NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements | Protocol (Translated to Turkish)
Balık Yağı Takviyeler Lipid Profilinin Rapid Değerlendirilmesi için Sağlam Aracı Olarak NMR Spektroskopisi
Burada, yüksek çözünürlüklü 1H ve 13C Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) spektroskopisi kapsüllenmiş balık yağı takviyeleri nicel ve nitel analiz için hızlı ve güvenilir bir araç olarak kullanılmıştır.
Batı diyet nedenle balık yağı takviyelerinin tüketimi bu temel besinlerin alımını artırmak için önerilir n -3 yağ asitleri bakımından fakirdir. Bu çalışmanın amacı, yüksek çözünürlüklü 1 H ve iki farklı NMR aletleri kullanılarak 13 ° C NMR spektroskopisi kullanarak kapsül balık yağı takviyeleri kalitatif ve kantitatif analiz ortaya koymaktır; 500 MHz ve 850 MHz alet. Her iki protonu (1H) ve karbon (13C) NMR spektrumları, balık yağı takviyeleri ana bileşenlerinin miktarlarının belirlenmesi için kullanılabilir. Balık yağı takviyeleri lipid miktarının ilgili 1D spektrumları uygun NMR sinyallerinin entegrasyonu ile elde edilir. 1H ve 13 C NMR ile elde edilen sonuçlar, iki çekirdek ve iki araç arasında çözünürlük ve hassasiyet farkına rağmen, birbirleri ile iyi bir uyum içindedir. 1H NMR tekliftayfı, bir saat 10 dakika sürer 13C NMR analizi, aksine, 1 dakikadan daha az olarak kaydedilebilir olarak sa daha hızlı analiz, 13C NMR ile karşılaştırıldığında. 13C NMR spektrumu, ancak çok daha açıklayıcıdır. Tek tek yağlı asitlerin daha fazla sayıda sayısal verileri ve gliserol omurgası üzerinde yağlı asitlerin konumsal dağılımını belirlemek için kullanılabilir. Hem çekirdek arıtma veya ayırma aşamalarına gerek kalmadan tek bir deneyde sayısal bilgi sağlayabilir. Manyetik alanın gücü çoğunlukla 13C NMR ile ilgili olarak daha düşük bir çözünürlüğe 1H NMR spektrumları etkiler, ancak, daha düşük maliyetli NMR aletleri verimli gıda sanayi ve kalite kontrol laboratuarlarında standart bir yöntem olarak uygulanabilir.
Diyet, n-3 yağ asitlerinin tüketimi, kalp bozuklukları, 1, 2, 3, enflamatuar hastalıklar 4 ve diyabet 5 gibi çeşitli koşullara karşı faydalı olduğu kanıtlanmıştır. Batı diyet n -3 yağ asitleri kötü kabul edilir ve böylece balık yağı takviyelerinin tüketimi n geliştirmek için tavsiye edilir -6 / n -3 tüketicinin beslenme 1'de denge. balık yağı takviyesi tüketiminde son artışa rağmen, sorular bu ürünlerin bazılarının güvenliği, özgünlük ve kalitesi hakkında kalır. balık yağı takviyelerinin hızlı ve doğru kompozisyon analizi doğru bu ticari ürünlerin kalitesini değerlendirmek ve tüketici güvenliğini sağlamak için esastır.
balık yağı takviyesi değerlendirilmesi için en yaygın yöntemlers gaz kromatografisi (GC) ve kızıl ötesi spektroskopi (IR) 'dir. Bu son derece hassas yöntemler olmakla birlikte, bunların çeşitli sakıncaları 6 muzdarip. GC analizi, ayrı ayrı bileşiklerin ayrılması ve türetilmesi 7 gereklidir ve lipid oksidasyonu analiz 8, 9 sırasında oluşabilir, çünkü zaman alıcı (4-8 saat) 'dir. IR spektroskopisi nicel olabilir, bir tahmin modeli IR bantları, tek bir bileşik 10 atfedilebilir hangi istisnalar olmasına rağmen, kısmi en az kareler regresyon (PLSR) kullanılarak inşa edilmesi gerekmektedir. PLSR analizi 11 süresini uzatır örneklerin çok sayıda, analiz edilmesi gerekir. Bu nedenle, balık yağı örneklerinin çok sayıda doğru ve hızlı analiz izin yeni analitik yöntemler geliştirilmesinde artan bir ilgi vardır. örneğin Offi gibi örgütlerSağlık (NIH) ve Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) National Institutes of Besin Takviyesi (ODS) ait ce bu yeni yöntemler 12, 13 geliştirmektir Resmi Analitik Kimyagerler Derneği (AOAC) ile işbirliği var.
Tarama ve diyet takviyeleri olarak çok bileşenli matrisler, değerlendirilmesi için en ümit verici analitik yöntemlerden biri, Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi 14, 15'dir. NMR spektroskopisi birçok avantajı vardır: bir tahribatsız ve niceliksel bir teknik, hiçbir numune hazırlama için en az gerektirir ve mükemmel doğruluk ve üretkenlik ile karakterize edilir. bu çözücülerin sadece küçük miktarlarda kullanmaktadır Buna ek olarak, NMR spektroskopisi, çevre dostu bir yöntemdir. NMR spektroskopisi ana dezavantajı, diğer analyti kıyasla nispeten düşük duyarlılığıcal yöntem, ancak bu tür güçlü manyetik alanlar, çeşitli çaplarda kriyojenik sondalar, gelişmiş veri işleme ve çok yönlü darbe dizileri ve teknikleri gibi aletlerin son zamanlardaki teknolojik ilerlemeler nM aralığına kadar karşı artmış bir hassasiyet. NMR enstrümantasyon yüksek maliyetli olmakla birlikte, NMR spektrometre uzun ömürlü ve NMR birçok uygulama uzun vadede analiz maliyetini düşürmek. Bu ayrıntılı video protokol alanında yeni uygulayıcı 1 H ve balık yağı takviyeleri 13C NMR spektroskopik analizleri ile bağlantılı tuzaklar önlemek için tasarlanmıştır.
Not: Dikkat, kullanılmadan önce ilgili tüm güvenlik bilgi formuna (MSDS) bakın. Numune hazırlanmasında kullanılan döteryumlanmış kloroform (CDCI3) toksiktir. Davlumbaz ve kişisel koruyucu ekipman kullanımı dahil numune hazırlama yaparken tüm uygun emniyet uygulamalarını kullanın (koruyucu gözlükler, eldivenler, laboratuvar önlüğü, tam boy pantolon, ayakkabı-toe kapalı).
1H ve 13C örneklerinin hazırlanması
Bir şırınga kullanılarak bir diyet kapsülden balık yağı, 120 uL (~ 110 mg) ekstrakte edin ve 4 mL bir cam şişe içine koyun. Balık yağının ağırlığını kaydedin.
1 H ve13C kimyasal kaymalar için bir referans olarak kullanılmıştır tetrametilsilan (TMS),% 0.01 ihtiva eden CDCI3, 500 uL balık yağı, yaklaşık 120 uL eritin.
NOT: TMS kullanımıdırSadece kimyasal kayma kalibrasyonu için (aşama numaraları 2.2.1.2.7 ve 2.2.2.2.7 bakınız) d değil, miktar tayini için amaçları (aşama numaraları 2.2.1.3 ve 2.2.2.3 bakınız).
Miktar mg cinsinden ifade edilen ise bir 2,6-di-tert-butil-4-metilfenol hazırlayın (BHT) stok çözeltisi, / g ((Cr BHT yaklaşık 220 mg ve krom (III) asetilasetonat, 15 mg çözülmesiyle, istenen acac) 3), TMS,% 0.01 ihtiva eden CDCI3 20 mL. Balık yağı, 100 mg (± 10 mg), çözünmesi için stok çözeltisi, 500 uL kullanın.
yağ (bu işlem birkaç saniye sürer) çözüldükten sonra, doğrudan çıkan yüksek kalitede 5 mm -NMR tüpüne çözeltinin tüm transferi ve bir kapak ekleyin. örnekleri hazırlandıktan sonra 24 saat içinde örnekleri analiz.
