaciju,

         do dovršetka navedene metode.
   2.   U slučaju potvrde prisutnosti organizma potrebno je zadržati i na primjeren način pohraniti:

               —

               materijal iz stavka 1., i

               —

               uzorak zaraženog materijala rajčice ili patlidžana, inokuliranog ekstraktom gomolja ili biljke, prema potrebi, te

               —

               izoliranu kulturu organizma,

         i to barem jedan mjesec nakon provedbe postupka obavještavanja iz članka 5. stavka 2.
   PRILOG IV.
   Elementi istraživanja iz članka 5. stavka 1. točke (a) podtočke i. prema potrebi uključuju:

               i.

               mjesta proizvodnje,

                           —

                           na kojima se uzgaja ili se uzgajao krumpir koji je klonski srodan krumpiru za koji je utvrđena zaraza organizmom,

                           —

                           na kojima se uzgajaju ili su se uzgajale rajčice koje potječu iz istog izvora kao i rajčice za koje je utvrđena zaraza organizmom,

                           —

                           na kojima se uzgajaju ili su se uzgajali krumpir ili rajčice koji su zbog sumnje na prisutnost organizma podvrgnuti službenoj kontroli,

                           —

                           na kojima se uzgaja ili se uzgajao krumpir koji je klonski srodan krumpiru uzgojenom na mjestima proizvodnje koja su zaražena organizmom,

                           —

                           na kojima se uzgajaju krumpir ili rajčice i koja se nalaze u blizini zaraženih mjesta proizvodnje, uključujući mjesta proizvodnje na kojima se koriste ista oprema i objekti izravno ili putem zajedničkog zakupca,

                           —

                           na kojima se za navodnjavanje ili prskanje koriste površinske vode iz bilo kojeg izvora za koji postoji sumnja na zarazu ili za koji je potvrđena zaraza organizmom,

                           —

                           na kojima se za navodnjavanje ili prskanje koriste površinske vode iz izvora koji se zajednički koristi s mjestom proizvodnje za koje postoji sumnja na zarazu ili za koje je potvrđena zaraza organizmom,

                           —

                           koja su poplavljena ili su bila poplavljena površinskim vodama za koje postoji sumnja na zarazu ili za koje je potvrđena zaraza organizmom; i

               ii.

               površinske vode koje se koriste za navodnjavanje ili prskanje, ili koje su poplavile polje(-a) ili mjesto(-a) proizvodnje za koje(-a) je potvrđena zaraza organizmom.

         PRILOG V.
   1.   Elementi za utvrđivanje opsega vjerojatne zaraze iz članka 5. stavka 1. točke (a) podtočke iii. i članka 5. stavka 1. točke (c) podtočke iii. prema potrebi uključuju:

               —

               navedeni biljni materijal uzgojen na mjestu proizvodnje koje je u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom ii. označeno kao zaraženo,

               —

               mjesta proizvodnje povezana putem proizvodnje s navedenim biljnim materijalom koji je u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom ii. označen kao zaražen, uključujući mjesta proizvodnje na kojima se koriste ista oprema i objekti, izravno ili putem zajedničkog zakupca,

               —

               navedeni biljni materijal proizveden na mjestu(-ima) proizvodnje iz prethodne alineje ili koji se na takvom(-im) mjestu(-ima) proizvodnje nalazio u vrijeme kada se navedeni biljni materijal, koji je u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom ii. označen kao zaražen, nalazio na mjestima proizvodnje iz prve alineje,

               —

               skladišta u kojima se rukuje navedenim biljnim materijalom iz gore navedenih mjesta proizvodnje,

               —

               sve strojeve, vozila, posude, skladišta ili njihove dijelove i sve druge predmete, uključujući materijal za pakiranje, koji su mogli doći u doticaj s navedenim biljnim materijalom koji je u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom ii. označen kao zaražen,

               —

               sav navedeni biljni materijal, uskladišten ili u doticaju s bilo kojim objektom ili predmetom iz prethodne alineje prije čišćenja i raskuživanja tih objekata i predmeta,

               —

               na temelju rezultata istraživanja i testiranja iz članka 5. stavka 1. točke (a) podtočke i., u slučaju krumpira, gomolje ili biljke koje su sestrinski ili materinski klonski srodne navedenom biljnom materijalu te u slučaju rajčice, biljke iz istog izvora kao i navedeni biljni materijal koji je označen kao zaražen u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom ii., a za koje se usprkos negativnom rezultatu testa na organizam smatra kako su vjerojatno zaraženi uslijed klonske srodnosti,

               —

               mjesto(-a) proizvodnje navedenog biljnog materijala iz prethodne alineje,

               —

               mjesto(-a) proizvodnje navedenog biljnog materijala na kojima se za navodnjavanje ili prskanje koriste površinske vode koje su u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom ii. označene kao zaražene,

               —

               navedeni biljni materijal proizveden na poljima poplavljenim površinskim vodama za koje je potvrđena zaraza organizmom.

