HİSTOLOJİ PREPARATLARININ HAZIRLANMASI - Histoloji
Canlılardan alınan doku ya da organ parçalarını mikroskopla incelenir duruma getirebilmek için takip ettiğimiz işlemlerin tümüne birden histolojik teknik adını veriyoruz. Bu amaçla kullanılan yöntemler uygulayacağımız mikroskobi tekniğine bağlı olarak ilk bakışta bazı farklılıklar görünse de temelde prensipler aynıdır. Bu konuyla ilgili temel prensipleri anlayabilmek için klasik ışık mikroskobunda inceleyeceğimiz bir preparatın hazırlanışını görelim.
Bir histolojik incelemenin sağlıklı bir şekilde yapılabilmesi için dokuya ait yapı özelliklerinin, kimyasal içeriklerinin iyi korunmuş olması gerekir. Bunun için canlılara ait preparatların hazırlanışında ilk temel prensip hücre ve dokuları canlıdakine en yakın şekilde tutabilmektir. Bunun için ilk hedef otolizi engellemek olmadır. Canlı hücre içinde, etrafı membranla çevrili, eritici enzimler içeren, lizozom adını verdiğimiz organeller vardır. Hücre bu yapıları sindirim amacıyla kullanır. Ölümden sonra eritici enzimler sitoplazma içine geçerek hücreyi eritmeye başlar. Bu olaya kendini eritme anlamına gelen otoliz adı verilir. Otolize uğramış hücreler normal görünümünü kaybederek incelenmesi imkansız hale gelir. Otolizi engellemek amacıyla kullanılan bazı maddeler lizozomların içindeki enzimlerin sitoplazmaya geçişini ve erimeyi önlerler. Bu olaya tespit ya da fiksasyon, bu amaçla kullanılan maddelere de fiksatör adı verilir. Pek çok tespit maddesi ve tespit yöntemi vardır. Uygulayacağımız tespitin sonraki işlemlere, özellikle boyama işlemine bir zarar vermiyor olmasına dikkat etmek gerekir. Örneğin, klasik yöntemlerle tespit ve takip edilen dokularda yağ hücreleri içindeki depo yağını korumak imkansızdır. Hücrelerdeki yağ içeriği takip işlemleri esnasında akar, hücrelerin içleri sonradan boş görünür. Eğer bir çalışmada bu hücreleri yağ içerikleri ile beraber görmek istiyorsak fiziksel bir tespit yöntemi olan dondurma tekniğine başvurabiliriz.
Fiziksel olarak tespit yöntemlerine örnek olarak periferik kan yayma preparatlarının boyanmadan önce ısıtılarak ya da doğrudan kurutularak tesbitini verebiliriz.
Otoliz nedir? Fiksasyon hangi amaçla yapılır?
Kimyasal tespit yöntemleri hem kullanılma sıklığı hem de kullanılan fiksatörlerin çeşitliliği açısından daha çok zenginlik gösterir. En bilinen ve yaygın kullanılan fiksatör formoldür. Formol genellikle %10'luk sulu çözeltisi şeklinde kullanılır. Ticari formol %100'lükmüş gibi kabul edilerek 1 kısım formol, 9 kısım suyla karıştırılarak tesbit sölüsyonu hazırlanır. Ayrıca, glutaraldehit, osmium tetraoksit, bazı asitler, alkoller ya da bunların kombine formları daha az sıklıkla kullanılan kimyasal fiksatörlere örnek olarak verilebilir. Bütün fiksatiflerin istenen özelliklerinin yanı sıra istenmeyen bazı etkileri de vardır. Değişik kombinasyonlar kullanılarak istenen tespit özelliklerinin artmasını, istenmeyen bazı etkilerin en aza indirgenmesini sağlamak mümkündür. Birleşik olarak kullanılan fiksatörler çoğu kere ilk bulup kullanan araştırıcının adıyla anılırlar (Bouin, Carnoy, Zenker gibi).
