Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens | Protocol (Translated to Turkish)
Retrospektif mikroRNA sıralama: Parafin gömülü RNA Formalin sabit örnekler kullanarak Tamamlayıcı DNA Kütüphane hazırlık Protokolü
Parafin katıştırılmış örneklerden formalin sabit insan hastalıkların moleküler biyolojik değerli bir kaynağı temsil eder. Burada başlangıçta taze donmuş RNA ile tasarlanmış ve dokulara gelen arşivlenmiş mikroRNA'lar analizini 35 yaşına kadar saklı için en iyi duruma getirilmiş bir laboratuar tabanlı cDNA Kütüphanesi hazırlık protokolü, mevcut.
-Arşivlenmiş, formalin sabit klinik olarak sınıflandırılmış parafin gömülü (FFPE) doku kanseri geliştirme retrospektif moleküler çalışmalar için nükleik asitler sağlayabilir. Daha sonra invaziv hastalık geliştirmek hastalarda non-invaziv veya önceden Malign lezyonlar kullanarak, gen ifade analizleri Kanser riski için yatkınlık erken moleküler değişiklikler tanımlamaya yardımcı. De nükleik asitler FFPE dokulardan kurtarılan şiddetli fiziksel hasar ve kimyasal değişiklikler, daha onların analiz yapmak zor ve genellikle adapte deneyleri gerektirir uğramıştır tanımlanmıştır. Küçük bir sınıfı temsil mikroRNA (miRNAs), ancak, RNA molekülleri ~ 18-24'e kadar sadece kapsayan nükleotit, gösterilmiştir uzun süreli depolama dayanabilir ve başarılı bir şekilde FFPE örnekleri analiz için. Burada özellikle hangi son zamanlarda güçlü ve son derece tekrarlanabilir kullanarak arşivlenmiş zaman gerekir gösterilmiştir analiz arşivlenmiş dokulardan çıkarılan küçük RNA'ların en iyi duruma getirilmiş bir 3' barkodlu Tamamlayıcı DNA (cDNA) Kütüphane hazırlık iletişim kuralı mevcut Klinik örneklerin 35 yıl boyunca saklanır. Bu kütüphane hazırlık nerede RNA örnekleri (en fazla 18) bireysel 3' barkodlu bağdaştırıcılarla bakmaksızın ve birlikte sonraki enzimatik ve biyokimyasal hazırlıkları havuza alınmış tehlikeye/bozulmuş malzeme multiplex analizine de adapte önce analiz. Tüm purifications boyutu özel seçimleri ve enrichments barkodlu küçük RNA türlerin sağlayan polyacrylamide Jel Elektroforez tarafından (sayfa), gerçekleştirilir. Bir pilot Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) yeni nesil sıralama (NGS) için malzeme en uygun miktarda üretmek belirli amplifikasyon döngüsü belirlenmesi bu cDNA Kütüphanesi hazırlık dakika RNA girişleri için de adapte önemlidir. Bu yaklaşım bozulmuş FFPE RNA 35 yaşına kadar arşivlenmiş örnekler üzerinden kullanımı için optimize edildi ve son derece tekrarlanabilir NGS veriler sağlar.
miRNAs oldukça iyi formalin sabit parafin gömülü (FFPE) örnek1,2,3' te korunmuş. Önceki çalışma bu kısa düzenleyici kodlamayan tek iplikçikli RNA molekülleri ifade FFPE örneklerinden toplam RNA kullanarak başarıyla değerlendirilecek ve orijinal taze karşılaştırıldığında ilgili gen ifadesi verileri sağlamak göstermiştir doku4,5,6,7,8. FFPE doku işleme (formaldehit, ısı, kuruma, vb), endojen RNases ve küçük boyutu miRNAs (~ 18-24 yaş örneklerin tarafından etkilenmesine neden için gösterilen büyük boyutlu haberci RNA karşılaştırıldığında nukleotid) onları bozulması için dayanıklı ve esnek de yüksek üretilen iş mRNA çalışmalar arşivlenmiş numuneler9daha iyi performans miRNA ifade çalışmalar aracılığıyla gösterdi uzun süreli depolama için yapmak görünür. miRNA ifade çalışmalar çoğunlukla küçük ölçekli analizleri yapılmıştır, arşivlenmiş klinik örnekler kullanarak o tek gösterdi veya kantitatif PCR deneyleri multiplexed, Mikroarray teknolojileri ve en yakın zamanda NGS farklı olabilir korunmuş miRNAs ifadeden sonra en iyi duruma getirme Bu deneyleri10,11,12,13,14değerlendirmek için kullanılabilir.
Verilen bu bozukluk miRNA ifade insan maligniteler çeşitli gelişimi ile ilişkili olmuştur ve orada olduğunu potansiyel olarak büyük bir kaynağı klinik olarak arşivlenmiş örnekleri açıklamalı, belirgin olmuştur ki bu küçük RNA molekülleri potansiyel kanser biyolojik15,16,17,18gelecek vaat eden bir kaynağı temsil eder. NGS gibi yüksek üretilen iş gen ifade teknoloji kullanımı miRNA transkriptlerinizin PCR ve/veya microarrays19gibi hedeflenen teknolojileri karşılaştırıldığında genel bir değerlendirme sağlama avantajına sahiptir. Bu nedenle, en iyi duruma getirilmiş, uygun fiyatlı ve kolayca uygulanabilir bir iletişim kuralı cDNA Kütüphanesi hazırlanması için eski arşivlenmiş örnekler üzerinden küçük RNA'ların NGS için büyük ölçekli retrospektif çalışmalar20etkinleştirmek için optimize edildi.
Biz daha önce bir eşzamanlı RNA/DNA ekstraksiyon protokol çağdaş ticari kitleri21daha iyi performans için bulduğumuz eski arşivlenmiş numuneler RNA ve DNA ayrı kurtarma için kurulmuş. Toplam RNA FFPE doku kez uzun süre arşivlenmiş edinmek için bu ayıklama protokolü kullanarak, klinik örnekler 35 yaşına kadar korunmuş miRNAs NGS cDNA kitaplıkları hazırlanması optimize edilmiştir. Ayrıca, klinik olarak sınıflandırılmış duktal Karsinom situ kitaplıklardan cDNA (DCIS) örnekler nerede hazırladığımız son yayınlanan bir çalışmada, belirtilen kantitatif PCR tarafından doğrulanmış differentially ifade miRNAs tespit belirli miRNA ifade değiştiğine DCIS lezyonlar DCIS lezyonlar için meme kanseri geliştirmek mi hastalar karşılaştırıldığında meme kanseri hastaların tespit olabilir.
Küçük RNA cDNA kütüphaneler hazırlanması için ticari kitleri, onların kesilmesi için potansiyel maliyetini, hem de göz önüne alındığında optimize değil telif hakkı/patent-korumalı reaktifler kullanımı, daha önce yayımlanmış uyum karar verdik Laboratuvar tabanlı ve kiti ücretsiz 3' barkodlu cDNA Kütüphanesi hazırlık iletişim kuralı için küçük RNA'lar FFPE örnek arşivlenen NGS 18 eş zamanlı analiz izin22örnekler. Bu iletişim kuralı FFPE RNA numuneler adaptasyon için kritik olan görsel ve teknik değerlendirme kontrol noktaları ile ideal ve sağlam bir adım adım yordam sağlar ve uygulama güvenliği aşılan veya zor diğer kaynakları için güçlü bir potansiyele sahiptir RNA malzeme kullanmak için. Özgün protokolün uygulanabilirliği ile floresan (örneğin, SYBR altın) radioactively etiketli boyutu işaretleri değiştirerek düzelmiştir büyük polyacrylamide jelleri ve birleştirilmiş arşivini seçimi sırasında kullanılan tespit RNA boyutu işaretleri. Ligasyonu 3' barkodlu bağdaştırıcılarının çoğu 18 bireysel FFPE RNA numuneler için en iyi duruma getirilmiş bu protokolü kullanır sonra 5' bağdaştırıcısı ligasyonu geçmesi birlikte havuza alınmış, ters-transkripsiyon ve bir pilot PCR analiz için uygun son cDNA amplifikasyon yüksek üretilen iş sequencer üzerinde kütüphane büyük ölçekli PCR güçlendirme, arıtma ve NGS önce.
