Multimodal Quantitative Phase Imaging with Digital Holographic Microscopy Accurately Assesses Intestinal Inflammation and Epithelial Wound Healing | Protocol (Translated to Turkish)
Örneğin, iltihabik bağırsak hastalığı, sıklığı, Crohn hastalığı ve ülseratif kolit, son yıllarda önemli ölçüde artmıştır. IBD etyolojisi bilinmemektedir ve mevcut tedavi stratejileri bağışıklık sisteminin baskılanması belirsiz dayanmaktadır. Özellikle belirgin IBD yönetimini geliştirmek olabilir bağırsak iltihabı ve epitel yara iyileşmesini hedefleyen tedavilerin geliştirilmesi, ancak bu iltihabi değişikliklerin doğru bir algılama gerektirir. Şu anda, potansiyel ilaç adayları, genellikle in vivo veya in vitro hücre kültürü bazlı tekniklerle hayvan modelleri kullanılarak değerlendirildi. Histolojik muayene genellikle örnek özelliklerini değiştirebilir ve ayrıca, bulguların yorumlanması araştırmacı uzmanlığı ile değişebilir hücreleri veya ilgi dokulara lekeli olması gerektirir. Dijital holografik mikroskobu (DHM), optik yol uzunluğu gecikme tespitine dayanan sağlar,leke bırakmayan kantitatif faz kontrast görüntüleme. Bu sonuçlar, doğrudan mutlak biyofizik parametreleri ile ilişkili olduğu için izin verir. Bu kırılma endeksi ölçümü göre DHM doku yoğunluğundaki değişiklikler ölçümü, kolitli farelerin ve insanlardan elde edilen kolon doku örneklerinin farklı tabakalarda, boyama olmaksızın, iltihaplı değişiklikler ölçmek için gösterilmektedir. Ayrıca, bu tür kuru kütle ve göç hücrelerin tabaka kalınlığı gibi yaralı alan ve morfolojik parametrelerin eş zamanlı tayini basit otomatik belirlenmesi yoluyla DHM kullanılarak in vitro mümkün epitel yara iyileşmesi sürekli multimodal etiket ücretsiz izleme göstermektedir. Sonuç olarak, DHM değerli, roman ve kantitatif aracı olası parametreler için mutlak değerler ile bağırsak iltihabı değerlendirilmesi için, in vitro epitel yara iyileşmesinin basitleştirilmiş miktarının temsil ve bu nedenle öteleme tanı u için yüksek bir potansiyele sahiptirse.
İltihaplı bağırsak yani hastalığı (IBD), ülseratif kolit (UC) ve Crohn hastalığı (CD), mide bağırsak 1 idiopatik enflamatuar hastalıklardır. IBD altta yatan patofizyoloji ve potansiyel yeni ilaçlar ya da yeni tanı yaklaşımları değerlendirmeye Araştırma özellikle önem taşımaktadır. Hem temel araştırma ve İBH hastalarının klinik yönetiminde, bağırsak mukoza dikkat 2,3 odağı haline gelmiştir. Mukoza bakterilere, epitel hücreleri, bağırsak, bağışıklık sisteminin çeşitli hücre bileşenleri arasındaki etkileşim bağırsak 4,5 homeostazı orkestra hangi anatomik sınırları temsil etmektedir. Ancak, İBH hastalarında, kontrolsüz ve kalıcı bağırsak iltihabı nihayet kendisi yerel inflamasyon 6 sinirlendiren epitel bariyer fonksiyonunun bozulması ile sonuçlanacak olabilir ülserasyonlar veya darlık gibi algılanabilir hasarı, mukozal yol açar.
7 sonrasında gastrointestinal ülser veya anastomoz kaçağı iyileşmesi için temel gereklilik olduğunu yara. Epitel şifa deneyleri şifa in vitro yara simüle ve bağırsak iltihabı 8,9 sıçan modellerinde olabilir yara. Hem in vitro ve in vivo yaklaşımlar deneysel değerlendirmenin doğruluğu sınırlayan sakıncaları var. In vitro deneyleri, klasik çizik deneyleri gibi, floresan kromoforlar ile uzun süren boyama yöntemleri veya transfeksiyon gerektirir. Genellikle 10 otomatik olamaz hücre proliferasyonu ve göçü devamlı olmayan izleme ile sınırlıdır. Dekstran sodyum sülfat (DSS) bağlı kolit in vivo modeller, sık olarak görülen önemli değişiklik, kısmen dayanıklı okumaları eksikliği laboratuvar belirteçleri de, mauygunsuz kral gibi belirteçler kolit şiddetini 11,12 değerlendirmek için. Iltihaplı mukozasında histolojik analiz şu anda hala kolit şiddetini belirlemek için en geçerli yöntemdir ancak bu, in vitro epitel yara iyileşme deneyleri gibi, boyama gerektirir ve araştırmacının uzmanlık 13 bağlıdır.
En son dijital holografik mikroskobu (DHM), kantitatif faz mikroskobu 14 bir varyantı, in vitro ve in vivo 15 epitel yara iyileşmesinin değerlendirilmesi için yararlı bir araç olarak tespit edilmiştir. DHM (OPD) optik yol uzunluğu gecikme ölçümü doku yoğunluğunun değerlendirilmesini sağlar hangi umutları yeni kanser tanısı 16-18 ve inflamasyon ile ilgili doku değişikliklerinin 19 ölçümü. Ayrıca, DHM hücre kalınlığı, hücre kaplı yüzey alanı ve hücre içi (protein) içerik miktarının belirlenmesi ile hücre morfolojisi dinamikleri izlenmesine olanak sağlar İn vitro tahlillerde, DHM fizyolojik süreçleri, örneğin, hücre hacmi ve kalınlık 21,22 değişimlerinin değerlendirilmesiyle hücresel su geçirgenliğinin analiz edilmesini sağlar. Ayrıca, DHM ölçümleri araştırmacı-ilişkili örnek önyargı engeller otomatik hale getirilebilir.
