Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens | Protocol (Translated to Turkish)
Bir Tükürük Antikor Multiplex Immuoassay Gelişmekte Çevre Patojenler İnsan Pozlama'yı Tedbir
Bir Multiplex Antikor Tarama Yöntemi kullanılarak r Luminex xMAP Tahlil için bir Capture ELISA Dönüşüm…
Multiplexed Florometrik immunoassay Test Metodolojisi ve Sorun Giderme…
Klinik Antikor Örnekleri fagositik AktivitesiBelirlenmesi…
Protein-Protein Etkileşimi Okumak Manyetik Boncuk ullanarak Bir Sıvı Faz Affinity Yakalama Testi: Poliovirüs-Nanobody Örnek…
Augustine, S. A., Eason, T. N., Simmons, K. J., Curioso, C. L., Griffin, S. M., Ramudit, M. K., Plunkett, T. R. Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens. J. Vis. Exp. (115), e54415, doi:10.3791/54415 (2016).
etiyoloji ve çevresel patojenlere karşı insan maruziyet etkileri dolayısıyla, pozlama ve enfeksiyonlar kullanarak maliyetli, yüksek hacimli yaklaşımları değerlendirmek yeteneği vazgeçilmez olacağını, dünya çapında önemli bir endişe ve. Bu yazıda, aynı anda birden fazla patojen insan tükürük antikorların varlığı ölçebilen bir tane bazlı çoklu immunoassay geliştirilmesi ve analizini açıklamaktadır. o, invaziv olmayan ucuz ve serum daha toplamak için kolaydır çünkü tükürük bu uygulamada özellikle çekici. Çevresel patojenlerinin antijenlerinin karboksillenmiş mikrosferler (taneleri) birleştirilmiş bir tane bazlı, solüsyon faz tahlili kullanılarak insan tükürük örnekleri çok küçük hacimlerde antikorları ölçmek için kullanılmıştır. Boncuk Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, Noroviruses (G I.1 ve G II.4) antijenleri ve hepatit A virüsü ile birleştirildi. antijenler yeterli birleştirildi sağlamakboncuklar, birleştirme biyotinlenmiş anti-tür ikincil bir saptama antikorları ve streptavidin-R-fikoeritrin muhabir (SAPE) ile kuluçkalandı ve ardından, türe-özgü, hayvansal kaynaklı primer yakalama antikorları kullanılarak teyit edildi. herhangi bir antijene bağlı değildi dışında spesifik olmayan ölçmek için bir kontrol olarak, bir boncuk grubu diğerlerine aynı işleme tabi tutuldu. antijen bağlı olan ve kontrol tanesi, daha sonra akış sitometrisi ilkelerine göre yüksek bir verim Analyzer üzerinde ölçülen, ileriye yönelik olarak toplanan, insan tükürük numuneleri ile inkübe edilmiştir, ve her bir antijene karşı antikorlar, ortalama florasan yoğunluğu birimleri (MFI) ölçüldü . Bu multipleks immunoassay daha az numune ile daha fazla veri içeren avantajlar, bir numarası vardır; azaltılmış maliyetler ve işçilik; ve yetenek ilgi birçok hedefleri tahlil özelleştirmek için. Sonuçlar tükrük çoklu bağışıklık especia olabilir, daha önceki maruz ve enfeksiyonları belirleme yeteneğine sahip olabileceğini göstermektedirBüyük insan topluluklarını kapsayan gözetim çalışmalarında Lly faydalıdır.
Ishal ilişkili hastalık seksen sekiz yüzde dünya çapında yaklaşık 1.5 milyon ölüme neden, kirli su insan maruz güvensiz gıda ve kötü sanitasyon / hijyen ile ilişkilidir, çoğunluğu çocuk 1 bulunmaktadır. Bu halk sağlığı yetkilileri ve politika yapıcılar için endişe önemli bir nedenidir. Su bazlı ve diğer çevresel patojenler ile ilişkili pozlama ve hastalıkları araştırmak için bir çaba, insan örneklerinde 2-4 antikorları ölçmek için bir multipleks immunoassay geliştirdi. Bu yöntem, bu patojenlere maruz kalma belirlemek ve daha iyi immunoprevalence ve olay enfeksiyonları tanımlamak için epidemiyolojik çalışmalar uygulanabilir.
