Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells | Protocol (Translated to Turkish)
İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir
GIRK Kanal Modülatörler belirlenmesi içinoresan Tarama Testi…
Yetişkin grubuyla Memeli Nöronlar içine DNAtranükleer Mikroenjeksiyon…
Biz nasıl bir iyon kanalı fonksiyonu tek bir nokta mutasyonu etkisinin araştırılması gösterecektir.
Biz nasıl bir iyon kanalı bir nokta mutasyonu tanıtan fonksiyonel etkilerini incelemek amacıyla gösterecektir. Biz nöronların eksitabilite düzenleyen için önemli olan G-protein-kapılı içsel giderilmesi potasyum (GIRK olarak anılacaktır) kanalları, çalışma. Dört farklı memeli GIRK kanal alt birimden (GIRK1-GIRK4) vardır - bir homotetramer oluşturması nedeniyle biz GIRK2 odaklanır. Muskarinik reseptör (M2R) olarak G-protein reseptörler (GPCRs), farklı türde uyarılması GIRK kanal aktivasyonuna yol açar. Alkol aynı zamanda doğrudan GIRK kanallarını harekete geçirir. Biz özellikle cDNA GIRK kanal için bir veya daha fazla nükleotidler değişen bir amino asit nasıl mutasyona gösterecektir. Bu mutasyona uğramış cDNA dizisi saflaştırılmış bakteriler amplifiye olacak ve nokta mutasyonu varlığı DNA dizi tarafından teyit edilecektir. Mutasyona uğramış ve yabani tip GIRK kanallar için cDNAs in vitro kültür insan embriyonik böbrek HEK293T hücrelerine transfekte olacaktır. Son olarak, tüm hücre yama klemp elektrofizyoloji ektopik ifade yabani tip ya da mutasyona uğramış GIRK kanallar yoluyla makroskopik potasyum akımlarını incelemek için kullanılır. Bu deneyde, biz M2R bağımlı ve alkol bağımlısı aktivasyon GIRK2 kanal L257W mutasyon etkisi inceleyeceğiz.
1. Sitesi Mutagenez Yönetmen
Biz GIRK2 memeli ifade plazmid pcDNA3.1 kodlama cDNA ve Stratagene (Agilent Technologies) Quikchange XL II site directed mutagenesis kiti kullanılarak, üreticinin talimatlarına göre bir nokta mutasyonu tanıtmak.
Astarlar dizisi mevcut online astar tasarım programı kullanarak kolayca oluşturulabilir:
Not: BD 14 ml tüpler protokol açıklanan yerine standart Eppendorf 1,5 mL tüpler kullanın. Ancak, XL10-Altın ultracompetent E. β-mercaptoethanol ile ön tedavi coli, 30s ısı şok ve NZY + (veya NZYM +) medya başarılı mutagenez için kritik öneme sahiptir. Mümkünse, yeni bir kısıtlama sitesi oluşturur ek bir sessiz mutasyon mühendislik Aşağıdaki mutant koloniler tarama için kullanışlı olabilir.
2. Miniprep, DNA Dizi ve Maxiprep
2.1 Qiagen miniprep ve sıralama.
Bireysel bakteri kolonilerinin aldı ve ampisilin (AMP) ile LB suyu yetiştirilmektedir. Biz cDNA arındırıcı için üreticinin yönergelerini izleyin. Yukarıda Adım 1 dahil bir kısıtlama sitesi ise basit bir kısıtlama, sindirme, mutasyon, başarılı bir tanıtım teyit kullanılabilir. Otomatik DNA dizi analizi yapılır, off-site ve cDNA mutasyon varlığını doğrulamak için önemlidir, hem de herhangi bir istenmeyen mutasyonların olup olmadığını değerlendirmek. Bu adım çok önemlidir. Biz ileri T7 organizatörü ve BGH sıralama primerler ters kullanarak tüm GIRK kodlama dizisi dizisi pcDNA3.1 plazmid kanadında çoklu klonlama yeri.
