The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia | Protocol (Translated to Turkish)
Kolon-26 Karsinoma Tümör taşıyan Kanser Kaşeksi Araştırmaları Modeli Olarak Fare
Kas erimesi, kanser, sepsis, karaciğer, siroz, kalp ve böbrek yetmezliği, kronik obstrüktif akciğer hastalığı ve AİDS gibi çeşitli klinik durumlardan ciddi bir komplikasyondur. Özelde, kas kaybı kanseri 1 hastalarının en az% 50 açıktır. Bağlı ve / veya iskelet kası proteolitik sistemlerinin aşırı aktivasyonu artan protein yıkımı, kanser sonuçları iskelet kas kaybı protein sentezini 6 düşmüştür. Lipoliz, yağ dokusunun azalmasına yol da görülmektedir. Klinik olarak, kaşeksi düşük kaliteli ve yaşam boyu ile bağlantılıdır ve 20 ölüm nedeni olduğu tahmin edilmektedir - kanser hastalarında 7% 30. mümkün olduğunca yakından insan hastalığı andıran deneysel modellerin kullanımı yararlı olacaktır. Optimal bir hayvan modeli yüksek üretilebilirliği, hem de farklı tedaviler arasında, sınırlı parazit ve öngörülemeyen faktörler ile karakterize edilirgenellikle klinik durum 8 ile ilişkili diyet, cinsiyet ve genetik arka plan. yeni bir yöntem kanser geliştirme konusunda şüpheli genetik olarak tadil edilmiş farelerin kullanımı her ne kadar ana kadar, kanser kaşeksi, kanser hücreleri veya karsinojenlerin enjeksiyon nakli ile karakterize edilen, hayvan modellerinde özellikle incelenmiştir.
C26 karsinoma taşıyan fareler, kanser kaşeksisi 2,5 arasında da iyi karakterize edilmiş ve yaygın olarak kullanılan bir modeli temsil (aynı zamanda kolon 26 ve adenokarsinom olarak da adlandırılır). Özellikle gelişmiş yağ ve protein katabolizması 9 vücuda ve kas kilo kaybı C26 tümör sonuçlarının büyümesi. Genel olarak, toplam vücut ağırlığına karşı% 10 tümör ağırlığı iskelet kası ağırlıkça% 20-25 arasında bir azalma ve yağ 3,10 daha büyük bir tükenmesi ile ilişkilidir. Hepatomegali, splenomegali, aynı zamanda, akut faz tepkisinin aktivasyonunun ve pro-infla yükselmesi ile birlikte, tümör büyümesi ile gözlenirmmatory sitokin düzeyleri 3,11. Bunlar arasında, çok iyi, IL-6, bu sitokin muhtemelen kaşeksi 12 yalnızca indükleyicisi olmadığı halde, C2-6 modelinde kas yıkımı aracılık çok önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Yükselmiş IL-6, JAK / STAT3 sentezleme yolu aktivasyonu yoluyla, kas atrofisine yol açan ve bu transkripsiyon faktörünün, kas 3,4 israf engelleyebilir.
C26-kaynaklı kas erimesi esnasında, kas atrofi birçok koşullarında olduğu gibi, kas kütlesi değil hücre ölümü veya liflerin 13 zarara, büyük ölçüde kas lifleri arasında kas protein içeriği düşüşleri dolayısıyla kaybolur. C26 kaşeksi, daha küçük enine kesit alanlara doğru bir kayma glikolitik ve oksidatif elyaf 2 hem de görülmektedir. Bu, aynı zamanda, indirgenmiş kas gücü 5 ile tutarlıdır. Dünya çapında birçok grup kanser CAC kas güçsüzlüğü yeni arabulucular veya klinik olarak anlamlı ilaç keşfetmek için C26 modelinin avantajlarından almışHexia. Bununla birlikte, bu modelin kullanımı için bir çok farklı işlemler elde edilen verilerin tutarlılığı kaygılara ve çeşitli deneysel koşullar altında yeniden üretilebilirlik engelleri poz bildirilmiştir. Burada standart ve tekrarlanabilir verileri verir kanser kaşeksi çalışma için bu modelin tipik kullanımı bildirmektedir.
Etik Beyanı: Thomas Jefferson Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri ve Indiana Üniversitesi Tıp Okulu tarafından kabul edildi tarif edilen tüm çalışmalar.
1. C26 Hücre Büyümesi ve Hazırlık
Tam büyüme ortamı C26 kolorektal kanser hücreleri (Ohio Devlet Üniversitesi Tıp Merkezi (OSUMC)) elde edilir ve hazırlanması (örneğin, yüksek glukoz Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM)% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS ihtiva eden), 1 mM sodyum piruvat,% 1 glutamin ve% 1 streptomisin / penisilin).
Not: iyi arası deney tekrarlanabilirlik izin vermek için, mümkün olduğu kadar düşük bir geçit C26 hücrelerinin kullanımı tercih edilir.
Tam büyüme ortamı ile şişelerinde 50,000 hücre / cm2 plaka için ticari olarak temin edilebilen hücre sayacını kullanın. Alt konfluent kadar CO2 37 ° C'de nemli bir atmosferde inkübe ve% 5. prev yüksek yoğunlukta onları kültüre kaçınınent farklılaşma ve hücre fenotipleri sürüklenen.
İlk geçişten sonra, plaka yeterli hücre hayvan planlanan sayıda implant edilmek üzere. Hücre implantasyonu gününden, cm2 başına 0.02 mi 0.25% tripsin-EDTA çözeltisi ile tripsinizasyon ile hücreleri ayırmak tripsin ml'si başına taze ortam, en az 3 ml ekleyerek tripsin nötralize hücre / ml hücre konsantrasyonunu saptamak ve steril PBS içinde deney (fare başına 1 x 10 6 hücre) için gerekli olan hücre sayısını yeniden süspanse edin.