         2.   Utvrđivanje mogućeg širenja zaraze u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom iv. i člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom iii. uključuje:

               i.

               u slučajevima iz članka 5. stavka 1. točke (a) podtočke iv., razmatranje sljedećih elemenata:

                           —

                           blizine ostalih mjesta proizvodnje na kojima se uzgaja navedeni biljni materijal,

                           —

                           zajedničke proizvodnje i uporabe zaliha sjemenskog krumpira,

                           —

                           mjesta proizvodnje na kojima se koriste površinske vode za navodnjavanje ili prskanje navedenog biljnog materijala u slučajevima u kojima postoji ili je postojala opasnost od otjecanja površinskih voda s mjesta proizvodnje ili njihova poplavljivanja, koja su u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom ii. označena kao zaražena,

               ii.

               u slučajevima u kojima je površinska voda, u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (c) podtočkom ii., označena kao zaražena:

                           —

                           mjesto(-a) proizvodnje u kojima se proizvodi navedeni biljni materijal, a nalaze se u neposrednoj blizini površinskih voda koje su označene kao zaražene ili ih ugrožava poplavljivanje takvim vodama,

                           —

                           sve odvojene bazene za navodnjavanje koji su povezani s površinskim vodama koje su označene kao zaražene.

         3.   Pojedinosti obavijesti iz članka 5. stavka 2. prvog podstavka uključuju:

               —

               datum prijave sumnje na zarazu iz članka 4. i datume uzorkovanja i potvrde prisutnosti organizma u skladu s člankom 5., ovisno o slučaju,

               —

               opis elemenata utvrđene zaraze i granica područja zaraze.

         4.   Pojedinosti dodatnih obavijesti iz članka 5. stavka 2. drugog podstavka uključuju:

               —

               za sve pošiljke ili partije krumpira koje su označene kao zaražene, certifikate propisane člancima 7. i 8. Direktive 77/93/EEZ, broj biljne putovnice ili registarski broj proizvođača krumpira, zajedničkih skladišta i otpremnih centara, ovisno o slučaju,

               —

               za sve pošiljke ili partije biljaka rajčica koje su označene kao zaražene, certifikate propisane člancima 7. i 8. Direktive 77/93/EEZ i broj biljne putovnice, u skladu s popisima iz Priloga V. dijela A odjeljka I.2.2. Direktive 77/93/EEZ,

               —

               naziv sorte i kategoriju za zalihe sjemenskog krumpira i, ako je moguće, u svim drugim slučajevima,

               —

               sve ostale podatke povezane s potvrđenom pojavom bolesti koje Komisija može zatražiti.

         PRILOG VI.
   1.   U vezi s člankom 6. stavkom 1., odredbe su:

               —

               spaljivanje, ili

               —

               uporaba za prehranu životinja nakon izvršene toplinske obrade kako bi se spriječio rizik od preživljavanja organizma, ili

               —

               duboko zakopavanje na odlagalištu na kojemu ne postoji rizik od istjecanja na poljoprivredna zemljišta ili od doticaja s izvorima vode koji bi se mogli koristiti za navodnjavanje poljoprivrednog zemljišta, ili

               —

               industrijska prerada pod uvjetom da se izravno i odmah dostavi u pogon za preradu opremljen službeno odobrenim objektima za zbrinjavanje otpada u skladu s odredbama Priloga VII. ove Direktive, ili

               —

               ostale mjere, pod uvjetom da se dokaže da ne postoji prepoznatljivi rizik od širenja organizma; o tim je mjerama potrebno odmah obavijestiti Komisiju i ostale države članice.

