Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography | Protocol (Translated to Turkish)
Zararsız ve uzun-dönem için bir adım adım Protokolü vasküler remodeling ve gerçek zamanlı kültür iskele yıkımı biyobozunur polimer iskele tabanlı doku mühendisliği kan damarlarının pulsatil stimülasyon ile işlem izleme Optik koherens tomografi kullanılarak burada açıklanmıştır.
Yapısal ve mekanik özellikleri doğal kan damarları için benzer ile mühendislik vasküler Greftler atardamar bypass için artan talebi karşılamak için bekleniyor. Büyüme dinamikleri karakterizasyonu ve remodeling süreci parçalanabilir polimer iskele tabanlı doku mühendisliği kan damarlarının (TEBVs) pulsatil stimülasyon ile damar doku mühendisliği için önemlidir. Optik görüntüleme teknikleri vaskülarizasyon mühendislik doku yüksek çözünürlüklü görüntü gerçek zamanlı kültür etkinleştirme izleme için güçlü araçlar olarak göze çarpıyor. Bu kağıt bir zararsız ve hızlı gerçek zamanlı strateji büyüme izlemek için görüntüleme ve TEBVs uzun vadeli kültüründe optik koherens tomografi (OCT) kullanarak remodeling gösteriyor. Geometrik morfoloji vasküler remodeling süreci, duvar kalınlığı ve karşılaştırma TEBV kalınlıkta farklı kültür zaman puan ve pulsatil stimülasyon varlığı da dahil olmak üzere değerlendirilir. Son olarak, OCT veya gerçek zamanlı gözlem altında pulsatil stimülasyon reconstructing dokularda polimer bozulması için pratik olanakları sağlar tarafından değil ve her gemi segmentinde polimer bozulması kullanarak değerlendirmesi ile karşılaştırıldığında Tarama elektron microscopic(SEM) ve polarize mikroskop.
Kan damarları (TEBVs) doku mühendisliği en umut verici malzeme bir ideal vasküler greft1' dir. Klinik olarak benzer yapısal ve işlevsel özellikleri olarak yerli gemiler ile yararlı olması için Greftler geliştirmek için bir çok teknik vasküler işlevi2,3korumak için tasarlanmıştır. Her ne kadar kabul edilebilir a_ılabilinirse oranları ile mühendislik damarları implantasyon sırasında ve faz III klinik çalışmada4, uzun vadeli kültür ve yüksek maliyet de TEBVs gelişimi izleme gerekliliği gösterir. Hücre dışı matrix(ECM) büyüme, yenileme ve uyum süreçlerinde TEBVs biomimetic kemoterapi-mekanik ortamında anlayış damar doku mühendisliği gelişimi için çok önemli bilgiler sağlar.
Küçük çaplı mühendislik damarları5 gelişimini izlemek için ideal strateji zararsız, steril, boyuna, üç boyutlu ve nicel olmalıdır. TEBVs farklı kültür koşullar altında bile değişiklikler öncesi ve sonrası damar nakli dahil olmak üzere bu görüntüleme yöntemi tarafından değerlendirildi. Mühendislik yaşam gemilerin özelliklerini açıklamak üzere stratejileri ihtiyaç vardır. Optik görüntüleme teknikleri görselleştirme ve miktar Biyomalzeme ve doku birikimi sağlar. Diğer avantajları ile yüksek çözünürlük6,7derin doku ve etiket içermeyen görüntülemede etkinleştirmek için olasılığı vardır. Ancak, görüntü özgü molekülleri ve daha az kolayca erişilebilir optik donanımları, gerçek zamanlı izleme için doğrusal olmayan optik mikroskobu kapsamlı uygulama sınırlı olan önemli bir pratik engel olur. Optik koherens tomografi (OCT) kardiyak girişimsel tedavi8rehberlik için bir çok kullanılan klinik araç olarak damar içi görüntüleme yöntemi ile optik bir yaklaşımdır. Literatürde, Ekim yöntemi TEBVs9,10damar doku mühendisliği araştırma için olumlu görüntüleme yöntemleri ile birleştiğinde, duvar kalınlığı değerlendirmek için bir yol olarak bildirildi. Dinamikleri vasküler mühendislik ise büyüme ve remodeling değil görülmektedir.
