Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo | Protocol (Translated to Turkish)
Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama
Yenidoğan fare retina bir anjiyogenez modüle farklı genler ya da uyuşturucu rolleri soruşturma izin anjiyogenez bir iyi karakterize fizyolojik modeli sağlar
Anjiyogenez, önceden mevcut olan damar ağı yeni kan damarlarının filizlenmesi tarafından tanımlanan yeni kan damarı oluşumunu ve karmaşık bir süreçtir. Anjiyogenez, kanser, körlük ve iskemik hastalıklar gibi kan damarı oluşumunu düzensiz olduğu birçok hastalık, aynı zamanda, sadece organ ve dokuların normal gelişiminde önemli bir rol oynamaktadır, ancak. Anjiyogenez hastalığında özellikle yeni damar oluşumunu denemek ve düzenlemek için yeni ilaç gelişimi için önemli bir hedef bu yüzden yetişkin yaşamda, kan damarları genellikle sakin olan. Daha iyi anjiyogenez anlamak ve düzenlemek için uygun stratejiler geliştirmek amacıyla, modeller doğru dahil olan farklı biyolojik adımları yansıtan gereklidir. Damar sertliği, damar ve kılcal doğumdan sonraki ilk hafta içinde vasküler pleksus oluşturmak için geliştirmek için fare yenidoğan retina damar mükemmel bir model sunar. Bu model aynı zamanda, iki-di sahip olma avantajına sahiptirmensional (2B) yapısı diğer damar ağları karmaşık 3D anatomisi ile karşılaştırıldığında basit analizi yapma. Doğum sonrası farklı zamanlarda retinal vasküler pleksus analiz ederek, bu mikroskop altında anjiogenez çeşitli aşamalarında gözlemlemek mümkündür. Bu makalede, isolectin ve vasküler spesifik antikorlar ile floresan boyama kullanılarak bir fare retina damar analiz etmek için basit bir işlem ortaya koymaktadır.
Anjiyogenez, önceden mevcut olan damar ağı yeni kan damarlarının oluşumu ile tanımlanan ve çok sayıda sinyal yolları ile düzenlenmiş olan karmaşık bir gelişimsel bir süreçtir. Bunların en önemli VEGF yoldur. VEGF komşu kan damarlarında çimlenme anjiyogenik en başlamadan iskemik hücreleri ve yol tarafından serbest bırakılır. Filiz yeni bir damar önde gelen endotel hücre VEGF kaynağına doğru ulaşmak olduğunu filopodia üreten bir 'ipucu' hücre, ve 'sap' endotel hücreleri prolifere takip eder. Bu şekilde, aktive edilmiş endotel hücreleri göç eder ve bunlar, yeni damar tüpler oluşturmak burada avasküler bir bölge doğru çoğalır. Kan akışını desteklemek için bu tüpler stabilize etmek amacıyla, endotelial hücreler perisitler ve yeni kan damarlarının 1 çevreleyen yumuşak kas hücreleri ile etkileşime girer. Anjiyogenez, embriyo ve artan doku vaskülarizasyonu için gereklidir. Bununla birlikte, aynı zamanda pek çok patolojik katkıdakanser gibi kalori bozuklukları; anjiyogenez bozukluklar iskemik hastalıkları ile ilişkili ise. Hastalığın tedavisi için bir araç olarak anjiyojenez düzenleyen etkili ilaç tedavilerinin geliştirilmesi büyük ilgi taşımaktadır. Örneğin, etkili bir anti-anjiyojenik faktörler, kanser büyümesini azaltmak pro-anjiyogenik stratejiler iskemik bir hastalığı tedavi etmek için kullanılabilir iken olacaktır. Böylece, anjiyogenez modelleri daha iyi yeni damar oluşumu ve vasküler büyüme artırmak veya azaltmak için yeni tedavi stratejileri geliştirmek için düzenleme anlamak için gereklidir.
