İyonların Voltaj-Kapılı İyon Kanallarından Hareketi
· Aksiyon potansiyeli (AP) ile ilgili erken çalışmalar, Cole ve Curtis: AP oluşumu sırasında membranın iyon geçirgenliğinde büyük artış.
Cole ve Curtis tarafından 1938 yılında iyonik akım ve aksiyon potansiyelinin osiloskop kaydının eşzamanlı gösterilmesi.
· Alan Hodgkin ve Bernard Katz:
o Ekstrasellüler Na+ oranı azalırsa AP amplitüdü de azalır ® AP oluşumundan sorumlu iyon Na+
o AP sona ermesi sırasında membranın K+ geçirgenliği artar.
Voltage-Clamp tekniği ile voltaj kapılı kanallardan Na+ ve K+ akımlarının kaydedilmesi
· Alan Hodgkin ve Andrew Huxley;
o Mürekkep balığı dev aksonunda voltage-clamp çalışmaları: Membranın değişik voltajlarda iyonlara karşı geçirgenliğinin ölçülmesi
o Na+ için pozitif geri besleme siklusu:
Voltage-clamp : AP oluşumu sırasında ortaya çıkan iyon hareketlerinin gösterilmesine olanak sağlayan teknik.
1949'da deneysel olarak nöronlarda membran potansiyelini sabitlemek amacıyla geliştirildi. 1950'lerde Alan Hodgkin ve Andrew Huxley bu tekniği kullanarak AP mekanizmasının temelindeki iyonik hareketleri gösterdi.
Sistem temel olarak iki akım elektrodu, bu elektrotlara bağlı bir akım jeneratörü ve bir akım monitöründen oluşur. Akım jeneratörü sayesinde membran belirli bir depolarizasyon seviyesinde getirilebilmektedir.
Voltage-clamp düzeneğinin işlemesi için bu sisteme bir negatif geri besleme mekanizması eklenir. Bu mekanizma içinde iki amplifikatör yer alır.
Amplifikatörlerden biri (membran potansiyeli amplifikatörü) hücre içi ve dışı iki elektrot ile membran potansiyelini ölçer. Diğer amplifikatör (geri besleme amplifikatörü) ise iki girdi alır; bunlardan biri membran potansiyelini ölçen amplifikatörden gelen bilgi, diğeri ise jeneratörün oluşturduğu orijinal voltaj bilgisidir. Geri besleme amplifikatörü, membran potansiyeli ile orijinal voltaj arasındaki farkı kapatacak gerekli akımı oluşturarak membran potansiyelinin daima sabit bir düzeyde tutulmasını sağlar.
· Membran üzerinde oluşturulan bir depolarizasyon, voltaj-kapılı iyon kanalarının açılmasına neden olur. Bu iyonların hareketi, normalde membran üzerinde bir voltaj farkına neden olacaktır. Ancak, voltaj kıskacı (clamp) voltajı belirli seviyede tutmaya devam eder.
· Bu durumda, örneğin açılan bir voltaj-kapılı Na+ kanalından içeri Na+ girişi ile membran içinde pozitif yükler artmaya başladığı anda, geri besleme amplifikatörü zıt bir etkiyle hücre içine negatif akım enjekte eder.
· Böylece, hücre içine giren Na iyonunun membran potansiyeli üzerinde bir değişiklik yapması önlemiş olur.
· Membran potansiyelini orijinal değerine döndürmek için kullanılan negatif akım miktarı, başlangıçtaki depolarizasyonun ne kadar Na+ girişine neden olduğunu gösterir.
Tipik bir voltage-clamp denemesi voltajın istirahat membran potansiyelinde sabitlenmesi ile başlatılır.
10 mV gücünde bir uyarıya yanıt olarak uyarının verildiği ilk anda iyonik olmayan (kapasitif) bir akımdan sonra, uyarı devam ettiği sürece hafif bir dışa akım (outward) görülür.
Uyarı sona erdiğinde yine anlık kapasitif bir içe doğru akımdan sonra iyonik ve kapasitif akımlar sıfırlanır ve membran potansiyeli eski değerine geri döner,
Depolarizasyon süresince devam eden dışa doğru akım, membranın istirahat iyon kanalları tarafından oluşturulur ve 'sızıntı akımı' (leakage current : Ii) olarak adlandırılır. Tipik bir nöronda istirahat membran potansiyelinin oluşumunda K+ kanalları en büyük role sahiptir.
