Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis | Protocol (Translated to Turkish)
İnsan Lipoaspirates den Yağ-türetilen Kök Hücreel İzolasyon…
İnsan göbek bağı ve fetal plasentadan Mezenkimalomal Hücre İzolasyonu ve Vasıflandırılması…
NOT: Tüm hasta numuneleri bilgilendirilmiş rıza ile elde edilmiştir ve deneysel protokolleri gözden ve Stanford Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu (Protokol # 2188 # 9999 ve) tarafından onaylanmıştır.
1. Hücre İzolasyonu ve Kültür:
Genel / lokal anestezi altında karın, kanadını, ve / veya uyluk bölgesi seçmeli lipoaspiration geçiren sağlıklı kadın hastalarda insan deri altı yağ dokusu edinin. Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK) onayı insan dokularından TSK izole protokolü elde edilmiş olduğundan emin olun ve bu tür malzemeler ile çalışırken kurumsal güvenlik önlemlerine uyun.
Lipoaspirated adipoz dokudan SVF elde edilmesi için, ilk olarak 1 x steril fosfat-tamponlu tuzlu su, eşit hacimlerde (PBS) lipoaspirate üç kez yıkayın. Dikkatle aspire ve alt sulu tabaka atın.
Ben Hank de Kolajenaz 0.075% Tip: kollajenaz sindirim tampon hazırlayınDengeli Tuz Çözeltisi (HBSS). FACS tamponu hazırlayın: 2% FBS, 1% P188 ve PBS içinde% 1 Pen-Strep. Bir piyasada mevcut 0.22 mikron gözenek boyutu hızlı akış polietersülfon filtre kullanarak her iki çözümleri Filtre.
Yıkandı, yağ dokusu sindirimi için, 37 ° C (yaklaşık 180 sallar / dk) 60 dakika boyunca çalkalanan bir su banyosu içinde güvenli bir şekilde sindirim gemi kolajenaz sindirimi tampon maddesinin eşit hacmi ekleyin ve koyun.
Not: Bu sallama esnasında maksimum sindirim için izin vermesi, gerekli olandan daha büyük bir hacim sindirim kap kullanmak için en iyi (yani, kolajenaz sindirim tamponu 250 mi, 1 litrelik bir steril şişe içine yıkanmış adipoz dokusu 250 ml) eklenmiştir.
FACS tampon maddesinin eşit hacmi ilave edildikten ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında oturmak için izin enzimatik aktivitesini nötralize. Daha sonra, 4 ° C'de 20 dakika boyunca 233 x g'de santrifüje tabi tutun.
Dikkatle aspire ve yüksek yoğunluklu SVF pelet rahatsız etmemek için özen, süpernatant atın.
RT kırmızı 5-10 ml pelletiniHücre topağı boyutuna göre, liziz tamponunda. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 233 x g'de 5 dakika santrifüj oda sıcaklığında oturup çözeltisi bırakın.
Aspire yüzer madde ve topak boyutuna göre geleneksel büyüme ortamı 5-10 ml ekleyerek pelletini (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı [DMEM] /% 10 FBS /% 1 penisilin-streptomisin solüsyonu [Pen-strep]).
Selüler artığın ayrılması için bir 100 um naylon hücre süzgecinden Süspansiyon filtre edilir.
4 ° C'de 5 dakika boyunca 233 x g'de santrifüj ve pelet bozmadan süpernatant atılır.
Topak boyutuna dayalı geleneksel büyüme ortamı 5-10 ml olacak şekilde pelletini.
15 cm'lik standart kültür çanak 2 x 10 6 hücre yerleştirin ve 37 ° C /% 21 O 2,% 5 CO 2 birincil kültürleri O / N kurmak. 37 ° C /% 21 O2, büyüme ortamı içinde,% 5 CO2 seviyesinde kendiliğinden farklılaşmasını önlemek için alt konfluent seviyelerde muhafaza edin.
NOT: Tam Hücre yoğunluğuKonfluent 15 cm plaka yaklaşık 4-6 x 10 6 hücre olduğunu.
Boyama öncesi 36 saat için 37 ° C /% 21 O2,% 5 CO2, geleneksel bir büyüme ortamı içinde kültür TSK / ayırma.
(Imalatçının protokolüne göre) Accutase kullanılarak kültür plakalarından Asansör TSK.
