Download "KOLON ADENOKARSİNOMLARINDA TÜMÖR-STROMA ORANI, TÜMÖR KÖK HÜCRELERİ İLE ENTROPİNİN İLİŞKİSİ VE PROGNOSTİK ÖNEMİ. Yasemin Çakır DEÜTF Tıbbi Patoloji AD"
1 KOLON ADENOKARSİNOMLARINDA TÜMÖR-STROMA ORANI, TÜMÖR KÖK HÜCRELERİ İLE ENTROPİNİN İLİŞKİSİ VE PROGNOSTİK ÖNEMİ Yasemin Çakır DEÜTF Tıbbi Patoloji AD
2 Amaç/Hipotez Bu araştırmada kolon tümörlerinde bir kısmı önceki çalışmalarda prognostik belirteç olarak tanımlanan, tümörde ve tümör invaziv kenarındaki tümör stroma heterojenitesinin belirteçleri olabilecek matematiksel öznitelikler olan tümör/stroma oranı, entropi ve karmaşıklığın tümöral kök hücreler, histopatolojik ve klinik prognostik belirteçler ile ilişkisinin ortaya konulması hedeflenmiştir.
3 Tablo 1: Kolorektal Kanser Kök Hücre Belirteçleri Kısaltmalar: ALCAM, activated leukocyte cell adhesion molecule; ALDH-1, aldehyde dehydrogenase-1; APC, adenomatous polyposis coli; Bmi-1, B lymphoma Mo-MLV insertion region 1 homolog; EpCAM, epithelial cell adhesion moleculelgr-5, leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 5; Msi-1, musashi-1; Vaiopoulos, A.G., et al., Colorectal cancer stem cells. Stem Cells, (3): p
4 Entropi, Karmaşıklık ve Oran Kavramları Entropi Evrendeki düzensizliğin, belirsizliğin, bilgi eksikliğinin ve kullanılmaz hale gelmiş enerjinin bir ölçüsü olarak tanımlanmaktadır. Entropi, aynı zamanda moleküler düzensizlik veya moleküler rastgeleliğin bir ölçüsü olarak da ifade edilmektedir. Karsinogenez sırasında, genomik mutasyonlar ve epigenetik değişiklikler sonucu, rastgeleliğin artttığı ve nükleustaki uzaysal entropinin yükselerek bilgi içeriğinin azaldığı belirtilmektedir. Bu nedenle tümör malignitesinde artışla birlikte nükleer kromatin entropisinde de artış olacağı beklenmektedir
6 Oran Oran öznitelikleri, belli bir görüntü alanı içerisindeki tümor (Tm), stroma (St) veya lümen (Lm) olarak işaretlenmiş piksellerin frekans oranlarından elde edilen öznitelikler olarak tanımlanır. Bu öznitelik değeri, incelenen bir vakaya ait toplam Tm pikselleri sayısının, toplam St piksel sayısına bölünmesi ile elde edilir. Karmaşıklık Bir görüntüdeki veya ilgi alanındaki i değerindeki piksellerden komşuluk ilişkisi ile j değerindeki piksellere geçiş sayısı olarak tanımlanır. Bu çalışmada Tm, St ve Lm pikselleri arasındaki geçiş sayıları karmaşıklık öznitelikleri kullanılmıştır.
7 GEREÇ-YÖNTEM Çalışmaya yılları arasında DEÜTF de radikal cerrahi tedavi uygulanan ve kolon adenokarsinomu tanısı alan, neoadjuvan tedavi almamış 248 hasta dahil edildi. Demografik ve patolojik verilere patoloji raporlarından, klinik bilgilere Genel Cerrahi Anabilim Dalı na ait verilerden ulaşıldı.
