Tsetsefluer findes i træbevokset savanne og i krat og skov. De lever af blod fra mennesker og dyr. Hunnerne lægger ikke sine æg på normal vis. Der dannes og befrugtes i stedet ét æg ad gangen som klækkes inde i hunnen, hvor larven lever af kirtelsekreter. Straks efter fødslen forpupper larven sig, og den voksne tsetseflue kommer frem efter fire uger.