Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models | Protocol (Translated to Turkish)
Biz trombüsler oluşumunu tıkayıcı zaman izlemek için intravital mikroskopi kullanılarak etkin bir şekilde karakterize bir rafine demir klorür (FeCl3) karotis ve mezenterik arter üzerinde indüklenen trombozu modelleri prosedürü yanı sıra damar, rapor.
Arter trombozu (kan pıhtısı) ateroskleroz, diyabet, obezite, kanser ve kronik otoimmün romatolojik bozukluklar gibi kronik inflamasyon ile ilişkili birçok sistemik hastalığın sık görülen bir komplikasyondur. uygunsuz trombosit aktivasyonu, agregasyonu ve sonraki coagulatory mekanizmalarından arteriyel dolaşım kök meydana ve trombüs kalp krizi, felç ve ekstremite kaybına neden oluyor. Damar duvarı damar duvarındaki kan hücreleri, hormonlar ve sitokinler yanı sıra antioksidan proteinlerin ifadesini dolaşan, birden fazla hücre tiplerini içerir ve kayma gerilmesi dahil dışsal faktörlerin çok sayıda etkilenir karmaşık bir sistemdir. In vitro deneyler çoğaltma yapamaz Bu kompleks bir ortam ve bu nedenle, hayvan modelleri kullanarak in vivo çalışmalar, trombotik hastalıklarda yer alan mekanizmaların daha iyi anlaşılması izin vermek için çok önemlidir.
Fareler sim sahip olduğu gösterilmiştirtromboz, ateroskleroz, enflamasyon ve diyabet 1,2 açısından insanlara Ilar mekanizmaları. Ayrıca, transjenik ve knockout farelerde kompleks fizyolojik veya patolojik bir ortamda belirli bir gen ürünlerinin işlevi test etmek için oluşturulabilir. Bu tür çalışmalar, insan patoloji taklit ve yeni yollar ve tedavilerin, keşif ile ilgili önemli mekanistik bilgi vermek yanı sıra tromboz uyuşturucu etkileri karakterize önemli ayrıntıları sağlayabilir.
Patolojik arteriyel trombüs subendotelyal matrise 3,4 katman yaralanma veya disfonksiyon ve kan akışının pozlama endotel nedeniyle oluşur. Çeşitli tromboz modelleri, mekanik yaralanma, photoreactive bileşik Rose Bengal tabanlı oksidatif hasarı ve lazer yaralanması 5 olarak bu endotel hasarına neden geliştirilmiştir. Bu spektrumda, Demir klorür (FeCl3) vasküler yaralanma tromboz yaygın olarak kullanılan modeldir indüklenen. Bu reaktif olduğundadamarların dış alana uygulanabilir trombositleri ve pıhtılaşma kademeli dizisinin parçalarına dolaşımdaki endotel hücre koruma kaybı, vasküler hücreler 6-8 oksidatif hasarı neden olur. FeCl3 modeli basit ve hem antikoagülan ve anti-trombosit ilaçlara duyarlı olduğunu ve fareler, sıçan, kobay ve tavşan 6-15 yılında karotis ve femoral arterler, şahdamarından ve mezenterik ve kremasterik arteriyollerde ve venüllerden üzerinde yapılmıştır.
Bu modelde biri ölçülebilir bir parametre Doppler debimetre ile veya Intravital mikroskopi 6,7,9 doğrudan gözlem altında kan akımının kesilmesi olarak ölçülen damar tıkanıklığı, tamamlamak için yaralanma geçen süredir. 5 ila 30 dakika arasında zaman bir dizi işaret, C57BL6 farelerine 7-10,16 farklı çalışmalarında rapor edildiği FeCl3 konsantrasyonları, anestezi cerrahi teknikler, fare yaş, genomik arka, b, ölçüm yönteminin türleriLood akışı ve diğer çevresel değişkenler, bu modelde anlamlı bir etkiye sahiptir. Bu geniş değişkenlik zor farklı araştırma gruplarından çalışmaları karşılaştırmak ve ince farklılıkların tespiti zor hale getirebilir yapar.
Böyle bir değişkenliğe en aza indirmek ve in vivo model sisteminde bir homojen tekrarlanabilir kurmak için bir vizyon ile, minimal değişiklik 6-10,16-19 ile son derece tekrarlanabilir veri yapar FeCl3 indüklenen karotid arter modeli rafine. Bu yazıda tarif ve becerilerini paylaşmak ve bu model yararlanabilir birkaç temsilci deneysel rapor örnekleri.
Tüm prosedürler ve hayvanların manipülasyonlar Amerika Birleşik Devletleri Halk Sağlığı Servisi İnsani Bakım Politika ve Hayvanların Kullanımı ve Bakımı NIH Kılavuzu ve uygun Cleveland Clinic Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri (IACUC) tarafından onaylanmıştır Laboratuar Hayvanlarının kullanımı.
Etiketleme plateletler için floresan boya
tuzlu su içinde, rodamin 6G çözeltisi, 0.5 mg / ml hazırlamak ve 0.22 um filtre ile çözelti sterilize edin.
% 30 FeCl 3 taze bir stok solüsyonu olun saf su (Susuz, 1.85 M eşittir), ve 0.45 um filtresi ile filtre. 5 ml taze FeCI istenen konsantrasyonda 3 çözeltisi [örneğin,% 2.5 (0.154 M),% 5 (0.308 M), 7.5% (0.463 M),% 10 (0.617 M) ile% 12.5 (0.771 M)] ile hazırlayın su i ile% 30 FeCl3 çözeltisi seyreltilmesina 6 cm doku kültürü çanak ve kapağı tutmak kapattı.
NOT: kültür çanak kullanmak daha kolay gibi 1.5 ml mikrosantrifüj tüp olarak, dar bir kaptan onu almak için daha FeCl3 çözeltisi ile doymuş filtre kağıdı almak için yapar. FeCl3 son derece tehlikelidir ve böyle giyen eldiven vb laboratuvar önlüğü, Kişisel Koruyucu Ekipman olarak önlemler, her zaman alınması gerektiğini söyledi.
