Knudsen blev født den 22. november 1968 i København, datter af fotograf Ebbe Knudsen og lærerinde Susanne Knudsen. I alderen fem til syv år boede hun med sine forældre i Tanzania, hvor forældrene var frivillige under Mellemfolkeligt Samvirke. Hun er uddannet på Théâtre de l'Ombre i Paris fra 1987 til 1990. Hun blev i begyndelsen af 1990'erne også en del af teatergruppen FÅR302 og har blandt andet medvirket i "Manden og kvinden" på Mungo Park Teater i 1996, "Dage på toppen" på Teater FÅR302 i 1997, "Alice i underverdenen" på Betty Nansen Teatret i 1998 og "Galileis Liv" ligeledes på Betty Nansen Teatret i 1999.  Filmkarriere I 1997 debuterede Knudsen i hovedrollen som Julie i Jonas Elmers Let's get lost. Filmens manuskript var kun en skitse, der krævede, at skuespillerne improviserede deres roller og dialogen. Knudsen har senere udtalt, at hun ikke var særlig god til improvisation og kun accepterede, fordi hun troede, det ville være en let sommerkomedie. Filmen blev et gennembrud i Danmark, og Knudsen modtog både en Robert for årets kvindelige hovedrolle og en Bodil for det samme. Kritikere kaldte Knudsens præstation dominerende. Filmanmelder Kim Skotte skrev i Politiken, at Knudsen havde ramt en ny tone med en "særlig evne til at indfange den moderne kvindes usikkerhed og styrke." Efter sin optræden i 1999 i tv-mysteriet Motello spillede Knudsen hovedrollen i Susanne Biers romantiske komedie Den eneste ene. Filmen blev en af årtiets bedst indtjenende film i Danmark; den markerede en ny retning i moderne, danske, romantiske komedier byggende på Knudsens skuespillerstil. Knudsens skildring af Sus, en kvinde, der bliver gravid med sin mand, der er hende utro, mens hun er forelsket i en anden mand, gav hende igen en Robert og en Bodil for bedste kvindelige hovedrolle. Knudsen vendte tilbage til samarbejdet med Elmer i 2001 i forbindelse med komedien Monas Verden. Lige som i Elmers første film var Knudsen igen forpligtet til at improvisere sin dialog og karakter. Knudsens skildring af Mona, en snerpet revisor, der forsøger at afværge den romantiske forelskelse i en bankrøver, mens de holdes som gidsler, indbragte hende en Bodil-nominering for bedste kvindelige hovedrolle. Juni 2011 modtog Knudsen en af tv-verdenens fineste, internationale priser, da tv-priserne ved den 50. Monte-Carlo Television Festival i Monaco blev overrakt af Prins Albert. Hun blev bedste kvindelige skuespiller i dramaserie og modtog prisen Golden Nymph, som er en kopi af Salmacis Golden Nymph af billedhuggeren François-Joseph Bosio (1768-1845). I 2015 spillede Sidse Babett Knudsen den store birolle i den franske film Hermelinen over for den franske skuespiller Fabrice Luchini. For det modtog hun den franske filmpris César.