2. NMR Cihazın hazırlanması
Not: Dikkat NMR aletleri tarafından üretilen güçlü manyetik alanların varlığı tıbbi cihaz ve impl etkileyebilir dikkatKalp pili ve cerrahi protezler, hem de kredi kartları, saatler, vb analiz olmayan koruyucu mıknatıslar kullanılarak gerçekleştirilmesi durumunda ek tedbirli olmak gerekir gibi elektronik öğeler olarak karıncalar. İki NMR aletleri 1 H ve 13C NMR spektrumları elde edilmesi için kullanılmıştır; üçlü rezonans helyum soğutmalı ters (TCI), 5 mm prob ve 500,20 MHz ve 1H ve 13 C sıcaklıkta 125,77 MHz'de çalışan bir spektrometre ile donatılmış 850,23 MHz'de, sırasıyla 1 H ve13C çekirdekler için 213,81 MHz'de çalışan bir spektrometre, çekirdek, sırasıyla gözlenen geniş bir bant ile donatılmıştır (BBO) 5 mm prob azot soğutulmuştur. Bütün deneyler, 25 ± 0.1 ° C 'de gerçekleştirildi ve spektrumları bir standart NMR verileri analiz etme ve işleme yazılım paketi ile işlenmiştir (Malzeme listesi).
NMR spektrumları elde Hazırlık
Not: 1 H ve 13C NMR spektrumlarıaracından numuneyi çıkarmadan dolayısıyla elde edilebilir.
dönen bir türbin içine NMR tüpünün yerleştirin (Malzeme Listesi bakınız).
spinner ve kademeli bir derinlik ölçerin üstüne Tüp ve alt kısmı ölçerin alt temas edene kadar hafifçe tüpün üst itin.
SampleCase açık nokta NMR örnek yerleştirin. örnek yerleştirilir yuva numarasını not edin.
NMR örnek yüklemek için, # sizin numuneyi tutan SampleCase yuvadır kontrol bilgisayarı ve türü 'sx #', geri dönün.
Kilit penceresi ekranda görünmesini CDCI3 arasında döteryum sinyali bekleyin. otomatik yazın "lockdisp" görünmüyorsa. En kısa zamanda döteryum sinyali görülebilir, tip komut satırında "kilit" ve CDCI3 döteryum rezonans örnek kilitlemek için solventin listesinden "CDCI3" seçin.
NOT: Döteryum sÖnceki kullanıcı farklı bir çözücü kullanıldığı takdirde ignal görünmeyebilir. Kullanıcı numune aşağı gösterge için beklemesi gereken, o zaman kilitleyin.
eğirme sağlamak için komut satırında Tür "bsmsdisp" aktif değildir. "SPIN" butonuna yeşilse, eğirme devre dışı bırakmak için tıklayın.
Yeni bir veri kümesi oluşturmak için "Yeni" komutunu yazın. "NAME" sekmesine ve "EXPNO" sekmesinde deneme sayısında belirlenen veriler için bir ad girin. "PROCNO" sekmesinde "1" sayısını kullanın. "Deney" sekmesinde, hit "Seç" ve "Proton" parametresi dosyayı seçin. "BAŞLIK" sekmesinde deney başlığını yazın. "Tamam" ı tıklayın.
mevcut NMR probuna ve çözücü için standart parametreleri elde etmek üzere, komut doğrultusunda "getprosol" yazın.
1D 13C ters g "Deneme" sekmede "C13IG" darbe dizisi seçilmesi 13 ° C için yineleyin 2.1.7,ated deneyini ayrılmış.
Her iki karbon ve proton çekirdekleri için otomatik ayarlama ve sondanın eşleştirme gerçekleştirmek için komut "atma" yazın.
NMR sinyallerinin için son derece homojen bir manyetik alan elde etmek için layneri tek boyutlu bir değişim ölçüsü ve böylece optimum bir forma gerçekleştirin.
basitçe sırayla yürüterek, 1D takılıp sıkıldıktan için standart otomatik işlemi uygulayın komutları "qu topshim 1dfast ss", "qu topshim tuneb ss" ve komut satırında "qu topshim raporu".
90 ° atma kalibrasyon
1 H (adımlarını 2.1.7 ve 2.1.8 bakınız) için yeni bir veri kümesi oluşturun.
90 ° pul kalibre edilmesi için otomasyon programı başlatmak için komut satırında komut "paropt" yazınse. değiştirilecek parametre olarak seçin atım süresi, p1,.
"2" artışlarını uS ve "16" deneyleri butonu, p1 başlangıç ​​değeri olarak "2" us başla.
13 ° C ayarlanmış bir yeni veri oluşturma (adım 2.1.9) ve 13 ° C çekirdekleri (adım 2.2.1.2 ve 2.2.1.3 bakınız) için bu işlemi tekrar edin.
1 H null yöntemi 16 ile ölçülen T 1 ölçüm
Not: boş yöntem z eksenine gözlemlenebilir enine manyetizasyon oluşturan bir son 90 ° darbe boyunca rahatlama sağlamak için, bir gecikme (Tau) ile 180 ° atma takip oluşan inversiyon kurtarma darbe dizisi kullanır.
inversiyon kurtarma denemesine darbe dizisi değiştirmek için "pulprog t1ir1d" yazın.
Comman aşağıdaki komutları yazınd çizgisi boyunca ppm spektral genişliği, RF vericinin merkezi tarar taklit tarama sayısı ve veri noktaları "sw 8" sayısını, "o1p 3.8", "ns 2", "DS sayısını ayarlamak 2" ve "td 64K".
Tip "p1 (değer)" ve darbe kalibrasyonu ile saptandığı haliyle, 90 ° pals için süre değerleri butonu (adım 2.2.1) ve (180 ° pals için "p2 (değer)" 180 ° süresi değeri yazın darbe iki ile çarpılır 90 ° atma süresi) 'dir.
"D1 10" yazarak, çok büyük bir değere, örneğin 10 saniye geri döngü süresi ayarlayın.
Komut satırında "d7 10ms" yazarak, kısa bir değere, örneğin 10 ms tau ayarlayın.
RG otomatik hesaplama için "komutunu Rga" kullanılarak uygun bir değere alıcı kazancı (RG) ayarlayın.
Komut "zg" yazarak bir spektrum çalıştırın.
"EFP" yazarak Fourier dönüşümü yürütmeKomut satırında.
Komut satırında komut "apk" yazarak otomatik faz düzeltme gerçekleştirin. Ek faz ayarlamaları ayrıca, spektrum geliştirmek tıklayın gerekiyorsa "Süreç sekmesi," o zaman faz düzeltme moduna girmek için "Faz ayarla" simgesine tıklayın.
Tüm sinyaller negatif emme modunda kadar fare sürükleyerek sıfır derece (0) ve birinci dereceden (1) faz düzeltme simgeleri kullanın. Uygulayın ve faz düzeltme modundan çıkmak için "İade ve Kaydet" düğmesine tıklayarak faz düzeltme değerlerini kaydedin.
Tüm pikler adımları tekrarlayarak pozitif veya sıfırlanmış ya kadar tau artırmak 2.2.2.6-2.2.2.9. T 1 değerini belirlemek için, sadece en yüksek LN2 ile sıfırlanmış olan tau değerine bölünür.
13 ° C null yöntemi 16 ile ölçülen T 1 ölçüm
13 ° C ayarlanmış bir yeni veri oluşturma (adım 2.1.9 bakınız)
Tür "pulprog t1irpg" karbon çekirdeği için inversiyon-kurtarma denemesine darbe dizisi değiştirmek için.
"Sw 200", "o1p 98": ppm spektral genişliği, RF vericinin merkezi taramaların sayısı, sahte taramaların sayısı ve veri noktalarının sayısını ayarlamak için komut hattı üzerinde aşağıdaki komutları yazın "ns 8", "ds 2" ve "td 64K".
Tip "p1 (değer)" ve darbe kalibrasyonu ile saptandığı haliyle, 90 ° pals için süre değerleri girerek 180 ° pals için tip "p2 (değer)" (süre değeri 90 ° (adım 2.2.1) iki ile çarpılır darbe süresi).
"D1 100" yazarak, çok büyük bir değere, örneğin 100 saniye geri döngü süresi ayarlayın.
Kısa bir değere ayarlayın tau komut satırında "d7 100ms" yazarak, örneğin 100 ms.
receiv ayarlaRG otomatik hesaplama için "komutunu Rga" kullanılarak uygun bir değere er kazancı (RG).
Komut satırında "EFP" yazarak Fourier-dönüşümü yürütün.
Komut satırında komut "apk" yazarak Otomatik faz düzeltme gerçekleştirin. Ek faz ayarlamaları ayrıca spektrum artırmak için gerekli ise, "Phase ayarlama" simgesi ve sıfırıncı dereceden (0) ve birinci dereceden faz (1) düzeltilmesi için faz düzeltmesi simgeleri tıklayın.
sıfır derece ve birinci dereceden faz düzeltme simgeleri tıklayarak da tüm sinyaller negatif emme modunda kadar, fareyi. Uygulayın ve faz düzeltme modundan çıkmak için "İade ve Kaydet" düğmesine tıklayarak faz düzeltme değerlerini kaydedin.
Tüm pikler adımları tekrarlayarak pozitif veya sıfırlanmış ya kadar tau artırmak 2.2.3.6-2.2.3.9. Belirlemek, birsey belirlemekT1 değeri, sadece en yüksek LN2 ile sıfırlanmış olan tau değerine bölünür.