1. tüm reaktifler ve astar hazırlanması
Tüm astar ve bağdaştırıcıları şekil 1' de açıklandığı gibi sipariş.
Kalibratör, her bireysel ligasyonu çivili kokteyl hisse senedi hazırlayın.
RNase free su ile 0.5 µM için taşıyıcı Oligonükleotid (şekil 1) resuspend. 100 µM 0.5 µM taşıyıcı Oligonükleotid çözümü kullanmak için 10 Kalibratör oligonucleotides (şekil 1) resuspend.
Her bir 100 µM kokteyl Kalibratör hisse senedi almak için 10 KALİBRATÖRLER siliconized bir microcentrifuge içinde 10 µL birleştirmek ve -20 ° C'de depolamak için 0,026 nM çözüm hazırlamak
20 benzersiz, liyofilize, adenylated 3' bağdaştırıcıları RNase free su 50 µM (şekil 1) son bir konsantrasyon ile sulandırmak.
Not: Bireysel silikonlu tüpler her bağdaştırıcısı üzerinden 2.5 µL aliquots hazırlamak ve-80 ° C'de 2 yıla kadar depolamak için önerilir.
Desalted 19 nt-3 resuspend' bağdaştırıcısı ve 24 nt-3' bağdaştırıcısı boyutu işaret oligonucleotides 250 ng/ml (şekil 1).
HPLC arıtılmış 5' bağdaştırıcısına 100 µM RNAse free su ile resuspend. Resuspend 5' ve 3' PCR astar 100 µM RNase free su (şekil 1) kullanarak.
Not: Aliquot 1-2 deneyler ve mağaza-80 ° C'de için gerekli miktarda tüm oligonucleotides
Boya %98,8 formamide % 1 birleştirerek yükleme (PAA) jel (v/v) 0, 5 M Na2H2 EDTA, pH 8.0 ve % 0.2 bromophenol mavi denaturing polyacrylamide hazırlamak ve 1 mL aliquots-80 ° C'de ayarla
0, 5 M Na2H2 EDTA çözüm için 50 mL su nükleaz ücretsiz 18.6 g Na2H2 EDTA tozu ekleyerek hazırlayın. PH 8.0 ulaşmak için NaOH Pelet ekleyin. 100 ml 0.5 M Na2H2 EDTA, pH 8.0 hisse senedi çözüm elde etmek için ses seviyesini.
Bromophenol bir ayrı 15 mL tüp içinde mavi 15 mg tartın. 600 µL nükleaz ücretsiz su ekleyin. De-iyonize formamide 14.25 mL ekleyin. 150 µL 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8.0 çözüm ekleyin.
Aliquot 1 mL aliquots-80 ° C'de 15 mL PAA nihai çözüm
5 özel jel boya % 0,2 bromophenol mavi, % 0,2 Ksilen cyanol FF, 50 mM Na2H2 EDTA, pH 8.0 ve % 20 birleştirerek yükleme x hazırlamak Ficoll türü-400.
Na2H21,86 g resuspend-EDTA nükleaz ücretsiz su bir 400 mL ölçek üzerinde bir manyetik karıştırıcı, oda sıcaklığında (RT) 50 ml. Bir pH 8.0 ulaşmak için NaOH Pelet ekleyin. 50 mM Na2H2 EDTA çözüm elde etmek için 100 mL ulaşmak için nükleaz ücretsiz su ekleyin.
Bromophenol mavi toz 20 mg, 20 mg Ksilen cyanol FF tozu ve Ficoll türü-400 tozu 2 g ağırlığında ve 5 mL 50 mM Na2H2 EDTA resuspend.
Üç içeren tüp boya ve 50 mM Na2H2 EDTA 5 mL ekleyin. 5 x agarose jel yükleme boya karıştırmak, 1 mL aliquots hazırlamak ve-80 ° C'de depolayın
2. 3' barkodlu Bağdaştırıcı d 18 bireysel RNA örnekleri ile ayarlayın
18 bireysel RNA numuneler tanımlamak (pre-bölünmemeli 100 ng nükleaz ücretsiz su 1,5 mL silikonlu microcentrifuge tüpler 9.5 µL) ve 10 dakikadır defrost buzda tüpler ayarla.
10 x RNA ligaz arabellek (ATP) olmadan taze hazırlayın.
1.5 mL silikonlu microcentrifuge tüp su RNase free 343 µL, Tris 1 M pH 7.5, 1 M MgCl2, 50 µL 20 mg/mL sığır serum albümin ve 14 M 2-mercaptoethanol 7 µL 100 µL 500 µL birleştirin. Mix 2 için santrifüj tüpü flicking tarafından 2.000 x g ve RT ve set üzerinde buz s.
Not: gösteren tüm merdiven içinde bu protokolü "santrifüj 2 s" benchtop microcentrifuge RT ve 2.000 x g hız çözümleri tüpler altına toplamak için gerçekleştirilir.
% 50 sulu DMSO hisse senedi RNase free 1 mL ekleyerek DMSO 1 ml 2 mL silikonlu microcentrifuge tüp su hazırlamak, tüp alüminyum folyo kaydırmak ve RT. mağaza
1.5 mL silikonlu microcentrifuge tüp içinde aşağıdaki sırada birleştirerek 0,026 nM Kalibratör kokteyl için 10 dk. hazırla ligasyonu Master Mix buzda defrost: 10 x RNA ligaz arabellek ve 120 µL % 50 sulu DMSO 200 mL pipet kullanarak 40 µL , ve 10 µL 0,026 nM Kalibratör 10 µL pipet kullanarak kokteyl ekleyin. Mix, 2 s ve küme santrifüj kapasitesi için 1,5 mL tüp fiske buz üzerinde.
Tüp ligasyonu Master Mix 8,5 µL her 18 ayrı ayrı bölünmemeli FFPE RNA örnekleri ekleyin, yavaşça tüpler santrifüj 2 s ve buz üzerinde mağaza için fiske.
18, 3' barkodlu bağdaştırıcıdan her biri üzerinden 2.5 µL aliquots defrost ve 20 dk için defrost için buz koyun.
3-µL pipet 1 µL olan her ağ bağdaştırıcısının RNA ve ligasyonu Master Mix (Yani, 9,5 µL + 8.5 µL) içeren ilgili FFPE RNA örnekleri aktarmak için kullanın.
Değil yukarı ve aşağı pipet, sadece sıvı içine dağıtmak ve ucu çıkar. İpuçları FFPE RNA örnekleri arasında değiştirmek için emin olun. Her tüpün kapatın, karıştırmak için fiske santrifüj 2 s ve set üzerinde buz.
Yanında duvar ilanı 18 tüpler için 1 dk 90 ° C'de ısı blokta tepkiler tabiatını ve hemen buza koyun.
Tüp ligasyonu enzim çözüm sulandrarak 10 µL kesilmiş K227Q T4 RNA ligaz 2 ile 10 µL RNase free, su taze 1,5 mL silikonlu microcentrifuge tüpüne hazırlayın.
1 µL seyreltilmiş ligasyonu enzim her 18 RNA örnekleri içine aktarmak için 3 µL pipet kullanın (yukarı ve aşağı pipet ve ipuçları her tüpün arasında değiştirmek). 18 d buza ayarla ve 4 ° C soğuk oda bir gecede kuluçka 18 h için yer.
3. ve birleştirilmiş küçük RNA'ların saflaştırılması
Tüp ligasyonu reaksiyonlar yanında duvar ilanı 18 tüpler için 1 dk 90 ° c ısı blokta devre dışı bırakıp soğumasını en az 2 min için buz dönün.
Yağış Master Mix mavi boya kovalent glikojen 5 M RNase-Alerjik NaCl 26 µL için taze silikonlu microcentrifuge tüpüne bağlı 1 µL ekleyerek hazırlayın.
Yağış Master Mix 1.2 µL her 18 tüpler içine aktarın. 63 µL % 100 etanol her 18 tüpler için ekleyin. Her tüpün kapatın, fiske mix, 2 s ve yer santrifüj kapasitesi için buz üzerine boruları. Tüm 18 tüpler içeriğini tek 1,5 silikonlu mL tüp içine birleştirme.