Tükürük insan biyomarker araştırma için serum alternatif olarak önemli söz sahibidir. Tükürük kullanmanın avantajları arasında non-invaziv ve numune toplama, düşük maliyet kolaylığı vardır, ve numuneler kolayca çocukların 5-7 <alınabilir/ Sup>. Serum ve tükürük örnekleri H. karşı antikorlar için yoğun çalışmalar yapılmıştır pylori 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumonia 12, hepatit virüsleri A ve C 13-14, Noroviruses 2-4,15, T. gondii 2-4, dang humması virüsü 16, insan bağışıklık eksikliği virüsü (HIV), 17 ve Escherichia coli O157: H7 18.
Bir çoklu immünolojik eş zamanlı olarak tek bir örnek hacmi içinde ve bir döngü veya çalışmasında çok analit analizi sağlar. C Çoklanmış antijenler jejuni, T. gondii, H. pylori, hepatit A virüsü, ve iki Noroviruses bir kullanarak bu patojenler, insan tükürük IgG 2-4 ve IgA 3,4 ve plazma IgG 2,3 antikor tepkilerini ölçmek için kullanılmıştırBoncuk esaslı çoklayıcı immüno. su, toprak ve gıda mikroplara maruz kalma epidemiyolojik çalışmalar ile birlikte kullanıldığında, bu çalışmada açıklanan testin tipi çevre patojenlerin neden olduğu enfeksiyonların anlayışı geliştirmek için değerli bilgiler verebilir. Ayrıca, bu tür çalışmalarda elde edilen tükürük antikor veriler risk değerlendirmesi modelleri 19-22 geliştirmek için kullanılabilir.
Onay (KİK # 08-1844, Kuzey Karolina, Chapel Hill, NC, USA Üniversitesi) Boquerón Beach, Porto Riko, en beachgoers gelen uyarılmış oluğu tükürük örneklerinin toplanması için Amerika Birleşik Devletleri'nde bir parçası olarak Kurumsal Değerlendirme Kurulu elde edildi çevre Koruma Ajansı (USEPA) Milli Epidemiyolojik ve Dinlenme (NEEAR) Su Çalışması 23 çevresel Değerlendirme yüzme ilişkili risklerini ve hastalıkları değerlendirmek için. Çalışma konuları bilgilendirilmiş onam sağlanan ve eğitimli USEPA yükleniciler tarafından tükürük toplama cihazının kullanımı ile ilgili talimatı verildi. Tükürük numuneleri alınması üzerine, bu santrifüjlenmiş ve 4 anlatıldığı gibi -80 ° C'de saklandı, buz üzerinde taşınmıştır ve bulundu.
1. Boncuk Aktivasyon
Vorteks ve 20 saniye sonicating ve mikrosantrifüj tüplerine stok boncuk (400 ul) transferi yaklaşık 5.0 x 10 6 tarafından süspanse boncuk seti stokları.
Not: TO 12.5 x 10 6 boncuk / ml'lik bir konsantrasyonda temin edilmektedir boncuk.
2 dakika süreyle 10,000 x g'de santrifüj edilerek stok boncuk pelet.
20 saniye boyunca girdap ve sonikasyon ile damıtılmış su (dH 2 O) Süpernatantı ve 100 ul pelet boncuklar tekrar süspansiyon. Adımı tekrarlayın 1.2.
Süpernatantı ve 20 saniye vorteksleyin ve sonikasyon ile 100 mM sodyum fosfat monobazik, pH 6.2, 80 ul yıkandı boncuklar tekrar süspansiyon.
Kullanımdan hemen önce, 10 mg Sülfo-NHS kana 200 ul dH 2 O eklenerek 50 mg / ml N -hydroxysulfosuccinimide (Sülfo-NHS) çözüm. girdap ile karıştırın.
Boncuklar 50 mg / ml Sülfo-NHS 10 ul ekle. girdap ile karıştırın.
Kullanımdan hemen önce, 10 mg EDC kana 200 uL damıtılmış su (DH 2 O) eklenerek 50 mg / ml 1-etil- [3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorür (EDC) çözüm. girdap ile karıştırın.
50 10 ul ekleyintanelere mg / ml EDC çözeltisi. girdap ile karıştırın. 10 dakika aralıklarla girdap karıştırma ile, karanlıkta, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca boncuk inkübe edin. 2 dakika için 10,000 x g'de mikrosantrifüj ile aktive boncuklar Pelet.
