Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids | Protocol (Translated to Turkish)
Epitel ve stromal hücrelerden oluşan ve yerli endometrial dokunun özelliklerini koruyan insan primer endometriyal organoidler oluşturmak için bir protokol sunulmuştur. Bu protokol, rahim dokusu alımından endometrial organoidlerin histolojik işleme yöntemlerini açıklamaktadır.
İnsan endometrium vücutta ki en hormonal duyarlı dokulardan biridir ve gebeliğin kurulması için gereklidir. Bu doku da hastalıklı olabilir ve morbidite ve hatta ölüme neden olabilir. İnsan endometrial biyolojisini inceleyen model sistemler, tek hücreli in vitro kültür sistemleri ile sınırlandırılmıştır. Buna ek olarak, endometriumun en önemli hücre tiplerinden biri olan epitel hücreleri, kültürdeki fizyolojik özelliklerini iyi yaymaz veya korumaz ve böylece endometriyal biyoloji anlayışımız sınırlı kalmaktadır. İlk defa insan endometriumunun hem epitel hem de stromal hücrelerinden oluşan endometrial organoidler oluşturduk. Bu organoidler herhangi bir ekzojen iskele malzemeleri gerektirmez ve özellikle epitel hücreleri küresel benzeri yapıyı kapsayacak şekilde düzenlemek ve üretmek ve kollajen salgılayan merkezinde stromal hücreleri ile polarize olur. Östrojen, progesteron ve androjen reseptörleri epitel ve stromal hücrelerde ifade edilir ve östrojen ve testosteron fizyolojik düzeyleri ile tedavi organoidlerin organizasyonu teşvik. Bu yeni model sistemi, normal endometriyal biyoloji ve hastalıkları daha önce mümkün olmayan şekillerde incelemek için kullanılabilir.
İnsan endometrium hatları rahim boşluğu ve implantasyon sırasında embriyo için ilk temas olarak hizmet vermektedir. Endometrium luminal ve glandüler epitel hücreleri, destekleyici stromal fibroblastlar, endotel hücreleri ve bağışıklık hücrelerinden oluşur. Birlikte, Bu hücre tipleri seks steroid hormonları için en duyarlı dokulardan biri olan endometrial doku makyaj1. Her adet döngüsü sırasında meydana gelen değişiklikler çarpıcı. Embriyo implantasyonunun gerçekleşmesi için uygun büyüme ve endometriumun yeniden şekillendirilmesi gereklidir. Östrojen ve progesteron anormal yanıt gebeliğin başarılı kurulması için izin vermez ve hatta endometrial neoplazi de dahil olmak üzere hastalıklara neden olabilir refrakter bir endometrium neden olabilir.
Endometriumda oluşan hormon yanıtlarını ve temel değişiklikleri incelemek için ameliyat veya endometrial biyopsi sırasında hastalardan alınan endometrial dokulardan alınan hücreler hücre kültüründe yayılımkonusu olmuştur. Endometrial stromal hücreler tercihen çoğalır ve kolayca yayılır, ve progesteron tarafından indüklenen farklılaşma süreci in vitro recapitulated olabilir. Sonuç olarak, desidualizasyon2,3olarak adlandırdığı bu farklılaşma sürecinde çok şey öğrenilmiştir. Endometrium diğer önemli hücre tipi, luminal ve glandüler epitel hücreleri, ancak, polarite kaybetme, yaşlanma, yaşlanmak, ve sınırlı çoğaltıcı potansiyele sahip, geleneksel monolayers olarak iyi büyümek yok. Sonuç olarak, daha az biyoloji ve insan endometrium onların rolü bilinmektedir. Birçok neoplazi epitel hücrelerinden kaynaklandığı gibi, hiperplazi veya kanser hücrelerine dönüşüm ile ilişkili mekanizmalar tam olarak tanımlanmış olmaya devam etmektedir. Ayrıca, çalışmalar hormon yanıtı endometriumepitelve stromal hücreler arasında samimi parakrin eylemleri içerdiğini kurduk4 ,5.