         2.   Primjerena uporaba ili zbrinjavanje navedenog biljnog materijala iz članka 6. stavka 2. pod nadzorom nadležnih službenih tijela odnosne(-ih) države(-a) članice(-a), uz primjerenu komunikaciju između nadležnih službenih tijela s ciljem postizanja takvog nadzora u svakom trenutku i odobrenje nadležnog službenog tijela države članice u kojoj se krumpir pakira ili prerađuje za pogone za zbrinjavanje otpada iz prve i druge alineje, jest:

               i.

               za gomolje krumpira:

                           —

                           uporaba kao merkantilni krumpir namijenjen za prehranu i pakiran na mjestima s prikladnim objektima za zbrinjavanje otpada, pripremljen i namijenjen za izravnu isporuku i uporabu bez prepakiranja, ili

                           —

                           uporaba kao merkantilni krumpir namijenjen industrijskoj preradi, koji se izravno i odmah dostavlja u pogon za preradu opremljen primjerenim objektima za zbrinjavanje otpada, ili

                           —

                           drugačija uporaba ili zbrinjavanjem, pod uvjetom da se dokaže ne postoji prepoznatljivi rizik od širenja organizma i uz odobrenje navedenih nadležnih službenih tijela. O tim je mjerama potrebno odmah obavijestiti Komisiju i ostale države članice.

               ii.

               za ostale dijelove biljaka, uključujući ostatke stabljika i listova,

                           —

                           uništavanje, ili

                           —

                           drugačija uporaba ili zbrinjavanje, pod uvjetom da se dokaže da ne postoji prepoznatljivi rizik od širenja organizma; o tim je mjerama potrebno odmah obavijestiti Komisiju i ostale države članice.

         3.   Primjerene metode za raskuživanje predmeta iz članka 6. stavka 3. su čišćenje i, prema potrebi, dezinfekcija, kako ne bi bilo prepoznatljivog rizika od širenja organizma, a primjenjuju se pod nadzorom nadležnih službenih tijela država članica.
   4.   Niz mjera koje provode države članice u sigurnosnom(-im) području(-ima) utvrđenom(-ima) u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom iv. i točkom (c) podtočkom iii. i navedenom(-im) u članku 6. stavku 4., uključuju sljedeće:
   4.1.   U slučajevima u kojima su mjesta proizvodnje označena kao zaražena u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom ii.:

               (a)

               u polju ili jedinici proizvodnje zaštićene kulture koji su u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom ii. označeni kao zaraženi,

                           i.

                           tijekom barem četiri vegetacijske godine nakon utvrđivanja zaraze:

                                       —

                                       poduzimaju se mjere za uklanjanje samoniklih biljaka krumpira i rajčice i drugih biljaka domaćina organizma, uključujući korov iz porodice Solanaceae, i

                                       —

                                       ne sade se:

                                                   —

                                                   gomolji ili biljke krumpira,

                                                   —

                                                   biljke i sjeme rajčice,

                                                   —

                                                   uzimajući u obzir biologiju organizma,

                                                               —

                                                               ostale biljke domaćini,

                                                               —

                                                               biljne vrste porodice Brassica za koje je utvrđen rizik da omogućavaju preživljavanje organizma,

                                                   —

                                                   kulture za koje je utvrđen rizik da omogućavaju širenje organizma;

                                       —

                                       u prvoj sezoni uzgoja krumpira ili rajčice nakon razdoblja iz prethodne alineje i pod uvjetom da na polju nisu pronađene samonikle biljke krumpira i rajčice te druge biljke domaćini, uključujući korove iz porodice Solanaceae, tijekom barem dvije uzastopne vegetacijske godine prije sadnje,

                                                   —

                                                   u slučaju krumpira, službeno certificirani sjemenski krumpir sadi se samo za merkantilnu proizvodnju, i

                                                   —

                                                   provodi se službeno istraživanje, uključujući testiranje, u skladu s člankom 2. stavkom 1.,

                                       —

                                       u sezoni uzgoja krumpira ili rajčice nakon sezone iz prethodne alineje i nakon odgovarajućeg plodoreda, u slučaju krumpira sadi se službeno certificirani sjemenski krumpir namijenjen za proizvodnju sjemenskog ili merkantilnog krumpira, a u slučaju krumpira i rajčice provodi se službeno istraživanje u skladu s člankom 2. stavkom 1.; ili

                           ii.

                           tijekom pet vegetacijskih godina nakon godine u kojoj je utvrđena zaraza,

                                       —

                                       provode se mjere za uklanjanje samoniklih biljaka krumpira i rajčice i drugih biljaka domaćina organizma, uključujući korov iz porodice Solanaceae, i

                                       —

                                       polje se tijekom prve tri godine određuje i održava na ugaru, zasijano žitaricama u skladu s utvrđenim rizikom ili kao stalni pašnjak s učestalom niskom košnjom ili intenzivnom ispašom, ili kao livada za proizvodnju sjemena, nakon čega se u naredne dvije godine sade biljke koje nisu biljke domaćini organizma i za koje nije utvrđen rizik od preživljavanja ili širenja organizma,