Süpernatantı ve 20 saniye vorteksleyin ve sonikasyon ile, 50 mM 2- [N-morfolino] etansülfonik asit (MES), pH 5.0, 250 ul içinde yeniden süspanse boncuklar.
2 dakika için 10,000 x g'de mikrosantrifüj ile aktive boncuklar Pelet.
Tekrarlayın 1.9 ve 1.10 adımları.
Not: Bu, 50 mM MES, pH 5.0 ile iki kez yıkamadan toplam sağlar.
20 saniye vorteksleyin ve sonikasyon ile 50 mM MES, pH 5.0, 100 ul boncuk tekrar.
2. Boncuk Kaplin
Çift Tablo 1 'de gösterilen konsantrasyonları kullanılarak kordon kümelerine antijenler.
aktive boncuklar, her antijen ekleyin ve 50 mM MES, pH 5.0 içinde 500 ul toplam hacim getirmek. antijenleri karıştırın birgirdap tarafından d boncuklar.
karanlıkta, oda sıcaklığında dönme (~ 15 dak) karıştırma ile 2 saat süre ile, antijenleri ve boncuk inkübe edin. 2 dakika için 10,000 x g'de mikrosantrifüj ile bağlanmış boncuk Pelet.
Süpernatantı ve fosfat tamponlu tuzlu su, 500 ul içinde yeniden süspanse boncuklar (PBS) -bovine serum albümini (BSA) -polyoxyethylenesorbitan monolaurat (Tween-20) -sodyum azid (PBS-TBN) girdap ve sonikasyon ile pH 7.4 ile yıkanır. 2 dakika süreyle 10,000 x g'de mikrosantrifüj ile boncuk pelet ve süpernatant kaldırmak.
Dikkat: Sodyum azid bir akut toksik bir kimyasaldır. Yutma veya cilt ile temasında alırsa o ölümcüldür. Toz / duman / gaz / sis / buhar veya sprey teneffüs etmeyin. Uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) 'ın işlerken giyin ve uygun kanunlara uygun olarak bertaraf edin.
20 saniye vorteksleyin ve sonikasyon ile PBS-TBN 1 ml boncuk tekrar.
2 dakika için 10,000 x g'de mikrosantrifüje edilerek boncuk Pelet.
Tekrarlayın 2.5 ve 2.6 adımları tekrarlayın.
Not: Bu PBS-TBN ile iki yıkar toplam sağlar.
1 ml PBS,% 1 BSA,% 0.05 azid, pH 7.4 içinde bağlı ve yıkandı boncuk süspanse. karanlıkta 2-8 ° C buzdolabı bağlanmış boncuklar saklayın.
3. Boncuk Sayısı
su veya PBS tamponu içinde bağlanmış boncuk 1:10 seyreltme hazırlayın.
Yük örnek tanıtım noktasında bir hemasitometre üzerine boncuk seyreltme 10 ul.
4 x 4 köşe ızgaraları birinde görülen boncuk sayın. Kont (4 x 4 ızgara 1 köşesi) x (1 x 10 4) x (seyreltme faktörü) ml x tabanda hacmi: aşağıdaki formül kullanılarak birleştiğinde boncuk toplam sayısını hesaplayın.
Antijen bağlamalar 4. Onay
20 saniye boyunca girdap ve sonikasyon ile ilgi antijenlere birleştiğinde boncuk stok karışımı tekrar süspansiyon.
nihai bağlanmış boncuk stokları seyrelterek bir çalışma boncuk karışımı hazırlayınPBS-% 1 BSA tamponu (PBS% 1 BSA, pH 7.4) içinde belirlenen her bir benzersiz boncuk / ml, 100 boncuk konsantrasyonu.
en az 7 PBS-% 1 BSA tamponu ile 96-gözenekli yuvarlak tabanlı plakanın üreticinin tavsiyelerine göre IgG primer antikor anti-tür seri seyreltileri iki misli hazırlayın.
Yıkama tamponu, 100 ul her bir antijen birleştirme doğrulama testi için 96 oyuklu filtre taban plakasının ayrı bir 8 oyuklu kolonu (8 sıra) önceden ıslak ve vakum ile süpernatantı. Önceden ıslak oyuklara boncuk karışımı (antijene bağlanan boncuklar) Çalışma 50 ul ekle.