Not: sıralama Elektroferogram sıralama verileri yeterli kaliteyi sağlamak için dikkatli bir şekilde incelemek için önemlidir. Yüksek kaliteli Elektroferogram biraz arka plan gürültüsü ile keskin, örtüşmeyen zirveleri vardır.
Biz üreticinin yönergeleri izleyin.
Not: Bu adım verimli transfeksiyon için önemli olan cDNA saflık, geliştirmek için deneyler yer almaktadır.
3. HEK293T Hücre Kültürü ve Transfeksiyon
Bütün bu adımlar, steril doku kültürü kaputu yapılmalıdır.
3.1 Hücre kültürü
HEK293T hücreleri (37 ° C,% 5 CO 2 nemlendirilmiş inkübatör) kültüre kolay olduğu için, kullanımı kolay ve hızlı çoğaltma zaman, yüksek transfeksiyon verimliliği tüm hücre yama klemp elektrofizyoloji için uygun . HEK293T hücreleri plazmid pcDNA3.1 episomal çoğaltma sağlar SV40 büyük T antijeni ifade eder.
HEK293T hücreleri L-glutamin ile desteklenmiş düşük glukoz DMEM medya ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) kültür. Pasajlanması hücreleri, hücreler / FBS içeren taze medya ilavesi ile enzim aktivitesi durur, doku çanak ayırmak kadar bekleyin, tripsin / EDTA konfluent (% 90-95) HEK293T hücrelerin% 0.25 ekleyin. Plaka ~ 1 X 10 5 hücre / 1 ml de ortalama antibiyotik içermeyen kültür ortamı ile birlikte 12 kuyu hücre kültürü çanak içine. (1 X 10 5 hücre, yaklaşık 10 ml medya ile yeniden süspanse konfluent T25 balon elde edilen hücre süspansiyonu 350 mcL) .
8-24 saat sonra, HEK hücreleri plastik yapışır ve transfeksiyon için hazır olacak. CDNA 0.2 mikrogram kanal, Invitrogen Lipofectamine 2000 kullanılarak cDNA 0.4 mikrogram M2R reseptör cDNA ve 0.04 mg YFP Transfect hücreleri. Not: Biz, başarılı bir şekilde (yeşil hücreler muhtemelen GIRK kanalları ve M2 reseptörleri içerecektir) transfekte hangi hücrelerin belirlemek için cDNA YFP küçük bir miktar kullanın. Kullanımı cDNA konsantrasyonu her klon için ayarlanması gerekir.
3.3 transfekte hücrelerinin Floresan görselleştirme.
Yeri 12-iyi bir ters floresan mikroskop sahnede plaka ve YFP ifade hücrelerini inceleyen. DIC görüntü karşılaştırın ve yeşil hücreleri yaklaşık numarasını not edin. Bu transfeksiyon verimliliği bir tahmin sağlar.
24-iyi yemekleri ve Poly-D-lizin kaplı kapak fişleri 3.4 Hazırlık
12 mm cam kapak fişleri (Warner, CS-12R), deiyonize su ile yıkama ve bir gecede% 95 etanol sallayarak, Radiacwash bir gecede onları sallayarak temizleyin. Kullanana kadar% 70 etanol temiz kapak fişleri saklayın.
Etanol ile Petri kabı, forseps ve brülör kullanarak etanol kapalı alev, bir koyun kapak fişlerid steril bir 24 plaka bir yer.
Poli-D-lisin 250 mcL (PDL) çözümü ile her bir kuyunun kapağı [0.2 mg / ml] ve kapak fişleri gecede PDL çözüm dalmış steril kaputun altında oturup sağlar. Buharlaşmasını önlemek için Parafilm 24 plaka sarın.
Ertesi sabah, PDL aspirat ve 2x steril su ile yıkayın. Tabak kapağı, kaputun altında kuruması için açık bırakın. Steril alüminyum folyo ile kaplı kapak fişleri ile 24 iyi yemekleri sarılmış ve hafta boyunca oda sıcaklığında saklanabilir.
