Maya - Küf01. Genel Bilgiler02. Standart Analiz Yöntemi.03. Özel Grupların Sayımı04. Kullanılan Besiyerleri 04.01. Yeast extract Glucose Chloramphenicol Agar 04.02. Malt Extract Agar 04.03. Potato Dextrose Agar 04.04. %50 Glucose Broth 04.05. Oxytetracyclin Glucose Yeast (OGY) Agar (Merck 1.10877) 04.06. Wort Agar (Merck 1.05448) 04.07. Rose Bengal Chloramphenicol (RBC) Agar (Merck 1.00467) 04.08. Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol (DRBC) Agar (Merck 1.00466) 04.09. Dichloran Glycerol (DG 18) Agar (Merck 1.00465)01. Genel BilgilerMaya – küf sayısı açıkta pazarlanan, üretim teknolojisi gereği paketleme işleminden önce açıkhavaya maruz kalan, ürün pastörize olsa dahi ambalaj materyalinden bulaşma olabilen, yıkamave soğutma/dondurma dışında teknolojik işlem görmeyen gıdalar için önemli bir kalitegöstergesidir. Baharat gibi toprakla teması fazla olan ve yıkama dahi yapılmadan sadeceöğütülüp ambalajlanan ürünlerde küf sayısı oldukça yüksek iken, şekerli ürünlerde daha ziyademaya hakimdir.Gıda mikrobiyolojisi ile ilgili standartlarda genel olarak toplam maya ve küf sayısı beraberceele alınır. Bu deyim, toplam bakteri sayımında olduğu gibi uygun bir besiyerinde uyguninkübasyon koşulları sonunda koloni oluşturabilen maya ve küf hücrelerinin toplam sayısınıverir. Genel olarak maya ve küfler için yaygın kullanılan besiyerleri ile yapılan analizlerde buiki grup mikroorganizma kolaylıkla gelişebilirken, bakterilerin gelişerek koloni oluşturmalarıbaşta yüksek asitlik veya antibiyotik kullanımı ile engellenir.Maya – küf hakkında daha fazla genel bilgi için burayı tıklayın.02. Standart Analiz YöntemiÇoğu standartta toplam maya ve küf sayısı dikkate alınırken, özellikle ticari ilişkilerdeazımsanmayacak boyutta olmak üzere maya ve küf sayılarının ayrı ayrı ele alınması damümkündür. Bu koşulda ya bu iki grup mikroorganizmanın adı geçen besiyerlerinde kolonimorfolojileri dikkate alınarak ayrı sayımları yapılır ya da amaca uygun olarak farklı besiyerlerikullanılabilir. Örneğin, sadece mayaların gelişmesi isteniyor ise besiyeri bileşimine %0,25konsantrasyonda sodyum propionat katılarak küf gelişmesi baskılanabilir.Toplam maya-küf sayımı için genel olarak 25-28 oC (bazı kaynaklara göre 20-22 oC) ve 5 günsüren aerobik inkübasyon yapılır. Aşırı küf miseli gelişmesi neticesinde sayım güçlüğüolacağından, sayım sonuçları 3. günün sonundan itibaren alınabilmektedir. Prensip olarak bu 2.
sürenin sonunda maya ve özellikle küf gelişimi gözlenmemişse inkübasyona 48 saat dahadevam edilmektedir. Küflerin, mayalara göre daha geç koloni oluşturması, küf kolonilerininyayılarak daha önce gelişmiş maya kolonilerini örtmesi gibi nedenlerle maya kolonilerininönceden sayılması ve/veya petri kutusunda işaretlenmesi yararlı bir uygulamadır.Maya-küf sayımı için kullanılan besiyerlerinde bakterilerin gelişmesi ortamın asitlendirilmesiveya antibiyotik kullanımı ile önlenebilir. Asit olarak filitre ile sterilize edilmiş %10 luk tartarikasit veya laktik asit kullanılır. Asit, sterilize edilmiş ve 45 oC a kadar soğutulmuş ve sıvı haldetutulan besiyerine ilave edilir. İlave edilecek miktar ön denemelerle saptanabilir ve aynı besiyeriiçin her zaman aynı asit aynı miktarda katılabilir. Asit ilavesinden sonra dondurulan besiyerihiçbir şekilde yeniden eritilmez. Antibiyotik olarak klortetrasiklin hidroklorür kullanımıönerilir. Bu antibiyotik %1 konsantrasyonda hazırlanıp filitre ile sterilize edilir. Karanlıkta ve+4 oC da olmak üzere en uzun 1 ay depolanabilir. Antibiyotik son konsantrasyonu 40 ppmolacak şekilde, sterilize edilip 45 