An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity | Protocol (Translated to Turkish)
Fare kan-Testis bariyeri bütünlük çalışma için In Vivo yöntemi
Sıçan Testislerindeki Sertoli Hücreleri İzolasyon eritübüler Hücreler…
Testis germ hücrelerinin üç boyutlu Kromatinmarlık Koru Hazırlama Yöntemi kaydırın…
Burada, inulin-FITC testis enjekte edilerek kan-testis bariyer bütünlüğünü değerlendirmek için bir protokol mevcut. Bu genetik ve çevresel öğeleri tarafından tehlikeye girebilir kan-testis bariyer bütünlüğünü incelemek için bir verimli vivo içinde yöntemidir.
Sperma testis seminifer tübüllerin içinde olgun sperm hücreleri içine spermatogonia gelişmedir. Bu işlem Sertoli hücre kavşaklar, memeli vücuttaki dar doku engeldir ve iki bölmeleri, bir bazal ve bir adluminal seminifer epitel diğer kan-testis bariyeri (BTB), tarafından desteklenmektedir. BTB germ hücreleri için benzersiz bir microenvironment mayoz oluşturur ı / II ve sperm ile spermiogenesis içine postmeiotic spermatids gelişimi için. Burada, fare testis içinde vivobütünlüğünü BTB izlemek için güvenilir bir tahlil açıklayın. Sağlam bir BTB FITC Birleşik seminifer tübüllerin apikal bölmesinin inulin bazal üzerinden difüzyon engeller. Bu teknik gen adaylar, virüsler veya BTB işlevi veya kolay bir prosedür ve cerrahi becerileri alternatif yöntemlerine göre en az bir şartı ile bütünlüğü etkileyen çevresel toxicants çalışmak için uygundur.
Memeli sperma spermatogonial kendini yenileme ve spermatocytes aracılığıyla hangi dramatik sırasında farklılaşma yolu ile spermiogenesis, mitoz ve mayoz haploit sperm hücreleri içine kapsayan son derece yapılandırılmış bir süreç olarak kabul edilir biyokimyasal ve morfolojik değişiklikler oluşur. Gelişmekte olan germ hücreleri aşamalı olarak lümen doğru Seminifer tübül tabanından taşınmaktadır. Bu işlem germ hücreleri ve Sertoli hücreleri1,2arasında hücre-hücre kişiler tarafından düzenlenmiştir. Bitişik Sertoli hücreleri Seminifer tübül Bankası bulunan BTB oluştururlar. BTB fiziksel olarak bir bazal ve bir adluminal bölme epitel ayırır. VIII - IX epitel döngüsünün aşamaları sırasında bazal bölmeleri gelen preleptotene/leptotene spermatocytes adluminal bölmeleri3girme BTB karşıdan karşıya geçirin. Bu nedenle, BTB fonksiyonu mayoz ve spermiogenesis4,5,6tamamlanması için bir immunoprivileged microenvironment sağlamaktır. Sadece sıkı kavşak (TJs) oluşan diğer kan doku engelleri farklı olarak (Örneğin, kan - beyin bariyerini), BTB tarafından dört farklı kavşak (TJs, ektoplazmik Uzmanlıklar, gap kavşaklar ve ara filaman tabanlı oluşturulur desmosomes)1,7arasında Sertoli hücreleri.
Birçok çalışma mekanizmaları BTB bütünlük7,8,9araştırmak için genetik olarak değiştirilmiş fare, virüs enfeksiyonları ve çevre toxicants kullandık. BTB bozulma Engelli sperma ve subfertility ya da kısırlık neden olmaktadır. BTB oluşumu ve bütünlük kişiler arasında Sertoli hücreleri8etkilenmeye teyit edilmiştir beri izole Sertoli hücre birincil kültür temel bir vitro modeli kullanılan BTB çalışma için. Ancak, bu model doğru BTB dinamiği içinde vivotaklit edemez. Ayrıca, germ hücre Sertoli hücreleri ile eş böyle kültür yok yeteneğine sahip tüm ilgili yapısal ve işlevsel bileşenleri BTB10,11yansıtan olarak kurulmuştur.