Burada, bağırsak iltihabı bir murin modelinde DHM kullanımını göstermek ve ayrıca bir etiket içermeyen in vitro deneyi olarak yara iyileşmesi kantitatif kontrolü için, insan doku numuneleri analizlerine dhm uygulanır. İlk olarak, IBD insanlardan, kolitli farelerin ve doku bölümleri farklı kolon duvar tabakalarının enflamatuar alterasyonların değerlendirir. DHM kantitatif faz görüntüleme işlemini anlattıktan sonra, biz edinilen sayısal faz görüntüler değerlendirilmesini tarif de mikroskop bileşenleri, doku kesitlerinin hazırlanması ve kullanımına ilişkin ayrıntılı yönergeler sağlar.
Daha sonra, DHM UTI olabileceğini göstermekin vitro epitel yara iyileşmesi sürekli multimodal izlenmesi için lized ve hücre tabakası kalınlığı, kuru kütlesinin ve hücresel hacmi gibi hücresel özelliklerinin analizini açıklar ilaca bağlı ve fizyolojik hücre değişiklikler hakkında fikir verir.
Tüm hayvan deneyleri Alman Hayvanları Koruma Kanunu uyarınca, bölgesel etik kurul (Landesamt für Natur, Çevre und Verbraucherschutz, LANUV, Almanya) tarafından onaylanmıştır. Münster Üniversitesi yerel etik kurul histolojik ve mikroskop analizi için insan dokularının kullanılmasını onayladı.
1. Hayvanlar ve Malzeme
Yerel hayvan bakımı mevzuatına göre kadın ya da 20 gr 25 tartmak gerekli DSS-duyarlı suş erkek fareler ve evin kullanın. Kemirgenler için özel chow sağlamak ve su ad libitum içme otoklava.
Otoklavlanmış musluk suyu ile 5 gün: dekstran sülfat sodyum (36,000-50,000 Da DSS, molekül ağırlığı) ağırlık / hacim% 3 uygulanmasıyla, akut DSS kolit başlatmak.
NOT: DSS gücü üretici ve toplu bağlı oldukça değişkendir. , Hastalık aktivitesinin uyarılması için ilk tedarikçisi tarafından sağlanan DSS test hangi da içinily vücut ağırlığı, güvenilir ve objektif bir göstergedir.
Kolon doku örneklerinin histolojik değerlendirme için, deney sonunda CO 2 insuflasyon (veya ulusal ve kurumsal rehberlere tarafından belirtildiği gibi) fareler euthanize.
2. Deneysel Kurulum DSS-kolit ve In-vitro Yara İyileşmesi Tahliller
Hücre kültürü ve yara iyileşmesi testinin kurulması.
37 ° C'de% 95 nem ve% 5 CO2 ortamında Caco-2 hücreleri, büyütün. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile RPMI ortamı kullanın.
Yüksek kültür eki ile 35 mm Petri tabaklarda 4 x 10 5 hücre / cm2 yoğunluğunda Tohum Caco-2 hücreleri (bkz, Şekil 4A).
NOT: insert yaralı bölgeyi temsil eden tanımlanmış hücre boş alan analiz edilecek ayrılmış iki hücre kaplı alanları oluşturur.
iki gün sonra, ortam seedin değiştirmeörn. Önce, otomatik pipet kullanılarak hücre artıkları ile arta kalan ortam aspire gerçekleştirmek fosfat tamponlu tuzlu su, 100 ul (PBS) ile yıkayın ve taze RPMI ortamı ya da serum yoksun orta ekleyin.
yara iyileşmesi davranış değişiklikleri tespit etmek için 20 ng EGF / ml serum ya da 2 ug mitomisin C / ml serum ile takviye edilmiş serum yoksun ortamında (% 0.1 FBS) içinde 24 saat süre ile kültür hücreleri. 24 saat boyunca kontrol hücrelerine normal RPMI ortamı ekleyin.
Kültür 24 saat sonra, kaldırma ve adım 3.4 de tarif edildiği gibi kültür ekleri atmak ve dhm gerçekleştirin.
Akut DSS kolit indüksiyon
(Ağırlık / hacim) DSS çözeltisi% 3 elde etmek için su otoklava 100 ml DSS hazırlanan, 3 g. 7 gün boyunca fareler ad libitum içme suyu yerine bu çözüm sağlar. fare / günlük DSS çözeltisi 5 ml hesaplayın. Kontrol farelerde ad libitum için DSS olmadan otoklavlanmış su sağlar.
Kemirgen ve insan kolon cryostatic kesit hazırlanması
Deneyin sonunda CO2 üfleme ile fareler öldürülür.
Laparotomi 23 tarafından hayvanların karın teşrih. dikkatle cımbız kullanarak tüm kolon çıkarın ve cerrahi makas kullanarak İleal ve rektal ucunu kesti. rektal sonuna kadar çekal boylamasına bir makasla kolon kesin ve kolon açın. PBS 24 ile yıkama ardından cımbız kullanarak örnekten tüm dışkı çıkarın.
içeriye kavisli mukoza ile rektal sonuna kadar çekal boylamasına tomurcuk bir pamuk ile tüm kolon yuvarlayarak İsviçre rulo hazırlayın. uygun kesme ısısı (OCT), bileşik kolonik örnekleri gömme ve sonraki kullanıma kadar -80 ° C'de donduruldu tutun.
uygun kesme ısısı OCT bileşiği cerrahi numunenin insan kolon dokusunun yerleştirme ve sonraki kullanıma kadar -80 ° C'de donduruldu tutun.
Bir cryoto yardımıyla Ekim-bileşik gömülü dokulardan 7 mikron kalınlığında kesilmiş bölümlerimuayene beni hemen önce.