Tek boyutlu (1D) NMR spektrumları
NMR verilerinin kazanılması
Adım 2.1.7 oluşturulan 1H veri kümesine git ve komut hattı "pulprog zg" yazarak standart "darbe edinmedikçe" darbe dizisi, "zg" kullanın.
90 ° atma açısı ppm spektral genişliği, RF vericinin merkezi taramaların sayısı, sahte taramaların sayısı, veri noktalarının sayısını ve nabız süresini ayarlamak için komut hattı üzerinde aşağıdaki komutları yazın "sw 8", "o1p 3.8", "ns 2", "ds 2", "td 64K" ve "(darbe kalibrasyonu ile saptandığı haliyle), p1" (adım 2.2.1 bakınız).
Not: 32K veri noktası 500 MHz aleti kullanılabilir.
Komut satırında sırasıyla "d1 7s" ya da "d1 9s" yazarak 850 MHz aleti 500 MHz aleti için 7 sn ya da 9 saniyelik bir dinlenme gecikmesi ayarlayın.
Geliştirilmiş başlangıca sahip bir spektrum elde etmek "digmod baseopt" yazın.
Komut satırında darbe edinmedikçe komutu "zg" yazarak edinimini başlayın.
NMR verilerinin işlenmesi
sıfır dolgu uygulamak ve 64K gerçek spektrumun boyutunu ayarlamak için komut satırında "si 64 K" yazın.
Bir satır dönüşümü önce Fourier 0.3 Hz faktörü genişletilmesi ile bir ağırlıklandırma (üstel bozunma) uygulamak için komut satırında "lb 0,3" yazarak 0.3 Hz parametresini genişletmek hattı ayarlayın.
komuta "EFP" yazarak Fourier-dönüşümü yürütünhat.
Komut satırında komut "apk" yazarak Otomatik faz düzeltme gerçekleştirin. Ek faz ayarlamaları ayrıca spektrum geliştirmek tıklayarak gerekiyorsa "İşlem sekme", sonra "Faz ayarlama" simgesi ve sıfırıncı dereceden (0) ve birinci dereceden (1) bir faz düzeltme için faz düzeltmesi sembol simgeleri tıklayın .
sıfır sıralı ve birinci dereceden faz düzeltme ikonlara tıklayarak ederken sinyallerin tüm olumlu absorpsiyon moduna gelene kadar, fareyi sürükleyin. Uygulayın ve faz düzeltme modundan çıkmak için "İade ve Kaydet" düğmesine tıklayarak faz düzeltme değerlerini kaydedin.
Komut "abs n" yazarak entegrasyon üzerine baz satırı düzeltilmesi için bir polinom dördüncü dereceden işlevini uygulayın.
Not: Bu en az yoğunluğa sahip bir düz spektral bir temel temin eder.
TMS'den ppm ilgili kimyasal kaymalar (δ = 0). Kalibrasyon tıklayın ( "Kalibrasyon. Axe'") Simgesi ve 0'a yakın zirve TMS NMR sinyalinin () üstünde kırmızı çizgi ile imleci. Sol tıklama ve yazın' dır 0.
NMR verileri analizi
"Entegre" simgesi ( "Süreç" sekmesi altında) ve vurgu ile 5.05 ve δ 5.81 δ, δ 4.98 piklere yanı sıra 0,6 ö 1,1 δ simge ( "Yeni bölge tanımla") spektral bölge entegre. integral yoluyla tıklama ve sürükleme bıraktı.
NOT: devreden ve sol tıklama ve bölgeye yakınlaştırmak için fareyi sürüklemeye vurgulamak simgesine tıklamanız bir bölge üzerinde durulması gereken varsa. Gerekirse eşik yoğunluğunu ayarlamak için, orta fare düğmesini kullanın. Daha sonra, entegrasyon işlevi etkin hale gelecek zirveye taşımak için tekrar vurgulamak simgesine tıklayın.
görünen ayrılmaz değerine sağ tıklayıp 100'e yukarıdaki integral toplamı Normalesinyalin altında ler ve "integral toplamını Normale" seçeneğini seçin. Giriş kutusuna değer "100" ve entegrasyon modundan çıkmak için "Return ve Kaydet" i tıklayın.
Bir iç standart olarak BHT kullanıldığında, δ 6.98 doruğu entegre ve stok çözeltisi 0.5 mL başına BHT milimol entegre eşit bir değere ayarlar.
ilgi konusu zirve entegre, mümkün pikin her bir yan 10 Hz uzanan (adım 2.3.1.3.1 bakınız).
Benzer bir şekilde, 13C-NMR spektrumu, toplama ve işleme gerçekleştirmek için devam edin.
13C veri kümesine git ve komut hattı "pulprog ZGig" yazarak ters kapılı ayrılmış darbe dizisi, "ZGig" kullanılır.
NOT: Standart genişbant decou ile bir karbon deneme çalıştırmak içinPLED puls dizisi, komut doğrultusunda tip "pulprog zgpg".
90 ° atma açısı ppm spektral genişliği, RF vericinin merkezi taramaların sayısı, sahte taramaların sayısı, veri noktalarının sayısını ve nabız süresini ayarlamak için komut hattı üzerinde aşağıdaki komutları yazın "sw 200", "o1p 95", "ns 16" "ds 2", "td 64K" ve "(darbe kalibrasyonu ile saptandığı haliyle), p1" (adım 2.2.1.4 bakınız).
Komut satırında sırasıyla "d1 35s" ya da "d1 45s" yazarak 850 MHz aleti 500 MHz aleti 35 s veya 45 saniyelik bir dinlenme gecikmesi ayarlayın. BHT kullanırken, gevşeme gecikmesi 500 MHz aleti 50 s ve 850 MHz aleti 60 s olmalıdır.
w bir spektrum elde etmek için komut satırına "digmod baseopt" yazıni geliştirilmiş taban.
Bir satır dönüşümü önce Fourier 1.0 Hz faktörü genişletilmesi ile bir ağırlıklandırma (üstel bozunma) uygulamak için komut satırında "lb 1.0" yazarak 1.0 Hz parametresini genişletmek hattı ayarlayın.
Komut satırında komut "apk" yazarak Otomatik faz düzeltme gerçekleştirin. Ek faz ayarlamaları ayrıca spektrum geliştirmek tıklayarak gerekiyorsa "İşlem sekme", sonra "Faz ayarlama" simgesi ve sıfırıncı dereceden (0) ve birinci dereceden faz (1) düzeltilmesi için faz düzeltmesi simgeleri tıklayın .
NOT: Karbon spektrumları 214 MHz (850 MHz alet) (birinci dereceden) frekans bağımlı hataların düzeltilmesi Larmor frekansında kaydedilmiş için zor olabilir ve zaman nedeniyle büyük rezonans dışı etkilerin daha az deneyimli kullanıcılar için alıcı 90 ° atma.
Komut satırında komut "abs n" yazarak entegrasyon üzerine baz satırı düzeltilmesi için bir polinom dördüncü dereceden işlevini uygulayın.
TMS'den ppm ilgili kimyasal kaymalar (δ = 0). Kalibrasyon ( "Kalibrasyon. Eksen") simgesine tıklayın ve başvurulacak NMR sinyalinin üstünde kırmızı çizgi ile imleci. "0" in sol tıklayın ve türü.
( "Süreç" sekmesi altında) "entegre" simgesi ve vurgulamak kullanılarak 171 ö 175 ila δ simge ( "Yeni bölge tanımla") spektral bölge entegre. integral yoluyla tıklama ve sürükleme bıraktı.
NOT: devreden ve sol tıklama ve bölgeye yakınlaştırmak için fareyi sürüklemeye vurgulamak simgesine tıklamanız bir bölge üzerinde durulması gereken varsa. Daha sonra, entegrasyon işlevi etkin hale gelecek zirveye taşımak için tekrar vurgulamak simgesine tıklayın.
sinyalinin altında görünen ayrılmaz değer üzerinde sağ klik yaparak 100 ayrılmaz Set ve "İntegral Akım kalibrasyonu" seçeneğini seçin. Giriş kutusuna değer "100" ve "Return and save" tıklayın entegrasyon modundan çıkmak için.
Bir iç standart olarak BHT kullanıldığında, δ 151.45 doruğu entegre ayrılmaz eşit bir değere ayarlarstok çözeltisi 0.5 mL başına BHT milimol.
pikin her bir yan 5 Hz uzanan ilgili maksimum entegre (adım 2.3.2.3.1 bakınız).
