Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay | Protocol (Translated to Turkish)
Enzimatik bir hücre füzyon deneyi kullanılarak SNARE-aracılı membran füzyon analizi
Hücre içi SNARE mikroskobu Imaging Floresans ömür fından kaçakçılığı görüntülenmesi…
Biz β-galaktosidaz aktive ifadesi ile SNARE-aracılı membran füzyon olaylar rakamlarla bir hücre füzyonu tahlil geliştirdik.
SNARE (ler oluble N-etilmaleimid duyarlı faktör ttachment proteini yeniden reseptör) veziküller (v-SNARE) ve hedef membranlarda protein etkileşimleri (t-SNARE) intrasellüler vezikül füzyon 1-4 katalize. Sulandırma deneyleri SNARE-aracılı membran füzyon 5 mekanizması ve düzenleme kesme için gereklidir. Bir hücre füzyon deneyi 6,7 olarak, SNARE proteinler hücre yüzeyinde ektopik olarak ifade edilmiştir. Bu SNARE hücre zarının kaynaştırmak için yeterli olduğunu gösteren, SNARE proteinler tahrik hücre-hücre füzyonu "döndürülmüş". Hücre füzyon deneyi mikroskopik analiz dayandığından çok v-ve t-SNARE etkileşimleri kantitatif analiz için kullanılan zaman, daha az verimlidir.
Burada β-galaktosidaz aktive ifadesi ile SNARE-aracılı hücre füzyonu olayların rakamlarla, yeni bir tahlil 8 tarif. Ikitetrasiklin kontrollü Transaktivatörü (TTA) ve tetrasiklin yanıt elementinin kontrolü (TRE-lacZ) altında lacZ genini kodlayan bir haberci plazmid: Tet-Off gen ifade sistemi 9 bileşenlerinin bir ölçme sistemi olarak kullanılmaktadır. Ekspres hücre yüzeyinde t-SNARE çevrilen protein COS-7 hücrelerinin (T-hücreleri) içine hücre yüzeyinde v-SNARE proteinleri (v-hücreleri) ile transfekte TRE-lacZ çevrilen COS-7 hücreleri içine transfekte Bu TTA . TRE, lacZ transkripsiyonel aktivasyonu ve β-galaktosidaz ekspresyonu için TTA'nın bağlayıcı olarak V-ve T-hücrelerinin sonuç SNARE-bağımlı füzyon. Β-galaktosidaz aktivitesi 420 nm'de absorbans ile bir kolorimetrik yöntemle ölçülür.
Vezikül ilişkili membran proteinleri (vampirler) Çeşitli post-Golgi veziküler bölümlerinde 10-15 ikamet v-SNARE vardır. Aynı seviyede vamps 1, 3, 4, 5, 7 ve 8 ile ifade, onların membran füzyonu karşılaştırmakenzimatik hücre füzyon deneyi kullanılarak faaliyetleri. Spektrometrik ölçüm dayanarak, bu testte SNARE-aracılı membran füzyon analiz ve yüksek verimlilik çalışmaları için nicel bir yaklaşım sunuyor.
1. Hücre Kültürü ve Transfeksiyon
COS-7 hücreleri, 4.5 g / l glikoz ve% 10 fetal bovin serumu (FBS) ile desteklenmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) içinde kültürlenmiştir.
Plazmid transfeksiyon üreticinin talimatlarına (Invitrogen) göre lipofektamin ile yapılır.
2. Hücre Yüzey SNARE İfade Floresan Mikroskobik Analizi
Transfeksiyon önceki gün, 3 × 10 4 COS-7 hücreleri 24-kuyucuğu bulunan steril 12-mm cam lamelleri (Fisher Scientific) üzerine numaralı seribaşı.
TTA kodlayan plazmid her iyi, 0.25 mcg v-hücreleri için (pTet-Off, Clontech) ekspres vamps çevrilen plazmid 0.25 mikrogram ile transfekte edilir.
Her bir kuyudaki T hücreleri için, plazmid kodlama TRE-lacZ (PBI-G, Clontech) 0.25 ug 0.25 ug ekspres SNAP-25 ve syntaxins 1 veya 4 çevrilen plazmid her biri ile transfekte edilir.
T sonra 24 saatransfection hücreler yine PBS içinde% 4 paraformaldehid + + 10 dakika boyunca (PBS 0.1 g / l CaCl2, 0.1 g / l MgCI2 ile desteklenmiş), ve sonra PBS içinde% 10 FBS içinde bloke + + 30 dakika süreyle sabitlenir.