8 İmmünohistokimyasal Boyama ve Değerlendirme CD133 ve Lgr5 ile immünhistokimyasal boyama gerçekleştirildi. Pozitif internal kontrol olarak neoplastik olmayan komşu kolon mukozası kullanıldı. Ekspresyon, tüm tümör alanındaki hücreler dikkate alınarak incelendi. CD133 ve Lgr5 in ekspresyonları semikantitatif olarak değerlendirildi. %5 ve üzeri hücre boyanması (Lgr5 ile sitoplamik, CD133 ile apikal membranöz) pozitif olarak değerlendirildi. Pozitif boyanma yaygınlığı göre; %5 hücrede boyanma 1+ %5-50 hücrede boyanma.. 2+ %50 den fazla hücrede boyanma.. 3+ * Choi, D., et al., Cancer stem cell markers CD133 and CD24 correlate with invasiveness and differentiation in colorectal adenocarcinoma. World J Gastroenterol, (18): p * Horst, D., et al., CD133 expression is an independent prognostic marker for low survival in colorectal cancer. Br J Cancer, (8): p * Fan, X.S., et al., Expression of Lgr5 in human colorectal carcinogenesis and its potential correlation with beta-catenin. Int J Colorectal Dis, (5): p * Kleist, B., et al., Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer. Int J Clin Exp Pathol, (4): p
9 Resim 1: Farklı yaygınlıkta apikal sitoplazmik/membranöz CD133 ekspresyonu (A: pozitif kontrol ve negatif boyanma, B: skor 1, C: skor 2, D: skor 3)
10 Resim 1: Farklı yaygınlıkta apikal sitoplazmik Lgr5 ekspresyonu (A: pozitif kontrol ve negatif boyanma, B: skor 1, C: skor 2, D: skor 3)
11 Görüntü Analizi Yöntemi-1 Hastalara ait hematoksilen eozin boyalı preparatlardan tümörün en derin invazyon alanını temsil eden ve tercihen normal mukozayı da içeren preparatlar seçildi. Bu preparatlardan, ışık mikroskobuna (Nicon Eclips Ci-L) bağlı video kamera (Nicon DS-Fi2) ile X20 lik büyütmede, tümörü yüzeyden derine doğru tam kat yansıtacak şekilde çoklu (3-10 adet, ortalama 5,35±1,32 görüntü) dijital fotoğraflar elde edildi. Toplam 1327 fotoğraf, bilgisayar ortamında, bu araştırma kapsamında geliştirilmiş olan Arachne (Netform Mühendislik, yazılım aracı kullanılarak incelendi.
12 Görüntü Analizi Yöntemi-2 Bu incelemede her bir vakaya ait histopatolojik görüntüler, istenilen boyutlarda piksellere ayrılabilme olanağı sağlayan bu yazılım aracı kullanılarak 400 μm2 lik alanlara ayrıldı. Pikselleme sonrası, bilgisayar faresinde sol/sağ tıklama ile her bir noktanın üzerinde yer aldığı faklı görüntü elemanına (Tümör (Tm), stroma (St), lümen (Lm)) göre noktalar farklı renklerle kodlandı. Tümör çevresinde retraksiyonuna bağlı oluşan boşluklar stroma olarak, tümör nekrozu alanları tümör ve gland lümenlerine, dökülen nekrotik tümör hücreleri lümen olarak kabul edildi. Toplamda her olguda ortalama 3,95 mm² (2,22-7,7 mm²) tümor alanı kodlandı.
13 Figür 1: Arachne yazılım aracında tümör, stroma ve lümen seçilmiş görüntü örneği
14 Görüntü Analizi Değerlendirilmesi Kodlanmış görüntü elemanları, bir tamsayı olan iki boyutlu görüntüler olup bu bilgi dışında herhangi bir gri seviye veya renkli görüntü bilgisi kullanılmadı. Oran özniteliği; Tm/St, (Tm+Lm)/St ve Tm/Lm oranlarından oluşan üç farklı formül kullanılarak hesaplandı. Karmaşıklık özniteliği; Tm, St ve Lm pikselleri arasındaki geçiş sayıları kullanıldı.