Tüp kapatın, mix, santrifüj için üç kez 2 s ve çökelti 60 dk için buz üzerinde yer için ters çevir.
Bir büyük (16 x 20 cm2) % 15 polyacrylamide jel sayfa için hazırlayın.
Döküm iki 0.1 cm boşluk ekleyiciler ile cam plakalar (silane kaplamalar için güvenli bir alternatif ile tedavi) silikonlu.
Sistem seyreltici, sistem konsantresi, sistem tampon 3 mL, APS (% 9) 240 µL ve TEMED 12 µL 50 mL tüp içinde 18 mL 9 mL birleştirin.
Sayfa jel çözüm 30 mL pipet kullanarak cam plakanın arasında transfer bir 14-iyi tarak (0.1 cm kalınlığında) eklemek ve RT kuvvetlendirmek için 30 dk jel izin.
16.000 x g ve 60 dk 4 ° C, havuza alınan d ile 1.5 mL tüp santrifüj kapasitesi.
Tarak kaldırın. Kuyuları bol RNase free su kuyuları içinde ulaşmak ve yukarıda bir lavabo (bir seferde bir de) dışarı un polimerli Akrilamid kuvvet ile 200 µL uç tarafında fışkırmak şişe kullanarak ile temizleyin. 15 ayarla % bir jel aparatı sayfa rezervuarlar Tris-Bor EDTA (TBE) çözüm x 0,5 ile doldurun ve jel 30 dk için 450 V önceden çalıştırın.
Havuza alınan d ile tüp santrifüj kurtarmak ve dikkatle RNA Pelet Makinası.
Süpernatant 1 mL pipet ucu ile kaldırmayı ancak bazı sıvı en altında bırakmak. Tüp eğilme ve 20 mL pipet kalan süpernatant Pelet dokunmadan kaldırmak için kullanın. Emme Pelet dokunmadan Pasteur pipet üstünde onun son 10 µL uç ile kullanarak tüp vakum.
RNA Pelet RNase free su 20 µL içinde tüp flicking tarafından resuspend. Eriyik-e doğru RNA resuspend, karıştırmak için fiske yükleme PAA jel 20 µL ekleyin, santrifüj 2 için RT, oturdu ve tüp için 1 dk 90 ºC ayarlamak ve sonra hemen buza koyun.
Her iki tarafta (Şekil 2) 2 boş wells bırakarak değiştir 0,5 x TBE jel cihazları taze 0.5 x TBE ve yük merdiveni, boyutu işaretleri ve jel, ortasına ve birleştirilmiş miRNAs.
Jel 450 V çalıştırmak (35 mA) 60 dk için 10 dakika soğumasını ve tekrar 520 V çalıştırmak run duraklatma (25 mA) başka bir 60 dk. %15 Uncast için cam plakanın birini kaldırarak sayfa.
Hafifçe cam plaka üzerinde oturan jel sprey floresan boya solüsyonu (10 µL) 25 ml 0.5 x TBE ve izin ile oturmak karanlıkta 5 min için düz.
Cam üzerinde mavi bir ışık transilluminator jel yatırın ve her iki 19 hizalamak nt ve 24 nt boyutu işaretleri ve birleştirilmiş küçük RNA'lar (Şekil 2) eksizyon yönlendirmek için bir cetvel ile. Jel tüketim.
Eksize jel jel dilimleri, güvenli bir şekilde 1.5 mL microcentrifuge silikonlu tüp içine yerleştirilmiş parçalara ayırması için tasarlanmış bir 0.5 mL tüp yerleştirin. 16.000 x g 3 dk RT. Resuspend az için de 300 µL 400 mm NaCl çözüm ile parçalanmış jel santrifüj kapasitesi, tüp kapatın ve parafin film ile kapatın.
Tüp ajitasyon 1.100 rpm'de thermomixer üzerinde bir gecede kuluçka (16-17 h) için bir 4 ° C soğuk odada ayarlayın.
4. 5' bağdaştırıcısının ligasyonu
Çözüm aktarmak ve parçalanmış jel 5 mikron filtre için bir 1,5 silikonlu mL tüp içinde oturan tüp, tutkal ile parafin film ve 2300 x g ve RT., 5 min için santrifüj kapasitesi
950 µL % 100 etanol süzülmüş ekleyin, tüp kapatın, ters çevir mix, 2 için santrifüj kapasitesi için s, parafin film ile tüp mühür ve buz 1 h için açık olarak ayarlayın.
% 12 sayfa jeli 3,3 adımda anlatıldığı gibi hazırlamak, ama seyreltici, 14.4 mL konsantre, arabellek 3 mL 12.6 mL, 240 µL APS ve TEMED 12 µL 50 mL tüp içine getirin. % 12 önceden çalıştırmak sayfa jel için 450 V de 30 dk (~ 35 mA) 0.5 içinde x TBE.
16.000 x g 4 ° C'de 60 dk için de saf küçük RNA çözüm santrifüj kapasitesi
Dikkatlice dışarı çözüm toplu kaldırmak ve Pelet dokunmadan kalan çözüm kaldırmak için 200 mL pipet kullanın 1 mL pipet kullanarak süpernatant pipet.
Pasteur pipet ile 10 mL uç tarafında bir vakum şişesi bağlı kullanarak, dikkatle Pelet dokunmadan kuru.
Pelet su RNase free 9 µL içinde yukarı ve aşağı pipetting olmadan resuspend ama hafifçe tüp flicking tarafından 2 s ve küme buz tüp için santrifüj kapasitesi.
10 x 1 M Tris pH 7.5 500 µL birleştirerek RNA ligaz arabellek (ATP ile) taze hazırlamak, 1 M MgCl2, 20 mg/ml 50 µL 100 µL acetylated BSA, 10 mm ATP, 2-mercaptoethanol 7 µL 200 µL 14 M ve su RNase free 143 µL.
Mix 10 x (ATP ile) RNA ligaz tampon tüp flicking tarafından ve santrifüj kapasitesi 2 için çözüm tüp alt toplamak için s.
Ekleme 2 µL 10 RNA ligaz önbellekle (ATP), x 5' bağdaştırıcısı ligasyonu kadar belirlediği 100 µM 5' bağdaştırıcısı ve 6 µL % 50 sulu DMSO 9 µL, 3' barkodlu küçük RNA çözümü için 1 µL.
Tüpü hafifçe karıştırın, 2 için santrifüj kapasitesi fiske belgili tanımlık eriyik, toplamak için s 1 dk 90 ° C'de ısı blokta ve en az 2 dakika buzda tüp yerleştirin.
T4 RNA ligaz 1 2 µL çözüm içine ekleyin (yukarı ve aşağı pipet değil), tüp, 2 s ve tüp içinde yüzen raf için 60 dk 37 ° C su banyosunda oturmak için santrifüj hafifçe vur.
Aynı anda, iki d 19 nt-3 arasında ayarlayın ' bağdaştırıcısı ve bağdaştırıcı 5' ve 24 nt-3 arasında iki d ' bağdaştırıcısı ve bağdaştırıcı 5'.
19nt-3 2 µL birleştirmek ' bağdaştırıcısı (250 ng/µL) veya 24 nt-3' adaptörü (250 ng/µL) ile: 5' bağdaştırıcısının (100 µM), 10 x RNA ligaz önbellekle (ATP), 2 µL 2 µL % 50 sulu DMSO, 6 µL RNase free su 6 µL ve T4 RNA ligaz 1 2 µL 1,5 mL silikonlu microcentrifuge tüp içinde.
Mix, 2 s ve küme santrifüj kapasitesi tüplere fiske tüpler 37 ° c 60 dk için.
20 µL PAA Denaturing arabelleği için tüm d Ekle (küçük RNA'ların, 19nt-3 ile 2 d saf ' bağdaştırıcısı ve 24nt-3 ile 2 d ' bağdaştırıcısı).