Son zamanlarda, endometrial epitel hücrelerinin üç boyutlu (3D) organoid kültürü iki bağımsız grup tarafından kurulmuştur6,7, endometrial dokudan oluşan organoidlerin ilk raporları. Bu organoidler bir protein matrisi(Malzeme Tablosu)içine gömülü endometrial epitel hücrelerinden oluşuyordu ve endometrial endometriumun hormonal olarak duyarlı önemli bir bölmesi olan stromal fibroblastları içermiş. Matris proteinler çok dan çok değişebilir ve mutlaka dokuda meydana gelmez sinyal yolları tetikleyebilir gibi, endometrium bileşenleri ile matris proteinleri yerine ideal olacaktır. Mevcut çalışmada, insan endometriumunun epitel ve stromal hücrelerinin iskelesiz insan endometrial organoidlerinin oluşturulmasına bir protokol sunulmuştur. Stromal hücrelerin varlığı sadece epitel hücreleri için destek sağlamakla kalmıyor, aynı zamanda endometriyal hormon yanıtı için önemli olduğu tespit edilen gerekli parakrin eylemleri de sağlar4,8,9 .
Yeni multisellüler endometriyal organoid oluşturmak için basit ve hem epitel hem de stromal hücreleri içeren endometrium bir model sistemi sunuyor. Bu organoidler hormonal dengesizlik veya eksojen hakaretler nedeniyle tümörigenez gibi hastalığın uzun süreli hormonal değişiklikleri ve erken olaylarını incelemek için kullanılabilir. Bu organoidlerin karmaşıklığı sonunda diğer hücre tipleri içerecek şekilde genişletilebilir, endotel ve bağışıklık hücreleri muhtemelen miyomsal hücreleri ile de dahil olmak üzere gerçekten insan doku fizyolojisi taklit etmek.
Endometrial örnekler Northwestern Üniversitesi Prentice Kadın Hastanesi'nde benign rahim koşulları için rutin histerektomi geçiren premenopozal kadınlardan alındı, Kurumsal İnceleme Kurulu onaylı protokole göre. Çalışmaya dahil olan tüm kadınlardan yazılı izin alındı.
1. Agarose Kalıplarının Hazırlanması
Hücre izolasyonuna başlamadan önce, organoidleri üreticinin talimatlarına göre barındırmak için %1,5 agarose mikro kalıpları(Malzeme Tablosu)atar ve dengeler.
2. Endometrial Organoidlerin Üretimi
Primer stromal ve epitel hücrelerinin hasat
Aseptik tekniği kullanan bir biyogüvenlik kabininde, enzim solüsyonu (2.5 mg/mL kollajenaz tip I + 0.1 mg/mL DNase I 10 mL dispase [500 ünite]) 37 °C'de hazırlayın ve çözeltiyi 15 mL konik tüpe 0,2 μm şırınga filtresi kullanarak steril filtre uygulayın.
Aseptik tekniği kullanarak bir biyogüvenlik kabine, rahim biyopsileri ve neşter ile çok küçük parçalar halinde başlık altında kıyma doku endometrium kazımak.
NOT: Yeterli sayıda organoid üretmek için en az 20 mm x 10 mm x 1 mm olan endometrial doku gereklidir.
15 mL konik tüpte enzim çözeltisine taze kıyılmış doku koyun. Kapağı kapatın ve kontaminasyonu önlemek için üst kısmı balmumu filmi(Malzeme Tablosu)ile sarın.
Bir su banyosu veya 37 °C'de bir kuvöz ile tüp koyun 30 dakika hafif sallayarak (80−100 rpm).
50 mL konik bir tüp üzerinde 20 μm hücreli süzgeç üstüne 100 μm hücreli süzgeç yığını. Çözeltiyi iki süzgeçten süzün ve 15 mL konik tüpü Hank'in dengeli tuz çözeltisinin (HBSS) 10 mL'i ile durulayın; Malzeme Tablosu) ve tüm hücrelerin toplanmasını sağlamak için süzgeç aracılığıyla yıkama koymak.
NOT: Akış-sıvı stromal hücreleri ve kırmızı kan hücreleri (~ 20 mL toplam) içerir. Epitel hücreleri 20 μm süzgeç üzerinde toplanır. Sindirilmemiş doku parçaları 100 μm süzgeç üstünde kalır. Sindirilmemiş dokuyu biyolojik tehlike selamı kabına atın.
20 μm hücresüzü adım 2.1.5'ten yeni bir 50 mL konik tüpe ters çevirin ve epitel hücrelerini süzgeçten 20 mL organoid ortam(Malzeme Tablosu)ile yıkayın ve %1 kalem/strep ile tamamlayın.
5 dk için 500 x g adım 2.1.5 ve 2.1.6 konik tüpler santrifüj.
