Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography | Protocol (Translated to Turkish)
Boyuna morfolojik ve fizyolojik izleme optik koherens tomografi kullanarak üç boyutlu tümör pulcuklarının
İnsan Nöroendokrin Tümör Terapi Çalışmaları Üçodel İnsan nöroendokrin tümör hücre hatlarında…
Üç boyutlu Karışık-hücre Sfero Co-kültürden MemeHücrelerinin İzolasyonu…
Vivo, Perkütan, İğne Tabanlı, Böbrekelerin Optik Koherens Tomografi…
Tümör sferoidlerin Yüksek throughput Görüntüzi: Otomatik ve Doğru küremsiler boyutunu ölçmek için kullanıcı-dostu Yazılım Uygulama…
Optik koherens tomografi (OCT), üç boyutlu görüntüleme teknolojisi, izlemek ve çok hücreli tümör pulcuklarının büyüme kinetik karakterize etmek için kullanıldı. Tümör pulcuklarının yaklaşım ve içsel optik zayıflama Karşıtlık'dayalı pulcuklarının etiket içermeyen ölü dokuyu algılama sayma Voksel kullanarak hassas hacimsel miktar gösterdi.
Tümör pulcuklarının üç boyutlu (3D) hücre kültür model kanser araştırma ve anti-kanser ilaç keşif olarak geliştirilmiştir. Ancak, şu anda, yüksek-den geçerek görüntüleme yöntemleri kullanan parlak alan veya floresan algılama, tümör küresel nedeniyle sınırlı ışık penetrasyon, difüzyon floresan boyalar ve genel olarak 3D yapısını çözümleyemediği ve Derinlik-resolvability. Son zamanlarda, bizim laboratuvar optik koherens tomografi (OCT), çok hücreli tümör pulcuklarının boyuna karakterizasyonu bir 96-şey tabak içinde gerçekleştirmek için modality, Imaging 3D etiket içermeyen ve tahribatsız kullanımı gösterilmiştir. OCT yüksekliği yaklaşık 600 µm kadar büyüyen tümör pulcuklarının 3D morfolojik ve fizyolojik bilgi alma yeteneğine sahip. Bu makalede, tüm çok iyi plaka tarayan ve tümör pulcuklarının, 3D OCT verilerini otomatik olarak alır yüksek üretilen iş OCT (HT-Ekim) görüntüleme sistemi göstermektedir. Biz protokol HT-Ekim sistemi ve inşaat kurallarda ayrıntıları açıklamak. 3D OCT verilerden bir 3D render ile küresel genel yapısını görselleştirebilirsiniz ve ortogonal dilimleri, boyut ve hacim morfolojik bilgilere göre tümör küresel boyuna büyüme eğrisi karakterize ve gelişimini izlemek Optik içsel zayıflama Karşıtlık'göre tümör küresel ölü hücre bölgelerde. HT-Ekim için eleme yanı sıra biofabricated örnekleri karakterize uyuşturucu yüksek üretilen iş görüntüleme yöntemi kullanılabileceğini göstermektedir.
Kanser Dünya1' deki ölüm ikinci önde gelen nedenidir. Kanser hedefleme uyuşturucu gelişmekte olan hastalar için çok önemli önem taşımaktadır. Ancak, bu yeni anti-kanser ilaçlar fazla % 90 etkinlik ve klinik çalışmalarda2beklenmedik toksisite eksikliği nedeniyle geliştirme aşamasında başarısız tahmin edilmektedir. Nedeni basit iki boyutlu (2D) hücre kültür modelleri kullanımını ilaç bulma2 aşağıdaki aşamaları için bileşik etkinlik ve toksisite sınırlı tahmini değerleri ile sonuçları sağlayan bileşik filtreleme için bağlanabilir , 3 , 4. son zamanlarda, üç boyutlu (3D) tümör küresel modelleri anti-kanser ilacı discovery3,4,5 için klinik fizyolojik ve farmakolojik veri sağlamak için geliştirilmiştir ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25. Beri bu pulcuklarının tümörler vivo içindedoku özgü özelliklerini taklit edebilen, besin ve oksijen gibi ilaç direnci19, bu modellerin kullanımı yanı sıra degrade, hipoksik çekirdek potansiyel olarak ilaç bulma zaman çizelgeleri kısaltabilir, yatırım maliyetleri azaltmak ve yeni ilaçlar hastalara daha etkili bir şekilde getir. 3D tümör küresel kalkınma bileşik etkinliğini değerlendirmek için bir kritik yaklaşım küresel büyüme ve yineleme tedaviler9,26altında izlemektir. Bunu yapmak için onun çapı ve hacmi, yüksek çözünürlüklü görüntüleme yöntemleri ile ilgili tümör morfolojisi nicel karakterizasyonu zorunludur.