Tüpler, santrifüj 2 flicking tarafından Mix s, 1 dk. Transfer 90 ° C'de ısı blok üzerine boruları buz tüm tüplere kuluçkaya ve bir merdiven (PAA 20 µL ile merdiven 3 mL) hazırlamak.
Jel aparatı Pre-Run ile üst rezervuarı boş % 12 sayfa jel ve taze 0.5 x TBE çözüm (kuyu, uzun, ince ucu pipet ile boşalttı) kuyu seviyesinin altında ekleyin.
Bir ince pipet ucu ile örnekleri şekil 3' te açıklandığı gibi yükleyin.
Jel zirvesine bireysel wells doldurmak için kullanmak taze 0.5 x TBE.
Taze 0,5 eklemek x TBE için rezervuar wells ve Başlat % 12 Elektroforez yukarıda sayfa 450 V de 60 dk (~ 35 mA).
Çalıştır jel soğumasını 10 min için jeneratör kapalı geçiş yaparak duraklatın. Jeneratör yeniden başlatın ve 60 dk için jel 520 V çalıştırın (~ 25 mA).
Jeneratör durdurmak, bir lavabo yukarıda aparatı ters çevirme rezervuarlar boş ve % 12 uncast cam plakanın birini kaldırarak sayfa.
Cam düz jel ile oturup, floresan boyası 25 ml 0.5 10 µL ile jel sprey x TBE, üzerinde mavi bir ışık transilluminator jel ile cam 5 dk. göklere için karanlıkta kuluçkaya ve her iki 19 hizalamak nt ve her iki 24 nt boyutu işaretleri ile bir cetvel ve birleştirilmiş küçük RNA'lar (şekil 3) eksizyon yönlendirmek için.
Jel tüketim ve eksize jel parça 0.5 mL jel kırıcı tüp içine aktarın. Jel kırıcı tüp, set silikonlu 1.5 mL microcentrifuge tüp içine ve parafin film ile güvenli kapağı kapatın. Jel kırıcı tüpü çıkarması, 300 mm NaCl 300 µL ve 100 µM 3' PCR astar 1 µL 1,5 mL tüp içinde ezilmiş jel parçaları ekleyin.
Tüp (17-18 h) gecede ajitasyon bir thermomixer 4 ° C'de 1.100 RPM üzerinde filmde parafin ile soğuk bir odada kapatın.
5. ters transkripsiyon, 5 tane ' ve 3' barkodlu küçük RNA'lar saf
Al thermomixer ve filtre tüpünden 5 mikron filtre tüp ile çözüm arındırmak.
Kullanım çözüm 1.5 mL eklenen 5 µM filtre tüp üzerine aktarmak için 1 mL pipet RNase free toplama tüp silikonlu. 3 dak 2,300 x g ve RT. adlı için tüp santrifüj kapasitesi
Filtre tüp atmak ve 950 µL % 100 etanol süzülmüş solüsyon içeren 1.5 mL microcentrifuge toplama tüp ekleyin. Mix, 2 s ve 60 dk. RNA cips tüp 16.000 x g ve 1 h için 4 ° C, centrifuging tarafından çökelti buz üzerinde yer için santrifüj tüpü ters çevir.
RNA Pelet kuru.
Kapağı açın ve süpernatant biraz sıvı dibinde bırakarak bir 1-mL pipet ile dikkatli bir şekilde çıkarın.
20 µL pipet Pelet dokunmadan tüm geri kalan süpernatant kaldırmak için kullanın. Pelet karşı tarafta oturmak herhangi bir çözüm sağlamak için tüp eğ.
Pasteur pipet bir 10 mL filtresiz pipet ucuyla süpernatant Aspire edin ve bir vakum kullanma Pelet Makinası için kullanın.
RNA Pelet RNase free su 5.6 µL içinde resuspend.
15 dk. Set bir ters transkripsiyon tepki kadar buzda ters transkripsiyon reaktifler 5 x arabellek, 4.2 µL 10 x deoxynucleotide trifosfat (dNTPs) (her 2 mM) ve dithiothreitol (DTT) 1,5 µL 3 µL ekleyerek RNase free, 5.6 µL defrost resuspended Pelet.
Yavaşça tepki karıştırın ve 2 için santrifüj kapasitesi için tüp fiske s çözüm toplamak için. Tepki tam olarak 30 s ve doğrudan üzerine bir thermomixer 50 ° C'de sonra transfer için 90 ° C'de ısı blokta ayarlayın
Böylece sıcaklık eşitler tüp 2 min için thermomixer çıkarma. Ters transkripsiyon enzim 0,75 µL doğrudan çözüm, flick karışımı yavaşça ve tüp thermomixer 30 dk 50 ° c üzerinde hemen geriye ekleyin.
30 dakika sonra tüp ters transkripsiyon durdurmak 1 dk için 95 ° C ısı bloğunda aktarın. 95 µL RNase free su doğrudan ters transkripsiyon ekleyin, karıştırmak için tüp fiske ve 2 min için buz üzerinde doğrudan ayarlayın.
CDNA kağıt kitaplığı ve Kütüphane kimliği ile tüp etiket
6. pilot PCR ve büyük ölçekli PCR güçlendirme
Hazırlamak taze 10 x PCR tampon RNase free su ekleyerek 304 µL tarafından 2 m KCl, 1 M Tris pH 8.0, 50 µL 125 µL 10 µL 1 M MgCl2, 1 M 2-mercaptoethanol silikonlu microcentrifuge tüp içinde % 1 Triton X-100 ve 6 µL 5 µL ve RT. tutmak
67 µL RNase ücretsiz su, 10 µL PCR tampon, 10 x dNTPs, 100 µM 5' PCR astar, 0.5 µL 100 µM 3' PCR astar, cDNA kağıt kitaplığı 10 µL 0.5 µL 10 µL x 10 ve 50 2 µL birleştirerek Pilot PCR reaksiyon araya x Taq polimeraz.
İki ayarla PCR bir thermocycler üzerinde aşağıdaki gibi döngüleri: dosya 45 için 1: 94 ° C s, 85 için 50 ° C s ve 72 ° C 60 s 10 döngüsü tutun 4 ° C'de; Dosya 2: 94 ° C 45 için s, 85 için 50 ° C s ve 72 ° C 60 s 2 döngüsü 4 ° C'de tutun Dosya 1 başlayın ve Pilot PCR reaksiyon thermocycler olarak ayarlayın.
Dosya sonuna 1, PCR tüp açın ve 20 µL pipet kullanarak, 5 x 3 µL içeren bir 1.5 mL microcentrifuge tüp içine Pilot PCR reaksiyon gelen transfer 12 µL boya yükleme jel, yukarı ve aşağı pipetting tarafından mix, tüp kapatın ve "10 devir" etiketleyin.
Pilot PCR tüp kapatın ve dosya 2 bir thermocycler başlatın. Dosya sonuna 2, PCR tüp açın ve çözüm 12 µL 3 µL 5 x jel yükleme boya ile 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarmak için bir 20 mL pipet kullanın ve "12 devir" etiketleyin.
6.2.2 ve PCR döngüsü 14, 16, 18 ve 20 sırasında Pilot PCR reaksiyon gelen 12 µL PCR ürün toplamak için 6.2.3 adımda açıklanan adımları yineleyin. 5 x jel yükleme boya 3 µL her 12 µL PCR aliquots ekleyin ve 20 nt merdiven merdiven 3 µL ve su RNase free 9 µL içeren.
0,5 ile % 2.5 özel jel hazırlamak x TBE.
Özel temiz bir ölçek 2.5 g tartmak ve 100 mL 0.5 ekleyin x TBE. Çözüm bir mikrodalga ısı kadar kaynar. Çözüm mikrodalga kaldırmak için özel karıştırmak, etidyum bromür (10 mg/mL) 4 μL ekleyin ve her iki ucunda bant ile kapalı bir 7 x 10 cm2 Elektroforez tepsi çözüm aktarmak için şişe girdap.
Bir 8-iyi tarak set ve RT. katılaşmış özel jel 0,5 ile dolu bir Elektroforez cihazı içine Transfer, kuvvetlendirmek özel jel x TBE.
Merdiven ve PCR örnekleri özel jel üzerinde yüklemek ve çalıştırmak için 30 dk 120 V.