1H ve 13C NMR spektrumları iki NMR aletleri kullanılarak ticari olarak mevcut balık yağı takviyeleri için toplanmıştır; 850 MHz ve 500 MHz spektrometre üzerinde kaydedildi. Bu tayflar, örneğin dokosaheksaenoik asidi (DHA), eikosapentaenoik asit (EPA), örneğin n gibi n -1 asil zincirleri ve beslenme açısından önemli indeksi gibi diğer bileşikler, balık yağı bileşenleri, kantitatif tayini için kullanılabilir -6 / n -3 oranı. miktar daha dahili bir standart kullanılmadan yapılabilir, bununla birlikte, sayısal sonuçlar nispi molar yüzdeleri olarak ifade edilmesi gerekir. verileri mutlak değerleri (mg / g) olarak ifade edilmesi gerektiğinde, bir iç standart gereklidir. NMR ile elde edilen sonuçlar, t bağlı olarak, 0.3 ile% 13C NMR analizi için 2 ve% 0.5 ila% 1 'H NMR analizi için% 2.5 arasında değişen nispi standart sapma (RSD) ile yüksek oranda tekrarlanabilir o, kolesterol. Proton spektrumları analizinin doğruluğunu etkileyen, kalabalık olma eğilimindedir, çünkü 1H NMR için biraz daha yüksek MSB sıklıkla, bilhassa gürültü (S / N) daha düşük bir sinyal rezonansları için gözlenir. Çok iyi bir uyum 850 MHz ve% 1 ila% 4 arasında RSDS 500 MHz aleti arasında bulunmuştur. Özellikle n -1 asil zincirleri gibi daha düşük konsantrasyonlarda görünür bileşikler için, 1 H ve 13 ° C ile elde edilen sonuçları karşılaştırırken (% 8 kadar) nispeten yüksek RSDS gözlenmiştir. NMR spektroskopisi, daha önce bazı balık yağı bileşenleri belirlenmesi de dahil olmak üzere lipit analizi için bir araç olarak doğrulanmıştır. Sonuçlar böyle GC 17, 18 gibi geleneksel yöntemlerle, iyi bir uyum içindedir olduğunu gösterdi.
1H NMR analizi
"Xfig"> Şekil 1 (A), bir 850 MHz ve (B), 500 MHz aleti üzerinde elde edilen 1H-NMR spektrumları karşılaştırır. 850 MHz frekans aralığı daha yüksek çözünürlük ile karakterize edilir, DHA, EPA, ve n-6 / n de dahil olmak üzere, balık yağı, ancak ana bileşenleri -3 oranı da 500 MHz spektrumundan tayin edilebilir. Balık yağı 1H NMR spektrumu tam NMR tahsisi başka 19 bulunabilir ise kantitatif amacıyla kullanılabilir balık yağı yağ asitlerinin 1H-NMR sinyalleri, Tablo 1 'de gösterilmiştir.
1H NMR n -3 toplam miktarının ölçümü için güvenilir verileri vermiştir, n -6, DHA, trans-yağ asitleri, n -1 asil zincirleri, ve doymuş yağ asitleri (SFA). 1H NMR analizi için, uygun ilişkileri kullanımı lerin en gereklidir çünküsinyali veren farklı yağ asitleri ve lipidler için ortak olan proton gruplarına aittir. Bu nedenle, çoğu durumda balık yağı yağ asitlerinin konsantrasyonu, uygun ilişkileri dahil, sadece çeşitli 1H NMR sinyallerinin kombinasyonu ile tespit edilebilir. Buna ek olarak, bu denklemler her bir grup ile bağlantılı proton farklı sayıda normalize aritmetik katsayıları ihtiva eder. Bir iç standart kullanıldığı zaman, aşağıdaki denklem dikkate alınmalıdır: C = I / IS x K Cı balık yağı mg / g analit konsantrasyonu / K x A x MW / m (1), IS, I iç standart benzersiz ait bir proton sinyalinin alanıdır IS, benzersiz ilgi lipid atfedilen bir rezonans yekparedir, N incelendiğinde fonksiyonel grubun proton sayısı,N, analiz için kullanılan dahili bir standart proton sayısı, A, iç standart milimoldür, MA (metil esterler olarak ifade edilmiştir) yağlı asitin molekül ağırlığıdır, ve m, balık yağı miktarı, g olarak ifade edilmiştir.
Örnek 1, DHA: DHA oranı I DHA, DHA H α ve H β protonlara ait 2.39 δ sinyalin integrali Denklem Cı DHA = ¾ I DHA / S, ve S tarafından belirlenir SFA metil proton integralinin toplamının, n -6, n-9, n -3, trans yağ asitleri yanı sıra 5.05 ve δ 5.81 δ δ 4.98 de n -1 asil zincirlerinin tepe integralleri vardır. Entegre bir DHA Normadört protonlara karşılık geldiğinden, yekpare S üç protonlara karşılık gelirken, 3/4 ile çarpılmasıyla lized. 1H NMR gliserol omurgası üzerinde yağlı asitlerin konumsal dağılımı hakkında bilgi veren yeteneğine sahip değildir ve bu nedenle sadece yağlı asitlerin toplam miktarının ölçümü için kullanılabilir. Kapsüllenmiş balık yağı takviyesi 1H NMR analizi, bunun DHA% 10.5 oluşur gösterdi. BHT ile aynı örnek DHA konsantrasyonu 105,23 mg / g olduğu tespit edildi. Bu değerler, 13C NMR (13 ° C analizi için bakınız örnek 2) ile elde edilen değerlere çok yakındır.
Örnek 2, n -1 asil zincirleri n -1 asil zincirlerinin konsantrasyonu ilişkisi Cı, n-1 ile verilir = I, n-1, 3. n'nin-1 5.818 δ sinyalin yekparedir / S. BuSinyal üç ile çarpılmasıyla normalize edilmesi gerekmektedir, böylece, bir protona tekabül vb. BHT kullanılarak, N -1 zaman asil zincirleri denklemi Cı, n-1 = 2, burada n-1 / I BHT ile belirlenir. Sonuçlar, n -1 asil zincirlerinin MW bilinmemektedir çünkü mg / g olarak ifade edilemez.
Örnek 3 n-6 / n -3 oranı: bu önemli n indeksi -6 asil zincirleri (iki proton) bis-alilik protonlara karşılık gelen, 2.77 δ rezonansın normalize yoğunluklarının oranı hesaplanabilir 0.97 δ de üçlü üzerinde n, 3 yağ asitleri ait üç protonlara karşılık gelir. Ilişki Cı, n-6 / C, n-3 = A ve B sinyallerinin integralleridir 3/2 a / I B,sırasıyla 2.77 ve δ 0.97, δ de. n-6 yağ asitleri ilişki Cı, n-6 = 3 / 2I n-6 / S, I, n-6 2.77 δ, bis-allilik proton yekparedir belirlenir.
Örnek 4, trans-yağ asitleri: Trans yağ asitleri, trans 0.91 δ sinyalin integrali Denklem Cı trans = I, trans / S, hesaplanabilir. 850 MHz aleti kullanılarak, 1H NMR ile tespit edildiği üzere, bu örnek, trans-yağ asitleri 3.07% ihtiva eder. 500 MHz aleti analiz aynı örnek trans yağ asitlerinin% 3.03 ihtiva ettiği bulunmuştur.
Örnek 5, doymuş yağ asitleri (SFA): SFA konsantrasyonu calcul olabilirATED denklemi Cı SFA = S - C, n-3 - Cı, n-6 - Cn-9 - Cı, n-1 - Cı trans. N -9 yağlı asitler (özellikle oleik asit) denklemi C'ye göre tayin edilebilir N-9 = (3/4 S - 3/2, burada n-6) S n alilik proton yekparedir / S, -6 ve n -9 2.01 δ de. Bir ticari olarak temin edilebilen, balık yağı numunede SFA miktarı% 36,1 olduğu tespit edildi. 13C NMR ile analiz aynı örnek% 33.8 SFA ihtiva ettiği bulunmuştur. Balık yağı mg / g olarak ifade edilemez ise SFA farklı MW çeşitli FA (örneğin, stearik ve palmitik) grubu ve böylece konsantrasyonunu temsil etmektedir.