Konvansiyonel görüntüleme yöntemleri, alan parlak, faz kontrast7,9,22,24ve floresan mikroskopi8,9,16gibi 18,22 küresel'ın çapı ölçüsü sağlayabilirsiniz ancak küresel 3B alanda genel yapısını çözümlenemiyor. Pek çok faktör penetrasyon problama ışığın içinde küresel dahil olmak üzere bu kısıtlamalar katkıda bulunmak; küresel içine floresan boyalar difüzyon; heyecanlı floresan boyalar içinde veya küresel güçlü emme ve saçılma nedeniyle ters yüzeyine flüoresan sinyalleri yayan; ve derinlik-resolvability bu yöntemleri görüntüleme. Bu kez bir yanlış cilt ölçüde yol açar. Pulcuklarının nekrotik çekirdek geliştirilmesi nekroz vivo içinde tümör6,10,15,19,25taklit eder. Bu patolojik özellik 2D hücre kültürleri19,25,27,28çoğaltılamaz düşüktür. Küresel boyutu 500 µm çapı, üç kat konsantrik yapısı, daha büyük olan Proliferasyona hücreler dış tabakası, orta tabaka deneniyor hücre ve nekrotik bir çekirdek, dahil olmak üzere küresel6',10 görülebilir ,15,19,25, oksijen ve besin yetersizliği nedeniyle. Canlı ve ölü hücre floresans görüntüleme nekrotik çekirdek sınırına etiketlemek için standart bir yaklaşımdır. Ancak, yine, bu floresan boyalar ve görünür ışık penetrations gerçek şeklini gelişimini izlemek için nekrotik çekirdek içine sonda potansiyeline engel.
Modalite Imaging alternatif bir 3D optik koherens tomografi (OCT) tümör pulcuklarının karakterize tanıştırdı. OCT ilâ etiket içermeyen, tahribatsız 3D verileri alınıyor kapasitesine sahip bir tekniktir Biyomedikal görüntüleme 1-2 mm biyolojik doku29,30,31,32,33 derinliklerinde ,34. OCT düşük tutarlılık Interferometry örnek farklı derinliklerinden gelen sinyalleri arka dağınık algılamak için kullanır ve yatay ve dikey yönlere mikron düzeyinde mekansal çözünürlükte yeniden oluşturulan derinlik çözüldü görüntüleri sağlar. OCT göz hastalıkları35,36,37 ve anjiyografi38,39yaygın olarak benimsemiştir. Önceki çalışmalarda OCT vitro morfolojisi tümör pulcuklarının membran matris (Örneğin, Matrigel) gözlemlemek ve fotodinamik tedavi40,41onların yanıtları değerlendirmek için kullandık. Son zamanlarda, bizim grup sistematik olarak izlemek ve çok iyi plakaları423D tümör pulcuklarının büyüme kinetik ölçmek için bir yüksek-den geçerek OCT görüntüleme platformu kuruldu. Yaklaşım ve içsel optik zayıflama Karşıtlık'dayalı pulcuklarının etiket içermeyen nekrotik doku algılama sayma Voksel kullanarak 3D tümör pulcuklarının kesin hacimsel miktar gösterdi. Bu yazıda nasıl OCT görüntüleme platformu inşa ve tümör pulcuklarının yüksek çözünürlüklü 3 boyutlu görüntüleri elde etmek için istihdam ayrıntılarını açıklar. Büyüme kinetik 3D tümör pulcuklarının, küresel çapı ve birimlerin, doğru ölçümler de dahil olmak üzere, adım adım kantitatif analiz konusunda açıklanmıştır. Ayrıca, içsel optik zayıflama Karşıtlık'dayalı EKM kullanarak nekrotik doku bölgeleri tahribatsız algılama yöntemi gösterilir.
1. hücre hazırlanması
Hücre hatları nitelikli bir tedarikçiden edinin.
Not: hücreleri ilgi hücre satırlarından küresel kültür ortamda veya bir substrat (Matrigel gibi membran matris) yardımıyla oluşturabilir doğrulayın. Bir tur öncesi bir deneme için bir denetimi gerçekleştirmek ya da edebiyat9 içine bak.
Aşağıdaki hücre kültürünü tedarikçi tarafından sağlanan belirli yordamı donmuş hücreleri çözülme. Genel yordam43başka bir yerde bulunabilir.
1-2 pasajlar 25 cm2 kültür şişeler için hücreleri kültür. Hücreleri sonra 3D hücre kültürü için kullanmaya hazırsınız.
Her gün hücreleri sağlık durumunu izlemek ve bir kuluçka (37 ° C, % 5 CO2, % 95 nem) standart koşullarda proje. Medya gerektiği gibi yenileyin.
Not: Kültür orta DMEM (4,5 g/M glikoz), %1 antibiyotik antimycotic, % 10 fetal Sığır serum oluşur. Onlar izdiham içinde kültür şişeye ulaşmadan alt kültür hücreleri. Tedarikçi tarafından sağlanan hücre kültür kılavuz izleyin. Genel bir prosedür-ebilmek bulunmak elsehwhere44.
3D hücre kültürü çok iyi plakaları üzerinde aşağıdaki genel Protokolü9dayalı gerçekleştirin.
Kültür balonun kültür ortamını çıkarın ve sterilize edilmiş fosfat tamponlu tuz (PBS, 37 ° C'ye ısıtılmış) ile yıkayın.
Hücreleri tripsin ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA, % 0.5) 1 mL ekleyerek 3 min için balonun içine resuspend. Daha sonra kültür tripsin sulandırmak için medya ekleyin.
Hücre süspansiyon 15 mL santrifüj tüpü ve santrifüj 500 x g ve oda sıcaklığında 5 min için içine aktarın.
Süpernatant kaldırmak ve önceden ısıtılmış kültür ortamının 4 mL içeren hücreleri resuspend. Örnek hücre konsantrasyonu belirlemek için hücre sayımı için bir hemasitometre üzerine bir damla pipet. (Örneğin, 3.000 hücre/mL) tohum için uygun toplama hücrelere sulandırmak.
Not: ilk hücre konsantrasyonu küresel her hücre kültürünü ve çok iyi plaka (96-şey, 384-şey veya 1536-şey) her tür için en iyi duruma getirme.
