Dondurma İşlemleri – Liv Tüp Bebek Kliniği
Tedavi sürecinde alınan her türlü canlı hücre ve dokuların, belirli şartlar ve yasal düzenlemeler dahilinde, ileri bir tarihte tekrar kullanılmak üzere dondurularak saklanması mümkündür.
Canlılarda dondurarak saklama (kriyoprezervasyon) yöntemi, zaman ile ya da çevresel koşulların etkisiyle zarar görebilecek hücre ya da dokuların, kriyoprotektan olarak adlandırılan özel kimyasallara maruz bırakıldıktan sonra çok düşük sıcaklıklarda (-196 derece) bekletilmesi olarak tanımlanabilir. İlk uygulamaları hayvan çalışmalarında, özellikle spermlerde, yapılan dondurma işlemi 1950 yıllarında insan sperminde de kullanılmış ve dondurulmuş-çözülmüş spermin inseminasyonu yolu ile ilk gebelik bu yıllarda elde edilmiştir. Embriyolarda dondurma için ilk uygulamalar 1970 yıllarında başlamış olmakla birlikte, dondurulmuş-çözülmüş embriyo ile ilk gebelik ancak 1984 yılında elde edilebilmiştir. O yıllardan yakın zamana kadar sperm ve embriyo dondurma ile ilgili çalışma ve uygulamalar kontrollü yavaş dondurma olarak tanımlanan ve kademeli olarak ısıyı düşüren programlanabilir cihazlar kullanılarak gerçekleştirilirken, günümüzde tüp bebek laboratuvarlarında artık vitrifikasyon olarak adlandırılan hızlı dondurma yöntemi, yumurtalar da dahil olmak üzere, tüm hücreler için başarıyla uygulanabilmektedir.
Su, sıfırın altında sıcaklıklarda buz kristalleri oluştururak donar ve genleşir. Oluşan bu kristaller ve genleşme hücre zarlarını parçalar ve çözme sonrasında hücrenin canlılığını sürdürmesi mümkün olmaz. Dolayısıyla dondurmada birinci öncelik hücre içerisindeki suyun dışarı çıkarılmasıdır. Yüksek yoğunlukta şeker solüsyonları (sucrose, trehalose) bunu sağlar fakat bu durumda da yoğun rehidrasyon (su kaybı) nedeniyle hücreler zarar görebilir. Bu noktada kriyoprotektanlar devreye girer. Bu amaçla kullanılan kriyoprotektanlar donma sıcaklıklarında camsı bir yapıda katılaşarak buz kristali oluşumunu önlemeye yardımcı olurlar. Vitrifikasyon (camsılaştırma) ismi buradan gelmektedir. Özellikle embryo ve yumurta dondurma için kullanılan solüsyonlar hücre zarından geçebilen ve geçemeyen moleküler boyutlarda 2 farklı kriyoprotektan kullanırlar. Hücre içi kriyoprotektan hücreden çıkan suyun yerine geçerken, hücre dışı kriyoprotektanda hücre çevresinde koruyucu etki yapar.
Sperm dondurma işlemi androloji laboratuvarında gerçekleştirilir. Hem ejakulasyon yoluyla elde edilen semen örnekleri hem de operatif yollarla (TESE, TESA) elde edilen testiküler sperm örnekleri aynı yöntemlerle başarıyla dondurulabilmektedir. Dondurma için, bu işleme özel üretilmiş hazır solüsyonlar kullanılır. Kullanılan solüsyonun protokolüne uygun oranlarda solüsyon eklenen sperm örnekleri, yine bu işlem için üretilmiş olan taşıyıcılara (HSS-High Security Straw ya da kriyotüp) yüklenir ve oda sıcaklığında ve sıvı azot buharında ardışık bekleme aşamalarından sonra sıvı azot içerisine atılarak işlem tamamlanır. Bekleme süreleri, solüsyonlar içerisindeki kriyoprotektanların hücre içine girişi ve hücre içerisindeki suyun dışarı çıkışı şeklindeki denge reaksiyonunun tamamlanması için gereklidir.
Sperm örnekleri, özellikle hücre zarlarının geçirgenliği bakımından, farklı yapılarda spermler içerir ve dolayısıyla dondurma işlemine dayanıklılıkları (kriyotolerans) farklı olur. Bu nedenle sperm dondurma-çözme işlemlerinde %30 civarlarında canlılık kaybı normal kabul edilmektedir.
