Doku Lipidlerini Parafin Kesitlerinde Gümüşleme Yoluyla Demonstrasyonu-A new Silver Impregnation Method that detects the Tissue Lipids in Paraffin Sections - Nüve Forum
Veterinerlik Fakültesi hakkinda Doku Lipidlerini Parafin Kesitlerinde Gümüşleme Yoluyla Demonstrasyonu-A new Silver Impregnation Method that detects the Tissue Lipids in Paraffin Sections ile ilgili bilgiler
Bu çalışmada, doku lipidlerinin parafin kesitlerinde-demonstrasyonunu sağlayan bir gümüş impregnasyon metodu geliştirildi. Bu amaçla, amonyaklı gümüş nitrat solüsyonundan yararlanıldı; Kesin bir sonuca varabilmek için, normal yolla gümüşlenen kestiler, Pyridine ekstraksiyonuna
Doku Lipidlerini Parafin Kesitlerinde Gümüşleme Yoluyla Demonstrasyonu-A new Silver Impregnation Method that detects the Tissue Lipids in Paraffin Sections
Bu çalışmada, doku lipidlerinin parafin kesitlerinde-demonstrasyonunu sağlayan bir gümüş impregnasyon metodu geliştirildi. Bu amaçla, amonyaklı gümüş nitrat solüsyonundan yararlanıldı; Kesin bir sonuca varabilmek için, normal yolla gümüşlenen kestiler, Pyridine ekstraksiyonuna ve Diastase testine tabi tutulduktan sonra gümüşlcnenlcrlc ve'ayrıca, glikojen için Best Carmin, P.A.S. ve Bauer-Feulgen'le boyananlarla karşılaştırıldı. ,
Bouin ve Gendre solüsyonlarının, gümüşlenecek materyal için cn iyi tespit solüsyonları oldukları sonucuna varıldı.
A new silver impregnation method that demonstrates the tissue lipids in paraffin sec¬tions was developed. One percent of ammoniacal silver nitrate solution that also contained 100 mg of Na2C03 per 100 ml of the solution was used.Before impregnating them the sections were,divided into three groups (i.e. untreated, pyridine extracted and diastase pretreated). These were compared to the others stained by Best's Carmine; P.A.S., arid Baurc-Feulgen for glycogen.
Bpüin's and Gendre's.solutipns were the best fixatives for this new technic.
Doku lipidlerinin incelenmesinde genellikle Sudan grubu boyalarla boyanan dondurma kesitleri kullanılır. Bü boya metodlarmın bazı sakıncaları vardır. Bir defa, dondurma kesitleri alındıktan sonra, arta kalan parçaların uzun zaman saklanması olanaksızdır. Halbuki çoğu araştırmalar, kati.bir sonuca varabilmek için, aynı materyali defalarca kullanmayı gerektirir. Bu da ancak, parafinle blok yapılarak bozulmayacak hale getirilmiş meteryal kullanılmakla mümkün olur. Sudan boyalarının bir sakıncası da, bunların lipidlerle birlikte nötür yağları ve yağ asitlerini de boyamalarıdır.
Diğer taraftan, Sudan grubu boyalarla boyanmış preparatlardan tam net ve kontrastlı fotoğraflar çekmek her zaman kolay olmamaktadır.
CÍACCÍO (3), Mc MANUS (10) vc ELFTMAN (5,6) lipidien' parafin kesitlerinde demonstre etmeyi başarmışlardır. Ancak bu araştırmacılar, boya olarak Sudan grubu boyaları kullanmışlardır.
Çeşitli zamanlarda, retikulin ipliklerini HUMASON - LUSH-BAUGH (7) metoduna göre parafin kesitlerde gümüşlerken, bazı durumlarda karaciğer ve böbrek epitellerindc siyah renkli granüllerle karşılaşıldı. Şekil ve lokalizasyon bakımından lipid tabiatında olmaları gerektiği kanısına varılan bu granüllerin etraflı bir şekilde incelenmesine karar verildi ve neticede, lipid demonstrasyonuna yarayan aşağıdaki gümüşleme metodu geliştirildi.
A.ü. Veteriner Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Kürsüsü Doçenti, Ankara, Türkiye
Prof. Dr. Zihni Erençin
A. (J. Veteriner Fakültesi Histoloji ve Emhriyoloji Kürsüsü
Baldassare and ghostgirl like this.
Konu ghostgirl tarafından (14.06.09 saat 13:07 ) değiştirilmiştir..
Araştırmada kedi ve kobaydan alınan karaciğer, böbrek, ince barsak ve kas materyali kullanıldı. Parçalar %ıo formol, formol-al-kol, formol-kalsiyum (BAKER, 1), Elftman (5,6), Bouin vc Gendre solüsyonlarında tespit edildi; alkol serilerinden sonra 3 defa (toplam 48 saat) methylbenzoate-celloidin'de parlatıldı; benzoller ve benzol-parafinden geçirilerek parafin emdirildi ve parafinde bloka alındı. 7 Mikronluk kesitler aşağıdaki şekilde boyandı: .