oC da sıvı halde tutulan besiyerine ilave edilir. Maya-küfsayımı için kullanılacak tüm besiyerlerine asit veya antibiyotik katılacak diye bir kural yoktur.Bazı besiyerlerinde zaten antibiyotik vardır ve/veya besiyerinin kendisi zaten yeterince asitlidir.Gıdalarda maya ve küflerin sayımı için Oxytetracyclin Glucose Yeast Agar (Merck 1.10877)Potato Dextrose Agar (Merck 1.10130), Malt Extract Agar (Merck 1.05398), Wort Agar (Merck1.05448), Rose Bengal Chloramphenicol Agar (Merck 1.00467), Dichloran Rose BengalChloramphenicol (DRBC) Agar (Merck 1.00466), süt ve ürünlerinin analizi için Yeast extractGlucose Chloramphenicol Agar (Merck 1.16000), düşük su aktiviteli gıdalardaki kserofilküflerin sayımı için Dichloran Glycerol (DG 18) Agar (Merck 1.00465) en yaygın kullanılanbesiyerleridir.Sayım standart yayma veya dökme kültürel sayım yöntemi ile yapılır. Dökme yöntemi ileçalışıldığında termal şoklardan sakınmak için besiyeri sıcaklığının 45 oC ı geçmemesinedikkat edilmelidir. Yayma kültürel sayım yöntemi kullanılmasının, besiyeri yüzeyinde mayave küflerin daha hızlı üremesi, düzgün ve standart koloni oluşumu, sayım sonrası izolasyonidentifikasyon kolaylığı nedeniyle daha avantajlı olduğu belirtilmektedir.Küflerin sayımında EMS yöntemi pratik olarak kullanılmamakla beraber, maya sayımında buyöntem kullanılmaktadır ve aşağıda ozmofilik maya sayımı bölümünde bu konuda örnekverilmiştir.Maya – küf hakkında daha fazla analiz bilgisi için burayı tıklayın.03. Özel Grupların SayımıOzmofilik – ozmotolerant maya sayımı özellikle ve başta elma suyu konsantresi olmak üzeremeyve suyu konsantrelerinde hemen hemen en önemli hatta tek mikrobiyolojik kalitekriteridir. Bu grup mayalar meyve suyu konsantrelerinde gelişerek üründe bozulmalara nedenolmaktadır. Ozmofilik – ozmotolerant mayaların beraberce sayımında %50 Glikoz Brothbesiyeri kullanılarak EMS yöntemi ile sayım sıklıkla kullanılmakla beraber, UluslararasıMeyve Suyu Federasyonu (IFU) her iki grubun ayrı sayımını önermektedir.Buğday ve diğer tahıllar, fındık vb. ürünlerde küflü dane sayımı çoğu kere başvurulan bir kalitegöstergesidir. Temel olarak küf gelişimine uygun bir besiyerine analizi yapılacak örnektenyeteri sayıda dane doğrudan önceden Petri kutusuna dökülmüş ve katılaşmış besiyerine 3.
yerleştirilir. Bu işlemde danenin tümünün besiyeri ile temas etmesine özen gösterilir.İnkübasyon sonrasında Petri kutusuna ekilmiş daneler içinde küf gelişimi olanların sayısıtoplam ekilen dane sayısına bölünerek yüzde küflü dane sayısı hesaplanır. Bu uygulamada küfkolonilerinin birbirine karışmasının ve buna bağlı olarak sayım güçlüğü ile karşılaşılmasınınönlenmesi amacı ile inkübasyonun genellikle üçüncü gününde steromikroskop ile Petri kutusuincelenir ve mikrokoloni oluşturan daneler sayılır.Howard Lamı ile küflü saha sayımı özellikle salça ve ketçap gibi domates ürünlerindekullanılan hammaddenin kalitesi hakkında bilgi veren bir sayım yöntemidir. Bu yöntem meyvesularında da uygulanmaktadır. Howard lamı sayım yöntemi için burayı tıklayın.Thoma lamı ise mayaların fermantasyon amacı ile kullanıldığı üretimlerde (bira, şarap, vs.)maya sayısının hızlı bir şekilde belirlendiği mikroskobik bir sayım yöntemidir. Diğermikroskobik sayım yöntemlerinden farklı olarak canlı hücre sayısı belirlenebilir. Thoma lamısayım yöntemi için burayı tıklayın.04. Kullanılan Besiyerleri04.01. Yeast extract Glucose Chloramphenicol Agar (Merck 1.16000)Dehidre besiyeri 40 g/l olacak şekilde distile su içinde ısıtılarak eritilir, otoklavda 121 oC da15 dakika sterilize edilir ve steril petri kutularına 12,5 er ml dökülür. Hazırlanmış besiyeriberrak sarı renklidir ve buzdolabında 4 ay, oda sıcaklığında 2 hafta depolanabilir. Besiyeribileşimindeki kloramfenikol refakatçi floranın gelişimini baskılar. Besiyerinin diğer maya-küf besiyerlerine göre çok büyük bir hazırlama kolaylığı antibiyotiğin bileşimde olması veotoklav sonrası başka bir katkıya gerek duyulmamasıdır. 