Anjiyogenez araştırma temel bir unsuru uygun bir damar modelinin seçimdir. In vitro modellerde pek çok tür endotel hücre göçü, çoğalması ve hayatta kalma 2,3 olarak anjiyogenez temel adımları yeniden tasarlanmıştır. Sıklıkla in vitro tahlilinde kullanılan bir rağmen t bir Matrigel matrisi üzerinde endotelyal hücre, bir dallı bir şebeke oluşumuonun endotel hücreleri için spesifik değildir, ne de genellikle perisit ve düz kas hücrelerinin destek dahil etmez. Bu tür vücut embriyoit tahlilinde, aortik halka deneyi ve fetal metatarsal deneyi gibi fare organ kültürü ile ex vivo olarak filizlenme anjiyogenez Değerlendirilmesi ek destek hücreleri bağlamında endotel hücrelerinin damar analizine izin verir. Bununla birlikte, bu testler, ana sınırlamaları analiz için sınırlı bir pencere vererek, kan akışının olmaması ve zaman içinde damarlarının regresyon içerir. Bu nedenle, daha doğru bir anjiyogenez düzenleme anlamak için, in vivo modellerde de arka kol veya bacak iskemisi model olarak, örneğin deri altına implante edilen sünger veya fişleri Matrigel kullanılarak fare geliştirilenlerdir olarak gereklidir. Ancak, bu modeller neovessels karmaşık 3D mimarisi nedeniyle analiz etmek zordur. Buna karşılık, zebrabalıkları embriyo tamamının görüntülenmesi anjiyogenez için mükemmel bir model olduğunu kanıtlamıştırorganizma 4. Bununla birlikte, fare, fare birçok durumda, tercih edilen bir model yapımı evrimsel olarak çok daha yakından zebrabalıkları göre insan ile ilgilidir. Sonuç olarak doğum sonrası fare retinanın anjiyogenez anjiyogenez araştırmalar için tercih edilen bir iyi karakterize yöntem temsil eder. Bu fizyolojik bir ayar, aynı zamanda kolayca uygun floresan lekeleri kullanılarak görüntülendi edilebilir bir 2D vasküler pleksus sağlar sadece. Damar ağı, endotel proliferasyonu, çimlenme, perivasküler hücre toplanması ve gemi yeniden bir mimarisi tüm bu teknik kullanılarak incelenebilir.
Neonatal fare retinasında, retinal kan damarlarının gelişimi Postnatal ilk haftasında meydana gelir. Fareler, insanlar farklı, kör doğarlar ve retina sadece doğumdan sonra vaskülarize olur. Retina damarları doğum sonrası gün 0 (P0) de optik sinir retina yakın merkezinde kaynaklanan ve son derece düzenlemek oluşturmak için anjiyogenez tarafından geliştirmekyaklaşık P8 5 ile retina çevre ulaşır d vasküler pleksus. Kan damarları kılcal pleksus yavaş yavaş bir araya kapiller ağı ile arterler ve venler düzenli bir alternatif desen oluşturmak için çevre doğru optik disk dışarı doğru büyüyen karakteristik bir şekilde gelişir. Retina damar böylece nispeten kolay düz montaj hazırlıkları 5 retina damar incelemek için yapım, onlar aslında bir 2D düzlemde ne de büyüdükçe damarlar kolayca tespit edilebilir olarak anjiyogenez çalışmak için ideal bir model sağlar. Birkaç saat ex vivo olarak endotelial fazla uç hücre yanıtlarının analizi için Yeni doğan fare retina izole edilmesi için bir yöntem olup 6 bildirilmiştir. Alternatif olarak, tüm retina damar ve ilişkili vasküler işaretleri daha ayrıntılı bir araştırma farklı gelişim aşamalarında sabit retina örneklerinin immün gerektirir.
Burada sağlamakBiz mikroskop altında son görüntüleme için boyama protokolleri ile (ayrıca 7) doğum sonrası gözün ilk enükleasyon gelen fare retina vasküler pleksus, ve tüm montaj boyama için kullandığınız güvenilir ve teknik yalındır yöntemi ayrıntılı bir açıklama.