1 mm x 2 mm boyutu filtre kağıdı kesin. Aynı çanak FeCl3 çözeltisi içinde kesilmiş filtre kağıdı yeterli parçalarını bekletin.
Papaverin hidroklorür çözeltisi
su içinde, papaverin hidroklorür çözeltisi (25 mg / ml) hazırlayın ve 0.22 um filtre ile çözelti sterilize edin.
, 6-yuvalı doku kültürü plakasında,% 2 agaroz PBS içinde jel veya tuzlu su hazırlama yaklaşık 1 cm kalınlıkta ve Cı~ 3 cm çapında yarım daire için ut.
2. FeCl3 Kaynaklı Karotis Arter Yaralanması Tromboz Modeli
Tromboz Model Cerrahi İşlemleri
12 haftalık C57BL6 fareleri (ya da diğer suşlar olarak gerekli) - 8 kullanın. intraperitonal enjeksiyon yoluyla ketamin (100 mg / kg) / ksilazin (10 mg / kg) karışımı ile fareler anestezi. ayak sıkıştırarak anestezi derinliği onaylayın.
NOT: ketamin / xylazine Bu miktar en az 1 saat boyunca stabil anestezi hayvan ve hiç ağrı (kısma ayak yanıt) tutmak için yeterlidir.
küçük bir hayvan elektrikli kesme makinesi ile boyun ve üst göğüs kürk çıkarın. Depilasyon krem ​​gerekli değildir. anestezi sırasında kurumasını önlemek için gözleri nötr petrol göz merhemi sürün.
15 cm doku kültürü plaka kapağı üzerinde yatar pozisyonda fare sabitleyin. hin sabitlemek için uzun bir bant (~ 10 cm) kullanınD bacaklarda ve alt gövde, ve ön ayakları korumak için küçük bir bant (2 cm x 0,5 cm) iki adettir. , Kesici dişlerin etrafına sarmak için 4-0 sütür kullanın fare boyun düz (Şekil 2) tutmak için kapağa sütür iki ucu bantlayın.
cerrahi ışık kaynağı altında operatöre doğru fare kafası ile plaka koyun.
Alkol ped ile cerrahi siteyi sterilize edin. Cildi tutmak için Mikro-Adson Forseps kullanın ve küçük bir kesi yapmak için bir cerrahi makas kullanın (2-3 mm).
forseps ile kesi cilt tutun ve çene kesi içine kapalı cerrahi makas yerleştirin. deri altı tabakadan cildi serbest makas açın manubrium veya çene doğru subkutan makas itin ve.
Hyoid kemik düzeyinde (Şekil 3A ve 3B) için manubrium bir orta hat kesi yapmak için cerrahi makas ile cilt kesin. Açık açık ince fasya (noktalı çizgi içinde teşrih (Şekil 3B ve 3C arasında Şekil 3B); mavi oklar).
Not: manubrium (Şekil 3C'de siyah ok) ve trakea (Şekil 3C'de T) adımından sonra görülecektir.
Serbest hemostatı çeneleri açın (Şekil 3C sarı noktalı çizgi) 02:00 konumuna doğru fasya altında hemostat eklemek, yumuşak doku ve Graefe forseps ile manubrium sağında görülen cilt tutun çevreleyen dokudan juguler ven.
Sağ juguler ven (Şekil 3B, ok) ortaya çıkarmak için cerrahi makas ile 02:00 pozisyonunda (Şekil 3C) doğru fasya, yumuşak doku ve cildi kesin.
Daha sonra 22 G iğne ve değişim ile 1 ml şırınga kullanarak 300 ul rodamin 6G çözümü - yaklaşık 200 Beraberliko 30 G iğne.
NOT: Bu ince ucu hasardan 30 G iğne korur. Doğrudan ucu zarar vermez 30 G iğne ile rodamin 6G çözüm çizim; Ancak enjeksiyon zor hale getirebilir hasara neden olur yanlışlıkla konteyner duvar dokunmadan.
yavaş yavaş rodamin 6G çözüm iterek 30 G iğne yıkayın, hiçbir hava kabarcığı şırınga veya iğne kalır emin olun. Enjeksiyon için 100 ul rodamin 6G çözüm tutun.
Bend 2 - şah damarından çok derin iğne takmadan önlemek ve daha kolay (Şekil 3D) kontrollü enjeksiyon yapar olacaktır iğne tutucu ile 90 ° açı, iğne 3 mm uç.
Etiket trombositlerin sağ juguler ven içine rodamin 6G çözüm enjekte. injection.Af sırasında başka bir eliyle Graefe forseps ile tek elle şırınga ve iğneyi tutun, şırınga stabilize ve pozisyonda iğne tutmak içinter enjeksiyonu, kanamayı önlemek için Graefe forseps ile enjeksiyon bölgesini kelepçe.
hemostatı çeneleri açın ve enjeksiyon yerinde damar duvarını kelepçe Graefe forseps altında yerleştirin ve sonra bir 6-0 sütür ile enjeksiyon bölgesini Arter.
Not: Adım 2.1.15 bir alternatif olarak, kanamayı durdurmak 2 dakika boyunca bir parmak ile enjeksiyon yerinde basınç uygulamak; Bununla birlikte, bu yöntem, bundan başka neden enjeksiyon yerinde pıhtı kaza kaldırılırsa, kanama riskine sahiptir.
Açıkça hemostat ve Graefe forseps ile sol alt çene bezi etrafındaki yumuşak doku ve fasya teşrih ve sol sternokleidomastoid kası (Şekil 3E mavi ok) açığa çıkarmak için 07:00 pozisyonuna (Şekil 3E) doğru bezi çekin.
Açık açık bıraktı sternokleidomastoid kas ve omohyoid kas veya sternohy arasındaki fasya (Şekil 3E, noktalı çizgi) teşrihhemostatla trakea sol sitesine bulunan oid kas (Şekil 3E, yeşil ok).
Sternokleidomastoid kasının (Şekil 3E mavi ok) orta altında 6-0 ipek sütür (yaklaşık 15 cm uzunluğunda) ile bir iğne geçirin birlikte sütür iki ucu koymak ve 10:00 pozisyonunda doğru yanal sütür çekin .
