A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection | Protocol (Translated to Turkish)
Canlı Görüntüleme ve Viral Enfeksiyon Quantification için Bir Luciferase-floresan Reporter Grip Virüsü
Grip A virüs enfeksiyonu bir fare modeliçalışmalarda…
Influenza A virüsleri (IAVs) yıllık salgınlara ve ara sıra salgınlara neden olan bulaşıcı solunum patojenleridir. Burada, yeni bir rekombinant luciferase ve floresan ifade iki muhabir IAV (BIRFLU) kullanarak vivo viral enfeksiyonları izlemek için bir protokol açıklar. Bu yaklaşım in vivo IAV çalışma için mükemmel bir araç ile araştırmacılar sağlar.
Influenza A virüsleri (IAVs) önemli sağlık ve ekonomik sonuçları ile ilişkili insan solunum hastalığı neden. Diğer virüslerde olduğu gibi, IAV'yi incelemek, virüs hücrelerinde ve/veya enfeksiyon hayvan modellerinde virüsün varlığını saptamak için zahmetli ikincil yaklaşımların kullanılmasını gerektirir. Bu sınırlama son zamanlarda kolayca izlenebilir floresan veya biyolüminesans (luciferase) muhabir proteinleri ifade rekombinant IAVs üretimi ile atlatılmış olmuştur. Ancak araştırmacılar, IAV genomunun yabancı dizileri de içeren kısıtlı kapasitesi nedeniyle floresan veya luciferase muhabiri genlerini seçmek zorunda kalmıştır. Bu sınırlamayı aşmak için, iav enfeksiyonlarını in vitro ve in vivo olarak kolayca takip etmek için hem floresan hem de luciferase muhabiri genini ifade eden bir rekombinant çoğaltma-yetkin bi-reporter IAV (BIRFLU) oluşturduk. Bu amaçla, influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) viral olmayan yapısal olmayan (NS) ve hemagglutinin (HA) viral segmentleri floresan Venüs ve biyolüminesans Nanoluc luciferase proteinlerini kodlamak için değiştirildi. Burada BirFLU'nun IAV enfeksiyonunun fare modelinde kullanımını ve in vivo görüntüleme sistemi kullanarak her iki muhabir genin invivo görüntüleme sistemini tespit insini anlatıyoruz. Özellikle, hem muhabirlerin ifadeleri ve viral çoğaltma arasında iyi bir korelasyon gözlemledik. Moleküler biyoloji, hayvan araştırmaları ve görüntüleme teknolojilerinde en ileri tekniklerin birleşimi, araştırmacılara virüs-konak etkileşimleri ve dinamikleri de dahil olmak üzere grip araştırmaları için bu aracı kullanma fırsatı sağlar. viral enfeksiyonlar. Daha da önemlisi, farklı viral segmentlerden iki yabancı genifade etmek için genetik olarak viral genomu değiştirmek için fizibilite için bu yaklaşımı kullanmak için fırsatlar açılır: (i) yeni IAV aşılarının geliştirilmesi, (ii) rekombinant IAVs üretimi diğer insan patojen enfeksiyonlarının tedavisinde aşı vektörleri olarak kullanılabilir.
Influenza A virüsü (IAV) Orthomyxoviridae ailesinin tek iplikçikli negatif-sense parçalı RNA virüsü1,2,3. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) 3-5 milyon yıllık grip vakaları ve grip dünya çapında4,5,6250.000 'den fazla ölüm tahmin ediyor. Özellikle grip karşı savunmasız gruplar yaşlılar dahil, bağışıklık bireyler, ve çocuklar7,8,9,10,11. Aşılar mevcut ve viral enfeksiyona karşı en yaygın ve etkili müdahale temsil rağmen, IAV hızla gelişmeye ve önceden varolan bağışıklık kaçmak yapabiliyor3,12,13, 14.000 , 15. 2009 yılında bir pandemik H1N1 suşu yeniden ortaya çıkması ve patojenik IAV ortaya çıkması dünya çapında insan halk sağlığı için sürekli tehdit yineler4,16.
Bir salgın veya pandemik sırasında, yeni izole edilen virüslerin patojenitesini ve geçirilme kabiliyetini hızla belirlemek çok önemlidir. Şu anda mevcut teknikleri virüs tespit etmek için zaman alıcı ve bazen bu analizlerin tamamlanmasını geciktirebilir zahmetli yaklaşımların kullanımını gerektirir17,18,19,20. Ayrıca, mevcut viral tahliller bir salgın durumunda gerekli olabilir, ölçeklendirmek zordur. Son olarak, fareler, kobaylar ve gelincikler gibi doğrulanmış hayvan enfeksiyonlarının kullanımı rutin olarak kullanılır ve grip enfeksiyonları, bağışıklık yanıtları ve yeni aşıların ve/veya antivirallerin etkinliğini incelemede hayati önem taşımaktadır. Ancak, bu modeller gerçek zamanlı olarak viral dinamikleri gözlemlemek için yetersizlik nedeniyle kısıtlayıcı; bu viral enfeksiyonların statik görüntüleme çalışmaları sınırlar21,22,23,24,25. Bu tahlillerde kullanılan hayvanlar da viral yükü belirlemek için ötenazi edilir, böylece bu çalışmaları tamamlamak için gerekli hayvan sayısını artırmak26. Tüm bu sınırlamaları aşmak için, birçok araştırmacı rekombinant çoğaltma-yetkin, muhabir ifade IAVs, hangi virolojik tahliller hızlandırılması ve gerçek zamanlı 26 içinde vivo viral yük ve yayma tespit yeteneğine sahip kullanımı güveniyor ,27,28,29,30,31,32,33,34,35 ,36,37,38,39,40,41. Daha da önemlisi, bu muhabir ifade IAVs hücre kültüründe vahşi tip (WT) IAVs benzer çoğaltmak edebiliyoruz ve enfeksiyon hayvan modellerinde33,42.
Floresan ve biyolüminesans proteinler, duyarlılıkları, stabilitesi ve kullanım kolaylığı nedeniyle araştırmacılar tarafından yaygın olarak kullanılan iki muhabir sistemdir. Buna ek olarak, floresan ve biyolüminesans protein algılama teknolojileri43,44,45,46,47,48 muazzam destek ve ilerleme var . Floresan proteinler ve luciferase onları kızdırma izin farklı özelliklere sahip, özellikle nasıl heyecanlı durumları oluşturulur ve nasıl yayılım tespit edilir farklı43,44,45, 46,47,48. Floresan proteinler ilk olarak enerjiyi emerek heyecanlanırlar, moleküller daha düşük bir enerji durumuna düştükçe daha sonra farklı bir dalga boyunda ışık olarak serbest bırakılır43. Öte yandan, biyolüminesans ışık üretmek için bir substrat, oksijen ve bazen ATP içeren bir kimyasal ekzotermik reaksiyon elde edilir45. Muhabir proteinlerin bu iki tür değişen özellikleri nedeniyle, bir ilgi çalışmaya bağlı olarak diğerinden daha belki daha avantajlı. Floresan proteinler yaygın hücresel lokalizasyon gözlemlemek için kullanılır iken28,41, onların in vivo sinyalleri yetersiz yoğunlukta ve genellikle canlı dokularda otofloresan tarafından gizlenmiş49. Bu nedenle, araştırmacılar canlı organizmalarda viral dinamikleri değerlendirmek için luciferases güveniyor, floresan proteinler ex vivo çalışmalar için tercih edilebilir rağmen50,51,52,53. Floresan proteinlerin aksine, luciferases in vivo çalışmalar için daha uygundur ve non-invaziv yaklaşımlar da uygulanabilir26,27,28,29,30 , 31.000 , 32.000 , 33.000 , 34.000 , 35.000 , 36.000 , 37.000 , 38.000 , 39,5 000 , 40,5 000 , 41.000 , 54- Sonuç olarak, çalışmanın türüne bağlı olarak, araştırmacılar, çalışmalarını işlevsellik ve hassasiyetlerin bir dengesine tabi tâyiçler olan floresan veya luciferase muhabiri protein in kullanımı arasında seçim yapmalıdırlar ve ciddi rekombinant muhabir virüslerin kullanışlılığını kısıtlar. Ayrıca, floresan veya luciferase sistemleri kullanan farklı muhabir genlerin ekspresyonu ile elde edilen verilerin yorumlanmasını tehlikeye atabilecek viral çoğaltma veya yayma arasındaki korelasyona ilişkin endişeler vardır. muhabir ifade IAVs.