En iyi PCR döngüsü (şekil 4A) tanımlamak için bir UV kutusunda jel değerlendirin.
Not: şekil 4B' beklenen PCR Grup boyutu gösterilir.
İki PCR grup her farklı Wells gözlemlemek (üst bant: DNA Kütüphane, alt grup: astar dimer).
CDNA amplifikasyon yeterli PCR çevriminde nerede cDNA Kütüphanesi görünür, ama astar dimer zar zor döngüsü seçerek tanımlamak gözlemlenebilir.
Not: Genel olarak, 12-16 döngüleri arasında yeterli PCR döngüsü seçilir. Şekil 4Aüzerinde bu kitaplık için yeterli PCR döngüsü 14 yaşında.
Büyük ölçekli PCR reaksiyonları (6 x 100 µL) kadar özel jel Kütüphane arıtma için ayarlayın.
10 adımda 6.1 takip PCR arabellek x taze bir tüp hazırlayın.
Büyük ölçekli PCR Master Mix bir 1,5 mL tüp 435.5 µL RNase Free su, 10 x PCR arabelleği, 65 µL 3.25 µL 5' PCR astar, 3.25 µL PCR astar 3' ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetting, 10 x dNTPs, 65 µL birleştirerek hazırlayın.
88 µL PCR Master Mix altı 0.5 mL PCR tüpler içine aktarın. CDNA kağıt kitaplığı (buz üzerinde depolanan) 10 µL aktarmak, 50 x Taq polimeraz 2 µL her 6 PCR tüpleri ekleyin ve pipet karıştırmak için.
Negatif bir PCR reaksiyon tüp RNase ücretsiz su, 10 x PCR arabelleği 10 µL, 10 x dNTPs 10 µL, 0.5 µL PCR astar 5', 0.5 µL PCR astar 3' ve 50 x Taq polimeraz ve pipet karıştırmak için 2 µL 77 µL birleştirerek hazırlayın.
PCR tüpleri 6.2.1 adımda açıklanan ve amplifikasyon döngüleri en uygun sayısını ayarlayın PCR döngüsü kullanılarak thermocycler yerleştirin. 0,5 kullanarak % 2.5 özel jel hazırlamak 6.3 adımda anlatıldığı gibi x TBE.
PCR güçlendirme sonra 9 µL 5 x jel yükleme boya 3 µL içeren altı 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine her PCR tüpünden transfer.
20 nt merdiven merdiven 3 mL su RNase free ve boya 1,5 mL tüp yükleme ekleme 3 µL jel 9 µL içine birleştirerek hazırlayın.
Yük merdiveni, negatif PCR kontrol ve özel jel üzerine 6 PCR ürünleri ve jel 30 dk 120 V çalıştırın.
PCR Arttırımlar yolları UV kutusunu (bir görüntü çekmek) arasında tekdüzelik doğrulayın.
3 PCR reaksiyonları iki 1,5 mL silikonlu microcentrifuge tube (3 x 91 µL) içine birleştirmek, 27 µL 5 M NaCl ve % 100 etanol 950 µL ekleyin. Mix ve -20 ° PCR ürünleri çökelti C gecede ayarlamak için tüpler tersine çevirin.
7. cDNA Kütüphanesi arıtma ve değerlendirme
16.000 x g 4 ° C'de 60 dk için de PCR reaksiyonları ile her iki tüpler santrifüj kapasitesi
1 mL pipet ile süpernatant kaldırmak sonra üst tarafında Pelet ve alt tarafında sıvı ile tüp eğilme ve bir vakum şişesi bir küvet ile bağlı bir Pasteur pipet kullanın ve 10 mL bahşiş Pasteur pipet sonundaki sıvı Aspire edin.
PmeI Özet kadar ayarla.
Bir PCR pellet 17,5 µL nükleaz ücretsiz su ile resuspend ve resuspended Pelet ikinci PCR Pelet aktarın. 10 arabellek x 2 µL ve PmeI enzim 0.5 µL ekleyin ve "denemeler" den 37 ° C'de 2 h için bir su banyosunda ayarlayın
0,5 kullanarak % 2.5 özel jel hazırlamak x TBE (adım 6.3). 5 x jel yükleme boya 6 µL sindirmek için ekleyin. Her Özet 13 µL özel jel iki bitişik kuyu aktarmak, 20 nt boyutu merdiven son Wells yükleyin ve jel (şekil 4 d) 150 V 90 dk için çalıştırın.
Jel UV kutusundaki üst PCR grup tüketim, jel adet taze ağırlığını 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarmak ve jel parçaları bir ölçekte tartmak.
Üreticinin yönergelerini izleyerek bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak eksize PCR güçlendirilmiş cDNA Kütüphanesi arındırmak. Bir DNA miktar tahlil ve enstrüman, üreticinin yönergeleri kullanarak cDNA Kütüphanesi ölçmek.
Boyutu ve saflık bir Bioanalyzer (şekil 5) bir yüksek-duyarlı DNA çip ile cDNA Kütüphanesi değerlendirin. Sıra bir yüksek üretilen iş sistemi kullanarak cDNA Kütüphanesi. FASTQ veri dosyası RNAworld boru hattı için bağdaştırıcı kesme ve miRNA serileri tanımlamak için insan genomu dizilimi aktarın.
Yönteminde burada, toplam 18 bireysel FFPE RNA örneklerinin açıklandığı gibi (100 ng her) ayrı tüplerde 3' adenylated barkodlu Oligonükleotid T4 ligasyonu gecede geçmesi ayarlanır. Ertesi gün, enzimatik reaksiyonları ısı devre dışı, kombine ve tek bir tüp çöktürülmüş. RNA Pelet resuspended ve bir polyacrylamide nerede sayfa jel bitişik wells göç RNA Oligonükleotid boyutu işaretleri uygun ölçekli 3' barkodlu seçmek için kullanılır jel (sayfa), denaturing % 15 üzerinde ve birleştirilmiş RNA molekülleri ayrılır küçük RNA'lar (Şekil 2). Eksize jel parça ve birleştirilmiş RNA molekülleri elute için bir NaCl çözümde gecede inkübe. Ertesi gün, eluted RNA çöktürülmüş ve bir 5' bağdaştırıcısı ligasyonu gerçekleştirilir. Daha sonra 5' bakmaksızın bağdaştırıcısı küçük RNA molekülleri göç ve burada tekrar geçirilen RNA boyutu işaret oligonucleotides küçük RNA'ların boyutu eksizyon 3' barkodlu oligonucleotides ve 5' bağdaştırıcısı ( içeren izin bir % 12 Akrilamid jel üzerinde ayrılmış Şekil 3). Eksize jel gecede elüsyon RNA'ın izin vermek için bir NaCl çözümde inkübe. Ertesi gün, ve birleştirilmiş küçük RNA molekülleri çöktürülmüş ve Pelet RNase free su ters-transkripsiyon tarafından takip resuspended; bir aliquot cDNA moleküllerin bir pilot PCR reaksiyon (şekil 4A) geçer. Büyük ölçekli PCR reaksiyonları cDNA kütüphanelerin aynı giriş'i kullanarak ayarlanır ve tüm tepkileri yeterince güçlendirilmiş PCR (4B rakam), havuzu önce ve gece etanol yağış olduğunu doğrulamak için % 2.5 özel jel üzerinde değerlendirilir. Ertesi gün, benzersiz 18 FFPE RNA numuneler için tüm 18 bireysel kütüphaneleri içeren güçlendirilmiş cDNA Kütüphanesi % 2.5 özel jel ve üst PCR grup, (şekil 4 c) nt varlığına ve saf 100'de çalışan geçirilir. CDNA Kütüphanesi arıtma sonra saf PCR ürün astar dimer aşırı veya diğer yan PCR reaksiyon içermiyor belirlemek için bir yüksek hassasiyet DNA çip üzerinde (şekil 5) değerlendirilir. PCR ürünü sonra bir yüksek-den geçerek sıralama sistemi analiz edilir. Bağdaştırıcı kesme ve 18 tek tek dosyaları nesil her 18 örneklerin RNAworld boru hattı kullanılarak gerçekleştirilir (erişim sağlanan bize Dr. Thomas Tuschl tarafından). Biostatistical analizleri sonra FFPE RNA numuneler miRNA içeriğini değerlendirmek için gerçekleştirilir.