500 g olan 1 kutu dehidre besiyeri ile1000 petri kutusu hazırlanır.04.02. Malt Extract Agar (Merck 1.05398)Dehidre besiyeri 48 g/l olacak şekilde distile su içinde ısıtılarak eritilir, otoklavda 121 oC da10 dakika sterilize edilir ve steril petri kutularına 12,5 er ml dökülür. Hazırlanmış besiyeriberrak sarımsı renklidir ve buzdolabında 2 ay depolanabilir. Otoklavda sterilizasyon sırasındaaşırı ısıtmadan kaçınılmalıdır. 500 g olan 1 kutu dehidre besiyeri ile 833 petri kutusuhazırlanır. Bu besiyeri hakkında daha fazla bilgi için burayı tıklayın.04.03. Potato Dextrose Agar (Merck 1.10130)Dehidre besiyeri 39 g/l olacak şekilde distile su içinde ısıtılarak eritilir, 121 oC da otoklavda15 dakika sterilize edilir ve steril petri kutularına 12,5 er ml dökülür. Hazırlanmış besiyeriberrak açık sarı renklidir ve buzdolabında 2 ay depolanabilir. Asitlendirme isteniyor ise (pHyaklaşık 3,5) su banyosunda tutulan besiyeri sıcaklığı 45-50 oC a düştüğünde filitre ilesterilize edilmiş %10 tartarik asitten 14 ml ilave edilir, karıştırılıp yine steril petri kutularına12,5 er ml dökülür. Asitlendirilmiş besiyeri tekrar eritilemez. Analiz edilecek örnekterefakatçi flora olarak bakteri yükü fazla değilse ve/veya önemli değil ise PDA besiyeriasitlendirilmeden de kullanılabilir. 500 g olan 1 kutu dehidre besiyeri ile 1040 petri kutusuhazırlanır. Bu besiyeri hakkında daha fazla bilgi için burayı tıklayın. 4.
04.04. %50 Glucose BrothMeyve suyu konsantrelerinde ozmofilik/ozmotolerant maya sayımı için kullanılan bubesiyerinin hazır ticari preparatı yoktur. Ancak laboratuvarda rahatlıkla hazırlanabilir. Su ile 1litreye işaretlenen boş erlene 500 g glikoz (Merck 1.08342), %0,5 olacak şekilde 5 g mayaekstraktı (Yeast Extract ; Merck 1.03753) ve işaretlenmiş yere kadar distile su ilave edilir.Isıtılarak ve karıştırılarak eritilir. Tüplere 10 ar ml dağıtıldıktan sonra 121 oC da 15 dakikasterilize edilir. Hazırlanmış besiyeri berrak ve kahve renklidir. Buzdolabında 2 aya kadardepolanabilir. Bileşimdeki yüksek glikoz konsantrasyonu nedeni ile bu besiyerindeozmofilik/ozmotolerant mayalar dışındaki refakatçi flora gelişemez. Ozmotik şoktansakınmak için %20 glikoz kullanılarak yapılan seyreltmeden sonra standart EMS yöntemi ileekim yapılır ve tüplerin üzeri 2 cm olacak şekilde (yaklaşık 4 ml) steril katı parafin (Merck1.07158) ile örtülür ve 30 oC da 10 güne kadar inkübasyona bırakılır. Bu süre sonunda gazoluşumuna bağlı olarak parafin tabakasının yukarı itilmesi pozitif olarak değerlendirilir.Ekimi bitirilmiş tüplere katı parafin ilavesi zor ve zahmetli bir uygulamadır. Kullanılacakpipetin önceden bunzen bekinde ısıtılması ile katı parafinin pipet içinde donması önlenebilir.04.05. Oxytetracyclin Glucose Yeast (OGY) Agar (Merck 1.10877)Başta gıda olmak üzere her türlü materyalde maya ve küflerin belirlenmesi ve sayımı içinkullanılır. Dehidre besiyeri 30 g/l konsantrasyonda olacak şekilde destile su içinde ısıtılarakeritilir ve otoklavda 121 oC ‘da 15 dakika sterilize edilir. Otoklav sonrasında 50 oC ‘a soğutulanbesiyerine 2 şişe/l OGY selektif katkısı (Merck 1.09877) ya da 1 ml/l gentamicin çözeltisi(Merck 1.11977) ilave edilir, karıştırılır ve petrilere dökülür. OGY katkısı oxytetracyclinebileşimindedir. Bu besiyeri özellikle tereyağının rutin analizi için önerilmektedir. Dışkıanalizlerinde Enterobacteriaceae familyası üyelerinin daha iyi baskılanması için oxytetracyclineyerine gentamicine kullanılmalıdır. 