Aksi belirtilmedikçe tüm adımları, oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
1. Doğum sonrası Eyes enükleasyon ve Fiksasyon
Yan yavru insanca öldürüldü fare yerleştirin, makas ile göz kaplayan deri kaldırmak.
Göz tanıttılar makas ve forseps kullanın.
Enüklee göz altında yer makas, optik sinir ve çevresindeki dokuları kesmek ve göz çıkarın. Oda sıcaklığında, 2x PBS içinde oluşur% 4 paraformaldehit (PFA), ihtiva eden bir 24-kuyucuklu plakaya aktarılır.
Her bir göz için 10 düzeltmek için - 10 dk - 15 dk, daha sonra 5 için buz üzerinde soğuk 2x PBS transfer. Bu sabitleme derecesi her bir göz için eşit olduğundan emin olmak için enucleations ve sonraki sabitleme sendeleyip en iyisidir.
2. Doğum sonrası Murin retina diseksiyonu
2x PBS içeren bir Petri kabı içine transferi gözleri bir disse altında delik ve yer genişletmek için kesilmiş bir plastik Pasteur pipeti kullanarakmikroskop cting.
Forseps ve makas kullanılarak göz çevresinde herhangi bir yağ çıkarmak.
Pierce keskin bir makas ile korneanın kenar ve kornea ve iris ve atın etrafını kesin.
Retina ve sklera arasında forseps yerleştirin ve retina gözyaşı özen sklera çıkarın. Koroid tabakası da kaldırılabilir, ancak bu adımı sırasında meydana gelen retinaya hasar riski varsa, koroid tabakası önemli ölçüde immün kalitesini etkilemez olarak bırakılabilir.
Lens ve forseps kullanarak vitreus mizah çıkarın.
Ince forseps ile gözün merkezinde bir araya toplayarak hyaloids gemilerin çıkarın sonra hızlı bir şekilde retinanın merkezi (alternatif olarak ince makas ile hyaloid gemilerin dibinde kelepir) uzak çekin.
Temiz bir Petri kabındaki PBS ile fincan şeklinde retina durulayın.
Bahar scisso kullanarak retinanın yarıçapı yaklaşık 2/3 ulaşan 4 ile 5 radyal kesiler olunrs bir 'taç yaprağı' şekil oluşturmak için.
PBS retina düzleştirmek için bir Pasteur pipeti kullanarak, ve sonra emici kağıt küçük bir parça ile herhangi bir aşırı PBS kaldırmak çekişi.
Yavaşça pipet soğuk (-20 ° C) retina yüzeyine damla metanol damla tamamen ek metanol ile daha sonra sel kaplı ve kadar. Bu retina düzeltmek için ve permeabilization kolaylaştıracaktır yardımcı olacaktır. Retina beyaz dönecek.
Delik genişletmek için kesilmiş bir plastik Pasteur pipeti kullanarak 2 ml tüp aktarın.
Immün devam etmeden önce en az 20 dakika soğuk metanol içinde retina bırakın. Burada kullanılan antikorlar, sadece VE-kaderin metanol sabit retina üzerinde başarılı bir şekilde kullanılamaz. Bu durumda retina adım 9 sonra immün doğrudan devam etmek gerekir.
Gerekirse kadar boyamadan önce bir kaç ay için, retinalar -20 ° C'de metanol içinde saklanabilir.
3. Immuno / Retina Vascu bir isolectin Boyamalature
Dikkatle çıkarın / metanol dökün ve yavaşça (bu aşamada retina yukarıdaki adım 11 ile aynı 2 ml'lik bir tüp içinde hala) PBS içinde kısaca retina yıkayın.
Perm / Blok çözüm 100 ul PBS ve kapak retina çıkarın (PBS +% 0.3 Triton +% 0,2 BSA) + 5 uygun serum% (bkz. Tablo 1) ve 1 saat için hafifçe sallayın.
Nazik 4 gece sallayarak ° C 100 seçilen primer antikor ul (bkz. Tablo 1) ve / veya IsolectinB4, Perm / Blok seyreltilmesi ile hazırlanan tüm ile retina Blok ve inkübe / Perm çıkarın.