Elektron mikroskopta incelenecek preparatların hazırlanmasında ultrastruktürel yapının detaylı incelenebilmesi için çift fiksasyon işlemine gereksinim vardır. Bu işlemde önce tamponlanmış glutaraldehit ilk fiksatör olarak, daha sonra tamponlanmış osmium tetroksit ikinci fiksatör olarak kullanılır.
Birleşik tespitten ne anlıyorsunuz?
Doku ve organlardan alınan parçaların tespitinde aşağıdaki konulara dikkat etmek gerekir:
- Tespit ve takipte kullanılan sölüsyonların dokunun içine iyi işlemesi için parçaların yeterince küçültülmüş olmasına özen gösteriniz. Parçanın boyutlarının 0.5 cm. yi geçmiyor olması daha olumlu sonuç verecektir.
- Parçalar alındıktan hemen sonra bekletilmeden tespit sıvısına konulmalıdır.
- Parçalar büyük ve kanlı ise tespit sıvısı yenilenmelidir.
- Tespit sıvısının, hacim olarak konulan parça ya da parçaların minimum kırk katı fazlalığında olmasına çalışılmalıdır.
- Uygulayacağımız her tespit yöntemi için önerilen süreye uyulmalıdır.
-Tespitten sonra parçalar iyi yıkanmalı, yapay görüntülere neden olmaması için tespit maddesi dokudan tamamen uzaklaştırılmalıdır.
- Ayrıca SAĞLIĞIMIZ AÇISINDAN:
Histoloji laboratuvarlarında kullanılan pek çok madde gibi tespit maddelerinin buharlarının canlı hücre ve organizma için son derece zararlı olduğunu aklımızdan çıkarmayıp, bu işlemlerin çeker ocak denilen yerlerde yapılmasına dikkat etmeliyiz. Eğer bu mümkün olmuyorsa laboratuvar ortamının çok iyi havalandırılıyor olmasına özen göstermeliyiz.
Tespitte uyulması gereken kurallar nelerdir?
Tespit işlemleri ne tür yerlerde yapılmalıdır, neden?
Tespit edilmiş parçalar bu aşamadan sonra suyundan arındırılır. Bu işleme dehidratasyon adı verilir. Dehidratasyon işlemi için suyu kolaylıkla kendi bünyesine kabul eden etil alkol, izopropil alkol, dioksan, anilin gibi maddeler kullanılır. Bunlardan en yaygın kullanılanı etil alkoldür. Derecesi absolu alkole kadar ulaşan banyolardan geçirilen parçalar daha sonra ışığı geçirgen hale getirilir. Bu işleme şeffaflaştırma (clearing) işlemi denir. Bu amaçla en sık kullanılan madde ksiloldur. Ayrıca benzen, toluen, kloroform gibi maddeler bu amaçla kullanılan maddelere örnektir.
Bu işlemler petri kutuları gibi buharlaşmayı engellemek için düzgün kapaklı cam kaplarda elle takip şeklinde yapılabildiği gibi otomatik takip makineleri ile de yapılabilir. Otomatik takip makineleri zaman ayarlaması yapılabilen, doku parçalarının istenilen kaplarda istediğmiz kadar kalmasını sağlayan makinelerdir.
Dehidratasyon nedir? Hangi maddeler bu amaçla kullanılır
Elektron mikroskop için hazırlanan preparatlar da doku parçaları dehitratasyon işleminden geçirilir. Bu işlem için de yine ethanol kullanılır. Gömme işleminden önce plastik eritici olan propilen oksit gibi maddelerde infiltre edilir.
