KROMATOGRAFİ. - ppt indir
... konulu sunumlar: "KROMATOGRAFİ."— Sunum transkripti:
KROMATOGRAFİ Kromatografi, bir karışımda bulunan maddelerin,birisabit diğeri hareketli faz olmak üzere birbirleriyle karışmayan iki fazlı bir sistemde ayrılması, tanınması ve saflaştırılması yöntemlerinin genel adıdır. Çeşitli maddelerin hareketli faz yardımıyla,sabit faz üzerinde, değişik hızlarla hareket etmeleri veya sürüklenmeleri esasına dayanır
Kromatografi tekniğinin temelinde üç ana unsur yer alır.• Sabit faz: Bu faz daima bir "katı" veya bir "katı destek üzerine emdirilmiş bir sıvı tabakasından" oluşur. • Hareketli faz: Bu faz daima bir "sıvı" veya "gazdan" oluşur. • Sabit faz, hareketli faz ve karışımında yer alan maddeler arasındaki etkileşimin türü: Kromatografide "yüzey tutunması veya adsorpsiyon" ile "çözünürlük" gibi olgular temel etkileşim türlerini oluştururlar.
İlk kez Rus botanikçi Mikhail Tsvett (1903)tarafından geliştirilen bir yöntemdir. Tsvett bu yöntemi bitki pigmentlerinin(klorofil A,klorofilB ve ksantofil) renkli bileşenlerini ayırmakta kullanılmıştır. Kullandığı kolonda renkli bandlar oluştuğundan, bu ayırma yöntemine kromatografi adını vermişti
Bir parça kağıt şeridin aşağı hizasından1 cm kadar yukarısına bir damla siyah mürekkep damlatınız Kağıt şeridi, mürekkep damlattığınız kısım su hizasının üstünde kalacak şekilde su tankına batırınız ve dik bir şekilde tutunuz. Su,kapiler etkisiyle kağıt üzerinde yukarı doğru yürürken mürekkebi çözer ve sürüklemeye başlar. Mürekkebin içindeki bileşenler kağıt üzerinde farklı hızlarda ilerleyerek ayrılmış olur.
Kromatografi ‘nin Sınıflandırılması1-Uygulama Biçimine Göre 2-Ayrılma Mekanizmalarına Göre 3-Faz Tiplerine Göre
1-Uygulama Biçimine Göre- Düzlemsel kromatografi Kağıt kromatografisi İnce tabaka kromatografisi (TLC) -Kolon kromatografisi Gaz kromatografisi (GC) Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) Süperkritik akışkan kromatografisi
2-Ayrılma Mekanizmalarına Göre• Adsorpsiyon kromatografisi • Dağılma kromatografisi • İyon değiştirme kromatografisi • Jel filtrasyon (Moleküler eleme) kromatografisi • İyon çifti kromatografisi • Afinite kromatografisi
3-Faz Tiplerine Göre -Sıvı kromatografisi Sıvı-Katı kromatografisiSıvı-Sıvı kromatografisi -Gaz kromatografisi Gaz-Katı kromatografisi Gaz-Sıvı kromatografisi
•Kolon kromatografisi:biyomoleküllerindepo (tampon) sabit faz (katı porlu matriks) mobil faz elüent Protein karışımı •Kolon kromatografisi:biyomoleküllerin saflaştırılmasında sıklıkla kullanılır •Kolon, biyomolekülleri seçici adsorblayan bir maddeyle (katı porlu matriks) doldurulur  SABİT FAZ •biyomolekül karışımı kolona tatbik edilir HAREKETLİ FAZ •Tampon çözelti (MOBİL FAZ) ile yıkanan kolon tarafından, adsorbe edilmeyenler  önce adsorbe edilenler  daha geç kolonu terkeder. kolondan çıkarlar
1903 yılında Tsvet bitki pigmentleriyle çalışırkenkolon dolgu maddesi olarak kireç kullanmıştı. Günümüzde ise çoğunlukla silika jel ve alumina kullanılmaktadır.