Bu sınırlamayı, aynı viral genom55'te hem floresan hem de luciferase proteini kodlayan rekombinant çoğaltma yetkin bi-reporter IAV (BIRFLU) üreterek aştık ( Şekil1). Burada, NanoLuc luciferase (Nluc), küçük ve parlak biyolüminesans protein48, influenza A / Porto Riko/08/1934 H1N1 viral HA segmentinde hemagglutinin (HA) dizisinin yukarı yerleştirildi (PR8)24,33, 40,55,56,57. Buna ek olarak, Venüs, sık kullanılan monomerik floresan protein, non-yapısal (NS) viral segment32,33,36,41,55içine yerleştirildi . Birflu hem floresan hem de luciferase muhabiri genleri için kodlar bu yana, ya muhabir protein sinyali viral çoğaltma ve in vitro veya in vivo55yaymak belirlemek için okuma olarak kullanılabilir. BirFLU'nun nesil ve in vitro veya in vivo karakterizasyonu ile ilgili ek bilgiler son yayınımızda bulunabilir55. BIRFLU yeni bir floresan ve biyolüminesans bazlı mikronötralizasyon testi 55 ile antiviral ilaçların etkinliğiniveya nötralize antikorların etkinliğini test etmek için kullanılabilir. Ayrıca, BIRFLU da enfeksiyon bir fare modeli viral dinamikleri değerlendirmek için kullanılabilir55. Bu yazıda, BIRFLU55 in vitro karakterize prosedürleri ve nasıl in vivo veya Venüs ex vivo algılamak için in vivo lüminesans görüntüleme sistemleri kullanarak farelerde BIRFLU enfeksiyonu çalışma açıklanmıştır.
Moleküler biyoloji, hayvan araştırmaları ve görüntüleme teknolojilerinde en ileri tekniklerin birleşimi, araştırmacılara virüs-konak etkileşimleri, viral enfeksiyon dinamikleri dahil olmak üzere IAV araştırmaları için BIRFLU'yu kullanma fırsatı nı sunar; IAV enfeksiyonlarının terapötik tedavisi için yeni aşı yaklaşımlarının geliştirilmesi veya Diğer patojen enfeksiyonların tedavisinde aşı vektörü olarak IAV'nin potansiyel kullanımı.
Farelerle ilgili tüm protokoller, Rochester Üniversitesi Tıp ve Diş Hekimliği Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) tarafından onaylanmıştır. Hayvanlarda yapılan tüm deneyler, Ulusal Araştırma Konseyi58Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndaki tavsiyelere uyun. Rochester Üniversitesi Tıp ve Diş Hekimliği Fakültesi'ndeki Laboratuvar Hayvan Tıbbı tesislerinin Vivarium ve Bölümü, Laboratuvar Hayvan Bakımı (AALAC) Uluslararası Ve federal ve eyalet yasalarına ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) politikasına uymak. Farelerle çalışırken uygun Kişisel Koruma Ekipmanları (PPE) gereklidir. Her kurumda bu makalede özetlenen deneyler icra edilirken benzer politikalar ve gereksinimler uygulanmalıdır.
1. Küçük Omurgalı Hayvanların Kullanımı
Beş ila yedi haftalık dişi BALB/c farelerini satın alın ve özel patojensiz koşullar altında hayvan bakım tesisinde muhafaza edin. Fareler belirlenen tesislere vardıklarında, hayvanların yeni ortamlarına uyum sağlaması için 4-5 gün dinlenme süresi bekleyin.
IACUC protokollerini izleyerek, kafes başına en fazla 5 fare yerleştirin.
NOT: Deney sonucunda, hayvanın öldüğünden emin olmak için, fareler ikincisinin fiziksel bir yöntem olması gerektiği göz önünde bulundurularak onaylanan iki prosedür kullanılarak ötenaziye tabi tutulmaktadır. Bu çalışmada, BIRFLU ve in vivo görüntüleme ile fare enfeksiyonu sonra, hayvanlar öldürücü bir doz ile ötenazi edilir 2,2,2-tribromoetanol (TBE), ve daha önce gösterdiğimiz gibi fiziksel ikincil yöntem olarak hepatik ven keserek23.
NOT: Bu yazıda, BIRFLU influenza A/ Porto Riko/08/34 H1N1 (PR8), ortak bir fare uyarlanmış laboratuvar IAV suşu23,32,33,56omurgasında oluşturuldu . Virüs daha önce açıklanan plazmid tabanlı ters genetik yaklaşımlar ve nesil tam bir açıklama kullanılarak oluşturuldu ve in vitro ve BIRFLU in vivo karakterizasyonu bizim son yayınbulunabilir 55. IAV enfeksiyonlarını içeren tüm işlemler (in vitro veya in vivo) biyolojik güvenlik kabininde biyogüvenlik düzeyi (BSL)-2 koşulları altında gerçekleştirildi.
DİkKAT: Uygun bir biyogüvenlik düzeyi biyogüvenlik risk değerlendirmesine uygun olarak belirlenmelidir. Biyogüvenlik risk değerlendirmelerinin yapılması ve etkili biyogüvenlik içeren bir alan oluşturulması na ilişkin ek bilgiler, deneylerin yapılacağı kuruma danışılmalıdır.
Biyogüvenlik dolaplarını tüm deneysel işlemlerden önce ve sonra %70 etanol veya klor dioksit dezenfektanile temizleyin. Fareler için, tüm diseksiyon malzemelerini (makas, diseksiyon forsepsi, vb.) ve dounce homogenizer'ı kullanımdan önce ve sonra sterilize edin.
Prosedürler sırasında üretilen tüm biyolojik materyalleri uygun IBC ve IACUC yönergeleri altında atın.
3. BirFLU'nun In Vitro Karakterizasyonu (Şekil 2)
NOT: Tüm arabellek ve ortam kompozisyonları için Tablo 1'e bakın.
Protein ekspresyonunu floresans (Şekil2A) ve dolaylı immünfloresans ile analiz edin (Şekil 2B)
Enfeksiyondan bir gün önce, madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epitel hücreleri (1 x 105 hücre/kuyu, triplicates) ile tohum 24-iyi plakalar doku kültürü medya ve% 5 CO2ile 37 ° C kuvöz plakaları korumak . Hem mock-enfekte hem de BIRFLU enfekte hücrelerde seçilen tüm antikorları değerlendirmek için yeterli kuyu hazırlayın.