Antikor / isolectin çıkarın ve retina 4 yıkayın PBS x 10 dk +% 0.3 Triton (PBSTx).
Bazı durumlarda, IsolectinB4-Alexa488 konjüge ya da doğrudan primer antikor ile örneğin aşağıdaki boyama, ikincil antikorun gerekli değildir ve retina (basamak 7) doğrudan monte edilebilir. Konjuge olmayan bir primer antikor, uygun florun 100 ul, daha sonra adım 3'te kullanılan görmüşseescent ikincil antikor (PBSTx içinde 1/200 seyreltilmiş) ilave edildi ve 4 ° C sıcaklıkta ya da oda sıcaklığında, 4 saat süreyle gece boyunca inkübasyona bırakılmıştır.
Ikincil antikor çıkarın ve 2 ml PBSTx içinde retina 4 x 15 dakika yıkayın.
Geniş bir delik plastik Pasteur pipeti kullanarak slayt üzerine retina aktarmak ve emici dokusu ile fazla PBSTx çıkarın. 50 ul ekleyerek Dağı retina retina üzerinde lamel ve yavaşça konumu üzerine mountant uzatır.
Transferi onlar uzatmak mountant ayarlamak için izin vermek için, düz ve ışıktan korumalı olmasını sağlamak, 4 ° C gecede buzdolabı kayar.
Görüntü retina bir konfokal mikroskop veya Epifloresans mikroskop kullanılarak.
Diseksiyon sonra retinanın düz çiçek (Şekil 1) gibi görünmelidir. Yukarıda belirtilen protokol kullanılarak, endotel hücrelerinin, anti-a-düz kas aktin (Şekil 2) kullanılarak görselleştirilmiştir isolectin B4-Alexa488 boyaması kullanılarak ve vasküler kas hücrelerinin destek görülebilir. Şekil 2'de bir 5X objektif kullanarak düşük güç görünümü retinanın damar örgütün genel bir bakış sağlar. Ayrıca, yukarıda verilen protokol antikorlar, farklı bir arada kullanarak, endotel hücreleri, anti-CD31 immüno-boyama ve destekleyici perisitler NG2 (Şekil 3) veya desmin (Şekil 4) karşı antikorlar kullanılarak görülür kullanılarak görülebilir. Anti-desmin boyama perisitler süreçler gibi parmak görselleştirme ve yakından endotel hücreleri ile ilişkili olup olmadığını belirlemek için faydalıdır. Öte yandan, anti-NG2 boyama yararlı olduğu, her bir pericyte çekirdeğine özetlenmektedirdamar sistemi üzerindeki pericyte hücrelerin sayısını ölçülmesidir. Bu yüksek güç (örneğin 60X) objektif kullanarak görüş alanı başına hücre sayarak yapılırdı. Eğer gerekli olursa, antikorların alternatif kombinasyonları da (bakınız Tablo 1) de kullanılabilir, örneğin, bir anti-kollajen IV vasküler bazal membran görüntülenmesi için yararlıdır. Endotel hücreleri için lekelenmiş olan retinası gibi retinanın kenarına doğru merkezi damar yoğunluğu ve damar dallanma frekans damar ilerlemesi gibi anjiyojenezin önemli özellikleri için analiz edilebilir.
Şekil 1. Hemen diseksiyon ve metanol ilave edildikten sonra, neonatal retina görünmesi. Bu görüntü bir Zeiss Stemi SV6 ve Axiocam İK kullanılarak alınır c kamera.
