Inden hun blev Ukraines første kvindelige premierminister, var hun en af lederne af Den Orange Revolution, der slog igennem i 2005. Mens Viktor Jusjtjenko var præsident blev Timosjenko udnævnt til energiminister, med det overordnede ansvar for Ukraines energiforsyning. Hun fik tilnavnet gasprinsessen fordi hun privatiserede store dele af Ukraines energiforsyning. I 2005 kårede Forbes Magazine Timosjenko som den tredjemest magtfulde kvinde i verden. Hun stillede op til præsidentvalget i 2010, hvor hun tabte til den pro-russiske Viktor Janukovitj med 45.47% mod Janukovitj 49% af stemmerne i anden runde. Hun anklagede efterfølgende Janukovitj for at svindle med resultatet, en anklage hun senere trak tilbage, da hun ikke mente, at man kunne stole på domstolene. Før sin politiske karriere var hun en succesfuld men kontroversiel forretningskvinde. Hun tog en økonomieksamen fra Dnipropetrovsk Universitet 1984, og gik derefter videre til en doktorafhandling i økonomi. Efter arbejde som økonom på en fabrik i Dnipropetrovsk kom hun via videobranchen til naturgasindustrien, hvor hun tjente en formue. Timosjenko blev i oktober 2011 idømt 7 års fængsel for magtmisbrug. Ifølge retten "gik hun ud over sine fuldmagter, da hun som premierminister indgik gaskontrakter med Rusland". Anklagemyndigheden mente kontrakterne skadede Ukraine økonomisk. 2. oktober 2013 krævede Europaparlamentet Timosjenko løsladt. Timosjenko blev løsladt 22. februar 2014 efter flere dage med uro i Ukraine, som kostede 77 mennesker livet. Den formelle begrundelse for løsladelsen var, at de forhold hun var dømt for, nu var afkriminaliseret. Julia Timosjenko blev 2012-13 sammen med den tidligere premierminister Pavlo Lazarenko mistænkt for involvering i mordet på Jevgen Sjtjerban, hans kone Nadia Nikitina og yderligere to personer. De betalte ifølge mistanken for at få dem myrdet.