Arka plandaki kuyulara olarak hizmet seyreltilmiş antikor yerine 8 satır 96-çukurlu bir filtre plakasının her bir sütunun satır 1-7 ve PBS% 1 BSA tamponu 50 ul antikor seyreltileri 50 ul ekle. pipetleme ile 5 kez aşağı çok kanallı bir pipet ile karıştırılır. Her antijen birleştiğinde boncuk seti için aynı prosedürü uygulayın teyit edilecek.
Kapak ve oda sıcaklığında karanlıkta inkübe izin500 rpm'de bir mikro çalkalayıcı içinde 1 saat süre ile kısa süreli olarak. vakum ile süpernatantı.
yıkama tamponu 100 ul ile kuyu yıkayın ve vakum ile süpernatant kaldırmak. 1x tekrarlayın. Çok kanallı bir pipet ile PBS-% 1 BSA, 50 ul boncuk tekrar.
PBS-% 1 BSA içinde 16 ug / ml biyotinile anti-türe özel IgG sekonder antikor saptama seyreltilir.
aşağı 5 kez yukarı pipetleme ve her kuyuya seyreltilmiş ikincil antikor 50 ul ekleyin.
Filtre plakasını örtün ve bir plaka karıştırıcısı üzerinde 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe izin verin. vakum ile süpernatantı. yıkama tamponu 100 ul ile kuyu yıkayın ve vakum ile süpernatant kaldırmak. yıkama 1x tekrarlayın.
Çok kanallı bir pipet ile PBS-% 1 BSA, 50 ul boncuk tekrar.
PBS-% 1 BSA içinde 24 ug / ml streptavidin-R-fikoeritrin reporter (SAPE) seyreltin.
her muhabir 50 ul iyi ekleyin ve yukarı pipetleme ve 5 kez aşağı karıştırın.
Cve filtre plakası üzerine bir plaka karıştırıcısı üzerinde 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe izin verin. vakum ile süpernatantı. yıkama tamponu 100 ul ile kuyu yıkayın ve vakum ile süpernatant kaldırmak. yıkama 1x tekrarlayın.
Yeniden süspanse PBS-% 1 BSA, 100 ul boncuk ve analiz cihazı 29 ile 50 ul analiz eder.
Not: tane bazlı çoklu immüno Sonuçlar ortalama florasan yoğunluğu (MFI) olarak ölçülür. hataları önlemek için varsa, her zaman, yazılım kılavuzunun en son sürümü bakın.
5. Tükürük Multiplex İmmunoassay
-80 ° C dondurucu tükürük alınır ve oda sıcaklığında erimeye sağlar.
Süspanse antijen 20 saniye vorteks ve sonikasyon ile boncuk stokları birleştiğinde.
PBS-% 1 BSA tampon içinde benzersiz her boncuk grubunun / ml, 100 boncuk nihai konsantrasyona bağlı kordon stokları seyrelterek bir çalışma boncuk karışımı hazırlayın.
tükürük 4 seyreltme w: 1 hazırlayınPBS-% 1 BSA, 96 tampon de, derin oyuklu plakaya i.
Ön ıslak filtre yıkama tamponu 100 ul ile plaka ve vakum ile süpernatant kaldırmak.
8 nihai seyreltme: çalışan bir boncuk karışımı ve 1 96 oyuklu filtre plakası 95 oyuklarına seyreltildi tükürük, eşit hacimde 50 ul ekle. Çok kanallı bir pipet ile reaksiyonları karıştırın. de birinin kontrol edilmesi için, 50 ul antijen bağlanan boncuklar artı (tükürük için bir yedek olarak) PBS-% 1 BSA tampon 50 ul ekle.
Kapak 500 rpm'de bir mikro-plaka çalkalayıcıda 1 saat süreyle oda sıcaklığında karanlıkta inkübe sağlar. vakum ile süpernatantı. yıkama tamponu 100 ul ile kuyu yıkayın ve vakum ile süpernatant kaldırmak. yıkama 1x tekrarlayın.
Çok kanallı bir pipet ile PBS-% 1 BSA, 50 ul içinde süspanse boncuklar.
PBS-% 1 BSA içinde 16 ug / ml biyotinile edilmiş keçi anti-insan IgG ikincil antikoru saptama seyreltilir.
her çukuruna ikincil antikor seyreltilmiş 50 ul ekle ile karıştırınÇok kanallı bir pipet.
her 50 ul muhabiri de ekleyin ve çok kanallı pipet ile karıştırın.
