Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney | Protocol (Translated to Turkish)
CD4 İzolasyon Miltenyi MACS Arıtma Fare lenfüğümleri + T hücreleri…
Kemirgen Lenf Düğümü Stromal Hücrelerininasyonu…
Böbrek Bağışıklık Hücreleri Güvenilir ve Yüksekik Ekstraksiyon…
DNabT hücreleri periferal T-hücreleri arasında nadirdir; Bununla birlikte, belli olmayan lenfoid dokuda bol miktarda bulunmaktadır. Non-lenfoid doku DN T hücrelerini izole Zorluk patofizyolojik önemini kabul kapasitelerine rağmen fonksiyonel analizini engellemektedir. Bu murin böbreğinden yüksek derecede arıtılmış DN T hücrelerinin izole edilmesi için yeni bir protokol açıklar.
Lenfoid olmayan dokulardan DN T hücrelerinin izole edilmesi için standart bir protokol, çeşitli immün yanıtların onların daha çok rapor katılımı rağmen bulunmamaktadır. DN T hücreleri Allotransplantlar 1-6 bağışıklık ve oto-bağışıklık yanıtlarını ve tolerans düzenlenmesinde implike edilmiştir özel bir immün hücre türüdür. DN T-hücreleri, periferik kan ve sekonder lemfoid organlarda (dalak ve lenf düğümleri) nadir, ancak, fakat normal böbrekte önemli sakinleri vardır. Çok az nedeniyle çevrede kendi azlığı onların patofizyolojik işlevi 7 hakkında bilinmektedir. Biz son zamanlarda sürekli halde ve iskemi reperfüzyon yaralanması esnasında böbrek 8'de bu nüfusun kapsamlı bir fenotipik ve fonksiyonel analiz nitelendirdi. DN T hücresi işlevinin analizi büyük ölçüde böbrek kendi izolasyon için bir protokol geliştirilerek artırılacaktır.
Burada, biz isolatio sağlayan bir roman protokol açıklarMurin böbrekten oldukça saf ab CD4 + CD8 + T hücreleri ve T hücre DN n. Kısaca, biz kollajenaz kullanılarak böbrek doku sindirmek ve yoğunluk gradyanı ile böbrek mononükleer hücreleri (KMNC) izole. Bu KMNC den% 70 'den% 3 hematopoietik T hücreleri zenginleştirmek için iki aşama takip eder. İlk adım, CD45 + izolasyon kiti kullanılarak hematopoietik hücrelerin pozitif seçim oluşur. İkinci aşamada, DN T hücreleri negatif CD4, CD8 ve MHC sınıf II monoklonal antikorlar ve CD1d α-GalCer tetramer kullanılarak olmayan arzu edilen hücreler ayrılmasıyla izole edilmektedir. Bu strateji,% 90'dan fazla saf DN T hücre popülasyonu yol açar. , FACS analizi ile, ardından yukarıda belirtilen antikorlar ile lekeleme yüzey saflığını teyit etmek için kullanılır.
Periferik αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - double-negatif (DN) T hücreleri fenotip ve işlevlerini 1-4 sahip çeşitli tiplerin ayrılır. DN T hücreleri, tam olarak anlaşılamamıştır, fakat çok daha farklı hastalık modellerinde 4-6 patofizyolojik bağışıklık tepkilerine dahil edilmektedir.
DN T hücrelerinin artan çeşitli bağışıklık ve oto-bağışıklık tepkilerinin düzenlenmesi ve allotransplant tolerans modülasyonunda rol benzersiz bir bağışıklık hücresi bir türüdür. 4-6, 9 Bunlar dalak ve lenf düğümleri (periferal kan ve sekonder lemfoid organlarda nadirdir .) Ancak, normal böbrek ve bağırsak epitel 10-12 önemli sakinleri vardır. Çok az kararlı halde böbrekte işlevlerine yaklaşık 7 ve böbrek transpl ile bağlantılı akut böbrek hasarı (AKI) gibi patolojik koşullar altında bilinirkarınca.