Membran potansiyelini 60 mV arttıracak bir uyarı durumunda hücre içindeki akım değişikliklerinin şekli farklılaşır.
Uyarının verildiği ilk anda görülen bir dışa doğru kapasitif akımdan sonra, önce bir içe doğru iyonik akım, kısa bir süre sonra da çok miktarda dışa doğru iyonik akım gözlenir.
Bu dışa akım bir plato seviyesine ulaşarak, depolarizasyon uyarısının sonlanmasına kadar devam eder.
Bu durum, bu derecede bir uyarı sonucu iki farklı iyon kanalının devreye girmesi sonucu ortaya çıkmıştır. Bu iyonik akımlar Na+ ve K+ için selektif kanal blokerlerinin kullanılması ile birbirinden ayırt edilebilir.
· Tetradotoxin (TTX): Seçici Na+ kanal bloker etkili zehir
(Pasifik okyanusunda yaşayan Puffer balığında bulunur, bu balıktan usulüne uygun olmayan şartlarda hazırlanan sushi tarzı yemekler ile alınan nanomolar konsantrasyonda TTX öldürücüdür)
· Tetraetilamonyum (TEA): Seçici K+ kanal blokeri
60 mV şiddetinde bir uyarıya karşın TTX uygulaması ile görülen K+ akımı (IK) ve TEA uygulaması ile görülen Na+ akımı (INa).
Voltage-clamp ile edilen bilgilerden membran iletkenliklerinin (g) hesaplanması
Farklı iyonlar için membran iletkenliği, voltage-clamp tekniği sırasında elde edilen akımlar ile hesaplanabilir. Bu hesaplama hücrenin bir devre üzerinde ifadesinden yola çıkılarak yapılır.
gNa: Na+ iletkenliği
gK: K+ iletkenliği
gl: Tüm iyonlar için sızma iletkenliği
E: Sızma durumunda iyonlar için güç kaynağı (konsantrasyon gradyanı)
El: Sızma kanallarının güç kaynağı, istirahat membran potansiyeline eşit.
· Ohm yasasına göre: IK = gK(Vm - EK) ve INa = gNa(Vm - ENa)
· Buna göre; gK = IK/(Vm - EK) ve gNa = INa/(Vm - ENa) olacaktır.
· Voltage-clamp ile değişik voltaj düzeylerinde membranın Na+ ve K+ geçirgenliklerinin gösterilmesi, Na+ ve K+ kanallarının iki benzer, iki de farklı özelliğini ortaya çıkarmıştır.
o Benzer özellikler:
§ Her iki kanal da depolarize edici bir uyarıya cevap olarak açılır
§ Depolarize edici uyarının şiddeti arttıkça, kanalın açık kalma aralıkları uzar
o Farklı özellikler:
§ Uzamış depolarizasyon uyaranına karşı iki kanal hem yanıt, hem de açık kalma aralığı açısından farklılık gösterir
Değişik derecelerdeki depolarizasyon uyaranlarına, uzun dönemde Na+ ve K+ iletkenliği yanıtı
Kısa ve uzun süreli depolarizasyon uyaranlarının Na+ ve K+ iletkenliği üzerindeki etkisi
a (kesikli çizgi): Kısa süreli uyarı
b (düz çizgi): Uzun süreli uyarı
Na+ kanallarının bazı özellikleri
· Na+ kanallarına depolarize edici uyarı
· Na+ kanalları, açılıp kapandıktan sonra bir süre refrakter dönemde kalır ve tekrar uyarılamazlar.
· Na+ kanallarının inaktivasyon özelliği sahip olduğu iki tür kapı nedeniyle ortaya çıkar. Kanalın iyon geçişine izin vermesi için bu kapıların ikisi de açık olmalıdır.
Voltaj-kapılı Na+ kanalının kapalı, açık ve inaktif durumları.
· Membranın depolarizasyonu voltaj-kapılı Na+ kanallarının açılmasına neden olur (g Na ­).
· Na+ iyonlarının hücre içine girişi membranın depolarizasyon derecesini arttırır, bu da daha fazla Na+ kanalının açılmasına neden olur.