NOT: yoğunluk / cm 2 yaklaşık 500.000 hücre olduğunda C26 hücreleri confluency ulaşır.
gruba yetişkin CD2F1 fareler (en az 8 hafta) Rastgele (genellikle kontrol eden ve tümör taşıyıcılar) en az n = 6, grup başına olan.
Not: C26 tümörleri hem de Balb / c farelerde büyür. Ancak, bizim deneyime dayalı, CD2F1 fareler bu özel tümör modeli için daha çok yönlü ve ekonomik ana temsil etmektedir. Dahası,klinik ve 14-16, C26 kaşeksi cevaben cinsiyet farklılıkları da 17 görülebilir israf kanserle ilişkili kas diğer deneysel modellerde bildirilen bulgulara benzer (aynı zamanda bakınız Tablo 1).
Teneffüs (oksijen% 3) ile izofluran kullanarak fare anestezisi. münhasıran tümör aşılama gerçekleştirmek için gerekli süre anestezi altında hayvan koruyun. Emin fare vücut ısı kaybını önlemek için ısıtılmış bir pad üzerinde durduğundan emin olun. Tümör enjeksiyon işlemine başlamadan önce, yavaşça arka ayak kısma doğru anesthetization onaylayın.
NOT: Bu prosedür (genellikle birkaç saniye) süresi nedeniyle, veteriner göz merhemi kullanılması gerekli değildir. Aynı nedenle, sham operasyonu geçiren kontrol hayvanları kilo beklenmemektedir.
hızlı t ihtiva eden çözeltinin 250 ul enjekte 26-gauge iğne ile steril 1 ml insülin şırıngası kullanılarakumor deri altından ve intrascapularly fare yağ yastığı hücreleri.
Not: Kontrol hayvanları intrascapularly yağ yastığı steril tuz çözeltisi 250 ul alır.
kendi kafesine hayvan geri yerleştirin. o nazik manipülasyon cevap verebilecek ve bir doğrulma refleksini kazanmış kadar doğrudan doğruya en az bir kez her 15 dakikada fare gözlemlemek.
NOT: gözetimsiz fare bırakın ve sağlam bir alt tabaka içeren bir sıcak kurtarma kafesine tutmayın. tamamen anestezi kurtarıldı kadar Dahası, hayvan odasına fare dönmez. Genellikle, fareler araştırmacı bireysel gıda alımını değerlendirmeyi amaçlar sürece ayrı muhafaza edilmesi gerekmez. Bu durumda ve otomatik metabolik kafeslerinin kullanımı değil ise, gıda tüketimi manuel kayıt muhtemelen günlük ve her gün aynı saatte, yapılmalıdır.
günlük fareler kontrol edin ve onların vücut ağırlıklarını kaydeder.
NOT: vücut kondisyon skoru Kayıt veev kafes davranışları tedavi çalışmaları 18 için yararlıdır kaşeksi ve hastalık davranışı, dereceleri ayırt edebilir.
3. Ötanazi ve Kan Alma
kontrollere göre, tümör ana vücut ağırlığı kaybı% 5,% 10 veya% 15, başlangıç ​​vücut ağırlıkları ile karşılaştırıldığında (hafif, orta ve şiddetli kaşeksi, sırasıyla) ulaştığı zaman fareler euthanize.
NOT: Bir tüm gruplar ötenazi bu süre sonra% 10'luk bir ağırlık kaybı, ulaşana kadar tipik bir deney gerçekleştirilecektir. Vücut ağırlığı kaybı tümör dahil vücut ağırlığı ölçülerek değerlendirilir.
izofluran genel anestezi (oksijen% 3) altında fare yerleştirin. (- 1.5 ml yaklaşık 1) kalp ponksiyonu yoluyla kan çizin.
K 2 -EDTA (18 mg), boş tüpler kan toplayın ve buz üzerine koyun. Santrifüj, kan (4 ° C'de 15 dakika boyunca 2,000 x g) ve plazma / serum toplanır.
c vasıtasıyla fare Euthanizeervical çıkık. Doku eksizyon ve organ koleksiyonu geçin.
4. Doku ve Organ Eksizyon
Not: biyokimyasal ve moleküler biyoloji deneylerinde dokuların kullanımı, her bir organ ve doku ağırlığında ve önceden etiketlenmiş cryotubes hemen içine bir parça yer planı. Yapış -80 ° C sıvı nitrojen ve mağaza donma.
kürk doku örnekleri kirlenmesini önlemek amacıyla, tüm vücut üzerinde% 70 etanol sprey.
Bir yatar pozisyonda bir diseksiyon yatakta fare yerleştirin ve yükseltilmiş bir büret kelepçe ayak takarak dikey bir uzuv uzatmak.
Dumont forseps ile alt ekstremite cilt tutun ve yavaşça alt ekstremitenin yatan kas karınlarını açığa, deri ve fasya kaldırmak için kavisli ince makas kullanın.
lateral ve medial arka femur üzerinde kondillerin ve onun ekleme onun kökeni ile arka alt ekstremite üzerinde gastroknemius kas tanımlamakkalkaneal tendonun aracılığıyla kalkaneus.
gastroknemius kalkaneal tendonun kesmek için devam edin. Dumont forseps ile gastroknemius distal ucunu tutun ve kökeni doğru kas karın çekin. makas kullanarak, femur mümkün olduğunca yakın orijinde kas kesti. Bir tabak kas yerleştirin. hemen tartılır ve sıvı azot içinde bir tüpün içinde dondurma.