Kolon Kromatografi TipleriKolondaki dolgu maddesi ve seçilen elüsyon metoduna göre gruplandırılır: i.Jel filtrasyonu  büyüklük ii.İyon değişim  yük iii.Affinite  (bağlanma)
i.Jel Filtrasyon KromatografiKarışımdaki moleküllerin molekül büyüklüklerinde göre ayrılması esasına dayanır •Kolon, jel boncuklar(belli büyüklüğe sahip ve karışımdaki bileşenlerle etkileşmeyen bir madde) ile doldurulur  katı matriks •Biyomolekül karışımını içeren tampon, kolondan geçirilir Küçük moleküller,jel boncuklar arasındaki boşluklara girer,kolondan geç çıkarlar. Büyük moleküller,jel boncuklar arasındaki boşluklara giremez ve kolondan hızlı bir biçimde sürüklenerek önce çıkarlar.
Kromatografik ayırma sırasında bozunması veya degişikliğeuğraması istenmeyen protein ya da enzim gibi biyolojik moleküllerin birbirinden ayrılması için kullanılır. Bu yöntem ile polimerlerin molekül ağırlığı dağılımı da tayin edilebilir Avantaj Büyük miktarda : biyomolekül karışımı saflaştırılabilir Dezavantaj: Yavaş ayırım
ii.İyon exchange (değiş-tokuş) KromatografiMaddelerin iyonik grupları ile iyon değiştiricideki iyonik grupların eşdeğer miktarlarının karşılıklı yer değiştirmesi esasına dayanır İyon değiştirme kromatografisi, kullanılan iyon değiştiricinin anyon veya katyon aktarmasına göre sırasıyla anyon değiştirme kromatografisi veya katyon değiştirme kromatografisi olarak adlandırılır. Anyon değiştirme kromatografisinde,kolon içindeki sabit tabaka olan matrixe kovalent bağlı iyonlar pozitif yüklüdür,bu iyonlar kolondan geçirilen çözeltideki anyonları kendine çeker,çözeltideki anyonlar ayrılır,sadece katyonlar ortamdan çıkar. Katyon değiştirme kromatografisinde ise,benzer sistemle çözeltideki katyonlar ayrılır,anyonlar ortamdan çıkar.
Cl- ve I- karışımının nitrat bağlanmış anyon değiştirici RNO3 ile bileşenlerine ayrılmasında geçerli dengeler aşağıdaki biçimdedir: Cl- + RNO3 RCl + NO3 I- + RNO3 RI + NO3 I Anyon Değiştirici Cl- R: Çözünmeyen Matriks RNO3 : Anyon Değiştirici
İyon değiştirmeyi etkileyen faktörlerHareketli faz derişimi Hareketli faz pH’sı Kompleks oluşturucu etki İyon değiştirme kromatografisinin uygulanması Ayrılmaları güç olan bazı iyonları ve asitlerin Aminoasitler Seyreltik iyon çözeltileri deriştirmede Asit ve baz elde edilmesinde NaCl↔NaOH + Cl
iii.Affinite KromatografisiEnzim, hormon,vb spesifik proteinlerin saflaştırılmasında kullanılır.Kolonun dolgu maddesine,(dekstran, poliakrilamid, selüloz vb)spesifik protein ile kompleks yapabilen bir ligand bağlanır: Ligand ile kompleks yapan spesifik protein,katı desteğe bağlanarak kolonda tutulurken; serbest proteinler kolonu terkederler. Bağlı protein, daha sonra, pH değişikliği / tuz çözeltileri veya ligand ilavesiyle kolondan elüe edilir Seçiciliği fazla olan bu yöntem,kromatografi tekniklerinin en yenisidir. Seçiciliği fazla olan bu yöntem,kromatografi tekniklerinin en yenisidir. Antijen – Antikor Enzim – Substrat Reseptör– İlaç gibi oldukça spesifik etkileşimlere dayanır.