NOT: Optimum numune kalınlığı sebat ve soruşturma altında doku tipinin saçılma özelliklerine bağlıdır. nedeniyle kantitatif DHM faz kontrast görüntülerde ışık saçılması kolon doku, gürültü> 10 mikron neden önemli bir artış dilim kalınlığı kullanılarak açıklanan deneyler için kalınlığı örnekleri <5 mikron cryo kesme işleminden hasar kaynaklı eserler için daha yüksek bir risk gösterirken.
Bir bardak nesne taşıyıcı slayta bölümleri aktarın.
3. Teknik Donanım, Dijital Hologram Edinme ve Değerlendirme Yazılım ve Prosedürler
kantitatif hücre ve doku görüntüleme için dijital holografik mikroskop
Şekil 1'de gösterildiği gibi, canlı hücre görüntüleme 25 için bir off-eksenli Mach-Zehnder dijital holografik mikroskopi sistemi kullanın. Mikroskop ile donatılmış olduğundan emin olun10X mikroskop objektifi 35 mm bir çapı olan bir cam bir nesne taşıyıcısı slaytlar ve Petri kutularına için bir tutucu ile birlikte, bir mikroskop aşamasında bir ısıtma odası kantitatif faz görüntüleme 25 fizyolojik 37 ° C sıcaklık ve yazılım korumak için.
Not: Örneğin, Kemper ve ark 26 ile Langehanenberg diğ 27 de tarif edildiği gibi...
NOT: Alternatif olarak, parlak bir alan mikroskobu ve canlı hücrelerin nicel faz görüntüleme ve disseke doku slaytları gerçekleştirme yeteneğine sahip benzer bir sistemi kullanın.
Temiz mikroskop lensi ve lens temizleme kağıdı ve toz veya diğer kirlilikler kaldırmak için mikroskop üreticisi tarafından tavsiye edildiği gibi bir temizlik maddesi (örneğin, etanol) ile kondansatör.
beyaz ışık aydınlatma "konulu" "parlak bir alan" görüntüleme modu ve anahtarı seçin, DHM mikroskop görüntü elde etme yazılımını başlatın. Köhler-illumin sağlamak(Alternatif olarak, standart bir görüntü elde etme yazılımı bu aşamada kullanılabilir) görüntü tedarik yazılımı canlı görüntüleme penceresinde örnek gözlemlerken mikroskop üretici tarafından tavsiye edildiği gibi örnek yapımı.
NOT: Görüntü yoğunluğu görüş alanı içinde homojen dağıtılması gerekmektedir ve örnek pozisyon mikroskop odak sürücü ile optik yeniden odaklanma sırasında hareket etmemelidir.
Lazer ışığı "konulu" beyaz ışık aydınlatması ve anahtarı "kapalı" açmak "DHM" görüntüleme modunu seçin. Lazer ışığı ile aydınlatma homojen olup olmadığını kontrol edin (yani, ışık şiddeti homojen DHM mikroskop görüntüleme toplama yazılımı canlı görüntüleme penceresinde dağıldığı) ve off-eksen taşıyıcı girişim saçak deseni yeterli kontrast ile görüntülenir gözlemleyin çekilen görüntüler (dijital hologramlar).
görüntüleme için kriyostat kesitleri hazırlanmasıDHM ile
(Kalınlık, cam obje taşıyıcı üzerine kriyostat bölümü: 7 mikron, 2.3 de açıklandığı gibi) numune alın dondurucu. RT ve normal atmosfer, yaklaşık 5 dakika boyunca numune Defrost.
tamamen tamponu ile kaplanana kadar, bir pipet kullanılarak, doku bölümünün üzerine orta gömme kütlesi olarak 100 ul fosfat tamponlu tuz (PBS) - 50 ekleyin. Temiz bir cam kapak slip (cam kalınlığı 170 mikron) ile örnek örtün.
NOT: Aşırı kurutma kırılma indeksi önemli değişiklikler ve örnek saçılma özelliklerini uyarabilir.
Cam taşıyıcı ve kapak kayma alt ışık saçılması neden olabilir toz ve diğer kirleticilerden temizlenir emin olun. Örnek parlak bir alan mikroskobu ve DHM ile soruşturma için hazırdır.
DHM doku bölümlerinin kantitatif faz görüntüleme
Dijital holografik mikroskop açın görüntüleme için 10X mikroskop merceği seçin. i başlatBüyücü edinimi DHM mikroskop yazılım ve parlak dosya görüntüleme modunu seçin.
mikroskop objektif bakan kapak kayma ile, mikroskop lamı tutucu) 2'de açıklandığı gibi doku slayt yerleştirin.
DHM mikroskop parlak alan aydınlatma "konulu" anahtarı. mikroskop aşaması ile örnek yerleştirin ve ilgi doku alanı canlı izleme penceresinde görünür olduğundan emin olun. mikroskop odak sürücüsünü kullanarak görüntü netliğini iyileştirmek.
Not: yanısıra ilgi alanı, doku olmayan sürgünün bir alan, görüş alanında mevcut olmalıdır.
görüntü elde etme yazılımı kullanarak keskin odaklanmış örnek parlak bir alan görüntü yakalamak.
Seç "DHM" görüntüleme modu, lazer ışığı aydınlatma "konulu" beyaz ışık aydınlatması "kapalı" açmak ve kapatmak. 3 milisaniyenin altında hologram kayıt için "pozlama süresi" seçtiğinizden emin hologr gözlemlemekaphic eksen dışı girişim saçaklar görüntüleme toplama yazılımı canlı görüntüleme penceresi yeterli kontrast görünür ve bir dijital hologram yakalamak.
parlak bir alan görüntüler ve farklı örnek alanların dijital hologramlar yeterli sayıda kaydedildi kadar 3.3.5 - Tekrar 3.3.3 adımları. Hologram satın alma artık tamamlanmıştır.
