Proje 6 – Evrimsel Genetik Laboratuvarı / Evolutionary Genetics Laboratory / eGL
İstilacı Tatlısu Balık Türlerinin Belirlenmesinde eDNA Metabarkodlama Tekniğinin Kullanılması: Yukarı Sakarya Havzası Modeli
Antropojenik eylemler nedeniyle olumsuz etkilenen biyoçeşitliliğe yönelik oluşan tehditlerin başında biyolojik istila konusu gelmekte ve son yıllarda önemini giderek artırmaktadır. Başta Kuzey Amerika, Avrupa, Avustralya ve Uzakdoğu ülkeleri olmak üzere dünyanın birçok yerinde istilacı türlerin erken tespiti, tür seviyesinde tanımlanması ve mücadelesinde moleküler teknikler en çok başvurulan yöntem haline gelmiş ve oluşturulan protokoller birçok ülkede resmi makamlarca ve çevre kuruluşları tarafından standart uygulamalar olarak geçerlilik kazanmıştır. Türkiye ise istilacı türler ile mücadelede moleküler yöntemlerin kullanılması sürecine entegre olamamış görünmektedir.
İstilacı türlerin DNA temelli yöntemler kullanılarak çevresel örneklerden (su örnekleri, bentik sediment örnekleri, balast suları vb.) tespit edilmesi, istilacı türlere yönelik uygulanan yönetim planları bakımından günümüzde en büyük yenilik olup, hızla yaygınlık kazanmaktadır. Bu yöntemler arasında en son geliştirilen yöntem olan çevresel DNA (eDNA) terimi literatürde ilk kez 1987 yılında, sediment örneklerinden mikrobiyal DNA elde edilmesine yönelik olarak kullanılmış, ancak farklı alanlarda uygulamaların gelişmesi 2000’li yılların başında gerçekleşmiştir. eDNA, hedef organizmaya ihtiyaç duyulmadan, DNA’nın çevresel örneklerden (toprak, su, hava gibi) elde edilmesini tanımlamak için kullanılan bir terimdir. En belirgin özelliği birçok farklı organizmadan kaynak alan genomik DNA kompleksi şeklinde olması ve parçalanmış halde bulunmasıdır. Toplam eDNA içerisinde canlı hücreler ve organizmalardan kaynaklı hücresel DNA ve doğal hücre ölümü ve onu takip eden hücre yapısının yıkılmasından kaynaklı hücre dışı DNA birlikte bulunmaktadır. Birden çok taksonun kompleks ve degrede bir DNA kaynağından, DNA barkodlarından daha kısa nükleotid dizilerini hedef alan belirteçler kullanılarak tanımlanması bu konuda ulaşılan en son bilimsel yenilik olup, bu yöntem “eDNA metabarkodlama” şeklinde isimlendirilmiştir.
Bu proje önerisinde, Yukarı Sakarya Havzası’nda istilacı tür konumunda bulunan Carassius gibelio, Clarias gariepinus, Orechromis niloticus ve Pseudorasbora parva türlerinin, tüm dünyada istilacı türleri tespit etmede kullanılan en yeni yöntem olan eDNA metabarkodlama yöntemi kullanılarak tespit edilmeleri ve populasyon durumlarının ortaya koyulması hedeflenmektedir. Bu yöntem Türkiye’de ilk defa uygulanacak olup, yürütülecek bu proje ile Türkiye iç sularındaki istilacı türlerin erken teşhisi ve mücadelesinde eDNA metabarkodlama yönteminin uygun bir yaklaşım olup olmadığı konusunda önemli veriler elde edilmesi sağlanacaktır.
Önerilen proje, eDNA çalışmaları için standart bir örnekleme protokolü oluşturmayı; hedef türlere spesifik primerler tasarlanmasını; tasarlanan primerler ile balık türlerine yönelik evrensel primerlerin kullanılarak mevcut istilacı türlerin ve olası yeni istilacı türlerin, tür seviyesinde belirlenmesini ve elde edilen moleküler verilerin değerlendirilmesi sonucunda eDNA’nın miktar ve kalitesine etki eden parametrelerin ortaya çıkarılmasını kapsamaktadır. Bu kapsam dahilinde Yukarı Sakarya Havzası’ndan belirlenen 10 istasyondan, 4 farklı mevsimde, 3 tekerrürlü (negatif ve pozitif kontroller hariç) örnekleme iki farklı yöntem ile yapılacak; elde edilen örneklerden eDNA izolasyonu gerçekleştirilecek; eDNA örnekleri kullanılarak 4 hedef istilacı türün mini DNA barkod bölgeleri PCR ile çoğaltılacak; ayrıca balık türleri için mitokondriyal sitokrom b bölgesine spesifik evrensel primer çiftleri kullanılarak farklı bir mitokondriyal gen bölgesi analiz edilecek ve DNA dizi analizleri gerçekleştirilecektir. Ardından, belirlenen nükleotid dizilerinin referans diziler ile karşılaştırılması suretiyle tür seviyesinde tanımlamalar yapılacak ve son olarak sonuçlar istatistiksel olarak değerlendirilerek anlamlı olup olmadıkları tespit edilecektir.
Ülkemizde gerçekleştirilecek ilk, uluslararası platformda ise sayılı eDNA çalışmalarından biri olarak planlanması nedeniyle projemiz temelde özgün bir değer taşımaktadır. Ayrıca çalışılacak havza ve hedeflenen istilacı türlere ilişkin dünyadaki ilk eDNA metabarkodlama çalışması olarak tasarlanmıştır. Bu proje ile henüz literatürde olmayan, eDNA örneklerinin alınmasında ve saklanmasında standart arazi protokolünün oluşturulması, eDNA çalışmalarının planlanması esnasında istasyon seçiminde dikkat edilecek noktalar, mevsimsel faktörlerin eDNA üzerindeki etkileri, örneklerin kaç tekrarlı alınması gerektiği, pozitif ve negatif kontrollerin ne şekilde tasarlanması gerektiği, su örneğinin taşınma ve saklanma koşullarının optimize edilerek standart hale getirilmesi ve bunun COST aksiyonunda paylaşılarak uluslararası standart haline getirilmesi hedeflenmektedir. Çalışma sonunda elde edilecek veriler değerlendirilip, yöntemin etkinliği ortaya koyulduktan sonra Türkiye’nin iç sulardaki istilacı türlerle mücadele stratejisi ile uyumlu bir şekilde Yukarı Sakarya Havzası için çözüm önerileri sunulması planlanmaktadır. Çalışma, Yukarı Sakarya Havzası’ndaki hedef türlerin populasyon durumlarının güncel durumunun belirlenmesi, özellikle de populasyon durumuna ilişkin literatür bilgisi bulunmayan Pseudorasbora parva türünün son durumunun belirlenmesi için ayrıca önem taşımaktadır.