NOT: Viral enfeksiyona başlamadan önce bir monolayer onaylamak için bir ışık mikroskop altında hücreleri görselleştirme öneririz. MdCK hücrelerinin enfeksiyon zamanına kadar %90 birleşmesi önerilir.
Enfeksiyon medyasında WT veya BIRFLU IV'lerin seyreltmelerini hazırlayın ve 0,25 mL/well enfeksiyon ortamının son hacminde hücre başına 0,1 plak oluşturan birim (PFU) çokluğu ile tohumlu MDCK hücrelerine bulaştırın.
Doku kültürü ortamını adım 3.1.1'den çıkarın ve MDCK hücrelerini 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkayın. 3.1.2'den MDCK hücrelerine virüs seyreltmelerini ekleyin ve plakaları viral adsorpsiyona izin vermek için oda sıcaklığında 1 saat boyunca sallanan bir platforma yerleştirin.
NOT: Sahte enfekte hücreler virüs yokluğunda sadece enfeksiyon media ile kuluçkaya yatırılır.
Viral adsorpsiyondan sonra (adım 3.1.3), aspirasyon ile viral inokülü çıkarın ve her kuyuya 1 μg/mL TPCK ile tedavi edilen tripsin içeren 1 mL enfeksiyon sonrası ortam ekleyin. 33 °C'de %5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 18 saat kuluçka hücreleri.
18 saat enfeksiyon dan sonra, 24-iyi plakalar (3.1.4) doku kültürü supernatant kaldırın. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 0,25 mL/kuyu fiksasyon/permeabilizasyon çözeltisi ile hücreleri sabitleyip permeabilize edin.
NOT: Formaldehit maruziyetini önlemek için fiksasyon/permeabilizasyon çözeltisini duman kaputunda hazırlayın.
Fiksasyon/permeabilizasyon çözümünün 3.1.5 adımından çıkarın, hücreleri 1x PBS ile iki kez yıkayın ve hücreleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca 0,25 mL/kuyuile katıştırın.
NOT: Bir sonraki adıma geçin veya hücreleri bir gecede 4 °C'de tıkama çözümünde depolayın.
Engelleme çözeltisini (adım 3.1.6) çıkarın ve Fare monoklonal antikorunun (MAb) IAV nükleoproteinine, NP'ye (HB-65) veya NLuc'a karşı 1:1.000'lik bir tavşan poliklonal antikorunun (pAb) seyreltilmesine karşı 0,25 mL/iyi (1 μg/mL) ekleyin (Malzeme Tablosunabakınız). her ikisi de antikor seyreltme çözeltisi (1x PBS, %2.5 BSA) seyreltilmiş ve hücreleri 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırır.
3.1.7 adımdan birincil antikor çıkarın, hücreleri 1x PBS ile üç kez yıkayın ve 0.25 mL/well ile inkübed texas kırmızı konjuge anti-fare veya anti-tavşan ikincil antikorlar (Malzemeler Tablosubakınız) antikor 1:200 seyreltilmiş seyreltme çözeltisi.
NOT: Hücre çekirdekleri aynı sekonder antikor çözeltisine 0.5 μg/mL 4',6'-diamidino-2-fenilindole (DAPI) eklenerek aynı anda elde edilebilir. Hücreleri karanlıkta 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın. Diğer floroforlarla konjuge diğer sekonder antikorlar kullanılabilir.
İkincil antikor ve DAPI'yi adım 3.1.8'den çıkarın, hücreleri 1x PBS ile üç kez yıkayın. Yıkadıktan sonra hücreleri 0,25 mL/kuyuda 1x PBS'de bırakın.
Venüs ve Nluc muhabiri ifadesini tespit etmek için plakayı floresan mikroskobun sahnesine, uygun floresan filtreleri kullanarak enfekte hücrelerden np'yi yerleştirin. Floresan mikroskobu (20x büyütme) kullanarak görüntüleri yakalayın ve bir görüntü düzenleme yazılımı (Şekil2A,B)kullanarak birleştirin.
Nluc aktivitesini(Şekil 2C)ve viral replikasyonu (Şekil2D)analiz edin.
Enfeksiyondan bir gün önce, MDCK hücrelerine sahip 12 kuyulu tabaklar (2 x 105hücre/kuyu, triplicates) 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde %5 CO2 ile doku kültürü ortamını kullanarak enfeksiyon zamanına kadar yaklaşık %90 biraraya gelir.
NOT: Enfeksiyondan önce, MDCK hücrelerinin monotabakasını doğrulamak için mikroskop altındaki hücreleri kontrol edin.
Enfeksiyon günü, 0,5 mL/kuyuda 0.001 PFU moi ile trilikite olarak MDCK hücrelerine (adım 3.2.1.) bulaşmasını sağlamak için enfeksiyon ortamlarında WT ve BIRFLU virüslerinin seyreltilmesini hazırlar. Doku kültürünü orta çıkarın ve 1x PBS ile iki kez MDCK hücreleri yıkayın.
MDCK monolayers virüs seyreltme ekleyin ve bir sallanan platformda 1 saat oda sıcaklığında viral adsorpsiyon sağlar. Viral adsorpsiyondan sonra, virüs inoculumunu çıkarın ve her kuyuya 1 μg/mL TPCK ile tedavi edilen tripsin içeren 1,5 mL enfeksiyon sonrası ortam ekleyin. Enfekte hücreleri 33 °C'de %5 CO2 nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın ve 3.2.4 adımda belirtilen zaman noktalarında süpernatants toplayın.
24, 48, 72 ve 96 h post enfeksiyon (p.i.) her kuyudan 150 μL doku kültürü supernatant toplamak ve Nluc tahlilleri ve viral titrasyonlar gerçekleştirmek için -80 °C'de bir mikrosantrifüj tüpü nde örnekleri saklayın.
Nluc etkinlik tayini gerçekleştirmek için üreticinin göstergelerini takip edin. İlk olarak, -80 °C 'de (adım 3.2.4) buz üzerinde depolanan doku kültürü supernatant çözülür.
NOT: Üreticinin önerilerine bakın ve gerekirse türetiyi optimize edin.
Luc substrat 1:50'yi seyreltme tamponuyla seyrelterek luciferase tsay çözeltisini (Bkz. MalzemelerTablosuna bakın) hazırlayın. Luciferase tahlilleri için beyaz düz alt 96-iyi mikroplaka, toplanan doku kültürü supernatant örnekleri 10 ila 25 μL ile luciferase tahlil çözeltisi 25 μL karıştırın. Bir luminometre (Şekil2C)kullanarak lüminesans ölçmeden önce karışımı 2-3 dakika kuluçkaya yatırın.
NOT: Doku kültürü supernatants enfeksiyöz viral parçacıkların varlığı floresan bağışıklık odaklama analizi tarafından belirlenir (Venüs) veya dolaylı immünfloresans (viral antijen boyama) daha önce açıklandığı gibi23,32, 33,56.
Viral titrasyonlardan bir gün önce, doku kültürü ortamları ile 96 kuyulu bir plakadaki (2 x 104 hücre/kuyu, üçleme) tohum MDCK hücreleri ve hücrelerin enfeksiyon zamanında %90 birleşmesine izin vererek %5 CO2ile 37 °C'de bir kuvözde yer alabilebiledir.