· Bu süreç membran potansiyelini Na+ için denge noktasına (ENa) yaklaştırır.
· Bu aşamada iki nedenle AP'in depolarizasyon fazı sona erer.
o Na+ kanallarının inaktive olarak Na+ girişinin azalması
o Voltaj-kapılı K+ kanallarının açılarak dışarı doğru hızlı bir K+ akımı olması
· Membran repolarize olmaya başlar.
AP sırasında membranın Na+ ve K+ geçirgenliği
· Çoğu hücrede repolarizasyonu bir art-potansiyel (hiperpolarizasyon dönemi takip eder. Bu durum K+ kanallarının henüz kapanmamış olmasından kaynaklanır.
AP Sonrası refrakter periyod
· Absolut (mutlak) refrakter periyod: Herhangi büyüklükteki bir uyaranla nöronu tekrar uyarmak olası değildir.
· Relatif (göreceli) refrakter periyod: Normalde gerekenden daha yüksek bir uyaran ile yeni bir aksiyon potansiyeli başlatılabilir.
· Refrakter periyodlar ikisi birlikte bir kaç milisaniye sürer.
· Bazı Na+ kanallarının inaktif durumda olması ve K+ kanallarının hala açık kalması refrakter periyod oluşumunun nedenidir.
Hep ya da hiç kuralı
· Membranı eşik altında depolarize eden HİÇ bir uyaran AP oluşturamazken, eşik değeri aşan depolarizasyon uyaranları HEP aynı amplitüdde AP oluşturur.
· Hep ya da hiç kuralı doğrudan açılan voltaj-kapılı Na+ sayısı ile ilişkilidir.
· Belli sayıda açılan voltaj-kapılı Na+ kanalının oluşturduğu Na+ akımı, istirahat K+ kanallarınca karşılanır. Açılan Na+ kanalı sayısı arttıkça membran potansiyeli eşik değere ulaşır ve AP oluşur.
Voltaj-Kapılı İyon Kanallarının Özelliklerine Göre Nöronların Uyarılma Özelliklerinde Değişiklikler
Farklı Tipte İyon Kanalları
· Bir çok nöron voltaj kapılı Ca2+ ve Cl- kanalları ile hiperpolarizasyon ile aktive olan Na+ ve K+ kanalları (h-tipi kanallar) da bulundurur. Bu kanallar AP oluşumuna farklı şekillerde katkıda bulunur.
· İstirahat membran potansiyeli ve AP inen fazından sorumlu K+ kanalları değişik nöronlarda farklı özelliklerde bulunabilir:
o Yavaş aktive olan K+ kanalı (delayed rectifier)
o İntrasellüler Ca2+ ile aktive olan K+ kanalı; duyarlılığı depolarizasyonda artar.
o A-tipi K+ kanalı: Na+ kanalına benzer şekilde depolarizasyon ile hızlı şekilde açılır, depolarizasyon uzarsa inaktive olur.
o M-tipi K+ kanalı: İstirahat membran potansiyelindeki küçük değişikliklere yanıt olarak açılır
§ M-tipi kanalların bazı türleri ACh tarafından kapalı duruma getirilebilir.
· Benzer şekilde, voltaj-kapılı Ca2+ ve Na+ kanallarının da bilinen farklı türleri vardır.
Sitoplazmik Ca2+ düzeyinin farklı etkileri
· AP oluşumu sırasında meydana gelen iyon konsantrasyonu değişiklikleri genellikle önemli bir hücre içi modülasyona neden olmazken; Ca2+ için durum farklıdır.
o Hücre içine Ca2+ girişi kendi başına depolarizasyonu arttırıcı bir faktör olarak görev yapar.
o Bazı hücrelerde bulunan Ca2+ duyarlı K+ kanalları ise Ca2+ düzeyinin artışı ile depolarizasyonu azaltıcı yönde etkili olur.
o Bunun dışında Ca2+, farklı hücrelerde kendi kanalını bloke etme, defosforilasyon, ikinci habercilerin uyarılması gibi süreçleri başlatabilir.