Hücreler, anti-myc monoklonal antikor 9E10 (neat hibridoma kültür yüzey maddesi) ile 1.5 saat için inkübe edilir.
Ile dört yıkamadan sonra PBS + + hücreleri 1:500 dilüsyon FITC-konjuge sekonder antikor (Jackson Immunoresearch Laboratories) ile 1 saat boyunca kuluçkaya bırakıldı.
Ile dört yıkamadan sonra PBS + + etiketli hücreler antifade Gold reaktifi (Invitrogen) uzatmak da monte edilmiştir.
Konfokal görüntüler Olympus lazer tarama konfokal mikroskop üzerinde toplanır. Görüntüler Adobe Photoshop yazılımı ile işlenir.
3. Hücre Yüzey SNARE İfade FACS Analizi
Transfeksiyondan bir gün önce, 2 x 10 5 COS-7 hücreleri 6-plakaların her kuyuya tohumlanmıştır.
Tra sonra 24 saatile nsfection SNARE, pTet-Off ve PBI-G plazmidler döndürülmüş, hücreler PBS içinde% 1 paraformaldehid + + ile 15 dakika daha sabit, ve sonra PBS içinde% 10 FBS içinde + + 15 dakika için bloke edilmiştir.
Hücreler, 60 dakika boyunca, anti-myc monoklonal 9E10 antikoru ile inkübe edilir.
Üç yıkamadan sonra PBS + +, hücreler 45 dakika süreyle FITC-konjuge sekonder antikor (1:200 dilüsyon) ile etiketlenir.
PBS ile üç yıkar + +, hücreleri bir hücre kazıyıcı ile plakalar kazınmış sonra.
15.000 hücreler FACSCalibur akış sitometresinin (BD Biosciences) kullanılarak analiz edilmektedir. Her bir numune grubunun ortalama floresan yoğunluğu CellQuest Pro yazılımı kullanılarak elde edilir.
4. Enzimatik Hücre Füzyon Deneyi
Transfeksiyondan bir gün önce, 1.2 x 10 6 COS-7 hücrelerinin her biri 100 mm doku kültürü çanağı içinde ekildi ve 2 x 10 5 COS-7 hücreleri 6-plakaların her kuyuya tohumlanmıştır.
5, ug Flipp her biri - v-hücreleri, 0.5plazmid ed VAMP her 100-mm kültür çanak hücrelerine pTet-Off 5 mikrogram ile transfekte edilir. Kontrol hücreleri boş vektör pcDNA3.1 (+) ve pTet-Off ile transfekte edilmiştir. Vamps 1, 4, 5, 7 ve 8, tunicamycin N-glikolizasyon önlemek için, (10 ug / ml) transfeksiyon esnasında hücre kültürü aracı maddesi içinde yer almaktadır.
6-kuyucuğu her iyi t-hücreleri için, 1 mg SNAP-25 plazmid saygısız ve PBI-G 0.5 mikrogram ile transfekte edilir plazmid syntaxin4 saygısız plazmid syntaxin1 veya 0.05 mikrogram çevirdi.
Transfeksiyondan 24 saat sonra, hücreler v-enzim içermeyen hücre Ayrılma Tamponu (Invitrogen) ile kültür kaplarından ayrılır. Kaldırılan hücreler bir hemasitometre ile sayılır ve resüspande edilirler, HEPES-tamponlu DMEM% 10 FBS, 6.7 ug / ml ve 0.67 tunicamycin mM DTT ile desteklenmiştir.
4.8 x tekrar süspanse 10 5 v-hücrelerinin her biri de zaten t-hücreleri içeren eklenir.
6, 12 veya 24 saat sonra, sıçan 37 ° C'de% 5 CO2 içinde
90 dakika sonra, reaksiyon kolorimetrik 1 M sodyum karbonat eklenmesi ile durdurulur.
420 nm Absorbans bir HITACHI 100-40 spektrofotometresi kullanılarak ölçülür.