NOT: Gastroknemius birlikte soleus kas tüketim için değil emin olun. Bu durum oluşursa, dikkatli hafifçe forseps ile çekerek soleus çıkartın.
belirlemek ve tibia ve distal tendon yoluyla medial çivi onun ekleme anterolateral yüzeyinde kendi kökeninden tibialis anterior kas tüketim geçin.
kaldıraç olması için, işaret parmağı ve başparmak ile haneleri tutarak ayak tutun. hemen tibialis yüzeysel uzak tendon altında Dumont forseps ucu takın ve bu bl o forseps hareketunt tarafı olan bağ dokusu tibialis kasının göbek ayırmak için kullanılabilir.
ince kavisli makas kullanarak uzak tendon kesilmiş ve ardından tibia mümkün olduğunca yakın, kökeni kas kesti.
diyaframın hemen üstünde kesi durdurma, hipogastrik bölgede başlayan sagittal bir kesi yapılması ve epigastrik bölgeye superior hareket ettirerek karın boşluğuna açın.
NOT: kesi derinliği sadece karın kas duvarı ve altta yatan periton fasya ihlal için yeterli olmalıdır.
Dikkatle künt uçlu forseps ile iyice kavrayarak karaciğer kaldırmak ve boşluğa karaciğer uygun herhangi bir kan damarlarını veya bağ dokusu uzak teşrih ince kavisli makas kullanın. arkasında herhangi bir lobları bırakmamaya özen gösterin. Tartın ve sıvı azot içinde bir tüpün içinde karaciğer dondurma ek.
, Künt uçlu forseps kullanarak bağırsak uzaklaşmaya ve daha sonra kaldırmak nazikçe ortaya çıkarmak vedalak. künt uçlu forseps ile yavaşça dalak kavrayın ve boşluğa dalağı yapışan bağ dokusu veya kan damarlarını uzak teşrih ince kavisli makas arka veya künt tarafını kullanın. Tartın ve sıvı azot içinde bir tüpün içinde dondurma ek.
(Kadınlarda) (erkeklerde) epididime bitişik veya rahim gonadal yağ yastıkları, tanımlayın. Yavaşça künt uçlu forseps ile epididimal yağ yastığı kavramak ve boşluktan doku çekin. ince kavisli makas kullanarak, yağ yastığı bağlı olabilecek gonadal doku kesip. yağ yastığı tartılır ve sıvı azot içinde bir tüp içinde dondurmak oturtun.
Not: Genel olarak, bu yağ dokusu farelerde toplam vücut yağ kütlesinin Örnek olarak kabul edilir ve kaşeksi ağırlığında bir şekilde azalacaktır. Diğer yağ pedleri benzer şekilde tanımlanmış, parçalara ayrılır, ayrılmış ve tartılır olabilir.
hayvanın göğüs açmak için kavisli ince makas kullanın. st her iki lateral sınırları bağlı kaburga kesipernum. sternum kaldırın. forseps iki çift kullanarak, göğüs kafesinin her tarafını kavramak ve göğüs boşluğu açmak için yanal her tarafı çekin.
Ince forseps ile kalbi çekin. Dikkatle sol atriyum aort kesilmesinin kavisli ince makas ile kalbi tüketim. ince bazı emici kağıt karşı blot herhangi bir kalıntı kan organı boşaltmak emin olun. Tartın ve sıvı azot içinde bir tüpün içinde dondurma ek.
5. Kas Dondurma ve Montaj
sıvı azot içine izopentan ihtiva eden küçük bir plastik kap (50 mi) alt yarısında bırakın. biraz ağdalı hale gelir ve bir katı beyaz laminant astar beher içini oluşturduğunda izopentan kullanıma hazır (sıcaklık: -160 ° C).
NOT: Her zaman bronz veya alüminyum el aletleri Kıvılcım çıkarmayan kullanın. Ürün buharı solumaktan kaçının. Yeterli havalandırma ile kullanın. Bir dökülme ile uğraşan ve havalandırma imkansız ya da impractic isediğerleri, uygun bir maske giyin.
izopentan içine kısaca (10 sn) batırarak bir ayna (mantar) bazı gömme orta dondurun.
Liflerin yönünü muhafaza etmek ve kesitleri için izin vermek için, mantar göre dikine tendon tarafından tutarak kas (örn., Tibialis veya gastroknemius) anlaştım.
Dikkatle dondurulmuş gömme ortamı üstünde taze kas uç kısmını yerleştirin.
NOT: kas sopa olacak. Tamamen gömme orta ile kas çevreleyen DEĞİL önemlidir. Kesit alanı daha sonraki tespiti için dikey bir yönlendirme sağlamak için de önemlidir.
izopentan banyoya bağlı kas ile mandreni (- numune boyutu ve bileşimine bağlı olarak, 15 saniye zamanki donma süresi 7) batırın.
NOT: dondurma çözeltisi daldırma tamamen numune dondurmak için gerekli olandan daha fazla sürmemelidir. çok uzun olacak frac Donmaçok kısa bir süre buz kristali oluşumuna neden olurken, doku bloğu Ture. İyi dondurulmuş numune kireçli beyaz olacaktır.
numune dondurulduktan sonra, küçük bir plastik torba veya numune tüpü (50 mi) içine yerleştirin ve hemen -80 ° C'de ya da sıvı nitrojen içinde derin dondurucuda saklayın.
Ham Verilerin 6. Analizi
(FBW), farelerin boyutu varyasyonlarının kontrol nihai vücut ağırlığı normalize etmek için; Tümör olmayan bir vücut ağırlığı; ve karkas, organ ve başlangıçtaki vücut ağırlığının (IBW) göre (gram olarak ifade edilmiştir) doku ağırlığı ve "ağırlık / 100 mg IBW" olarak ifade eder.