Not: çoklu immüno Sonuçlar ortalama florasan yoğunluğu (MFI) birimleri cinsinden ölçülür. Her zaman ifadeYazılım kılavuzun en son sürümü, varsa hataları önlemek için.
Bir benzersiz Boncuk değişkenlik örnek için spesifik olmayan bağlanma ölçmek ve kontrol numunesi olarak kullanılmıştır. Bu boncuklar da birleştirme aşamasında herhangi bir antijen ile inkübe değil haricinde antijene bağlanmış boncuklara benzer şekilde muamele edilmiştir. ayrıca serumdan şüpheli kirlenme nedeniyle analizleri ve kalan yanıtlar dağıtılan log edildi tüm tükürük örnekleri ile inkübe kontrol boncuk elde edilen MFI değerleri> 500 çıkarıldı. dişeti toplama cihazına veya çalışma katılımcı periodontal hastalık varsa ekli sünger ile çok güçlü bir şekilde ovuşturdu eğer tükürük serum ile kontamine olabilir. Günlük MFI veri ortalama artı günlük MFI değerlerinin 3 standart sapma dayalı 505 MFI bir immünopozitif kesme noktasını hesaplamak için kullanıldı dönüştürdü. Buna ek olarak, antijene bağlı boncuklar inceltilmiş dışında her şekilde test kuyuları tedavi edildi belirli çukurlara eklendiuted tükürük arka floresan ve çapraz reaktivite değerlendirmek için PBS-% 1 BSA ile değiştirildi. Bu Arka plandaki kuyulara elde edilen MFI değerleri her tükürük örnek için her bir antijen-bağlı kordon kümesinden MFI değerleri çıkarılmıştır.
Boncuk bağlama her bir antijen için spesifik hayvan kaynaklı türe özgü primer saptama antikorları kullanılarak teyit edildi. 2 tarif edildiği gibi, antijen bağlanan boncuklar tahlilinin dinamik aralığını yaklaşan sahip olmasını sağlamak için, bir MFI ≥18,000 doz tepkisi ve primer antikorlar ile <% 10 hedef olmayan arasında çapraz reaktivite gözlem gibi uygun kuplaj tanımlanan . C. Örnek birleştirme teyit jejuni ve T. tahlilinde antijenlerin gondii, Şekil 1 'de gösterilmiştir.
(505 MFI) kuruldu kesme noktasına göre, immunoprevalence oranınumuneler için S (n = 2.078) yaklaşık% 2 (n = 41) ile ilgili T için değişmektedir gondii norovirus GI.1 (Şekil 2) için yaklaşık% 50 (n = 1009) için. Veri immunoprevalence hızı Noroviruses için en yüksek hepatit A virüsü ve H. izledi belirtmek pylori.
Örneklerin% 32 (n = 672), deneyde patojenlerin tüm immunonegative iken,% 68 (s = 1,406) Şekil 3., Bir ya da daha fazla patojenlere immunopozitif bir ya da daha çoğuna immünreaksiyon dağılımını göstermektedir patojenler.
Şekil 1: bağlanması onay çoklu bağışıklık organizma için iki analiz birleştirilmesi onayı antijenleri için gerçekleştirilmiştir ve grafikler C için edildi. jejuni ve T. Bu şekilde gondii repre edilirSorumlunuzu multipleks immunoassay içinde antijenler için bağlantı teyidinde. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Çoklu bağışıklık belirli patojenlerin özgü patojenlere Immunoprevalence Immunoprevalence yaklaşık% 2 ila T. değişmektedir gondii norovirus GI.1 için yaklaşık% 50 arasındadır. Norovirus antijenlerine karşı antikorlar, daha yaygın olarak HAV (hepatit A virüsü) ve ardından H gözlenmiştir pylori. T. gondii ve C jejuni antikorlar analiz tükürük örneklerinde daha az sıklıkla ortaya çıktı. inci büyük halini görmek için tıklayınızrakamdır.