Bunu doğrulamak için yordamı, taze eşleşen en iyi duruma getirilmiş donmuş ve FFPE meme tümör numune analizleri (şekil 6) için kullanılmıştır. İki benzer invaziv duktal meme Karsinomu (IDC) tümör yordamı duyarlılığını değerlendirmek ve miRNA ifade farklılıklar arasında iki taze donmuş doku tespit de içinde tespit edilemedi eşleşen arşivlenmiş FFPE belirlemek için seçildi RNA örnekler. Bu deneme için eşleşen iki FFPE RNA örnekleri ve 2 taze donmuş elde RNA yapıldı Toplam kalitesini (şekil 6A) değerlendirildi. Olarak beklenen, RNA boyutunu ve kalitesini FFPE örneklerin ciddi azalma (1 ve 3 şerit ve yolları 2 ve 4 karşılaştırmak) eşleşen taze donmuş RNA'ların için karşılaştırıldığında. Taze donmuş meslektaşları-80 ° C'de saklanan vardı iken diğer RT 8 yıldır (IBC2), arşivlenmiş ve bir FFPE RNA'ın 4 yıldır (invaziv meme kanseri 1, (IBC1)) RT arşivlenmiş Dört bireysel RNA numuneler tek bir Kitaplığı'nda, 4 bireysel barkod ve araziler şekil 6Bgörüntülenir dağıtım okumak miRNA kullanarak analiz edildi. İki üst panel iki taze donmuş tümör RNA'ların ve belirli FFPE RNA numune karşılıkları arasında miRNA ifade ilişki görüntüler. Araziler arasında eşleşen taze donmuş ve FFPE miRNAs göstermek farklı şekilde işlenmiş örnekler (dondurulmuş FFPE) tespit miRNAs arasında yüksek bir korelasyon gözlemlediği gibi iyi bir tekrarlanabilirlik cDNA Kütüphanesi hazırlık sağlar. MiRNA ifade veri iki farklı donmuş tümörler arasında iki farklı FFPE tümörler arasında korelasyon göstermek iki alt kapı aynası. Şekil 6Cbelirttiği gibi arasında iki taze donmuş tümör tespit miRNA ifade farklılıkları tespit iki eşleşen FFPE tümör örnekler arasında farklılıklar ile korelasyon. Önemi miRNA ifade farklılıklar tespit vardı hem de taze donmuş ve FFPE tümörler.
Daha fazla bu yaklaşım duyarlılığını değerlendirmek için 12 arşivlenmiş FFPE numuneler ve 4 taze donmuş RNA numuneler miRNA ifade veri kullanılmıştır (şekil 6D). 16 farklı RNA numuneler tek tek 3' barkodlu ve bir tek cDNA Kütüphanesi hazırlanması için kullanılan diğer şeyler. Bu kütüphane dahil iki meme hücre hatlarında, MCF10A kullanılan RNA örnekleri (normal benzeri hücre satır) ve MCF7 (meme kanseri hücre kültürünü) taze donmuş RNA taze hücrelerden ve eşleşen onların arşivlenmiş FFPE meslektaşları23, ve FFPE RNA örnekleri iki meme kanserinden örnekleri (IBC1 ve IBC2 şekil 6A ve 6B) bağımsız olarak analiz ve taze donmuş eşleşen ve FFPE RNA normal servikal örnekleri (Cx) örnekleri. Ayrıca, normal (normal Br1, normal Br2 ve normal Br3) ve kanser meme dokuları (IBC 5, IBC 6 ve IBC 7) taze donmuş karşılıkları olmadan arşivlenen FFPE numuneler analiz edildi. Taze ne olursa olsun heatmap Tarih gibi dondurulmuş veya FFPE RNA kökenli, birlikte kümelenmiş miRNA ifade profilleri aynı hücreleri (MCF10 veya MCF7) veya aynı doku (IBC1, IBC2 veya Cx). Buna ek olarak, soldan sağa, denetimsiz kümede belirtildiği gibi normal meme hücreleri ve dokuların birlikte meme tümörleri ve tümör hücreleri kümelenmiş sağ tarafta kümelenmiş. Farklı miRNA ifade profil görüntülenen, servikal doku heatmap sağ tarafta kümelenmiş.
Klinik olarak arşivlenmiş FFPE örneklerin çoğu taze donmuş karşılıkları yok ama onlar farklı depolama süresi bittikten sonra alınabilmesi için göz önüne alındığında, bu en iyi duruma getirilmiş cDNA Kütüphanesi hazırlık iletişim kuralı uygulanabilir olup olmadığını belirlemek için aranan ve giderek daha büyük FFPE numuneler ile yeniden oluşturulabilir. Şekil 7, arşivlenmiş 18, 20, 22, 27, FFPE doku miRNA ifade profillerden gösterildiği şekliyle 30 ve 35 yıl elde edilmiştir. RNA en iyi duruma getirilmiş eşzamanlı RNA/DNA yordamı21kullanarak ayıklandı ve dördüz RNA aliquots her bireysel FFPE örnekten kurumlara aynı gün ve-80 ° C'de kitaplık hazırlıkları öncesinde depolanan. Toplam 9 farklı FFPE örneklerin içinde yinelenen, nerede her bireysel RNA aliquot ile aynı kitaplık içindeki farklı barkodlu oligonucleotides (18 barkodlar toplam), tane analiz. Bu deney sırasında iki ayrı hafta (hafta 1 ve 2. hafta) tekrarlandı. Bu cDNA Kütüphanesi hazırlık tekrarlanabilirlik değerlendirilmesi tek bir kitaplık içinde ve bir hafta aralığı ile iki farklı kitaplıklar arasında iki farklı barkod kullanarak aynı RNA numuneler ile izin verdi. Şekil 7tarihinde gözlemlediği gibi korelasyon katsayısı 0,96 numune veya kütüphane hazırlık haftanın yaşı ne olursa olsun yukarıda kaldı; Bu nedenle, en iyi duruma getirilmiş cDNA Kütüphanesi hazırlık Protokolü arşivleme zaman ne olursa olsun FFPE örneklerin tekrarlanabilir analiz için güçlü bir araç sağlar, örneğin, yüksek tekrarlanabilir önlemler (meme #9 bakınız) 35 yaşındaki arşivlenmiş FFPE RNA görüntülenen eşdeğer bu 20 yaşındaki FFPE RNA örnekleri (meme #3 bakınız) kaydetti.