DHM görüntüleme için yara iyileşmesi tahlilleri hazırlanması
DHM ölçümler sırasında sabit sıcaklık koşulları temin etmek üzere 3 saat önce deney başlamadan göre - 1 DHM mikroskop Petri kabı ısıtma odasına açın.
Gerekli ekipman (2.3 anlatılan yara iyileşmesi tahlil için Petri kabı) ile tezgah hazırlayın pipetler, cımbız, Petri kabı için cam kapak, 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES), fizyolojik hücre kültür ortamının tamponlu steril bir ortamda numune hazırlama için sıcaklık (37 ° C).
NOT: 3 oluşmaktadır.
Petri kabı, plastik kapağı çıkarın ve bir pipet ile hücre kültür ortamı çıkarın. cımbız kullanarak Petri kabı alttan çıkartın.
Ölü hücreleri ve yara alanında kalan hücre bileşenleri (örneğin, serum) ortadan kaldırmak amacıyla tamponlu 1 mi HEPES hücre kültürü ortamı ile 2 kez - Örnek 1 yıkayın. 2 ml HEPES tamponlu hücre kültür ortamı ekleyin ve cam kapaklı Petri kabı kap.
cam kapak ve Petri kabı alt toz ve diğer kirleticilerden temizlenmiş olduğundan emin olun. Örnek DHM ile zaman atlamalı gözlem için hazırdır.
DHM in vitro yara iyileşmesi sürekli modelli izleme
önce 3 saat - DHM mikroskop yaklaşık 1 Petri kabı ısıtma odasına açınDeneyin başlamasından DHM ölçümler sırasında sabit sıcaklık koşulları temin etmek üzere.
Dijital holografik mikroskop "konulu" anahtarı, görüntüleme için 10X mikroskop merceği seçin. DHM mikroskop görüntü elde etme yazılımını başlatın ve "aydınlık alan" görüntüleme modunu seçin. Petri kabı ısıtma haznesi fizyolojik bir sıcaklık (37 ° C) çalıştığından emin olun.
DHM mikroskop etüvde 4'te tarif edildiği gibi hazırlanmıştır yara iyileşme testi ile petri) yerleştirin.
parlak bir alan görüntüleme modunu seçin ve DHM mikroskop görüntü elde etme yazılımı canlı izleme penceresinde gözlemlerken mikroskop aşaması ile örnek yerleştirin. numunenin istenen alan keskin beyaz ışık aydınlatma altında odaklı görünür gözlemleyin.
Beyaz altında numune farklı alanlarda parlak bir alan görüntüler (yara alan ve konfluent hücreleri ile çevresinde) Yakalamagörüntü elde etme yazılım ve belge görünümü, hücre yoğunluğu ve homojenlik ışık aydınlatma.
DHM mikroskop "parlak bir alan" görüntüleme modunu seçin. DHM mikroskop görüntü elde etme yazılımı ile canlı izleme penceresinde beyaz ışık aydınlatma altında uygun bir yara alanı seçin. yara alan ölü hücreler ve hiçbir serum kalıntılarından serbest olduğundan emin olun ve her iki taraf da tercihen düz sınırları tek bir homojen hücre tabakası içerir emin olun.
DHM mikroskop görüntü elde etme yazılımı ile parlak bir alan görüntüleme modunda ilk yara alanının beyaz ışık görüntü yakalamak.
lazer aydınlatma "konulu" "DHM" modunu ve anahtarı seçin, beyaz ışık aydınlatması "kapalı" konuma getirin. hologram kayıt için aşağıdaki 3 msn bir pozlama süresi (parazit saçaklar t görüntü elde etme yazılımı canlı görüntüleme penceresi yeterli kontrast görünür holografik off-ekseni gözlemlemek seçinO mikroskobu DHM) ve dijital hologram yakalamak.
görüntü elde etme yazılımı ile DHM modunda örnek hologramı Yakalama ve görüntü kalitesini kontrol etmek için DHM mikroskop yeniden yazılımı ile kantitatif faz görüntüyü yeniden.
DHM mikroskop görüntü elde etme yazılımı ile time-lapse Hologram edinimi için - (5 dk örneğin, 3) uygun bir gecikme zamanı seçin.
örnek, yalnızca hologram edinimi sırasında lazer ışığı ile aydınlatılmış olduğu görüntü elde etme yazılımı time-lapse edinimi modunu seçin.
yara iyileşmesi testinin time-lapse DHM gözlem başlatın.
Amaçlanan süre sonra time-lapse edinimi durdurmak parlak bir alan görüntüleme modunu seçmek ve beyaz ışık görüntüleme altında numunenin son görünümünü belgelemek.
disseke dokuların dijital hologramlar yeniden ve ölçmek için bir parametre olarak ortalama kırılma endeksi belirlemekdoku yoğunluğu
Kemper ve ark., 26. ve Langehanenberg ve ark., 27 de tarif edildiği gibi, örneğin, DHM mikroskop, bir yazılım ile kesilerek dokuların dijital hologramlar kantitatif faz görüntüleri yeniden.
Çıkarları (ROI) 19 uygun seçilmiş bölgelerde farklı doku katmanları (epitel, submukoza, stroma) ortalama faz kontrast Δφ belirleyin.
Bir refraktometre kullanılarak veya alternatif literatürden uygun bir değer kullanarak gömme ortamın kırılma indeksi belirleyin. (tipik gömme ortamı için kırılma indisi değerleri: n Su = 1.334 28, N Fosfat tuz (PBS) = 1.337 29, N, hücre kültür ortamı = 1,337-1,339 29,30 tamponlu).