Şekil 2. Isolectin B4-Alexa488 (yeşil) (A) ile bütün montaj retina (yaş P7) immün, anti-alfa düz kas aktin-Cy3 (kırmızı) (B) veya birleştirilmiş (C). Bu görüntüler bir Zeiss axioimager ile alınır ve 5X objektif kullanarak Axiocam HRM kamera. arter ve venlerin alternatif desen unutmayın. Arterler hemen onları çevreleyen kılcal serbest bölge tarafından tanınan ve alfa düz kas aktin için (kırmızı) pozitif leke düz kas hücreleri ile kaplanmıştır. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3 anti-CD31 primer antikor (Alexa488 konjuge anti-fare IgG, yeşil, A ile tespit) ile bütün montaj retina (P6 yaş) Double immün;. Anti-tavşan IgG konjuge ile tespit ve anti-NG2 primer antikor Alexa 594 (kırmızı, B). Bu konfokal görüntüler 13 z dilimleri, 0.47 mikron kalınlığında her birinden lazer tarama görüntüleri birleştirerek bir 60X objektif kullanılarak alınmıştır. C görüntülerin bir yerleşim CD31-pozitif endotel hücreleri (yeşil) ve NG2 pozitif perisitler (kırmızı) gösterir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 4 anti-CD31 primer antikor (Alexa488 konjuge anti-fare IgG, yeşil, A ile tespit) ile bütün montaj retina (P6 yaş) Double immün;. Anti-tavşan IgG konjuge ile tespit ve anti-desmin primer antikor Alexa 594 (kırmızı, B). Bu konfokal görüntüler 21 z dilimleri, 0.24 mikron kalınlığında her birinden lazer tarama görüntüleri birleştirerek bir 60X objektif kullanılarak alınmıştır. C görüntülerin bir yerleşim CD31-pozitif endotel hücreleri (yeşil) ve desmin pozitif perisitler (kırmızı) gösterir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Birincil antikor Seyreltme Çalışma Engelleme çözüm (Serum + Perm / Blok) İkincil antikor
Anti-NG2 (Kondroitin Sülfat Proteoglikanlar) 1:250 % 5 keçi serumu Keçi anti tavşan Alexa 594
Anti-GFAP 1:500 % 5 keçi serumu Keçi anti-fare Alexa 488
Anti-desmin 1:500 % 5 keçi serumu Keçi anti tavşan Alexa 594
Anti-Kollajen IV 1:200 % 5 keçi serumu Keçi anti tavşan Alexa 594
Anti-endoglin 1:100 % 5 keçi serumu Keçi anti sıçan Alexa 594
Anti-CD31 1:500 % 5 keçi serumu Keçi anti sıçan Alexa 488
Anti-VE-kaderin 01:10 % 5 keçi serumu Keçi anti sıçan Alexa 594
Anti-ALK1 01:25 % 5 eşek serum Eşek anti keçi Alexa 594
Anti-ASMA-Cy5 1:100 <td> Perm Blok sadece Yok / A
Tablo 1. Tüm montaj retina immunofluorescent boyama için birincil antikor örnekleri.
Burada sunulan yöntem anjiogenezin kolay ölçülebilir ve fizyolojik ilgili model yapımı, yenidoğan fare retina lekeli bütün montaj hazırlıkları görüntüler elde etmek için basit ve etkili bir yol sunar. Başlangıçta, fare göz küçük boyutu ve dünya şekli nedeniyle incelemek için oldukça zor olabilir, biraz pratik ve iyi diseksiyon araçları güvenilir sonuçlar için gereklidir bu yüzden. Bu göz su kaybı küçük bir miktar neden olur ve diseksiyon kolaylaştırır içi yörünge basıncı azaltır, çünkü PBS 2x konsantrasyonda hazırlanmış gözlerin Diseksiyon önemlidir. Retinanın iyi bir hazırlık çeşitli nedenlerden dolayı önemlidir. Birinci olarak, damar bütünlüğünü korur. Hyaloid damar iyi kaldırılmaz İkinci olarak, bu arka plan yüksek düzeyde yol açan, antikor boyama verimini azaltır ve çözünürlüğü azalmıştır. Retinanın PFA fiksasyon süresi çok uzun ise, bu sorun da oluşabilir. Bununla birlikte,boyamadan önce, -20 ° C'de derin dondurucuda metanol içinde birkaç aya kadar uzun süreli depolama öncesine kadar isolectin boyama ve Tablo 1 'de antikorların çoğu için