NOT: Alternatif olarak, bazı araştırmacılar tibia uzunluğu kas kütlesi normalleştirmek.
Veri analizi için bir yazılım kullanın. normalize ağırlıkları ortalama ve SD bulun. kontrolleri ve C26 taşıyan fareler arasında Student t-testi ile istatistiksel analiz.
NOT: Sonuçlar IBW (vücuda göre sunulabilirve tümör içermeyen) FBW, tümör, organ ve doku ağırlıkları.
7. Kas Kesit
etrafında -23 ° C'ye kadar kriyostat iç odasının çalışma sıcaklığını ayarlamak.
çalışma sıcaklığı (birkaç saat yeterli olmalıdır) de alışmak için (daha önce -80 ° C'de saklanan) numune izin verin.
Kesme birden örneğinin (tercihen tibialis anterior veya gastroknemius kas) ve cam slaytlar bunları toplamak 8-mikron kalınlığında kesitler.
NOT: kas orta göbek bölgesinde bölümü kesin. Ayrıca, doğruluk sağlamak amacıyla, montaj eksenine dik kesitler halinde kesilmiştir.
Kriyostat odasının içine cam slaytlar tutun. Amaç IF / İHK çalışmaları veya enzimatik boyama gerçekleştirmek için ise onları çözülme izin vermeyin.
Daha fazla analiz için -80 ° C'de slaytlar saklayın.
Laminin immünfloresans tarafından Myofiber Boyutu 8. Değerlendirme (Alternatif 1)
19 belirler. Kas bölümden H & E boyama morfolojisi analizi için değerli ve uygun bir yöntem temsil etmesine rağmen, bir IF yaklaşımı 14 kullanımı önemli ölçüde daha hızlı ve H & E-bazlı yöntemine göre mütevazi daha doğrudur. H & E yöntemleri aşağıda tarif edilmiştir.
kriyostat veya -80 ° C depolama ya da doku bölümleri çıkarın ve oda sıcaklığına dengelenmeye olanak (yaklaşık 5-10 dakika).
Not: farede ortaya çıkartılan primer antikorlar ile ilişkili spesifik olmayan etkileşimleri önlemek için, ya bu kullanımda, antikorlar, başka bir türden yükseltilmiş ya da ticari olarak temin edilebilen "fare on fare" immunodeteksiyon kiti kullanmak tavsiye edilir.
Ön serin bölümleri daldırınEd metanol (-20 ° C) 10 dakika.
5 dakika boyunca PBS 1X oda sıcaklığında bölümler yıkayın.
PBS çıkarın ve slayt bölümlerini kuşatmak için immünohistokimyasal uygulamalar için bir kalem kullanın. herhangi bir noktada bölümleri tamamen kuru izin vermeyin.
Oda sıcaklığında 1 saat boyunca bölümleri üzerine - (% 8 FBS PBS içinde veya PBS içinde% 5 keçi serumu 5), uygun bir bloke edici tampon uygulanır.
engelleme tamponu çıkarın.
nemli bir oda içinde bir tavşan anti-laminin (1:30) ya da oda sıcaklığında 2 saat boyunca bölümlere blokaj tamponunda, bir fare anti-distrofin (1:30) birincil antikor (ya da gece boyunca 4 ° C'de) ya da uygulanır.
5 dakika boyunca 1 x PBS ile bölümleri yıkayın.
Yıkama tamponu çıkarın ve 5 dakika boyunca 1 x PBS içinde tekrar bölümleri yıkayın.
Yıkama tamponu çıkarın ve uygun bir fluorescent sekonder antikor uygulayın: oda sıcaklığında 1 saat boyunca nemli bir oda içinde bölümlere (1 bloke edici tampon içinde 1,000).
ikincil antikor çıkarın ve 5 için 1x PBS ile bölümleri yıkayınMin.
Yıkama tamponu çıkarın ve 5 dakika boyunca 1 x PBS ile yıkama tekrarlayın. Yıkama tamponunu çıkarın ve su-esaslı bir ortamı kullanılarak bir kapak camı ile bölümleri kapsamaktadır.
lekeli bölümün dijital görüntüleri kullanarak kas morfolojik özelliklerini belirlemek. Bunu yapmak için, bir ters floresan ışık mikroskobu kullanmak IF bölümler (10X veya 20X büyütme hedefi uygun), bir dijital kamera ve görüntü yakalama yazılımı ile birlikte. Her dijital görüntüde bir ölçek çubuğu yerleştirin - CSA ölçümünü kolaylaştırmak için (20 30 rastgele alanlar her kas bölümü için tavsiye edilir). Görüntüler ImageJ programı kullanarak görüntü analiz yazılımı ile uyumlu olacak şekilde TIF formatında kaydedilmiş olmalıdır.
Endomizyumun 20 floresan ikincil antikor varlığı sayesinde kasılma dokusu (myofiber boyutu) gelen bağ dokusu ayırt etmek için bir ImageJ makro kullanın.
NOT: Makro ve talimatlar auth edinilebilirors, Richard Lieber ve Shannon Bremner.
Masaüstünde simgesini çift tıklatarak ImageJ programını açın.
"Eklentiler" sekmesini kez tıklayarak CSA makro yükleyin. bir kez tıklayarak "Install" seçeneğini seçmek için imleci aşağı hareket ettirin.
"Aç" a tıklayın sonra kaydedilen klasörden seçerek kesit makro yükleyin ve.
Makro açıldıktan sonra, ImageJ araç çubuğundan "Dosya" ve ardından "Aç" linkine tıklayarak ölçek çubuğu içeren histolojik görüntüyü açmak.