Not: Bu yordam sternokleidomastoid kasının dışında bulunan, sol juguler ven, bir zarar gelmemesi için dikkatle yapılmalıdır.
Açık açık ince sternohyoid kas ve / veya sternokleidomastoid kas çekerek sonra karotid arter (CA) (Şekil 3F ok) açığa omohyoid kas ayırın. gerektiğinde sternohyoid kas ve / veya omohyoid kas kesin. CA'yı dokunmadan CA yumuşak dokuyu ayırmak için hemostat kullanın
NOT: CA vagus siniri eşlik ediyor, beyaz yapı görülen (Şekil 3F sarı noktalı çizgiler arasında) omohyoid kasın altında çoğu durumda.
vagus siniri ve CA'yı kaçınarak CA etrafında yanal fasya almak için bir ince uçlu forseps kullanın CA ve vagus siniri arasındaki fasya bir delik yumruk başka ince uçlu forseps kullanın.
delikten kanca geçirin ve hafifçe CA kaldırın ve ardından CA altında ince uçlu forseps yerleştirin adventisyal yumuşak doku şerit CA boyunca zıt yönlerde kanca ve forseps taşıyın. Çevreleyen dokudan CA (Şekil 3H, mavi ok) Serbest en azından ~ 5 mm uzunluğunda.
Düz bir siyah plastik kahve karıştırıcı sonuna basın, arka plan floresan engellemek için, 3 mm parçası haline kahve karıştırıcı kesen ve ardından "U" şeklinde plastik (Şekil 3H, yeşil iki parça almak için kat kenarları boyunca uzunlamasına kesilmiş ) ok.
(Şekil 3H, yeşil ok) ile CA kaldırırken CA altına yerleştirin. Hemen CA'yı kurumasını önlemek için tuzlu su 2-3 damla uygulamak
Gerçek zamanlı Kaydı Video
10X su mercek altında uygun bir konumda mikroskop sahne ve yere birlikte fare ve plaka kapağı aktarın. 10X objektif ve tuzlu su ile CA arasındaki boşluğu doldurmak.
Dijital video kayıt yazılımı uygulamasını başlatın ve yeni bir dosya başlatmak ve buna göre adlandırın. Normal damar görüntüleri kaydetmek ve video kayıt durduğunda kare numarasını yazınız.
NOT: Kayıt için bilgisayarda bir video kayıt yazılımı Referans. Biz dijital video kayıt yazılımı kullanmak ve aşağıdaki açıklamaları bu uygulama dayanmaktadır.
NOT: Mekanik tra yanauma endotel zarar ve trombüs oluşumu 20 yol açabilir, FeCl3 yaralanma öncesi damar duvarına cerrahi yaralanma olduğunu doğrulamak için gereklidir. FeCl3 indüklenen yaralanma etkisini bir bariyer oluşturur ve zayıflatmak olabilir CA etrafında kalan doku, olduğunu doğrulamak için de gereklidir. kolay, daha sonra geçen süreleri göre videoları analiz yapacak kayıtların kare sayısını yazın.
10X objektif dışarı plaka kapağı fareyi hareket ettirin. ince ve ince ucu yapmak ve dikkatle CA etrafında tuzlu leke kullanmak için bir kağıt havlu bir köşesini katlayın cerrahi alanındaki diğer yerlerde yanı sıra (CA dokunmaktan kaçının). Bu, kullanılan FeCl3 çözeltisinin seyreltilmesinden kaçınmak önemlidir.
Ince bir uç forseps kullanın ve FeCl3 çözeltisi ile doymuş filtre kağıdı bir parça alıp CA doğrudan yerleştirin ve 1 dakika boyunca sahada tutmak.
NOT: To kan ve hasat doğru veri yardım görselleştirme, yakın maruz CA (Şekil 3I) distal ucuna filtre kağıdı yerleştirin ve geç kan akışını gözlemlemek için (Şekil 3I yeşil ok) proksimal yerinde kısa bir segmenti bırakın faz (aşağıya bakınız).
Filtre kağıdı çıkarın (bu zaman noktası başlangıcı olarak tanımlanan "yaralanma sonrası") ve tuzlu su (en az 2 mi) ile CA yıkayın.
geri 10X objektif plaka kapak ile fare koymak; gemi gözlemlemek ve video görüntüleri başlar. Kaydın ilk dakika sonunda video çerçeve numarasını yazın.
Not: Trombüs formasyonu bilgisayar ekranında ya da mikroskop altında gerçek zamanlı video görüntüleri görülmektedir flüoresan trombositler birikimi ile tanımlanır. Tutanak video görüntüleri hemen mikroskop altında geri fare koyarak sonra. f çıkardıktan sonra ilk dakika sonuna kadar kayıt tutmakilter kağıdı. Yaralanma hakkında bilgi edinmek için proksimal sitelerine uzak gelen tüm gemi gözlemlemek ve sonra ilgi alanı odaklanmak daha görüntüleme için (genellikle yaralı bölgenin merkezidir).
10 saniye ilk 10 dakika deneyin sonuna kadar (örneğin, 3:05 ile 02:55) ve daha sonra 10 sn her dakika için her dakika için rekor video görüntüleri. Her bir kayıt durduğunda çerçeve numaralarını yazın.
NOT: Modelin bitiş noktaları şunlardır: 1) kan akımı> 30 sn sona erdiğinde; veya 2) tıkanıklığı yaralanma sonrası 30 dakika içinde görülen değilse. Bu durumda, istatistiksel analiz için 30 dakika kullanımı. başında 10 msn gibi video kaydının Pozlama Saati ayarlayın, böylece trombüs üzerinde kan akışını gözlemlemek kolay olacaktır. trombüs büyük olur ve floresan kameranın sensörü doyurur, bu trombüs üzerinde kan akışını tespit etmek zorlaşır. Bu sorunu çözmek için, görüntüleme ce hareketkan akımı hala net bir şekilde görülebilir proksimal yaralanmamış sitesinden (Şekil 3I, yeşil ok) nter. Proksimal un yaralı sitede odaklanarak zaman kan akımı daha net görülebilir, böylece biz de, 15 veya 20 msn Açığa Zaman artırmak. kan akışı duracak zaman, çok sayıda büyük hücreler (lökositler) trombüsün proksimal yerinde damar duvarında rulo başlar. Büyük hücrelerin görünümü sonra 3 dakika - Akış genellikle 2 içinde durur. değişti ise kayıt kağıda Zaman Açığa yazın. normal doğal suş C57BL6 fare kullanılması durumunda, genellikle, deneyin sonuna kadar anestezi yaklaşık 30 dakika sürer.