Tohum hücrelere bir ultra düşük eki (ULA) yuvarlak popolu çok iyi plaka. Her şey yaklaşık 600 hücreleri olan hücre süspansiyon, 200 µL 3.000 hücre/mL konsantrasyonu her kuyuda içine ekleyin.
RT santrifüj kapasitesi 7 dk, 350 g x hızında veya kullanılabilir en düşük hız tohum sonra doğru bir plaka bağdaştırıcısı kullanan bütün tabağı.
Not: Santrifüj hücreleri tek, tek bir küresel şekillendirme kolaylaştırmak için kuyu ortasına doğru toplamak yardımcı olur. Santrifüj adım başlangıçta tümör pulcuklarının oluşturmak için yalnızca bir kez gerçekleştirilir. Tümör pulcuklarının büyüyen başlattığınızda bu yinelenir değil.
Çok iyi plaka 37 ° C ve % 5 CO2 bir kültür kuluçka korumak ve Kültür medya 3 günde yenileyin.
Not: Büyüme zaman farklı 3D kültür koşulları için değişebilir. Böylece küresel ~ 500 mikron 4\u20127 gün HCT 116 hücrelerin içinde büyüyebilir bizim çalışmada, 96-şey kaplamalar, U-87 MG ve HCT 116 hücre hatlarında 3.000 hücre/mL kullanılır. Medya takviyeleri ve büyüme faktörleri için farklı küresel modelleri, bağlı genel 3D kültür Protokolü eklemeyi düşünün.
OCT görüntüleme tümör pulcuklarının 3\u20124 günde onların büyüme boyuna bir çalışma için gerçekleştirin.
Not: OCT görüntüleme için önerilen zaman puan 4. gün, gün 7, gün 11, gün 14, gün 18 ve 21 gün olurdu.
2. yüksek-Platform Imaging üretilen iş Ekim
Not: başvuruda bulunulan bkz: iş29,30,31,32,33,34 için ayrıntılı bir inceleme ilkeleri ve uygulamaları, Ekim. Bkz: Şekil 1 ve Huang vd. 42 , görüntüleme sistemi bu çalışmada kullanılan özel Ekim Ayrıntılar için.
Tümör küresel görüntüleme için OCT sistemi için uygun bir geniş bant ışık kaynağı seçin.
Not: Burada, merkezi bir dalga boyu ~ 1,320 ile superluminescent diyot (SLD, Şekil 1A,B) nm ve ~ 110 nm bant genişliği geniş bant bir ışık kaynağı olarak kullanıldı.
Başvuru kol ve örnek kol ( Şekil 1A,B Ayrıntılar için bakınız) şemaları takip OCT sistemi oluşturmak. OCT sistem inşa Malzemeleri tablo optik bileşenlerinin bir listesi için bkz. Başvuru kol ve örnek kol optik yol uzunluğu yakından eşleşen emin olun.
Ekim tasarımını Spektrometre ayrıntılarını alternatif olarak, eşleşen bir ticari Spektrometre seçmek için bir Kolimatör, bir ızgara, bir F-theta lens ve bir satır taramalı kamera (bkz: Şekil 1 c için kurulum34) de dahil olmak üzere spektrometre, inşa Merkezi dalgaboyu ışık kaynağı. Spektrometre düzgün tüm Lazer bant genişliği, yüksek foton toplama verimliliği elde etmek için ve yavaş wash-out kesişim deseni sağlamak için kapsayacak şekilde hizalanmış emin olun.
Örnek kol gücü, görüntüleme derinliği, derinlik bağımlı duyarlılık, eksenel çözünürlük, odak ve lateral çözünürlük derinliği toplam gibi aşağıdaki ölçümler de dahil olmak üzere OCT sisteminin performansını karakterize. Zayıf bir yansıtıcı (Örneğin, bir ayna ile bir nötr yoğunluk filtresi) derinlik bağımlı duyarlılık, eksenel çözünürlük ve odak derinliği ölçmek için bir örnek olarak yerleştirin. Bir USAF çözünürlük testi grafik hedef yanal çözünürlük kontrol etmek için örnek yerleştirin.
Not:34,45 tanımları ölçümler OCT performansı ve bu ölçümler45karakterize etmek için iletişim kuralları için bkz: başvurur. Bizim çalışmada kullanılan özel OCT sistemi için ölçülen parametrelerinin bir listesi için bkz. Tablo 1 .
Görüntü tümör pulcuklarının farklı Wells (bkz: Şekil 1B) çok iyi plakasına yatay hareketi sağlamak için bir motorlu çeviri sahne alanı seçin. Bir sahne ile bir seyahat sıra-108 mm x 72 mm çaptan çok iyi plaka tüm Kuyu yapımı tam bir tarama sağlamak için kullanın. Bir 2D veya 3D motorlu çeviri sahne yazılım kontrolü ile her şey tam yerini ve otomasyon OCT sistem yüksek üretilen iş görüntüleme için etkinleştirmek için kullanın.
Bir plaka adaptörü kullanın veya bir plaka sahibi (3D baskı tarafından) çok iyi plaka sabit bir pozisyonda tutmak için tasarım.
Yatırma ve rotasyon sahne ve çevirim sahne alanı'nda (bkz: Şekil 1 D), monte edilmiş bir rotasyon sahne devirme bir 2D kullanarak çok iyi plaka farklı kuyulardan odak düzlem varyasyonu en aza indirmek için herhangi bir OCT Imaging gerçekleştirmeden önce düzeltin. D2, D11, B6, D6, G6 yol gösterici wells göreli konumlarını (Şekil 1A) OCT görüntüleri izlerken kullanın.