Parçalardan rahatça kesitler alabilmek, düzgün kesit yüzeyleri sağlayabilmek için gömme ya da bloklama olarak ifade ettiğimiz işleme başvururuz. Parafin, jelatin, selloidin, karbovaks gibi maddeler bu işleme uygundur. En yaygın kullanılan madde parafindir. 56-60 derecede sıvılaşan parafin etüvde hazır tutulur. Parça prizmatik kalıplar içine konur, üzerine sıvı
parafin dökülür. Parafin laboratuvar ısısında mum gibi donarak sertleşir. Kalıptan çıkarınca içinde bizim doku parçamız da bulunan düzgün prizmatik bir parafin bloku elde ederiz. Parafin intersüller boşluklara hatta hücrelerin içine bile penetre olarak dokuyu daha sabit ve kesilebilir hale getirir. Elektron mikroskop için ışık mikroskobuna oranla çok daha ince kesitlere ihtiyaç vardır. Bu nedenle gömme ya da bloklama işleminde daha sert plastik maddeler gereklidir.
Bunun için epon, araldit gibi epoxy plastik maddeler kullanılır.
Bloklama işleminde ne tür maddeler kullanılır?
Blokladığımız doku ve organ parçalarında düzgün ince kesitler almak için kullandığımız aletlere mikrotom denir. Işık mikroskop incelemeleri için kullandığımız mikrotomlar mikron düzeylerinde ince kesitler alabilirlerken elektron mikroskop araştırmalarında kullanılan ultramikrotomlar angström inceliklerinde kesitler sağlarlar. Işık mikroskobu için kesitler almakta kullandığımız mikrotomlarda çelik bıçaklar kullanılırken, EM için kesitler aldığımız ultra mikrotomlarda cam ya da daha iyisi elmas bıçaklar kullanılır. Işık mikroskop çalışmalarında genellikle 6-10 mikronluk kesitler kullanılır. Mikrotomların bıçakların hareketli olduğu kızaklı mikrotom denilen tipleri ya da bıçaklarının sabit, kesilecek blokların hareketli olduğu rotari mikrotom tipleri vardır. Mikrotom aracılığıyla parafin bloklardan isteğimiz kalınlıklarda dilimler keserken blok içindeki parçadan da aynı kalınlıkta kesitler elde etmiş oluruz. Daha sonra lam üzerinde alınan kesitler boyama işlemine hazır olurlar.
Xylol gibi bazı solventler doku içindeki lipidler gibi bazı maddeleri eritebilirler. Bu istenmeyen etkinin önüne geçmek için cryostat adı verilen dondurma mikrotomları kullanılır. Dokular bu yöntemle düşük ısıda aniden dondurularak takip işlemlerinden geçirilmeden ve bloklanmadan kesit alınabilir hale gelir.
Mikrotom ve Ultramikrotom neye denir?
Çok ufak ayrıcalıklar dışında dokuların büyük bir kısmı renksizdir ve boyanmadığı sürece ışık mikroskobunda incelenmesi zordur. Çeşitli doku ve hücre kısımlarının yapıları nedeniyle farklı kimyasal özellikteki boyaları farklı bir şekilde tutmaları histolojide boyamanın esasını teşkil eder. Histolojik araştırmalarda kullanılan boyaların büyük bir çoğunluğu asit veya
baz özelliğinde olup dokudaki ionize köklerle elektrostatik bağlantı yaparlar. Bu şekilde doku ve hücrelerin daha belirgin bir şekilde ortaya çıkması sağlanırken diğer yandan kimyasal yapısını bildiğimiz boyalarla reaksiyona giren yapıların kimyasal özellikleri ortaya konmuş olur. Histolojik boyalar renklendirici gruplarının asit ya da baz oluşuna göre asit ve bazik boyalar olmak üzere iki ana grupta toplanırlar. Bazik boyaları çeken, o boyanın renginde boyanan hücre ve doku kısımları bazofil boyanıyor ya da bazofili gösteriyor diye tanımlanır.