Toplanan stromal hücrelerle, supernatant çıkarın ve kırmızı kan hücresi lisis tampon 10 mL ile pelet resuspend. 37 °C'de 10−15 dk. Konik tüpü 5 000 x g 5 dk için santrifüj edin, süpernatantı çıkarın ve 200−300 μL organoid ortamla peleti yeniden askıya alın (daha fazla talimat için 2.2.2 numaralı adıma bakın).
Toplanan epitel hücreleri ile, supernatant çıkarın ve organoid medya 100 μL ile yeniden askıya (daha fazla talimatlar için adım 2.2.2 bakınız).
24 kuyulu bir tablanın kuyularında %1,5 agarose kalıplarını (kuyu başına 1 kalıp) dengeledikten sonra, agarose kalıplarının dışındaki organoid ortamı çıkarın ve doku kültür plakasını yatırın, böylece agarose yemeklerinin hücre tohumlama odasından orta dikkatle kaldırılır.
Mikroskop altında epitel (adım 2.1.9) ve stromal (adım 2.1.8'den) hücre süspansiyonlarını görüntüleyin. Epitel veya stromal hücre süspansiyonlarına bir seferde 100 μL daha fazla organoid ortam ekleyin, böylece süspansiyonlar yoğunluğu kabaca eşit olur.
NOT: Epitel hücreleri bir araya toplanır ve epitel hücrelerini tek hücresüspansiyonlarına sindirmek/denemek tavsiye edilmez.
Stromal hücrelerin 1 kısmını epitel hücrelerinin 3 bölümü ile hacmine göre birleştirin.
Pipet 50 μL (60.000 hücre) agarose kalıp hücre tohumlama odasına kombine hücre süspansiyon.
Agarose kalıpları hücrelerle doldurulduktan sonra, 24 kuyulu plakanın kuyusuna 400 μL taze organoid ortam ekleyin.
NOT: Ortam agarose yemeklerinin yüzeyinin hemen altına ulaşır ve hücrelerin kalıplardan dışarı süzülmesine neden olmaz. 2−3 gün sonra hücreler yerleşir ve organoidler oluşturmaya başlar.
500 μL organoid ortam ile her iki günde bir orta yıkın.
2-3 gün sonra, epitel ve stromal hücrelerin örgütlenmesini teşvik etmek için 0.1 nM estradiol (E) ve 0.8 nM testosteron (T) ile takviye edilen bir ortam değiştirin.
NOT: Epitel ve stromal hücrelerin organizasyonu hormonlu veya hormonsuz oluşabilir rağmen, daha fazla organoidler hormonların varlığında organize olacaktır.
3. Deneyler için Endometrial Organoidlerin Hasat
NOT: Deney yapıldıktan sonra histoloji veya RNA analizi için endometrial organoidler işlenebilir. Aşağıdaki adımlar organoidlerin nasıl işlenir olduğunu açıklar.
Fosfat tamponlu salinde (PBS) %1.5 agarose kaynatılarak çözün. Sıvı agarose yaklaşık 50 °C'ye soğumasını bekleyin.
Bir diseksiyon mikroskobu altında, 24-iyi plaka tilt ve dikkatle agarose kalıp dışından orta pipet. Organoidleri bozmamak için agarose kalıbının içinden ortayı dikkatlice çıkar.
Bir diseksiyon mikroskobu altında, dikkatle pipet 70-75 ° L sıcak (50 °C) 1.5% agarose agarose çanak odasına. Organoidleri rahatsız etmemeye dikkat edin.
4 °C'de 5 dk soğumaya bırakın.
24 kuyu plakasının her bir kuyuya %4 paraformaldehit (PFA) ekleyin ve 4 °C'de organoidiçeren tüm mühürlü agarose kalıbını düzeltin. Daha sonra 4 °C'de %70 etanolde parafin gömme işlemi ne kadar hazır olana kadar saklayın.
Bir diseksiyon mikroskobu altında, 24-iyi plaka tilt ve dikkatle agarose kalıp odasından orta pipet.
Zorla pipet 1 mL taze organoid orta doğrudan agarose kalıbına böylece organoidler mikrowells dışarı atılır. Çok fazla kabarcıklar oluşturmak için dikkatli olun.
3.2.2 adımdan aynı ortamla pipetlemetekrar tekrarlayın.
Organoidler içeren tüm orta toplayın. Organoidleri toplamak ve RNA ekstraksiyonuna geçmek için maksimum hızda santrifüj.
Protokol şeması Şekil 1'degösterilmiştir. Komindoku patologlar tarafından incelendikten sonra ameliyatla elde edildi. Endometriyal astar kazınarak miyometriumdan ayrılmış ve endometriyal doku enzimatik olarak protokolde belirtildiği gibi hücrelere sindirilmiştir. Epitel ve stromal hücreler agarose kalıplarında mikrowelllere eklendi. Kültürde 7 gün kaldıktan sonra organoidler 7−14 gün daha E ve T ile tedavi edildi.
Histolojik işlemler için, endometriyal organoidler içeren agarose kalıpları agarose ile mühürlendi ve bir gecede %4 PFA ile fiksasyon yapıldı. Bu kalıplar standart parafin katıştırma, kesitli ve histoloji, immünoresans veya immünohistokimya için lekeli olarak işlenmiştir. Hematoksilin ve eozin (H&E) boyama(Şekil 2A)dışında ve merkezdeki hücrelere astar eden tek bir hücre tabakası ile küresel benzeri bir yapı ortaya çıkardı. Endometrial epitel (E-kadherin) ve stromal hücreler (vimentin) için hücrespesifik belirteçler merkezde stromal hücreler ile organoid çevreleyen epitel hücreleri ortaya(Şekil 2B).
Endometrial fizyolojinin belirteçleri endometrial organoidlerin doğal dokunun bazı özelliklerini koruduğunu doğruladı. Kollajen mavisi ve hücreleri kırmızı ile lekeler trikrom boyama, stromal hücrelerin yaşadığı merkezde kollajen varlığını göstererek, doğal dokuya benzer stromal hücreler le kollajenin aktif üretimini ve salgısını göstermektedir(Şekil 3 A). Buna ek olarak, immünohistokimyasal boyama östrojen reseptörlerinin varlığını ortaya (ER), androjen reseptörleri (AR), ve progesteron reseptörleri (PR) hem epitelyal ve stromal hücrelerde(Şekil 3B).
Şekil 1: İnsan primer endometrial hücrelerden iskelesiz 3Boyutlu endometrial organoidlerin üretimi. Uterin dokular benign patolojisi olan premenopozal endometrial dokulardan elde edildi ve doku parçasından endometrial astar çıkarıldı. Enzimatik sindirim üzerine endometrial epitel ve stromal hücreler hacim olarak 3:1 oranında %1.5 agarose kalıplarına tohumlanmış ve 7 güne kadar seks hormonuz ortamda muhafaza edilmiştir. Estradiol (E) ve testosteron (T) adet döngüsünün foliküler faz10 sırasında E ve T düzeylerini taklit etmek ve organoidlerin organizasyonu teşvik etmek için 3D kültürlere eklendi. Teerawat ve ark., JCEM, (2019)11' den uyarlanmıştır.
Şekil 2: Endometrial organoidlerde hücrespesifik belirteçlerinin histolojisi ve immünofloresan boyanışı. Normal adet döngüsünün foliküler evresini taklit eden 14 günlük stepwise hormon tedavisi (7 gün boyunca 0.1 nM E ve 0.8 nM T, 6 gün boyunca 1 nM E ve 0.8 nM T, 1 gün boyunca 1 nM E ve 1.25 nM T) gözlendi. (A) Parafin gömülü organoidlerde H&E boyama yapıldı. (B) Hücre spesifik belirteçleri E-kadherin immünofloresan boyama tarafından değerlendirildi (epitel, kırmızı), vimentin (stromal, yeşil) ve 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; çekirdek, mavi) hangi hücrelerin yapısal organizasyon ortaya organoidler. Ölçek çubuğu = 20 μm. Teerawat vd., JCEM, (2019)<11' den uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Endometrial organoidler 14 günlük foliküler faz hormonu tedavisinden sonra yerli doku karakteristiklerini sergilerler. (A) Kollajen (mavi) ve hücreleri (kırmızı) görselleştirmek için trikrom boyama yapıldı. Trikrom leke endometrial doku (sol panel) ve endometrial organoidler (Ölçek çubukları = 20 μm, sağ panel) üzerinde yapıldı. (B) Endometrial dokularda (Ölçek çubuğu = 100 μm alt paneller) ve endometrial organoidlerde (Ölçek çubuğu = 20 μm, üst panellerde) ER, AR ve PR için immünohistokimyasal boyama yapıldı. Pozitif leke kahverengi olarak gösterilir ve hematoksilin leke çözeltisi mavi gösterilen karşı leke olarak eklenmiştir. Teerawat ve ark., JCEM, (2019)11' den uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ekzojen iskele malzemeleri kullanılmadan endometriumun epitel ve stromal hücrelerinden oluşan insan endometriyal organoidleri ürettik. Birincil endometrial epitel hücrelerininorganoidler6,7oluşturabildiği gösterilmiş olsa da, bu hücreler fare sarkom hücreleri tarafından salgılanan jelatinimsi bir protein matrisine gömülmüştür (bkz. Malzemeler Tablosu) spheroid benzeri yapılar oluşturur. Buna ek olarak, endometrial stromal hücreler yoktu. Sistemimizdeki endometrial dokunun önemli bir destekleyici bileşeni olan stromal hücrelerin, epitel hücrelerinin uyması için iskeleyi sağladığını ve hücre tipleri arasında parakrin sinyalleme nin meydana geldiğini tahmin ediyoruz. Stromal hücrelerin etrafındaki epitel hücrelerinin organizasyonu, fizyolojik ipuçlarını sağlayan iki hücre tipi arasında aktif bir etkileşim olduğunu göstermiştir. Endometriumun hormonal yanıtı epitel ve stromal hücreler arasındaki parakrin etkileşimlere dayandığından4,8,9, çok hücreli organoidlerimiz yerlinin alternatif, daha karmaşık bir mimik Doku.
Burada üretilen organoidler çoğunlukla somatik hücrelerdi, ancak hücrelerin küçük bir yüzdesi kök benzeriydi. Bu organoidleri nesiller boyu süreyle kabul etmedik ve hayatta kalıp yaymayacaklarını bilmiyoruz. Buna ek olarak, endometrial organoidler doğada tüm organoidler epitel, stromal veya kök hücre aynı sayıda içerdiği değil, hatta aynı doku dan kaynaklanan heterojen. Organoidlerin boyutları da farklıydı ve çoğu hücre yapılar gibi küresel bir hastalık oluştururken, her mikrokuyudaki gevşek hücreler gözlendi. E ve T varlığı merkezde dış ve stromal hücreleri astar epitel hücrelerinin özel organizasyonu ile organoid oluşumu teşvik ortaya çıktı. Tek başına E veya T'nin organoid oluşumunu destekleyip teşvik etmeyeceğini ve en uygun tedavi süresinin ne olacağını test etmedik. Parametrelerin ve koşulların ek test planlanan deney için uygun ideal endometrial organoidler oluşturmak için yararlı olacaktır.
Orta büyüme ve sağkalım teşvik etmek için organoidler kültür önemli bir bileşenidir. Endometrial hücrelerle çalışma deneyimimizden, kültürdeki epitel hücrelerinin büyümesi, iyi yayılan stromal hücrelerin aksine en zor olandır. Epitel hücre kökenli meme kanserinin mammospheres ve tümörspheres oluşturmak için kullanılan tercih organoid medya(Malzeme Tablosu)dahil olmak üzere farklı ortamlar test edildi. Testlerimiz, bu orta ortam organoidlerinin 14−28 günlük kültürler boyunca yapısal bütünlüklerini ve canlılıklarını korumalarına izin verdiğini ortaya koymuştur. Ancak bu ortamın stromal hücreler üzerindeki etkisinin ek bir araştırma yapılması gerekmektedir. Organoid ortamda kollajen in sağkalımı ve üretimine rağmen, 3Boyutlu kültürde gözlenen proliferasyon oranı monokatlarda olduğundan çok daha düşüktü. Ancak çoğalma da 3D yapısından kaynaklanabilir. Kullanılan organoid ortam ticari olarak kullanılabilir olduğu göz önüne alındığında, orta bileşenleri tescilli doğası nedeniyle belirsiz kalır.
İleride yapılan çalışmalarda, bu endometrial organoidlerin karmaşıklığının endotel ve immün hücreler de dahil olmak üzere endometriumda bulunan diğer hücre tiplerini bir araya getirerek arttırılması öngörülmektedir. Bu mühendislik biyoloji, fonksiyon, hastalık çalışma ve ilaç test etmek için kullanılabilecek tam bir endometrial mimik sadece başlangıcıdır.
Bu çalışma NIEHS/NIH/NCATS UG3 hibe (ES029073) ve Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge fund (JJK) tarafından finanse edilmiştir. Biz parafin katıştırma için sabit organoidler işleme için Northwestern Patoloji Çekirdek Tesisi kabul etmek istiyorum. Woodruff, Burdette ve Urbanek laboratuvarları da dahil olmak üzere tüm UG3 ekibini anlayışlı tartışmalar ve işbirlikleri için kabul etmek istiyoruz.