Döndürme kuyuları, OCT görüntüler (Şekil 1E) aynı yatay pozisyonlarda kadın plaka kenarlarını sahne hareket yönü ile paralel olduğundan emin olmak için plaka ayarlayın. Böylece kuyu OCT (Şekil 1F) görüntüleme için aynı dikey konumlarda kalır optik tabloya paralel olması için plaka devirme ayarlayın.
Not: Uyum devirme açı ve odak yardımcı OCT görüntü kalitesi bütün kuyuları için en iyi duruma getirme. Ancak, Kültür medya farklı Wells yüksekliğini varyasyonları küresel görüntü defocusing için yol açabilir optik yolları değişiklikler neden olabilir. Auto-odak iyi görüntü kalitesi elde etmek için OCT Imaging odak düzlemi kontrol etmek için uygulanabilir. Ayarlama adım OCT görüntü kalitesiz tümör küresel nedeniyle aşağıdaki sorunları gidermez: küresel ilk tohumlama konumu nedeniyle; decentering biofabricated hücre dışı matrisler katıştırılmış küresel yükselmesi; Zavallı plaka kaliteli iyi dipleri boy büyük farklılıklar nedeniyle. Ek yazılım denetim ile auto-odak ya da otomatik hizalama görev görüntüleme sistemi OKT performansını optimize etmek için uygulanabilir.
OCT resim alma ve her birinden de sırayla veri toplamak için sahne hareketi kontrol etmek için bir özel bilgisayar programı kullanın.
3. tarama ve tümör pulcuklarının işleme Ekim
Tümör pulcuklarının OCT görüntüleme günü, çok iyi plaka kuluçka makinesi al. Görüntüleme sistemi OKT altında çok iyi plaka aktarın. Plaka bağdaştırıcısı üstüne yerleştirin.
Not: Tümör pulcuklarının OCT görüntüleme Polistren levha kapak açma veya kapatma ile gerçekleştirilebilir. Ancak, kuyulardan buharlaşma nedeniyle kapağındaki su yoğunlaşmaları ışık geçirgenliği etkiler ve en uygun daha az OCT görüntüleri pulcuklarının verimli ışık yolunu deforme.
Z-yönünü çeviri sahne hareket ettirerek plaka yüksekliğini ayarlayın. ~ 100-200 odak düzlemi konumunu korumak mikron depth-wise üniform olmayan etkisini en aza indirmek için her küresel üst yüzeyinin altında odak profil.
Bir uygun OCT tarama aralığı (Örneğin, 1 mm x 1 mm) onun gelişme evrelerine göre bütün tümör küresel karşılamak için özel yazılım ayarlayın. Ayarı kaydetmek için Kaydet parametreler ' i tıklatın.
Tümör pulcuklarının teker teker pulcuklarının içeren plaka bütün kuyuları için 3 boyutlu OCT görüntüleri elde etmek için özel yazılım kullanmak. Önizleme resmi görüntülemek ve OCT görüntü elde etmek için Al düğmesini tıklatın için Önizleme düğmesini tıklatın.
Not: sahne hareket halinde değilken OCT küresel veri toplanan olun. Küresel U alt Merkezi'nde de genellikle bulunur. Ancak, sahne hızlanan veya küresel kültür medya atalet nedeniyle yavaşlatma küresel kültür medyada kaydırılır.
İşlem 3D OCT veri kümeleri, tümör pulcuklarının özel C++ işleme kodu ile OCT yapısal görüntüler oluşturmak için. Şekil 2A post-processing OCT veri akış çizelgesi için bkz.
Not: Şekil 4A oluşturulan 3D OCT yapısal görüntüleri için bkz.
Bkz: Bölüm 5, Drexler ve Fujimoto34 ve Jian vd. 46 OCT veri işleme adımları ayrıntılı açıklaması için. Tüm üç boyutlu piksel boyutunu ayarlamak. OCT yapısal görüntü düzeltilmiş ölçeklerde yeniden ölçeklendirme.
Not: Başvuru kol ve örnek kol optik yol farkı ölçüsü eksenel yönde (z-yön) OCT görüntülerin mesafedir. Böylece, kırılma indisi (n) örneğinin rescaling için eksenel yönde piksel boyutunu ayarlama zaman dikkate alınması gerekir. Bizim çalışmada, n kullandığımız 1.37 tümör küresel42kırılma indisi =.
Küresel görüntüleri 2B OCT görüntüleri üç kesitsel XY, XZ ve YZ uçak içinde küresel centroid kullanarak kolaj oluşturmak. Şekil 3 c-E kolajlar küresel görüntüleri temsilcisi çıkışı için bkz. Tüm küresel cisimlerin yaklaşık aynı yerde konumlandığından emin olmak için MATLAB işlevi dftregistration47, kullanarak tüm pulcuklarının için görüntü kaydı gerçekleştirmek.
Bir ticari veya özel yazılım kullanarak küresel 3D render edinin.
Not: Aşağıdaki adımlar tümör pulcuklarının ticari bir yazılım kullanarak 3D render edinme gösterir.
3D OCT veri belgili tanımlık bilgisayar yazılımı yükleyin.
Surpass Masası'nı tıklatın. Sonra Eklemek Yeni Birim'itıklatın. 3D render için kullanılacak karışım modu seçin.