Bu makale, biyobozunur polimer iskele tabanlı TEBVs hazırlanması için dört hafta kültür ayrıntı. İnsan göbek arterlerin vasküler düz kas hücreleri (HUASMCs) genişletilmiş ve gözenekli parçalanabilir Poliglikolik Asit (PGA) iskele biyoreaktör içinde içine tohumlari. Biyobozunur polimerler doku mühendisliği için geçici bir substrat rolü oynamak ve bir belirli bozulma hızı11var. İskele bozulması ve neo-doku oluşumu arasında uygun bir eşleşme sağlamak için ECM ve PGA iskele etkili vasküler remodeling için çok önemli faktörlerdir. Perfüzyon sistemi yerli gemilerin biyomekanik microenvironment taklit ve tutarlı bir deformasyon basınç stimülasyon altında tutar.
Sunulan Protokolü amacı görüntüleme TEBVs ve uzun vadeli kültürünü izleme için nispeten basit ve zararsız bir strateji tarif etmektir. Bu iletişim kuralı görselleştirme morfolojik değişiklikler ve farklı kültür koşullar altında mühendislik gemilerin kalınlığı ölçümleri için yararlı olabilir. Ayrıca, polimer esaslı malzemeler bozulması iskele mühendislik doku analizleri için kimlik gerçekleştirilebilir. Elektron tarama yöntemleri birleştirerek microscopic(SEM) ve bu iletişim kuralı, korelasyon ve miktar hücre dışı matriks dağıtım ve PGA yıkımı kullanılan polarize mikroskop, hangi değerlendirilmesi iskele kolaylaştırabilir yapılabilir bozulma OCT görüntüleme ile birlikte.
1. parçalanabilir PGA iskele doku mühendisliği damarları kültür dayalı
PGA iskele imalatı
PGA mesh (19 mm çap ve 1 mm kalınlığında) Etilen oksit (17 cm uzunluk, 5.0 mm çap ve 0.3 mm kalınlığında) tarafından sterilize silikon tüp etrafında dikmek 5-0 dikiş kullanarak.
Politetrafloroetilen (ePTFE, 1 cm uzunluk) 4-0 dikiş üzerine her iki ucuna PGA mesh ile dikmek ve 2 mm tarafından üst üste.
PGA İskele 1 mol/L NaOH 1 dk. için mesh kayma yapısını ayarlamak ve doku kültürü sınıf su 2 min için üç kez emmek için el ile daldırma. Yavaşça pat iskele kağıt mendil ile her zaman kuru. O zaman bir başlıklı bir körük için 1 h ile iskele kadar kuru.
Biyoreaktör ve Y-Kavşak OCT görüntüleme için kurul
Emmek geliştirilen cam silindirik biyoreaktör (10 cm çapında ve 11.7 cm yükseklik içinde dört dudakları ve dört yan kol Şekil 1' de gösterildiği gibi reaktör dışında), PGA iskele, silikon tüp (dış çapı 5 mm, kalınlık 0.3 mm), biyouyumlu tüpler, bağlayıcılar, heyecan bar ve derleme bir su tankında % 95 etanol 2s için donatımı.
PGA iskele yan-silah konektörlü bir tarafı yanı sıra başka bir tarafı OCT embolisinin teslim etmek için kullanılan Y kavşak ile bağlı biyoreaktör üzerinden çek. Başka bir PGA iskele biyoreaktör olarak aynı şekilde bir araya getirin. Şekil 1' e bakınız.
Biyoreaktör dudaklarına ePTFE 4-0 dikişler ile sıkma tarafından uygun.
1 h için tekrar etanol tankında biyoreaktör koymak ve üzerinde üfleyici ile örtünün geceleme kadar kuru.
HUASMCs ve statik biyoreaktör Klima tohum
HUASMCs insan umbilikal arterler standart explant teknikleriyle izole et.