Kapağında 3.5 Kaplama transfekte HEK293T hücreleri fişleri
24 saat 24-iyi çanak (~ 4 X 10 3 hücre / kuyu) transfeksiyon, split hücreler cam kapak içeren sonra poli-D-lizin ile kaplı kayar. Not: transfekte hücreleri 24-72 saat yazılan transfeksiyon kadar kullanılabilir. Hücreler yama kelepçe elektrofizyoloji deney için ayrı ayrı kapak fişleri sağlamak için ayrılmıştır.
4.1 hazırlanması Çözümler
Ekstrasellüler (banyo) solüsyonu: 20 mM KCl, 140 mM NaCl, 0.5 mM CaCl 2, MgCl 2 2 mM ve 10 mM HEPES (NaOH ile pH 7.4 set).
Kısım 20K banyo çözümü ve uygun modülatörleri
20K + Ba 2 + 1 mM BaCl 2 içeren çözüm: dahilde giderilmesi akımların spesifik bir inhibitörüdür
20K + Karbakol'ün: 5 mcM Karbakol'ün ile çözüm: Belirli bir M2R agonist, G-proteinler M2R çiftler açık GIRK kanalları
20K + Etanol: doğrudan GIRK kanalları etkinleştirmek için 100 mM EtOH içeren banyo solüsyonu
Yeri banyo çözümleri hızlı değişim perfüzyon sistemi şırınga (solüsyon kaplarında). Not: Biz bir Warner tutam valf sistemi, banyo çözümleri kontrol etmek için kullanır. PE boru tavsiye edilir.
İç / elektrot çözüm: 140 mM KCl, 20 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5.4 mM MgCl 2, 2.5 mM K 2 ATP ve 0,3 mcM Li 2 GTP ile 10 mM HEPES (pH, 7.4 ').
ATP ve GTP olmadan elektrot çözümü olun. Biz, -80 ° C'de saklanan ATP ve GTP hacimde ayrı ayrı hazırlamak ve deney günü elektrot çözüm ekleyin. ATP / GTP korumak için buz üzerinde son elektrot çözümü ile şırınga tutar. Biz steril filtre (0.2 mikron) iç / dış çözümler mikrobiyal gelişmeyi engellemek ve tüplerin tıkanma olasılığı ve elektrot azaltmak.
4.2 Çekme elektrotlar
Biz Narishige iki adımlı dikey Warner Aracı (1.5 mm dış çapı, 0.86 mm iç çap ve 7.5 cm uzunluğunda) çektirmesi ve borosilikat cam elektrot intrasellüler çözümü ile dolu direnç M 3-7 elektrotlar elde etmek için kullanırlar.
Not: Bu deneysel elektrot çektirmesi ve elektrot cam türü için laboratuarda parametrelerini belirlemek için gereklidir. Bizim dikey çektirmesi için, ikinci çekme için ilk çekin ve ~ 43 için 60.2, bir ısı ayarı kullanın.
Sıkma 4.3 Tüm hücre yama
Ters bir floresan mikroskop aşamasında dış çözüm yeri ve çanak kapağı, vazelin küçük miktarda kullanarak, bir 35 mm çanak kayma kapak monte edin. Odak ve hücreleri bulmak için DIC kullanın YFP pozitif hücreleri bulmak için floresan YFP geçmek.
Perfüzyon manifoldu yeşil bir hücre (hücre dışında ilgi = 2-3 hücre boyu 20-30 mikron) yakın pozisyon ucu.
Kazanç 1, Yapılandırma:: tam hücreli β = 1, mod V-klemp elektrotlar solüsyonu ile doldurun, aşağıdaki başlangıç ​​ayarları Axopatch 200B amplifikatör (headstage Axon Instruments) ekleyin.
Pipet tıkanmasını önlemek ve hücrenin hemen üzerinde elektrot ucu yere manipülatör kullanmak için elektrot pozitif basınç uygulayın.
Pipet potansiyeli Sıfır için bir test gerilimi adım sunmak için Seal Sına düğmesini seçin. 5 mV dikdörtgen gerilim adım Clampex Mührü Test penceresinde görünecektir. 0 nA akım baz-line getirmek için amplifikatör Pipet Ofset potansiyometre ayarlayın. Alternatif olarak, V-track modu ve "0.00" amplifikatör metre ekranda gerilim getirmek için amplifikatör Pipet Ofset potansiyometre VTrack ve kullanımı metre topuzu seçici amplifikatör moduna geçiş yaparak pipet potansiyeli sıfır.