Çünkü her oyuncunun rolünü tanımlayan, alloresponses de dahil olmak üzere bağışıklık tepkilerini düzenleyen farklı bağışıklık hücrelerinin karmaşık rolleri alloresponses anlamak ve yeni terapötik tasarımı önemlidir. Ve fizyolojik koşullar altında, farklı hastalık, böbrekte bulunan DN T hücrelerinin önemli sayıda göz önüne alındığında, DN T hücreleri transplant alıcılarında kritik farelerde ve insanlarda bağışıklık ve oto-bağışıklık tepkileri düzenlenmesinde bir rol oynayabilir ve alloresponses muhtemeldir. Hala dağınık delil olsa Biriken hem patojenik ve bağışıklık fonksiyonları DN T hücrelerini implicates ama neden ve nasıl belli bir zararlı ya da baskılayıcı fonksiyonunu sergilemek ve çevre onları nasıl etkilediğini de anlaşılamamıştır.
Nedeniyle böbrekte düşük bolluğu nedeniyle, izolasyon geliştirilmiş yöntemler gerekmektedir.
T DN T hücrelerinin izole edilmesi için standart bir protokol bulunmamaktadıro non-lenfoid dokular. Bizim protokol böbrekten DN T hücrelerinin izole edilmesi için yeni bir yöntem tarif eder; Bununla birlikte, yöntem, aynı zamanda, çeşitli lenfoid olmayan dokular için kullanılabilir.
1.. Araçların hazırlanması, Kültür Medya ve Reaktifler
Araçlar: steril koşullar altında reaktifler hazırlamak ve bir laminar akış başlığı altında kullanmak.
Fetal sığır serumu% 5, bikarbonat, 2.1 g, 10 ml 100 x glutamat, HEPES, 10 mg, 1 mg sodyum piruvat ve 10 ml 100 x penisilin / streptomisin eklemek, RPMI doku kültür ortamı 1 L hazırlayın.
Not: Önerilen doku kültür ortamı, RPMI, DMEM ile değiştirilebilir.
% 5 kolajenaz "D" çözeltisi (doku kültürü ortamında 9 ml kolajenaz "D" 5 ml) hazırlayın.
% 100,% 80 ve% 40: Üç farklı konsantrasyonlarda Percoll çözeltisi olun. Şu konsantrasyonlar 1 numune için hesaplanır. Oda sıcaklığında çözümler tutun.
Percoll çözeltisi (stok çözeltiden) seyreltilmemiş Percoll 9 ml ekleyin; PBS 10x 1 ml ekleyin.
Percoll çözeltisi:; Percoll 8 ml% 100 eklemek PBS 1x 2 ml ekleyin.
Perkol çözüm:Percoll% 80 4 ml; 1x PBS içinde 4 ml.
(FACS) tampon sıralama floresan-aktive edilmiş hücre için 1 L olun; 5 ml% 10 BSA (% 0.1 BSA), 1 ml% 10 sodyum azid (0.1%), 2 ml EDTA maddesi, 1 x PBS ile 1000 ml'ye ekleyin.
Böbrek sindirim 2. Hazırlanması
, Gerekli kurumsal onayı edinilen standart yöntemlerle fareler kurban ve asıl bulbus olfaktoryusları alındı ​​ve mevcut yönetmelik ve hayvan bakım yönergeleri izleyerek olması.
Pentobarbital (0.07 mg / kg) ile fare anestezisi.
Bir cerrahi masaya yatar pozisyonda fare yerleştirin.
% 70 etanol ile karın bölgesinde püskürtün.
Petri kabına kollajenaz D çözeltisinin 10 ml ilave edilir.
Çıkarın ve her fareden her ikisi de böbrek açarlar.
Için sternum karın derisi ve karın zarı aracılığıyla bir orta hat kesi yaparak üşüme boşluğu açınpubis.
Tarafına lateral olarak bağırsak hareket ile sol böbrek Açığa.
Dikkatlice forseps ile sol kapsülü ayrı.
Not: Kapsül böbrek çevreleyen şeffaf bir katman olarak görünür ve kısmen perinefrik adipoz doku ile kaplı.
Bir cerrahi makas kullanarak pedikül damarlarını keserek sol böbrek çıkarın.
Sağ böbrek için aynı işlemi tekrarlayın.
Not: sağ böbrek daha kranial ve orta hat (pedicels kısa olan) daha yakındır.