Bir kez (% 2 FBS ve% 1 Pen-strep ile PBS) FACS tamponu ile hücreleri yıkayın.
4 ° C'de 5 dakika boyunca 233 x g'de santrifüjleyin.
Pelet bozmadan süpernatant atın. FACS tampon 0.5-1 ml hücrelerin tekrar (hücre sayısı ve arzu edilen antikor miktarı ile ilgili olarak).
NOT: hücre süspansiyonu hacmi, FACS antikor üreticinin tavsiyeleri doğrultusunda, antikor konsantrasyonunu belirler. Bununla birlikte, antikor konsantrasyonu titrasyon, 1 için bir başlangıç ​​konsantrasyonu kullanılarak: bir antikor kullanan ilk defa ise, 100, genellikle tavsiye edilir.
Toplam sayısınıBir hemasitometre kullanarak hücreleri.
1,5 ml santrifüj tüplerine rezervasyon 100 ul'lik bir boyanmamış örnek ve (kullanılan floresan antikor sayısına göre) tek renkli kontrol için kullanılır.
(Üreticinin talimatlarına göre, önceden belirlenmiş konsantrasyonlarda) uygun şekilde floresan ile etiketlenmiş monoklonal antikor ekleyin ve ışıktan korunan, buz üzerinde 20-30 dakika boyunca inkübe edin.
Osteojenik alt popülasyonunu etiketlemek için: 01:50 konsantrasyonunda FACS tamponu içerisinde, anti-CD90 (APC, anti-insan CD90 (Thy1)) ya da anti-CD105 (FITC anti-insan CD105 (endoglin)) seyreltin.
Diğer hücre popülasyonları (örneğin, hematopoietik ve endotelial hücreler), etiketlemek için: Anti-CD45 (anti-insan CD45 Pasifik mavi), anti-CD34 (anti-insan CD34 APC) ve / veya anti-CD31 (anti-insan CD31 PE seyreltin ) FACS 1:50 arasında bir konsantrasyona kadar tampon.
Doğrudan konjüge edilmiş antikorlar kullanılarak değil, uygun bir streptavidin-konjuge ikinci bir biyotinlenmiş primer antikor kullanımı1 bir seyreltme örneğin streptavidin PE-Cy7 olarak li antikor: 100.
Süpernatan aspire, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 233 x g'de FACS tamponu ve santrifüj tüpleri doldurun: inkübasyondan sonra, hücreler iki kez yıkayın.
Hücre kümeleri kaldırmak için bir 70 mikron naylon hücre süzgecinden 400-500 ul FACS tampon ve filtre örneklerinde hücrelerin tekrar.
Filtre en FACS tüplerine etiketli hücreler aktarın ve analiz süresince buz üzerinde örnekleri tutmak.
3. floresan aktive edilen hücre sınıflandırma
NOT: Aşağıdaki adımlar önceki floresan-aktive hücrede bilgi sıralama (FACS) veya yetenekli bir teknisyen yardımı zorunlu.
Ileri dağılım (FSC), yan dağılım (SSC) incelemek için, tasarım analizi araziler uygun FACS yazılımını kullanarak, Fikoeritrin (PE) -Texas Kırmızı, Pasifik Mavi, Fluoresein İzotiosiyanat (FITC), alofikosiyanin (APC) ve diğer fluorofor kullanımıd hücreleri etiketlemek için.
Hücre sıralayıcı, kısaca girdap hücreleri tekrar süspansiyon her numune içine yerleştirmeden önce.
Hücre kalıntıları hariç tutmak için ve taban çizgisi otoflüoresan belirlemek için, toplam hücre popülasyonunun kapılarını ayarlamak için lekelenmemiş numune analizi ile başlar.
Lekesiz numune propidiyum iyodür (PI) ekleyin ve toplam hücre nüfus içindeki canlı hücrelerin nüfusu görselleştirmek için analiz. Bu nüfusun etrafında bir kapı oluşturun.
Floresan tazminat ayarlamak için her florokrom için tek renkli kontrol örneği analiz.
Sıralama için kapıları konumunu ayarlamak için lekeli örnek analiz.
Hücreler ölü hücreleri boyamak için lekeli örnek PI ekleyin.