Clampex 8.2 yazılımı (M 3-7 olmalıdır) sızdırmazlık test komutunu kullanarak elektrot direncini kontrol ediniz..
Kayıtlı bir protokol dosyasını açın veya yeni bir protokol oluşturmak. Protokol dosya açmak için ana menüden seçin, ardından Aç Protokolü Edinme ve kayıtlı bir gerilim protokol dosyayı seçin. Bu deneme için, protokol 2 üzerinden 40 mV ile -100 mV ve rampa tek bir 50 ms gerilim adım teslim membran potansiyeli-40mV tutmak için yaratılmıştır00 ms. Bu protokol, her 2 saniyede yürütülür. GIRK kanalları ters potansiyel ve içe doğru bir düzeltme gözlem için rampa protokolü sağlar. Gerilim-kapılı iyon kanalları için, dikdörtgen planlı bir gerilim adım daha uygun olabilir.
Yaklaşım hücre kullanarak ince ayar manipülatör, pozitif basınç serbest, negatif basınç uygulamak hücre yüzeyinde dokunduktan sonra, ve direnç artışı izlemek Seal Test osiloskop penceresinde. Bir kez direnç GΩ aralığında, elektrot membranı (Gigaseal kurdu) üzerine imzalanmıştı.
Negatif basınç, hücre zarı kırmak ve hücre içine erişim almak için bir darbe uygulayın. Bir kez tam hücreli yapılandırma, kayıt kapasitif akımlar artmıştır.
Clampex Membran Test Switch ve erişim direnci Ra, membran direnci Rm, membran kapasitans Cm yazmak ve göz gerçek kapasitif akım teorik eğri üstel uyum doğrulamak. Membran kapasitans hücre boyutu ile doğru orantılıdır ve akım yoğunluğunun hesaplanması için daha sonra kullanılabilir olacak.
10 kHz -40 mV ve filtre V-Out (membran potansiyeli) Testi, Seal geri dönün
Amplifikatör membran kapasitans ve seri direnç için aşağıdaki adımları ile telafi:
TÜM HÜCRE CAP switch. Düz bir test darbe elde edene kadar, ileri ve geri TÜM HÜCRE OTP ve SERİSİ DİRENCİ çevirir ayarlayın. Ayrıca pipet kapasitans FAST CAP topuzu ayarlamanız gerekebilir.
Yaklaşık% 60-80% TAHMİN düğmeyi çevirin, tekrar tekrar ayarlayarak TÜM HÜCRE OTP ve seri direnç arama (pipet kapasitans telafisi FAST CAP topuzu de ayarlamanız gerekebilir).
Yeniden ayarlayarak TÜM HÜCRE CAP ve seri direnç (pipet kapasitans telafisi FAST CAP topuzu de ayarlamanız gerekebilir) nabız düz tutmaya çalışırken, hücre salınan% COMP-% 100 çevirin. Zaman sabiti azaltarak gecikme ayarlayın.
Cm (membran kapasitans), Rs (seri direnç),% COMP değerleri bir yere yazın,% beklenenin ve Gecikme süresi notebook amplifikatör. Cm ve Rs yukarıdaki Membran Test ölçülen Cm ve Rm yaklaşık olarak aynı olmalıdır.
Banyo çözümü kontrol etmek için harici bir çözüm valfi açın. 2kHz amplifikatör 8-kutuplu Bessel filtre ayarlayın, bir gerilim kelepçe protokolü açın ve kayıt akımları başlar.
Biz, 100 mV ile +40 mV üzerinde 200 ms 50 ms sonra rampalar -100 mV adımları ve her 2 saniyede teslim edilir bir rampa protokolü kullanarak GIRK akımları kaydedin. Rampa protokol ters potansiyel gözlem ve GIRK kanalları içe düzeltme özelliği sağlar. Oda sıcaklığında (22-25 ° C), akım GIRK yakın K (E K = -50 mV) için hesaplanan denge potansiyeline yakın -50 mV (banyosunda 20 mM KCl ile), ters gerektiğini, sonra devam E K olumlu potansiyelleri oldukça düz.