Şekil 3:. Birden patojenlere immünreaksiyon dağılımı aynı zamanda çoklu immüno aynı anda 50 ul örnek hacmi birden fazla patojenlere immünreaksiyon analizi sağlar. Hemen hemen tahlil tükürük örnekleri üçüncü bir multipleks antijenlerin her karşı antikorlar için immunonegative oldu. çeyrek iki antijenlere pozitif iken yaklaşık örneklerin% 31'i bir antijen için immünopozitif oldu. % 9.4, üç antijenlere immünopozitif oldu. % 3 aynı anda dört ya da daha fazla antijenlere karşı olumlu oldu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Antijen Boncuk Seti birleştirme tamponu Ag Konsantrasyon (ug) 1 köşede boncuk # Boncuk içinde / ml Vol. 4 ml 100 B / uL (ul) için
C. jejuni 8 MES 5.0 50 64 6400 94
H. pylori 33 MES 5.0 25 71 7100 85
Hepatit a 42 MES 5.0 100 91 9100 66
T. gondii 30 MES 5.0 25 85 8500 71
Norovirüs GII.4 55 MES 5.0 5 72 7.200 83
Norovirüs GI.1 67 MES 5.0 5 63 6300 95
uncoupled 80 MES 5.0 60 6.000 100
tanelerin toplam hacmi (ul) 594
ihtiyaç duyulan tampon toplam hacmi (ul) 3406
Tablo 1:. Birleştirme ve onay tamamlandıktan sonra gösterildiği gibi çoklu immunoassay için tanecik karışımı çalışan her kordon kümesi oluşan bir ana karışımı elde edilmiştir. master miks bir arasında dağıtıldı96 gözlü plaka içindeki deliklerin LL. Wells tümü sadece boncuk ve PBS-% 1 BSA tampon ihtiva edilen bir plan kontrol oyuğu dışında tükürük ile inkübe edildi.
Bu sonuçlar, çok katlı bir bağışıklık deneyi, immünopozitif ya immunonegative olan tükürük örnekleri arasında ayrım için yararlı olduğunu göstermektedir. immunopozitivitesi belirlemek için, tek bir kesim noktası ortalama artı tükürük örneklerinin her test kontrol Kuplajsız boncuk log dönüştürülmüş MFI yanıtları üç standart sapma hesaplanırken tarafından geliştirilmiştir. kesim noktası, ya bir tek ya da çok patojenlere maruz kalma ve immunoprevalence değerlendirme yeteneği elde edildi. Bu ayrımcı güç, çevresel ve diğer patojenlere maruz kalma ile ilgili sağlık riskleri araştırmak için nüfus çalışmalarında yararlı olabilir.
MFI dağıtımı, Kuplajsız kontrolleri ve hangi çalışma cevaplamak için tasarlanmıştır soru bağlı bir cut-off noktası belirlemek için kullanılabilecek birkaç başka yöntemler vardır. Cut-off belirlemek için bazı örnekler, sonlu karışık modelleme 24-26 dahil ortalama artı 3kontrollere cevapların standart sapmaları, denetimlere cevapların 2 standart sapma ve kontroller 27,28 verilen yanıtların üç kez ortalama artı anlamına gelir. Basit gösterimleri için, daha az sıkı kriterler kullanılabilir fakat epidemiyolojik çalışmalar için, yanlış pozitif raporlama olasılığını azaltmak için daha sıkı bir tanım istihdam etmek daha uygun olabilir. Bizim ilk uygulama yüzücüler ve bilmeyenlerin arasında immunoconversion ve immunoprevalence bakmaktır. Bu çalışmada, Kuplajsız kontrol MFI normal dağılım ve sonuçları günlük dönüştürülmüştür.
Bir boncuk tabanlı multipleks immunoassay yapmadan avantajları zaman ve emek ve reaktiflerin az miktarda gerektiren süre aynı anda en fazla 500 analitler için tepkilerini ölçmek yeteneği çok düşük örnek hacimlerinin kullanımı, azaltılması sayılabilir. Buna karşılık, maruz kalma ve / veya enfeksiyon durumunu işaret antikor düzeylerinin değerlendirilmesi geleneksel yöntemleri (örneğin
çoklu bir bağışıklık sınırlamaları primer yakalama ve ikinci algılama antikorlar, antijenler ve raportör optimal konsantrasyonlarını belirlemek için sıkı optimizasyon ihtiyacı bulunmaktadır. Belirli bir antijene karşı oluşan antikorlar, diğer organizmalardan antijenleri ile çapraz reaksiyona girecektir ve böylece yanlış pozitif okuma neden olabilir çapraz reaktivite bağışıklık önemli bir husustur. Optimizasyon, çapraz reaktivite ve spesifik olmayan bağlanma, daha önce 2-4 ele alınmıştır. Böyle bir deneyde başarısı belirgin Antibo yanı sıra yüksek oranda immünojenik antijenler elde yeteneği büyük ölçüde bağlıdırBoncuk bağlama ve birleştirme onayı adımda kullanmak için bu antijenlere karşı ölür. Başka bir sınırlama deneyleri doğrulamak için karakterize (tanısal pozitif ve negatif) örneklerinin sınırlı bulunmasıdır.