DİKKAT NOT: doğru veri vermeyecektir kan akımı kesilmesi, işareti olarak beyaz toplanan trombosit pıhtı kullanmayın ve maruz kalma süresi etkilenir. beyaz pıhtı (bkz temsili video 1) durdurdu kan akışını anlamına gelmez damar lümeni kaplı.
3. FeCl3 Kaynaklı Mezenterik Arter / Ven Trombozu Modeli
Bölüm 2.1.1 belirtildiği gibi 12 haftalık C57BL6 fareler - 8 uyutmak. anestezi sırasında kurumasını önlemek için gözleri veteriner merhem sürün.
intraperitoneal bağırsak peristalsis inhibe Papaverin çözeltisi (toplam 0.4 mg / fare) enjekte edilir.
Bir hayvan elektrikli kesme makinesi ile boyun ve karın kürk çıkarın. Depilasyon krem ​​gerekli değildir.
15 cm doku kültürü plaka kapağı üzerinde yatar pozisyonda fare sabitleyin. Tüm bacakları sabitlemek için küçük bir bant (2 cm x 0,5 cm) dört adet kullanın. Kesici etrafında sarmak için 4 -0 sütür kullanın, boyun düz (Şekil 2) tutmak için kapağa sütür iki ucu bantlayın.
prosedürleri 2.1.4 izleyin -2.1.15 etiket trombositlerin için rodamin 6G enjeksiyonu için juguler ven ortaya çıkarmak.
Cerrahi makas (Şekil 4A) kullanarak karın daha düşük kılıç şeklinde deri yoluyla orta hat kesi gerçekleştirin. (Olarak da adlandırılır linea alba, Şekil 4A, ok) açıktır ve herhangi bir kan damarları vardır Graefe forseps ile, yaklaşık 2 asansör orta periton Pick up - kesme sınırının altında hiçbir bağırsak onaylamak, 3 mm yüksekliğinde ve açık periton kesip uzunlamasına ince makas (Şekil 4B) ile.
Sağ lateral pozisyonda fareler yeniden sabitleyin. Karın yakın yarım daire agaroz jel yerleştirin ve yavaşça bağırsak exteriorize ve Graefe forseps (Şekil 4C) ile jel üstünde yayıldı. Tromboz deney (Şekil 4C, ok) için ikinci şubesi kullanın.
NOT: bağırsakları exteriorize yardımcı hemostat veya Micro-Adson forseps kullanın. zarar kaçınınbağırsak ve damar.
bağırsak ve geminin nem tutmak için 6 damla serum fizyolojik - 5 yerleştirin. Mikroskop sahneye birlikte plaka kapaklı fare aktarın ve 10X kuru mercek altında uygun konuma yerleştirin.
NOT: jejunoileal membran tuzlu su çözeltisi tutamayacak, çünkü kuru bir lensi kullanın. nemli tutmak maruz kalan dokularda tuzlu su çözeltisi damla emin olun.
tedaviden önce mezenterik arter ve ven çevresinde tuzlu kurulayın.
% 12.5 FeCl3 çözeltisi ile doymuş filtre kağıdı bir parça alıp 1 dakika (Şekil 4D) için mezenterik arter ve ven doğrudan yerleştirmek için ince uçlu forseps kullanın. Filtre kağıdı çıkarın ve tuzlu su ile yaralanan mezenterik arter ve ven durulayın (en az 2 ml) (bu zaman noktası "yaralanma sonrası" başlangıcı olarak tanımlanır).
geri 10X kuru mercek altında plaka kapak ile fare koymak; gemileri gözlemlemek ve rec başlar2.2'de belirtildiği gibi Ord video görüntüleri).
NOT: Bu deneyin bitiş noktaları şunlardır: 1) kan akımı> 30 sn sona erdiğinde; ya da 2) tıkanması yaralanma sonrası 30 dakika içinde görülür değilse, ve bu durumda, istatistiksel analiz için 30 dakika kullanın.
Deney sonunda, hiçbir nefes ve kalp atışı teyit sonra servikal dislokasyon tarafından takip aşırı doz ketamin / ksilazin (200/20 mg / Kg) kullanarak fareler euthanize.