Etiketli hücre popülasyonlarının sıralayın. Sıralama 1,5 ml santrifüj tüplerine ya da kültür ortamı içeren konik tüp (15 mi) içine ya.
El hücre gereken miktarı, elde edildikten sonra sıralama bırakın.
BizeFACS ing, küçük bir kısmını analiz (örn., 500 hücreler) edinilen hücre popülasyonunun bir saflık kontrolü gerçekleştirecek.
NOT: Bu adım sıralanmış hücre popülasyonlarının saflığını onaylar. İdeal olarak, saflık% 90-95 daha büyük olmalıdır.
4 ° C'de 5 dakika boyunca 233 x g'de santrifüje hücreler hemen% 10 FBS içeren taze ortam 1 ml sıralama tamamlanmasını ve tekrar süspansiyon, aşağıdaki C.
Not: kullanılan ortamın miktarı, hücre peleti büyüklüğüne göre arttırılabilir.
Jelatin kaplı plakalar üzerinde plaka hücre canlılığını geliştirmek. Nihai hücre verimi, plaka 6-çukurlu plaka içindeki oyuk başına 300,000 hücre, 12 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına 100,000 hücre bağlı olarak değişir.
İnsan TSK (Şekil 1A, 1B) bir yüksek oranda zenginleştirilmiş popülasyonlarının izole edilmesi geliştirilmiş osteogenez sonuçlar hücreleri için bir marker olarak CD90 kullanılması. TSK Pasifik Mavi-konjüge anti-insan CD45 FITC-konjüge anti-insan CD105 ve APC-konjuge edilmiş anti-insan CD90 ile lekelenmiştir. Sonrası sıralama analizi ile nicelleştirilmiştir olarak sıralama sonra, saflık derecesi, daha büyük% 98 idi.
İki yeni alt popülasyonlar muhtemel izolasyonu için izin transkripsiyonel profillerine dayalı hücre gruplarının tanımlanması. Daha önce tarif edildiği gibi, her 6,8,9 umut verici bir alt populasyonun (düşük CD90 + ve CD105) osteojenik potansiyeli ve aynı zamanda bunun, in vitro olarak ayrıştırılmamış nüfus karakterize etmek için, hücreler, 14 gün boyunca osteojenik farklılaşma ortamı içinde kültürlenmiştir. 7. günde (kemik oluşumu 10 erken saptanması için kullanılır) alkalin fosfataz boyama önemli ölçüde CD90 + artmıştır (Şekil 2A) nüfus göreceli. Bu, hem ağır ve miktar (Şekil 2A), sonra gözlenmiştir. Benzer şekilde, Alizarin kırmızı boyama 14. günde (hücre dışı matris mineralizasyonu ve son uç osteojenik farklılaşma 9 için bir ölçü tespit etmek için kullanılan bir deney) CD90 + TSK hücre-dışı matrisi (Şekil 2B) önemli ölçüde daha büyük bir miktarda mineralize mümkün olduğunu göstermiştir. İzole TSK sıralama sonra osteojenik farklılaşma geçmesi yeteneği muhafaza ama kurtarmak için bir kaç gün gerektirebilir. TSK kültürde yayılması sırasında yaşlanmış olmak gibi düşük geçiş hücreleri ile diğer tüm deneyleri yapmak için gereklidir.
Şekil 1: Hücre büyüklüğü ve karmaşıklığı için (A) kapıları hücre artıkları hariç ve bir nüfus o izole çizildiDaha fazla analiz için f tek hücre. (B) tek sıralanır CD90 (solda) ve tek sıralanır CD105 (sağda) 36 saat ASC hasattan sonra TSK FACS analizi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2 (A), alkalin fosfataz boyama (üst) ve osteojenik farklılaşma ortam içinde 7 günlük bir kültürden sonra, TSK ölçümü (alt) (B), 14 gün sonra TSK alizarin kırmızı boyama (üst) ve lekeleme (alt) ölçümü. osteojenik farklılaşma ortamda kültür. Iki kuyruklu Student, CD90 + TSK ve CD105 düşük hücreler sıralanmamış hücreleri (* p <0.05 göre alkalin fosfataz boyama ve hücre dışı matris mineralizasyon artış olduğunu ortayat-testi). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şu anda, insan adipoz dokusu SVF TSK homojen alt popülasyonlarının izolasyonu arzu hedefi olsa zorlu kalır. Bu tür hücreler, kemik doku oluşumu ve homeostazı incelemek için kullanılabilir gibi pro-osteojenik ASC alt popülasyonlarının izole edilmesi özellikle tercih edilir. Ancak, adipoz doku SVF. Hücre kapasitesi ve farklılaşma potansiyelinin kök açısından bu heterojenite için moleküler temeli hücrelerinin toplanmış nüfus anlaşılmaktadır olamaz 11 önemli heterojenitesini barındıran ve bunun yerine tek bir hücre analizi gerektirir. 12 Bu yaklaşımla, yüzey belirteçleri yakından TSK osteojenik farklılaşma kapasitesi tespit edilebilir ile ilişkili.