Kolon Kromatografisi a)Gaz Kromatografi (GC)b)Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografi (HPLC)
GC a) Gaz kromatografisiBir karışımda gaz halinde bulunan veya kolayca buharlaştırılabilen bileşenlerin birbirinden ayrılması amacıyla gaz kromatografisi yöntemi kullanılır. Bu yöntemde ayrılma, bileşenlerin farklı katı yüzeylerdeki farklı adsorpsiyon ilgilerine göre gerçekleşir. Numunede bulunan bileşenler bir cihazla spektrum haline getirilir ve bu spektrumda bulunan her pik ayrı bir bileşeni gösterir.
Hareketli faz olarak helyum, azot veya argon gibi inert bir gaz kullanılır ve bu gaza taşıyıcı gaz adı verilir. Kolon içinde kullanılan sabit faz; silika, alumina veya karbon gibi bir katı ise yöntem, gaz-katı kromatografisi adını alır. Eğer sabit faz kiezelguhr gibi inert katı bir dolgu maddesi üzerine tutturulmus uçucu olmayan bir sıvı film ise yöntem gaz-sıvı kromatografisi adını alır. Bu şekilde kullanılan kolonlara dolgulu kolonlar denilir. Gaz kromatografisi yönteminde kolonlar 2-10 mm iç çapında ve 1-5 m boyundadır. Fakat inert bir katı dolgu maddesi üzerine uçucu olmayan bir sıvı kaplanması yerine, bu sıvı filminin doğrudan ince bir cam veya silika kapiler borunun iç yüzeyine tutundurulmasi ile mm iç çapinda ve m gibi çok uzun kapiler kolonların kullanılması mümkün olabilir. Bu nedenle kapiler kolonların verimliligi ve ayırıcılığı, dolgulu kolonlara oranla çok daha iyidir.
b) Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi HPLCSıvı kromatografi bir ayırma tekniğidir. Bir sıvıda çözünmüş ayrılacak bileşenler, bir kolon içerisinde bulunan genellikle katı bir destek üzerindeki sabit faz ile farklı etkileşmelere girerek, kolon içinde değişik hızlarda ilerler. Kolonu değişik zamanlarda terkederler ve böylece birbirlerinden ayrılırlar. Burada taşıyıcı faz olan sıvı, pompalarla kolona basıldığından yüksek akış hızındadır. Bu nedenle ayırma daha kısa sürede ve tam olarak gerçekleşmektedir. Ayrılan bileşik, kolon çıkışına bağlanan uygun bir dedektörle tesbit edilip miktarıyla orantılı olarak kaydedilir. Yüksek hızda gerçekleştirilen ayırmaların yapıldığı sıvı kromatografi sistemlerine, Yüksek Basınç Sıvı Kromatografi (HPSC) denir Normal Faz Sıvı Kromatografisi: Polar sabit faz ve apolar veya düşük polariteye sahip hareketli faz Ters Faz Sıvı Kromatografisi: Sabit faz apolar, hareketli faz ise polardır
Ters faz kromatografisinin avantajları1. Normal faz kromatografide, sıvı fazın kontrolü çok önemli ve kritiktir.Hareketli faz bileşimindeki küçük değişiklikler kromatogramda belirgin farklılıklara neden olabilir. 2. Dengeye ulaşma normal faz kromatografide çok yavaştır. 3. Normal faz kromatografide polar maddelerin elüsyonu çok yavaştır ve yayvan piklere sebep olu 4. Apolar çözücüler çok pahalıdır, ayrıca nemden uzak tutmak zordur.
Fatma Tekeli Hazırlayan: Numara: Fakülte: NEF Danışman: Doç.Dr.Hilmi Namlı
"KROMATOGRAFİ." indir ppt
MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II
Çözeltiler. Proje hakkında