Niceliksel bir hücre füzyon deneyi geliştirmek için, biz TRE TTA bağlama ile güçlü transkripsiyonel aktivasyon yararlanmak. TTA yokluğunda, TRE-lacZ yılında lacZ geninin transkripsiyonu sessizdir. TTA mevcut olduğu zaman, TRE bağlanır ve lacZ geni transkripsiyonunu aktive eder. Şekil 1, bu enzimatik hücre füzyon tahlil oluşan bir akış şeması gösterilmektedir. TTA hücre yüzeyinde ifade v-SNARE proteinler, ve TRE-lacZ T-hücreleri içine transfekte edilir ki v-hücrelerine transfekte olduğu hücre yüzeyinde ifade t-SNARE proteinleri. TRE, lacZ ve transkripsiyonel aktivasyonu ve β-galaktosidaz ifade TTA'nın bağlayıcı olarak V-ve T-hücrelerinin sonuç Füzyon.
Şekil 2A çevrilen SNARE yapıların alan yapısını göstermektedir. Preprolactin sinyal sekansı SNARE N-termini ile birleşir. Bunlar mühendislik SNARE 'çevrilen' denirSNARE Çünkü hücre zarının karşı SNARE motifleri yönelim çevrilir. COS-7 hücreleri çevrilen SNARE plazmitler ile birlikte transfekte edildiğinde, SNARE proteinlerin hücre yüzeyi (Şekil 2B) ile ifade edilir çevirdi. Akış sitometrisi hücre yüzeyi (Şekil 2C ve D) SNARE proteinlerin ekspresyonu seviyesini ölçmek için kullanılır. Bunların membran füzyonu kapasitelerini karşılaştırmak için, vamps aynı seviyede ifade edilmesi gerekir. Bu nedenle, titre edildi ve her bir konsantrasyonu plazmid transfeksiyon kullanılabilir SNARE çevrilen optimize edilmiştir. , VAMP7; VAMP3, 0.5 mg;; VAMP4, 0.5 mg; VAMP5, 0.05 mcg VAMP1, 0.2 mikrogram: Flipped SNARE plazmidleri aşağıdaki konsantrasyonları (ortalama 10 cm 2 büyüme alanı, yani, başına iyi 6-kuyucuğu olarak) transfekte edilir 1.0 ug; VAMP8, 0.1 ug; syntaxin1, 0.5 ug; syntaxin4, 0.05 g. TTA, TRE-lacZ ve SNAP-25 döndürülebiliyorlar 10 cm 2 büyüme alanı başına 1 mikrogram az transfekte edildi. Suc altındasyntaxins 1 ve 4 hücre yüzey (Şekil 2B) aynı seviyede ifade ederken s koşullar, vamps 1, 3, 4, 5, 7 ve 8, aynı seviyede ifade edilmiştir. Gibi konfokal ve faz kontrast görüntü analizi (Şekil 2E) ile gösterildiği gibi, COS-7 hücreleri% 80 çevrilen SNARE plazmitler ile birlikte transfekte edilir. Çift etiketleme görüntü analizi (Şekil 2F) v-transfekte edilmiş hücreler% 70 TTA her ikisi de ifade edebilir ve VAMP çevrilen protein olduğunu göstermektedir. TRE-lacZ yılında lacZ geni hücre füzyonu önce ifade olmadığı için, biz TRE-lacZ hem ifade ve t-SNARE proteinler saygısız t-hücreleri transfekte yüzdesini belirlemek mümkün değildir.
Sinaptik ekzositozu ara nöronal SNARE (v-SNARE VAMP2, ve t-SNARE syntaxin1 ve SNAP-25) tahlil uygulanabilirliğini test etmek için kullanılır. Nitekim, syntaxin1/SNAP-25 ifade VAMP2 ve t-hücreleri ifade v-hücreleri birleştirilir, sağlam β-galactosidase ifade (Şekil 3) tespit edilir. Ancak, VAMP2 veya SNAP-25 örtülü değilken, sadece bazal β-galaktosidaz aktivitesi hücre füzyonu ve β-galaktosidaz ifade v-ve t-SNARE etkileşimleri güveniyor belirten algılanır. Bu sonuçlar, enzimatik hücre füzyon tahlil v-ve t-SNARE verimli arasında füzojenik eşleşmeler tespit olduğunu göstermektedir.
Hücre yüzeyi (Şekil 2B) aynı seviyede VAMP proteinleri ifade ile, onların membran füzyonu aktivitelerini karşılaştırmak. T-SNARE syntaxin1/SNAP-25, vamps 1, 3, ve vampirler 4 ve 7 en az% 50 olması ve sırasıyla% 30 daha düşük füzyon aktiviteleri, (Şekil 4) ise 8, karşılaştırılabilir ve en yüksek erime aktivitelere sahiptir. Ile Buna karşılık, VAMP5 t-SNARE ile kombine edildiğinde, sadece bazal β-galaktosidaz aktivitesi VAMP5 synt membran füzyon sürücü olmadığını göstermektedir (Şekil 4) tespit ediliraxin1/SNAP-25.