Örnek 6, toplam steroller: Toplam sterol miktarı (serbest ve esterleştirilmiş) sig belirlenebilirDenklem C kullanarak 0.68 δ görünür karbon 18 metil proton, nal = G / S Ste. Bir ticari olarak temin edilebilen, balık yağı, örnek içindeki toplam sterol molar oranı% 0.32 olarak bulunmuştur. BHT de sterol mutlak konsantrasyonunun belirlenmesi için de kullanılabilir. Balık yağında ana sterol, kolesterol ve vitamin D (ya da bunun öncüsü 7-dehidrokolesterolü) ve genellikle ek ilave edilir. Bu bileşikler, çok benzer bir MW sahiptir. Bu nedenle, sonuçlar aşağıdaki denkleme göre mg / g olarak ifade edilebilir şekilde hesaplanır ve C = 2/3 I STE / l MA: STE teşkil kolesterol moleküler kütlesi (386), olan bir x MW STE / m, IS balık yağı 20'de sterolic fraksiyonun çoğunluğu. BHT ile aynı örnek içinde sterollerin miktarı 3.8 mg / balık yağı g olmuştur. Kolesterol bireysel belirlenmesi (δ (δ 0.678) çözünürlüğü arttırmak için bir pencere fonksiyonunun tatbik edildikten sonra 850 MHz aleti üzerinde uygulanabilir.
13C NMR Analizi
Şekil 2 (a) bir 850 MHz ve (B) karbonil karbon alanında 500 MHz aleti üzerinde alınan 13C NMR spektrumunu göstermektedir. İki spektrumları çok benzer ve bilgilerin aynı miktarda sağlayabilir. 13C NMR spektrumu başarılı bir şekilde stearidonik (SDA) ve eikosatetraenoik (ETA) asitler gibi ek bir yağ asitlerinin analiziyle kontrol için de kullanılabilir, ancak daha fazla tarama bu asitler daha düşük konsantrasyonlarda olduğu örnekler için gereklidir. 13C spektrumları nedeniyle büyük spektral genişlik ve geniş bant ayırmasının uygulama, yüksek çözünürlük ile karakterize edilenskalar bağlama etkisini ortadan kaldırır ve singlet üretir. Bu nedenle, bir 500 MHz aleti kullanırken bile örtüşen sınırlı yoktur.
13C NMR spektrumu 1H NMR spektrumuna göre çok daha detaylı ve daha az sinyal üst üste görülmektedir, çünkü daha kapsamlı nicel veriler sağlayabilir (Şekil 1 ve 2). Bu yağlı asitlerin çok sayıda aynı zamanda gliserol iskeleti 19, 21, 22 üzerindeki konum dağıtımı için sayısal bilgi sağlaması nedeniyle, 13C spektrumunda en yararlı spektral karbonil karbon bölgesidir. 13.5 ö 14,5 δ metil grubu alan n -3 toplam miktarının hızlı tespiti için kullanılan, n, -6, N-9 ve yağlı doyurulabilirasitler (SFA), hem de trans yağ asitleri. Bununla birlikte, 500 MHz NMR spektrometresi içinde, n kısmi bir örtüşme-6 ve n--9 doymuş yağ asitleri (SFA) vardır. 850 MHz alet hala daha güvenilir bir seçenek olarak kabul edilir olsa da çözünürlük geliştirme için bir pencere fonksiyonunun uygulaması bu sorunu çözebilir. Karbon spektrumu olefinik bölgesi n toplam miktarı için kullanılan -3 edilebilir n -1 asil zincirleri hem de, örneğin, DHA, EPA, arakidonik asit (AA), linolenik (Ln) tek tek yağlı asitlerin belirlenmesi için n -3, ve oleik asit (OL) (Tablo 2 ye bakınız). 13C NMR, aynı zamanda, 14.31 (metil) δ karbon sinyalleri kullanılarak etil esterler (EE) zengin takviyeleri gibi diğer kaynaklardan gelen balık yağı karakterizasyonu ve δ 60.20 (metilen) için uygulanabilir.
C-analizi için, yağlı asitler unsurlar olabilmektedirGenel bir ilişki C'ye göre, bütün asil zincirlerinin toplam entegrali ile uygun alifatik, olefinik, ve karbonil sinyalleri entegrali bölünmesi ile daimi olarak tutturulabilir = I / S (2), C, mol analit konsantrasyonu (% burada ), benzersiz olarak ilgi konusu lipid atfedilen bir rezonans yekparedir ve S numunenin toplam lipit içeriği temsil sinyal (ler) in toplam ayrılmaz bir parçasıdır. Asil zincirlerinin toplam integral S 171 ö 175 ila δ bölgeyi entegre edilmesi suretiyle tespit edilebilir ve 100'e ayarlanır.
Balık yağının mg / g yağ asitlerinin miktarının belirlenmesi aşağıdaki ilişki bazında, bir iç standart ile yapılır: C = I / IS x A x MW / m (3), Cı-analit konsantrasyonu olduğu mg / gBalık yağı, benzersiz olarak ilgi konusu lipid atfedilen bir rezonans ayrılmaz MA, molekül, ben iç standart için benzersiz ait bir karbon sinyali alan bir dahili standart milimol olduğu 'dir, ilgili bileşiğin ağırlığı ve m (yağ metil esterleri ifade asitler için) ila g balık yağı miktarıdır. 13C NMR spektrumu tam NMR tahsisi başka 19 bulunabilir ise kantitatif amacıyla kullanılabilir balık yağı yağ asitlerinin 13C-NMR sinyalleri, Tablo 2'de gösterilmiştir.
Örnek 1, EPA sn-2 pozisyonunda: sn-2 pozisyonuna EPA miktarı (%) S tarafından 172.56 δ sinyalin integrali bölünmesi ile hesaplanır. Bir co sn-2 pozisyonunda EPA miktarımmercially kullanılabilir örnek 850 MHz aleti kullanılarak% 3.4 olduğu bulunmuştur. Bir iç standart olarak aynı spektrometresi ve BHT kullanarak, sn-2 pozisyonunda EPA miktarı mg olarak ifade / balık yağı gr 29.73 mg / g'dır. 500 MHz aleti analiz aynı örnek sn-2 konumunda% 3.6 ya da 31.39 mg / EPA g ihtiva ettiği bulunmuştur. Sn-EPA nispi moleküler oranı hesaplanırken -2 tamamen ayrılmış spektrumu kullanılarak benzer sonuçlar elde edilebilir. EPA karbonil karbon referans olarak kullanılan diğer karbonil karbonu, aynı önemsiz derecede proton ayırmayla etkilenir olmasıdır. Ölçümü için kullanılan 151.45 δ de BHT C, yağlı asitlerin karbonil karbonu ile karşılaştırıldığında farklı bir NOE donanım almak için, BHT kullanıldığında Ancak, büyük sapmalar gözlenir. O nedenle tamamen üretimden bağımsız spektrum iç standartlarını kullanarak veya c entegre olduğunca kaçınılmalıdırFarklı çokluklar ile arbons.
Örnek 2, DHA toplamı: DHA toplam miktarı (%), basit olarak sırasıyla 172.48 ve δ 172.08, δ en NMR sinyallerinin ile belirlenen sn -1,3 ve sn-2 pozisyonunda DHA miktarlarının ilave edilmesi ile hesaplanır. 1H NMR ile analiz, aynı örnek (1H analizi örnek 1 e bakınız) 13C NMR analizine göre DHA% 10.3 ihtiva ettiği bulunmuştur. DHA miktarı da bir iç standart ile Denklem 3 DHA toplamı 103.25 mg / g kullanarak mg / g olarak ifade edilebilir.
Örnek 3, SDA toplam miktarı: SDA toplam miktarı (%) -1,3 ve sn pozisyonuna SDA karbonil karbonu ait olan 172.99 δ sinyallerin integrali eklenmesi ve δ 172,60 belirlenirsn-2, daha sonra sırasıyla S tarafından toplamına bölünmesi. İncelenen örnek 3.93% SDA veya 34.54 mg / g ihtiva ettiği bulunmuştur.
Örnek 4, n -3 Ln: n -3 Ln (%) entegre S δ 131.85 sinyalin integrali bölünmesiyle belirlenebilir. Analiz balık yağı numunesi n -3 Ln molar oranı% 0,7 idi. BHT kullanılarak saf derişimi, 5.5 mg / g olarak hesaplandı.
Örnek 5, trans yağ asitleri: trans yağ asitleri mol oranı S 13.80 δ sinyalin integrali bölünmesiyle belirlenir. 1H NMR ile analiz edildi ve trans FA% 3.07 olduğu saptandı, aynı numunenin analizi, aynı zamanda 13 ° C NMR ile analiz edildi ve trans yağ asidi içeriği% 3.42 olarak bulunmuştur. T500 MHz aleti ile aynı örnek 13C NMR analizi de trans yağ asitlerinin bir 3.64% içerik ortaya koymuşlardır. Balık yağının mmol / g trans FA miktarı, bir iç standart ve denklem C BHT kullanılarak belirlenebilir = I / ancak sonuçlar nedeniyle yoğun 13.80 δ de mg / g olarak ifade edilemez, x A / m'den IS farklı MW çeşitli trans-yağ asitleri, özellikle trans-DHA ve trans EPA, tekabül eder.