Genişletmek ve düz kas hücre büyüme orta hücrelerinde oluşan DMEM orta, % 20 fetal Sığır serum, 2,36 mg/mL HEPES, 100 U/mL penisilin G, 50 µg/mL prolin, 20 µg/mL alanin, 50 µg/mL glisin, 1,5 µg/mL CuSO4, 50 µg/mL askorbik asit korumak , 10 ng/mL temel fibroblast büyüme faktörü ve 10 ng/mL trombosit-türevi büyüme faktörü.
5 × 106 hücre/mL PGA iskele üzerine yukarıdaki kültür ortamında bir konsantrasyon, tohum HUASMCs.
Heyecan (1.5 cm uzunluk) bar biyoreaktör koymak. Gaz değişimi yoluyla silikon stoper kapak için bir besleme borusu (5 mm çapında, 15 cm uzunluk) ve üç kısa boru parçaları (5 mm çapında, 7 cm uzunluk) yerleştirin.
PTFE 0,22 µm filtreler her hava değişimi tüp ve besleme borusu bir heparin kapağı takın. Karıştırma hızı dakikada 13 mermi olan heyecan bar ayarlayın. Cam biyoreaktör, silikon stoper kapak ve PGA iskele kültür sistemi monte.
HUASMCs için 45 dk biyoreaktör yaslanmış tarafından bağlı kalmak için her 15dk birlikte, sol ve sağ için izin. Reaktör bağlantı noktaları ve eklem tüm parafin film ile mühürlendi.
Luo bağlanmak-Ye pompa, PBS çanta, biyouyumlu tüp ile sürücü perfüzyon sistemi olarak. Tüpler PBS ile doldurmak için sürücüyü açın.
Oksijen kuluçka 37 ° C'de % 5 CO2 genel biyoreaktör yerleştirin Kültür odası HUASMCs kültür orta 450 mL ile doldurulması.
Durdur düğmesine basın ve sürücü aygıtın gücünü kapatın. Numaralı seribaşı iskele statik kültür altında bir hafta boyunca büyümeye.
Kültür orta eski orta yoluyla besleme borusu ve taze kültür orta eşit miktarda ile reaktör dolumu yarısı aspirating tarafından her 3-4 gün değiştirin.
Perfüzyon sistemi hazırlığı OCT görüntüleme
Biyouyumlu tüpler aracılığıyla daha sonra tekrar çantayı dolaşımını PBS çanta içinde sıvı pompa.
Sürücü gücünü açın ve pompa ayar 60 dövmek-de dakika ve çıkış sistolik basıncı 120 mmHg, frekans ile düzenleyen. Doku mühendisliği vasküler kültürü ihtiyaçlarına göre mekanik parametrelerini ayarlamak.
İşe perfüzyon sistemi yapmak için Çalıştır düğmesini tıklatın. Yukarıdaki sabit pulsatil stimülasyon damarları 3 hafta için yinelemeli olarak statik kültür 1 hafta sonra biyouyumlu tüpler10,12 basınçlandırma tarafından sağlar.
2. performans Ekim ile optik görüntüleme
10-20μm Aksiyel çözünürlük ve görüntü derinliği 1-2 mm TEBV frekans etki alanı OCT intravasküler görüntüleme sistemi9tarihinde dayalı yapısını tanımlamak için emin olmak için bir ışık kaynağı kullanın.
Güç geçiş açmak ve görüntü yakalama yazılımı açın.
Fiber optik görüntüleme Kateter sürücü-motorlu ve optik denetleyicisi (DOC) kateter otomatik geri çekilme fonksiyonu ile bağlayın.
10 mm/s bir otomatik geri çekilme hızı ile resim alma hızı saniyede 10 kare için parametreleri ayarlama.
Görüntüleme kateter Y-kavşak için heparin kap ile 18 G iğne ile ekleyin.
Kateter silikon tüp içine yerleştirin ve PGA iskele biyoreaktör üzerine yüklemeden önce PGA örgü dikiş gerginlik tanımlar.