Buzüzerinde çözülmüş doku kültürü supernatant örneklerini kullanın (adım 3.2.4.). Yeni bir 96-iyi plaka kuyuların her birine enfeksiyon medya 90 μL ekleyin, sonra ilk kuyu (satır A) için çözülmüş doku kültürü supernatant (adım 3.2.4) 10 μL ekleyin. A satırından B satırına 10 μL'yi karıştırmak ve aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın.
NOT: Bu yordam son satıra (H) kadar tekrarlanmalıdır. Biz viral titrelerin doğru ölçmek için triplicates viral titrasyonlar gerçekleştirmenizi öneririz.
96 kuyuplakalarında (adım 3.2.7) MDCK hücrelerinden doku kültürü ortamını çıkarın ve 1x PBS ile iki kez yıkayın. MDCK hücreleri içeren 96 kuyulu plakadaki her kuyuya virüs seyreltmelerini (adım 3.2.8) içeren 96 kuyulu plakanın süpernatant seyreltmelerinin 50'sini ekleyin.
Viral adsorpsiyon sağlamak için oda sıcaklığında 1 saat için sallanan bir platform üzerinde 96-iyi plaka kuluçka. Viral adsorpsiyondan sonra inokülü çıkarın ve 1 μg/mL TPCK ile tedavi edilen tripsin içeren enfeksiyon sonrası ortama 100 μL/kuyu ekleyin. Enfekte hücreleri %5 CO2ile 33 °C'lik bir kuluçka makinesinde 12 saat kuluçkaya yatırın.
BIRFLU Venüs ifade yana, enfekte hücrelerin sayısı doğrudan bir floresan mikroskop kullanılarak sayılabilir. Alternatif olarak, viral titreler daha önce viral bir protein23,56,57,59karşı bir antikor kullanılarak açıklandığı gibi dolaylı immünoresans tarafından tespit edilebilir. İkincisi için, bölüm 4.4'te açıklandığı gibi anti-NP mAb HB-65 kullanarak hücreleri ve lekeyi düzeltmeye/permeabilize etmeye devam edin.
Formülü kullanarak floresan oluşturan birimlerin (FFU)/mL sayısını sayarak viral titreleri belirleyin: ((FFU sayısı) x 20 x 1/seyreltme (Şekil 2D).
4. BirFLU'nun Vivo Karakterizasyonunda (Şekil 3 ve Şekil 4)
NOT: Farelerin intranazal enfeksiyonu daha önce açıklandığı gibi yapıldı23. İnfeksiyon fare modelini kullanarak in vivo IAV enfeksiyonu daha ayrıntılı bir protokol için, önceki yayın23ile ilişkili video görüntülemenizi öneririz. Bu bölümde yalnızca BIRFLU ile fare bulaşması için gereken adımları özetler.
Sağlıklarını ve genel fiziksel görünümlerini değerlendirmek için fareleri inceleyin. 1x PBS'deki BIRFLU seyreltmesini, toplam 30 μL/fare hacminde 1 x 106 PFU ile fareleri aşılamaya hazırlayın. Fare aşısı olana kadar virüsü buzda koruyun.
NOT: Mock-infected (1x PBS) fareler görüntüleme için iç kontrol olarak gerekli olacaktır. Birflu-enfekte hayvanlardan farklı bir kafese sahte enfekte fareler yerleştirin.
Beş ila yedi haftalık dişi BALB/c fareleri intraperitoneal olarak 240-250 mg/kg tribromoetanol (TBE) ile anesteze ederek iğneyi karın sağ tarafının 2/3'üne sokun. Daha sonra fareyi kafese geri döndürün ve yaklaşık 5 dakika bekleyin.
NOT: Enjektabl yatıştırıcılar in vivo grip enfeksiyonları için inhale yatıştırıcılar üzerinde tavsiye edilir, ikincisi hava yolu epitel tarafından davranış ve virüs alımını değiştirebilirsiniz gibi. Ayrıca, onlar da akciğer lokal bağışıklık yanıtlarını etkileyebilir ve enfekte farelerin in vivo görüntüleme ile müdahale. Son olarak, inhale yatıştırıcılar etki süresini azalttı, hangi enfekte hayvanların in vivo görüntüleme için bir sorun olacaktır.
Hazırlanan BIRFLU seyreltme 30 μL ile fareler intranasialınaşılamak. Farelerin kafese geri dönmeden önce düzgün nefes alıp vermediğini kontrol edin.
BIRFLU ile enfekte farelerin biyolüminesans takibi (Şekil 4A)
NOT: Bu el yazmasında Nluc veya Venüs'ün ifadesi ve BIRFLU ile enfekte olmuş farelerin akciğerlerindeki viral çoğalması enfeksiyon sonrası 3 gün olarak belirlenmiştir. Ancak, biyolüminesans görüntüleme doğası her deneysel zaman noktası için onları ötenazi gerek kalmadan bireysel BIRFLU enfekte hayvanlarda Nluc ifade nin tekrartekrar izlenmesine olanak sağlar. Açıklanan deneysel işlemlerin yapılabilmesi için isofluran anestezi manifoldu olan in vivo görüntüleme sistemi gereklidir. Görüntü toplama ve veri analizi için kullanılan görüntüleme aracı ve görüntü yazılımı ile ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
Biyolüminesans sinyalini iyileştirmek için fare lerin göğsünü tıraş edin. Görüntüleme yazılımını açın ve Initializetuşuna basın. Ardından, görüntüleme modunu biyolüminesansa ayarlama, otomatik kaydetme, otomatik, açık filtre, vb. için maruz kalma süresi dahil olmak üzere kullanılacak parametreleri ayarlayın.
Makine tamamen başharfe döndükten sonra, isofluran anestezi sistemini açın. Hayvanları anestezi odasına yerleştirin. Fareler aynı anda ve hafifçe oksijen gazı karışımı ile anestezi ve buharlaşmış 1-2% isoflurane.
Fareler anestezi edildikten sonra, 22 G iğneli bir şırınga kullanarak retro-orbital rota üzerinden 1x PBS'de (son hacim 100 μL/fare) 1:10 seyreltilmiş Nluc substratını (Malzeme Tablosuna bakın) uygulayın.
Nluc reaktif uygulamasından hemen sonra, hayvanları görüntüleme sırasında anestezi altında tutmak için, hayvanları göğüslerini yukarı bakacak şekilde ve manifold konisinin içine sokarak görüntüleme aletine yerleştirin. Görüntüleyici kapısını kapattıktan hemen sonra, yazılım programında Edinme'yi tıklatın (Şekil4A, üst).
Görüntülemeden sonra, fareleri tamamen iyileşene kadar onları izleyen kafeslerine geri verin ve izofluran buharlaştırıcıyı kapatın. Daha sonra, Venüs muhabiri gen ekspresyonunu değerlendirmek için fare akciğerlerinin ex vivo görüntülemesine devam edin (bölüm 4.3).
Edinilen biyolüminesans verilerini analiz etmek için görüntüleme yazılımı araçlarını kullanın. Belirli sinyali belirlemek ve ilgi bölgesinde (genellikle göğüs çevresinde) akı ölçümleri yapmak için RoI (ilgi bölgesi) aracını kullan (Şekil4A, alt). Yatırım getirisi şekli alakasız olsa da, sinyal difüzyon alanının tamamını yakalamak için genellikle daha büyük ROI'lar tercih edilir.
Ölçü'yetıklayın. Farklı parametreler veya görüntüleme cihazları tarafından sağlanan çıktı ölçümlerine karşılaştırılabilir mutlak bir foton emisyon ölçümü sağladığından, fotonlarda biyolüminesansı değerlendirin.