Nöronun farklı bölgelerinde uyarılabilirlik özelliğinin değişkenliği
· Nöronların farklı bölgeleri, farklı sinyal özellikleri gösterir.
o Aksonlar elektriksel uyarıları basitçe uzak mesafelere taşımak için özelleşmiştir.
o Nöronun girdi (input) alan, bu bilgiyi işleyen ve çıktı (output) oluşturan bölgeleri ise daha karmaşık işlevlere sahiptir.
· Farklı bölgelerin sahip olduğu farklı özelikler: Bu bölgelerde bulunan iyon kanalları ile saptanır.
· Bir çok nöronda dendritler yoğun Ca2+ ve K+ kanalları ile daha az sayıda Na+ kanalı içerir. Bu bölge AP oluşturmaktan daha çok elektrotonik sinyalleri toplayarak hücre gövdesinde değerlendirilmesini sağlar.
· Nöronun tetikleme bölgesi (trigger zone) ise, yoğun Na+ kanallarından dolayı AP oluşumu için en elverişli bölgedir.
· Akson üzerinde çok sayıda bulunan Na+ ve K+ kanalları AP'nin hızlıca iletilmesini sağlar.
· Akson ucu (presinaptik) bölge ise çok sayıda Ca2+ kanalı bulundurur ® Nörotransmitter salınımı
Nöronun eksitabilitesi: İyon kanallarının Rolü
· Bir nöronun sinaptik uyarana verdiği yanıt, sahip olduğu voltaj-kapılı iyon kanallarının oranına göre değişir.
· Bazı nöronlar tek bir AP yanıtı oluştururken, bazı nöronlar sabit frekansta AP dizileri oluşturabilir.
Nöronlarda farklı tekrarlayan ateşleme tipleri
1. N. Tractus solitarius'da bulunan bir nöronun uyarılmaya cevap olarak oluşturduğu bir dizi AP.
2. Nöronun daha hiperpolarize bir membran potansiyeline sahip olma durumunda geciken AP yanıtı.
Bu yanıt, A-tipi K+ kanallarının depolarizasyon sırasında açılmasına bağlıdır. Bu kanallar -55 mV membran potansiyeli düzeyinde inaktif durumdayken, daha negatif değerlerde depolarizasyon ile açılabilir duruma gelir.
1. Talamik bir nöronda eşik alt bir uyaranın oluşturduğu elektrotonik sinyal.
2. Aynı nöron, daha hiperpolarize bir durumdayken aynı uyaran ile uyarılırsa, patlama tarzında AP'ler oluşur.
Bu durumun nedeni, hiperpolarize durumda aktif hale gelen bir Ca2+ kanal gurubudur.
Talamokortikal ileti nöronlarında sinaptik uyarı olmaksızın, kendiliğinden gelişen patlama tarzında AP'lerinin oluşumu.
Bu durum, hücre membranında hiperpolarizasyon ile aktive olan h-tipi kanallar ile başlatılır. Daha sonra voltaj-kapılı Ca2+ kanalları ve en son voltaj-kapılı Na+ olaya katılarak AP oluşumunu sağlar.
Otonom gangliyondaki bir nöronun ateşleme özellikleri.
Sol taraftaki nöron membranında bulunan M-tipi K+ kanallarından dolayı uzun süreli bir uyarıya bile tek bir AP ile yanıt verir.
Sağ tarafta ise M-tipi K+ kanalı ACh ile bloke edilmiştir. Bu durumda aynı nöronda çok sayıda AP meydana gelebilir.
Voltaj-kapılı İyon Kanallarının Çalışma Prensibi: Hep veya Hiç Kuralı
· Voltage-clamp tekniği membranın geniş bir alandan kayıt yapılmasına olanak verir. Bu nedenle tek kanalın davranışı gözlenemez.
· Patch-clamp tekniği ile tek kanal davranışı gözlenebilir. Bu teknik, iyon kanallarının hep veya hiç kuralına uygun olarak açılıp kapandığını ortaya çıkarmıştır.
A. Patch-clamp tekniği: Mikropipet yardımıyla tek kanal davranışının gözlenmesi.
B. Sıçan çizgili kas hücre kültüründen elde edilen hücrelerden elde edilen kayıtlar.
1. Membrana uygulanan 10 mV'luk depolarize edici uyaran
2. 300 uyarı sonucunda gözlenen Na+ kanalından geçen toplam akım (membrandaki K+ kanalları TEA ile bloke edilmiş ve hesaplamada kapasitif akım çıkarılmıştır).