Deneysel Protokol: istikrarlı bir temel kaydettikten sonra, 20K + Karbakol'ün çözüm geçmek ve 20K banyo çözümü için geri dönmek, tepki doruk beklemek, daha sonra 20K + Etanol uygulamak ve pik cevabı bekleyin, sonra 20K banyo çözüm geçmek ve nihayet 20K + Ba 2 + çözümü. Bu ilaçların uygulama esnasında GIRK akımları (en çok -100 mV telaffuz) genlik değişiklikleri görürsünüz. Notebook, farklı ekstrasellüler çözümler uygulamaya karşılık gelen iz numarasını not edin. Tek bir Clampfit dosyası tüm deney için tüm Piyango içerecektir.
-100 MV veri GIRK akımları analiz etmek Clampfit 9.2 yazılımı kullanın.
Kayıt ile dosyayı açın -100 mV imleç ayarlayın. Varsayılan olarak ekranda üst üste tüm izlerini göreceksiniz. "Imleçler yaz" simgesine basarak sayısal verilerini içeren Excel gibi bir elektronik tablo yaratacaktır.
Atama X tarafından takip numarası sütun ve imleci sütunun Y için ve hızlı bir deney bir zaman ders arsa çizebilirsiniz "Grafik Oluştur" ikonuna basarak.
Ba 2 + tek başına dış perfüzyon çözümü ("20K mevcut" eksi "20K + Ba 2 + Akım") kaydedilen geçerli varlığı mevcut çıkarılarak bazal akımı hesaplayın. Aktive akımları 20K bazal akım çıkarılarak indüklenmiş akımlar hesaplayın (20K + Karbakol'ün mevcut "eksi" 20K mevcut ";" 20K + Etanol geçerli "eksi" mevcut 20K "). Membran kapasitans (amplifikatör doğrudan okuma) tarafından mevcut bölerek akım yoğunluğu (pA / pF) hesaplayın. Bazal akımlar tarafından indüklenmiş akımlar bölünmesi ve 100 ile çarpılması ile yüzde aktivasyon hesaplayın.
Yabani tip kanallar ile transfekte hücreler geçerli kayıt gerekir. GIRK kanal ölçmek içind ekstraselüler çözüm içeren 20 mM K + (145 mM K + hücre içi) güçlü içe düzeltme ve potasyum kanallarının önemli bir özelliği ~ -50 mV, ters bir potansiyel göstermelidir. Yabani tip akım karbakol uygulama (bazal aşırı akım 3-5 kat artış) üzerine güçlü bir artış ve 100 mM etanol aynı şekilde cevap verecektir. Not: elektrofizyoloji işareti kongre içe akım negatif ve dışa akımı pozitif. GIRK2 alkol bağlayıcı cebinde L257W mutasyon için, hem karbakol ve etanol zayıflatılmış tepkiler göreceksiniz. Bu L257 alkol ve G-protein aktivasyonu GIRK2 kanalları dahil olduğunu göstermektedir. GIRK2 mutagenez sonuçlarını daha fazla örnek için, Aryal ve arkadaşları tarafından son 1 yayınımıza bakın.
Şekil 1. Yabani tip GIRK2 kayıt için Clampfit 8.0 gösterir veri dosyası Pencere Üst sol panelinde üst üste farklı bah harici çözümler varlığı bir rampa gerilimi protokole tepki olarak kaydedilen süpürür gösterir. İmleç 1 -100 mV konumlandırılmış. Imleç değerleri tablo (sağ panel) yazılır. Alt sol panelinde süpürme sayısına karşılık, mevcut arsa gösterir. Etanol (EtOH) ve karbakol (Carb) ve Ba 2 + ile inhibisyonu ile akım artışı (Çökmelerin) unutmayın.