BirFLU ile enfekte farelerde floresan analizi (Şekil 3 ve Şekil 4B)
Daha önce açıklandığı gibi, in vivo görüntüleme sonra fare akciğerleri toplamak23.
Kısaca, tbe öldürücü bir doz (500 mg / kg) ile fareler ötenazi. Kesi bölgesini %70 etanol ile dezenfekte edin. Bir neşter ile, göğüs göğüs karnından karın tabanına bir kesi yapmak ve daha sonra makas ile yanlara kesi altından kesti. Daha sonra, karaciğer damarı (ikinci fiziksel ötenazi yöntemi) hayvan kanamak için kesti.
NOT: Görüntüleme sırasında yüksek arka plan sinyali önlemek için, akciğerlerde kan miktarını en aza indirmek için önemlidir (aşağıya bakın).
Dorsal recumbency fare yerleştirin ve plevra kesmek ve göğüs kafesi açmak için makas kullanın. Daha sonra, yavaşça forceps ile akciğerleri tutarak ise makas ile nefes borusu ucunu keserek akciğerleri çıkarın.
1x PBS 2 mL ile altı iyi plaka akciğerler yerleştirin ve 1x PBS ile akciğerleri üç kez yıkayın.
NOT: Numuneler arasında kontaminasyonu önlemek için, her hayvan arasındaki diseksiyon araçlarını temizleyin ve dezenfekte edin.
Görüntü edinme yazılımını başlatın ve görüntüleme modunu floresan, otomatik kaydetme, otomatik otomatik pozlama süresi, uyarma (500 nm) ve emisyon (540 nm) filtrelerine ayarlama dahil olmak üzere görüntüleme parametrelerini ayarlayın.
Makine başlatıldığında, akciğerleri siyah bir arka plan tepsisine yerleştirin, dokuların birbirinden ayrılmasını sağlar, tepsiyi görüntüleyiciye tanıyın ve görüntüleyici kapısını kapattıktan sonra görüntüleme sistemi programında Edinme'yi tıklatın ( Şekil 4B, üst).
Görüntülemeden sonra, numuneler aynı gün işlenirse, dokuları derhal çıkarın ve buzda (4 °C) saklayın; veya numuneler daha sonra farklı bir gün işlenirse, -80 °C'de saklamadan önce, hızlı bir şekilde dondurmak için bir tüp ve kuru buz üzerinde.
Görüntü işleme için YG aracını seçin ve her bir akciğerin etrafına ROI çizin. Ölçü'yetıklayın. Daha sonra, elde edilen ortalama radyant verimlilik ölçümlerini kullanarak, sahte enfekte farelerden (Şekil4B, alt) değerleri çıkarın.
NOT: BirFLU ile Nluc ve Venüs ekspresyonu düzeyleri ile sinyal dağılımı nın iyi bir korelasyonu vardır. Bu nedenle, aynı hayvanın Nluc (bütün fare) ve Venüs (excised lungs) ifadesini analiz etmek ve aynı oryantasyonu korumak önemlidir.
Fare akciğerlerinde BIRFLU replikasyonunun değerlendirilmesi (Şekil 3 ve Şekil 4C)
Daha önce açıklandığı gibi plak tahtına viral titrasyon için fare akciğerleri homojenize23.
Soğutulmuş enfeksiyon ortamı 1 mL ile bir Dounce homogenizer içine akciğerler yerleştirin. Tamamen parçalanana kadar oda sıcaklığında 1 dakika boyunca havanele ile akciğerleri homojenize ve 4 °C'de steril bir tüpte saklayın.
Numuneleri 10 dk için 300 x g'de santrifüj edin ve süpernatant'ı steril bir tüpte toplayın. Aynı gün kullanılacaksa numuneleri buzüzerinde saklayın veya daha sonra viral titreleri değerlendirmek için -80 °C'de dondurun.
NOT: Her akciğer örneği için yeni bir Dounce homogenizer kullanılmalıdır.
Plak tahsinini gerçekleştirmek için, viral titrasyonun bir gün önce doku kültürü ortamlarında MDCK hücreleri (5 x 105 hücre/kuyu) içeren altı kuyulu tabaklar tohumlar. Hücreleri bir gecede 37 °C'de %5 CO2 ile tüpaltında geçirin ve ertesi gün %90 biraraya ulaşın. Enfeksiyondan önce, hücrelerin ışık mikroskobu altında bir monolayer oluşturduğunu doğrulayın.
Enfeksiyon ortamlarında homojenize örneklerden (adım 4.4.1) süpernatantın 1:10 seri seyreltmelerini hazırlayın. 540 μL enfeksiyon ortamına sahip mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın, homojenize edilmiş akciğer örneğinden ilk tüpe 60 μL ekleyin, yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın ve yeni bir uç kullanarak bir sonraki tüpe 60°L aktarın. Bu seri seyreltme işlemini son seyreltme işlemine kadar tekrarlayın.
NOT: Bizim deneyim 7 seyreltme enfekte farelerin akciğerlerinden plak tsay ile viral titreleri belirlemek için yeterlidir.
MDCK hücrelerini (adım 4.4.3) 1x PBS ile iki kez yıkayın ve seri olarak seyreltilmiş numunelerin 500 μL'sini altı kuyudaki her kuyuya aktarın. Plakaları sallanan bir platforma yerleştirin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca viral emilimin oluşmasını bekleyin.
1 saatlik viral emilimi çıkardıktan sonra, viral inokülü çıkarın, 1 μg/mL TPCK ile tedavi edilen tripsin içeren 2 mL/kuyu bindirme ortamı ekleyin ve hücreleri 3 gün boyunca %5 CO 2'nin altında 33 °C'de kuluçkaya yatırın.
Enfekte hücreleri (adım 4.4.6) 1 mL/iyi % 4 formaldehit ile oda sıcaklığında 1x PBS 2 saat boyunca seyreltilmiş, sonra dikkatlice bindirme ortamını çıkarın ve her kuyuya 1 mL 1x PBS ekleyin. Venüs'ün görselleştirilmesi için, altı kuyulu plakaları floresan tespiti için bir görüntüleme sistemiyle görüntüleyin.
NOT: Viral plaklar bir görüntü düzenleme yazılımı kullanılarak renklendirilebilir (Bkz. MalzemelerTablosu).
Nluc ifadesini değerlendirmek için, bir anti-Nluc pAb kullanarak immünboyama ile viral plaklar görselleştirmek. Bunun için, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 0,5 mL/kuyu permeabilizasyon çözeltisi kullanarak 1x PBS'yi çıkarın, hücreleri geçirin.
Permeabilizasyon çözeltisini çıkarın, hücreleri 1x PBS ile üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca 0,5 mL/kuyuile bloklayın.
Blokaj çözeltisini adım 4.4.9'dan çıkarın ve pAb anti-Nluc'un 0,5 mL/kuyusu ile hücreleri 37 °C'de 1 saat seyreltme çözeltisinde 1:1.000 seyreltme çözeltisi ile inkübe edin.
Nluc ifade plaklar görselleştirme için üreticinin tavsiyesi aşağıdaki ABC Alkalifosfataz kiti ve DAB Peroksidaz Substrat Kiti kullanın.
Kısaca, 4.4.10'dan üç kez 1x PBS ile hücreleri yıkayın ve 0.5 mL/kuyu ile 37 °C'de 1 saat boyunca biyotinylated anti-tavşan ikincil antikor ile kuluçkaya yatırın.