Ülkemizde sperm dondurma işlemleri Sağlık Bakanlığı’nın yayınladığı ÜYTE Yönetmeliği’nde belirtilen koşullar ve sınırlamalar dahilinde uygulanabilmektedir. Buna göre;
Üreme fonksiyonlarının kaybedilmesine yol açacak olan ameliyatlar (testislerin alınması vb.) öncesinde,
Çok az sayıda sperm olması (kriptozoospermi) durumunda
dondurularak saklanabilirler. Bu haller dışında yasal olarak, sadece kişinin kendi istemi doğrultusunda sperm dondurulması mümkün değildir. Sperm örnekleri, bu materyallerin güvenliği açısından vericiye ait DNA analizi ile birlikte saklanır. 1 ve 4.maddede belirtilen tıbbi zorunluluklar nedeniyle sperm veya testis dokusunun saklanması durumunda, dondurulma tarihinden itibaren 90 gün içinde DNA analizi aranmaz. Bu süreyi aşması halinde DNA analizinin bulunması gereklidir. Saklama süresinin bir yılı aşması halinde her yıl dokuların/hücrelerin saklanması için kişi mutlaka başvuruda bulunarak rızasının devam ettiğini ifade eden imzalı dilekçesini vermelidir. Dondurulmuş sperm hücreleri merkezlerde en fazla 5 yıl süre ile saklanabilir. 5 yıldan fazla saklanması Bakanlığın iznine tabidir. saklanan dondurulan hücreler, alınan kişinin yıllık protokol yenilememesi, isteği ve ölümü durumlarında İl Sağlık Müdürlüğü tarafından belirlenen bir memur gözetiminde tutanak altına alınarak imha edilir.
Bu şartlar dahilinde spermlerin dondurulması, özellikle azospermi vakalarında, olası tekrar eden tüp bebek denemelerinde, erkek hasta için büyük kolaylık sağlamakta ve yeni bir operasyon stresini de ortadan kaldırmaktadır.
Embriyolar, vitrifikasyon metoduyla, 2 hücreli aşamadan blastokist aşamasına kadar her seviyede dondurulabilmektedir. Embriyo dondurma işleminde en önemli nokta uygun dondurma solüsyonlarının, embriyonun gelişim aşamasına uygun protokoller ile kullanılmasıdır. Bu işlem için bazı laboratuvarlar kendi solüsyonlarını hazırlıyor ise de, kalite kontrol açısından doğru olan hazır üretilmiş ve testleri yapılmış kitlerin kullanılmasıdır. Kullanılan dondurma kitinin protokolüne uygun olarak, embriyolar önce dengeleme solüsyonunda bekletilerek hücrelerin içinden suyun dışarı çıkışı ve kriyoprotektanın girişi sağlanır. 2. aşamada embriyolar daha yoğun kriyoprotektan ve şeker içeren bir solüsyona alınarak, dengeleme sürecinde hücre içinde kalan suyun dışarı çıkışı ve kriyoprotektanın hücre içinde kalması sağlanır. Sürenin bitiminde bu işlem için özel üretilmiş taşıyıcılara (cryotop, cryolock, cryoloop, cryovial vs.) yüklenen embriyolar sıvı azota(-196 derece) daldırılarak dondurma tamamlanır.
Embriyolar farklı gelişim aşamalarında farklı oranlarda hücre içi ve hücreler arası su içeriğine sahip oldukları için, dondurma sırasında bu durum mutlaka dikkate alınmalıdır. Örnek olarak blastokist aşamasında blastosöl içerisinde çok miktarda su içeren bir embriyonun dengeleme solüsyonunda bekleme süresi, klivaj dönemindeki bir embriyoya göre daha uzun olmalıdır. Bu şekilde, dondurulan embriyoların kalitesine de bağlı olarak, çözme sonrası %100’e varan oranlarda canlı geri dönüş almak mümkün olmaktadır. Yine de bazen dondurulan embriyoların çözülmesi sonrasında değişen oranlarda canlılık kayıpları gözlenebilmektedir. Bu nedenle, çözme sonrasında hem canlı embriyolarda hem de kısmi canlılık kaybı gözlenen embriyolarda çözme sonrası ileri gelişimin devam edip etmediğinden emin olmak için bir süre kültür solüsyonunda bekletilerek izlenmesi tercih edilmelidir. Bunun için ideal süre, klivaj dönem embriyolarda 1 gün, blastokistlerde ise en az 4 saat olmalıdır. Blastokistlerde canlılığa ek olarak, re-ekspansiyon olarak tanımlanan, embriyonun içerisine tekrar sıvı biriktirerek dondurma öncesi şekline geri dönüşü, başarılı bir dondurma-çözme işleminin ve gebelik şansının en önemli göstergesidir.
Dondurulmuş-çözülmüş embriyoların transferi sonrası gebeliklerle ilgili yapılan karşılaştırmalı bilimsel çalışmalara göre, şu ana kadar taze embriyo transferine göre, gebelik sürecinde oluşabilecek komplikasyonlar ya da doğum sonrası bebeklerin sağlığı bakımından artmış bir risk gözlenmemiştir.