yukarıdaki metodda tarif edildiği gibi TSK başarılı zenginleştirilmesi için en önemli faktör, FACS için kullanılan antikorlar ile ilgilidir. Bir cel için yüksek bir yakınlığa sahip bir antikorun seçimi akıllıca olmalıdırSöz konusu L-yüzey markeri. İdeal olarak, bu şekilde birden fazla adım, hücre ölümü, hücre kaybı ve hata tahakkuk artan bir şans gerektiren bir dolaylı boyama yöntemi, farklı olarak bir birincil konjuge antikoru olmalıdır. Ayrıca, FACS sırasında küçük değişiklikler hücre canlılığını artırabilir. Bu,% 10 jelatin ile önceden kaplanmış olan kültür levhaları üzerinde elde edilen hücre popülasyonu kaplama, bir soğuk depo içine sıralama her zaman buz üzerinde hücreleri tutarak, kültür ortamı içeren ve muhafazalara hücreleri sıralama içerir. Bu sıralanmış hücrelerin saflığını sağlamak amacıyla, bir post-sıralama saflık analizini gerçekleştirmek için önemlidir.
Bu teknik bir tesis içinde FACS ekipman ve uzmanlık durumu ile sınırlıdır. Birincil numuneler heterojen olarak Ayrıca, yüzey belirteçleri ifadesi bireysel bazda değişecektir. Anılan gibi, ASC olarak, düşük geçiş hücreleri ile tüm deneyler gerçekleştirmek için gereklidirs kültüründe yayılması sırasında yaşlanınca. Buna ek olarak, TSK kök hücre biyolojisi değiştirebilir in vitro koşullarında fenotipik ifadesinin bir değişiklik sergilediği bilinmektedir. Bu nedenle, klinik, tercüme için, in vitro kültivasyonu için gerek kalmadan bir iskelete doğrudan nakli ya da hücre ekimi için yüksek ölçüde saflaştınlmış bir hücre popülasyonu elde etmek için en iyi olur. Tartışılan ve son yayında 13 Zuk ve meslektaşları tarafından ele Buna ek olarak, ihtiyaç lipoaspirate büyük hacimleri, SVF tekniği ile yabancı olanlar için külfetli olabilir izole etmek işlenecek. Zuk ve arkadaşları tarafından tarif edilen yönteme göre de., Bu protokol kolayca ölçeklendirilebilir veya aşağı lipoaspirate hacmine uygun olarak ve abdominoplasties ve benzer prosedürler ile elde edilen yağ dokusundan TSK izole edilmesi için adapte edilebilir.