Genel olarak, VIVO BTB bütünlük deneyleri genellikle küçük moleküllerin, EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin ve FITC Birleşik inulin (inulin-FITC) dayanır. Normalde, biotin veya inulin-FITC bazal yuvası üzerinden difüzyon BTB yapısı tarafından engellenir. Bu nedenle, biz kontrol grubu ile karşılaştırıldığında BTB hasar ölçüde değerlendirmek için bu yöntemi kullanabilirsiniz. BTB sonunda adluminal bölme göstergeleri olarak girin küçük moleküller için erişilebilir süre BTB uyaranlara, kadmiyum klorür (CdCl2)12, tedaviyle gibi belirli türleri ile tehlikeye girebilir.
Bir erken vivo içinde BTB bütünlük tahlil biotin veya inulin-FITC ameliyat içerir ve invaziv, karmaşık ve zaman alıcı juguler ven enjekte içerir. Ayrıca, muhabir maddeler kan dolaşımı yoluyla tüm vücuda diffüz olarak biotin veya inulin-FITC seminifer tübüllerin içinde yerel konsantrasyonu sınırlıdır. Ayrıca, sistemik pozlama bağışıklık tepkileri neden olabilir. Burada, inulin-FITC küçük bir aliquot bir testis interstitium içine direkt enjeksiyon etkinleştirme basit ve etkili içinde vivo BTB bütünlük tahlil mevcut. İkincil antikorlar gerekli değildir olarak etiketleme yöntemi floresan, boyama işlemi uygun, kullanmaktır. Burada, floresan boya testis girme sürecinin görüntülenir.
Tüm gerçekleştirilen hayvan deneyleri Nanjing Tıp Üniversitesi Komitesi tarafından onaylanmış olması. Erkek C57BL/6 fare kontrollü photoperiod koşullar altında tutuldu ve yiyecek ve su ile temin edildi.
Mikroenjeksiyon kılcal bir dış çap, iç dimeter ve 1.0 mm, 0.8 mm ve 10,0 cm, uzunluğu ile sırasıyla kullanın.
Cam kılcal kapiller çektirme (Şekil 1A) ile çek. Test ve bağlı olarak kullanılıyor kapiller çektirme makine ayarlarını yapın.
Pipet ipuçları 50 µm çapı uç kılcal almak için kullanılacak forseps ile bölünürler.
Not: İpuçları testis nüfuz için çok uzun olabilir.
30 ° açı ipucunda micropipette beveler (Şekil 1 c) kullanarak keskinleştirme.
%1 Fentobarbital sodyum hazırlamak: Fentobarbital sodyum fosfat tamponlu tuz (PBS) (adım 2.3.3) 10 ml 100 mg geçiyoruz.
10 mg/mL inulin-FITC hazırlamak: inulin-FITC PBS (adım 2.1.6) 100 μL 1 mg geçiyoruz.
%4 paraformaldehyde hazır olun: paraformaldehyde (PFA) 4 g PBS (adım 2.3.3) 100 ml geçiyoruz.
% 30 sükroz hazırlamak: PBS (adım 2.3.4) 10 ml 3 g sükroz geçiyoruz.
% 0.1 kadmiyum klorür hazırlamak: kadmiyum klorür PBS (adım 2.1.1) 10 ml 10 mg geçiyoruz.
Anestezi ve hastayabenzer hazırlık
8-hafta-yaşlı C57BL/6 erkek fareler tartmak ve CdCl2gerekli doz hesaplayın. Bir grup farelerin tedavisinde (n = 3) CdCl2 (5 mg/kg c.a., IP) ameliyattan önce 3 d için. Başka bir grup 8 haftalık C57BL/6 erkek farelerin tedavisinde (n = 3) denetimi olarak PBS ile.
Steril enjektör, iğne, makas ve forseps kullanarak aseptik koşullar altında ameliyat.
Anestezi çalışma çözüm taze hazırlayın. Anestezi gerekli doz Fentobarbital sodyum/kg vücut ağırlığı 70 mg dır. Ortalama olarak, 8 hafta-in yaş, Yetişkin bir C57BL/6 fare 175 μL % 1 Fentobarbital sodyum (1,75 mg-fare de) karşılık gelen ~ 25 g ağırlığında.
Not: Fentobarbital sodyum steril fosfat tamponlu tuz çözeltisi içinde (PBS) feshedilmiştir. Çözüm tarafından 0.22 um filtre kullanılan önce filtre ünitesi.