Petri kabı içine böbrek yerleştirin.
Normal bir metal şekillendirme bıçağı kullanılarak küçük parçalar halinde böbrek doku (boyut olarak 1-2 mm) kesme ve (Şekil 1) 37 ° C kuluçka makinesi içinde 30-45 dakika boyunca kolajenaz çözeltisi içine parçaları yerleştirin.
Böbrek sindirimden Böbrek Mononükleer Hücreleri (KMNC) 3 eklenmiştir. Hazırlanması
Böbreğin, bir hücre süspansiyonu elde edilirmekanik olarak doku kültürü ortamı içinde 25 ml bir süzgeç (70 um) ve tekrar süspansiyon ile karıştırın doku bozarak sindirim.
Hücre süspansiyonu topak haline 4 ° C'de 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
Çok yavaş ve dikkatli bir şekilde% 40 Percoll çözeltisi 4 ml pelet yeniden askıya ve yavaşça bir transfer plastik bir pipet ile% 80 Percoll çözeltisi üzerine 4 ml kaplar. Bu açıkça bir saydam tabaka ile birbirinden ayrılmış iki aşamada neden olur. Bunun üzerine lipidler tekabül eden san bir tabaka olacaktır.
Fren kapalı modunda santrifüj ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüjleyin.
Aspirasyon ile sarı ve kalın üst tabakası (yaklaşık 1-2 ml) sökün.
Bir transfer pipeti ile iki fazın arayüzünden hafif beyazımsı saydam tabaka toplayın. Çok dikkatli doku kültür ortamı ihtiva eden 2 ml, 15 ml konik bir tüp içine aktarmak ve bu süspansiyon daha sonra bir toplam hacmin orta bölgesinin 13 ml ekleyin15 mi.
4 ° C'de 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüje
Ortamın 1 ml numune yeniden süspanse edin.
Bir menositometrede mavisi ile dışlama kullanarak KMNC sayısını saymak ve Böbrek başına ml başına KMNC numaraları gibi sonuçları ifade eder.
Bir kez yukarıdaki gibi yıkayın.
KMNC 4. Hematopoetik İzolasyonu (CD45 +) Hücreler (Aşama I)
Çalışan tampon 90 ul içine 10 7 hücreleri yeniden süspanse.
CD45 mikro-10 ul ilave edin ve 4 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe
Reaksiyonu durdurmak için çalışan tampon 1 ml ilave edilir. Çalışan tampon 500 ul, 4 ° C ve tekrar süspansiyon 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
Mıknatıslarında yerleştirerek manyetik sütun hazırlayın ve çalışan tampon içinde 3 ml ile yıkayın.
Manyetik kolonundan hücre süspansiyonu geçmek ve sütundan geçer etiketlenmemiş hücreleri toplamak.
Runn 3 ml hücreler üç kez yıkayıntampon ing. Daha sonra çıkış maddesinin toplar.
Ayırıcı ve pipet sütunlar üzerine çalışan tampon 5 ml sütun çıkarın ve hemen etiketli kısmını dışarı floş. Bu fraksiyon, CD45 + hücreleri içerir. Hücreleri saymak.
Böbrekler, farklı T-hücreleri alt-mutlak sayısını hesaplamak için akış sitometrisi ile pozitif hücrelerin yüzdesi (Şekil 2) ile KMNC toplam sayısı çarpın.
Negatif Seçim ile CD45 + Hazırlık DN T Cell 5. İzolasyonu (Aşama II)
Aşağıdaki biyotinile edilmiş antikorların her biri 2.5 ul (0.5 mg / ml, 1.25 ug) ekleyin, anti-CD4, anti-CD8, anti-Fc reseptörü (CD16/32), anti-MHC class II (IA b), anti- Her 10 7 hematopoietik hücreler için CD1d PBS-57 tetramer.
Soğuk bir odada 30 dakika boyunca inkübe hücreleri.
1 ml anti-Biotin, mikro-boncuklar ekleyin.
Soğuk bir odada 30 dakika boyunca inkübe edin.
T tüpü yerleştirinO mıknatıs ve tükenmesi geçin.
Bir hemasitometre kullanarak negatif fraksiyonunda DN T hücrelerinin toplam sayısını belirlemek için canlı hücreler sayılır.