16 Hastalara ait öznitelikler hesaplanırken farklı kümelemeler kullanıldı. Bunlar; Hasta bazında kümeleme: Herhangi bir hastaya ait bütün görüntülerin toplamından elde edilen değerlerle öznitelikler hesaplandı. Hasta görüntüleri bazında kümeleme: Herhangi bir hastayı oluşturan her bir görüntüden tek tek elde edilen özniteliklerin oluşturduğu dizinden istatistik ifadeler hesaplandı. Bu istatistik ifadeler; ortalama, varyans, en küçük ve en büyük tür. Bu yaklaşımda her bir hasta görüntüsüne karşılık gelen özniteliklerle bir sayı dizini oluşturuldu.
17 Alt görüntüler bazında kümeleme: Bu yaklaşımda da her bir hastaya karşılık gelen öznitelikler bir sayı dizinidir. Bir hastayı oluşturan her bir görüntünün içindeki, farklı piksel kenar uzunluğundaki kare bölgelerde hesaplamalar yapıldı. Bu çalışmada G değişkeni kare kenar uzunluğuna karşılık gelmektedir. Hesaplama yapılan her bir kare bölge G/2 kadar kaydırılarak bir sonraki bölge elde edildi (Şekil 1) İnvaziv kenar bazında kümeleme: Bir hastaya tümörün en invaziv olduğu ve son görüntünün temsil ettiği invaziv kenar görüntüsünden öznitelikler hesaplandı.
18 G/2 G Şekil 1: Lokal öznitelik hesaplama geometrisi (G piksel kare kenar uzunluğu)
19 Verilerin Değerlendirilmesi Veriler SPSS 15.0 paket programı ile değerlendirildi. Gruplar arasında klinik, patolojik ve hesaplanabilir değişkenler yönünden farkın önemliliği Ki-kare ve Mann-Whitney testleri ile değerlendirildi. Gruplar arasında belirteçlerin boyanma yaygınlığı yönünden farkın önemliliği bağımsız grup sayısı iki olduğunda Mann Whitney U testi, ikiden fazla olduğunda ise Kruskal Wallis testiyle değerlendirildi. Bağımsız risk faktörlerini belirlemek amacıyla Logistic ve Cox regresyon analizleri uygulandı. Belirteçlerin birbiriyle ve diğer parametrelerle korelasyonu Sperman ın Korelasyon testiyle araştırıldı. Belirteçlerin hastaların sağkalımları ile karşılaştırılması Kaplan Meier yöntemi ile değerlendirilmiştir. p<0,05 için sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
20 BULGULAR Çalışmaya dahil edilen 248 hastanın, 148 i erkek (%59,7) ve 100 ü kadın (%40.3) dır. Hastaların yaş aralığı 29-89, ortalamaları 65,9 dur. 163 ü (%65,7) yaşayan, 85 i (%34,3) ölen hastaların; Lokal nüks. 2 sinde (%5) hastada + Uzak nüks. 41 inde (%16,5) hastada + Uzak metastaz.. 68 inde (%27,4) hastada + Adjuvan tedavi. 185 (%74,6) hastada +, 63 (%25,4) -
21 İHK sel belirteçlerde skorlara göre oluşturulan alt gruplar arasında, genel sağkalım, nüks ve metastaz gelişimi açısından istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmadı. CD133 ve Lgr5 kök hücre belirteçleri arasında korelasyon saptanmadı.
22 Bağımsız risk faktörlerini belirlemek amacıyla uygulanan Logistic ve Cox regresyon analizlerinde; genel sağkalım durumu, nüks ve uzak metastaz gelişimi ile klinikopatolojik ve hesaplanmış öznitelik parametreleri arasında yapılan tek değişkenli analizlerde istatistiksel anlamlılık saptanan parametreler modele alındı.