Sekonder antikorları çıkarın, hücreleri 1x PBS ile üç kez yıkayın ve 37 °C'de 1 saat boyunca ABC çözeltisi ile kuluçkaya yatırın. Hücreleri 1x PBS ile üç kez yıkayın ve DAB HRP substrat Kiti ile viral plakları görselleştirin. Konvansiyonel bir tarayıcı kullanarak immünolekeli plakları tarayın.
NOT: İmmünoboyama için diğer benzer kitleri kullanılabilir.
Oda sıcaklığında 1 saat boyunca kristal mor çözeltiile viral plaklar leke. Kristal menekşe atın, su ile üç kez plakaları yıkayın, plakalar kurumasını bekleyin ve tekrar plakaları taranır.
Viral titreleri belirlemek için, kristal mor boyama sonra ortaya plaklar saymak. Geleneksel bir tarayıcı kullanarak plakları tarayın. ML başına plak şekillendirme üniteleri (PFU) (PFU/mL) olarak virüs titretini hesaplayın.
Vivo'da BIRFLU kararlılığını değerlendirmek için, kristal mor-lekeli plakların (bulaşıcı virüs sayısı, adım 4.4.12) sayısını sayarak muhabiri ifade eden virüslerin yüzdesini hesaplayın ve Venüs ve Nluc ifade eden plakların sayısıyla karşılaştırın ( adım 4.4.7 ve adım 4.4.11, sırasıyla).
Birflu in vitro üretimi ve karakterizasyonu (Şekil 1 ve Şekil 2)
İki farklı muhabir genini (BIRFLU) ifade eden bir rekombinant çoğaltma-yetkili IAV, son teknoloji moleküler biyoloji ve plazmid bazlı ters genetik teknikleri kullanılarak inşa edilmiştir (Şekil1). Burada, küçük boyutu, ATP-bağımsızlık, daha fazla yoğunluk ve optimize substrat48,60dahil olmak üzere diğer luciferases üzerinde çeşitli avantajlar nedeniyle Nluc kullanmayı seçti. Nluc IAV PR8 HA segmentine klonlanmış ve ardından ha'nın açık okuma çerçevesi (ORF) önünde domuz teschovirus (PTV) 2A dekolte alanı (2A) izlemiştir (Şekil 1). HA ORF orijinal ambalaj sinyalleri kaldırmak ve olası rekombinasyon önlemek için sessiz mutasyonlar dahil. Tam HA ambalaj sinyali, değiştirilmiş HA segmentinin aynı viral RNA segmentinden virion ve Nluc ve HA ekspresyonuna uygun şekilde dahil edilmesine izin vermek için Nluc'un önüne eklenmiştir (Şekil1). Buna ek olarak, floresan protein Venüs tek bir transkript ns1 ve NEP kodlar modifiye IAV PR8 NS segmentine klonlanmış oldu32,36,41,54, 57. yıl. Bu amaçla Venüs, NS1'in C-terminaline kaynaşmış ve tüm NEP ORF, NS1-Venüs ve NEP dizileri arasına yerleştirilen PTV 2A dekolte alanının aşağısına klonlanmış (Şekil1). Sonuç olarak, bu iki modifiye HA ve NS viral plazmid yapılar IAV PR8 ters genetik plazmidler geri kalanı ile birlikte birflu oluşturmak için kullanılmıştır (Şekil 1). BIRFLU in vitro ve in vivo karakterizasyonu daha önce55açıklanmıştır .
Şekil2'de Floresan ve dolaylı immünoresans yaklaşımları kullanılarak Venüs, Nluc ve NP ekspresyon düzeylerini belirleyerek in vitro BIRFLU karakterize edildik (Şekil 2A,B). MDCK hücrelerinin en fluent monolayers ya mock-enfekte veya enfekte (MOI 0.1) WT veya BIRFLU PR8 virüsleri ile ve, 18 saat post-enfeksiyon, Venüs ekspresyonu doğrudan floresan mikroskop isiyle değerlendirildi (Şekil2A,B). Nluc (Şekil 2A) ve NP (Şekil 2B) ekspresyonu her proteine özgü antikorlar kullanılarak dolaylı immünfloresans ile görselleştirildi. Beklendiği gibi, Venüs ve Nluc ekspresyonu sadece BIRFLU tarafından enfekte hücrelerde saptırıldı, WT PR8 virüsü ile enfekte hücrelerde değil. Buna ek olarak, dolaylı immünoresans mikroskopisi hem WT hem de BIRFLU PR8-enfekte hücrelerde NP ekspresyonu saptamıştır. Venüs, Nluc veya NP ifadesi beklendiği gibi sahte enfekte hücrelerde algılanmadı (ŞekilA,B).
Nluc ekspresyon düzeylerini in vitro olarak değerlendirmek için, MDCK hücreleri WT veya BIRFLU PR8 virüsleri ile enfekte edildi (MOI 0.001) ve doku kültürü supernatants Nluc aktivitesi 24, 48, 72 ve 96 h post-enfeksiyon değerlendirildi (Şekil2C). BIRFLU (Şekil2C)ile enfekte MDCK hücrelerinin doku kültüründe sadece Nluc aktivitesi saptandı. Doku kültüründe nluc aktivitesi supernatants 96 h post-enfeksiyon yüksek ekspresyon düzeyleri ile 24 saat post-enfeksiyon gibi erken tespit edildi, büyük olasılıkla çünkü sitopatik etkisi (CPE) viral enfeksiyon salınımı sırasında indüklenen Nluc protein muhafaza hücreiçine. Kültürlü hücrelerde BIRFLU'nun uygunluğunu değerlendirmek için WT ve BIRFLU PR8 virüslerinin büyüme kinetiği de değerlendirildi (Şekil2D) ve doku kültüründe enfeksiyöz virüsün varlığı immün odak testi ile belirlendi (Şekil 2D ). Özellikle, BIRFLU çoğaltma kinetik WT PR8 virüsü ile karşılaştırılabilir, BIRFLU çoğaltma biraz gecikmiş ve WT PR8 aynı viral titreleri ulaşmadı rağmen. Ancak, BIRFLU 5 x 107 PFU/mL (Şekil2D)titrelerine ulaşabildi ve viral genomdaki iki muhabir genin ekspresyonunun MDCK hücrelerindeki BIRFLU çoğalmasını önemli ölçüde etkilemediğini belirtti.
Farelerde BIRFLU enfeksiyonunun izlenmesi (Şekil 3 ve Şekil 4)
Şekil 3, IAV enfeksiyonunun fare modelinde BIRFLU dinamiklerinin değerlendirilmesi için bir şematik akış şemasıdır. Beş ila yedi haftalık dişi BALB/C farelerya ya 1x PBS ile bulaşmış ya da 1 x 106 PFU birflu intranasally ile enfekte olmuştur. 3 gün sonra, fareler isofluran e-posta ile anestezi edildi ve daha sonra nluc substrat retro-orbital ile enjekte edildi. Tüm fareler derhal IVIS cihazına yerleştirildi ve Nluc sinyali IVIS kullanılarak in vivo olarak değerlendirildi. Daha sonra fareler ötenazi yedirildi ve akciğerleri hasat edildi. Excised akciğerler daha sonra Venüs ekspresyonu ile floresan yoğunluğunu belirlemek için in vivo görüntüleyici kullanılarak ex vivo analiz edildi. Son olarak fare akciğerleri homojenleştirildi ve plak tsay ile viral titreler ve stabilite belirlendi. Plaklar Venüs'ün doğrudan floresansı, Nluc'a özgü antikorlar kullanılarak immünboyama ve kristal mor boyama ile değerlendirildi.