Görüntü açıldığında, düz çizgi ile ikonuna tıklayarak ImageJ programında "düz çizgi aracını" seçeneğini seçin.
"Düz çizgi aracı" seçildikten sonra, ölçek çubuğunun en soldaki ucunda bir kez tıklayın ve sonra ölçek çubuğunun en sağ ucunda bir kez tıklayın. Doğru yapıldığı zaman, ölçek çubuğunda üst üste sarı çizgi olmalıdır.
yello emin yapmaw hattı hala ölçek çubuğunda kaplanır, bir kez tıklayarak ImageJ araç çubuğundan "Analiz" sekmesini seçin.
"Analiz" sekmesinde, aşağı imleci ve bir kez tıklayarak "set ölçek" seçeneğini seçin.
"Set ölçek" penceresinde, kutu "piksel uzaklığı" değerini değiştirmek ETMEYİN. "Bilinen mesafe" kutusuna ölçek çubuğunun bilinen mesafeyi girin. Ölçek çubuğu birimlerinin (yani, mikrometre = um) ile haberleşmek için "Birim uzunluğu" kutusuna birimlerini değiştirin. Son olarak, bir kez "Global" sol kutusuna tıklayarak "küresel" seçeneğini seçin.
"Set ölçek" penceresini kapatın.
İlk resim açın klavyede "O" düğmesine basarak ölçülecek. . Kullanıcı, kaydedilen klasörden ölçülecek bulmak ve görüntüyü seçmek için izin veren bir pencere pop-up gözlemlemek tıklatarak bir kez tıklayarak ve resmi seçin "Aç."
<li> açıldıktan sonra, bir pencere CSA ölçümleri için ve dairesellik için kabul edilebilir aralığın seçimi için görünmelidir.
NOT: Bu ayarlar genellikle varsayılan değerlerine bırakılır. kimse bu ayarları değiştirmek isterse Ancak deneyde ölçülecek her ardışık görüntü için aynı değerleri tutmak için emin olun.
CSA aralığı ve daireselliği ayarladıktan sonra, bir "Eşik" penceresinde kırmızı piksel kaplı görüntüyü görüyoruz. kas lifleri doğru kırmızı piksel ile dolana kadar "Eşik" penceresindeki çubukları kullanarak görüntünün eşiğini ayarlayın.
NOT: birbirlerine değmeyen liflerin büyük sayısını elde etmek için deneyin; lifler dokunmadan ise, onlar aşağı düzenlenebilir gerekir büyük bir lif olarak ölçülecektir.
eşik ayarladıktan sonra, kas liflerini ölçmek için klavyedeki "1" tuşuna basınız.
sarı bir çizgi ile bireysel kas lifleri daire içine alın.Görüntünün üzerinde hareket ve eserler veya program tarafından seçilmiştir çift lifleri kaldırın. Bunu yapmak için, onları bir kez tıklayarak lifler olmayan yapıları seçin ve sonra klavyede "D" tuşuna basınız. Bu ölçümlerden bunları silecektir.
Seçin ve ölçümleri kopyalama "Ölçüm değeri penceresinde," ve daha fazla analiz için bir elektronik tabloya yapıştırın.
Not: elde edilen değerler, aynı zamanda, genel olarak, tümör büyümesinin küçük kas lifleri doğru bir kayma teşvik olup olmadığını belirlemek için bir parametre temsil elyaf tevzi analizi, değerlendirmek için de kullanılabilir.
pencerelerin sol üst köşesindeki "X" tıklayarak ImageJ tüm açık pencereleri kapatın.
8.29 - yeni bir resim açın "O" tuşuna basarak ve adımları 8.24 tekrarlayarak ölçülecek.
Değerlendirme H & E Lekeli Bölüm gelen Myofiber Boyutu 9. (Alternatif 2)
cam yerleştirinCoplin kavanoz içine slaytlar 8 dakika Harris hematoksilin süzülür içeren.
Not: Daha az yoğun bir boyama isteniyorsa Alternatif olarak, Mayer hematoksilin kullanılabilir.
deiyonize su slaytlar durulayın.
En fazla 5 dakika süreyle musluk suyunda slaytlar batırın.
Hızla deiyonize su ile durulayın ve ardından en az 2 dakika süreyle süzülmüş% 1 eozin çözüm onları kuluçkaya yatmaktadır.
Not: daha yoğun bir leke isteniyorsa, 1 ekleyin - eozin çözeltisine asetik asit 2 damla (% 0.01 veya daha az).
dehidrasyon adımları başlayın. en az 1 dakika boyunca% 70 etanol içinde kayar durulayın.
1 dakika boyunca% 90 etanol slaytlar batırın.
2 dakika boyunca% 100 etanol içinde kayar batırın.
2 dakika için ksilen slaytlar batırın. 2 dakika daha taze ksilen içeren başka Copley kavanoza slaytlar taşıyın.
NOT: kaplandı kadar (artık 1 saat daha) Ksilen slaytlar tutun.
coversli yerleştirinPermount veya seçtiğiniz bir Ksilen merkezli montaj ortam kullanılarak kas bölümlerinde ps.
20X büyütme ile mikroskop altında H & E boyalı cam slaytlar uyun ve tüm kas kesit alanı resimlerini kazanır. parlak ışık mikroskobu, dijital kamera ve görüntü yakalama yazılımını kullanarak görüntüleri elde edebilir.
Not: aynı büyütülerek çekilmiş, bir mikrometre bir ölçek çubuğu ya da görüntü varlığı CSA belirlemek için gerekli olacaktır. Yukarıdaki gibi, kayıt en az 20 - Her kas bölümü için 30 rasgele alanlar.
