Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification | Protocol (Translated to Turkish)
Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma
Biz doğru bir şekilde sıvı Kromatografi yüksek çözünürlüklü bir Kütle Spektrometre için arabirim ile proteinler ile izobarik etiketleme, geniş ayırma, Biyoinformatik araçlarını ve kalite kontrol adımları birlikte quantitate için bir protokol mevcut.
Kütle spektrometresi (MS) birçok olağanüstü gelişmeler yaptık-sıvı Kromatografi (LC) belirli teknik ilerleme ile tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) ve izobarik etiketleme çoğullama kapasite birleştiğinde proteomik dayalı. Burada, bir geniş LC/LC-MS/MS platform ve doğru bir şekilde tüm proteomes quantitate için sonrası MS Hesaplamalı girişim düzeltme ile etiketleme 10-plex tandem toplu etiket (TMT) birleştiren bir derin-proteomik profil oluşturma protokolü tanıtmak. Bu iletişim kuralı aşağıdaki temel adımları içerir: protein ayıklama ve sindirim, TMT etiketleme, 2-boyutlu (2D) LC, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ve sayısal veri işleme. Kalite kontrol adımları sorun giderme ve deneysel varyasyon değerlendirmek için dahil edilir. 10.000'den fazla proteinler memeli örnekleri arasında güvenle bu iletişim kuralı ile quantitated. Bu iletişim kuralı küçük değişiklikler ile sonrası translasyonel modifikasyonlar Nefelometri için uygulanabilir. Bu çoğaltılmış, sağlam yöntemi karmaşık örnekleri, hücre kültürü, hayvan doku ve insan klinik örnekler de dahil olmak üzere çeşitli proteomik analiz için güçlü bir araç sağlar.
Yeni nesil sıralama teknolojisindeki ilerlemeler biyolojik sistemleri ve insan hastalık çalışmak için yeni bir manzara açmıştır. Bu ölçümler genom, transcriptome, Proteom, metabolome ve diğer moleküler sistemlerin somut olmak için çok sayıda izin vardır. Kütle spektrometresi (MS) analitik kimya en hassas yöntemlerinden biridir ve proteomik uygulaması hızlı bir şekilde insan genomu sıralama sonra genişledi. Proteomik alanında, son birkaç yıl içinde MS tabanlı kantitatif analizleri, izobarik etiketleme ve araçları yanı sıra kapsamlı sıvı Kromatografi ile birlikte yeteneği çoğullama da dahil olmak üzere önemli teknik gelişmeler vermiştir , daha hızlı, daha doğru ölçümler için daha az örnek malzeme gerekli izin ilerler. Nicel proteomik proteinler ve ardından değişiklikleri son derece karmaşık biyolojik örnekleri1,2,3,4 , on binlerce profil oluşturma için genel bir yaklaşım haline gelmiştir , 5 , 6.
Çoğaltılmış izobarik etiketleme gibi yöntemleri izobarik etiketi göreli ve mutlak Nefelometri (örneğin, iTRAQ) ve tandem kitle etiketi (TMT) MS için büyük ölçüde örnek işlem hacmi geliştirilmiş ve tek bir analiz örnekleri sayısı arttı 1,6,7,8deneme. Yanı sıra diğer MS tabanlı Nefelometri yöntemleri, etiket içermeyen Nefelometri ve kararlı izotop amino asitler (örneğin, SILAC), hücre kültüründe ile potansiyel proteomik teknikler etiketleme gibi önemli9 alandır ,10,11. Örneğin, TMT yöntemi 10 protein örneklerini birlikte 1 deneyde 10-plex reaktifler kullanarak çözümlenmesi için izin verir. Bu yapısal olarak özdeş TMT etiketleri aynı genel kitle var, ama ağır izotoplar differentially böylece göreli Nefelometri etkinleştirme her etiket, MS/MS parçalanma sırasında bir benzersiz muhabir iyon kaynaklanan karbon veya azot atomu dağıtılır 10 örnekleri arasında. TMT strateji rutin olarak biyolojik yollar, hastalık ilerleme ve hücresel12,13,14çalışmaya uygulanır.
Önemli teknik gelişmeler sıvı Kromatografi (LC)-MS/MS sistemleri, LC ayırmaları ve Nefelometri doğruluk ödün vermeden protein tanımlama en üst düzeye çıkarmak için MS parametreleri açısından hem de gelişmiş var. İlk boyut peptidler ikinci boyutu için yüksek dikeylilik ile ayırma tekniği ile20maksimum sonuçlar elde etmek için av tüfeği proteomik yöntemi bu tür kritik ayrılmasıdır. Yüksek pH ters fazlı sıvı Kromatografi (RPLL) geleneksel güçlü katyon değişim Kromatografi20daha iyi performans sağlar. Yüksek pH RPLL düşük pH RPLL ikinci bir boyut ile birleştirildiğinde, hem analitik dinamik alan ve protein kapsamı, Bütün-Proteom analizleri15 işlemi sırasında toplu ifade proteinlerin tanımlama yeteneği içinde kaynaklanan artırıldı ,16,17,18. Diğer teknik gelişmeler küçük C18 parçacıklar (1.9 µm) içerir ve genişletilmiş uzun sütun (~ 1 m)19. Ayrıca, diğer önemli iyileştirmeler hızlı tarama hızları, geliştirilmiş hassasiyet ve çözünürlük20ve MS veri madenciliği21sofistike Biyoinformatik boru hatları ile Kütle Spektrometreleri yeni sürümlerini içerir.