Ortalama faz kontrast 19 değerleri farklı doku katmanlarının kırılma indeksleri hesaplayın
NOT: Denklem. Kesilmiş, doku kalınlığı d (burada 7 um): 1 λ (λ = 532 nm Burada) lazer ışığının dalga boyu ve n, ortam burada gömülü maddenin (kırılma endeksi: orta = N PBS n bir Abbe-Refraktometre tarafından belirlenen = 1.337).
Yeniden ve seri gözlem yara iyileşme time-lapse dijital hologramlar değerlendirmek
DHM mikroskop yazılımı 26,27 ile yara iyileşmesi gözlem sırasında elde edilen zaman atlamalı hologram serisi kantitatif faz görüntüleri yeniden.
maksimum faz kontrast görüntü kantitatif faz görüntülerin her dizi normalleştirmek.
Her olabilir görüntü bölütleme nicel DHM faz görüntüler hücreler tarafından kapsanan alan: C, belirlemeözgür yazılım hücre profiler kullanılarak oluşturulan (www.cellprofiler.org 31).
Konum: C hücreler Δφ hücresinin ortalama faz kontrast hesaplayın.
Konum: C 15 ortalama faz kontrast Δφ hücreden hücre kuru kütle DM almak
NOT: 2 DM hücresel kuru kitle gösterir Denklem, S c hücreleri ve α = 0.002 m 2 / kg tarafından işgal edilmiş bir alan sunuyor.
Tamamlayıcı hücre kırılma indisi n, hücre ve hücre kültür ortamı n ortamın kırılma endeksi belirlemek. 30 anlatıldığı gibi asılı hücrelerden ayrı deneysel n hücre belirleyin ve bir refraktometre ile n orta ölçün. Alternatif n hücresinin 30 ve orta 29,30 n için literatür değerleri kullanabilirsiniz.
L, Δφ hücresi n hücre ve n orta 26,32 ortalama hücre Kalınlığı d hücre hesaplamak
NOT: Denklem. 3 Parametre d hücre λ, lazer ışık ışık dalga boyu ortalama hücre kalınlığı belirtir; ise, Δφ hücre ortalama faz kontrast gösterir ve hücre ve n orta n ayrılmaz hücresel refraktif indeks ve çevresindeki ortamın kırılma indeksi vardır.
Dijital Holografik Mikroskopi için DHM Görüntüleme için tipik Kurulum (DHM)
Şekil 1 B gösterildiği gibi parlak alan görüntüleme ve kantitatif DHM faz kontrast görüntüleme gerçekleştirmek için, biz ters bir mikroskop uygulamalı. 25 daha önce tarif edildiği gibi sistem, bir DHM modülü ekleme ile modifiye edilmiştir. Mach-Zehnder yapılandırması (Şekil 1 A) YAG lazer l = 532 nm): Dijital hologramlar yanması ile bir frekans katlamalı Nd ışığıyla örneği oluşturulmuştur. Disseke dokular cam taşıyıcı slaytlar üzerinde ex vivo analiz edildi. Şek. 1 ° C 'de gösterildiği gibi canlı hücre kültürleri gözlemlemek yara iyileşmesi için özel bir Petri kapları gözlenmiştir. Numuneler, bir 10X mi yoluyla iletim aydınlatma görüntülendicroscope objektif (NA 0.3 =) ve bir tüp lens. Bir şarj çiftli aygıt kamera hafif eğimli referans dalga ile örnek görüntü (nesne dalga) atma tarafından oluşturulan girişim desenleri (dijital eksen dışı hologramlar) kaydetmek için kullanıldı. Dijital yakalanan hologramlar mekansal faz holografik opsiyonel 26,33 otomatik odaklama ile birlikte yeniden kaydırarak yeniden inşa edildi.
DHM murin DSS-indüklediği kolite sahip Değerlendirilmesi
Akut kolit, 5 gün boyunca içme suyu dekstran sülfat sodyum (DSS), ağ / hac% 3 uygulanması suretiyle indüklenmiştir. tezahürü ve kolitin ilerlemesinin kontrol grubu ile karşılaştırıldığında DSS ile tedavi edilen grupta ilerleyici kilo kaybı için izlenmesi ile takip edilmiştir. (Şekil 2, 19 uyarlanmıştır). Şiddetli coli endoskopik, ortakolon duvarının kalınlaşması ile yansıtıldığı gibi tis gözlendi, vasküler desen (örn spontan kanama, kırmızı ok), fibrin exudation (beyaz ok) ve mukozal yüzeyi (Şekil 2B) ayrıntı değişiklikler. Hematoksilen ve eozin Konvansiyonel histolojik değerlendirme (HE) kolon bölümleri ağırlıklı submukozaya (Şekil 2 C gri ok) bulunan kontrol hayvanları, ayetler DSS ile tedavi edilen kolonik duvarında belirgin ödem ortaya boyandı. Denklem 1 tarafından alınan sayısal DHM Faz kontrast görüntüleri ve ilgili kırılma endeksi haritaları karşılık gelen, aynı zamanda, yukarıda sözü edilen doku değişimlerinin tasvir. Buna ek olarak, 256 gri seviyelere kodlu refraktif indeks, yerli, boyanmamış doku örneklerinde epiteli (beyaz ok) ve stromada (siyah ok) (Şekil 2 de dahil olmak üzere doku katmanlarında yoğunluk farklılıkları belirtilen C). Kırılma endeksi anlamlı epitel, hem de sağlıklı kontrol (Şekil 2E) ile karşılaştırıldığında, kolitli farelerin mukoza altı ve stroma indirgendi. Buna ek olarak, klinik parametrenin (vücut ağırlığının göreli kaybı) ve mutlak fiziksel parametrenin (refraktif indeks) arasında anlamlı bir ilişki görülebiliyor (R 2 lineer = 0.64; 19 uyarlanan Şekil 2 D).