ImageJ yazılımı kullanarak myofiber boyutunu değerlendirin. Her dijital görüntü açın. Yukarıdaki ölçeği ayarlayın. Tablet giriş cihazı ve kalem ile hızlı giriş için, bir fare ile lif çevresi izleme, serbest seçim aracı kullanarak kas başına en az 1,500-2,000 kas lifleri ölçün ya da.
10. Veri Toplama ve Analizi
Kas lifi boyutunu oluşturmak amacıyla, ortalama lif "alanını değerlendirmek."Alan ve Feret çapı hem de dahil olmak üzere her kas, elde edilen ölçümler için araçları ve SD hesaplayın. Buna ek olarak, sırayla deneysel ayar ya küçük veya daha büyük kas lifleri doğru bir kayma ile ilişkili olup olmadığını değerlendirmek için, analiz" lif dağılımı . "
iki grup için eşsiz T-testi yapılarak sonucun önemini değerlendirir. C26 fareler grubunun ve kontrol grubu için elde edilen değerler arasındaki oranları belirler. araçlar SD ve fiber boyutlarda vardiya gösteren amaçlayan frekans dağılımı / histogram raporlama bir grafik değerleri çizilir.
(- 5 gün 4) üstel hücre büyümesi ardından enjeksiyondan sonra 8 d, - C26 tümör büyüme kinetiği ilk 7 için bir gecikme fazı göstermektedir. Tümör kütlesi, en sonunda (Şekil 1A-B, yaklaşık 2 g), ~ vücut ağırlığının% 10 ulaşır. ilk aşamasında, tümör sadece palpasyonla bulunabilir ve cildin küçük bir çıkıntı olarak görünür. İkinci aşamada, tümör derinin altında kütle olarak görülmektedir. Nadiren, tümör açık bir yara sonuçlanan ülsere olur; Bu durumda, bir fare deney grubu dışında ve dikkatli biçimde öldürüldü edilir.
Vücut ağırlığı, ilk fazda değişmez, ancak 10 ulaştığında önemli ölçüde, ikinci aşamada azalır - başlangıç vücut ağırlığına göre% 15 (tümörsüz ağırlık durumunda% 30; Şekil 1A). Tümör taşıyan fareler boşa ve sonunda darmadağınık kürk gösterdi görünürBir vücut kondisyonu (BC) ile deney süresi, 1 18 (Şekil 1C) eşit puan. BC1 iskelet yapıları belirgindir ve omurlar belirgin parçalı olduğu bir ciddi bir deri bir kemik fare, temsil eder. Vücut ağırlığı kaybı çoğunlukla hem iskelet kası ve yağ dokusu erimesi (Şekil 1B) tarafından muhasebeleştirilir. Gastroknemıus, özellikle, iskelet kası ağırlıkça% 30, anterior tibial ve kuadriseps (Şekil 2) - Vücut ağırlığı kaybı yaklaşık 20 azalma ile tutarlıdır. Diğer iskelet kasları (Şekil 2) ile karşılaştırıldığında kalp kası da önemli ölçüde daha az olmakla, ağırlık azalır. iskelet kası içindeki yağ kütlesi, ciddi tükendiği ilginçtir, hepatomegali (+% 16, p <0.01) ve dalak (+% 110, p <0.01), genel olarak, tümörün ana tespit edilir (-70%, p <0.001 Şekil 3).
(Şekil 4A-B) ile kas lifi CSA morfometrik değerlendirmesinden sonra gözlemlenen "1"> iskelet kası ağırlık kaybı ile tutarlı ve kas lifi boyutunda bir azalma ile orantılı seviyededir. Özel olarak, frekans dağılım analizi böylece bütün kas C26 tümör (Şekil 4C) varlığında, atrofi maruz düşündüren, C2-6-taşıyan farelerde daha küçük boyutlu elyaf doğru bir kayma gösterdi. Kanser gelişimi ile ilişkili kas CSA değişikliği büyüklüğü IF hafif (% 38, kontrole karşılık, farklı p <0.01 her ne kadar benzer sonuçlar, fiber ebadı ölçümü için geleneksel bir H & E bazlı metodoloji yararlanarak gözlenebilir merkezli yöntem kontrole karşı% 18, p <H & E göre yöntem için 0.01; Şekil 5).
Şekil 1: Kontrol ve C26 taşıyan fareler Vücut Ağırlıkları. Kontrol ve C26- kontrol ve tüm deney süresi boyunca C26 hosts (14 gün tümör enjeksiyonundan sonra). B) İlk vücut ağırlığı (IBW), son tümör içermeyen vücut ağırlığı (FBW) ve tümör ağırlığında A) Vücut ağırlığı eğrisi taşıyan hayvanlar. C) tümör aşılamadan sonra kurban (gün 14 anındaki kontroller ve C26-taşıyıcıları Temsilcisi resimler). Veriler ortalama SD olarak ifade edilir. n = farklılıkların 6. Önemi: * p <0.05, ** p <Student t-testi kullanılarak kontrol grubuna kıyasla 0.01, *** p <0.001. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Kontrol ve C kas Ağırlıkları26 taşıyan fareler. Kontrol ve C26 tümör taşıyıcıları tibialis, gastroknemıus, kuadrıseps ve kalp ağırlığı ağırlık / 100 mg IBW olarak rapor edilir. Veriler ortalama SD olarak ifade edilir. n = farklar 6. önemi: ** p <0.01 ve *** p <Student t-testi kullanılarak kontrol grubuna karşı 0.001.