Daha önce açıklanan çoğaltma-yetkili muhabir-ifade IAVs tek bir muhabir gen ifade, en sık ya bir floresan veya biyolüminesans protein, viral enfeksiyon ve çoğaltma için vekil olarak. Ancak, BIRFLU, viral enfeksiyon üzerine muhabir genlerin her iki tip ifade edebiliyoruz. Birflu enfeksiyonu sonrası biyolüminesans (in vivo görüntüleme) ile floresan (ex vivo görüntüleme) arasındaki ilişkiyi değerlendirmek için, beş ila yedi haftalık dişi BALB/c fareler 1x PBS ile enfekte olmuş veya BIRFLU (106 PFU) intranasile aşılanmış . Nluc aktivitesi (Şekil4A)in vivo görüntüleme cihazı kullanılarak 3 gün sonra retro-orbital enjekte edilen Nluc substrat uygulaması ile değerlendirildi. Biz gün 3 biyolüminesans değerlendirmek için seçtim çünkü önceki çalışmalarda IAV çoğaltma, PR8 dahil, gün 2 ve 4 post-enfeksiyon24arasında zirveleri gösterdi,54. Biyolüminesans izlendi (Şekil4A, üst) ve ortalama toplam akı hesaplamak için kullanılan (Akı (log10 p/s) (Şekil4A, alt). Tahmin edildiği gibi, BIRFLU ile aşılanan fareler yüksek biyolüminesans aktivitesi gösterdi, ancak sahte enfekte farelerde sinyal tespit edilmedi. Daha sonra enfekte farelerin akciğerleri hasat edildi ve Venüs ekspresyonu ex vivo görüntüleme (Şekil4B, üst) kullanılarak değerlendirildi. Ayrıca floresan ortalama radyant verimi hesaplanmıştır (Şekil4B, alt). Eksinti farelerin akciğerleri de viral titreleri ve BIRFLU in vivo genetik stabilitesini belirlemek için homojenize edildi (Şekil 4C,D). BIRFLU'nun genetik stabilitesi fare akciğerlerinden izole edilen virüsler ve floresan mikroskopi (Venüs, üst), immünboyama (Luc, orta) ve kristal mor boyama (alt) kullanılarak plak analizi ile analiz edildi. Fare akciğerlerinden elde edilen BIRFLU plaklar oluşturabildi ve her iki muhabir genini de ifade edebildi (Şekil 4C). Özellikle, biyolüminesans ve floresan sinyalleri arasında viral replikasyon ile iyi bir korelasyon gözlendi.
Şekil 1: IAV PR8 WT ve BIRFLU virion yapısı ve genom segmentlerinin şematik gösterimi. IAV iki büyük viral glikoproteinler hemagglutinin içeren bir lipid çift katmanlı çevrilidir (HA; siyah) ve nöraminidaz (NA; mavi). IAV sekiz tek telli, negatif-sense, RNA segmentleri (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M ve NS) içerir. Her viral segment 3' ve 5' uçlarında (kara kutular) kodlamayan bölgeleri (NCR) içerir. Ayrıca, viral (v) RNA'ların 3' ve 5' ucunda, vRNA'ların yeni doğan viriasyonlara (beyaz kutular) verimli bir şekilde saklanmasından sorumlu ambalaj sinyalleri bulunur. IAV PR8 HA ve NS viral segmentleri ve ürünleri siyah olarak belirtilmiştir. Nluc, Venüs ve PTV 2A dizileri sırasıyla kırmızı, yeşil ve çizgili kutularda gösterilir. Nluc ve Venüs'ü ifade eden modifiye EDILMIŞ HA ve NS segmentlerinin şematik gösterimi de BIRFLU'da belirtilmiştir. Bu rakam Nogales ve ark.55'tenuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: BirFLU'nun in vitro karakterizasyonu. (A, B) Doğrudan floresan ve immünofloresan ile protein ekspresyonunun analizi. MDCK hücreleri pr8 WT veya BIRFLU virüsleri ile mock-infected veya enfekte (MOI 0.1) idi. Enfekte hücreler, venüs ekspresyonunu doğrudan floresan mikroskopi ile görselleştirmek ve Belirli antikorlar ve dolaylı immünoresans kullanarak Nluc (A) ve viral NP (B) ekspresyonunu görselleştirmek için 18 saat sonrası enfeksiyon sonrası sabitlendi. Çekirdekler DAPI ile lekelendi. Temsili görüntüler (20x büyütme) gösterilir. Ölçek çubukları = 100 μm. (C, D) PR8 WT ve BIRFLU büyüme kinetik. Nluc aktivitesi(C) ve viral titreler (D) doku kültüründe enfekte MDCK hücrelerinden (MOI 0.001) WT ve BIRFLU PR8 virüsleri ile supernatants belirtilen zamanlarda enfeksiyon sonrası değerlendirildi. Veriler, triplicates± ± SD anlamına gelir. Viral titreler immün odak tsay (FFU/mL) ile belirlendi. Noktalı çizgi algılama sınırını gösterir (200 FFU/ml). Bu rakam Nogales ve ark.55'tenuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Farelerde BIRFLU çalışması için şematik gösterim. In vivo veya ex vivo görüntüleme kullanılarak 1 x 106 PFU BIRFLU ile enfekte farelerde Nluc ve Venüs muhabir genlerinin ekspresyonu değerlendirildi. Kısaca, gün 1, 5-7 haftalık dişi BALB / c fareler mock-enfekte edildi (1x PBS) veya birflu intranasally 1 x 106 PFU ile aşılanmış. 3. gün enfeksiyon sonrası fareler isofluran kullanılarak hafif anestezi edildi ve Nluc substratı retro-orbital olarak enjekte edildi. Nluc sinyali in vivo görüntüleme kullanılarak doğrudan değerlendirildi. Görüntülemeden hemen sonra fareler ötenazi yedirildi ve venüs'ün tüm ekstremakciğerlerde ekspresyonu ex vivo görüntüleme kullanılarak analiz edildi. Kurtarılan fare akciğerleri plak tsay ile viral replikasyon ve stabiliteyi değerlendirmek için homojenleştirildi. Oklar floresan (Venüs), immünboyama (Nluc) ve kristal mor boyama arasındaki ilişkiyi gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: In vivo biyolüminesans ve floresan ekspresyonu. Dişi beş ila yedi haftalık BALB/c fareler ipe enfekte (1x PBS) veya 1 x 106 PFU birflu intranasally ile aşılandı. Gün 3 enfeksiyon sonrası, Nlucaktivitesi (A) tüm fare tespit edildi. Parlaklık ölçeğini (p/sn/cm2/sr) gösteren tek bir farenin temsili görüntüleri. Biyolüminesans parlaklık değerleri sayısallaştırıldı ve ortalama toplam akı gösterilmiştir (Akı (Log10 p/s). Nluc görüntülemeden sonra, akciğerler ex vivogörüntüleme (B) için hasat edildi. Tüm akciğerlerden