Karotis Arter Trombozu Modeli
C57BL6 kökenli farelerde, biz bir başlangıç ​​noktası olarak 1 dakika boyunca gemi tedavisi için% 7.5 FeCl 3 kullanmanızı öneririz. % 7.5 tedavisi FeCl3 altında, yaralı alanı ve normal damar duvarında sınırları kolayca (Bkz online video 1) mikroskop altında tespit edilir, endotel tabakası önemli ölçüde hasar gördü düşündürmektedir. Trombüs FeCl3 tedavi üzerine hemen oluşmuş ve yaralanma sonrası tüm WT C57BL6 fareler 1 dakika görülmektedir. başlangıçta oluşan trombüs kararsız ve bunların parçaları genellikle uzak kan akışı ile yıkanır, bu yüzden oluşan trombüs 2 daha küçük hale - yaralanmadan sonra 3 dakika. Filtre kağıdı çıkardıktan sonra 4 dakika ve bunlar daha sonra oluşan trombüs kararlı ve genellikle yıkanarak değil - trombüs 3'ten büyütmek için başlar. Ortalama tıkayıcı zaman (n = 14), C57BL6 farelerde 11.3 ± 3.16 dakika olduğu zaman% 7.5 FeCl 3 6,7,19 (Şekil 5A ve online video 1) kullanılır. Daha önceki çalışmalarda bir azalma ve FeCl3 konsantrasyonlarının artması, hem bir anti-trombotik fare türüne ve WT farelerinde 6 arasındaki fark azalır olduğunu göstermiştir; Deneyimlerimize göre, 1 dakika boyunca% 7.5 FeCl3 ile karotid arter tedavisi amaçlarımız tüm karşılamak için yeterlidir. Buna ek olarak, bu model kullanılarak dört Örnek deneyler, aşağıdaki nakavt fareleri 7,8,16,19,21 kullanarak belirli genlerin fonksiyonunu test etmek:
Doku tipi plazminojen aktivatörü aracılığı ile trombolitik intravenöz perfüzyon
Doku tipi plasminojen etkinleştiricisi (tPA), Amerika Birleşik Devletleri 22 tromboliz tedavisi için FDA onaylı ilaçlar biridir. Böylece karotid arter trombozu modelinde, tPA-aracılı tromboliz görülmektedir. tromboz olduFeCl3% 7.5 ile başlatılmış ve tPA önce 5 dakika için oluşturmasına izin verilir (1 mg / kg vücut ağırlığı) bir boyun damarı kateterinin (22GA) ile perfüze edildi. Şekil 5B ve online video 2'de gösterildiği gibi, trombus sürekli büyütülmüş ve yaralanma sonrası lümeni 5 dakika yaklaşık% 50 işgal. trombüs tPA perfüzyon tPA trombosit aktivasyonu ve agregasyonunu etkilemez düşündüren sonra büyütmek için devam etti. Tromboliz tPA enjeksiyonundan sonra yaklaşık 4 dakika başladı. oluşan trombüs 30 dakika gözlem dönemi ve bu durumda olanlar hiçbir damar tıkanıklığı sırasında defalarca boyut varyasyonlarını geçmesi bulundu. Bu veriler açık bir şekilde tPA tamamen bu trombolitik neden olsa bile, platelet dolayımlı trombus oluşumunu inhibe olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, FeCl3 indüklenen arteryel tromboz modeli kullanılarak gelecekteki deneyler önemli bir önceki olabilir trombolitik ve diğer yardımcı tedaviler değerlendirmek için kullanılabileceği tasavvurTrombus oluşumunun ilgili entative etkisi.
Fare ile PAR4 Antikor perfüzyon trombozu önlediğini
Proteaz aktive edilmiş reseptör 4 (PAR4) N-terminal exodomain 23 proteolitik bölünme ile aktive edilir ve daha sonra trombosit aktivasyonu adımları yol açtığı trombosit bir G protein bağlı reseptör (GPCR) 'dir. Nieman laboratuvar bir keçi poliklonal PAR4 antikor PAR4 anyonik küme hedef ve böylece PAR4 aracılı trombosit aktivasyonu 24 için kritik bir adım etkileyen, PAR4 bölünme geciktirir (CAN12) üretti. 1 mg perfüzyon / C57BL6 farelerine, bu antikorun kg biz PAR4 parçalanmasının inhibisyonu anlamlı şekilde uzun zaman% 7.5 FeCl3 kaynaklı karotid arter trombozu modelinde, trombus oluşumunu tıkayıcı olduğu bulunmuştur (Şekil 5C ve online video 3). Bu FeCl3 tromboz modeli c indüklenen gösterirBir anti-trombosit maddeler etkilerini değerlendirir ve potansiyel terapötik stratejiler karakterize etmek için kullanılabilir.
Nanoparçacık aracılı Trombusların özgü Hedefleme
kan akışını yeniden sağlamak için hızlı pıhtı kaldırma iskemik inme ve miyokard enfarktüsü dahil tıkayıcı damar hastalıklarının tedavisinde çok önemlidir. Böyle tPA gibi trombolitik ilaçlar, sistemik teslim oluşan trombüs lize olabilir, yukarıda gösterdi, ama tamamen trombosit aktivasyonu ve yeniden toplama / oklüzyon engel olamaz. Ek olarak, serin proteaz ajanların sistemik doğrudan dağıtım kanama dahil olmak üzere, önemli yan etkilere yol açan, gelişigüzel hedef dışı harekete yol açar. Sen Gupta laboratuvar hemodinamik kesme akımı 25-27 altında pıhtı ile ilişkili aktive trombositler ve proteinlere bağlanabilen trombosit ilham nanoparçacık tabanlı sentetik teslim araçları mühendisliği var. Böylece incelenen bu nanopartiküller can olsunbir arter aktif şekillendirme trombüslerinin bağlanırlar.
tPA perfüzyon için deneyde belirtildiği gibi, kateter boyun damarına yerleştirilir ve düzgün bir akış oranında, nano enjeksiyonu için bir enjeksiyon pompası bağlanmıştır. Bu deney içinde, hiç flöresan boyası trombositleri etiket fareye enjekte edildi. Bunun yerine, nanopartiküller Rohdamine B ile etiketlenmiş; bu nedenle Intravital mikroskop altında görülebilir başardık. Daha önce belirtildiği gibi, tromboz, 1 dakika boyunca% 7.5 FeCl3 tedavi başlatıldı. WT farelerinde, trombus önemli miktarda yaralanma sonrası 5 dakika oluşturmak için bulunan bu yana, nanopartiküller aktif oluşturucu trombüs verimli bağlanan algılamak için nanopartiküllerin enjekte bu zaman noktası seçilir. Şekil 5D ve online video 4'te gösterildiği gibi, floresan nanopartiküllerin enjekte edilmesinden sonra, bir dağ şeklinde tespit etmişlerdirgiderek floresan parçacıklar tarafından koruyorum trombüs. Bu çalışmalar, pıhtılaşma hedefli partıküler İlaç Taşıma Sistemlerinin hedefleme kabiliyeti (ve daha sonraki tedavi etkinliğini) değerlendirmek için FeCl3 indüklenen trombozu modelinde yararını göstermektedir.
Trombüsü Formasyonu'nda Trombositler dışındaki Kırmızı kan hücrelerinin rolü.