Burada, duyarlılık ve işlem hacmi, kalite kontrol mekanizmaları deneme boyunca odaklanan geliştirmek için değişiklikler ile en son metodolojiler birleştirmek detaylı bir protokol açıklayın. Protokol protein ayıklama ve sindirim, 10-plex TMT etiketleme, temel pH ve asit pH RPLL ayırma, yüksek çözünürlüklü MS algılama ve MS veri işleme (şekil 1) içerir. Ayrıca, sorun giderme ve deneysel varyasyon değerlendirmek için çeşitli kalite kontrol adımları uygulayın. Bu ayrıntılı iletişim kuralı düzenli olarak tanımlamak ve doğru bir şekilde proteinler üzerinden bir lysate binlerce quantitate araştırmacılar yeni alana yardımcı olma amacını taşıyan veya doku.
dikkat: tüm ilgili güvenlik veri sayfaları (Yani, MSDS) kullanmadan önce lütfen danışın. Lütfen tüm uygun güvenlik uygulamaları bu iletişim kuralını kullanırlar.
Not: 10 örnekleri Proteom Nefelometri için kullanılan bir TMT 10-plex izobarik etiket reaktif küme Bu protokol için.
1. hazırlık hücreler/doku
Not: düşük sıcaklıkta proteinlerin biyolojik durumlarına içinde tutmak için en az sürede örnekleri toplamak için çok önemlidir.
10 cm 10 mL buz iki kez plakalı (örneğin, HEK 293 hücreleri) yıkama yapışık hücreleri soğuk fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS). Scrape ve PBS 1 mL (~ 2 x 10 6 hücreler) hücrelerde toplamak. Aktarım için 1,5 mL tüpler ve 600 x g 4 ° C. mağaza hücre granül-80 ° C'de, 5 min için de Santrifüjü lizis kadar sonra PBS kaldırmak.
Not: Bir pilot deney genellikle protein verim incelemek için gerçekleştirilir. Yaklaşık 1 mg protein çıkarılan 10 x 10 6 memeli hücreleri veya bir 15 cm tabak ile % 80 izdiham.
Alternatif olarak, yıkandıktan sonra plaka doğrudan lizis arabelleği ekleyerek onların plaka üzerinde yapışık hücreleri parçalayıcı. Lysates 1.5 mL tüpler içine toplamak ve protokol açıklama adım 2.5 kullanın.
15 mL tüpler, iki kez yıkama
toplamak süspansiyon hücrelerde buz soğuk PBS 10 mL ile 1,5 mL tüpler içine aktarmak ve santrifüj kapasitesi 600 x g de PBS kaldırmak için. PBS tamamen lizis tampon maddeler istenen konsantrasyonu korumak için yıkama adımlardan kaldırın. Saklamak hücre granül-80 ° c kadar lizis.
Toplamak ve dokularda hızla tartın. Dokulara sıvı azot diseksiyon ve mağaza hemen sonra devam-80 ° C.
Not: Dokulara protein verimini yaklaşık % 5 için % 10 doku ağırlığının olduğunu
homojen doku boyutlarını ve anatomik bölgeler için 10 örnekleri örnek heterojenite azaltmak için kullanın. Kan kirlenme örnekleri buz soğuk PBS protein Nefelometri ve aşağı akım veri analizi etkileyen son derece bol kan proteinleri önlemek için 1 mL ile iki kez durulama tarafından kaldırmak.
2. Protein çıkarma, kalite kontrol Western Blot, çözüm sindirim ve peptid Desalting
Not: her 10 işleme aynı şekilde önce TMT etiketli örnekleri havuzu azaltmak için gerekli kadar herhangi bir adımı sırasında örnekleri varyasyon.
Olun lizis arabellek (50 mM HEPES [pH 8,5], 8 M üre ve % 0,5 sodyum deoxycholate) denemenin gün.
Not: Kısmi proteini denatürasyon örnek lizis sırasında protein sindirimi verimliliği etkiler.
Numune hacmi arabelleğe oranı 10:1 ve cam boncuk (0.5 mm çapında) son hacminin ~ %20 hücre topakları veya doku (örneğin, arabellek ve örnekleri arasında 10: 1 hacim oranı) son protein konsantrasyonu 5 elde etmek böylece
Ekle lizis tampon 10 mg/mL. Kullanılan hücre sayısı veya doku örnekleri ağırlığını dikkate alarak tüm 10 örnekleri aynı konsantrasyonu tutmak.
Koru üre konsantrasyon için örnek katı üre ekleyerek 8 m. Hücre Pelet veya doku hacmi 8 M toplama ulaşmak için örnek eklemek için katı üre miktarını hesaplarken dikkate unutmayın.
Not: Un taze üre arabellek yapay kimyasal değişiklik (örneğin, protein carbamylation) tanıtmak ve tespit peptidler sayısını olumsuz yönde etkiler. Üre hatırı sayılır bir hacim kaplar (üre 100 mg ~ 73 µL çözümde kaplar).
Çözünmez enkaz lysate sindirim çözünmez proteinler 23 izin vermek için devam.
Lyse hızda 8 4 ° C'de 30 s, 5 s ve yineleme boyunca'bir karıştırıcıda örnekleri 5 kere veya örnekleri homojenize oluncaya kadar. Örnekleri de 30 vortexing tarafından lysed (RT) oda sıcaklığında 30 s s ~ 10 döngüleri için buz dönemi soğutma. Lizis koşulları örnek türüne bağlı olarak gerektiği gibi ayarlayın.
Lysate iyi Santrifüjü olmadan ve 2 küçük aliquots (~ 15 µL her). Ölçü protein konsantrasyonu 1 aliquot ve 1 aliquot western blot analizi gerçekleştirerek olumlu denetim doğrulama gerçekleştirmek için kullanın. Kalan büyük aliquot proteomik analizi için devam.
Ölçü protein konsantrasyonu bir standart protein Nefelometri tahlil veya bir Coomassie lekeli kısa Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide jel (% 10) 22 sığır serum albumin (BSA) ile standart olarak. BSA standart bilinen konsantrasyon doğruluğu yüksek bir derece ile kullanın. En yüksek doğruluk düzeyine ulaşmak için BSA standart amino asit analizi gerçekleştirin.