DHM insanlarda Crohn Hastalığı Değerlendirme
Crohn hastalığı sıklıkla gastrointestinal endoskopi ile tespit bağırsak duvarının olağanüstü inflamatuar değişiklikler ile tanımlanır. fibrin exudat ile Karakteristik makroskopik özellikleri mukoza yüzeyinde ayrıntı içermektedir, uzunlamasına ülserleriyonları (Şekil 3 A), kanama ve spontan (aynı zamanda "salyangoz yollar" olarak anılacaktır). aktif CD'li hastalardan alınan doku örneklerinin HE boyama ile histolojik değerlendirme genellikle kolon duvarı yanı sıra submukozal ödem ortaya koymaktadır. Denklem 1 tarafından alınan kantitatif DHM faz kontrastlı görüntüler ve ilgili refraktif indeks haritaları Yazışmalarda burada epiteli (Şekil 3 B) görülen kolon duvarının inflamatuvar aracılı geliştirme / şişme, algıladı. Bundan başka, bir mutlak parametre olarak kırılma indeksi, aynı zamanda önemli ölçüde remisyonda ayetler aktif CD (Şekil 3 C) sahip hastalardan kolonik doku örneklerinde, tüm duvar tabakaları (epitelyum, alt mukoza ve stromanın) indirgendi.
-In vitro Yara Şifa multimodal İzleme
Caco-2 hücre deneyleri standardize koşulları sağlamak için özel bir Petri kabı kullanılarak yapılmıştır yara iyileşmesi. Çanağı 500 um (Şekil 4A) bir boşluk ile ayrılmış iki ayrı bölmeleri oluşturan bir kültür eki ile donatılmıştır. Farklı fizyolojik ortamlarda simüle etmek için, hücreler, epidermal büyüme faktörü (EGF) ile uyarılan veya mitomisin C ile inhibe tedavisiz ya incelenmiştir. DHM kurulum Deneyin başlamasından (Şekil 4 B) sonra 0, 22.5 ve 45 saat sonra (256 gri seviyelere kodlu) temsili kantitatif DHM faz kontrast görüntüleri burada tasvir zamanla yara iyileşmesi sürecinde, sürekli izlenmesine olanak sağlar. Şekil 5'te yanlış renk kodlu sözde 3D ​​araziler gelen üç di hücre tabakası kalınlığı mekansal gelişimini göstermektedirKonakları. optik yol uzunluğu gecikme hücresel kırılma endeksi göre ve 2 ve 3 denklemlerini, DHM, hücre kapalı yüzey alanı, ortalama hücre kalınlığı ve hücre kuru kütle (hücresel özellikleri arasındaki izlenmesiyle hareketi, çoğalması ve şekil eşzamanlı dinamik değerlendirilmesini sağlar Şekil 4 ° C). Özet olarak, Şekil 4'te veriler görüş alanında artmış bir ortalama hücre kalınlığı, yara alanına bir hücre hızlı göç ve daha yüksek bir kuru kütle EGF simülasyon sonuçları kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında göstermektedir. inhibe hücreleri kapsar Cı aksine, Mitomisin biraz deney sırasında, kontrol hücrelerine göre yüzey alanı azalmış ve biraz daha düşük bir kuru kütle artışı göstermektedir. Ancak, ortalama hücre kalınlığı, hem kıyasla azalmış uyarılmış ve kontrol hücreleri açıkça görünür.
Şekil 1. Dijital Holografik Mikroskop (DHM). DHM iş istasyonu (A) şematik kurulum için Off-ekseni Kur Kullanılan. Mikroskop kurulumu (monitör, canlı görüntü ve kontrol yazılımı (1) tasvir fotoğrafı karşılık, eksen dışı kurulumu dijital mikroskop (2), (B), mikroskop (yeşil noktalı çizgi) ve bir numunenin optik yol kırmızı ile gösterilen ( ok (C)). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. DHM tarafından Fare DSS-kaynaklı Kolit Değerlendirilmesi. Kolit ders günlük beni izledigöreceli vücut ağırlığı ve tekrarlanan endoskopik takip muayene asurement. (19 uyarlanmıştır) DSS uygulama (A) başlamasından sonra 4 gün göreceli vücut ağırlığının büyük bir kayıp fokal ülserasyonlar ve mukozal açığı (B) dahil olmak üzere, yerleşmiş kolit endoskopik işaretleri eşlik etti. Geleneksel HE-lekeli cryostatic bölümlerin analizi submukozal ödem, muskularis ve mukozada belirgin bir mukozal inflamatuar infiltratın kalınlaşma saptandı. Denklem 1 tarafından alınan kantitatif DHM faz kontrastlı görüntüler ve ilgili refraktif indeks haritaları gelen (256 gri seviyelere kodlu) iltihap sürecinde submukozanın ödemli değişiklikler doğruladı (C) (beyaz ok epitel, gri submukozayı ve siyah stroma gösterir). Anlamlı kırılma indeksi (mutlak fiziksel parametrenin, R2 lineer = 0.6 ile korelasyon vücut ağırlığının göreli kaybı (bir klinik parametre)4; Önemli ölçüde epitel hem de mukoza altı ve sağlıklı kontrollere göre, kolitli farelerin stroma indirgendi 19 uyarlanmıştır (D)), (ortalama ± SEM, *** P <0.001; e.) Tıklayın burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.