Son çalışmalar kırmızı kan hücreleri (eritrositler) FeCl3 trombozu modelinde 28 önemli rol oynadığını ileri sürmüşlerdir ve yaralı damar duvarının 29,30 ilk yapışık kan bileşenidir. Bu fenomen keşfetmek için, 1,1-dioktadesil-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyanine perklorat (Dil, 10 uM nihai konsantrasyon) ile eritrositlerde etiketli. Dil-etiketli eritrositler PBS ile iki kez yıkandı ve% 35 hematokrit tuzlu su içinde yeniden süspansiyona alınmıştır. Dil etiketli RBC süspansiyonu (fare başına 100 ul) enjekte oldulethally 5 gün deney 19 önce ışınlanmış olan trombositopenik farelere ed. Bu trombositopenik fareler önemli eğer onlar yapmak, damar duvarına biding RBC şansını artıracaktır trombosit, azalmıştır. Floresan etiketli trombositleri (Şekil 5) kullanılarak yapılan deneyler aksine, floresan hücre belirgin bir birikiminin damarı çeperi üzerinde bulunmuştur damar hasarı (Şekil 6A ve online V ideo 5) sonra. Bununla birlikte, trombosit açısından zengin trombus oluşumu ile birlikte, eritrosit pıhtı (Şekil 6A) şeklini görüntülemektedir trombüs birikmesine başlamıştır. Yaralı karotis İmmünfloresan boyama Dil-etiketli eritrositler özellikle trombüs (Şekil 6B & C) içinde sıkışıp kalırlar ise damar duvarına yapışık büyük hücreler, (CD41 pozitif, yeşil) trombositler olduğunu göstermiştir. Bu çalışmalar göstermektedirFeCl3 indüklenen tromboz modeli trombus oluşumunda hücresel ve moleküler bileşenleri ve uzay-zamansal olaylar mekanik anlamada kullanılabilir.
Mezenterik Tromboz Modeli
Mezenterik trombozu modelinde, FeCl3 yüksek bir konsantrasyon - gemiler genellikle yağ dokusu ile çevrili olarak (10% 12.5) tavsiye edilir, damar duvarına doğru FeCl3 dağılmasını engellemek ve hangi nedenle FeCl3 indüklediği gelen gemi önler yaralanma 7. Bu model, venöz tromboz çalışma için uygundur. Online video 6'da gösterildiği gibi, trombüs yaklaşık görülmüştür ~ mezenterik ven 15 sn topikal% 12.5 FeCl3 çözeltisi ama trombus oluşumu ile doymuş filtre kağıdı uygulandıktan sonra önemli ölçüde mezenterik arter geciktirilir. trombüs oluşumunu tıkayıcı ortalama zaman ~ 17 ± 7.2 dakika (n = 11) m esenteric damar ve mezenterik arter, yaklaşık 23 ± 9.9 dakika (n = 10) 12.5% ​​FeCl3 7 kullanılır.
Şekil 1. Cerrahi Aletler. Fare cerrahi için asgari gerekli araçları gösterilir. Daha detaylı bilgi için malzemeler listesine bakın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Cerrahi Şekil 2. Fare Fiksasyon. Karotid arter trombozu modelinde veya mezenterik tromboz modeli için rodamin 6G boya enjeksiyonu için 15 cm kültür çanak kapağı üzerinde fare sabitleyin.= "_ Blank" olsun> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Karotis Arter Trombozu Modeli. Prosedürler Rodamin 6G enjeksiyonu gösterilmiştir kan sistemi ve sol karotis maruz içine boya floresan, juguler ven ortaya çıkarmak. (A) 'da, hattı dil kemiği seviyesine manubrium kesi belirtir; (B), mavi oklar submaksiller bezleri gösterir ve sarı noktalı çizgiler alt çene bezlerinden arasındaki fasya temsil eder; (C), mavi oklar submaksiller bezleri gösterir, siyah ok manubrium gösterir ve noktalı sarı çizgi juguler ven maruz kesmek için konumu belirtir; (D), mavi ok juguler ven belirtir; (E), sarı ok sol alt çene bezi, mavi ok Indicat gösterires sternokleidomastoid kas sol noktalı sarı çizgi fasya gösterir ve yeşil ok omohyoid kas veya kas sternohyoid belirtir; (F) 'de, mavi ok sarı noktalı çizgiler ince sternohyoid kas ve / veya omohyoid kas göstermek, karotid arter belirtir; (G), mavi ok karotis arter gösterir ve yeşil ok vagus siniri gösterir; (H), mavi ok karotis arter gösterir ve yeşil ok plastik "U-şeklinde" kahve karıştırıcı belirtir; ve (I), mavi ok FeCl3 çözeltisi ile yer filtre kağıdı gösterir ve yeşil ok karotis arter gösterir. T trakea gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. mezenterik arter ve mezenterik damarların Ven Trombozu Modeli. Pozlama yanı sıra FeCl3 tedavi gösterilmiştir. (A), mavi ok linea alba, geminin olmadan beyaz lifli doku gösterir; (B), bir kesi yalnız kesilmiş olarak linea alba gösterilmiştir; (C), mavi oklar mezenterik arterler ve venler ikinci kemer gösterir; (D), mavi ok FeCl3 çözeltisi ile yer filtre kağıdının gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Karotis Arter Trombozu Modeli kullanılarak Şekil 5. Temsilcisi deneyler. (A). TheC57Bl / 6 farede trombüs oluşumu 7 ile tedavi0,5% FeCl3. (B). TPA trombolitik etkisi aracılı. (C). Tromboz gösterilmiştir fare trombin reseptör PAR4 hedefleyen antikor enjeksiyonu. (D). Trombüs-site hedefli nanovehicles özellikle aktif şekillendirme trombüs gösterildi bağlamak . Enj. P parçacığın enjeksiyon gösterir; ve zirve B trombus partiküllerin pik şerit gösterir. Tüm görüntüler de aynı büyütme altına alındı. Ölçek çubuğu = 300 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Trombüsü Oluşumu Üzerine RBC Şekil 6. Rolü. (A)% 7.5 FeCl sonra karotid arter trombozu modelinde ve görüntülere maruz bırakıldı Dil-etiketli eritrosit perfüzyon aldı Trombositopenik fareler (B & C) yaralandı karotis arterler toplandı ve frozen hazırlanmıştır. Trombositler CD41 (Yeşil) ve eritrosit ile boyandı kırmızı (DIL) olarak gösterilmiştir. Çekirdekler DAPI ile boyanmıştır. (B ve C) 'de gösterilen kaplar, iki farklı farelerden edildi. Ölçek çubukları 50 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Video 1: vahşi tip (WT), farelerde karotid arter trombozu modeli Örnek bir video. (Indirmek için sağ tıklatın.) Bu video yer topikal uygulayarak filtre kağıdı ile uyarılan WT farelerin karotis arter temsili trombüs oluşumunu gösterirFeCl3 çözüm% 7.5 ile. Trombositler Rodamin 6G intravenöz enjeksiyon ile etiketlendi ve video tek renkli modunda alınmıştır. beyaz kütle pıhtılaşmış trombositler olduğunu.