% 75 etanol ile cerrahi alan temiz ve temiz doku havlu ile alanı kapsamaktadır.
Termostatik ısıtıcıyı ve 37 ° c sıcaklık ayarlama
İnulin-FITC çalışma çözüm (10 mg/mL) ameliyat günü hazırlamak.
8-hafta-yaşlı C57BL/6 erkek fareler tartmak ve anestezi gerekli doz hesaplayın.
Mayi iğne Fentobarbital sodyum 1 mL steril Ģırınga kullanarak gerçekleştirin. Fare temiz bir kafeste tutmak.
Göz refleks tepki ve nefes desen tam anestezi altında olduğunu doğrulamak için fare gözlemlemek.
Not: Genellikle, 10-15 dk ihtiyaç vardır fare derinden, ayak çimdik yanıt toplam eksikliği ve bakım yavaş, düzenli nefes alma ile anestezi kadar.
Fare operasyon alanına taşıma ve onun göz çevresi kuruluğu (Şekil 2A) anestezi sırasında önlemek için nemli bir doku kağıt ile kaplayın.
Karın onun saç tıraş makinesi ile tıraş ve cerrahi alan % 75 etanol ile dezenfekte.
Keskin makas ile karın duvarı ortaya çıkarmak için Prepusyal bezleri üzerinde 1 cm cilt kesi yapmak. Karın duvarına küçük forseps ile Asansör ve periton boşluğu (Şekil 2B) ortaya çıkarmak için bir 0,5 cm kesi yapmak.
Forseps testis ve epididim çevresinde yağ yastıkları aramak için kullanın. Dikkatli bir şekilde yağ yastıkları bağlı testis açıkça ortaya çıkarmak için çıkar (Şekil 2C ve 2D). Genellikle, bir testis teker teker çalışır.
Not: Yağ yastıkları ve testis elleriyle dokunmaktan kaçının.
Yağ yastıkları ve testis (Şekil 2C) altında bir kağıdı (9 cm çapında) yerleştirin.
İnulin-FITC mikroenjeksiyon pipet enjekte ve micromanipulator birimi (Şekil 1 d) bağlayın. Yavaşça mikroenjeksiyon pipet tunica albuginea altında Ekle ve inulin-FITC 20 μL toplam (Şekil 2E ve 2F) testis interstitium yükleyin.
Not: Dikkatli hareket önlemek için Mikroenjeksiyon pipet düşürmek.
İnulin-FITC testis (Şekil 2 g) içinde hareketi izlemek.
Hemen testis enjeksiyon tamamlanmasından sonra karın boşluğuna geri koymak.
Kontralateral testis yordamı yineleyin. Bu testis bir denetim olarak PBS 20 μL ile enjekte edilir.
Cerrahi sütür ile cilt kapatın ve termostatik ısıtıcı (Şekil 1B) ısı pad için fareyi hareket ettirin. Subkutan enjeksiyon yoluyla vücut ağırlığının 1 kg başına analjezik (buprenorfin) 1 mg doz yönetmek.
Testisler ve donmuş bölümleri hazırlık hasat
40 dakika sonra enjeksiyon, hayvan bakımı göre servikal çıkığı tarafından alıcı fare ötenazi ve yönergeleri kullanın.
Keskin makas testis toplamak için kullanın. Testis her türlü kan kirlilik buz gibi PBS 1 mL yerleştirin.
4 12-24 h. atma için 4 ° C'de % 4 paraformaldehyde (PFA) testis tamir % PFA ve yıkama doku 3 x 1.5 mL % 1 PBS oda sıcaklığında ile.
% 30 sükroz dokusunda gecede kurutmak. Testis gömme çerçevede koymak ve doku en iyi kesim ısı bileşik (OCT) kapsar. OKT'yi dondurulur sonra tüm sınav-ebilmek var olmak örtülü OCT ile gömme çerçeve OCT ile doldurun.
Bir cryostat-20 ° C'de 5 mikron kalınlığında, dondurulmuş kesitleri testisler, kesilmiş ve onlara mikroskop slaytlar için uygun.
Not: Kuru buz içinde katıştırılmış doku Refreezing kesme için sertlik artabilir.
