Uludağ Üni. Zir. Fak. Bahçe Bit. Blm.
Aşı Uyuşmazlığının Belirlenmesinde Moleküler Yöntemlerin Kullanılması
Meyve yetiştiriciliğinde aşı uyuşmazlığının bir sorun olarak ortaya çıkmasından beri araştırıcılar bir yandan anaç ve kalem ilişkileri ile olayın mekanizmasını araştırırken bir yandan da aşı uyuşmazlığının önceden tahmin edilmesine yönelik çalışmalar yapmışlardır. Aşı uyuşmazlığının önceden tahmin edilebilmesi bahçe bitkileri açısından, özellikle erken anaç seleksiyonu ve yeni çeşitlerin aşı uyuşması yönünden özelliklerinin belirlenmesinde büyük bir avantaj sağlayacaktır. Geliştirilecek belirleyici bir metot sayesinde aşılama yapılmadan uyuşan kombinasyonlar seçilebilecek ve bunlar üretimde kullanılırken uyuşmayan kombinasyonlardan kaçınılacaktır. Veya sadece birkaç büyüme sezonunda, yıllarca beklemeye gerek kalmadan, uyuşmazlık saptanabilecektir. Dolayısıyla uyuşmazlık belirtilerinin görülebilmesi için yıllarca bekleyerek materyal, zaman ve işçilik kaybı önlenmiş olacaktır.
Günümüze kadar çeşitli araştırıcılar tarafından uyuşmazlığın pek çok tanımı yapılmıştır. Bunları göz önünde bulundurarak geniş bir tanımlama yapmak mümkündür. Buna göre uyuşmazlık, aşılanan farklı iki bitkinin birlikte ortak tam bir doku oluşturamaması ya da yetersiz bir doku oluşturmasına; ilerleyen yıllarda bitkideki fizyolojik çabaların, farklı iki parçanın karşılıklı olarak gereksinimlerini karşılamada yetersiz kalması ya da farklı nedenler sonucu birlikte yaşamamalarına ve tek bir bitki oluşturamamalarına uyuşmazlık denmektedir (1). Uyuşur bir aşı kombinasyonunun gelişmesindeki temel aşamalar, anaç ile kalemin birbiri ile bütünlük sağlaması, birleşme yerindeki iç yüzeylerde kallus hücrelerinin oluşumu, farklılaşması ve vasküler devamlılığın sağlanması şeklinde özetlenmektedir. Aşılamadan sonraki ilk yıllarda her zaman gözle görülür uyuşmazlık belirtileri ortaya çıkmamaktadır. Aşı uyuşmazlığı bazı durumlarda 4 hatta 10 yıl sonra bile ortaya çıkabilmektedir. Bu nedenle bir aşı kombinasyonunun uyuşur olup olmadığının veya ileride uyuşmazlık gösterip göstermeyeceğinin önceden tespit edilmesi ekonomik açıdan özellikle de erken anaç seleksiyonunda büyük öneme sahiptir.
Bu amaca yönelik çalışmalar, ilk yıllarda anaç ve kalemin büyüme özelliklerinin incelenerek aşılamadan sonra uyuşmazlık belirtilerinin görülmesi ve buna göre uyuşur veya uyuşmaz kombinasyonlara karar verilmesi şeklinde olmuştur. Araştırıcılar, daha sonraları fizyolojik, anatomik ve biyokimyasal çalışmalar yapmışlardır. Bu yöntemlerde uzun yıllar boyunca bitkilerin incelenmesine gerek duyulması nedeniyle aşı uyuşmazlığını önceden belirlemede yetersiz kalmıştır. Son yıllardaki çalışmalarda ise aşı uyuşmazlığının erken belirlenmesi olayına izoenzimler ve toplam proteinler gibi moleküler yaklaşımlar ağırlık kazanmıştır.
Aşı Uyuşmazlığının belirlenmesinde İzoenzimlerin Kullanımı
Organizmaların izoenzim parmak izlerinde gösterdikleri benzerlik veya farklılık bu materyallerin taksanomik ve metabolik benzerlikleri ile ilgili bilgi verebilmektedir. İzoenzimlerdeki bu farklılıklar nitelik ve/veya nicelik yönünden belirlenebilmektedir. İzoenzimlerin belirlenmesi elektroforez tekniği sayesinde mümkün olabilmektedir. İzoenzimlerin aşı uyuşmazlığında kullanımında test materyalleri aşılandığında izoenzim bantlarındaki değişiklikler veya benzerlikler bu materyallerin gösterdikleri veya ileride gösterebilecekleri fizyolojik tepkiler ile gelişimsel değişmeleri hakkında bilgi verebilmektedir. Ayrıca uyuşmazlığın tahmininde elektroforez teknikleri kullanıldığında, gerçek aşılama yapılmadan önce materyaller test edilebildiğinden aşı bölgesi diğer analiz tekniklerinde olduğu gibi zarar görmemektedir. Bu da bize test materyali yönünden avantaj sağlayarak, daha sonra oluşabilecek uyuşmazlık belirtilerini tahmin etmemize yarayacaktır (2).