temsili resimler gösterilir. Venüs ekspresyonunu ölçmek için, ilgi bölgelerinin (ROI) ortalama değerleri, sahte enfekte farelerden akciğer oto-floresanına normalleştirildi ve kıvrım değişiklikleri hesaplandı. Birflu in vivo'nun genetik stabilitesini analiz etmek için fare akciğerlerinden elde edilen virüsler floresan mikroskopi (Venüs, üst), immünboyama (Nluc, orta) ve kristal mor boyama (alt) (C) kullanılarak plak testinde analiz edildi. Bir fareden temsili görüntüler gösterilir. Virüs replikasyonunu değerlendirmek için görüntüleme sonrası tüm akciğerler homojenleştirildi ve MDCK hücrelerine bulaşmaya ve plaktesti (PFU/mL) (D) ile viral titreleri belirlemek için kullanıldı. Oklar floresan (Venüs), immünboyama (Nluc) ve kristal mor boyama arasındaki ilişkiyi gösterir. Çubuklar akciğer virüsü titrelerinin ortalama ± SD'sini temsil eder. Bu rakam Logales ve ark.55'tenuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Doku kültürü ortamı ve çözümleri Kompozisyon Depolama Kullanın
Doku kültürü ortamı: Dulbecco modifiye Eagle's orta (DMEM), 10 % Fetal Sığır Serumu (FBS), %1 Penisilin-Streptomisin-L-glutamin (PSG) (DMEM 10 % FBS 1% PSG). 445 ml DMEM, 50 mL FBS ve 5 mL 100x PSG. 4 °C MDCK hücrelerinin bakımı
Enfeksiyon sonrası ortam: DMEM %0.3 Büyükbaş Albumin (BA), %1 PSG (DMEM %0.3 BA % 1 PSG). 491 ml DMEM, 4.2 ml % 35 BA ve 5 ml 100x PSG 4 °C Viral enfeksiyon sonrası MDCK hücrelerinin bakımı
10x Fosfat tamponlu salin (PBS) NaCl 80 g, KCl 2 g, Na 11.5 g2HPO4.7H2O, KH2PO 2 g4. ddH2O'dan 1 L'ye kadar ekle pH'ı 7,3'e ayarla Oda sıcaklığı 1x PBS hazırlamak için
1x PBS DDH2O ile seyreltik 10x PBS Oda sıcaklığı Hücreleri yıkama
Enfeksiyon ortamları: 1x PBS, 0.3% BA, 1% Penisilin-Streptomisin (PS) (PBS / BA /PS). 487 mL 1x PBS steril, 4.2 mL %35 BA ve 5 ml %100x 1 PS(100 U/mL) 4 °C Viral enfeksiyonlar
Fiksasyon/permeabilizasyon çözeltisi: %4 formaldehit, %0.5 triton X-100 1x PBS seyreltilir. 400 mL nötr tamponlu formalin %10, Triton X-100 5 ml ve 1x PBS 595 mL Oda sıcaklığı MDCK hücrelerinin düzeltilmesi ve permeabilizasyonu.
Bloklama çözümü: 1x PBS'de %2.5 Sığır Serum Albumini (BSA). 1x PBS 97,5 mL'de 2,5 g BSA 4 °C İmmünfluoresans ve plak tahlilleri için blokaj çözümü.
Antikor seyreltme çözeltisi (1x PBS'de %1 BSA) 1x PBS 99 mL'de 1 g BSA 4 °C Primer ve sekonder antikorların seyreltilmesi.
%0,1 kristal mor çözelti 400 mL metanolde 1 g kristal menekşe. 600 ml ddH2O ekleyin Oda sıcaklığı Plak tahlillerinde MDCK hücrelerinin boyanma.
Tosylsulfonyl fenililel klorometil keton (TPCK) ile tedavi edilen tripsin ddH2O'da 1 mg/mL'de 1000x stok çözeltisi hazırlayın -20 °C Viral enfeksiyonlar için.
Tablo 1: Doku kültürü ortamı ve çözümleri.
Araştırmacılar anlamak ve viral çoğaltma ve patogenez26,27,28mevcut anlayış üzerine genişletmek için hayati moleküler araçlar olarak rekombinant muhabir-ifade virüsleri dayanıyordu, 29.000 , 30,5 000 , 31.000 , 32.000 , 33.000 , 34.000 , 35.000 , 36.000 , 37.000 , 38.000 , 39,5 000 , 40,5 000 , 41.000 , 54- En çok tercih edilen muhabir genler luciferases ve floresan proteinler, özellikle onların tanımlanmasında teknolojik gelişmeler nedeniyle, gelişmiş varyantların geliştirilmesi ve görüntüleme teknolojileri tarafından tespit43 , 44.000 , 45.000 , 46.000 , 47.000 , 48. Rekombinant muhabir virüsler genellikle virolojik tahlilleri hızlandırmak için kullanılır, in vitro ve in vivo virüslerin dinamikleri çalışma, ve şu anda onaylanmış veya yeni aşı ve tedavi yaklaşımlarının etkinliğini test etmek için26, 27,28,29,30,31,32,33,34,35, 36,37,38,39,40,41,54. Ne yazık ki, IAV durumunda, geçmiş çalışmalar tek bir muhabir genin ifade sınırlıydı, hangi yapılabilir çalışma türü engeller 26,27,28,29 , 30,5 000 , 31.000 , 32.000 , 33.000 , 34.000 , 35.000 , 36.000 , 37.000 , 38.000 , 39,5 000 , 40,5 000 , 41.000 , 54- Bu sınırlamayı önlemek için, bir Nluc luciferase ve Venüs floresan protein (BIRFLU) ifade eden bir çoğaltma-yetkili bi-reporter IAV oluşturduk.
Bu yazıda, BirFLU'nun in vitro karakterizasyonu ve IAV enfeksiyonunun fare modelini kullanarak in vivo viral enfeksiyonu izlemek için BIRFLU'yu kullanmak için deneysel yaklaşımları açıklıyoruz. BIRFLU Nluc ve Venüs ekspresyonu viral titrelerle ilişkilidir. Buna ek olarak, BIRFLU kararlı kaldı ve enfekte farelerin akciğerlerinden kurtarıldıktan sonra her iki muhabir genleri ifade etmeye devam etti. Bu yaklaşım, araştırmacılara IAV enfeksiyonlarının tedavisi için yeni tedavi alternatiflerinin tanımlanması ve geliştirilmesi de dahil olmak üzere, kültürlü hücrelerde ve hayvan modellerinde IAV'yi inceleme fırsatı sunmaktadır.
PR8'in belkemiği kullanılarak bir flu üretilmiş olmasına rağmen, aynı deneysel yaklaşım kullanılarak farklı tip, alt tip veya viral gerinim omurgaları kullanılarak diğer rekombinant IAV oluşturulabilir. Aynı şekilde, bu raporda IAV'nin fare modelinde BIRFLU'nun kullanımına ilişkin deneysel prosedürleri açıklanmıştır. Ancak, BIRFLU diğer hayvan modellerinde IAV enfeksiyonu değerlendirmek için değerli bir teknoloji olabilir.
LM-S laboratuvarında grip virüsü üzerine yapılan araştırmalar, NIAID Grip Araştırma ve Gözetim (CEIRS) sözleşmesi No'nun bir üyesi olan New York Grip Mükemmellik Merkezi (NYICE) (NIH 272201400005C) tarafından kısmen finanse edilmektedir. HHSN272201400005C (NYICE) ve Savunma Bakanlığı (DoD) Hakemli Tıbbi Araştırma Programı (PRMRP) hibe W81XWH-18-1-0460.