23 Kaplan Meier yaşam analizinde; Hastaların klinik takip sürelerinin 1 ay - 87 ay Ortalama takip süresinin 35,7±22,78 ay Yaşayan ve ölen hastaların tümünün sağkalım analizine göre tahmini yaşam süreleri ortalama 60,89 ay (CI: 56,16-65,56)
24 Elde edilen analiz sonuçları incelendiğinde; istatistiksel anlamlı sonuçların birçoğunun, oluşturulan 8x8 ve 16x16 lık alt görüntülerden elde edildiği görülmüştür. Ayrıca invaziv kenarda yapılan değerlendirmelerde de önemli miktarda anlamlılık saptanmıştır. Oran özniteliği sonuçları, tümör miktarındaki artışın ölüm, nüks ve metastaz gelişimi ile anlamlı ilişkili olduğunu göstermiştir. Ölüm riskinin; 8x8 lik alt görüntülerde maksimum Tm/St oranı ile 1,02 kat; 16x16 lık alt görüntülerde ortalama Tm/St oranı ile 1,2 kat Nüks riskinin; 16x16 lık alt görüntülerde varyans Tm/St oranı ile 1,002 kat arttığı görülmüştür.
25 Tümörün infiltratif karekterini yansıtan entropi ve karmaşıklık özniteliklerine ait analiz sonuçları incelendiğinde, özellikle invaziv kenardaki 8x8 ve 16x16 lık alt görüntülerde anlamlı sonuçlar elde edildiği dikkati çekmiştir. Bu özniteliklerin pt ve pn evreleri ile anlamlı ilişkili olduğu, bu evrelerdeki artışla birlikte entropi ve karmaşılık öznitelik değerlerinin de yükseldiği saptanmıştır. Bunlara ek olarak invaziv kenarda hesaplanmış olan entropi ile ölüm riskinin 1,9 kat arttığı belirlenmiştir.
26 Tarafımızca yürütülen bu çalışmada; Korele sonuçlar elde edilmeyen bu iki belirteç ile genel sağkalım, nüks ve metastaz gelişimi arasında istatistiksel anlamlı ilişki saptanmamıştır. Hesaplanmış özniteliklerden entropi ve karmaşıklık ortalamalarının CD133 alt grupları arasında anlamlı farklılığa sahip olduğu ancak değerlerin skorla paralel olarak değişmediği görülmüştür. Lgr5 alt gruplarında oran ve entropi öznitelik ortalamaları arasında anlamlı fark bulunmuş ancak benzer bir şekilde değerlerin skorla paralel olarak değişmediği saptanmıştır.
27 Sonuç Olarak; Bu çalışmada; Morfometrik analizlerin kalitatif sistemlerle karşılaştırıldığında, çok sayıda doku bileşeninin, tümörün genelini daha iyi yansıtabilecek şekilde daha geniş alanlarda, çok daha hassas ve doğru ölçülebilmesine olanak sağladığı görülmüştür.
28 Bu çalışmanın özgün bulgusu tümörlerde entropi, karmaşıklık özniteliklerinin tanımlanması ve kolon tümörü invaziv kenarındaki tümör/stroma ilişkili entropinin hesaplanabilir bir bağımsız prognostik değişken olarak tanımlanmasıdır. Önceki çalışmalarda kantitatif değerlendirmeye dayanmayan stroma artışının prognostik önemli olma verisi, bu çalışmada kullanılan kantitatif yöntemle anlamlı bulunmamıştır, aksine tümör oranının yüksek olması kötü prognozla ilişkili bulunmuştur. Kök hücre belirteçleri olarak kabul edilen LGR5 ve CD133 de prognostik ya da hesaplanabilir öznitelikler olarak bu seride anlamlı bulunmamışlardır.
ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ SONUÇ RAPORU Proje Başlığı Kolorektal kanserli hastalarda kök hücre gen ekspresyon profili ve prognostik önemi Proje Yürütücüsünün İsmi Prof. Dr. Hakan Akbulut