protokolü içinde kritik adımlar vardır. Bunlar: yabancı proteinlerin, azid, glisin, Tris ya da herhangi bir primer amin ihtiva etmeyen boncuklara bağlanmış olan antijenler sağlamaktır. bu maddelerin herhangi bir antijen hazırlanmasında varsa, diyaliz veya kromatografi ile çıkarılmalıdır. Biri 5 milyon boncuk başına antijen 5 ug ile başlar ve optimal konsantrasyonunu bulmak için titre tavsiye edilmektedir. En iyi hassasiyet ve dinamik aralık verir optimum algılama antikor konsantrasyonunu seçin. sinyaller antijen ve tespit antikor konsantrasyonları artış (kanca etkisi) olarak azalma eğilimindedir unutmayın. antijen konsantrasyonu artar sonra tespit Örneğin, sinyal düşmesi durumundaİyon antikoru sınırlayıcı olabilir. Bunun tersine, sinyaller raportör (SAPE) daha sonra algılama antikoru arttıkça azalırsa sınırlayıcı olabilir. Her proteinin (kuyu başına belirlenen her bir tanenin 5.000) için en uygun kaplin birleştirerek çapraz reaktivite için multipleks edin. Optimal algılama antikoru miktarı ile birleştirerek multipleks boncuk setleri test edin. muhabir optimize etmek ve tek tek her antijen test ederek antijenin bir standart eğri yapmak.
duyarlılığı geliştirmek ve medyan floresan sinyal artırmak için multipleks immunoassay Giderme önem taşımaktadır. hassasiyetini artırmak için, ya da boncuk veya algılama antikoru konsantrasyonuna bağlı antijen miktarını azaltır. yakalama ve / veya tespit edilmesi için daha yüksek bir afinite antikorun kullanımı da duyarlılığı iyileştirebilir. boncuklara bağlanmış antijen miktarının artırılması ortalama flüoresan sinyal arttırabilir. Bir çalışmada polyvinylal serum örnekleri ön kuluçka gösterdicohol artı polivinilpirolidon (PVX) tamponu gibi burada tarif edilmektedir olarak tane bazlı çoklu tahlil 30 kullanılarak serolojik deneylerde spesifik olmayan bağlanmayı önlemek edebilmektedir. Ancak, bizim işbirlikçileri tarafından başka bir çalışmada PBS-BSA ve PVX tamponlar arasında anlamlı bir etkisi bulunamadı. Onlar daha nedeniyle PVX tampon yüksek viskozite, bu mikroplak kuyuları 3 cihazında boncuk edinimi ve oluşan köpük ile ilgili sorunlar yarattığı sonucuna varmıştır.
Sonuç olarak, aynı zamanda, bir çok küçük bir numune hacmi çok sayıda patojenin insan tükürük antikorların varlığı ölçme yeteneğine sahip bir yöntem sunulmuştur. Gelecekte, bu testte yüzme ilgili maruziyet veya enfeksiyonlarla ilişkili tükürük antikorlarının varlığını tespit etmek ve risk değerlendirme modellerini bilgilendirmek yardımcı olmak için kullanılacaktır. Buna ek olarak, deney hava ve gıda kaynaklı exposur ile bağlantılı antikorlar ölçmek için kullanılabilires, olay enfeksiyonlar veya immunoconversions belirlemek ve anket tipi nüfus çalışmalar yürüten epidemiyologler kritik immünolojik bilgiler sağlar.
Araştırma ve Geliştirme onun Ofisi aracılığıyla Amerika Birleşik Devletleri Çevre Koruma Ajansı tarafından finanse edilen ve burada açıklanan araştırma başardı. Bu Kurumun idari inceleme tabi ve yayın için onaylanmıştır. ticari adları veya ticari ürünlerin Mansiyon kullanımı için onay ya da tavsiye niteliğinde değildir.