Görüş açısı fare işaretçisini kullanarak görüntü sürükleyerek ayarlayın.
3D tümör pulcuklarının 4. morfolojik miktar
Not: Bu miktar özel bir yazılı kod MATLAB içinde işler. İşlemi başlatmak için Çalıştır düğmesini tıklatın. Şekil 2B pulcuklarının morfolojik miktar adımları akış çizelgesi için bkz.
Küresel çapı, yükseklik ve çapı tabanlı birim ölçmek.
2D OCT görüntüleri küresel centroid geçen üç kesitsel XY, XZ ve YZ uçak içinde seçin.
Çapı ölçmek ve küresel XY ve XZ yüksekliğini uçak, anılan sıraya göre.
Küresel çapı tabanlı birim kullanarak hesaplama: , tümör küresel şeklinde bir varsayım ile.
Voksel tabanlı küresel güç ölçmek.
Speckles kaldırmak için küresel OCT yapısal Datası 3D ortalama filtre uygulayın.
Açıkgöz kenar algılama48 filtre, kare kare, tümör küresel bölge iyi alttan ayıran uygun bir eşik ile kullanarak tümör pulcuklarının kesiminde.
3D verileri için bağ voxels grubu (yerleşik işlev bkz: bwconncomp).
Her bağ Voksel grubunda ve (el ile seçilmiş), küresel centroid her grup için arasındaki uzaklığı hesaplamak. Küresel bölge grup olarak en az ortalama mesafe ile tanımlayın.
Voxels küresel bölgesi içinde saymak ve küresel toplam hacmi verimli gerçek birim (birim/Voksel), bir tek tek Voksel tarafından çarpın.
5. ölü hücre bölge 3D tümör pulcuklarının tespiti
Not: homojen bir ortamda bira-Lambert hukuk49tarafından OCT geri dağınık yoğunluğu Derinlik (ı(z)) bir fonksiyonu olarak algılanan tanımlanabilir: , z derinliğini gösterir nerede μ optik zayıflama olduğunu katsayısı, ve ben0 örnek olay yoğunluğu. Bu nedenle türetilmiş optik zayıflatma katsayısı olarak ifade edilebilir: . OCT görüntüleri kez logaritmik bir ölçekte çizilen ilişkili beri OCT yoğunluğu profil eğimi optik zayıflatma katsayısı türetmek için alınabilir. Şekil 2C optik zayıflatma haritaların üretimi bir akış çizelgesi için bkz:.
Küresel dışında istenmeyen bölgeleri kaldırmak için segment gerçekleştirin. OCT Albümdeki doğasında vardır benek gürültü bastırmak için 3D ortalama filtre uygulayın.
Pixel-Wise edinmek optik zayıflama katsayıları doğrusal tarafından belirli bir derinlik Aralık üzerinde (hareketli pencere), günlük ölçekli OCT yoğunluğu profiline uyan onun yamaç ayıklamak ve yamaç -1 tarafından çarpın/2.
Not: Her Voksel parçalı Küresel bölgesi içinde zayıflatma katsayısı OCT yoğunluğu profil 10-Voksel derinlik penceresindeki (derinlemesine ~ 40 mikron), eğimi dayalı ortasındaki pencerede yer alan Voksel ile hesaplanır.
Bir çerçeve içinde eksenel her tarama ve optik zayıflama katsayıları parçalı Küresel bölgesinin tüm voxels için hesaplanır kadar parçalı Küresel bölge içeren bir 3B veri kümesi her çerçevede yukarıda (merdiven 5.1 ve 5.2) yöntemleri uygulayın.
Yüksek-zayıflama bölgesi vurgulamak için ikili eşik gerçekleştirin.
Not: Bkz: Huang vd. 42 eşik çubuk grafik analizi ile yüksek-zayıflama bölgesinin belirlenmesi için.
Binarized optik zayıflama harita (karıştırma) ölü hücre bölge etiketlemek için orijinal görüntü üzerinde vurgulayın. Ölü hücre bölgesinin 3D dağılımını görselleştirmenizi karışımlı zayıflama harita 3D olarak işlenen görüntü oluşturmak.
6. Histoloji ve immünhistokimya
Not: Histoloji ve tümör pulcuklarının görüntülerini lekeli immünhistokimya (IHC) karşılık gelen OCT sonuçları ile ilişkilendirmek için elde edilir.
Seçilen zaman noktalarda, 1-2 tümör pulcuklarının Histoloji ve IHC boyama çok iyi plaka seçin. Bir pipet 1 mL pipet ipuçları ile küresel bir 1,5 mL santrifüj tüpü kuyudan aktarmak için kullanın.
Not: 1 mL pipet ucu ucunu açılışı küresel yapısını zarar görmesini önlemek için tümör küresel boyutundan büyük olduğundan emin olmak için transfer önce kesilmiş.
% 10 formaldehit ve düzeltme 48 h için dolu bir tek 1.5 mL microcentrifuge tüp her tümör küresel toplayın.
Histoloji ve IHC işlemleri standart parafin katıştırma teknikleri kullanarak her küresel için gerçekleştirin.
Not: Leke 5 mikron kalınlığında kesitler tümör pulcuklarının Hematoksilen ve eozin (H & E) ve terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP nick bitiş (tünel) apoptosis algılama etiketleme için. Hematoksilen counterstaining tünel için uygulanır. Dijital slayt tarayıcı lekeli örnek inceden inceye gözden geçirmek ve yüksek çözünürlüklü elde etmek için kullanılan histolojik ve IHC görüntüler.