Video 2: karotid arter trombozu modelinde saptanan doku plazminojen aktivatörü (tPA) aracılı trombolitik etki. (Indirmek için sağ tıklatın.) Videoda 1'de belirtildiği gibi Trombosit etiketleme ve trombüs oluşumu başlandı ve tPA damardan 5 dk% 7.5 sonra FeCl3 yaralanma enjekte edildi.
Video 3: Antitrombositik ilaç, na karotid arter trombozu modelinde saptanan antitrombotik etkisi aracılı markalama anti-proteaz aktive edilen reseptör 4 (PAR4) antikor. Trombüs oluşumu topikal% 7.5 FeCl3 ile yer filtre kağıdının uygulanarak başlatılmıştır önce (indirmek için sağ tıklatın.) Bu deneyde, farelerin PAR4 antikor ve rodamin 6G enjeksiyonu 10 dk aldı.
Video 4: Nanopartikül aracılı trombüs-özel hedefleme. (Indirmek için sağ tıklatın.) Bu deneyde, karotid arter trombüs oluşumu etiketleme trombosit olmadan FeCl3% 7.5 ile başlatılmıştır. Nanopartikül Rodamin B ile etiketlenmiş ve damar hasarı sonrası Fare 5 dakika enjekte edilmiştir.
Video 5: karotid arter trombozu modelinde saptanan kırmızı kan hücrelerinin bağları. (Indirmek için sağ tıklatın.) Kırmızı kan hücreleri (eritrositler) 1,1-dioktadesil-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindocarbocyanine perklorat (Dil, 10 uM son konsantrasyon) ve 100 ul ile etiketlendi Dil-etiketli eritrositler (% 35 hematokrit) trombositopenik farelere enjekte edildi. Resim trombosit markalama bu deneyde yapılmıştır. With7.5% FeCl3 yukarıda da belirtildiği gibi trombüs başlatılmıştır.
Video 6: WT fareler üzerinde mezenterik arter ve ven trombozu modelinde Temsilcisi videosu. (Sağ-click indirmek için). Plateletler rodamin 6G intravenöz enjeksiyon ile etiketlendi ve trombüs 1 dakika için% 12.5 FeCl3 çözeltisi ile filtre kağıdı bir parça uygulandıktan sonra lokal olarak başlatıldı. gemi 10X kuru mercek altına gözlendi.
FeCl3 indüklediği modeli trombosit fonksiyonu ve tromboz 7,8,16,19,31-33 genetik değişiklikler hakkında değerli bilgiler sağlayabilir sadece en yaygın olarak kullanılan tromboz modellerinde biridir, ama aynı zamanda değerli bir araç olabilir aterotrombotik hastalıkların 11,17,34-37 tedavisi ve önlenmesi için terapötik bileşikler ve stratejiler değerlendirilmesi için. Burada biz modifikasyonları ve bu modelin iyileştirmeler gösterildiği antikoagülan (tPA), anti-trombosit ilaçlar (PAR4 antikoru) etkisini belirlemek için yeterince duyarlı olan, bu teknik, bir yardımcı ek kanıt göstermiştir. tromboz mekanik çalışma ek olarak, model, aynı zamanda nanoteknolojiler bazlı, trombüs hedefli ilaç dağıtım çalışma için kullanılabilir. Ayrıca, flüoresan ROS göstergesi 21 enjeksiyonu ile damar duvarı reaktif oksijen türleri (ROS) oluşumunun saptanması için de kullanılabilir.
Titizteknikler bu modeller gerçekleştirmek için gereklidir. Operatör yeterli cerrahi beceri yanı sıra damar ve kan hücre biyolojisi derin bir anlayışa sahip olmalıdır. FeCl3 kaynaklı karotid arter trombozu modelinde birçok kilit noktalarıdır 6: (1) filtre kağıdı uygulanmasına izin ve geç aşamada intravital mikroskobu altında kan akışını gözlemlemek için bir boşluk bırakmak için karotis arter (~ 5 mm) yeterli uzunluğa maruz ; (2) açıkça filtre kağıdı doğrudan damar duvara temas ve hatta yaralanma üretmek için izin karotis arter çevresinde adventisyal yumuşak doku şerit; (3) damar duvarında ve FeCl3 -saturated filtre kağıdı uygulamadan önce hiçbir trombüs oluşumuna hiçbir mekanik yaralanma onaylamak; (4) arka plan floresan engellemek için, ve FeCl3 yayılmasını önlemek için, çevre dokularda arter ayırmak için siyah plastik şeklinde "U" bir parça ile karotis arter altında yatan. Bu stratejilerle, biz son derece yarattıVahşi tip C57BL / 6 fareleri, bu fare türünde% 7.5 FeCl3 trombozu süresi 11.3 ± 3.16 min (n = 14) 6,7,19 olan tekrarlanabilir verileri. Rodamin 6G boyun toplardamarı enjeksiyonu zor olabilir hücreleri dolaşımdaki etiketlemek için. Bir alternatif olarak, bir kuyruk damarı enjeksiyonu 15 cm plaka kapağı fare sabitlemeden önce gerçekleştirilebilir. Karotis arter modele karşılaştırılmasında, mezenterik arter ve ven modeli daha kolay ve daha az cerrahi yoğun. nedeniyle yağ dokusu tarafından gemilerin kapsama, Sonuç bölümdeki Ancak, mezenterik tromboz modeli ven trombozu eğitim için iyidir ama farklı fareler arasında hatayı en aza indirmek için daha büyük bir örneklem büyüklüğü gerektirir.