Şekil 1: Oligonucleotides. Tüm Oligonükleotid dizileri, karşılık gelen kimyasal değişimleri ve bu protokol için kullanılan konsantrasyonları anlatılmıştır. Kimyasal değişimleri türleri değişiklik kutusu ve Oligonükleotid serilerinde görüntülenen kısaltılmış değişiklikleri açıklanmıştır. Kokteyl Kalibratör hangi taşıyıcı Oligonükleotid (0.5 µM) içeren bir çözüm resuspended 10 bireysel RNA Oligonükleotid Kalibratörler, listesini görüntüler. On sekiz 3' barkodlu Oligonükleotid bağdaştırıcıları ile gri gölgelendirme barkod'ın sıra üzerinde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. RNA dizisinin 5' bağdaştırıcısının ve 3' PCR ve 5' PCR astar DNA dizileri ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Yani Protokolü 19 nt-3 olarak başvurulan iki boyutu işaret oligonucleotides RNA dizisi ' bağdaştırıcısı ve 24 nt-3' bağdaştırıcısı boyutu işaretleri, sağlanır. Tüm DNA ve RNA oligonucleotides ticari olarak satın alındı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: 3' barkodlu RNA örnekleri sayfa arıtma. (Bkz: iyi 8) havuz ve 18 barkodlu RNA örnekleri, resuspended RNA Pelet geçirilir ve Elektroforez % 15 Akrilamid üzerinde ayrılmış presipite jel sonra. Kırmızı kare bir neşter bıçakla varlığına ve silikonlu microcentrifuge nükleaz ücretsiz tüp içine transfer 3' barkodlu mikroRNA, içeren alan vurgulamaktadır. Toplam 19 nt-3 içeren iki ile dört Wells ' bağdaştırıcısı ve iki 24 nt-3 içeren ' bağdaştırıcı kitaplık her tarafında de uzak kuruldu (bkz: Kuyu yapımı 5, 6 ve 10, 11, sırasıyla). T4 RNA ligaz 1 ve arıtma ve birleştirilmiş boyutu için bir test olarak işaretleri olmak tamamlandı ertesi gün, tüp ligasyonu reaksiyonlar 19 nt-3 içeren ' bağdaştırıcısı boyutu işaretçisiyle 5' bağdaştırıcısı ve 24 nt 3' 5' bağdaştırıcısı bağdaştırıcı boyutu işaretçisiyle wells 2 çalıştırmak bir d 3, anılan sıraya göre. Sarı kareler ve birleştirilmiş boyutu marker RNA oligonucleotides 5' adaptörü ile temsil eden eksize bantları görüntüler. Bu bantların saf, çöktürülmüş ve sırasında sayfa arıtma % 12'si üzerinde çalıştırmak ( şekil 3 aşağı bakın). Kuyu 1 ve 13 ve birleştirilmiş ürünler beklenen boyutları onaylamak yardımcı oldu 20 nt boyutu merdiveni içerir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: saf Kütüphane sayfa arıtma ligasyonu 5' bağdaştırıcısının sonra. Arıtılmış RNA Kütüphane 5' bağdaştırıcısıyla bakmaksızın ve beklenen ürün boyutu 12'den % güvenliğe (bkz: kırmızı kare) ve birleştirilmiş boyutu işaretçileri kullanarak sayfa. T4 RNA d 19 nt-3 arasında ürünlerin ' bağdaştırıcısı ve 5' bağdaştırıcısı (kuyu 4 ve 9) ve 24 nt-3 arasında ' bağdaştırıcısı ve 5' bağdaştırıcısı (kuyu 5 ve 10) de RNA kitaplığı içeren her iki tarafında paralel olarak çalıştırmak. En yüksek grup (beyaz yıldız görmek) 5' bağdaştırıcısı ligasyonu ürünüdür ve kılavuz olarak 5' içeren jel bant kesme için kullanılan bağdaştırıcı RNA Kütüphane bakmaksızın. Önceki sayfada saf ligasyonu beden işareti ligasyonu ürünler iyi 3'te çalışır. Kuyu 1 ile 12 gözlemlediği gibi 20 nt boyutu merdiveni de RNA Kütüphane beklenen boyutu doğrulamak için çalıştırıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Pilot PCR ve cDNA Kütüphanesi büyük ölçekli amplifikasyon. PCR ürünlerinin oranı ve boyutu arasında etidyum bromür varlığında % 2.5 özel jel olarak değerlendirildi. (Barkodlu RNA Kütüphane, bir aliquot cDNA Kütüphanesi, ters transkripsiyon tek bir pilot PCR reaksiyon 5' ve 3' PCR primerler kullanılarak güçlendirilmiş sonraA). Aliquots pilot PCR reaksiyonları, 10, 12, 14, 16, 18 ve 20 döngüsü sırasında elde edilen ve üzerinde % 2.5 özel jel göç. Kuyu 1 ile 7 arasında gözlemlediği gibi cDNA Kütüphanesi ve bağdaştırıcı dimer varlığı katlanarak gözlemlenebilir (yeşil dikdörtgen bakın). Bu kitaplığın cDNA Kütüphanesi amplifikasyon için seçili PCR döngüsü 15 yaşındaydım. (B) bu şematik farklı oligonucleotides ve üzerinde sayfa ve özel jelleri tanımlanabilen ortaya çıkan RNA ve DNA ürünler, uzunluğunu ve konumunu görüntüler. (C) Aliquots 6 büyük ölçekli PCR reaksiyonları ( Atanımlanır), ayrı ayrı bir % 2.5 özel analiz (bkz: wells 3-8) jel. PCR ürünleri iki tür, yani kütüphane (üst grup) ve astar dimer (alt grup) bu jel (bkz: yeşil dikdörtgenler) görülebilir. Boş PCR reaksiyon cDNA olmadan hiçbir PCR güçlendirme görüntüler (iyi 2 bakınız). 20 nt boyutu merdiven (bkz: iyi 1) ürün boyutları doğrulanmasına izin verir. (D) jel yansımasında % 2.5 özel bir mavi ışık transilluminator jel havuza alınan PCR reaksiyonları içeren iki bitişik wells koştu. Her iki kuyu en yüksek grupta gözlemlediği gibi içinde beklenen Kütüphane boyutu ve bağdaştırıcı dimer grubu altında bulunur. Üst PCR bantları çıkardım ve jel ekstraksiyon kiti ile saf. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: arıtılmış PCR değerlendirilmesi güçlendirilmiş DNA kitaplık. PCR güçlendirilmiş cDNA Kütüphanesi Küçük aliquot (1 µL) yüksek hassasiyet DNA çip havacilik tabanlı bir platform üzerinde kullanarak analiz edilir. (A) bu panel boyutu işaretçileri araç kalibrasyonu için geçiş görüntüler. (B) bu panel arıtılmış PCR güçlendirilmiş cDNA Kütüphanesi göç görüntüler. En yüksek tepe 100 boyutunda ölçülür bp (yıldız işareti görmek) ve cDNA Kütüphanesi temsil eder. 72 değerlendirilen küçük tepe bp tarafından araç astar bağdaştırıcısı dimer temsil eder. 100 bp en yüksek 18 bireysel barkodlu RNA numuneler için sonraki NGS yüksek üretilen iş sıralama sistemi içeren güçlendirilmiş cDNA Kütüphanesi için tahmini boyutu dayalı havacilik platformu ortaya tarafından algıladı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: cDNA Kütüphanesi hazırlık ve yeni nesil sıralama kullanarak eşleşen taze donmuş ve formalin sabit parafin katıştırılmış örneklerden. (A)toplam RNA çıkarılan eşleşen gelen taze donmuş ve FFPE invaziv duktal Karsinom (IDC) tümör havacilik tabanlı platform üzerinde toplam RNA yonga üzerinde analiz edilebilir. (B) toplam RNA üzerinden eşleşen taze donmuş ve FFPE örnekler (IBC 1 ve IBC2) yapıldı cDNA Kütüphanesi hazırlık Protokolü ve miRNA sıralama veri çizildi. (C) IBC1/IBC2 örneklerin arasında korelasyon DifferentialmiRNA ifade arasında donmuş ve FFPE örnekleri eşleştirilmiş. miRNA ifade günlük sayısında görüntülenen milyon (CPM), yüksek düşük okur (kırmızı, mavi renk). MiRNA, başına iki doku çift arasındaki ifade fark önemini gri daireler tarafından taze ve FFPE örnekleri'da belirtilen yüksek ve düşük ifade miRNAs birlikte görüntülenir. (D) toplam RNA eşleşen taze ve meme hücre hatları (MCF10A ve MCF7), insan invaziv meme kanseri (IBC 1 ve IBC2), servikal doku (Cx), örnekleri FFPE RNA çıkarılan arşivlenmiş normal meme dokuları (normal Br1, normal Br2 ve normal Br 3) ve Arşivlenmiş invaziv meme kanseri (IBC 5, IBC 6 ve IBC7) aynı çalışması içinde cDNA Kütüphanesi hazırlık yapıldı. Kitaplıklarda tespit miRNAs NGS veri bir ısı haritası yapılandırmada görüntülenir. Bu rakam Loudig ve ark. değiştirildi 20 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: cDNA Kütüphanesi hazırlık ve miRNA ifade ilişki arasında büyük kullanarak çoğaltır arşivlenmiş FFPE numuneler. Toplam RNA 18, 20, 22, 27, 30 ve 35 yaşındaki arşivlenmiş FFPE meme dokusu numuneler bizim en iyi duruma getirilmiş cDNA Kütüphanesi hazırlık Protokolü uygulandı. 