Ilk kapısı CD45 +, ikinci kapısı TCRαβ +: Bu yolluk strateji izleyerek akış sitometri ile DN T hücrelerinin saflığını kontrol edin. CD1d + hücreleri hariç. CD8 + vs arsa CD4 + T hücrelerini DN (Şekil 3) tespit etmek.
Saflık yüzdesi ile belirlenen toplam sayısı çarpın.
Not:% 90'dan fazla saf DN T hücre popülasyonu içinde bu protokol kullanılması,.
Yabani tip C57BL / 6 (B6), böbrek böbrek başına yaklaşık 1.5-2.1 x 10 6 mononükleer hücreleri içerir. Yaklaşık olarak en fazla% 10 CD45 + hematopoietik hücrelerdir. % 5 kolajenaz ile sindirme ile ve ardından, Şekil 1'de gösterildiği gibi böbrek tek çekirdekli hücreleri (KMNC) hazırlanması için, böbrekler küçük parçalar halinde kesilir.
Bu KMNC tabakası (Şekil 2, sol panel) toplamak için, bir yoğunluk gradyan santrifüj gerçekleştirilerek takip edilir. KMNC sonra bölüm 4 (STEP I) 'de tarif edildiği gibi CD45 + manyetik mikro-boncuklar kullanılarak pozitif seçime tabi tutuldu. Kolon bağlı sonra hücreler FACS ile yıkanır ve CD45 + için analiz edilmiştir. Bu, akış sitometrisi (Şekil 2, orta panel) ile yapılan analiz, yaklaşık 80-95% için CD45 + hücrelerinin zenginleşmesine yol açar. Zenginleştirilmiş hematopoietik CD45 + hücreleri arasında, yaklaşık% 40-60 TCR + (veriler gösterilmemiştir) αβ olduğu, yaklaşık 30-60% DN T hücreleri (Şekil 2, sağ panel) idi.
CD4 +, CD8 +, sınıf II MHC + ve biotin spesifik mAb ve anti-biyotin ve manyetik mikro-boncuklar kullanılarak sütun CD16/32 + hücreleri etiketlemek ve kaldırmak için negatif seçim için zenginleştirilmiş CD45 + hücreleri dahil tabi son aşama. (Şekil 3) DN T hücreleri (% 90-95) yüksek ölçüde saflaştırılmış Bu sonuç. Bu protokolün ardından 0,5 x 10 6 hematopoetik CD45 + fare (iki böbreği) başına manyetik etiketli hücrelere kadar elde etmek mümkün oldu.
Şekil 1.% 5 kollajenaz çözeltisi ile sindirim için böbrek hazırlanması. Fare böbrek 1-2 mm, küçük parçalar halinde kesilmiş ve kazmak için, 30 dakika boyunca kolajenaz D% 5 çözeltisi yerleştirilirestion. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
. Böbrek gelen CD45 + hematopoetik hücrelerin zenginleştirilmesi için Şekil 2 Strateji Sol:.. Pozitif seçimi ile CD45 + kitini kullanarak zenginleştirme önce böbrek MNC CD45 boyanma Merkezi: Pozitif seçimi ile CD45 + kitini kullanarak zenginleştirme sonrası böbrek MNC CD45 boyama Doğru.: Geçitli CD45 + hücreler, farklı T hücre alt kümelerinin arasında αβTCR + hücreleri CD4 ve CD8 profil. , bu fi büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınızGüre.