Kateter ucu faiz bölge üzerinde yerleştirin. Geri çekilme aygıt ve onay için görüntü kalitesi8ayarlayın.
Görüntüler 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 28 gün içinde kültür her bireysel TEBV için kazanmak ve sıralı olarak kaydetmek TEBV mikroyapı gerçek zamanlı gözlenmesi ile yüzey morfolojisi, iç yapısı ve kompozisyonu da dahil olmak üzere.
Ölçüm için güvenilir ölçüm mühendislik gemilerin her zaman 3 kez tekrarlayın. Bir dizi görüntü yakalama yazılımı kullanarak test boyunca görüntü yakalama.
3. görüntüleme Analizi
TEBV duvar kalınlığı ölçmek için görüntü analiz yazılımı kullanın. Analiz edilecek resmi seçin. TEBV iç tarafında yazılım tarafından otomatik olarak tanımlamak ve el ile dış yan kroki için izleme aracını tıklatın. Bir diyagramda kalınlıkta ekranda görünür.
Ölçüm için yapıları, güvenilir ölçüm 5 kez tekrarlayın. OCT analiz için elde edilen bilgi kör iki bağımsız araştırmacılar tarafından gerçekleştirildi.
4. hasat TEBV ve doku işleme
Açık belgili tanımlık silikon stoper kapak kültür sona erdiğinde biyoreaktör yerleştirilen ve kültür orta atın. Biyoreaktör ağzından ePTFE gevşetin ve silikon tüpler ePTFE dış tarafındaki makasla kesme. Biyoreaktör üzerinden TEBVs hasat ve elektron mikroskobu muayene tarama için bölümlere kesti.
TEBVs geri kalanı alın ve 4 µm kalınlığında bölümlere kesti. Destekleyici silikon boruyu çıkarmak ve bölümler %4 paraformaldehyde ile düzeltin. Rutin histolojik Masson'ın trichrome boyama ve kolajen ve PGA10,13,14morfolojisi incelemek için kırmızı Sirius gerçekleştirin.
PGA içerik ve kollajen bileşeni değerlendirmek Sirius kırmızı tarafından polarize mikroskop boyama ile histolojik örnekleri inceleyin. PGA kalıntıları açıkça birefringence belirlenmis ve kalan alan kesit alanı10tabanlı sayılabilir.
Üç boyutlu kültür sistemi biyoreaktör ve perfüzyon sistemi bir kapalı sıvı döngüsü10,13 (Şekil 1) ile bir kültür odasında oluşuyordu. OCT görüntüleme kateter Y kavşak distal uç eklenen ve görüntüleme için silikon tüp geri çekti. OCT görüntüleme ilk biyobozunur polimer iskele tabanlı TEBVs yapısal karakterizasyon sırasında biyoreaktör ekimi betimlemek için kullanıldı.
Şekil 2 gösterdi bunlar remodeling mühendislik vasküler işlemi kesitsel, doku mikroyapı gerçek zamanlı görüntüleme. Duvar kalınlığı, parçalanabilir PGA içerik ve karşılaştırma TEBV kalınlıkta pulsatil stimülasyon varlığı yanı sıra farklı kültür zaman puan gibi geometrik morfoloji değerlendirilmiştir. Sinyal zengini PGA kademeli bozulması ve gevşek için sıkı yeni doku yapısı düşündüren bir eğilim azalan kalınlığı ve dramatik değişiklikler mühendislik doku kültürünün ilk iki hafta içinde görüldü. Kültür 21 gün damarlara hücre dışı matriks eşit olarak dağıtılmış ve çoğunlukla harcanmış yüksek sinyal bileşenleri ile pürüzsüz bir yapı oluşmuş. TEBVs duvar kalınlığı bile sinyal ile kültür yavaş yavaş üç hafta sonra arttı. Bu remodeling daha önce oluştu ve morfolojik değişiklikler daha açıkçası dinamik grup (Şekil 3) gösterdi. Böylece OCT görüntüleme in situ olarak görüntülenmeyecektir için tasarlanmış vasküler Morfoloji ve uzun süre çalışan kültür sırasında gerçek zamanlı olarak sağlar.