Not: Diğer doğru standartları mevcut olabilir. Protein konsantrasyonları da hücre sayıları veya doku ağırlıkları tarafından tahmin edilebilir. Protein (100 µg/örnek) 1 mg önerilir, ancak analizi ile protein (10 µg/örnek) kadar az 100 µg gerçekleştirilebilir.
%10 ACN ve LysC proteaz son derece RT koşulları 2 h 1 için denaturing altında protein sindirimi (w/w) 1: 100 bir enzim Substratı oranında son bir konsantrasyon elde etmek için
Ekle % 100 Asetonitril (ACN). Son bir konsantrasyon disülfür bağları proteinlerde azaltmak ve 1 h. gerçekleştirmek LysC sindirim, 7.2 M üre son bir konsantrasyon için kuluçkaya 1 mm dithiothreitol (DTT) ekleyin.
2 M üre ile 50 mM HEPES (pH 8,5) örnekleri ve daha fazla Özet örnekleri 3 h için RT, tripsin ile seyreltik veya bir tripsin protein oranı 1:50 (w/w) vasıl gece. Tripsin 100 µg protein ve yaklaşık 10 ng/µL tripsin konsantrasyon için kullanım yaklaşık 2 µg.
Not: verimsiz tripsin sindirim için yol açabilir pH sorunları, etkin olmayan tripsin veya enzim substrat için uygunsuz bir oranını kullanımı faktörlerdir.
DTT 1 mM verim ve peptidler RT. 2 h için daha da azaltmak için Ekle
Ekle iodoacetamide (IAA) 10 mM elde etmek için. RT peptidler Cys içeren alkylate için karanlıkta 30 dk için kuluçkaya.
30 mM ulaşmak için ve dik, 30 dk için kuluçkaya DTT ekleyerek unreacted IAA gidermek
Küçük bir aliquot her örneği inceleyerek tripsin sindirim verimliliğini kontrol edin. Ölü boşluk içinde gömülü Kromatografi medya ile 10 µL pipet ucu kullanarak üreticiye göre desalt ' s protokolü. Her örneğini analiz LC-MS/MS. LC-MS/MS tarafından adım 5, degradenin 10 dk 23 ' tür istisna ile aynı parametreleridir.
Bir arama parametresi olarak 4 cevapsız nefrette kullanarak MS ham veri (bkz. Adım 6 daha fazla detay) için bir veritabanı arama gerçekleştirmek.
Not: kesim sayısını cevapsız ise > % 10, eksik tripsin sindirim gösterebilir. Bu akış aşağı sonuçları olumsuz etkiler. Bu kritik kalite kontrol (QC) adımdır.
Sindirmek örnekleri tekrar cevapsız bölünme ise > % tripsin ek bir 10 µL örnekleri için ekleyerek 10.
Örnekleri trifluoroacetic asit (%1 konsantrasyon ulaşmak için TFA) ekleyerek acidify. PH pH şerit kullanarak ölçün. PH bahis doğrulayın2 ve 3 ween. Doğru pH elde kadar gerektiği gibi daha fazla TFA damla bilge (1 µL) ekleyin.
10 dk ve süpernatant toplamak için RT de 20.000 x g, santrifüj.
Yıkama 60 0,5 µg kapasite spin C18 ters fazlı reçine 0.25 mL metanol ile 100 µg örnekleri kullanıyorsanız içeren sütunlar. 0.03 30 µg kapasite spin sütunları ile %60 0.25 mL yıkama ACN/0.1% 10 µg örnekleri kullanıyorsanız TFA. 500 x g 30 spin sütunların santrifüj kapasitesi s.
0,5 mL %0.1 TFA ve Kaldır sütunlarla 500 x g 30 için de centrifuging tarafından equilibrate s.
Yük örnekleri sütunlarda ve örnekleri Santrifüjü 100 x g 3 dk ya da tüm örnek sütunu boyunca geçene kadar tarafından sütunları bağlayın.
%0,1 0.5 mL ekleyin TFA sütunları ve santrifüj 500 x g, 30 s.
Ekleyin 125 µL % 60 ACN/0.1% TFA her sütun için ve 100 x g 3 dk. emin olun tüm çözüm sütunu boyunca geçti de centrifuging elute.
Vakum yoğunlaştırıcı eluents kuru. Örnekleri tamamen kuru ve Hayır sıvı kalır tüpler içinde olduğundan emin olun. -80 ° c daha fazla analiz kadar mağaza.
3. TMT etiketleme peptidler
Not: tüm örneklerini TMT reaktifler tarafından tam olarak etiketlenir sağlamak için önemlidir. Çeşitli faktörler (örneğin, miktarı kullanılan TMT reaktifler, pH değeri ve protein Nefelometri doğruluğunu) olumsuz tüm aşağı akım sonuçları değiştirecek verimliliği etiketleme TMT etkileyebilir.
Sulandırmak her 50 mM HEPES tampon (pH 8,5) 50 µL peptid örnek desalted. PH kontrol edin ve 7 ile 8 arasında olduğundan emin olun.
Not: Örnek tamamen etiketleme verimliliği etkiler desalting adımdan sonra kurutulmuş değil Eğer asidik olabilir.
~ 1 µg etiketlenmemiş her örneği için bir sonraki TMT etiketleme verimliliği test, 3.3 adımda anlatıldığı gibi devam.