9 farklı FFPE numuneler Çoğalt RNA örnekleri ile farklı 3' barkodlu oligonucleotides bakmaksızın ve aynı kitaplıkta hafta 1 (w1) analiz edildi. Aynı deneyi (2. hafta ve w2) içinde bir bir hafta aralığı tekrarlandı. Tekrarlanabilirlik önlemler aynı arşivlenmiş RNA örnekler arasında yinelenen miRNA ifade veri heatmaps ve 0.93 ve 0,99 arasında korelasyon katsayıları ile görüntülenir. Bu rakam Loudig ve ark. değiştirildi 20 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Küçük RNA'lar FFPE RNA örnek arşivlenen NGS için son derece tekrarlanabilir ve sağlam cDNA Kütüphanesi hazırlık Protokolü Hafner vd tarafından açıklanan yordamı değiştirilmiş ve en iyi duruma getirilmiş sürümüdür bu protokol sunulmuştur 22
Bu iletişim kuralının tüm adımları FFPE numuneler kurtarılan eski arşivlenmiş ve güvenliği aşılan toplam RNA ile kullanım için optimize edilmiştir. Bu protokol, FFPE RNA, az miktarda işlemek için önemli bir adım tüm RNA örnekleri (Yani, 18 bireysel 100 ng FFPE RNA örnek) havuzu oluşturma 18 benzersiz 3' barkodlu bağdaştırıcıları ile bireysel d sonra yer alır. Bu kritik adımı düzgün tüm sonraki biyokimyasal ve enzimatik gereken adımları küçük RNA cDNA Kütüphanesi hazırlanması için geçmesi 18 FFPE RNA örnekleri sağlar. Ayrıca, bu adımı ihtimali geçiren RNA miktarını en üst düzeye çıkarır ve jel purifications küçük RNA molekülleri taşıyıcı etkisini arttırmak ve kolaylaştırılması gözlem cips ve seçimleri jel. Başka bir önemli özelliği bu protokol, daha az miktarda FFPE RNA ile çalışırken çok yönlülüğünü vurgular, pilot PCR reaksiyon cDNA Kütüphanesi en uygun amplifikasyon döngüsünü tanımlamak için kullanılır. Bu adımı da Kütüphane amplifikasyon zaman büyük ölçekli PCR reaksiyon hazırlama ve özel küçük RNA kitaplığı arındırıcı jel kritik olan astar dimer amplifikasyon karşı dinamikleri ilgili bilgiler sağlar. Bu iletişim kuralı için eklenen veriler arasında bu yaklaşımın tekrarlanabilirlik donmuş eşleşen ve FFPE numuneler ve aynı zamanda onun uygulanabilirliği büyük FFPE RNA numune örnekleri vurgulamak için 35 yaşına kadar arşivlenmiş gösterir.
Daha düşük kalite ve miktar kimyasal olarak değiştirilmiş ve uzlaşma FFPE RNA'ın yapılmış küçük RNA kütüphaneler hazırlanması için optimize edilmiştir böylece bu protokolü onun orijinal yorum--dan güncellenmiştir. Başarılı bir şekilde ligate ve FFPE örnekler üzerinden küçük RNA'ların yükseltmek için güncellenmiştir Bu yordamı, bir yönü ile ilgilidir Kalibratör kokteyl sırasında giriş için 0.026 için düşürüldü ilk 3' barkodlu bağdaştırıcısı ligasyonu, çivili miktarında nM önlemek için düşük bolluğu ligasyonu ile rekabet küçük RNA'ların FFPE RNA örnekleri mevcut. Özgün yordamı için bir başka önemli değişiklik tüm radioactively etiketli boyutu işaretleri ve birleştirilmiş küçük RNA'lar sayfa jeller üzerinde seçim sırasında kullanılan kaldırılması oldu. Bu radiolabeled boyutu işaretleri kullanımı bu yaklaşım uygulanabilirliği radyo-izotoplar kullanımı ama jelleri RNA ürünlerde de EngellediBRÜKSEL gözlenmesi için Sertifikalı laboratuarlar için sadece sınırlı. Bunun yerine, bu en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralında, boyutu işaretleri Wells kitaplığı sayfa jel'na bitişik çalıştırmak ve eksizyon ve birleştirilmiş küçük RNA'ların yönlendirmek için doğrudan bir floresan boya ile görüntülenir. Önemlisi, floresan boya Difüzyon RNA ürünleri önlemek için jel üzerinde hafifçe püskürtülür ve üzerinde mavi bir ışık kutusu görüntülenir. Daha sonra önlem ve eksize sayfa jel parçaları içinde yer alan ve birleştirilmiş küçük RNA'lar Difüzyon geliştirmek için bir tedbir olarak jel-kırıcı tüpler aynı şekilde kuluçka gecede 4 ° C'de ajitasyon altında bir NaCl çözümde önce jel ezmek için kullanılır. Tüm bu adımları dikkatlice daha küçük miktarda malzeme ile çalışmak için değerlendirildi.
Bu iletişim kuralı FFPE RNA örnekleri için farklı fazla zamanı için saklanan vardı farklı kaynaklardan (organ ve kurumların) uygulandı. Analizleri, taze ve donmuş örnekleri, gelen küçük RNA'ların sıralama ne zaman istimal bu yordamı optimize yüksek tekrarlanabilirlik saptandı. Ek değerlendirmeler kadar 35 yıldır, depolanan büyük arşivlenmiş FFPE örnekler kullanarak daha fazla protokolün geniş uygulanabilirliği için klinik örnekler gösterdi. FFPE örnekler en az FFPE RNA giriş gereksinimini 100 olduğu gösterilmiştir ng. Bu düşük gereksinim uygulanabilirliği bu protokol lezyonlar farklı boyut ve kullanılabilirlik çeşitli sağlar, ancak bu tek hücreli FFPE RNA analizi izin vermez. Unutmamak gerekir, ancak, bu iletişim kuralı optimize da exosomes 1'den girişleri ile dolaşan çıkarılan toplam RNA ile kullanılmıştır ng ve son derece tekrarlanabilir küçük RNA ifade profilleri (veri gösterilmez) sağlamak için gösterilir. Bu düşük giriş FFPE örneklerinde, küçük RNA'ların her ne kadar orijinal taze doku temsilcisi exosomes dolaşan mevcut toplam RNA düşük fazla oranlarda olduğunu göstermektedir.
Nerede bu en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı klinik olarak sınıflandırılmış DCIS FFPE örnekler için uygulanan, son çalışmalarında miRNA ifade farklılıkları NGS cDNA Kütüphanesi tarafından tanımlanan kantitatif PCR tarafından onaylanmış bulundu. Bu eser DCIS lezyonlar arşivlenmiş dokuları farklı kurumlardan gelen büyük ölçekli retrospektif çalışmalar  kullanarak fizibilite gösterdi. Bu çalışmada farklı zamanlarda (aralıklarla birkaç haftalık), tekrarlanabilirlik ve testin duyarlılığı ödün vermeden gerçekleştirildiğinde bu cDNA Kütüphanesi hazırlık sağlamlık da altını çizdi.
Klinik olarak sınıflandırılmış arşivlenmiş FFPE numuneler büyük miktarı göz önüne alındığında, bu en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı büyük ölçekli retrospektif analizleri kitaplıklarda cDNA hazırlanması için ve miRNA biyolojik potansiyel tanımlanması için güçlü bir araç sağlar Kanser geliştirme21ile ilişkili.
Yazarlar bu el yazması sunulan verilerin bir bölümünü içeren bir yayını International Journal moleküler Bilimler içinde Loudig vd tarafından yayımlanan ifşa etmek isterdim 21.
Dr. Thomas Tuschl, RNA Moleküler Biyoloji Laboratuvarı başkanı, hem de üyeleri onun laboratuvar destekleri ve onun laboratuar ve RNAworld boru hattı erişim sağlayan geliştirilen teknoloji paylaşımı için teşekkür ederiz. Biz Ayrıca Dr. Markus Hafner onun Protokolü paylaşımı ve onun ilk yordamda kullanılan tüm biyokimyasal ve enzimatik adımları hakkında detaylı açıklama sağlamak için teşekkür ederiz.