Şekil 4 TEBV histopatolojik bulur kültürünün 4 hafta sonra OCT görüntülerle karşılaştırıldığında. Masson'ın trichrome boyama PGA kalıntıları media tabakasında mühendislik damarlarının (Şekil 4B) ile birlikte belirli bir yöndeki dağıtılmış kollajen lifleri gösterir. Sirius kırmızı boyama PGA kalıntıları ve kollajen bileşen polarize mikroskop (Şekil 4 c) kullanarak saptandı. Tarama elektron filmler ile kompakt mikroyapı mühendislik gemilerin histolojik değerlendirme (Şekil 4 d) ile karşılaştırıldı. Birlikte ele alındığında, OCT görüntüleri farklı boyutlarda ve gözenekli ağ yapısı ile PGA olduğunu gösterdi. PGA İskele yapısı belirgin bir değişiklik vardır ve kültür orta ile doğrudan temas kültür erken dönemde şişmiş. Ama PGA sinyal yoğunluğu düşürülmüştür. PGA bileşenleri dağıldı ve hücreleri ve hücre dışı matriks ile değiştirilir. Daha az parçaları görüldü dört haftalık dönem. SEM görüntüleri kesitsel mühendislik damarlarının lif yırtılması kuluçka süre uzatımı için gösterdi. Petek benzeri yapıda daha kompakt ve daha az şeffaflık ile malzeme ve ekstraselüler matriks kompozit vardı.
Resim 1 . Doku biyoreaktör ve perfüzyon sistemi OCT görüntüleme için bir kültür odasında oluşan vasküler kültür Sistem Mühendisliği Şematik. Pulsatil pompa biyomekanik microenvironment taklit kararlı bir sıvı akışı sağlanan. OCT görüntüleme kateter silikon tüp kültür odasında geri çekildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Mikroyapı doku kültürü sırasında kan damarları mühendislik. Kültür zamanla yavaş yavaş sinyal zengini PGA bozulmuş ve yeni doku yapısı gevşek için sıkı olduğunu. TEBVs kültür dört hafta sonra eşit olarak dağıtılmış bir pürüzsüz yüzey ve bol hücre dışı matriks vardı. Gerçek zamanlı kesitsel resimlerle mühendislik vasküler remodeling işlemi gösterdi. Bu rakam Chen'den, arkdeğiştirildi. 10 burada kullanılan silikon tüp kalınlığı 0.8 mm olduğunu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Karşılaştırma TEBV duvar kalınlığı değişim dinamik ve statik gruplar halinde vasküler remodeling sırasında elde edilen OCT ölçümleri. Hata çubukları standart hata gösterir. Bu rakam Chen'den, arkdeğiştirildi. 10 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Biyobozunur polimer esaslı doku mühendisliği kan damarlarının Imaging. (A) TEBV OCT görüntüsünü kültürünün dört hafta sonra. M: kültür orta; S: silikon tüp; Burada kullanılan silikon tüp kalınlığı 0.8 mm olduğunu. Beyaz ok TEBV belirtti. Kırmızı ok PGA parçası gösterilir. (B) Masson'ın trichrome boyama iyi düzenlenmiş kollajen lifleri ile birlikte PGA rezidüel içerik medya tabakasında mühendislik damarlarının gösterdi. Ölçek çubuğu = 100 µm. (C) Sirius kırmızı boyama ortaya PGA kalıntıları polarize mikroskop kullanarak. Yeşil ok PGA parçası gösterir. Ölçek çubuğu: histolojik değerlendirme ile karşılaştırmak için 100 µm. (D) Tarama elektron filmler ile kompakt mikroyapı mühendislik gemi olduğunu gösterdi. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Oluşturmak için gemi ile yapısal mühendislik ve mekanik özellikleri yerel kan damarları benzer klinik kullanım süresini kısaltmak için yol açabilir ve vasküler mühendislik amacıdır. Optik görüntüleme teknikleri kültür ve pozlama Greftler bir kültür ortamına boyunca bireysel yapıları kısırlık7ödün vermeden izlenemiyor mühendislik doku vasküler belirli bileşenleri, görselleştirme izin. Bu makalede, kültür odası perfüzyon sistemden ayrılır. Nispeten bağımsız perfüzyon sistemi kültür sırasında kirliliği azalma riski ve OCT embolisinin yerleşimini güvence altına alır. Bu arada bu intraluminal modalite Imaging evlat edinmek kolay ve yüksek çözünürlüklü, histopatoloji, hangi TEBV büyüme durum değerlendirilmesi daha pratik yapılmış ve hatta yaklaşıyor ile kalbin içinde TEBVs emniyetli izleme beklenen önce kullanılmak üzere veya sonra implant yerleştirme.