Bu modelin sınırlama mekanizması açık değildir ve hala tartışmalıdır olmasıdır. Başlangıçta, bu modelin mekanizması FeCl3 endotel hücreleri oluşturulan ROS kaynaklı denüdasyon ve su bu olduğuna inanılıyordubsequently trombosit yapışması, agregasyonu ve trombüs oluşumunu 6,11 işlemek için, protrombotik subendotelyuma kan bileşenlerinin maruz yol açtı. Trombositopenik farelere GPVI antikor ile önceden muamele edilmiş trombosit yeniden oluşturulması, biz FeCl3 modeli trombosit GPVI bağlı olduğunu göstermiştir, ve engelleme trombosit GPVI önemli ölçüde FeCl3 neden trombüs oluşumu 19 inhibe etmiştir. Bu bulgu daha önceki raporlarda 38 ile uyumludur ve FeCl3 modeli tromboz 6 aracılı insan aterosklerotik plak yırtılması patofizyolojisini taklit etmek daha muhtemel olabileceğini düşündürmektedir. Bununla birlikte, bazı son çalışmalar, damar duvarına kırmızı kan hücrelerinin yapışması ve plazma proteinleri ve kan hücrelerinin 29,30 arasında FeCl3 indüklenen agregasyon fizikokimyasal etkisi de dahil olmak üzere yeni mekanizmalar önermiştir. Bu yeni anlayışlar bu modelin potansiyel mekanizmalar daha karmaşık olabileceğini düşündürmektedir.
Trombositopenik farelere Dil-etiketli eritrosit perfüzyon ve sonra FeCl3 -triggered yaralanma% 7.5 ile karotis arter FeCl3 uyararak, biz yaralı damar duvarlarına yapışan önemli hücreleri trombositlerin (Şekil 6 ve online video 5 olduğunu tespit ). Biz açık eritrositler yapışma bulamadık ve trombüs içinde eritrosit birikimi hapsine bir sonucu olması muhtemeldir görünüyordu. Bizim bulgularımız primer ve sekonder hemostaz 39 kavramlarını maç. Daha önceki raporlarda bizim gözlem farkı hipoksi ve taramalı elektron mikroskobu incelemesi için FeCl3 yaralı karotis arterler sol ventrikül önceden olmadan maruz vardı farelerde hazırlanan Barr ve arkadaşları 30, tarafından yapılan çalışmada olduğu gibi hemodinamik değişimden olabilir mekanik ventillation yardımı. Kan oksijen konsantrasyonu ve hemodinamik dramatik hem pulmoner olarak azalacak vegöğüs mekanik ventilasyon olmadan açıldıktan sonra kalp fonksiyonu hemen etkilenecektir. Oksijen yoksunluk uzun RBC yapışma artırabilir da prokoagülan yoluna ve tromboz 40 tetiklenmesi ile ilişkili bulunmuştur. Bir başka yeni bir yayın yaralı kabın 29 lümeninde ~ 50 mM'de FeCl3 bir kararlı hal konsantrasyonunun 5 ya da 10 dakika için potansiyel FeCl3 (% 20), çok yüksek bir konsantrasyon ile karotid arter tedavisinin göstermiştir . Dolayısıyla doğrudan çeşitli kan bileşenleri içine FeCl3 50 mM infüzyon ve trombüs oluşumu 29 FeCl3 eylem için yeni bir, 2-faz mekanizması önermektir onları açtı toplama ex vivo FeCl3 etkisi incelenmiştir. Oldukça ilginç olsa da, bu çalışmada elde edilen sonuçlar yaygın kullanılan FeCl3 modeli temsil etmemektedir olarak dikkatle yorumlanması gerekir. FEC yüksek konsantrasyonda aksineL3 (kağıt belirtildiği gibi% 20, 1 M) ve uzun işleme (5 ya da 10 dakika), daha önceki çalışmalar, ve Barr ve ark. 1 dakika boyunca% 10 FeCl3 tedavisi, 7 dakika 6,30 olan karotid arteri hızlı tıkayıcı trombus oluşumunu teşvik etmek için yeterli olduğunu göstermiştir. Buna ek olarak, FeCl3 modeli, FeCl3 bir başka düşük bir konsantrasyonunu kullanarak deneylerin çoğunda (5-7,5%) kullanılır.
Bu modelin bir diğer kısıtlılığı nedeniyle endotel ciddi oksidatif hasar yanı sıra endotel denüdasyon sonrası FeCl3 tedaviye, bu model endotel inflamasyonla ilişkili tromboz incelemek için uygun bir araç olmayabilir olmasıdır. Ancak, floresan etiketli lökositlerin perfüzyon ile birlikte karotis arter hazırlamak için bu teknikleri kullanarak, biz iltihaplı endotele 41 lökositlerin yapışmasını ve haddeleme test edebilirsiniz.
summ içindeli, biz rafine ve karotid arter üzerinde bir yüksek tekrarlanabilir yaralanma üretmek ve intravital mikroskobu ile doğru kan akımı bırakma zamanı ölçmek için FeCl3 indüklediği vasküler yaralanma modeli standart var. Bu model, antikoagülan ve antitrombotik ilaçlar test etmek için yeterli ve hassastır ve aynı zamanda trombüs hedefli nanotıpta çalışmaları için uygundur. Trombositopenik fareler veya aday ilaçların doğrudan damar içi enjeksiyon, kemik iliği nakli, trombosit infüzyon ile birlikte, bu, in vivo 7-10,16,19,42,43 trombozu incelemek için, basit ve duyarlı bir araç olduğunu göstermiştir .