DHM insanlarda Crohn Hastalığı Şekil 3. Değerlendirme. Endoskopik ve histolojik olarak teyit Crohn hastalığı olan hastalardan kolonik doku örnekleri incelenmiştir (A). HE-boyama mukozal kript uzatma ve iltihap hücrelerinin belirgin bir infiltrasyonu gösterilir. Ayrıca, submukozal ödem ve muskularis propria genişleme tespit edildi. Düzeltici analiziDenklem tarafından alınan kantitatif DHM faz kontrastlı görüntüler ve ilgili refraktif indeks haritaları, tekabül (1) (256 gri seviyelere kodlu) de epiteli (B) (burada bir beyaz ve siyah yıldız ile gösterilen) ödemli değişiklikler saptandı. Ortalama kırılma indeksinde önemli farklar, aktif parlama (boş sütunlar) ya da bir gerileme (siyah çubuklar) CD hastalarından örneklerde tespit edildi. Bu farklılıklar her doku tipi görülür (± SEM, *** p <0.001 ortalama C). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Beyaz Işık Mikroskopi ve DHM tarafından Epitel Yara İyileşmesi Şekil 4. izlenmesi. Kültür hücreler tran edildiözel ekler (kırmızı ok) Petri kapları içine sferred. Kültür ekleri uzaklaştırılmış önce, hücreler 24 saat boyunca, EGF veya mitomisin C ile ile muamele edilen ya da tek başına ortam maddesi (uyarılmamış kontrol) (A) ile muamele edildi. Kültür ekler çıkarılmasından sonra, yara iyileşmesi zaman içinde sürekli olarak DHM ile faz kontrastlı görüntüleme ile izlenmiştir. Hücre özetliyor açıkça kabul edilebilir. Temsilci kantitatif DHM faz kontrastlı görüntüler 22.5 saat sonra ve 45 saat (B) sonrasında ölçüm sonunda, deney başında gösterilmektedir. Paneli (C) hücre kaplı yüzeyi (S c) karşılık gelen zamansal değişimleri, ortalama hücre kalınlığı (d hücresi) ve hücresel kuru kütle (DM) görülmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. Kantitatif DHM Faz Kontrast Görüntüler Yanlış Renk kodlu Sözde 3 D Arsalar Hücre Katmanı Morfoloji Değişikliklerin İllüstrasyon. T = 0 Şekil 4B kantitatif DHM faz kontrast görüntüleri Temsilcisi yanlış renk kodlu sözde 3D ​​araziler, 22.5 saat sonra ve 45 saat sonra ölçüm sonunda, kontrol- hücre tabakalarının kalınlığı mekansal gelişimini göstermektedir, Mitomisin c-inhibe ve 3D EGF uyarılmış hücreler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bu DHM murin kolit modellerinde histolojik hasar ve insan kolon doku numuneleri ex vivo doğru değerlendirilmesini sağladığını gösterir. Ayrıca, DHM sürekli olarak aynı anda, hücresel değişiklikler hakkında çok modlu bilgi temin ederken epitel yara iyileşmesi takip göstermiştir. DHM olarak, dijital yakalanan hologramların yeniden sayısal 32 gerçekleştirilir. Bu nedenle, parlak bir alan mikroskobu, Zernike faz kontrast ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ile karşılaştırıldığında, DHM isteğe bağlı müteakip sayısal odak düzeltme (çok odaklı görüntüleme) ile kantitatif faz kontrast 27 sağlamaktadır. Kantitatif faz görüntüleme optik yol uzunluğu değişikliklerin belirlenmesi üzerine dayanmaktadır ve bu şekilde kullanılan ölçüm cihazı son derece bağımsızdır. Bu farklı enstrümanlar ile elde edilir ölçüm verilerinin karşılaştırılması kolaylaştırır. Buna ek olarak, DHM obje için sadece düşük ışık yoğunluğu gerektirirct aydınlatma. Bu Lekesiz disseke dokuların bir minimal invaziv analiz sağlar ve canlı hücrelerin uzun süreli zaman atlamalı gözlemler sırasında gerekli numune etkileşimi miktarını en aza indirir.
IBD terapötik armamentarium önemli ölçüde son iki yılda genişletmiştir. ÜK ve CD hem de etkili ve kabul edilebilir yan etki profilleri, roman ve son zamanlarda klinik pratikte 34-37 sokuldu integrinler hedefleyen özel antikorlar sahip, anti TNF-α tedavilerin, giriş yanında. Birçok diğer umut verici maddeler şu anda İBH 38-40 onların terapötik etkinlik için değerlendirilmektedir. Bununla birlikte, insanlarda klinik kullanım öncesinde, bu potansiyel tedavilerin etkinliği ve güvenliği hayvan çalışmalarında kanıtlanmış bulunmaktadır. DSS-kaynaklı kolit, yüksek tekrarlanabilirlik ve düşük maliyetle 23 nedeniyle en sık kullanılan fare kolit modellerinde biridir. Ayrıca, bu modelin can aliçin genetik olarak değiştirilmiş farelere uygulanması 41 suşları. Sistemik belirteçler, örneğin, CRP, hayvan modellerinde oldukça değişkendir, kolon histolojik değerlendirme hastalığın şiddetini 42,43 değerlendirmek için en geçerli yaklaşımı temsil ederken. Bununla birlikte, puanlama sistemleriyle göre histolojik inflamasyon kantitatif değerlendirme araştırmacı uzmanlık ve deneyim son derece bağlıdır. DHM ile mümkün olduğunca objektif parametrelere göre Otomatik değerlendirme ve puanlama bu kısıtlamaların üstesinden, ve ayrıca 19 boyanması için ihtiyaç kaçınarak, aynı zamanda zaman tasarrufu olduğunu. Ayrıca, DHM endoskopi sırasında elde edilen bir cerrahi kolonik hücrelerde ve mukoza örnekleri incelemek için kullanılabilir.