                                       —

                                       u prvoj sezoni uzgoja krumpira ili rajčica nakon razdoblja iz prethodne alineje,

                                                   —

                                                   u slučaju krumpira, sadi se službeno certificirani sjemenski krumpir namijenjen za proizvodnju sjemenskog ili merkantilnog krumpira,

                                             i provodi se službeno istraživanje, uključujući testiranje, u skladu s člankom 2. stavkom 1.;

               (b)

               u drugim poljima:

                           —

                           u vegetacijskoj godini nakon godine u kojoj je utvrđena zaraza:

                                       —

                                       ne sade se gomolji ni biljke krumpira, ni druge biljke domaćini organizma i prema potrebi se provode mjere za uklanjanje samoniklih biljaka krumpira i rajčice i drugih biljaka domaćina, uključujući korov iz porodice Solanaceae, ili

                                       —

                                       u slučaju gomolja krumpira, dopuštena je sadnja službeno certificiranog sjemenskog krumpira samo za merkantilnu proizvodnju pod uvjetom da se nadležnim službenim tijelima dokaže da su uklonjeni rizici povezani sa samoniklim biljkama krumpira i rajčice i drugim biljkama domaćinima organizma, uključujući korov iz porodice Solanaceae. Rastući se nasadi pregledavaju u odgovarajućem razdoblju, a samonikle se biljke krumpira testiraju na prisutnost organizma; nadalje, nakon vađenja se pregledavaju i gomolji krumpira;

                           —

                           tijekom prve vegetacijske godine nakon godine iz prve alineje,

                                       —

                                       u slučaju krumpira, sadi se samo službeno certificirani sjemenski krumpir namijenjen za proizvodnju sjemenskog ili merkantilnog krumpira,

                           —

                           tijekom barem druge uzgojne godine nakon godine iz prve alineje,

                                       —

                                       u slučaju krumpira, sadi se samo službeno certificirani sjemenski krumpir ili sjemenski krumpir proizveden pod službenim nadzorom od službeno certificiranog sjemenskog krumpira, namijenjen za proizvodnju sjemenskog ili merkantilnog krumpira,

                           —

                           u svakoj od vegetacijskih godina iz prethodnih alineja provode se mjere za uklanjanje samoniklih biljaka krumpira i rajčice i drugih biljaka domaćina organizma, uključujući korov iz porodice Solanaceae te službeno istraživanje u skladu s člankom 2. stavkom 1., a u slučajevima u kojima se sjemenski krumpir sadi za proizvodnju sjemena provodi se i testiranje gomolja;

               (c)

               odmah po utvrđivanju zaraze u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom ii. i u svakoj narednoj vegetacijskoj godini do prve sezone (uključujući tu sezonu) u kojoj je dopušten uzgoj krumpira ili rajčica u polju(-ima) koje(-a) je/su u skladu s točkom (a) označeno(-a) kao zaraženo(-a):

                           —

                           sve je strojeve i skladišne prostore na mjestu proizvodnje koji se koriste u proizvodnji krumpira ili rajčica potrebno očistiti i, prema potrebi, dezinificirati uporabom odgovarajuće metode iz točke 3.,

                           —

                           uvode se službene kontrole programa za navodnjavanje i prskanje, uključujući zabranu tih programa, kako bi se spriječilo širenje organizma;

               (d)

               u jedinici proizvodnje zaštićene kulture koja je u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom ii. označena kao zaražena, gdje se uzgojna podloga može u cijelosti zamijeniti,

                           —

                           ne sade se gomolji i biljke krumpira ili druge biljke domaćini organizma, uključujući biljke i sjeme rajčice, osim ako su u dotičnoj jedinici provedene mjere pod službenim nadzorom za uklanjanje organizma i čitavog materijala biljaka domaćina, uključujući barem potpunu zamjenu podloge za uzgoj i čišćenje, a prema potrebi i dezinfekciju predmetne jedinice i sve opreme, nakon čega su nadležna službena tijela odobrila proizvodnju krumpira ili rajčica, i

                           —

                           krumpir se proizvodi od službeno certificiranog sjemenskog krumpira, mini-gomolja ili mikro-biljaka koji potječu iz testiranih izvora,

                           —

                           uvode se službene kontrole programa za navodnjavanje i prskanje, uključujući zabranu tih programa, kako bi se spriječilo širenje organizma.