Örnek 6, EE: Balık yağı örneğinde EE konsantrasyonu S, çeşitli yağ asitlerinin EE metilen karbonu karşı gelen, 60.00 ö 60.50 δ spektral alan entegrali bölünmesi ile hesaplanır. bir EE fish yağı numunenin analizi,% 100 ee oluştuğunu gösterdi. Bu unutulmamalıdır ki EE örneklerinde EPA caDHA 60.31 ve / veya 173.09 δ sinyalin δ sinyali kullanılarak hesaplanabilir ise, n, 173.60 δ veya 60.20 δ metilen EE karbon ile karbonil doruğu ile, ya hesaplanabilir.
Bu analiz için kullanılan denklem edilebilir ayrıntılı bir açıklaması bulunabilir ise 13 ° C ve 1 H-NMR analizi ile ölçülmesi amacıyla kullanılabilecek teşhis sinyallerinin tam bir listesi, sırasıyla Tablo 1 ve 2'de bulunabilir başka yerde 19.
NMR ilave balık yağı takviyeleri oksidasyon durumunun değerlendirilmesi için uygulanabilir. Şekil 3, iki oksidasyon koşulları altında bir balık yağı numunenin 1H-NMR spektrumu karşılaştırır; ultraviyole ısıtma ve maruz bırakma, (UV)Işık. Lipid oksidasyonu karmaşık bir süreçtir ve oksidasyon ürünlerinin bileşimi oksidasyon koşullarına bağlıdır. Ana oksidasyon ürünleri (8.0-8.8 δ) hidroperoksitler, konjüge dienler hidroperoksitler (δ 5,4-6,7) ve (9.0- 10, δ) aldehidlerdir.
Şekil 1. 1 H NMR analizi. 850,23 (A) ve 500,20 MHz (B) 'CDCI3 çözeltisi içinde bir balık yağı takviyesi 1H-NMR spektrumunu göstermektedir. bunların saptanması için kullanılabilir EPA ve DHA NMR sinyalleri gösterilmiştir. Δ 0.97 pik, n-3 yağ asitlerinin toplam miktarının belirlenmesi için kullanılabilir. Tüm yağ zinciri metilen protonlarına ait olarak ö 1,39-1,20 de zarf, kırpılırs ve herhangi bir tanımlama veya ölçümü amacıyla kullanılamaz. 1H NMR spektrumu, 13C NMR spektrumuna ve böylece daha düşük spektral çözünürlük ile karşılaştırıldığında daha dar spektral genişliği (G) ile karakterize edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. 13C NMR analizi. 213,81 (A) ve 125,77 MHz (B) karbonil karbon bölgesinde CDCI3 çözeltisi içinde bir balık yağı takviyesi 13C-NMR spektrumu. Sn -1,3 ve sn-2 pozisyonunda EPA ve DHA NMR sinyalleri gösterilmiştir. Bu sinyaller, EPA ve DHA kantitatif tayini için kullanılabilir. sPE rağmen213,81 MHz'de kaydedilmiş ctra daha yüksek bir çözünürlük ve hassasiyet ile karakterize edilir, 125,77 MHz spektrumları ana bileşiklerin belirlenmesi için kullanılabilir. 13C NMR deneyinde ayırma uygulama karbon ve hidrojen çekirdekleri ve tekli 1H NMR spektrumuna göre analiz kolaylaştırır olarak böylece sinyaller görünür arasında skalar bağlama etkisini ortadan kaldırır. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 3. Balık yağı oksidasyonu. Oksitlenmiş balık yağı 1H NMR spektrumu, oksidasyon koşullarına bağlıdır. Hidroperoksitler (δ 8,0-8,8), c atfedilen rezonanslaronjugated dienler hidroperoksitler (δ 5,4-6,7) ve aldehitler gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
δ ppm Proton bileşik
0.677 CH3 (18) Kolesterol
0,678 CH3 (18) 7-dehidrokolesterol
0,88 CH2 CH3 (t), J-ω1, ω2 = 7.27 Hz n, -9, SFA asil zincirleri
0.883 CH2 CH3 (t), J-ω1, ω2 = 7.08 Hz N -6 asil zincirleri
0.911 CH2 CH3 (t), J-ω1, ω2 = 7.65Hz Trans asil zincirleri
0.973 CH2 CH3 (t), J-ω1, ω2 = 7.63Hz n -3 asil zincirleri
1.25 CH2 CH3 (t), J = 7.20 Hz Etil esterler
1,697 OCOCH2CH 2 (t): J, H α, Η β = Hz EPA asil zinciri
2,391 OCOCH 2 CH2 (t) DHA asil zinciri
2,772 CH = CHCH2 = CH N -6 asil zincirleri
2.81 CH = CHCH2 = CH n -3 asil zincirleri
3,593 3'a-CH2-OCO 1-MAG Gliserol
3,722 3'a, 3217, b-CH2-OCO (br) 1,2-DAG Gliserol
4,073 2'-CHOH (br) 1,3-DAG Gliserol
4,121 CH2 CH3 çoklu Etil esterler
4,173 1'B, 3'b-CH2-OCO (dd) 1,3-DAG Gliserol
4,238 1'a-CH2-OCO (dd) 1,2-DAG Gliserol
4,329 1'B-CH2-OCO (dd) 1,2-DAG Gliserol
4,989 -CH = CH2 cis (dd) N -1 asil zincirleri
5,052 -CH = CH2, trans (dd) N -1 asil zincirleri
5,082 2'-CHOCO 1,2-DAG Gliserol
5,268 2'; -CHOCO TAG Gliserol
5,436 CH = CHCH2 = CH2 N -1 asil zincirleri
5,818 -CH = CH2 N -1 asil zincirleri
Tablo 1: 1 H NMR spektrumu atanması. CDCI3 çözeltisi içinde ölçümü amacıyla kullanılabilir balık yağı yağlı asit sinyallerinin 1H-NMR kimyasal kaymaları sunulmaktadır. kimyasal kaymalar ppm cinsinden ölçülür ve çekirdeklerin kimyasal çevre hakkında bilgiler sağlar.
δ ppm Karbon
173,24 C1-SFA (1,3 sn)
172,21 C1-OL, Ç (-1,3 sn)
C1-ETA (-1,3 sn)
173,13 C1-DPA (a-1,3 sn)
173,03 C1 yönde (1,3 sn)
172,97 C1-EPA (1,3 sn)
172,73 C1-ETA (sn-2)
172,69 C1-DPA (sn-2)
172,61 C1 yönde (sn-2)
172,56 C1-EPA (sn-2)
172,48 C1-DHA (1,3 sn)
172,08 C1-DHA (sn-2)
128,45 C17, n -3
126,86 Cω4, bütün n -3
60.08 DHA, etil esterler
59.96 EPA, etil esterler
59,95-59,85 Diğer FA, etil esterler
33.48 C2-EPA sn-2
33,32 C2-EPA sn -1,3
31.44 C3-n -1
27,05 Allilik n -6
24.48 C3-SDA sn -1,3
24,44 C3-SDA sn-2
14.27 Cω1, bütün n -3
Tablo 2: 13 ° C NMR spektrumunun atanması. Kantitatif kullanım amacı kullanılabilir balık yağı yağlı asit sinyallerinin 13C-NMR kimyasal kaymalarıCDCI3 çözeltisi içinde işletim sistemleri sunulmaktadır.
Yan Şekil S1: 13C-NMR spektrumları arasındaki karşılaştırma standardı geniş bant dekuplaj (A) ve (B) 'puls dizileri girişli kesme, ters kullanılarak elde. spektrumları aynı işlem parametreleri ile işlenmiş tarama aynı sayıda aynı örnek için kaydedilmiş ve aynı ölçek faktörü ile gösterilmiştir. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Sorun Giderme için Değişiklikler ve Stratejileri
Spektral kalitesi. NMR sinyalinin ve böylece NMR spektrumunun çözünürlük çizgi genişliği manyetik alanın homojenlik optimizasyonu için bir işlem olup, bu, shimming son derece bağlıdır. rutin analizler için, 1D pullanma yeterli ve 3B pullanma bu düzenli bir şekilde NMR personel tarafından gerçekleştirilmesi göz önüne alındığında, gerekli değildir. O (90:10) D2: bu durum söz konusu değilse, bir 3D pullanma H2O 0.6 mL içeren bir numune kullanarak, analizden önce gerçekleştirilmelidir. daha iyi ve daha hızlı bir pullanma elde etmek için, örnek mıknatısın deliğin içine yerleştirilmeden önce, kademeli derinlik ölçer kullanılarak, radyo frekansı (RF) bobin uyarım / algılama bölgesinde merkezli edilmesi gerekmektedir. pullanma etkileyen diğer bir faktör 10-20 Hz bir dönme hızında örnek iplik olup. Bu dönüş hızında örnek iplik radyal şim artırır, ancak (X, Y, X,Y, XZ, YZ, X2-Y2, vs.), genel olarak birinci ya da daha yüksek seviyedeki eğirme yan bantlar görünümünü önlemek için tavsiye edilmez. Larmor faaliyet araçlar üzerinde çalışan daha düşük 400 MHz frekanslarında, ancak, büküm 1D NMR deneyleri için tavsiye edilir.