Şekil 3:. Kontrol ve organ ağırlıkları Fareler C26 taşıyan karaciğer, kontrol ve C26 tümör taşıyıcıları dalak ve epididimal yağ pedi ağırlıkları ağırlık / 100 mg IBW olarak rapor edilir. Veriler ortalama SD olarak ifade edilir. n = farklılıkların 6. Önemi: ** kontrol grubuna karşı p <0.01.
Şekil 4: immünofloresan Myofiber Boyutu morfometrisi. A) kontrol ve C26 ana bilgisayarlardan bir anti-distrofin antikoru (Vector Laboratories) kullanılarak tibialis bölümlerinin Floresan immünohistokimyasal tepki. Büyütme: 10X. Boyut bar. 100 mikron B) kontrol ve C26 taşıyan farelerin tibialis kasına ÇCİ ImageJ makro C) Frekans dağılımı ile ölçülen tibialis kasında CSA miktarının belirlenmesi.. Veri ortalama ± SD olarak ifade edilmiştir. n = her grup için 6. farklılıkların önemi: ** Student t-testi kullanılarak kontrol grubuna karşı p <0.01.
Şekil 5: H & E ile Myofiber Boyutu morfometrisi. Kontrol ve C26 ana bilgisayarlardan tibialis bölümden A) Hematoksilen & Eozin boyama. Büyütme: 20X. Boyut bar. 100 mikron B) Niceleme ve frekans dağılımıtibialis kasında CSA. Veriler ortalama SD olarak ifade edilir. n = farklar 6. önemi: *** Student t-testi kullanılarak kontrol grubuna karşı p <0.001.
Yazarlar fare suşu fare cinsiyet Hücre numarası köken Solid tümör olarak implante? Enjeksiyon bölgesindeki günler
Lazarus ve diğ., 1999 CD2F1 M 5 x 10 5 NCI YOK HAYIR dorsal bölgesi 17
Al-Majid ve McCarthy, 2001 CD2F1 F 2.5 x 10 6 OSUMC YOK HAYIR dorsal bölgesi 17
Samuels vd., 2001 Balb / c M 0.5 ug / ml Tümör süspansiyonu ns EVET dorsal bölgesi En fazla 11
Acharyya'mız ve ark., 2004 CD2F1 M 1 x 10 7 OSUMC YOK HAYIR Sağ cenah En fazla 24
Aulino ve arkadaşları., 2010 Balb / c ns 0.5 mm3 NCI EVET dorsal bölgesi 21
Benny-Klimek ve arkadaşları., 2010 CD2F1 F 1 x 10 6 OSUMC YOK HAYIR dorsal bölgesi 14
Bonetto ve arkadaşları 2011., 2012 CD2F1 F 1 x 10 6 OSUMC YOK HAYIR dorsal bölgesi
Cosper ve Leinwand 2010 CD2F1 M + F 5 x 10 5 ns YOK HAYIR Sağ cenah En fazla 27
Murphy ve ark. 2012 CD2F1 ns 5 x 10 5 NCI / OSUMC YOK HAYIR dorsal bölgesi 14
Cornwell ve ark. 2014 CD2F1 M 5 x 10 5 NCI YOK HAYIR Sağ ve Sol cenah En fazla 26
Assi ve ark. 2016 Balb / c ns 1 x 10 6 Hücre Hattı Servisi YOK HAYIR dorsal bölgesi En fazla 22
Tablo 1:. C26 İmplantasyonu için kullanılan farklı Protokollerinin Karşılaştırılması DifferenC26 implantasyonu için T protokolleri kullanılan fare suşu özel referans ile, temin edilmiştir, hücre sayısı ve aşılanmış tümör tipi, hücre kaynağı, enjeksiyon yeri ve deney süresi uzunluğu. OSUMC: Ohio State Üniversitesi Tıp Merkezi. NCI: Ulusal Kanser Enstitüsü. Ticari hücre hattı servis NS: belirtilmemiş.
Özellikle en son aşamada, kolorektal kanser kötü sonuçlar ve hastanın yaşam kalitesi azalmasına sorumludur kaşeksi gelişimi ile ilişkilidir. Birçok çalışma, kanser ikincil durumların tedavisine odaklanmıştır; Ancak, bu yönde birçok çabalara rağmen, hala kanser kaşeksi 21 için onaylanmış tedavi yoktur. hayvan modelleri bulguların çeviri en üst düzeye çıkarmak için, mümkün olduğu kadar yakın insan patoloji benzemesidir Böylece, zorunludur.
C26, tümör taşıyan farelere kanser kaşeksisi 22-24 yaygın olarak kullanılan bir deney modeli vardır. Bu model, yakın gövde, kas ve yağ kütlesi, hem de kas lifi atrofisi azalma ve enflamatuar gen ve belirgin bir protein hiperkatabolizması 2,5 uygun ubikuitin ligazların artan ekspresyonunu gösteren insan hastalığına benzer. Buna rağmen, verilerle bir kaç farklılıklar kanser Patie elde edilenNTS 25,26 bildirilmiştir. Nitekim, olmayan fizyolojik bir büyüme ortamının da dahil olmak üzere modelin bazı özellikleri, diğer modellerin (örneğin, genetik veya ortotopik enjeksiyon ile karşılaştırıldığında, nispeten kısa deneysel dönemi (ör ektopik tümör GI implante orthotopically deri altına yerine yetiştirilen) tümörler), IL-6 etki bağımlılık ve ciddi sınırlamalar temsil edebilir ve sonuçların yorumlanmasını kısıtlayabilir CD2F1 veya Balb / c farelerinin gerekli kullanımı.