CD90 ve CD105 önce erken mezenkimal kök c tanımlanmıştırBM-MSC ve ASC nüfus hem ell belirteçler,. Önceki araştırmalar uygun olarak, CD90 + popülasyonu yeni izole edilmiş SVF yaklaşık% 50 temsil etmektedir. Buna karşılık 14, ilk SVF sadece yaklaşık% 5-10 CD105 ifade edilmiştir. 6 Özellikle, arka arkaya geçişleri ile, CD105 sentezleme hızla hemen hemen yükselmiştir kültür neredeyse her yerde ifade sıfır 4-7 gün sonra. Bu TSK kök hücre biyolojisi değiştirebilir in vitro genişlemeleri sırasında önemli bir fenotipik sürüklenme sergiledikleri bilinmektedir. 15-17 İdeal olarak, kök hücreleri için klinik uygulamalar bir yapı iskeleti üzerine doğrudan nakli veya tohumlama arıtılmış hücre popülasyonlarının hemen kullanımını içerecektir in vitro kültivasyonu için ihtiyaç duymadan. CD90 + hücrelerinin yüzdesi yağ depo bağımlı kökeni farklı lipoaspirate numune veya yaşa bağlı bir şekilde değişiklik gösterebilir. Bununla birlikte, bir hücre yüzey markörü olarak CD90 ile zenginleştirme o sağlarGelişmiş osteojenik potansiyele sahip insan TSK fa ICSI'nin. Osteojenik zenginleşme Bu yöntem yeni bir kritik boyutlu iskelet kusurlar hastalarda hızlı ve güçlü bir kemik oluşumunu teşvik etmek için bir araç olarak hizmet etme potansiyeline sahiptir. Biz rutin olarak bu yukarıda açıklanan rağmen yağ depo kökenli veya hasta demografik göre değişebilir., Standart lipoaspirate o yaklaşık hücre verimi Anılan hasat yöntemi kullanılarak lipoaspirate 5 x 10 7 çekirdekli hücreler / 500 ml gözlemlemek 18 Yoshimura ve arkadaşları olduğunu bildirdi TSK nedenle SVF. 19 çekirdekli hücrelerin nüfusunun 10-35% temsil FACS kullanan TSK osteojenik zenginleştirme aşağıdaki kemik doku mühendisliği stratejilerinin uygulanması için bir iskele doğrudan ekim için önemli bir potansiyel bulunmaktadır.
Genellikle yüksek ölçüde saflaştırılmış hücre popülasyonları gerektirir deneysel ve klinik uygulamalar için hücre bazlı bir doku mühendisliği Stem. Merhaba Diğerarınma gh verimlilik yöntemleri, FACS için basit alternatif olarak var, kaydırma kompleman tükenmesi ve manyetik aktive hücre (MACS) sıralama vardır. Bununla birlikte, bazı durumlarda, FACS hem gerekli hem de avantajlı bulunmuştur: yüksek ölçüde saf alt popülasyonlarının izole edilmesi istendiği zaman, hedef yüzey işaretleyici hücre popülasyonunda sık meydana gelir, ya da hücrelerin ayrılması gerekir, aynı yüzeyin değişen ifade seviyeleri göre zaman işaretleyici.
Mikroakışkan-esaslı tek hücreli transkripsiyonel analizi ve floresans ile aktive edilen hücre tasnif, endoglin (CD105) ve Thy-1 (CD90) hem de kullanılması osteojenik genlerin ASC tanımlamasındaki farklılıklara ile ilişkili olduğu bulunmuştur. Tek hücre transkripsiyon profil istatistiksel analizi CD105 ve CD90 yüksek ekspresyonu düşük sentezleme artan osteojenik kapasiteli TSK alt gruplarını tarif gösterdi. Bu proteinler daha sonra d hücrelerin osteojenik alt popülasyonlarının zenginleştirilmesi için kullanılmıştırİnsan deri altı yağ dokusundan erived. 6,20
Bununla birlikte bu veriler, osteojenik transkripsiyon aktivitesi ile ilişkili, spesifik hücre yüzey belirteçleri göre TSK sıralama etkinliğini göstermektedir. Bu yaklaşımın fizibilitesi, örnek olarak CD90 ve CD105 kullanımı ile burada gösterilmiştir, ancak, daha fazla analiz derece osteojenik transkripsiyon aktivitesi ile ilişkili yüzey antijeni ifade umut verici kombinasyonlarını içerecek şekilde yapılması gerekir.
Yazarların hiçbiri bu metinde belirtilen ürünler, cihazlar veya uyuşturucu herhangi bir mali ilgi var. Yazarların hiçbiri rapor için herhangi bir rakip mali bir ilgi var.
Bu çalışma Sağlık Araştırma hibe R01-DE021683-01 ve Sağlık Araştırması hibe R01-DE019434 National Institutes MTL Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen; MTCDCW Howard Hughes Tıp Enstitüsü Araştırma Bursu ACS Franklin Martin Fakültesi Araştırma Bursu, Çocuk Rejeneratif Tıp Hagey Laboratuvarı ve Stanford Üniversitesi Çocuk Sağlığı Araştırma Enstitüsü Fakültesi Akademik Ödülü tarafından desteklenmiştir.