uygundur. Isolectin boyama nadiren sorunlu olsa da, bu endotel hücrelerinin yanısıra leke makrofajlar yapar. Bütün montaj retina iyi bir immün için, antikorların seçimi kritik olduğu ve boyama protokolü poliklonal antikorlar kullanıldığında, gruplar arasında değişebilir antikor özgüllüğü ve konsantrasyon göre adapte edilmesi gerekmektedir. Yüksek arka Ortalama olarak, antikor konsantrasyonunun düşürülmesi yıkama süresinin artırılması ya da yıkama adımları için daha fazla deterjan eklenerek azaltılabilir. Üretici tarafından belirtildiği gibi antikorlar varış bölünüp ve saklanır. -20 ° C'de saklanır olanlar için, bir çalışma kısım çözülme dondurma tekrar döngüleri önlemek için buzdolabında tutulur. Parlak floresan noktalar, lekeli örnek üzerinde özellikle görünüyorsa bu da mevcutdoku etrafındaki bölgede, bu antikor çökelen agrega kullanılmadan önce 5 dakika boyunca 10,000 rpm'de santrifüje edilerek antikor sonraki tüm deneylerde kaldırılması gereken mevcut olduğunu ortaya koymaktadır. Şu anda laboratuvarları tarafından kullanılan antikorların bazıları uygun seyreltme (Tablo 1) ile malzeme listesi yer almaktadır. Antikor uyumlu bir kombinasyon seçimi birincil ve ikincil antikorlar arasındaki istenmeyen çapraz reaksiyon önlemek için çok önemlidir. Hücre çoğalma önce doku hasat BrdU yaklaşık iki saatlik bir çözeltisi ile farenin enjekte edilerek izlenebilir. Bu timin analog DNA çoğalan içine dahil edilir ve daha önce açıklandığı gibi 8, belirli bir anti-BrdU antikoru kullanılarak tespit edilebilir.
Her retina çok kırılgan, ancak protokolü üzerinden çalışan iken hafifçe doku davranarak farklı vasküler belirteçler için lekeli olabilir. Kontrollerin bir dizi dahildirHer deney boyama özgünlüğü göstermek için. Tedavi edilmeyen retina az olmalıdır dokusunda otofloresans derecesi, ortaya çıkaracaktır. Bir birincil antikor kontrol herhangi bir dokuya ikincil antikorun spesifik olmayan bağlanmanın belirlenmesi izin verir. Yanlışlıkla diseksiyonu sırasında yırtık olan retina kontrolleri için yararlı doku sağlayabilir. Slaytlar, karanlıkta 4 ° C'de saklanır olarak monte edildikten sonra, floresan boyama sürece birkaç gün boyunca muhafaza edilir. Epifluorescent mikroskobu ile görüntüleme odak ışığı dışında kaldırır bir Apotome, kullanımı artırıldı. Alternatif olarak, konfokal mikroskopi doğru hücreye spesifik bir görüntüleme (Şekiller 3 ve 4) içerir.
Bu yöntem birçok olası uygulamalar vardır. Bu anjiyojenez düzenleyen anahtar genlerin Kre-loxP genetik 8-10 indüklenebilir kullanan çalışma da dahil olmak üzere, tükenmiş edildiği farenin uygulanabilir. Alternatif olarak retina anjiyogenez olabilirsorguya aşağıdaki ilaç tedavileri kendi yanlısı ya da anti-anjiyogenik etkileri 11 araştırılması ya sistemik veya intra-oküler teslim. Bu mevcut transgenik araçlarından yararlanmak ve retina damar 11,12 temel unsuru görselleştirmek için GFP veya RFP transgenik fareler kullanmak da mümkündür. (Oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS içinde% 4 PFA ile önceden tespit transgenik farenin, görüntüleme endojen GFP veya RFP retinalarında protokolün adım 2.12 metanol yerine kullanılan dikkat ediniz.) Ayrıca, moleküler sinyal incelemek amacıyla, mekanizmalar, in situ hibridizasyon 13 kullanılarak retina pleksusta spesifik genlerin ekspresyonunu görselleştirmek için yararlıdır.
Bu çalışma, Wellcome Trust ve İngiliz Kalp Vakfı tarafından finanse edildi.