Geçerli protokol, farklı coğrafi konumlarda ve farklı araştırmacılar 3,10 ile aynı özellikleri koruyarak ve farklı zamanlarda elde edilen sonuçlar arasındaki karşılaştırmalar izin laboratuvarımızda yapılan birçok deney boyunca yüksek tekrarlanabilir olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, verilerin tekrarlanabilirliği teşvik etmek amacıyla, açık ve ortak kurallar oluşturulması önemlidir.
toplayıcılar olarakliteratürden d birkaç uyarılar iki farklı laboratuarlarda aynı veri üremesini engelleyebilir. Aynı nedenlerle, farklı protokoller kullanılması çelişkili ve tartışmalı sonuçlar farklı fenotipleri ve sonuçlarını yanı sıra kurşun oluşturabilir. Gerçekten de, bu hayvan modelinde performans farklılıkları esas suşu (Balb / c ya da CD2F1) 2,5,27-29 farelerde cinsel kaynaklanan bildirilmiştir 17 kullanılan implante edildi tümör tipi (hücre süspansiyonu 3 29 yerine, greft 2,30) ve katı tümör, tümör kaynağı (NCI, ATCC veya OSUMC), enjekte edilmiş C26 hücrelerinin sayısı, enjeksiyon veya implantasyon yeri (dış yan yüzleri 6,17, 31 ya da dorsal 3,10,32). Farklı kaynaklardan (NCI karşı başta OSUMC) elde edilen C26 hücre hatlarının implantasyonu ile ilişkili etkilerin doğrudan karşılaştırma şimdiye böylece herhangi bir kesin conclusi çizim etmemizi engelleyen yapılmıştırons. Ancak, hücre kaynağının seçimi önemli ölçüde beklenen sonuçları etkileyebilecek olasıdır. kadın karşı erkeklerin seçimi göz önüne alındığında, araştırmacılar sonuçlarda önemli farklılıklar hatırlatılmalıdır. Cosper ve Leinwand 17 tarafından bildirilen Nitekim, erkek tümör taşıyan fareler, östrojen olmaması nedeniyle, daha fazla kardiyak kitle kaybı ve ölüm, tümöre daha sağlam bir pro-inflamatuar yanıt da dahil olmak üzere kadın daha şiddetli bir fenotip gösterebilir ve daha fazla kalp otofaji.
Özellikle bu model aşina olmayan ve başlangıçta güç analizi ve önceki deneyimlerimiz, deneysel koşul başına en az 6 hayvanlar (n = 6) istatistiksel olarak tespit etmek için tavsiye edilir kullanımından hem de dayanarak, sorunlarla karşı karşıya kalabileceği bu araştırmacılar için önemli farklılıklar. Randomizasyon deney hayvanlarında bu başlangıç ​​vücut ağırlıkları için dikkatle gerçekleştirilir de önemlidirgrupları arasında anlamlı farklılık yoktur. Benzer şekilde, operatörler arası değişkenliği önlemek için, aynı araştırmacı her hayvan üzerinde doku ve organ toplama gerçekleştirmek, tavsiye edilir. Bundan başka, dokular (özellikle kas) çalışmanın amacı, gen ekspresyonunu değerlendirmek veya enzimatik aktiviteleri değerlendirmek, özellikle de RNA ve enzimatik yapısını ve faaliyet korumak için mümkün olduğu kadar hızlı dondurulmuş zorunludur. Ayrıca, kas CSA belirlemek için girişimde, biz lif alanı raporlama genel kabul görmüş ve kas lifi boyutu temsilcisi olduğunu gösterdi. Burada, kas CSA değerlendirmek için iki farklı yöntem sunuyoruz. Şekiller 4-5'te gösterildiği gibi, israf derecesi farklı çıktı, ancak, her iki yöntem, kontrol ve tümör konaklar arasında myofiber boyutunda önemli bir azalma tespit etmek mümkün oldu.
Bu tutarsızlık her iki yöntem konkomitant olarak kabul edilebilir bir yol olmasına rağmen, aslında kaynaklanabilirs kas liflerinin büyüklüğü, H & E boyalı slaytlar kas özelliklerinin ölçümü en sık, hala emek-yoğun, zaman alıcı ve sınırlı doğruluk etkilenen bir manuel veya yarı otomatik bir süreçtir. Bizim deneyime dayalı, biz IF merkezli yöntem kas CSA bildirmek için daha doğru bir teknik olduğunu düşünüyoruz. Gerçekten de, bu tekniğin yararlanarak otomatik olarak ölçülebilir lif sayısı ve böylece ölçüm doğruluğunu artırmak önemli ölçüde daha büyüktür. Unutmayın ki, her iki teknikleri için, raporlama kas boyutu için alternatif bir yöntem Feret çapı değerlendirmektedir. İlginç bir şekilde, bu durum, bu parametre kesit açısının büyük ölçüde bağımsız olması nedeniyle çok güvenilir bir araç olarak kabul edilir. Bu "az iç çapı" ve "en az bir dış çapa" gibi diğer parametreler de kesit düzlemine hassas olmayan ve yalan alternatif göstergesi olarak Feret çapı yerine kullanılabilirer boyutu.
kaşeksi topluluğu açıkça tümörle ilişkili kas kaybı çalışmaları için daha fizyolojik modeller kurmak gerekiyor, ancak Sonuç olarak, biz C26 kolon karsinoma taşıyan fareler moleküler değişikliklerin araştırmak için iyi standardize ve kolay kullanımlı modeli temsil ve inanıyorum fizyolojik anormallikler genellikle tümörün meydana gelmesinden sonra tespit edildi. Gelecekteki uygulamalar kolon içine C26 hücrelerinin ortotopik implantasyonu kolorektal kanser kaşeksi uygun ve daha fizyolojik modeli temsil olabilir mi araştırılmasını içerecektir.