Şekil 1. Enzimatik hücre füzyon deneyi. TTA çevrilmiş V-SNARE plazmitler ile birlikte transfekte edilir ve TRE-lacZ döndürülmüş t-SNARE plazmitler ile birlikte transfekte edilir. V-ve T-hücre füzyon TRE TTA'nın bağlayıcı ve bir kolorimetrik metod ile ölçülür β-galaktosidaz ifade yol açar.
Şekil 2. Expression hücre yüzeyinde SNARE çevirdi. (A) Domain yapısı SNARE çevirdi. Preprolactin sinyal sekansı (SS) SNARE N-termini ile birleşir, ve bir Myc etiket sinyal sekansı ve SNARE motifleri (coiled bobin) arasına yerleştirilir. (B), COS-7 hücreleri TTA ve boş vektör pcDNA3.1 (+) ile transfekte edilir ya da plazmid VAMP5 çevirdi. 24Transfeksiyondan sonra, hr unpermeabilized hücreleri, anti-myc monoklonal antikor ile boyanmış. Örnek tek dilim konfokal görüntüler gösterilir. (C ve D), 24 TTA ve pcDNA3.1 (+) ile kotransfeksiyonu saat sonra ya da vamps (V-hücreleri), veya TRE-lacZ kotransfeksiyonu ile 24 saat sonra döndürerek, çevrilen SNAP-25 ve syntaxins 1 veya 4 (T-hücreleri ), unpermeabilized hücreler anti-myc antikor ile boyandı ve flow sitometri ile analiz edilir. (C) hücrelerinin FACS profilleri Örnek pcDNA3.1 (+) plazmidi ile transfekte edilmiş ya da VAMP1 çevirdi. Her bir numune grubunun ortalama floresan yoğunluğu CellQuest Pro yazılımı kullanılarak belirlenir. (D) hücre yüzeyinde aynı seviyede aynı seviyede vamps ifade eder ve ekspres syntaxins 1 ve 4 için, SNARE plazmidler titre konsantrasyonlarda transfekte edilir çevirdi. Gösterilen SNARE proteinlerin hücre yüzeyi boyama ortalama floresan yoğunlukları vardır. Hata çubukları 4 bağımsız deneyler standart sapmayı temsil etmektedir. Cotransfe sonra (E ve F) 24 saat TTA ile ction ve çevrilen VAMP5 plazmid, hücreler ile permeablized edilir% 0.2 Triton PBS içerisinde X-100 + + ve (E) anti-myc antikoru ile boyandı ya da anti-myc monoklonal antikor ve bir poliklonal antikor ile birlikte (F) iki lekeli tet represör (TTA saptamak için). (E) temsilcisi konfokal ve faz kontrast görüntüler Gösterilmektedir. Anti-myc antikoru (VAMP5) ile faz kontrast kanal içinde hücrelerinin toplam sayısı (n = 60 hücreleri) sayılabilir, ve transfeksiyon randımanı (% 80) hesaplanır ile etiketlenir transfekte edilmiş hücrelerin sayısı. (F) VAMP5 ve TTA her ikisi de ifade transfekte edilmiş hücrelerin sayısı ve ekspres VAMP5, TTA ya da her ikisi de (n = 75 transfekte edilmiş hücreler) sayılmasını Transfekte edilmiş hücrelerin toplam sayısı. VAMP5 ve TTA her ikisi de ifade Transfekte edilmiş hücrelerin yüzdesi daha sonra (% 70) tespit edilir. Ölçek bar, 20 mikron. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. Hücre füzyon v-ve t-tuzaklarına etkileşimine bağlıdır. ekspres TTA ve VAMP2 t-hücreleri ile inkübe olduğunu v-hücreleri olduğunu ifade TRE-lacZ, syntaxin1 ve SNAP-25. 24 saat sonra, hücreler lize edilir ve hücre lizatları içinde β-galaktosidaz aktivitesi 420 nm'de absorbans ile bir kolorimetrik metod kullanılarak tespit edilir. Ya VAMP2 saygısız veya SNAP-25 plazmid transfeksiyon ihmal edildiğinde sadece temel b-galaktosidaz aktivitesi tespit edilmiştir.