500 g olan bir kutu dehidre besiyeri ile 12,5 ml/petri hesabıile 1333 petri hazırlanır. 500 g olan bir kutu dehidre besiyeri için 33 şişe OGY katkısına gerekvardır. Bu katkı 15 şişe/kutu olarak pazarlanmaktadır. Yine 500 ml dehidre besiyeri içingereken gentamicine çözeltisi ise 17 ml ‘dir. Bir şişe gentamicine çözeltisinde 10 mlbulunmaktadır. Bu besiyeri hakkında daha fazla bilgi için burayı tıklayın.04.06. Wort Agar (Merck 1.05448)Özellikle mayalar için geliştirilmiş bir besiyeridir. Dehidre besiyeri 55 g/l konsantrasyondaolacak şekilde destile suda ısıtılarak eritilir, otoklavda 121 oC ‘da 15 dakika sterilize edilir.Bakteri gelişmesinin engellenmesi için pH ‘nın 3,5 ‘e düşürülmesi isteniyor ise 50 oC ‘asoğutulup filitre ile sterilize edilmiş %10 laktik asit çözeltisinden 12 ml/l olacak şekilde ilaveedilir, karıştırılır ve petri kutularına dökülür. 500 g olan bir kutu dehidre besiyeri ile 727 petrikutusu hazırlanır. Laktik asit (Merck 1.00366) %90 konsantrasyonda ve 500 ml olduğuna göre1 şişe laktik asit 500 g olan 41 kutu dehidre besiyeri için yeterlidir. Bu besiyeri hakkında dahafazla bilgi için burayı tıklayın.04.07. Rose Bengal Chloramphenicol (RBC) Agar (Merck 1.00467) 5.
Özellikle proteinli gıdalarda maya ve küf sayımı içindir. Dehidre besiyeri 32,2 g/litrekonsantrasyonda olacak şekilde destile su içinde kaynatılarak eritilip, otoklavda 121 oC ‘da15 dakika sterilize edilir. Hazırlanmış besiyeri pembe – kırmızı renklidir. Karanlıkta vebuzdolabında olmak kaydı ile 1 hafta depolanabilir. Besiyeri pH ‘sı nötr olmakla beraber,bakteri gelişimi chloramphenicol ile baskılanır. Rose – bengal ise küflerin yayılıcı kolonioluşturmasını engelleyerek sayımı kolaylaştırır. 500 g olan bir kutu dehidre besiyeri ile 12,5ml/petri hesabı ile 1242 petri hazırlanır.04.08. Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol (DRBC) Agar (Merck 1.00466)Gıdalarda bozulma yapan maya ve küflerin sayımı içindir. Dehidre besiyeri 31,6 g/litrekonsantrasyonda olacak şekilde destile su içinde kaynatılarak eritilip, otoklavda 121 oC ‘da15 dakika sterilize edilir. Hazırlanmış besiyeri berrak ve pembe renklidir. Karanlıkta vebuzdolabında olmak kaydı ile 1 hafta depolanabilir. Dichloran kolonilerin yayılmasınıengelleyerek sayımı kolaylaştırır. 500 g olan bir kutu dehidre besiyeri ile 12,5 ml/petri hesabıile 1265 petri hazırlanır. Bu besiyeri hakkında daha fazla bilgi için burayı tıklayın.04.09. Dichloran Glycerol (DG 18) Agar (Merck 1.00465)Özellikle düşük su aktiviteli kuru ve yarı kuru gıdalarda kserofil ve kserotolerant küflerinsayımı içindir. Dehidre besiyeri 31,6 g/litre konsantrasyonda destile su içinde kaynatılarakeritilir, üzerine 175 ml/l olacak şekilde gliserol (Merck 1.04092) ilave edilip, otoklavda 121o C ‘da 15 dakika sterilize edilir. Hazırlanmış besiyeri amber renkli ve hafif opalessenttir.Karanlıkta ve buzdolabında olmak kaydı ile 1 hafta depolanabilir. Besiyerine %18 gliserolilavesi su aktivitesini 0,99 ‘dan 0,95 ‘e düşürür. Düşük su aktivitesi ve chloramphenicolbakteri gelişmesini engeller. Dichloran kolonilerin yayılmasını engelleyerek sayımıkolaylaştırır. 500 g olan bir kutu dehidre besiyeri ile 12,5 ml/petri hesabı ile 1265 petrihazırlanır. Bu besiyeri hakkında daha fazla bilgi için burayı tıklayın. Recommended
Okyanus: Tehlike Analizi Doğruluk Anketi (Okyanus Danışmanlık)