Başarılı bir aşılamada önemli olan ligninleşme olayı ve lignin biyosentezindeki spesifik rolleri olabilen birçok izoperoksidazların varlığı araştırıcılara uyuşmazlığın tahmin edilme potansiyelini araştırma imkanı vermiştir. Uyuşmaz aşıların elektroforez ile belirlenmesi anatomik test metotlarından daha fazla avantajlara sahiptir. Bunlardan en önemlisi aşı bölgesinin yok edilmesine gerek kalmadan aşı birleşim noktasından sadece ince bir kabuk dokusu alınmasının analizler için yeterli olmasıdır. Bu nedenle, denemede kullanılacak her anaç için bir aşı yeterli olabilmektedir. Ayrıca, gerçekçi bir elektroforez testi, aşılamadan sonra 10 ay içinde yapılabilmektedir. Oysa ki fazla bir güvenilirliği olmamasına rağmen anatomik testler için en az 12-17 ay beklenmesi gerekebilmektedir.
Çin kestanesi, bodur meşe, çeşitli orman ağaçlarında (2) ve armut/ayva aşı kombinasyonlarında (3) aşılama yapılmadan anaç ve kalemin peroksidaz parmak izleri karşılaştırılmak suretiyle, iso-peroksidaz profilleri benzer anaç ve kalemlerin aşılamada uyuşma gösterebileceği, farklı olanların ise uyuşmaz kombinasyonlar oluşturacağı saptanmıştır. Böylece selekte edilen ve anaç potansiyeli olan genotiplerin aşı uyuşması yönünden karakteri ortaya konmuştur.
Aşı Uyuşmazlığının belirlenmesinde Toplam Proteinlerin Kullanımı
Elektroforez tekniğinin kullanımı, belli izoenzimlerin saptanması ile sınırlı değildir. Bu teknik aynı zamanda toplam proteinlerin belirlenmesinde de kullanılmaktadır. Bunun esası, aşı bileşenlerinin protein yapıları arasındaki benzerliğin aşıda başarıyı artıracağı görüşüne dayanmaktadır. Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) tekniği, proteinlerin kompleks yapılarını ayırarak karakterize etmek ve bunların moleküler ağırlıklarını tahmin etmede çok geniş çaplı kullanılan bir tekniktir.
Bu teknikler kullanılarak aşı bileşenlerinin protein profillerinin karşılaştırılmasıyla uyuşmazlığın belirlenmesi çalışmaları bazı Prunus türlerinde (4,5), asma bitkisinde (6) ve armut/ayva aşı kombinasyonlarında (3) yapılmıştır. Böylece, anaç ıslahında ve genotiplerin karakterlerini belirlemede daha kısa sürede sonuca ulaşmak mümkün olmuştur. Dolayısıyla, araştırıcılar, daha hızlı, kesin ve pratik olabilecek ve daha güvenilir sonuçlar verebilecek teknikleri kullanarak aşı uyuşmazlığının erken belirlenmesine yönelik bazı işaretler (markörler) bulma yolunda çalışmalarını yoğunlaştırmaktadırlar.
1- Yılmaz, M. 1992. Modern Bahçe Bitkileri Yetiştirme Tekniği. Çukurova Üniversitesi Basımevi, Adana. 151 s.2- Santamour, F. S. Jr., 1988. Graft Compatibility in Woody Plants: an Expanded Perspective. J. Environ. Hort., 6(1):27-32. 3- Gülen, H., 2000. Ayva ve Armutlarda Anaç/Kalem İlişkilerinin İzoenzim Analizleriyle Araştırılması.Ç.Ü. Fen Bil. Enst., Bahçe Bit. Anabilim Dalı, Doktora Tezi,Adana, 136 s. 4- Schmid, P.P.S., W. Feucht, 1985. Compatibility in Prunus avium/Prunus cerasus Graftings During the Initial Phase. III. Isoelectrofocusing of Proteins, Peroxidases and Acid Phosphatases During Union Formation. J. Hort. Science, 60(3): 311-318. 5- Moreno, M.A., J.P. Gaudillere, A. Moing, 1994. Protein and Amino Acid Content in Compatible and Incompatible Peach/Plum Grafts. J. Hort. Science, 69(6): 955-962. 6- Masa, A , 1989. Biochemical Affinity between the Scion Cultivars Albarino (Vitis vinifera L.) and Different rootstocks. Connaissance de la Vigne et du Vin 23 (4): 207-214, [Hort. Abstr. 60: 8004 (1990)].