Dağıtılması susuz ACN TMT reaktifler ve üretici takip ederek peptid örnekleri etiket ' s yönergeleri. 1 h. RT, Kimyasalları kuluçkaya
Desalting ~ 1 µg TMT etiketli ve - etiketsiz her örneğinin tarafından üretici göre katıştırılmış Kromatografi medya ile 10 µL pipet ipuçlarını kullanarak bir QC TMT etiketleme verimliliği test
gerçekleştirmek ' s protokolü. TMT etiketli ve etiketsiz örneklerini LC-MS/Bayan tarafından
Not: LC-MS/MS parametre ile bölüm 5, degradenin 10 dk. olduğunu istisna ile aynıdır
Ham veri etiketlenmemiş peptidler etiketli örnekleri tam etiketleme verimliliği ( Şekil 2) sağlanması, tespit edilmedi emin olmak için incelemek. 6-10 ayrı peptidler etiketleme etkinliğini doğrulamak için bunu.
4 µL % 5 hydroxylamine ekleyerek tepki gidermek ve 15 dk. için kuluçkaya
Küçük ve eşit birim (2 µL) aliquot TMT etiketli her örneğinin karıştırın. Katıştırılmış Kromatografi medya ile 10 µL pipet ipuçlarını kullanarak desalt. 3.4. adımda açıklandığı gibi örnekleri LC-MS/MS tarafından analiz. ATLAMA yazılım programına (peptidler ve proteinler listesine tandem MS raw dosyalarını dönüştüren bir açık kaynak veritabanı arama algoritması) tarafından tüm TMT etiketi yoğunluklarda tüm 10 örneklerini göreli yoğunlaşmasını oranını belirlemek için tanımlanan peptidler.
Not: Bu QC Premiks oran testi eşit final havuzu önce karıştırma için doğru oranını belirlemek yararlıdır, pipetting hatalar oluşabilir gibi bu konsantrasyonları değişecek ve protein Nefelometri adım her zaman doğru olmayabilir. O da her biri son karıştırmak için kullanılan 10 örnekleri miktarı eşit bir oranında tüm 3.5 adımda anlatıldığı gibi olması için en iyi yoldur.
1:1 oran tüm 10 örnekler üzerindeki ulaşmak için gereken birçok kez yineleyin.
Eşit Premiks oran testi sonuçlarına göre 10 örnekleri karıştırın. 9 diğer örnekleri birimleri ayarlamak için temel olarak en düşük konsantrasyon ile örnek kullanın.
Desalting tarafından havuza alınan TMT etiketli örnek su verme tepki yan kaldırmak.
Yıkama 1 mL katı fazlı ayıklama kartuşları 50 mg jelleştirici sütun ile 1 mL/0.25 mL metanol başına 100 µg örnekleri kullanıyorsanız içeren. 0,5 - 60 µg kapasite C18 spin sütunları ile 1 mL/0.25 mL % 60 yıkama ACN/0.1% 10 µg örnekleri kullanıyorsanız TFA. Santrifüj kapasitesi 500 x g 30 sütun s.
Yük örnekleri sütunlarda ve bağlamak vasıl 100 x g 3 dk ya da tüm örnek geçti kadar sütunu boyunca aralıklarla tarafından.
4. Geniş yüksek çözünürlüklü, temel pH LC Prefractionation
Set up 2 bağlı C18 sütun Köprülü etilen hibrid parçacıklar (4.6 mm x 25 cm 50 cm toplam alma, 3,5 µm partikül büyüklüğü) içeren ve microliter akışı yüksek performanslı LC pompa için kullanın ayırma.
Not: 2 sütun kullanımı peptid yükü artırır ve mutlaka Kromatografi iyileştirmez. Numune içeren ≤ 200 µg peptidler, 1 sütun yeterli.
Sonraki eklemeler 300 µL her metanol, su ve arabellek A (10 mM amonyum format, pH 8.0) ile 100 µL döngü yıkayın.
Sütunları 100 µL eşit karma isopropanol, metanol, ACN, ve su ile yıkama ve % 95 arabellek 2 h. A sütununda equilibrate
Solubilize desalted havuza alınan TMT etiketli peptid örnek 65 µL arabelleği A. örnek pH ~ 8.0 olduğunu doğrulayın. Hala asidik, amonyum hidroksit 8,0 pH ayarlamak için kullanın.
Aşağıdaki degrade ile tampon B kullanarak
Fractionate örnek (tampon bir artı %90 ACN): 15dk için % %15 20, 100 min için % %20 35 ve % 35 ila %50 30 dakika süreyle her 2 yükleme süresi de dahil olmak üzere min kesirleri toplamak için kesir toplayıcı ayarla. Akış hızı 0.4 mL/dk için ayarlayın. Bkz: bir temsilcisi Kromatografik için başvuru 29 ve şekil 1.
Toplam 80 kesirleri toplamak ve 40 kesirler (her diğer kesir) tam kuruluk için vakum yoğunlaştırıcı ile kuru.
LC-MS/MS analiz için 40 kurutulmuş örnekleri kullanır.
Tüm 80 kesirler Ultra derin Proteom kapsama alanı elde etmek için LC-MS/MS tarafından analiz.
5. LC-MS/MS hazırlık ve parametreleri
Not: Nefelometri içinde TMT tabanlı, peptid iyonları izobarik ve 1 seviye bir MS1 inceden inceye gözden geçirmek, son olarak görünür. Peptid iyon daha yüksek enerji çarpışma ayrılma (HCD) ile parçalanmış sonra ancak, onlar muhabir iyonları (10 benzersiz muhabir iyonları) yoğunluğuna göre MS/MS tarama quantitated. TMT muhabir iyon oranları TMT etiketli iyonları 24 ortak elüsyon bastırılmış. İyon yalıtım pencere 25, gaz fazlı arıtma 26, MultiNotch MS3 yöntemi 27 veya çok boyutlu LC ve uzun gradyanlar (4-8 h) ile geniş ayırma daralma 28 alternatif yaklaşım vardır.