1)	Xylol'ler, absolu alkoller ve 95'lik alkolden geçirilen kesitler, . 95'lik alkol+ Pyridine (aa)'da 15 dakika tutuldu,
2)	80 ve 70'lik alkoller üzerinden distile suya indirildi,
3)	37°C'ye kadar ısıtılmış distile suda 5 dakika tutuldu,
4)	yine 37°C'yc kadar ısıtılmış, amonyaklı gümüş nitrat eriyiğinde
(etüvde) 60 dakika bırakıldı,
. 5) 100 ml'sine 1 damla amonyak katılmış distile suda (oda ısısında) kısaca çalkalandı,
6) tamponlu formolde 5 dakika süre ile redükte edildi (bu kademede kesitler hafif şekilde siyahlaşırlar. Mikroskopta bakıldığında, açık kahverengine boyanmış sitoplazmada siyah granüller görü¬nür.),
7)	akarsuda 5 dakika yıkandı,
8)	100 ml'sine 5 ml sirke asidi katılmış %0,5'lik altın klorürde, sito-plazmamn rengi açılıncaya kadar (tahminen 10-15 dakika) dekolore edildi,
9)	akarsuda. 5 dakika yıkandı,
10)	%5'lik Sodium thyosulphate'da 5 dakika tespit edildi,
11)	akarsuda 5 dakika yıkandı,
' 12) Kernechtrot'la 10-15 dakika çekirdekler için boyandı,
13)	distile suda çalkalandı,
14)	95'lik alkollerden başlamak suretiyle alkollerden ve Xylol'lerdcn geçirildi,
15)	Kanada balzamı ya da sentetik medyumlarla kapatıldı. Sonuç: Lipid granülleri siyah, çekirdekler pembe.
Amonyakh gümüş nitrat eriyiğinin hazırlanması: 100 ml'lik bir Er-lenmeyer'e 10 ml distile su konur ve bunda 1 g gümüş nitrat eritilir. Erlenmeyer devamlı çalkalanırken eriyik üzerine damla damla amonyak akıtılır. Karışım önce kahverengi bir renk alır; amonyak damlatılmaya devam edilirse, renk açılmaya başlar ve sonunda eriyik tamamen berraklaşır. 2-3 Damla amonyak daha katıldıktan sonra eriyik distile su ile 100 ml'ye tamamlanır ve buna 100 mg kuru sodyum karbonat katılır.
Tamponlu formol hazırlanması: 95 ml distile suya 5 ml formol katılır ve karışımda 25 mg kuru sodyum karbonat eritilir.
Not: Amonyakh gümüş nitrat ve tamponlu formol solüsyonları her defasında taze hazırlanmalıdır.
Bazı gümüşlemeler, tespit edilmiş materyalin BAKER (ı)'ın
lipidler için geliştirdiği Pyridine ekstraksiyon testine tabi tutulmasından sonra yapıldı. Bir kısım kesitler ise, Diastase testi ile glikojen eriu	tildikten sonra gümüşlendi. Diğer bir kısım kesitler de, glikojen de-
monstrasyonu için, Best Carmine, P.A.S. ve Bauer-Feulgen metod-ları ile boyandı. Bu gibi durumlarda, alman seri kesitlerden biri gümüşle, bunu izleyen kesit ise, adı geçen glikojen boyalarından biri ile boyandı.
Gümüşleme ile beliren granüllerin hangi grup yağlardan olduk¬larını anlamak için, Nilblau sulphatc ve Sudanschwarz B (Romeis, paragraf 1069) ve Elftman (Romeis, paragraf 1084) boyamalarından yararlanıldı.
***9632; Kullanılan tespit solüsyonlarından bir k.smı lipid demonstras-yönuna uygun düşmemektedir. Bunlardan %ıo'luk formol, lipidleri iyi tespit etmemektedir. Formol-alkol tespitinden sonra, lipidlerle birlikte glikojen de hafif bir şekilde boyanmaktadır. Lipid derronr-trasyonlarında çok kullanılan formol-kalsiyum tespiti ise, lipid ile birlikte çekirdeklerin de gümüşü tutmalarına yol açmaktadır. Elftman tespitinden sonra lipid granülleri iyi boyanmakta fakat sitopl-azma koyu bir renk almaktadır. Bouin ve Gendre solüsyonları ise mükemmel sonuçlar vermektedir.
Boyamada kullanılan İcapların temizliğine dikkat edildiği sürece metod kaprissiz olarak çalışmaktadır.