Yüksek işlem hacmi optik koherens tomografi görüntüleme pulcuklarının bir 96-şey plaka
Şekil 3 gün 3 HCT 116 tümör pulcuklarının 96-şey plakalı HT-Ekim tarama sonucu sergiler. Koca tabağı sıralı tarama (H12) sağ alt kuyudan başlar. Şekil 3B HT-Ekim sisteminin yazılım uygulama Akış grafiğini gösterir. Bir küresel veriler toplanır ve işlenen sonra plaka sonraki ~ 2 için bekle taşınır s küresel dinlenmek ve sonraki küresel veri toplamak izin vermek için. Her OCT veri 400 x 400 x 1,0 0,84 x 2,3 mm3x gerçek bir birimine denk 1024 voxels oluşur. Şekil 3 c tr suratlı bir kolaj işlenmiş verilerinden oluşturulan HCT 116 pulcuklarının OCT görüntüleri gösterir. Sonuç diğer 2D yüksek üretilen iş görüntüleme sistemi22--dan imge ile karşılaştırılabilir olduğunu. 3D görüntüleme yeteneği, Ekim göz önüne alındığında, biz de 2D kesitsel küresel görüntüleri kolaj 96 kuyulardan (şekil 3Dküresel boyutlara izlemek ve düşey yöndeki inhomogeneity küresel görselleştirmek için) yaratacaktır. Bir kolaj 3D render küresel görüntülerin de herhangi bir önceden tanımlanmış (3E rakam) genel olarak 3D şekli görselleştirmek ve küresel yuvarlaklığını değerlendirmek mümkün açıdır. Satır taramalı kamera 92 kHz ve 47 kHz hızında sırasıyla çalışırken ~ 21 dk ve ~ 25 dk 96 iyi plaka olurdu için genel OCT görüntüleme ve işlem zaman unutmayın. Video 1 bir örnek için bkz.
Boyuna morfolojik ve fizyolojik izleme tümör küresel
Birden çok zaman puan için plaka tümör pulcuklarının OCT yapısal görüntülerini elde sonra biz daha fazla bu veri tümör pulcuklarının morfolojik ve fizyolojik bilgi miktarının tarafından analiz edebilirsiniz. Şekil 4 tümör pulcuklarının karakterize ve boyuna morfolojik ve fizyolojik bilgi kendilerinden farklı yaklaşımlar göstermektedir.
Şekil 4B tümör küresel görselleştirmek için farklı yöntemler sunulmaktadır. Ticari ya da özgür yazılım yardımıyla, biz 3D verileri belgili tanımlık bilgisayar yazılımı yüklemek ve tümör küresel (3D render) bir "birim" oluşturmak, hangi 3B alanda tümör küresel genel yapısını gösterir. Uygun eşik ile tümör küresel (Şekil 4B), küresel segment ve birimin tedbir için kullanılabilir bir yüzey Arsa yaratacaktır. Ayrıca farklı yönler (Şekil 4B, XZ, YZ ve XY) farklı kesit uçak ortogonal slaytlar (ortho slayt) oluşturmak ve çapı ve tümör küresel bu ortho slaytlardan yüksekliğini ölçebilir.
Birden çok zaman noktasından aynı küresel OCT veri toplama, biz morfolojik bilgi ölçmek ve onun boyuna değişiklikleri göstermek için küresel büyüme eğrisi oluşturur. Şekil 4 c 21 gün boyunca izlenen bir HCT 116 tümör küresel temsilcisi verileri gösterir. Bölümlenmiş veri ve Ortopedi slaytlar çapı, yükseklik ve tüm zaman noktası için küresel Voksel tabanlı hacmi tabloda listelenen ölçülür. Biz çapı tabanlı birim bir karşılaştırma için hesaplanır. Boyutu ve birim büyüme eğrileri çizildi, anılan sıraya göre. Büyüme eğrileri, bu HCT 116 tümör küresel 11 gün önce birimdeki bir doğrusal büyüme deseni takip görebiliyordu. Bu zaman noktasından önce küresel büyüyen devam etti ve nispeten düzgün bir şekil saklanır. Ancak, 11 gün sonra küresel oldu bozulduğu, basık ve tam 21 günde çöktü. Voksel tabanlı birim büyüme eğrisi açıkça gün 11 sonra yavaş yavaş azalan birimlerle eğilim gösterir.
OCT verilere göre biz de ölü-hücreler tümör pulcuklarının içinde dağılımı fizyolojik bilgi 2D kesitsel görüntülerden piksel piksel optik zayıflama analiz ederek elde edebilirsiniz. Şekil 2 ve iletişim kuralı 5 resimli yöntemleri biz-kantitatif ölü hücre bölgeleri belirlemek ve bu bölgelerde büyüme zamanın bir fonksiyonu olarak izleyebilirsiniz. Şekil 4 d temsilcisi ölü hücre alanlarda artış boyuna izleme sonucunda tümör küresel gösterir. Yüksek optik zayıflama vardı, kırmızı ile vurgulanacaktır alanları etiketli nekrotik alanlar gösterir. Optik zayıflama harita 14 gün geliştirme sırasında işlenen 3D, genişleyen, nekrotik bölgeler artış gösteren kırmızı sektör görebiliriz. Nekrotik alanlar artış yüzdesi olarak, tümör küresel mükemmel şeklini korumak olabilir değil. Bu nedenle, onlar bozabilir ve daraltmak, hangi Şekil 4 ctümör morfoloji boyuna izlenmesi içinde görüldü eğiliminde olacaktır.