Çözünürlük, hem de hassasiyeti, alıcı kazancı (RG) değeri etkilenir. Alıcı kazancının Düşük değerler analogdan-dijitale dönüştürücü (ADC), uygun neden taşma daha küçük olan değerler ise daha yüksek hassasiyeti azaltır. serbest indüksiyon çürüme (FID) ilk noktalar kaybolabilir ADC taşma asimetrik hattı şekilleri ile sonuçlanır ve sinyaller kantitatif amacıyla kullanılamaz. Çoğu durumda, komut "rga" uygun bir rg değerini hesaplar. Bununla birlikte, bazı durumlarda, bir yazılım ile hesaplanan Rf değeri ideal değerden daha yüksektir ve NMR sinyalinin Lorentz şeklinde bir bozulma vardır. İçindeBöyle bir durumda, kullanıcı gereken komut satırında "rg (değeri)" yazarak manuel girişi daha küçük bir RG değer. Bu protokol ile analiz edilen örneklerin için tipik bir RG değeri 8'dir.
kriyojenik kullanıldığında genellikle, yüksek bir kalite faktörüne (Q faktörü) son nabız ve algılama süresi arasında büyük bir gecikme (ölü zamanı)> 200US ile NMR problar soğutuldu, örneğin vericinin frekansı etrafında bir tümsek olarak bozulmaları önlemek için gereklidir ve spektrumun, taban haddeleme. Bununla birlikte, bu kadar uzun bir gecikme de güçlü sinyaller tabanı etrafında bir başlangıç ​​haddeleme ve büyük eğimler neden olabilir büyük bir olumsuz birinci dereceden faz, hataya neden olur. Küçük bir hassasiyet azalması 23 oluşabilir, ancak bu durumda, z-geri spin-eko puls dizisi, önemli ölçüde geliştirilmiş taban ile NMR spektrumlarını oluşturmak için kullanılabilir.
Fosfolipitler. balık yağının analizine ek olaraktrigliseridler ve etil esterler zengin örnekleri NMR fosfolipid (PL) bakımından zengin balık yağı numunelerinin analizi için kullanılabilir. PL şekilde agregalar, spektral çözünürlük ve duyarlılık önemli ölçüde azalmaya neden olabilir Ancak, özel bir dikkat bu örnekler için gereklidir. Metanol: bu örneklerin analizi, döterlenmiş kloroform oluşan bir çözücü karışımı için: 70:30 oranında (CDCI3 CD3OD) yüksek kalitede spektrumları elde etmek için gereklidir.
İç standart. Basit 1 H ve 13C NMR spektrumları ile son derece simetrik bir moleküldür ve tepe hiçbiri balık yağı bileşenleri ile örtüşen için BHT bu çalışmada, bir iç standart olarak seçildi. Ve bir sinyal de - BHT 6.97 δ bir singlet olarak görünür ve iki eşit aromatik protonları (OH grubuna göre para konumunda) aittir 1H NMR spektrumunda bir sinyal alır-OH grubu taşıyan bir aromatik kuaterner karbon ait 13C NMR spektrumunda δ 151,45. Bu sinyallerin her ikisi de balık yağı bileşenleri herhangi bir örtüşme vardır ve bu nedenle ölçümü amacıyla kullanılabilir. Örneğin 1,2,4,5-tetrakloro-3-nitrobenzen (TCNB) ya da metilen klorid gibi diğer bileşikler de bununla birlikte, daha uzun T1 değerlerle karakterize edilmiştir, alternatif dahili standart olarak kullanılabilir.
Balık yağı takviyeleri, çeşitli yağ asitleri ve lipitlerin ölçümü 1D spektrumlarında uygun tanısal NMR sinyallerinin entegrasyonu ile elde edilir. Bu tür sinyaller sadece belirli bir örnek bileşenine ait olmalıdır ve diğer bileşiklerden sinyalleri ile bir girişim olması gerekir. 1H NMR spektrumu, düşük çözünürlüklü ile karakterize edilir, çünkü bu nedeniyle che kısa dizi 1H NMR analizi için bir sorun olabilirmical kaymalar. Buna ek olarak, sayısal bağlantı varlığı (J) çoklular üretir ve analiz daha karmaşık hale getirir. Örneğin, etil esterler (EE), 1.25 δ de metil grubu karakteristik triplet (J = 7.20 Hz) 1 * H NMR kullanılarak ölçülebilir ve ester grubunun metilen protonlarının ait çoklu 4.12 δ de. Larmor faaliyet NMR aletleri kullanılarak daha düşük 850 MHz frekanslarında, ancak, 1H NMR ile EE analizi TG 4.14 δ tepe noktası ile 4.12 δ de nedeniyle pik kısmi üstüste gelme kaçınılması ve örtüşen olmalıdır 1.23-1.35 δ de alifatik metilen protonlarının geniş sinyal ile δ 1.25 sinyali. Büyük sapma bazı örneklerde EPA 1H ve13C analizi arasında gözlendi, 13C NMR t sağladığı etiketli bileşimin daha yakın olano üreticisi. Bu durum, balık yağı takviyeleri bazı türlerinde görülen diğer bileşiklerin sinyalleri, EPA analizi için kullanılan ö 1.69 sinyalin örtüşen, muhtemelen. Bir iç standart kullanılarak zaman sayımsal Ek hatalar nedeniyle iç standardın belirsiz saflığa ve tartı hatalardan kaynaklanabilir.
kompozisyon analizi, dahili standart kullanılmadan nispi molar konsantrasyonları ile ifade edilebilir. Sonuçlar yağ (mg / g) gramı başına yağ asidi miligram olarak, örneğin mutlak konsantrasyonları olarak ifade edilmesi gerekiyorsa, dahili bir standart kullanılması gerekmektedir. Bir iç standart kullanılarak bile Fakat, söz konusu NMR sinyali, farklı moleküler ağırlıklara sahip birden çok bileşikler ait durumlarda, sonuç mg / g olarak ifade edilemez. Buna ek olarak, iç standart kullanılması genellikle analiz uzunluğunu arttırır en yaygın iç s nedeniyle BHT olarak tandards, uzun dinlenme süreleri ile sonuçlanan yüksek moleküler simetri, küçük moleküllerdir. Darbeler arasında daha uzun gecikmeler gerekli olduğu kadar tekrarlama zamandan beri (darbeler + elde etme zamanı arasında geçen süre) numunede en uzun gevşeme süresi, T 1 'e göre ayarlanır, dahili bir standart kullanımı deney süresinin uzamasına neden olur. Bunun nedeni, karbon çekirdeği arasında son derece uzun bir T1 gevşeme zamanı 13C NMR analizi için özellikle önemli bir faktördür. Cr (AcAc) gibi bir paramanyetik bileşiğinin eklenmesi 3 etkin biçimde T 1 gevşeme süresini azaltabilir. Cr (acac) 3 tavsiye edilen yoğunlukta / çözeltiden 0.75 mg'dır. Cr (acac) 3 yüksek konsantrasyonlarda T 1 daha da azaltılması için kabul edilebilir, ancak, dikkatli, hat genişletilmesi için, S / N düşmesini engellemek için gereklidir.
13C NMR 1 H kıyasla çok daha yüksek bir spektral çözünürlük ile karakterize edilir, ancak ntent ">, 13C NMR deneyin duyarlılık (düşük olması nedeniyle, doğal bolluk (% 1.1) ve düşük dönermıknatıslık oranının 67.26 10 önemli ölçüde daha düşüktür analiz için uygun yağ sınırlı olduğunda artan bir çünkü 6 rad s-1 T-1) 13 ° C çekirdeklerin. Buna ek olarak, 13 ° C, uzun T1 gevşeme süreleri. Bu bir sorun olabilir analiz uzunluğunu artırmak taramaları sayısı gürültü oranı makul bir sinyal elde etmek için kullanılmalıdır.
duyarlılık ve NMR spektrumları çözünürlükte Sınırlamalar GC gibi başka teknikler ile analiz edilebilir balık yağı içinde çok sayıda küçük bileşiklerin analizi engeller. Örneğin, 1 Η NMR bağımsız sterol veya 13 ° C iken, yağ asitleri (örneğin, palmitik ve stearik) ayırmak için mümkün olduğu173.24 ve 172.82 δ δ tüm doymuş yağ asitlerinin sinyalleri ile üst üste gelecek şekilde dodekanoik ve miristik asit gibi balık yağı içinde çok düşük bir konsantrasyonda görünür bileşikleri belirlemek mümkün değildir. incelendiğinde numune miktarını artırmak mümkün bazı küçük bileşiklerin analizini yapar, ancak, dikkatli nedeniyle artan viskozite, çok konsantre örnekleri için gereklidir. S / N azalma, düşük spin-spin T2 gevşeme sürelerine neden hat genişlemesine yoktur, çünkü daha fazla petrol 150 mg ihtiva eden çok viskoz çözeltiler kaçınılmalıdır. Buna ek olarak, darbeler arasında uzun gecikmeler nedeniyle uzun T 1'in gerektirdiği ve shimming ve böylece çözünürlükte çeşitli sorunları vardır edilir.