3. 300 uyarı serisinden dokuzunun kayıtları. Her bir uyarıda Na+ kanalı sadece bir kez açılmaktadır (hep veya hiç).
Voltaj-kapılı Na+ kanalının kendi iç yükünde değişiklik, kanalın fonksiyonuna etkisi
· Na+ kanalı kapalı ® açık ® kapalı konumlarında gerçekte üç farklı durumda bulunur: İstirahat (kapalı) ® Uyarılma (açık) ® İnaktif (kapalı)
· Kanal proteini, kendi içinde net bir elektrik yükü bulundurur. Bu yükün değişimi kapı akımı (gating current = Ig) olarak adlandırılır ve bu akım membran potansiyelinden etkilenebilir.
· Kanalın farklı durumlarının kanal proteininin kapı akımından kaynaklandığı düşünülür.
A. Membran potansiyelini +60 mV'a çıkaran uzun süreli bir akım uygulandığında kapı akımı (Ig) ve Na+ hareketinin (INa) karşılaştırılması.
B. Kapı akımının üç farklı konumunda (1, 2 ve 3) kanalın düzensel değişiklikleri [İstirahat (kapalı) ® Uyarılma (açık) ® İnaktif (kapalı)].
Fig 9-16 Kanal proteinindeki net yükün değişmesi (Ig) sonucu S4 a-helix yapısının yer değiştirerek kanaldaki değişik düzensel durumları ortaya çıkarması.
A. İstirahat durumunda gömülü durumdaki (+) yüklü S4 yapısının kanalı kapalı tutması
B. Membran uyarıldığı zaman S4'ün membranın (-) yüklü ekstrasellüler tarafına doğru hareketi ve kanalın açılması
· Voltaj-kapılı iyon kanallarının seçicilik filtresi yardımıyla iyonları seçmesi (Bölüm 6)
· Na+, K+ ve Ca2+ iyon kanallarını kodlayan genlerin benzer özellikleri ® Ortak bir ancestor genden kaynaklanması (Bölüm 6)
Na+, Ca2+ ve K+ kanallarının benzerliği.
Na+ ve Ca2+ kanalları birbirinin aynısı tekrarlayan motiflerden oluşur.
Her bir tekrar içinde 6 transmembran alan bulunur.
Şekillerdeki P bölgesi seçicilik filtresini, kırmızı renkli S4 a-helix yapısı ise kanaldaki net yükü (gating current) taşıyan bölgeyi temsil etmektedir.
Na+ ve Ca2+ kanallarında tekrarlayan motifler ve onların tansmembran alanlarının üç boyutlu dizilişi (dört tekrardan üçü gösterilmiştir).
Bir gen ailesinin genişlemesi ile ortaya çıkmış voltaj-kapılı kanalların benzer moleküler yapısı
Voltaj-Kapılı Kanalların Mutasyonları: Nörolojik Hastalıklar
· Hiperkalemik periyodik paralizi: İskelet kası Na+ kanalı a-alt ünitesinde mutasyon ® Membranın Na+ geçirgenliğinde uygunsuz fonksiyon.
Ağır egzersizde; Ekstrasellüler K+ artışı, tablonun ağırlaşması ® Aşırı Na+ akımı; miyotoni veya yetersiz Na+ akımı; paralizi
· Epizodik ataksi: Delayed-rectifier, voltaj-kapılı K+ kanalında nokta mutasyonlar ® K+ dışa akımında yetersizlik ® Uyarılmış hücrede repolarizasyonun güçleşmesi
Ağır emosyonel veya fiziksel stress: Ataksi nöbetleri.
· AP iyonların voltaj-kapılı kanallardan hareketi sonucu ortaya çıkar.
· Na+, bazı durumlarda Ca2+ iyon kanallarının bu iyonların hücre içine hareketine izin vermesi membranı depolarize eder.
· Membran repolarizasyonundan sorumlu en önemli iyon: K+
· İki önemli analiz yöntemi:
o Voltage-clamp ® patch-clamp
o Kanalı oluşturan proteinlerin primer amino asit zincirinin gösterilmesi