Pack 75 µm iç çapı (ID) boş C18 reçine için 30-40 cm uzunluk (~1.3 µL yatak cilt) 1.9 µm sütunlarla.
Backpressure azaltmak ve ultra-yüksek-baskısı baskı üzerine önlemek için bir kelebek portföy ısıtıcı ile sütunları 65 ° c ısı sıvı Kromatografi (UPLC) sistemi. Sütunun tamamını Yatak uzunluk ısıtılır emin olmak için 2-3 kat kelebek ısıtıcı içinde sütun Kangal. Sütun üzerinde ısıtıcı içinde sıcaklık sensörü teyp değil dikkatli olmak ısıtıcı içine teyp.
Not: Kelebek portföy ısıtıcı monte ve pleksiglas araç XYZ aşamasına bağlı özel yapım bir parçası üzerine bantlanmış.
Hazırlama bir (% 3 Dimetil sülfoksit ve %0,2 formik asit) tampon ve B tampon (artı % 67 arabellek ACN) ve sütunları % 95 arabellek B. ile iyice yıkayın O zaman, tam olarak sütun % 95 arabellek A (en az 3 sütun birimler) equilibrate. Bir akış hızı ~0.25 µL/dk ve 280-320 bara backpressure kullanın
İncelemek LC-MS/MS sistem kalitesini 100 çalıştırarak ng sıçan beyin peptidler (veya standart bizim seçim) TMT etiketli örnekleri analiz daha önce iki kez. Sık sık yüksek kaliteli veri toplama emin olmak için aşağıdaki parametreleri denetleyin: MS sinyal yoğunluğu (e8 ve temel en yüksek yoğunluk için e9) arasında anket MS/MS spectra (y ve b iyonlar iyi bir temsil), en yüksek Genişlik (12-22 s), genel saklama süresi, kalite LC sistem basıncı (basınç yükselmesi > 50 barlar gösterir bir kirli sütun veya tıkanmış emitör ipucu) ve koş koş değişkenliği (aynı tepeler-meli var olmak < 30 s arasında çalıştırır).
Not: 10-plex TMT reaktifler (6,32 mDa fark) yakınındaki izobarik muhabir iyonları gidermek için MS/MS çözünürlük için en az 30.000 400 m/z olarak ayarlanmalıdır. İyon kapanı aletleri indüklenen çarpışma ayrılma (CID) uygulandığı üçte kural tabi değildir gibi PİLGRİM6A TMT10-plex muhabir iyon parçalanma için genellikle kullanılan.
Temiz ve düzenli olarak MS enstrüman kalibre ve sistem performansını artırmak için taze LC arabelleklerini kullan.
% 5 temel pH ayrılması kurutulmuş peptidler reconstitute TFA.
~0.2 µg akan %5 arabellek A. süre sütun üzerinde yük
Elute ile % %15 45 arabelleği B 150 dak. Aşağıdaki degradenin başlangıç noktası olarak kullanın: 0, arabellek B %5; zaman zaman 2, arabellek B %15; 135, arabellek B %45 zaman, 145, arabellek B %70 zaman; ve 150, arabellek B %95 zaman. Temel pik chromatograms inceledikten sonra biraz erken ve geç temel pH RPLL kesirler için degrade ayarlayın.
Veri bağımlı modunda Kütle Spektrometre iyon kapanı kitle çözümleyici (400-1600 m/z; 60.000 çözünürlük; 1 x 10 6 otomatik kazanç kontrolü (AGC) hedef; 50 ms Maksimum iyon süresi; ve centroid modu)'bir anket tarama ile çalışır. 20 MS/MS yüksek çözünürlüklü taramaları (60.000 çözünürlük, 1 x 10 5 AGC hedef, ~ 100 ms Maksimum iyon süresi, 35 normalleştirilmiş PİLGRİM6A çarpışma enerji, 0.4 m/z yalıtım pencere ve 20 s dinamik dışlama) gerçekleştirmek.
Not: ETD bölünme siteleri PİLGRİM6A farklı olduğu için elektron transferi ayrılma (ETD) TMT10-plex Kimyasalları muhabir iyon birbiri üzerine çakışması sonucu tavsiye edilmez. Çünkü tryptic peptidler genellikle + 2 şarj edilmiş Birleşik oluşturmak ve ETD daha verimli daha yüksek ücret Birleşik PİLGRİM6A olduğu gibi Ayrıca, ETD etkili değildir.
6. MS veri analizi
Not: veri analizi atlama yazılım programı ile açıklanmaktadır. Ancak, diğer ticari olarak kullanılabilir veya ücretsiz programlarla veri analizi gerçekleştirilebilir.
Etiket tabanlı melez ile Kütle Spektrometre süreç raw dosyaları arama bir desen tabanlı veritabanı arama ve duyarlılık ve özgüllük geliştirmek için bir etiket tabanlı de novo sıralama birleştiren motoru atlama 21,.
MzXML için convert ham veri biçimlendirmek ve MS2 spectra yanlış bulma oranı (FDR) hesaplamak için hedef-yem UniProt insan veritabanı (veya diğer uygun species-specific veritabanı) karşı arama.
Gerçekleştir habercisi ve parça iyonları için 10 ppm kitle tolerans kullanarak arar. 2 en fazla cevapsız nefrette, başına peptid 3 en fazla değişiklik siteleri ve atama , b, ve peptidler puanı için y iyonları ile tam olarak tryptic kısıtlama için diğer arama parametrelerini ayarlayın. Lys artıkları ve N termini TMT Etiketler statik değişiklikler ayarlayın (+229.162 Da) ve Cys kalıntılarının carbamidomethylation (+57.021 Da). Ayarla Met oksidasyon eklemek için dinamik değişiklikler (+15.994 Da), örnek işleme kaynaklanan ortak bir peptid eseri olduğu.