Slaytları oksijen bir kutuya koyun. Slaytlar, oda sıcaklığında 10 dakika sıcak.
Bölüm 3 yıkama x Tris arabelleğe alınmış serum (TBS) Oda sıcaklığında ile.
Karanlıkta 5 min için kuruması. Herhangi bir kalıntı TBS tozsuz kağıt ile yok etmek.
Kesitleri ile 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kapsar. Ters coverslip mikroskop slayttaki bir yer.
Confocal mikroskop kullanarak görüntüleri elde etmek. Toplam 20 X büyütme parlak floresan sinyali algılamak için genellikle yeterli olur.
BTB bütünlük tahlil gerçekleştirmek için deneysel set-up Şekil 1' de gösterilen. Çekin ve mikroenjeksiyon kılcal bir kılcal çektirmenin ve micropipette beveler, sırasıyla keskinleştirmek (Şekil 1A ve 1 C). Termostatik ısıtıcı ve mikroenjeksiyon donatımı Şekil 1B ve 1 Dgösterilmiştir.
Şekil 2 inulin-FITC enjeksiyon için önemli adımlar bazılarını görüntüler. Makas fare tam anestezi (Şekil 2A ve 2B) uğramıştır sonra küçük bir kesi yapmak için kullanın. Fare testis maruz ve mikroenjeksiyon pipet (Şekil 2C - 2 G) kullanarak floresan boya ile enjekte edilir.
Şekil 3 bir çalışmanın bir vivo içinde tahlil dayalı BTB bütünlüğünü değerlendirmek için tipik görüntüleri görüntüler. CdCl2fareler-tedavi grubunda 3 gün boyunca CdCl2 (5 mg/kg c.a., IP) akut bir doz ile enjekte. İnulin-FITC bazal yuvası üzerinden difüzyon CdCl2 seminifer epitel apikal bölmesinin içine kontrol grubu, BTB inşaat zarar ederken ve inulin (yeşil floresan) pasajlar BTB yapısında tarafından engellendi -tedavi grubunda. Beyaz çizgi parçaları inulin tarafından Bodrum membran (Şekil 3A) yolculuk mesafe gösterir. BTB hasar ölçüde mesafe tarafından belirlenir. Eliptik bir lümen için yarıçapı kısa ortalamasını ve tübül ortasına bazal bölmenin en uzun mesafe var. BTB hasarın indeks olarak böyle bir oranı kullanın:
Burada, DInulin inulin tarafından bazal yuvası mesafe ve DRADIUS aynı Seminifer tübül (Şekil 3B) RADIUS. Sağlam BTB Rictorfl / + fareler engeller inulin difüzyon apikal yuvası girmek için bariyer arasında. Buna ek olarak, Rictorcko fareler inulin difüzyon (Şekil 3 c) erişimine izin verme uzlaşma BTB var.
Şekil 1: fare testis interstisyel mikroenjeksiyon donatımı. (A)çekme cam dikey bir kılcal çektirmenin ile kılcal damarlar. ()B) Bu panel termostatik ısıtıcı gösterir. (C) ipuçları micropipette beveler kullanarak bilenmiş. (D) birimi için Mikroenjeksiyon mikroenjeksiyon pompa ve stereo mikroskop içerir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Bir fare bir vivo içinde testis interstisyel mikroenjeksiyon dava temsilcisi görüntülerini. (A) Bu panel bir tıraş makinesi tarafından karın saç kaldırılması gösterir. (B) Bu panel periton boşluğu ortaya çıkarmak için 0,5 cm karın duvarı kesi gösterir. (C) çekme yağ ekli testis açıkça ortaya çıkarmak için pads. (D) Bu panel testis ve epididim konumunu gösterir. (E) Bu panel mikroenjeksiyon pipet konumunu gösterir. (F) Ekle mikroenjeksiyon pipet testis interstitium içine. (G) Bu panel bir testis testis interstitium içine başarılı bir enjeksiyon ile gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: BTB bütünlüğünü değerlendirmek için bir çalışmaya dayanarak bir vivo içinde işlevsel tahlil. Yetişkin erkek fareler (n = 3 tedavi grubu ve kontrol grubu) CdCl2 ile (5 mg/kg c.a., IP) 3 gündür (tedavi grubunda) tedavi veya PBS ile 3 gündür (kontrol grubu) tedavi. İnulin-FITC