Şekil 2. Mutant GIRK2 L257W kayıt Clampfit 8.0 gösterir veri dosyası Pencere Açıklamaları Şekil 1'de olduğu gibi aynıdır. Karbakol (Carb) aktivasyon ve mutant kanalları EtOH indüklenen akımların azaltılması kaybı unutmayın.
Site-directed mutagenesis iyon kanallarının yapı-işlev ilişkileri incelemek için klasik bir yaklaşım. Bu, kritik bir kalıntı iyon kanalı değiştirerek bir kanal fonksiyonu belirgin değişiklikleri gözlemek gerekir önerme üzerine dayanır. Buna karşın, pek çok kritik olmayan pozisyonda mutasyonların kanal işlevi büyük tedirginlikler olmadan sokulabilir. Tipik olarak, söz konusu kalıntı ilk alanin, triptofan, 2 amino asitlerin en büyük mutasyon küçük bir polar olmayan amino asit, mutasyona uğramış. Kanal fonksiyonu için önemli bir kalıntı ise, her iki mutasyonların kanal aktivitesini değişecektir. Daha az temel kalıntısı mutasyona uğramış ise, mutasyon, özellikle alanin etkileri genellikle normaldir. Triptofan mutasyonlar triptofan boyutu ile ilişkili sterik engeller nedeniyle değişikliklere neden daha olasıdır. Genellikle, alanin veya triptofan yapısal bilgi kanalı (alanin veya triptofan tarama olarak adlandırılır) bir parçası, içinde eksik olan, sistematik mutasyon kritik artıkları bulmak için kullanılabilir. Paralel olarak, nispeten kısa bir süre içinde birden fazla artıkları test için izin ile birden fazla farklı nokta mutasyonlarının klonlar hazırlanmış olabilir dikkat etmek önemlidir. Son zamanlarda, kanal birden fazla kristal yapıları 3,4,5 kullanılabilir hale gelmiştir. Onlar bu protokolü açıklanan yaklaşım kullanarak test edilecek potansiyel kilit artıkları önermek için kullanılabilir.
Yabani tip kanal ölçümleri her zaman doğru transfeksiyon ve elektrofizyolojik deneyleri yapıldı sağlamak için bir pozitif kontrol olarak hizmet mutant kanal ölçümü eşlik etmelidir. Nokta mutasyonlarının fonksiyonel bir akımı eksikliği, güncel bir kanal aktivite yabani tip ya da değiştirilmiş düzenlemeye benzer yol açabilir. Ölçülebilir mevcut olmaması, yanlış katlanır veya değişmiş kaçakçılığı nedeniyle olabilir. Böyle bir durumda kanal biyotinilasyon tahlil veya plazma zarı ve hücre içinde kalan kanallar fonksiyonel olmayan kanallar arasında ayırt etmek için ekstrasellüler etiketi karşı immünofloresan boyama (hücre permeabilization olmadan) kullanarak yüzeye doğru trafikleri olmadığını öğrenmek için faydalı olabilir . Sonuç olarak, kanal değil, aynı zamanda kanal düzenleme mutasyon sonucu bazal aktivite sadece araştırmak için tavsiye edilir. G proteinleri, PIP2, iyonlar, ATP konsantrasyonu, fosforilasyon (tirozin, serin veya treonin mutasyon kullanarak), ubikuitinasyon veya sumoilasyon (lisin mutasyon kullanarak) tarafından düzenlenmesi de dahil olmak üzere ilgi iyon kanal kanal fonksiyonu modülasyon farklı mekanizmalar göre ele olabilir , doğrudan kanal açıcılar veya blokerleri.
Alkol Suistimali Ulusal Enstitüsü ve PA için bir ön doktora NIH NRSA dostluk (F31AA017042); Çalışmalarımız Neuroscience (PAS), Ulusal Uyuşturucu Enstitüsü (PAS R01 DA019022) McKnight Endowment Fund mali desteği ile mümkün yapıldı Alkolizm. GIRK2 L257W mutant Dr. Prafulla Aryal tarafından sağlanmıştır.
Floresan mikroskop ve sponsorluk nazik Leica Instruments tarafından sağlanmaktadır.