Tarafından aşağıdaki verilere filtre uygulama ölçütleri: 7 amino asit en az peptid uzunluğu, m/z doğruluk (örneğin, 5 ppm) ve eşleşen puanları (J puanı ve deltaCn). Grubuna göre peptid uzunluğu, trypticity, peptidler ve şarj devlet.
Puanları eşleştirerek filtreleme ek bir düzeyi protein FDR için % 1 aşağıda azaltmak için kullanın. Bir tek spektral sayısına göre tespit proteinler gerektiren eşleşen puanı ne kadar yüksekse.
1 Grup eşleşen protein üyeler birden fazla protein ailesi üyeleri tarafından paylaşılan peptidler küme için.
Not: cimrilik ilkesine göre grup atanan peptidler en yüksek sayıda protein ve benzersiz peptidler 1 tarafından eşleşen diğer proteinler tarafından temsil edilir.
Tüm eşleşen peptid spektrum maçlar (PSMs) arasında atlama yazılım paketi içine inşa edilmiş bir program kullanarak muhabir iyon sayıları toplayarak proteinler quantitate.
Her PSM kabul için ayıklamak ve TMT muhabir iyon yoğunluklarda etiketleme reaktifleri ve küresel PSM Nefelometri verilerden hesaplanan yükleme önyargı izotopik dağıtımını göre doğru. PSMs sırasında Nefelometri ile düşük yoğunluklu ve yüksek gürültü seviyesi kullanıcı tarafından tanımlanmış eşikleri ile filtre.
Ortalaması tüm 10 gazeteci iyonlar arasındaki her muhabir iyon göreli sinyal hesaplayın. PSMs göreli sinyaller saptanan proteinler için toplamı. Bu göreli sinyaller ilk 3 PSMs karşılık gelen proteinler ortalama muhabiri iyon yoğunluğunu çarparak mutlak sinyallere dönüştürmek.
Önlemlerden sonrası MS Hesaplamalı yaklaşımı kullanın. Y 1 iyon yoğunluğu muhabir iyon yoğunluğu için orantılı olduğunu varsayarak, temiz taramaları doğrusal ilişki hesaplamak ve gürültülü taramaları 23 yılında kirlenmiş y1ion yoğunluk girişim düzeyi türetin.
Not: TMT etiketli tryptic peptidler için K-TMT ve R artıkları 2 y 1 iyonlar türleridir (376.27574 Da ve 175.11895 Da, sırasıyla) MS2 taramaları. Yalnızca 1 y 1 iyon algılanır ve tanımlanan peptid ile tutarlı, MS2 temiz tarama ( şekil 3A) olarak kabul edilir. Her iki y1ions algıladıysa, gürültülü bir tarama MS2 sayılır.
Protein Nefelometri değerler daha ayrıntılı analiz için bir elektronik tablo yazılım programına dışa aktarın. İkili karşılaştırmalar veya bir Varyans analizi differentially ifade edilir proteinler tanımlamak için kullanın.
7. MS veri doğrulama
Not: MS verilerin kalitesini değerlendirmek için en az 1 yöntemi doğrulama zaman alan biyolojik deneyler işlemine devam etmeden önce gerçekleştirilmelidir.
El ile MS/MS spectra peptit dizisi ve TMT muhabir iyon Nefelometri doğrulamak ilgi proteinlerin inceleyin.
Protein Nefelometri veri bilinen kullanım MS sonuçları onaylamak için.
Doğrula protein değişiklikleri antikoru tabanlı yaklaşımlar (örneğin, weste ileRN leke ve immünhistokimya analizi).
Kimyasal olarak faiz peptidler sentez ve onları olarak kendi standartlarına yerli peptidler tanımlaması onaylamak için kullanın.
Not: MS/MS desen ve tutma zamanı LC-MS/MS sırasında aynı olması gerekir.
Protein değişiklikleri bir hedeflenen MS yaklaşımla doğrulamak.
Yukarıda açıklanan türler arası peptid mix sistematik olarak oranı sıkıştırma pre-MS ayırma, MS ayarları ve post-MS düzeltme23gibi 3 büyük protokolü adımda etkisini analiz için kullanılan. Pre-MS ayırma değerlendirilir ve bir temel pH RPLL kombinasyonu ve asidik pH RPLL kullanarak en iyi duruma getirilmiş. Post-MS analiz için sadece species-specific peptidler kabul edildi. Biz bu girişime model bir dizi parametre LC/LC-MS/MS2 yalıtım pencere, online LC çözünürlük, online asidik pH RPLL miktarda yükleme ve çevrimdışı yüksek pH RPLL çözünürlük gibi MS, incelemek için kullanılan (bkz. şekil 3 başvurusunda 29).
Sırasında çevrimdışı LC çözünürlüğünü değiştirmek için izobarik etiketli peptidler 320 kesirler ayrılmış ve sonra birlikte ayrılık güç ayarlamak için seçili kesirler kombine. Çevrimdışı LC çözünürlük girişim düzeyleri süre izleme toplanan kesir alt kümeleri (1, 5, 10, 20, 40, 80 ve 320), bir dizi kullanarak test edildi. Girişim düzeyleri bulduk yavaş yavaş %16,4 %2,8 azalmıştır, o geniş ayırma çevrimdışı LC ayırma sırasında biraz gösteren peptidler co eluting sorunu ortadan kalkar ama tamamen kaldırma kapasitesine sahip değildi parazit var.