CdCl2-tedavi grubunda BTB üzerinden bir geçiş oluşturur iken kontrol grubunda Seminifer tübül Bankası inulin-FITC (yeşil floresan) yakındır. (A)bu panelinde beyaz çizgi parçaları göstermek mesafe inulin-FITC işgal etti. Ölçek barlar 20 mikron vardır. (B) veri BTB bütünlük deneyleri bu histogramda, inulin (DInulin) vs tarafından kat edilen mesafeyi gösterir aynı tübül (DRADIUS) RADIUS gösterilir. Seksen tübüllerin rasgele seçilir. P < 0,001 (öğrenci t-test). (C) BTB bütünlüğü içinde Rictorcko farelerin testis güvenilir değil. Rictorcko fare tübüllerin, inulin tübül lümen ulaşan derin seminifer epitel içinde nüfuz eder. Ölçek Barlar 50 mikron vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Sperma seminifer epitel yer alır ve germ hücreleri ve somatik hücreler tarafından yönetilir son derece düzenli ve dinamik bir süreçtir (Örneğin, Sertoli hücreleri)13. Sertoli hücreleri tarafından oluşturulur, BTB yapısı bir bazal ve apikal bir bölme seminifer epitel ayırır. Segregasyonun ve haploit germ hücre gelişimi bir bağışıklık bariyer14oluşturan apikal kompartımanda oluşur.
BTB işlev tarafından toxicants veya hücre kavşaklar, erkek kısırlığı için önde gelen oluşumu dahil genlerdeki hatalarından kaynaklanan tehlikeye girebilir. BTB bütünlüğünü incelemek için BTB vivo içinde15bir vitro çok dikkatli oluşturan işlevsel epitel yeteneğine sahiptir hücre kültür sistemi kurulmuş olup Sertoli taklit eder. Bu vitro sistem yapısı ve fonksiyonu Sertoli hücre kavşak çalışması için basit bir modeli sağlar. Ancak, testisin Sertoli hücreleri izole ve kültürlü vitro hayvan yaş hücre yoğunluğu15,ve16ile ilgili sınırlı. Buna ek olarak, izlenen Sertoli hücreleri saflığı ve taklit eden BTB özellikleri olması gerekir ultrastructures varlığı17. Daha da önemlisi, BTB yapısı ve bütünlük da germ hücreleri ve çalışmalar germ hücre özel null mutant fare BTB kusurları10,18,19ile belirgin olarak Sertoli hücreleri arasındaki etkileşimler gerektirir. Böylece, BTB tüm önemli vivo içinde fonksiyonu recapitulating amacı zor11,20kalır için ortak bir kültür germ hücrelerinin Sertoli ile oluşturma içinde vitro hücreleri.
Bu iletişim kuralı bir yordam Chen ve ark. tarafından güncellenmiştir inulin-FITC enjekte edilerek BTB bütünlüğü içinde vivo değerlendirme yöntemi açıklar 21. erkek fareler, periton boşluğuna pozlama, testis, testis hasat ve donmuş bölümleri ve görüntüleri edinimi kesme interstitium içine boya mikroenjeksiyon anestezi protokolünü açıklar. Başarılı bir tamamlamak için birkaç adım olması gerekmektedir. İlk olarak, ciddi bir şekilde derin anestezi ölüme neden çünkü anestezi, uygun dozda kullanılması önemlidir. Ayrıca, kapiller iğne ucu uzunluğu çok uzun olmamalıdır; Aksi takdirde, pipet testis aşamıyor.
Burada sunulan yordamı virüsler, kimyasal toxicants veya aday proteinler BTB yönetmelikte yer alan rolü analiz etmek için kullanılabilir. Bu tahlil hassas, güvenilir ve BTB bütünlüğü içinde vivoizlemek için erişilebilir.
Bu eser ayırt edici genç bilim adamları için (BK20150047), Doğa Bilimleri ulusal anahtar R & D Çin programı (2016YFA0500902), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31471228, 31771653), Jiangsu Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir Jiangsu Eyaleti (BK20140897, 14KJA180005) ve Jiangsu Eyaleti K.Z. için yenilikçi ve girişimci Program temeli