Tüp bebek tedavisi sürecinde çeşitli nedenlerle embriyo dondurma uygulanabilmektedir. Bu nedenlerin başlıcaları;
Embriyo transferi sonrasında, olası bir dondurma-çözme denemesinde kullanılabilecek kalitede embriyoların kalması
Tedavi sürecinde ortaya çıkan ve hastanın sağlığını olumsuz etkileyebilecek klinik durumlar. (OHSS riski)
Tedavi sürecinde ortaya çıkan ve başarı şansını olumsuz etkileyebilecek klinik durumlar (yetersiz rahim kalınlaşması, erken progesteron artışı, polip ya da kistler vs.)
PGT amaçlı uygulanan 5.gün trofektoderm biyopsi sonrası
Transferin ertelenmesini gerektiren tedavi harici sağlık problemleri, acil durumlar, sosyal problemler vs.
Ülkemizde embriyo dondurma işlemleri Sağlık Bakanlığı’nın yayınladığı ÜYTE Yönetmeliği’nde belirtilen koşullar ve sınırlamalar dahilinde uygulanabilmektedir. Öncelikle, tüp bebek tedavisine başlangıç içinde geçerli olan, çiftin evli olması zorunluluğu vardır. Embriyolar ancak, eşlerin her ikisinin rızası ve yazılı onayı sonrasında dondurularak saklanabilir. Saklama süresinin bir yılı aşması halinde her yıl embriyonun saklanması için çiftler mutlaka başvuruda bulunarak taleplerinin devam ettiğini ifade eden imzalı dilekçe vermelidir. Embriyolar merkezlerde en fazla 5 yıl süre ile saklanabilir. 5 yıldan fazla saklanması Bakanlığın iznine tabidir. Eşlerin birlikte talebi, eşlerden birinin ölümü veya boşanmanın hükmen sabit olması halinde ya da belirlenen süre son bulduğunda saklanan embriyolar, İl Sağlık Müdürlüğü tarafından belirlenen bir memur gözetiminde tutanak altına alınarak imha edilir.
Yumurta, dondurma çalışmalarında en çok zorlanılan hücre türü olmuştur. Bunun en önemli nedeni yüksek yüzey/hacim oranına sahip büyük bir hücre olması (yumurta, insan vücudundaki en büyük hücredir) ve bu nedenle dondurma sürecinde ideal bir denge reaksiyonu sağlanmasının zor olmasıdır. Yine de son yıllarda vitrifikasyon metoduyla oldukça başarılı sonuçlar elde3 edilmiş ve artık standart bir dondurma yöntemi olarak uygulanmaya başlanmıştır. Yumurta dondurma işleminde, embriyo dondurma işleminde kullanılan solüsyonlar ve taşıyıcılar kullanılır fakat dondurma protokolü farklıdır.
Yumurta dondurma işlemi, yumurta toplama işleminin yapıldığı gün, işlemden 2 saat kadar sonra uygulanır. Bu süre başarılı bir dondurma için ideal süredir. Bu bekleme süreci sonunda denudasyon uygulanan yumurtlar dondurma işlemine alınır. Aynı hastadan alınan çok sayıda yumurtanın herbiri, dondurma işleminde dengelenme sürecini etkileyen farklı hücre zarı geçirgenliği değerlerine sahiptir. Bu nedenle dondurma sürecinde yumurtaların dengelenme seviyeleri, büzüşme ve tekrar eski formuna geri dönme(reexpansion) süreçleri mikroskop altında takip edilerek ve aynı dengelenme süresine sahip yumurtalar birarada olacak şekilde taşıyıcılara yüklenerek dondurulurlar.
Ülkemizde yumurta dondurma işlemleri Sağlık Bakanlığı’nın yayınladığı ÜYTE Yönetmeliği’nde belirtilen koşullar ve sınırlamalar dahilinde uygulanabilmektedir. Buna göre;
Üreme fonksiyonlarının kaybedilmesine yol açacak olan ameliyatlar (yumurtalıkların alınması gibi operasyonlar) öncesinde,
Düşük over rezervi olup henüz doğurmamış veya aile öyküsünde erken menopoz hikayesinin üç uzman tabipten oluşan sağlık kurulu raporu ile belgelendirilmesi durumunda,
yumurtalar dondurularak saklanabilmektedir. Bu haller dışında yasal olarak, sadece kişinin kendi istemi doğrultusunda yumurta dondurulması mümkün değildir. Saklama süreci ve imha ile ilgili yasal şartlar sperm için belirtilenler ile aynıdır.