Daha sonra biz MS2 yalıtım pencere etkisi parazit değerlendirildi. Biz deneysel girişim yaklaşık önceki çalışmalar29,30anlaşarak yalıtım pencerenin boyutunu orantılı olduğunu tespit ettik. Örneğin, pencere boyutu (1.6-0,4 Da) bir 4-fold fark sonuçlanan bir ~ 4-fold fark kesmesi düzeyi (14,4 %3.7). Ayrıca sütun MS analizi için en uygun yükleme miktarı belirlenir ve bu bilgi daha fazla girişim inkâr etmek için kullanılır. Biz % 9.4 müdahalelerden % 3.3 için örnek uygun miktarda yükleyerek azaltılmış. Çok fazla örnek yükleme31 genişletmektedir zirveye kurşun ve bu nedenle düşük protein Nefelometri doğruluk kaynaklanan girişime düzeyini yükseltmek. Son olarak, biz online RPLL çözünürlük (1, 2 ve 4 h) degrade uzunlukları değişen ve uzun sütun (~ 45 cm) kullanarak optimize. 4-h degrade girişim (% 0,4) aşağı neredeyse ortadan ama aynı zamanda araç zaman ekledi bulduk. En iyi duruma getirilmiş parametreleri bir dar yalıtım pencere (0.4 Da), ~ 100 ortaya ng örneğinin yüklü sütun ve orta ayırma (~ 40 x 2 s, 3.3 gün). Biz de bir post-MS düzeltme bilgisayar tabanlı strateji kullanarak biz nicel hassas protein oranları (3B rakam) belirlerken geliştirilmiş olduğunu gösterdi.
Bizim sonuçları LC-MS parametreleri kullanımını optimize ve post-MS düzeltme ayrıntılı proteomik profil sağlamak ve neredeyse kez izobarik etiketleme teknikleri protein Nefelometri için tarafından üretilen girişim ortadan kaldırmak gösterir.
Şekil 1: düzeni bütün-Proteom profil analizi TMT-LC/LC-MS/Bayan tarafından On biyolojik örnekler lysed, sindirmek ve 10 farklı TMT Etiketler, havuza alınan eşit ve fraksiyonlara içine 80 kesirler çevrimdışı temel pH ters fazlı sıvı Kromatografi (LC) tarafından etiketlenir. Her diğer kesir daha fazla asitli RPLL tarafından ayrılmış ve online yüksek çözünürlüklü bir Kütle Spektrometre ile analiz. MS/MS ham dosyaları işlenen ve peptid ve protein tanımlama için bir Uniprot veritabanı aranır. Proteinler TMT Etiketler göreli şiddetlerde göre quantitated. Son olarak, tespit ve quantitated proteinleri bütünleştirici veri analizi için sunuldu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: verimlilik muayene etiketleme TMT. Hem TMT etiketli ve etiketsiz örnekleri karşılık gelen LC-MS/verimlilik etiketleme TMT ayrı ayrı incelemek için MS tarafından analiz. Tam TMT etiketleme için (A) etiketlenmemiş peptid maksimum tamamen yapıldı TMT etiketli peptid yalnızca etiketli örnek mevcut ise etiketli örnek, (B) yok. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: girişim kaldırıldıktan sonra MS veri toplama için Hesaplamalı yaklaşım. (A)tüm MS2 taramaları temiz (sol paneli) ve gürültülü taramaları (doğru kapı aynası) ayrıldı. Gürültülü inceden inceye gözden geçirmek her iki y1 iyonları K ve R (1 bir hedef peptid ve peptidler kirletici diğerlerinden) sergi. (B) Escherichia coli peptidler ayrı ayrı 3 farklı TMT reaktifleri ile etiketli ve 1: 3'te havuzlu: 10 oranları. Yaklaşık 20-fold daha fazla fare peptidler arka plan olarak eklenmiştir. E. coli peptidler 3 grupta toplanan göreli yoğunluklarda y1 iyon tabanlı düzeltme TMT tabanlı Nefelometri için daha doğru ortaya çıkar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Biz yüksek üretilen iş iletişim kuralı olan çeşitli yayınları12,13,14' te,32 başarıyla uygulanan bir 10-plex izobarik etiketleme stratejisi ile proteinlerin Nefelometri için tarif . Bu protokol için ilâ 10 farklı biyolojik protein örnekleri 1 denemede analiz edebiliriz. Düzenli olarak tanımlamak ve 10.000 Eh proteinler yüksek güven ile quantitate. İzobarik etiketleme proteinler quantitate için etkili bir teknoloji olsa da, nicel yanlışlık için yol açabilir oranı sıkıştırma ile sınırlıdır. LC/LC optimizasyonu ve y1 iyon tabanlı post-MS düzeltme, birlikte MS/MS ayarları gibi çeşitli stratejileri kullanarak bizim protokolü çoğu girişim etkileri etkili bir şekilde kaldırır ve bu nedenle oldukça hassas geliştirir protein Nefelometri.
Protein Nefelometri için program fonksiyonları bir dizi yolla atlama dizisi. Biraz satıcı tarafından sağlanan sertifikalarda bildirilen değerleri farklıdır satın alınan reaktifler, her dizi için izotopik kirlilik şiddetindeydi. Ölçülen izotopik kirlilik yoğunluklarda muhabir iyonlar atlama yazılım düzeltmek için kullanılır. Bir proteinin genellikle iyonlaşma verimliliği gibi çoklu faktörlerden etkilenmektedir çeşitli mutlak yoğunluklarda ile birçok PSMs tarafından quantitated. Faktörlerin etkisi bilinmeyen olduğundan, kitle spectra yalnızca göreli zenginliği muhabir iyonlar TMT tahlil ortaya koyuyor. Muhabir iyonlar göreli zenginliği her muhabir iyon yoğunluğu ortalama yoğunluğu tüm 10 gazeteci tarafından bölünmesi ile hesaplanır. En iyi temsilcisi "mutlak sinyal" protein sağlamak için biz ortalama 3 PSMs göreli yoğunluklarını protein üzerinden en yüksek mutlak yoğunluklarda ile ve mutlak tahmin etmek için en güçlü mutlak yoğunluğu ortalama hesaplanan sinyal protein. Biz adımları rescaling olarak tanımlanır. Y1 düzeltme evrensel olarak herhangi bir TMT deneyleri için geçerlidir; Ancak, bazı durumlarda biz peptidler için y1 iyon içeren MS/MS spectra ile doğru değil. Ancak, spectra ~ %90 y1 iyonları lizin ve arginin var bulundu. Aynı C-terminal artıkları olarak tanımlanan peptid var peptidler co eluting tarafından neden müdahale telafi etmek için tahmini girişim düzey temelde iki katına ve düzeltme için kullanılan. Bu varsayım biz hangi biz aynı Yoğunluk düzeyi y1 K ve R içeren peptidler için gözlenen çok sayıda TMT deneyler üzerinde toplanmıştır ampirik kanıt dayanıyordu.