Epitel rejenerasyon ve yara iyileşmesi, gastrointestinal ülser ya da anastomoz kaçağı dahil olmak üzere birçok patolojik süreçte çok önemli bir mekanizmadır. Yaklaşımlar var vaat ederken v epitel yara iyileşmesini değerlendirmek içinivo 44, bu teknikler gelişmiş muayene araçları gerektirmez ve şu anda yaygın olarak mevcut değildir. Bu nedenle, şu anda epitel şifa yaygın vitro 9 çizik deneyleri ile incelenmiştir. Bu deneyler, yara kapatma geçerli muayene izin ama genellikle ilk o zaman değerlendirme 10,45 tekrarlanan önler, hücre boyama gerektirir. Buna ek olarak, hücresel değişiklik veriler bu deney düzeneği ile paralel olarak elde edilebilir. Apoptoz ve nekroz 46 arasında ayırt etmek için, hücre proliferasyonunu ve göçünü 46 değerlendirmek için kullanılabilir Bununla birlikte, bu bilgi büyük önem olabilir. Bu nedenle, olasılık aynı anda DHM muayene ile yara kapatılması izlenmesine hücre kalınlığı, kuru kitle veya doku yoğunluğunu belirlemek mukozal araştırma yüksek bir değere sahiptir.
İnsan IBD hastalar için tedavi hedefleri sürekli son on yıl boyunca değişen edilmiştir <sup> 47. Inflamasyon başlangıçta kontrol birincil öneme, daha sonra steroid içermeyen remisyon olması ve şimdi şifa mukozal görülürken tedavi 48 birincil hedefleri vardır. Son zamanlarda, bu histolojik remisyon bile tek başına 49 iyileşme mukozal üstün olabileceğini varsayılmıştır. İnsan IBD için kullanılabilir birkaç histolojik skorlama sistemleri var iken Ancak, gözlemciler arası değişkenlik 50 yüksek kalır. Bu nedenle, histolojik kolon örneklerin değerlendirilmesi için standart bir yaklaşıma ihtiyaç vardır. DHM bu hedefe katkıda bulunabilir ve daha fazla insan IBD hastaları ile prospektif klinik araştırmada değerlendirilmelidir.
sunulan deneysel prosedürde, numuneler son derece tutarlı lazer ışığı kullanılarak aydınlatılır ve görüntülenmiş. Bu nedenle, DHM çözünürlük esas olarak Örnek aydınlatma yanlış hizalanmasından kaynaklanan ışık saçılımı ve kırınım etkileri ile sınırlıdır, kalın örnekleri, toz veyaBu, optik bir yoldaki kondanse su gibi diğer yabancı maddeler. kantitatif DHM faz kontrast görüntüler, DHM kurulumu dikkatli hazırlanması ve hizalama ve örnek son derece hassas ölçüm verileri elde etmek için protokolde en önemli adımlardır. İyice mikroskop kondansatör ve mikroskop objektif, gürültüyü en aza indirmek için gerekli olan, özellikle optik görüntüleme elemanları, temizlenmelidir. Ayrıca numune taşıyıcı slaytlar, Petri kabı kapağı ve alt, hem de kullanılan hücre kültürü ortamı partikül halindeki empüritelerin ari olmalıdır. Bu şekilde uygulama sıvıların tüm bileşenleri ve uygun filtreleme temizlenmesi ile elde edilir.
Dijital hologram ve / veya disseke dokuların kantitatif DHM faz görüntüleri gürültülü ise, cam taşıyıcı ve kapak kayma toz ile kirlenmiş olabilir: Daha detaylı sorun giderme ipuçları aşağıdaki gibidir. Bu durumda, alkol (örneğin, saf etanol) cam taşıyıcı ve kapak kayma temizleyin. kalın isedisseke doku lık (> 10 mikron) ışık saçılması ve böylece sonuçları, daha ince doku bölümleri kullanmayı deneyin çok büyük. lazer ışığı ile aydınlatma homojen bir dağılım olması durumunda, mikroskoplar kondansatör ile nesne aydınlatma hizalayın. etkileri saçılma indükler cam kapağın altındaki su yoğunlaştırılmış ise, ısıtma haznesi ve oda nem sıcaklığını kontrol edin. durumda Hücre yoğunluğu birden fazla tabaka çok yüksek ya da hücre büyümesi, yara iyileşmesi deneyleri hazırlanması esnasında hücre yoğunluğu azaltır. DHM interferometrik ilkesine dayalı olarak, son olarak, yöntem, ayrı ayrı laboratuar ortamına göre değişir titreşim ya da başka mekanik etkilere karşı duyarlıdır. Bununla birlikte, bu etkiler, genellikle deney düzeneği hazırlanması sırasında holografi kayıt için yeterli seçilen pozlama süresi (genellikle milisaniye aralığında veya altında) ile en aza indirilebilir.
ÖzetleBizim sonuçlar nedeniyle kantitatif neredeyse otomatik bir şekilde histolojik inflamasyonu ex vivo değerlendirmek için onun yeteneği DHM parlak bir alan ve bu tür Zernike faz kontrast ve DIC gibi mevcut faz kontrast görüntüleme mikroskopi teknikleri üzerinde önemli avantajlara sahip olduğu göstermektedir. Ayrıca DHM örnekleri ile minimize etkileşim in vitro epitel yara iyileşmesinin etiket ücretsiz sürekli modelli değerlendirme sağlar. Bu İBH olan hastalarda DHM translasyon potansiyelini keşfetmek için 'dijital patoloji' ve daha fazla genişletilmiş çalışmalar açısından otomatik histolojik inceleme için önünü açıyor. Buna ek olarak, DHM fırsatları kantitatif hücre migrasyonu, morfolojisi ve çoğalmasını incelemek için in vitro roman sunuyor.
klinik uygulamaya DHM çeviri IBD teşhis geliştirmek potansiyeline sahiptir. DHM bağırsak iltihabı farklı derecelerde kantifikasyonunu yoluyla izin verdiğiyoğunluk değişiklikleri, bir "dijital patoloji" anlamında hastalığın objektif ve daha hassas değerlendirilmesi gibi fiziksel parametrelerin mümkün görünmektedir. objektif bir değerlendirme İBH hastalarının klinik yönetimi üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir.