Fertilizasyon (döllenme), kadın ve erkek üreme hücreleri olan oosit ve spermin birleşerek, devamındaki hücre bölünmeleri ile embriyoyu oluşturacak olan, tek hücreli zigotu meydana getirmesi olarak tanımlanabilir. Dolayısıyla döllenmenin gerçekleşebilmesi için öncelikle spermin oosite ulaşabilmesi gereklidir. Bu süreç, “in vitro” ortamda (kadın rahminde), cinsel birleşme esnasında erkeğin ejakulasyonu sonrası vajene dökülen spermlerin öncelikle rahime geçiş koridoru olan mukus yapıdaki serviksten geçişi ve rahimde ilerleyerek, ovule olmuş olan ve tubalarda bekleyen oosite ulaşarak bağlanması ve sperm başı içerisindeki genetik yapısını (DNA) içeren çekirdeği ve döllenmede görev olan birçok biyomolekülleri içeren sitoplazmasını oosit içerisine aktarması ile gerçekleşir.
Birinci öncelik spermin rahim içine ulaşması
In vitro ortamda döllenmenin sağlanabilmesi için birinci öncelik, yeterli sayıda hareketli spermin (~2 milyon) rahim içerisine ulaşabilmesidir. İkincil olarak spermlerin, akrozom adı verilen, başın ön tarafında yer alan kısmında, oositi çevreleyen kümülüs hücre tabakasını aşarak oositin dış koruyucu kılıfı olan zona pellucida tabakasına bağlanabilmesi ve nihayetinde oosite ulaşabilmesi için gerekli olan reseptörlere ve enzim içeriğine sahip olgunlukta olması gerekir. Bu süreçte yaşanabilecek çeşitli olumsuzluklar (sperm sayı azlığı, hareketliliği etkileyen kuyruk defektleri, akrozomal defektler) döllenmenin gerçekleşmesine engel olabilir.
IVF tedavilerinde birinci öncelik, spermin yumurtaya ulaşmasını engelleyebilecek aşamaların atlanarak, spermin direkt olarak oosit ile buluşturulmasını sağlamaktır. Bu amaçla infertil çiftlerde, infertilite durumuna göre IUI (Intra Uterin Inseminasyon,), IVF (In vitro Fertilizasyon) ya da ICSI (Intra Cytoplasmic Sperm Injection) yöntemleri uygulanır.
IUI işleminde amaç; spermlerin rahime ulaşmasını engelleyen olası servikal problemlerin aşılarak, hareketli sperm hücrelerinin direkt olarak rahim içerisine ulaştırılmasıdır. Devamında döllenmenin gerçekleşmesi, sperm ve oositin yapısal özelliklerine bağlıdır. IUI işlemiyle başarı sağlanamayan ya da gametlere bağlı önceden tanımlanan olumsuzluklar nedeniyle IUI ile sonuç alınamayacak vakalarda laboratuvarda dölleme yöntemleri uygulanır. Bu amaçla IVF ya da ICSI, yine infertilite endikasyonu doğrultusunda tercih edilir.
Sperm sayısı ve kalitesi önemli
IVF işleminde ön hazırlık işlemleri ile elde edilen sperm hücreleri, oosit sayısını arttırmak için uygulanan KOH (Kontrollü Overyen Hiperstimülasyon) tedavisi sonrası gerçekleştirilen OPU (Oocyte Pick-up) işlemi ile elde edilen oositler ile aynı kültür ortamında bekletilerek döllenme sağlanır. Bu yöntemin uygulanabilmesi için öncelikle sperm sayısının ve kalitesinin yeterli olması (sayının 2 milyon/ml üzeri olması ve belirgin morfolojik defektlerin bulunmaması) gerekir. Uygun şartlarda IVF uygulaması ile döllenme oranları yüzde 50-60 civarındadır.
ICSI yöntemi, özellikle düşük sperm sayısına sahip çiftlerde tercih edilen bir yöntem olmakla birlikte, döllenme başarısının IVF yöntemine göre daha yüksek olması (> yüzde 70) nedeniyle yaygın olarak kullanılır. Bu yöntemde, hazırlanan sperm hücreleri mikroskop altında, morfolojik özellikleri, hareketlilik tarzı ve sperm yapısına bağlı olarak tercih edilen alternatif seçim yöntemlerinin kullanımıyla, özel mikropipetler yardımı ile seçilerek, direkt olarak oosit içerisine enjekte edilir. Bu sayede, spermin oosite ulaşmasına engel olabilecek diğer olası faktörlerde aşılmış olur. ICSI yöntemi, spermin doğrudan oosit içerisine ulaşmasını sağlar; ancak bu durum her oositin kesin olarak dölleneceği anlamına gelmez. Döllenmenin başarılması, spermin fiziki olarak oosite ulaşmasının ötesinde, moleküler seviyede birçok aşamanın düzgün işlemesini gerektirir.
Oositin döllenebilmesi için birincil öncelik, sperm sitoplazması içerisinde bulunan bazı faktörlerin oositi aktive edebilmesidir. Oosit, mayoz bölünmenin metafaz 2 olarak tanımlanan aşamasında beklemede olan bir hücredir ve bölünmeye devam edebilmesi için sperm tarafından gelecek bir uyarıya ihtiyaç duyar. Bu noktada şu ana kadar tanımlanmış en belirgin faktör fosfolipaz-C olarak adlandırılan bir biyomoleküldür. Fosfolipaz-C, oosit sitoplazmasında, nihayetinde hücre içi kalsiyum seviyesinin artışına ve bir süre devam eden dalgalanmalara sebep olan bir seri süreci başlatan etkendir. Bu sinyali alan oositin mayoz bölünmesi devam eder ve nihayetinde zigot adı verilen döllenmiş hücre meydana gelir.
Döllenmeyi etkileyecek birçok engelin aşılmasını sağlayan ICSI yönteminde başarı oranı yüzde 70-80 civarındadır; ancak bazı vakalarda (yüzde 3-5) hiç döllenme gerçekleşemeyebilir. Döllenme başarısızlığının altında yatan nedenler oldukça komplekstir ve siklusa özel parametreler, oosit sayısı ve kalitesi, sperm sayısının ve kalitesinin yeterli olup olmaması gibi birçok faktöre bağlıdır. Nihayetinde döllenme başarısızlığının temel nedeni oosit aktivasyonun gerçekleşememesidir. Bu noktada sperme ait defektler başı çekmektedir.
Normal döllenmenin gerçekleşebilmesi için öncelikle spermin yeterli nükleer olgunluğa sahip olması, genetik materyalinin paketlenmesi ile ilgili bir defekt bulunmaması gereklidir. Spermin olgunlaşması sürecinde, sperm üretimi esnasında çevresel olumsuz etkilere karşı genetik yapının korunması için sıkı paketli durumda olan DNA’nın daha gevşek paketlenme formuna geçişi gereklidir. Globozoospermi olarak tanımlanan sperm morfolojik defekti bu konuda en dikkat çeken anomalidir. Bu defekte sahip spermlerde akrozom yokluğuna ek olarak, DNA sıkı paketlenmiş olarak kalmakta ve bu durum döllenme başarısını ciddi oranda (yüzde 0-20) etkiler. Ek olarak, sperm içerisinde oosit aktive edici faktörlerin yetersiz olması ve centriol adı verilen, döllenme sürecini yöneten mikrotübül yapılarını oluşturan organele ait defektlerde yine döllenme başarısını olumsuz etkiler.
Döllenme başarısını etkileyen oosite ait faktörlerin başında oosit sitoplazmasının yeterli olgunluğa sahip olmaması (sitoplazmik matürasyon) gelir. Oositin olgunluğu nükleer ve sitoplazmik olarak iki kısımda değerlendirilir. Polar cisimcik olarak adlandırılan hücrenin zona içerisinde gözlenmesi oositin nükleer olgunluğa ulaştığının işareti olmakla birlikte, bu yapıda bir oosit, sitoplazmik matürasyon olarak tanımlanan, döllenme sürecinde önemli rol oynayacak organellerin (özellikle mitokondri) miktarı bakımından yeterli seviyede olmayabilir. Bu durumda, sperm ile ilgili bir problem olmasa bile döllenme gerçekleşmeyebilir.
Laboratuvarda döllenme başarısızlığını aşabilmek için uygulanabilecek alternatif yöntemler bulunmaktadır. AOA (Assisted Oocyte Activation) olarak tanımlanan bu yöntemlerin ortak noktası, oositin döllenmesi için birincil öncelik olan hücre içi kalsiyum artışının suni olarak indüklenmesidir. Bu amaçla kullanılan yöntemler mekanik, elektrik ve kimyasal aktivasyon olarak 3 başlıkta toplanır:
Mekanik aktivasyon yönteminde, oosit sitoplazması mikroenjeksiyon esnasında mikropipet ile birkaç kez al-ver yapılarak oosit içi kalsiyum deşarjı ihtimalinin arttırılması amaçlanır. Ek olarak, mikroenjeksiyon esnasında harici olarak oosit içerisine kalsiyum verilmesi de uygulanabilir. Diğer yöntemlere göre başarı şansı daha düşüktür.
Elektrik aktivasyon yönteminde, bu yönteme özel cihaz ve kültür kaplarının kullanımıyla mikroenjeksiyon uygulanmış olan oositlere düşük voltajda elektrik sinyalleri verilir. Hücre zarı üzerindeki kanalların (pore) genişletilmesi ve hücre dışı kalsiyumun hücre içine girişinin arttırılması hedeflenir.
Kimyasal aktivasyon yönteminde, oositler çeşitli kimyasallar içerisinde bekletilerek elektrik aktivasyonda olduğu gibi yine hücre zarındaki kanalların genişletilmesi hedeflenir. Bu amaçla kullanılan kimyasallara etanol, calcium ionophore A213187, ionomycin, puromycin, strontium chloride, phorbol ester ve thimerosal örnek olarak verilebilir.
Oosit aktivasyonu ile özellikle sperme bağlı döllenme başarısızlıklarında oldukça başarılı sonuçlar bildirilmekle birlikte (globozoospermi vakalarında yüzde 100’e varan döllenme oranları elde edilebiliyor), oosite bağlı durumlarda aynı başarıya ulaşmak mümkün olamayabiliyor. Bu durumda en faydalı yaklaşım, önceki denemelerinde döllenme başarısızlığı yaşanan vakalarda, oosit sitoplazmik matürasyonun yetersiz kalabilmesi ihtimali doğrultusunda, OPU sonrası mikroenjeksiyona kadar bekleme süresinin uzatılması ya da KOH sürecinde yapılacak manipülasyonlarla (sürenin uzatılması ya da farklı protokollerin denenmesi) elde edilen oositlerin matürasyon ihtimalinin arttırılması olmaktadır.