Som barn spillede Ole Thestrup guitar og drømte på det tidspunkt om at blive noget ved musikken, men opgav denne karriere som 25-årig, da han blev optaget på skuespillerskolen ved Aarhus Teater, hvorfra han afsluttede sin skuespilleruddannelse i 1976. Derefter var han en del af det samme teaters ensemble til 1980, men spillede fortsat i flere forestillinger samtidig med, at han også optrådte i en lang række revyer og på andre teatre, herunder Det Kongelige Teater. Blandt forestillingerne, han medvirkede i, var på Aarhus Teater Godspell, Chicago, West Side Story og Bob Dylan Teaterkoncert og på Det Kongelige Teater Hamlet, Don Ranudo, Erasmus Montanus og Jeppe på Bjerget. Fra tv huskes han fra serien Een stor familie (1982-1983) i rollen som den koleriske ejendomsinspektør Erik Jensen og fra tv-julekalenderen Jul på Slottet, der på dette tidspunkt var den dyreste julekalender, DR havde produceret. Thestrup spillede nissefar Magnum, der sammen med familien forsøgte at hjælpe slottets beboere. Valget af Thestrup blev rost i Politiken: "Thestrup var perfekt castet... ...med sin kombination af gammeldansk lune og det karakteristiske dæmonglimt i øjet". I de senere år kunne han ses som politikeren Svend Åge Saltum i Borgen (2010-11) og som Julius Andersen i Badehotellet (2013-14). Thestrup indspillede en lang række film, stort set altid i biroller. Anders Thomas Jensen brugte flere gange Thestrup i biroller, først i den Oscar-vindende kortfilm Valgaften (1998), derefter i spillefilmene Blinkende lygter (2000), De grønne slagtere (2003), Adams æbler (2005) og Mænd og høns (2015). Han medvirkede også i en række børnefilm, blandt andet Gummi Tarzan (1981), Busters verden (1984) og Fakiren fra Bilbao (2004).  Privatliv Thestrup blev født som barn af Christian Svane Thestrup og Ella Thestrup. I 1991 blev han gift med Hanne Marie Knudsen, og han adopterede hendes datter Elise. Thestrup har to døtre fra tidligere ægteskaber.  Ole Thestrup lagde ikke skjul på, at han i mange år havde et alkoholproblem, som kulminerende med, at han den 28. juli 1988 blev sat af et British Airways Boeing 747-fly på vej fra London til Los Angeles på grund af kraftig beruselse. Ole Thestrup var blevet placeret i flyets ikke-ryger-afdeling, og gik på toilettet for at ryge, hvilket satte brandalarmen i gang. Ifølge Ekstra Bladet gik Ole Thestrup "amok og kastede sin drink i hovedet på piloten", da besætningen ville slukke hans cigaret. Kaptajnen på flyet turde ikke flyve videre og nødlandede flyet i Canada. Ved anholdelsen havde Thestrup en promille på 2,33. Ole Thestrup blev idømt tre måneders åbent fængsel i Headingley Correctional Institution i Winnipeg i Canada og afsonede 43 dage. Han modtog efterfølgende et erstatningskrav på 170.000 kroner, som dækkede ekstra brændstof-forbrug og landings- og startudgifter i forbindelse med nødlandingen. I august 1991 kørte Ole Thestrup galt i sin bil mellem Østbirk og Vestbirk, på vej fra Aarhus til Brædstrup, hvor han medvirkede i revyforestillingen Øm til Søs på Hotel Pejsegården. Han blev efterfølgende ført til afhøring og spiritusprøve på Politigården i Horsens. Ole Thestrup fik i februar 1998 en dom for at have kørt spirituskørsel to gange i oktober 1997. Efterfølgende startede han i afvænning efter Minnesotamodellen på behandlingsstedet Minnesota Center Damgaard ved Frederikshavn i sommeren 1998. Efter sin afvænning begyndte han at interessere sig for computere og byggede sin egen, hvilket ifølge Thestrup er skyld i, "at min hjerne regenererede og er helt klar i dag". Blinkende lygter (2000) var den første film Ole Thestrup lavede som ædru, da han efter eget udsagn drak sidste gang den 17. oktober 1997. I 2014 måtte Thestrup melde afbud til en rockmusicalen De Tre Musketerer som følge af hjerteproblemer, og han blev opereret. Hans rolle blev overtaget af Kirsten Lehfeldt. I april 2017 måtte Thestrup melde afbud til forestillingen Røde Orm, som Det Kongelige Teater satte op på Moesgaard Museum i Aarhus. Han skulle have spillet rollen som Harald Blåtand. Over 71.000 havde købt billet, og han blev afløst af Lars Lohmann. Efterfølgende meddelte han på sin facebookkonto, at der var tale om lungekræft,, men i juli forlød det, at behandlingen virkede. Den 2. februar 2018 kl. 01:50 sov Thestrup stille ind i sit hjem på Tuse Næs nær Holbæk. 10. februar blev han bisat fra Hørby Kirke.