Şekil 4. Vampir füzyon faaliyetlerinin karşılaştırılması. Optimize edilen transfeksiyon koşulları, vamps 1, 3, 4, 5, 7 ve 8 uyarınca v-hücrelerinin hücre yüzeyinde aynı seviyede ifade edilmiştir. T-hücreleri ile v-hücreleri birleştirerek sonra 24 saat olduğunu expres syntaxin1/SNAP-25, hücre füzyon enzimatik hücre füzyon deneyi kullanılarak ölçülür. Hata çubukları 4 bağımsız deneyler standart sapmayı temsil etmektedir. ** P <0.01, *** P <0.001 VAMP1.
Orijinal hücre füzyon deneyi 6 floresans mikroskobu ile SNARE-aracılı hücre füzyon olayları belirler. Burada β-galaktosidaz ve spektrometrik ölçüm aktive ifadesi ile SNARE-aracılı hücre füzyonu olayların rakamlarla yenilikçi bir tahlil açıklamaktadır. Bu testte kullanarak, rutin analiz 15 - 20 v ve t-SNARE tek bir deneyde kombinasyonları. Hücre yüzeyinde ifade SNARE ölçmek için akış sitometrisi kullanılarak, vamps ifade seviyeleri titre ve membran füzyon kapasiteleri (Şekiller 2 ve 4) karşılaştırın. Dahası, enzim hücre füzyon deneyi kullanılarak, VAMP1 proteinin hücre yüzey yoğunluğu hücre füzyon etkinliği olan bağımlılığı belirlenir ve hücre füzyon reaksiyon 8 VAMP1 proteini kooperativiteye görülen çoklu SNARE komplekslerinin birlikte hareketi gerekli değildir öne hücre zarının kaynaştırmak için.
Varlığı kabul edilen N-glikozilasyon Moti vardırfs (Asn-X-Ser/Thr) SNARE proteinlerde. N-glikozilasyon bölgesinin füzyon aktiviteleri SNARE proteinleri 6 döndürülmüş inhibe ettiği için, iki yaklaşım döndürülmüş SNARE proteinlerin glikozilasyon önlemek için kullanılmaktadır. İlk olarak, glikozilasyon yerinde mutasyonlar SNARE 6 oluşturur çevrilen içine tanıtılmaktadır. İkinci olarak, mevcut protokol de anlatıldığı gibi, N-glikolizasyon inhibitörü tunicamycin (6.7 mg / ml) hücre füzyon reaksiyonu dahil edilir. Buna ek olarak, 0.67 mM DTT SNARE füzyon aktiviteleri inhibe edebilen çevrilen SNARE proteinler arasında disülfid bağlarının oluşumunu önlemek için hücre füzyon reaksiyon eklenir. Tüm deneyler 6.7 ug / ml tunicamycin ve hücre kültür ortamı içinde 0.67 mM DTT ve buna ek olarak COS-7 hücrelerinin çoğalmasını ve hayatta kalma ile müdahale etmediğini göstermektedir. Biz rutin v-ve t-hücreleri birleştirerek sonra 24 saatte hücre füzyon reaksiyonu sonlandırın. Bununla birlikte, önemli SNARE-aracılı hücre füzyon v-a birleştirme 6 saat sonra tespit edilirnd t-hücreleri 8. Enzimatik hücre füzyon reaksiyonu hücre füzyon sonrası β-galaktosidaz ifadesi bağlı olduğundan, bu okuma sistemin zaman ders saygısız SNARE proteinleri aracılı membran füzyon zaman ders kalıyor.
Enzimatik hücre füzyon deneyi memeli hücrelerinde potansiyel v-ve t-SNARE etkileşimlerinin membran füzyon aktiviteleri incelemek için bir nicel sulandırma tahlil sunmaktadır. Coexpressing düzenleyici proteinleri (örn., Munc18) ve hücre yüzeyinde ya da hücre içinde rekombinant füzyon reaksiyon düzenleyici proteinler de dahil olmak üzere göre SNARE olarak, bu tahlil SNARE-aracılı membran füzyon düzenleyici mekanizmaların açıklamak için kullanılabilir. Buna ek olarak, bu tahlil inhibitörleri ya da SNARE-aracılı membran füzyon aktivatörleri için yüksek verimli tarama uygulamalar sahip olmalıdır.
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Louisville ve CA135123 Üniversitesi (CH) için başlangıç ​​fonları tarafından desteklenmektedir.