Genel olarak granüllü endoplazmik retikulumun yoğun olduğu kısımlar, hücre çekirdeği bazofili gösteren yapılardır. Asit boyalarla reaksiyona girerek onun renginde boyanan hücre ya da doku kısımları için asidofil boyanıyor ya da asidofili gösteriyor denir. Bazı ayrıcalıkları olmakla birlikte hücre sitoplazması, kollajen lifler, mitokondrium ve lizozomlar asidofilik yapılardır. Bazik boyalara örnek olarak Metilen Mavisi, Jansiyan Viyole, Bazik Füksin, Azokarmin, Safranin, Hematoksilin, Nükleer Fast Red verilebilir. Eozin, Pikrik Asit, Asit Füksin, Oranj G, Eritrosin, Kongo Kırmızısı, Light Green gibi boyalar asit boyalara örnektir.
Boyalar bazı yöntemlerde tek olarak kullanılır. Bazı yöntemlerde ikili ya da daha çok boya içeren birleşik yöntemler dediğimiz şekillerde kullanılırlar. Birleşik yöntemlerde kesitler birbiri ardından bazik ve asit boyalarla işleme tabi tutulurlar. Birleşik boya yöntemlerinden ikili olanlara örnek olarak çok yaygın bir boyama yöntemi olan Hematoksilin+Eozin (HE) yöntemi gösterilebilir. Azokarmin, Oranj G ve Anilin Mavisinden oluşan Heidenhein İn Azan yöntemi ise üçlü bir boyama yöntemidir.
Asidofili ve bazofili neye denir?
Birleşik boyama neye denir?
Bazı boyalar, bazı yapıları boyanan çözelti renginden farklı bir renge boyarlar. Bu olaya metakromazi, böyle boyalara da metakromatik boyalar denir. Örneğin toluidin mavisi dokuya düşük konsantrasyonda bağlandığında mavi renkte boyar (ortokromatik). Oysa bir yapıya yüksek konsantrasyonda bağlandığında mor-kırmızı renkte boyar (metakromatik).
Toluidin mavisinin Mast hücrelerinin granüllerini mor-kırmızı boyaması metakromatik boyanmadır.
Bazı lipidler, makromoleküller metafosfat, sülfomukopolisakkaritler, nükleik asitler metakromazi gösteren yapılardır. Toluidin mavisi, Metilen mavisi, Azur A gibi boyalar ise metakromatik boyalara örnek verilebilir.
Ortokromazi ve metakromazi nedir?
Bazı boyalar deneysel amaçla doğrudan canlıya verilebilir. Bu renkli maddeler organizmada bazı yerlerde tutularak canlıda boyanma sağlarlar. Örneğin, tripan mavisi deney hayvanının dolaşımına verildiğnide karaciğer kupffer hücreleri tarafından tutulur. Böylece hayvan daha canlıyken sitoplazması mavi tanecikler tarzında boyunmış olur. Vital boyalardan Tripan mavisi, Kongo kırmızısı, Çini mürekkebi, Alizarin ve Lityum karmin asit karakterde vital boyalardır. Metilen Mavisi, Nötral Red, Janus Green, Krezil Viyole ve Nigrosin bazik karakterde vital boyalardır.
Vital boyamanın diğer boyama yöntemlerinden farkı nedir?
Boyama işleminden sonra kesitler yeni baştan dehidrate edilir ve şeffaflaştırılır. Daha sonra üzerlerine lamel kapatılarak korunur. Preparatların kapatılmasında Kanada Balsamı ya da son zamanlarda ucuzluğu ve çabuk kuruması yönünden tercih edilen bazı sentetik yapıştırıcılar kullanılmaktadır. Uzun süre saklanılması düşünülen preparatları doğrudan güneş ışığı ya da kuvvetli ışıklardan sakınmak gerekir. Aksi takdirde boya solacaktır.
Dokuların renkli boyalarla boyanmasının yanı sıra altın, gümüş gibi bazı metallerin seçici olarak bazı kısımlara çöktürülmesi de o bölgelerin mikroskop altında kolayca belirlenmesini sağlayan boyadışı bir renklendirme yöntemi olarak karşımıza çıkar.
histoloji preparatlarinin hazirlanmasi