Girişim biz bu iletişim kuralı ' MS3 multinotch yaklaşım gibi tarif var dışında pek çok yöntem tarafından azaltılabilir. Bu yöntemlerin tümü geçerli ve kendi bireysel yararları. Sonuçta, metodoloji kullanılan bir dizi gibi etkenlere bağlıdır ama örnek tutara, enstrüman ve kullanıma sunulması (Yani, araç türü örnekleri analiz etmek için gereken süre), istenen sonuçları (Yani, sayısı sınırlı değildir proteinler) tespit ve Nefelometri doğruluk gerekli.
En doğru sonuçlar sağlamak için kalite kontrol adımları boyunca protokol kulak vermek önemlidir. Bunlar doğru standartları (örneğin, amino asit analizi uğramıştır BSA), örnek Nefelometri için kullanmayı içerir TMT reaktif etiketleme verimliliği test, tripsin sindirim verimliliğini belirleme, Premiks oranı sınadıktan Tüm 10 örnekleri eşit bir karıştırma ve herhangi bir yükleme önyargı düzeltmek için bir yazılım kullanarak emin olmak için. İçinde bilinen bir protein veya birden fazla protein ifade değişiklikleri tek tek örnekler arasındaki sergilemek için beklenen durumda, bu değişiklikler varsa ve tespit edilebilir onaylamak için ilk hücre lizis sonra western blot analizi yapmak önemlidir. Bu örnekleri test edilecek Biyoloji temsil ve tüm TMT Protokolü gerçekleştirmeden önce zaman, para ve çaba kaydeder sağlar. Belirli bir örnek bazı protein(s) ifade edemediği bekleniyor, aynı zamanda onların yokluğunda protokolü ile devam etmeden önce lizis sonra onaylamak için western blot analizi kullanmak önemlidir. Çoğu protein 10 biyolojik örnekler üzerindeki değiştirmek için beklenen Premiks oran testi kullanılır. Onlar bizim düzeltme olumsuz etkilemeyeceği bu yüzden biz de keratins gibi bilinen bulaşıcı proteinlerin kaldırıldı. Bizim Nefelometri yöntemi pipetting hataları, vb oluşmuş olabilir herhangi bir hata düzeltildi. Mümkün olduğunda, özellikle pipet birimleri 5 µL büyük hataları azaltmak için kullandık. Biz doğru bir 1:1 karışım elde emin olmak için bu Premiks testin birden fazla mermi gerçekleştirilen. Değiştirmek için protein büyük bir yüzdesi beklediğimiz gibi biz bu tür Premiks oranı sınama immunoprecipitation örnekler iletişim kuralı için kullanırken gerçekleştirmedi olduğunu unutmamak gerekir. Bu gibi durumlarda, Premiks test sonuçları çarpık. Bu da herhangi bir deneme içinde en az 1 / 10 örnekleri çok protein ifade (boş vektör, proteasome inhibisyon, vb) bu gibi durumlarda çeşitli bekleniyor doğrudur, çoğaltır Nefelometri kolaylaştırmak için kullanmak için önerilir istatistikler. Biz genellikle 3 performans örnekleri bu tür için çoğaltır öneririz. Sonuçta, çoğaltır sayısı her örnek beklenen değişkenliği üzerinde temel alır.
Bazı ince ayarlamalar ile bu sağlam Protokolü genel proteomik boru hattı proteinler, protein yolları, hastalık ilerleme ve diğer biyolojik fonksiyonları araştırmak için kullanılabilir. Burada sunulan Protokolü derin protein kapsama almak ve oranı bastırılması sırasında miktar hafifletmek için güçlü bir teknik sağlar. Küçük değişiklikler ile bu iletişim kuralı protein fosforilasyon, ubiquitination ve asetilasyon33,34gibi ardından değişiklikleri quantitate kolayca adapte edilebilir. Bu kapsamlı proteomik proje türleri genomik, transcriptomics ve muhtemelen metabolomics biyolojik sistemleri anlamak ve yeni keşifler moleküler mekanizmaları kolaylaştırmak bir sistem Biyoloji yaklaşımı için entegre edilebilir, biyolojik ve hastalık13,28,35,36,37,38tedavi hedefleri.
Doğru bir şekilde bütün-hücre ya da doku lysates gelen 10.000'den fazla protein quantitating için bir yöntemi göstermiştir. Bu yöntem birçok biyolojik sistemleri yaygın olarak uygulanabilir olması için bekliyoruz.
Yazarlar tüm diğer laboratuar ve tesis üyeler yararlı tartışma için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen tarafından desteklenmiştir NI H R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 ve ALSAÇ verir. MS analizi St. Jude çocuk Araştırma Hastanesi proteomik tesiste, kısmen desteklenen NIH Kanser Merkezi destek grant P30CA021765 tarafından seslendirildi. Yazarlar Nisha Badders el yazması düzenleme konusunda yardım için teşekkür ederiz.