Önerilen geri dönüşlü ölü dokuyu bölge algılama tekniği ile ilgili görüntüleri Histoloji ve IHC tarafından elde edilen OCT optik zayıflama Haritası HCT 116 tümör küresel karşılaştırarak doğrulandı. Şekil 4 d böyle bir karşılaştırma ile bir gün 14 HCT 116 küresel sunar. OCT zayıflama arasında iyi bir maç harita ve H & E ve tünel karşılık gelen dilimler, H & E ve tünel dilimleri OCT yüksek zayıflama kontur türetilmiş dash çizgilerle işaretlenmiş bölgelerde içinde özellikleri analiz ederek gösterilen bulundu bölgeler. H & E dilimler halinde, ölü doku bölgeleri kesikli çizgi bölge içinde yer alan daha az yoğun ve toplu yapı oldugu. Tünel dilimler halinde iyi bir maç yüksek zayıflama bölgesi ve tünel etiketli apoptotik hücre bölge arasında gözlendi.
Şekil 1: tümör küresel görüntüleme için yüksek üretilen iş optik koherens tomografi (HT-Ekim) sisteminin inşaat. HT-Ekim sisteminin(a)şemaları. Bir diyagramı 96-şey plaka OCT sistem yanında çizilir. Sarı etiketli beş wells (D2, D11, B6, D6, G6) (D) dönemlerinde hassas ayar kullanılır. (B) HT-Ekim sistemi gerçek yapılandırma. Sistem her bölümü için kullanılan optik bileşenler için Tablo malzemeleri görmek. (C) spektrometre için HT-Ekim sistemi Tasarla. (D) sahne kurulum için HT-Ekim sistemi. 6 eksenli sahne ve OCT edinme ve sahne hareketi arasındaki eşitleme doğru hizalaması, yüksek üretilen iş görüntüleme için gereklidir. (E) ve (döndürme ve devirme farklı wells son görüntü üzerinde etkileri göstermekF). Döndürme OCT görüntüleri devirme farklı kuyu dikey değişen yol açacak iken yatay kaydırmaya farklı Wells neden olur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: veri işleme tümör pulcuklarının, OCT yansımaları için. (A)genel son işlem adımları OCT veri için akış çizelgesi. Tümör küresel morfolojik miktar (B) akış çizelgesi. (C) akış tümör küresel ölü hücre bölge algılama. Ölçek çubuğu: tüm subfigures için 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: yüksek işlem hacmi OCT iyi 96 tarama plaka içeren U-87 MG tümör pulcuklarının. (A) gerçek kurulum ile 96-de amaç altında plaka. (B) akış şeması HT-Ekim sistemi yazılım uygulanması. 96 tr yüz (C), kesit (D) ve 3D işlenmiş en büyük yoğunluk projeksiyon (MIP) (E) OCT görüntüleri gün 3 HCT pulcuklarının işlenen verilerden oluşturulan 116 kolajlar. Ölçek çubuğu: 200 µm tüm subfigures için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: boyuna morfolojik ve fizyolojik miktar, tümör pulcuklarının 3D OCT verilerle. (A) elde edilen 3D OCT genel OCT post-processing sonra bir tümör küresel yapısal görüntüleri. OCT verilerden 3B Yüzey arsa ve XZ, YZ ve XY ortogonal dilimleri yapısı herhangi bir yönde (B) tümör küresel görselleştirmek için oluşturabilirsiniz. Boyuna bir tek tümör küresel (C) izleme, çapı, yükseklik ve Voksel tabanlı birim ( Tablo reçetesilistelenen) karakterize ve büyüme eğrileri boyutu ve birim 21 gün boyunca komplo gerçekleştirebilirsiniz geliştirme. Örnekte, geliştirilen, küresel olarak 11 günde bozulur ve tam 21 günde çöktü bu oldu. Daha fazla boyuna optik içsel zayıflama kontrast (D) dayalı bir tümör küresel fizyolojik durumunu izleyebilirsiniz. Bir tümör küresel görüntüleri render 3D görünüm ve ölü hücre bölgelerden gün 7 gün 14 büyüme gösterdi. Kırmızı Yüksek zayıflama etiketli ölü hücre alanlarda histolojik ile eşleştirilmiş ve immunohistokimyasal (IHC) neden olur. OCT zayıflama harita, H & E ve tünel Şekil 4 d sonucu Ref. 42 değiştirilme tarihi. Ölçek çubukları: tüm subfigures için 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Video 1: tümör pulcuklarının yüksek üretilen iş OCT görüntüleme. Bir iş akışı 3D OCT görüntüleme, temel OCT işleme ve sahne hareket video 5 x hız ile sunuldu. Önceki-in işlenmiş OCT pulcuklarının yapısal görüntülerini de sunuldu. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Tümör faaliyet morfolojik yapısı için son derece uygundur. Karakteristik büyüme eğrisi 2D hücre kültürleri için izleme, izleme için 3D tümör pulcuklarının büyüme eğrisi de uzun vadeli küresel büyüme davranış farklı hücre hatları için karakterize etmek için geleneksel bir yaklaşım benzer. Özellikle, biz tümör bozulma ya da doğrudan büyüme eğrisi yansır tümör büyütme analiz ederek uyuşturucu yanıt karakterize olabilir. Bu nedenle, boyutu ve büyüme eğrisi türetmek için ses düzeyi de dahil olmak üzere 3D tümör pulcuklarının, kantitatif değerlendirilmesi tümör pulcuklarının karakterizasyonu ve bileşik etkisi değerlendirilmesi için büyük önem taşıyor. Şu anda, platformlar Imaging faz kontrast parlak alanını temel alan veya floresan görüntüleme rutin görüntüleme ve morfoloji analizi veya 3D tümör pulcuklarının8,9,18işlevleri için kurulmuş, 22. Ancak, onlar tüm, büyük tümör yapısı nedeniyle sınırlı derinlik penetrasyonu yanı sıra düşük çözünürlüklü derinlik-resolvability çözmek mümkün değildir. Temsilcisi sonuçlarında tüm 3D yapısı zamanla gelişen tümör küresel görselleştirmek için OCT göstermiştir. 3D OCT görüntüleme hangi was değil elde edilebilir içinde derinliği boyunca çözünürlüğünü eksikliği konvansiyonel görüntüleme yöntemleri küresel herhangi bir yönelim ve yüksek-resolvability ile herhangi bir kesit görünümünü sağlayabilir. Ayrıca, voxel tabanlı birim miktar 3D OCT verilerini temel alan özgün şekillerini varsayarak olmadan küresel birimlerin doğru bir miktar vermiştir. Bu nedenle, OCT tümör pulcuklarının, farklı hücre hatları için karakteristik büyüme kalıplarının doğru ölçümler sağlar ve potansiyel olarak hizmet verebilir 3D morfoloji karakterizasyonu için sağlam bir görüntüleme yöntemidir olduğunu göstermiştir bir alternatif ilaç yanıt değerlendirme için.