         4.2.   Unutar sigurnosnog područja, ne dovodeći u pitanje mjere iz točke 4.1., države članice su dužne:

               (a)

               odmah i tijekom barem tri vegetacijske godine od utvrđivanja zaraze:

                           (aa)

                           u slučajevima u kojima je sigurnosno područje određeno u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom iv.,

                                       —

                                       osiguravati da njihova nadležna službena tijela vrše nadzor nad posjedima u kojima se uzgajaju ili skladište gomolji krumpira ili rajčice, ili se s istima rukuje, uključujući objekte u kojima se na temelju ugovora koriste strojevi za proizvodnju krumpira ili rajčica,

                                       —

                                       zahtijevati čišćenje i prema potrebi dezinfekciju strojeva i skladišta na predmetnim posjedima primjenom odgovarajućih metoda iz točke 3.,

                                       —

                                       zahtijevati sadnju samo certificiranog sjemenskog krumpira ili sjemenskog krumpira proizvedenog pod službenim nadzorom za cjelokupnu proizvodnju krumpira u tom području te testiranje nakon vađenja sjemenskog krumpira uzgojenog na mjestima proizvodnje koja su proglašena kao vjerojatno zaražena u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (a) podtočkom iii.,

                                       —

                                       zahtijevati da se na svim posjedima unutar tog područja s proizvedenim sjemenskim krumpirom postupa odvojeno od merkantilnog krumpira,

                                       —

                                       provesti službeno istraživanje u skladu s člankom 2. stavkom 1.,

                           (ab)

                           u slučajevima u kojima su površinske vode proglašene zaraženim u skladu s člankom 5. stavkom 1. točkom (c) podtočkom ii. ili uvrštene među čimbenike mogućeg širenja organizma u skladu s Prilogom V. točkom 2.,

                                       —

                                       provesti godišnje istraživanje u odgovarajućim vremenskim razdobljima, uključujući uzorkovanje površinskih voda i odgovarajućih biljaka domaćina iz porodice Solanaceae iz primjerenih izvora vode i testiranje u skladu sa

                                                   —

                                                   odgovarajućom metodom iz Priloga II. za navedeni biljni materijal, ili

                                                   —

                                                   bilo kojom drugom službeno odobrenom metodom u svim drugim slučajevima,

                                       —

                                       uvesti službene kontrole programa za navodnjavanje i prskanje, uključujući zabranu uporabe vode koja je označena kao zaražena za navodnjavanje i prskanje navedenog biljnog materijala i, prema potrebi, drugih biljaka domaćina organizma kako bi se spriječilo širenje organizma. Tu je zabranu moguće revidirati na temelju rezultata dobivenih navedenim godišnjim istraživanjem,

                                       —

                                       u slučaju kontaminacije otpadnih voda uvesti službene kontrole nad zbrinjavanjem otpada iz pogona za industrijsku preradu ili pakiranje u kojima se rukuje navedenim biljnim materijalom;

               (b)

               prema potrebi izraditi program zamjene svih zaliha sjemenskog krumpira u odgovarajućem vremenskom razdoblju.

         PRILOG VII.
   Službeno odobreni pogoni za zbrinjavanje otpada iz Priloga VI. stavka 1. četvrte alineje sukladni su sljedećim odredbama na način kako bi se izbjegao rizik od širenja organizma:

               i.

               otpad iz prerade krumpira i rajčica (uključujući odbačeni krumpir, koru i rajčice) i sav ostali kruti otpad povezan s krumpirom i rajčicama moraju se ukloniti na sljedeći način:

                           —

                           dubokim zakopavanjem na odlagalištu na kojem ne postoji rizik od istjecanja na poljoprivredna zemljišta ili od doticaja s izvorima vode koji bi se mogli koristiti za navodnjavanje poljoprivrednog zemljišta. Otpad se prevozi izravno na odlagalište u zatvorenom sustavu kako bi se izbjegao rizik od gubitka otpada, ili

                           —

                           spaljivanjem;

               ii.

               otpadne vode iz prerade: iz otpadnih se voda koje sadrže suspendirane krute čestice prije zbrinjavanja takve čestice uklanjaju filtracijom ili taloženjem. Te se krute čestice zbrinjavaju na način opisan u podstavku i.
               Otpadne vode se nakon toga:

                           —

                           prije zbrinjavanja zagrijavaju na temperaturu od najmanje 70 °C tijekom barem 30 minuta, ili

                           —

                           zbrinjavaju na drugi način uz službeno odobrenje i pod službenim nadzorom, na način da nema rizika da otpad dođe u doticaj s poljoprivrednim zemljištem ili izvorima vode koji bi se mogli koristiti za navodnjavanje poljoprivrednog zemljišta. Detalji tih mjera priopćavaju se ostalim državama članicama i Komisiji.