Geçerli protokol polimer esaslı parçalanabilir mühendislik gemi geliştirme OCT kateter tabanlı kullanarak değerlendirmek için hazır, hızlı gerçek zamanlı ve geri dönüşlü görüntüleme bir strateji gösterir. Dinamik bir süreç gözlem vasküler mühendislik, etkileyen bazı ana faktörler gibi kirlenme veya eşsiz doku kaybına yol açan hücre malzemesi etkileşim seçkin ile erken teşhis. NaOH-modified PGA iskele, iskele, ayırma steril kültür sistemi izleme sistemi, hızlı ve yetenekli kateter işlem süreci HUASMCs tohumlama başarılı imalatı protokolünün etkinliği sağlamak için kritik adımlar dahil .
Bu teknik bozulması Birleşik ve yeni doku ile harmanlanmış PGA iskele karmaşık yapısını değerlendirmek için yararlı olabilir. Gözenekli ağ yapısı ile polimer iskele yavaş yavaş düşer ve hücre adezyon ve hücre dışı matriks ifade için bir üç ölçü yapı için önemli olan ilk üç hafta içinde vasküler remodeling süreci hakim besin değişimi ve bir sinyal taşıyıcı15,16olarak. PGA kalıntıları mühendislik damarları açıkça Sirius tarafından tespit miktar için standart değerlendirme sonrasında olma potansiyeline var kırmızı lekeli resim, iskele tabanlı parçalanabilir vasküler Mühendisliği polarize mikroskoplar17 kullanımı ekimi. Bu nedenle polarize mikroskopla kombine OCT görüntüleme PGA bozulması vasküler Mühendisliği değerlendirmek için nitel ve nicel yöntemler olarak hizmet verebilir.
Bu teknik mühendislik vasküler remodeling sırasında hücre proliferasyonu, dağıtım, hücre-hücre ve hücre-ECM etkileşimi değerlendirmek için çözünürlük sınırı kısıtlamadır. TEBVs mikro hücresel veya hücre altı düzey18 araştırmak ve büyüme kinetik ölçmek için uygun yöntemi bulmak için umut. Kantitatif analiz ortalama optik sinyal OCT görüntüleme ile daha fazla malzeme bozulması vasküler mühendisliği mekanizması haberdar olabiliriz. Bu tür deneyler için gelecekteki çalışmalarımıza değerlendirilmektedir.
Genel olarak, bizim sonuçlar OCT bir hazır, hızlı gerçek zamanlı ve geri dönüşlü strateji büyüme izlemek için görüntüleme ve TEBVs remodeling olduğunu gösteriyor. Yapısal mimari özellikleri ve mühendislik gemileri uzun vadeli remodeling süreci karakterize etmek için kullanılmaktadır. Uygulama mühendislik damarlarının Polimer kalıntıları miktar için ek kanıt sağlanan polarize mikroskop OCT görüntüleme ile birlikte iskele bozulması değerlendirmek için yararlı olabilir. Birlikte ele alındığında, geçerli protokol damar doku mühendisliği uygulaması için Ekim umut verici değerini tutar.
Bu eser desteklemek için bilim ve teknoloji planlama projeyi Çin Guangdong Eyaleti (2016B070701007) kabul etmek istiyoruz.