Bu gümüşleme metodu ile lipid granülleri yuvarlak sekili ve irili ufaklı olarak belirmektedir. En iri granüllerin çapı 1,5 mikronu geçmemektedir, iri granüllerden bir kısmı, ortaları boş halkalar halinde gözükmektedir.
. .... Karaciğer lopçuklarında .grandiler homojen bir yayılma göster¬mektedir. Lopçukların hem periferleri ve hem de V. centralis'e yakın iç kısımlar aynı miktarda granül taşımaktadır (Şekil ı). Granüllerin çoğunluğuna, Remark kordonlarının, safra yarıklarına yakın iç kısımlarında rastlanmaktadır (Şekil 3); ancak, epitel hücrelerinin peri-fer kısımları da granülden yoksun değildir.
Lipid granüllerinin böbrekteki lokalizasyonu özelliklere sahiptir. Bunların büyük bir çoğunluğuna böbreğin korteksinde rastlanmaktadır. Bunun da hemen hemen tamamını Pars convoluta proximalis'ler taşımaktadır (Şekil 4a). Pars convoluta distalis'lerde (b) ise, lipide çoğu hallerde hiç rastlanmamaktadır. Bulunduğu hallerde ise miktarı, Pars convoluta proximalis'lerdekinden çok daha az olmaktadır. Her iki tür kanalcıkta da granüllerin çoğunluğu, epitel hücrelerinin 'apikal yarımlarında toplanmaktadır. Barsak epitel hücrelerinde de durum aynıdır. Bu hücrelerin de apikal yarımları, özellikle Microvillus'ların altındaki dar bir bölge granülden zengin bulunmaktadır. Buna karşılık iskelet kastelierinde granüller homojen bir yayılma göstermektedir.
Pyridinc ekstraksiyonundan sonra gümüşleme negatif, Diastase testinden sonra ise pozitif sonuçlar vermektedir.
BAKER (ı)'ın bildirdiğine göre, sıcak ***8226; Pyridine ekstraksiyonu, dokulardaki lipidlerin tamamen erimelerine sebep olmaktadır. Gerçekten de bu işlemden sonra gümüşlenen preparatlar her defasında negatif sonuçlar verdi. Buha-karşılık Diastase testi ile glikojeni eritilen kesitler ise, normal yolla gümüşlenenlerde olduğu gibi, pozitif bir reaksiyon gösterdi. Bu sonuçlar ve yukarıda adı geçen yağ boyaları ile yapılan karşılaştırmalar göz önüne alınarak, geliştirdiğimiz gümüşleme metodu ile boyanan granüllerin Hpid tabiatında oldukları kanısına varıldı. MlTCHELL-VVÎSLOCKİ (ıı) ve PRÎTCHARD (12) gümüşleme yoluyla dokulardaki glikojeni demonstre etmişlerdir. Araştırmacılar da bu amaçla amonyaklı gümüş nitrattan yararlanmışlardır. Bu durum, demonstre ettiğimiz granüllerin glikojen partikülleri ola¬bileceğini akla getirebilir. Fakat granüllerin diyastazda erimemeleri, buna karşılık piridin ekstraksiyonuna dayanıksız olmaları; ayrıca miktarca glikojenden daha az bulunmaları, bu ihtimali ortadan kaldırmaktadır.
Çalışma sırasında, adi geçen granüllerin glikojen tabiatında olmadığım doğrulayan diğer bir hususla daha karşılaşıldı: Araştırmada kullanılan kobavlardan bir tanesinin karaciğerinde glikojen özel bir lokalizasyon gösteriyordu. Diğerlerinden farklı olarak bu hayvanın karaciğerinde glikojene, lopçukların sadece iç kısımlarında, V. cen-tralis dolaylarında rastlanıyordu (Şekil 2); perifer kısımları ise hiç glikojen taşımıyordu. P.A.S., Best carmine ve Bauer-Feulgcn metod-ları daima bu durumu teyit ediyordu. Bunun üzerine, adı geçen materyalden yapılan seri kesitlerden biri Bauer-Fculgen metoduyla glikojen için boyandı (Şekil 2), bunu izleyen diğeri ise, lipid için gümüşlendi (Şekil I). Gümüşlenen kesitlerde boyanan granüller, lopçuk-, ların her tarafında eşit bir yayılma gösterdi; buna karşılık diğer ke¬sitlerde glikojene sadece lopçukların iç kısımlarında rastlandı. Bu durum da, gümüşleme ile beliren granüllerin glikojen olmadığım göstermektedir.