NMR ile balık yağı analiz edilen tüm bileşikler, herhangi bir ayırma veya saflaştırma adımları kullanmadan bir enstantane, aynı anda belirlenebilir. NMR,13C NMR etme 10 dakika sürer ise 1H spektrumu, bir dakikadan daha az olarak kaydedilebilir olarak alysis hızlıdır. Veri toplama süresini etkileyen birkaç faktör vardır ki, unutulmamalıdır. Spesifik olarak, 13 ° C NMR, 10 dakika çalışma süresi sadece dahili standartlar kullanılmadan da elde ve RF bobini ve ön yükselteç soğutulur ve böylece ısıl gürültü minimize edildiği kriyojenik soğutuldu probların kullanımı ile yapılabilir. Oda sıcaklığı (konvansiyonel) probları kullanıldığında deneysel zaman içinde bir 10-15 kat artış 13C NMR analizi için beklenmelidir.
NMR spektroskopisi balık yağı takviyeleri bileşimin nitel ve nicel olarak belirlenmesi için güçlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır, ve sürat ve bu bir potansiyele sahip olduğu geniş bir nu yüksek verimli tarama için uygulanacak Balık yağı numunelerinin ıs ı. Sinyal alanı sinyali neden çekirdeklerin sayısı ile doğru orantılıdır, çünkü NMR spektroskopisi tanım olarak kantitatif bir yöntemdir. Akut toksik kimyasallar NMR numuneleri hazırlamak için gerekli iken örnekleri elüte etmek için çözücü madde büyük miktarlarda gerektiren diğer yöntemlere zıt olarak, bu kimyasal maddelerin (örneğin, CDCI3) gibi küçük miktarlarda kullanılır, çünkü, bu yöntem, çevre dostudur. Ayrıca, NMR diğer analitik yöntemlere göre çeşitli avantajlara sahiptir. standartlara Kalibrasyon öncesinde analiz gereklidir ve her ayırma ve saflaştırma aşamaları olmadan en az bir numune hazırlama genellikle NMR çok hızlı bir analitik araç bir hale getiren benimsenmiştir. Buna ek olarak, 13C NMR gliserol iskeleti üzerinde çeşitli yağ asitlerinin konumsal dağılımının belirlenmesi için mevcut en iyi yöntemdir. Enzimatik hidroliz, alternatif olarak kullanılmış olsa da her zaman güvenilir değildir= "xref"> 24. Insan beslenmesinde 25, 26 kendi işlevini etkilediği bulunmuştur olarak gıdalarda çeşitli yağ asitlerinin regiospecificity okuyan önemli bir ilgi vardır, çünkü bu belirli bir önem taşımaktadır.
NMR analizi ve ürünlerin etiket arasında anlaşmaya rağmen, hem GC ve NMR arasındaki anlaşmayı gösteren bazı çalışmalar vardır aslında, biz daha titiz ve kapsamlı içi laboratuar çalışmaları NMR ve geleneksel arasındaki anlaşmayı incelemek için gerekli olduğuna inanıyoruz örnekler, farklı kökenlerden gelen balık yağı ürünleri daha büyük bir sayıda kullanarak balık yağı bileşenleri analizi için yöntemler, sertifikalı standart çözeltiler.
balık yağı analizinde NMR diğer bir önemli yönelik uygulama oksidasyon ürünlerinin belirlenmesi olacaktır. belirlenmesi ve buna ek olarakBalık yağı büyük bileşiklerin, örneğin aldehitler ve peroksitler gibi balık yağı çeşitli birincil ve ikincil oksidasyon ürünleri, bulunur. Şekil 3'te gösterildiği gibi, 1H-NMR, potansiyel olarak, farklı oksidasyon koşulları altında, balık yağı takviyeleri oksitleme durumunun değerlendirilmesi için uygulanabilir. Bu analizde en büyük zorluk NMR tahsisi ve bireysel oksidasyon ürünlerinin tanımlanması olacaktır. NMR donanım hassasiyeti ilerlemeler de, 13C NMR kullanarak tek tek sterol tanımlanmasına izin verir. NMR spektroskopisi (HR-MAS) NMR İplik Yüksek Çözünürlüklü Magic Angle kullanarak bile herhangi bir çıkarma olmadan bir bütün olarak balık doku analizi için uygulanabilir.
Kantitatif NMR spektrumları doğruluğunu etkileyen en önemli adımları iki 90 ° 'lik bir atımın seçimi ve pu arasında bir gecikme kullanılmasını içerirLSKÖ ≥ 5 x T1. darbe açısı enstrümantasyon ve örnek bağlı olan bir kalibre NMR parametredir darbe genişliği ile orantılıdır. Bir 90 ° atma gözlemlenebilir transvers (xy) manyetizasyon boyuna (z) manyetikleşme tam dönüşüm için gereklidir. Darbe Kalibrasyon öncesinde NMR iyi ayarlanmış ve eşleştirilecek ihtiyaçlarını problanmıştır dikkat etmek önemlidir. Bu numuneye, RF güç transferi optimize etmek ve böylece, S / N üst düzeye çıkarmak ve etkili bir şekilde ayrılmasını sağlayacaktır. Prob ayarlama çok numunenin dielektrik sabiti etkilenir, bu nedenle örnekler arasında konsantrasyonda bir fark olup olmadığını, her biri için ayar işlemi tekrar edilir. 1D 13C NMR deneyi hem 13 ° C ve 1 H-kanallar için otomatik ayarlama içerir ve eşleşen iki çekirdekleri için gereklidir.
5 x T 1 daha uzun pulslar arasında bir gecikme tam rec sağlarbaşlangıç ​​değerine net mıknatıslanma overy. spektrumda tüm rezonansları tamamen her bir atım önce rahat değil, sinyal kısmen bastırılır ve bu entegrasyonun hatalara neden olmaktadır. T1 değeri deney uzunluğu etkileyen önemli bir faktördür ve bu manyetik alan gücü hem de numunenin viskozitesine bağlıdır. Numuneler arasındaki viskozite benzer olduğu göz önüne alındığında, T 1 gevşeme süreleri sadece analiz oturumun başında, her enstrüman için belirlenmelidir.
13C NMR ile balık yağı analizinin bir diğer önemli özelliği, uygun darbe dizisi seçimidir. Nicel13C analizi için en güvenilir yöntem geniş bant proton ayırma elde etme süresi boyunca tatbik edilir ve bu şekilde 13 1 H polarizasyon transferi yoktur ayırma deneyi, kapı tersidirNükleer Overhauser etkisi (NOE) üzerinden ° C. tam olarak ayrılmış NMR deneyi kantitatif amaçlar için kullanılabilir iken kaçınılmalıdır farklı çok yönlü ve metil, metilen, metan ve karbonil karbonları arasında dolayısıyla entegre karşılaştırma ile karbonlu arasında farklı NOE faktör vardır, çünkü bu deneyi kullanılarak, ancak, dikkatli olunmalıdır. Benzer çokluğu ve kimyasal ortamının sadece karbon analizinde dikkate alındığında, bu rağmen, tam olarak ayrılmış bir yöntem güvenilirdir. Bunun bir örneği, 27 ayırma sonra NOE faktörler arasında anlamlı bir farklılık olduğu tespit edilmiştir yağlı asitlerin karbonil karbondur. Buna ek olarak, karbon taşıyan protonlar için, tam olarak ayrılmış deney bağlı NMR sinyali yoğunluğuna NOE katkıları daha yüksek hassasiyet sağlamaktadır. Iki darbe dizileri ile alınan spektrumları arasındaki bir karşılaştırma Şekil S1 'de gösterilmiştir.
Bu çalışma Ohio State Üniversitesi Sağlık Discovery Tema Foods ve Ohio State Üniversitesi Gıda Bilimi ve Teknolojisi Bölümü tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Ohio Eyalet Üniversitesi NMR tesis ve Penn State Üniversitesi NMR tesis teşekkür etmek istiyorum.