. Izole DN T hücrelerinin Şekil 3 Saflık Sol:. Negatif seleksiyon tarafından izole böbrek DN T hücrelerinin CD45 boyama Merkezi:.. Negatif seleksiyon tarafından izole böbrek DN T hücrelerinin TCRαβ boyama Sağ: izole DN T-hücreleri arasında CD4 ve CD8 boyama tarafından negatif seçim. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Arıtılmadan önce böbrekte 4.. Lenfositleri Şekil. Sağ:.. Böbrek dokusunda CD45 boyanma arıtılmadan önce bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Bu tür otoimmün hastalıklar, kanser, graft tolerans ve akut böbrek hasarı (AKI) da dahil olmak üzere böbrek hastalıkları, birincil olarak farklı patolojik koşullarda karıştıktan çünkü DN T hücrelerinde artan bir ilgi vardır, 8, 13, glomerülonefrit. Bu nedenle, daha iyi bir DN T hücrelerinin patofizyolojik fonksiyonları ve karakterize etmek için bir ihtiyaç vardır. Ancak, şu anda CD4 ve CD8 T hücreleri ile karşılaştırıldığında, bu hücrelerin fonksiyonu içinde anlayışında bir eksikliği vardır. Önemli bir neden, ikincil lenfoid organlarda DN T hücrelerinin azlığı ve bu nedenle in vitro analizi ve adoptif transfer deneyleri için yeterli hücre elde zorluğudur. DN T-hücreleri, bu gibi böbrek 8 olmayan lenfoid dokularda bulunan ama sağlam bir organdan kendi izolasyon için güvenilir yöntemler eksikliği fonksiyonlarını incelemek için çaba engellemektedir. Bu nedenle, DN T hücresi izolasyonuna yönelik yeni protokolböbrekten s DN T hücrelerin fonksiyonu araştırmayı hızlandırmak beklenmektedir. DN T hücrelerinin Fas eksiktir (LPR) veya FasL eksik (MP) farenin büyük sayılarda lenf düğümleri içinde birikir ve kolayca lenfoid organların 9, 14, 15 izole edilebilir, ama yine de, diğer bu hücrelerin izole edilmesi için bir sorun olmaya devam etmektedir dokular.
Bu protokole göre, iki farelerden alınan böbrekler yaklaşık 0,5 x 10 6 hematopoetik hücreleri (CD45 +) ve çevresinde 0,2 x 10 6 DN T hücrelerini verim. Bu sayı, in vitro kültürü, fonksiyonel analizlerin ve / veya FACS analizi gerçekleştirmek için yeterlidir. DN T hücre popülasyonunun saflığı, akış sitometresi ile teyit edilmelidir. Bu protokol,% 98 kadar saf olabilir DN T hücrelerinin bir popülasyonu sağlar. Bu protokol böbrekten DN T hücrelerinin izolasyonu için tasarlanmış olsa da, diğer non-lenfoid organların T hücrelerinin izole edilmesi için modifiye edilebilir böyle kalp gibi, tiroid vb
DN T hücreleri küçük bir nüfusu temsil yana, bu arınma ek mermi yaparak verimi artırmak için bazen gereklidir. DN T hücrelerinin sayısının daha yüksek (daha yüksek 0.5 x 10 6 hücre) gereklidir Ancak biz zaman ve reaktif maliyetini azaltmak amacıyla ayırma sıralama performans öneriyoruz.
Özet olarak, bu protokol böbrekten DN T hücrelerinin izole edilmesi için yeni bir yöntem tarif eder. Pozitif seçim ve daha sonra arzu edilen olmayan hücre popülasyonlarının tükenmesi için negatif seçim ve ardından basamak (sindirim ve KMNC zenginleştirme ile) bir preparasyon oluşmaktadır. Bu nedenle, izolasyon işlemi sırasında DN T hücrelerinin en az doğrudan değiştirme yoktur. Bu farelerde ve insanlarda periferal kandan ve konvansiyonel T hücrelerinin izole edilmesi için kullanılanlara benzer, ikincil lenfoid organların, DN T hücrelerinin izole edilmesi için mevcut protokoller olduğu dikkat çekicidir.
ove_content "> Bazı DN T hücreleri FcR'sidir-γ ifade ettiği gösterilmiştir Çünkü, alternatif bir seçenek kokteyl 16, 17 CD16/32 + dahil değildir. DN T hücrelerinin Başarılı izolasyon detay için büyük bir dikkat gerektirir. özellikle önemlidir adımlar şunlardır: doku sindirim, küçük parçalar halinde böbrek doku kesme ve doğru belirlenmesi ve yoğunluk gradyanı içinde ışık tabakası toplama Genel olarak, uygulama ve bazı el becerisi birkaç tur istenilen sonucu elde etmek için gereklidir..
Bu çalışma NIH PBS (R21 AI095484) tarafından desteklenmektedir. Biz CD1d tetramerin NHI tetramerdir çekirdek tesis ederiz.