MÍTCHELL-WÍSLOCKÍ (11) ve PRÎTCHARD (12), gümüşleme ile glikojen demonstrasyonu sırasında kesitleri Potassium permanganate ya da ehromie acid gibi oksidan maddelerle oksitle-mişlerdir Kendi metodumuzla yaptığımız gümüşlemelerde, periyodik ve kromik asitle oksidasyondan sonra, lipid granülleri ile birlikte, glikojen partiküllerinin de az çok belirdiğini gördük. Bu demektir ki' oksidasyondan sonra gümüşlemede glikojen ve lipid maddeleri birlikte boyanmaktadır. Bu sakıncadan ötürü metodumuz oksitleme kademesini kapsamamaktadır. LUDWÍG (9), MÎTCHELL-YVİS-LOCKİ (11) ve PRÎTCHARD (12) mctodlarmın spesifitesi üzerinde durmuş ve bu metodların glikojen için spesifik olmadıklarım, diğer hücre unsurlarının da gümüşü tuttuklarını bildirmiş, fakat bu 'unsurların neler olduklarını belirtmemiştir. Araştırmacıya göre, diyastaz testinden sonra, adı geçen metodlara göre gümüşlenen preparatlarda granüller azalmayıp tersine artmaktadırlar. Bu da, bu metodlarla boyanan unsurların sadece glikojen partikülleri olmadıklarını göstermektedir. Gerçekten de MİTCHELL-WlSLOCKl'nin çalışmasındaki 1 nolu resmin gösterdiği granüller, bizim fotoğraflarımızdaki lipid granüllerine çok benzemektedir.
Lipid gümüşlemesinde Pyridine'in oynadığı rol şöyle yorumlanabilir: LÎPP (8)'e göre, gümüşlemelerde renk husulü, şekilli unsurların gümüş partiküllerini yüzeylerinde tutmalarına bağlıdır. Yüzeylerinde Por'lar taşıyan unsurlar gümüşü daha kolaylıkla tutarlar. Pyridine'in bir yağ solventi olduğu bilinmektedir. Muhtemeldir ki bu madde, tespit edilmiş dokularda kısa sürede (15 dakika) yağ granüllerinin yüzeylerini çok hafif şekilde eriterek pürüzlendirmekte, bu da granüllerin gümüşü tutmalarını kolaylaştırmaktadır.
Geliştirdiğimiz metodun en iyi sonuçları Bouin ve Gendre tes¬pit solüsyonlarından sonra vermesinin nedenine gelince: BRESLAUGABE (2, s. 5), SPANNHOF (16, s. 18) ve ROMEÎS (15, s. 270) gibi araştırmacılar kitaplarında, pikrik asit taşıyan solüsyonların (Bouin, Gendre vs.), glikojen için ideal tespit solüsyonları olduklarını bildirmektedirler. Bu bakımdan da, demonstre ettiğimiz materyalin glikojen olabileceği akla gelebilir. Ancak CONTÍ et al. (4) ve RÎCCÎ (13, 14)'nin çalışmalarından da anlaşılacağı gibi, pikrik asit taşıyan tespit solüsyonları sadece glikojeni değil, yağları ve proteinleri de ideal bir şekilde tespit etmektedirler. Nitekim adı geçen araştırmacılar, lipid eriten anzimlerden çok zengin olan Pancreas'da lipidleri en iyi bir şekilde Bouin solüsyonu ile tespit edebildiklerini bildirmektedir. Araştırmacıların bulgularına göre, iyi bir lipid tespit solüsyonu olarak bilinen BAKER (l)'in formol-kalsiyum solüsyonu bile, adı geçen dokuda Bouin kadar iyi sonuç vermemektedir. RtCCİ (14) bunun sebebini, Bouin'de bulunan asit pikrik'in antilipaz etkisine bağlamaktadır. Araştırmacıya göre asit pikrik, sitoplazmadaki proteinleri denatürc ederek, bunların yağ damlaları etrafında, yağ anzimlerinden etkilenmeyen bir kabuk meydana getirmelerine yol açmakta, bu da yağların prezervasyonunu sağlamaktadır. Bizim görüşümüz de bu merkezdedir. Esasen asit pikriğin kuvvetli bir protein tespit maddesi olduğu bilinen bir husustur.
Periyodik asitle oksitlenmeyi de kapsayan HUMASON-LUSH-BAUGH (7) metodu, lipid granüllerini ender durumlarda ve seyrek bir şekilde meydana çıkarmaktadır. Bu metodla ayrıca muko-polisakkaridler ve açık bir tonda da olsa, glikojen de boyanmaktadır.
Geliştirdiğimiz metod ise, sadece lipid granüllerini demonstre etmektedir. Metodun tek sakıncası, hemen bütün gümüşleme metodlarında olduğu gibi, retikulin ipliklerini de boyamasındadır. Bu bakımdan metod, bağdokuların ve düz kastellerinin lipid yönünden incelenmelerine pek uygun düşmemektedir.
7980.pdf (693,2 KB (Kilobyte), 25x kez indirilmiştir)
demonstrasyonu-a, detects, doku, gümüşleme, impregnation, kesitlerinde, lipidlerini, lipids, method, paraffin, parafin, sections, silver, tissue, yoluyla