Floresan boyama kullanarak canlılık testleri bir popüler yaklaşım tümör pulcuklarının, özellikle uyuşturucu18eleme için fonksiyonel analiz için kalır. Ancak, floresan boyalar yıkıcı doğası bu testler sadece son nokta çalışmaları için uygun olduğunu gösterir. Bizim temsilcisi sonuçları (Şekil 4 d), tüm küresel içinde hücre canlılık karakterize olabilir alternatif bir yöntem gösterdi. Sonuçlarımız OCT içsel optik zayıflama Karşıtlık'dayalı küresel uygun bölgede ölü hücre bölgesinden ayırt edilebileceğini göstermiştir. Buna ek olarak, 3D görüntüleme yeteneği ve non-yıkıcı doğa OCT sisteminin, ölü hücre dağılımları kantitatif değerlendirilmesi ve ölü hücre bölgeler içinde küresel ilerleme içinde in situ izlenmesi mümkün olan potansiyel olarak küresel büyüme deseni daha değerli bilgiler verir. Ancak, biz temsilcisi sonuçlarımızda biz apoptozis ve nekroz, ikili OCT zayıflama harita gibi hücre ölüm modları farklı türde ayırt etmek mümkün değildir, dikkat etmelisiniz.
Bir uyuşturucu beri bileşik Kütüphane geniş olabilir (> 10.000), tümör pulcuklarının çok iyi tabak içinde uyuşturucu tarama sırasında derecesinin yüksek üretilen iş ve sağlam bir sistem zorunludur. Geçerli yüksek üretilen iş görüntüleme sistemi 96 iyi plaka bir tarama elde edebilirsiniz < 2D 5 dk tarama modu22. OCT motorlu sahne yardımı ile yüksek-den geçerek tarama amaç için adapte edilebilir. Bir de bir ticari olarak mevcut OCT sistemiyle (bkz: Tablo malzemeleri ticari OCT sistemleri listesi için) özel OCT sistemimize benzer bir performans elde etmek ve bir motorlu sahne sisteme dahil. Ancak, çabaları motorlu sahne entegre ticari OCT sistemi değiştirmek için alınmalıdır. Ayrıca, OCT edinme tetikleyici ve sahne hareket tetikleyici arasındaki eşitleme gerçekleştirmek için özel yazılım uygulama gereklidir. Bizim prototip için HT-Ekim sistemi, 2-18 kamera hız seçimine bağlı olarak bir tek tümör küresel bir 3D OCT verilerden elde etmek için saniye sürdü. Böylece, toplam edinme zaman ~3.2 min HT-Ekim sistemi kullanılarak bir 96-şey tabak gibi kısa olabilir. Ancak, veri işleme, veri okuma ve sabit diskler ve sahne hareketleri, yazma da dahil olmak üzere geçerli HT-Ekim sistemi için ara adımlar zaman alıcı kaldı. Ek ~ 18 min ~3.2 min en az veriler alma süresi üzerine gerekli olacaktır. Zaman Imaging toplam birkaç açıdan daha da azaltılabilir: state-of--art OCT sistemlerine bir yüksek hızlı ayarlanabilir Lazer kaynak50,51ile; kullanın kritik adımlar (veri toplama, veri işleme, yazma, sahne hareketi) düzenleyerek iş akışının optimize edilmiş çalışma paralel olarak; bir uzay bölümü çoğullama Kur52ile paralel bir OCT görüntülemede istihdam. Sistem optimizasyonu ile yüksek-den geçerek OCT sistem karakterizasyonu diğer 3D biyo-fabrikasyon örneklerinin yanı sıra kanser ilaç keşif yararlı olabilir (Örn., 3D doku organoids) çeşitli biyomedikal uygulamalar için.
Yazarlar hiçbir rakip faiz ifşa.
Bu eser NSF tarafından desteklenen IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR verir-TT (dudak-1640707), NIH hibe R21EY026380, R15EB019704 ve R01EB025209 ve Lehigh Üniversitesi başlangıç fonu.