BİYOLOJİK DOZİMETRİ VE İLGİLİ GELİŞMELER - Biyoteknoloji
Radyasyonun organizmaya olan etkileri akut ve kronik şekilde olmaktadır. Akut etkiler insanda radyasyona maruz kalındıktan kısa bir süre sonra klinik bulgular ile ortaya çıkmaktadırlar. Bunlar merkezi sinir sistemi (100 Sv ve üzeri), gastrointestinal (10-100 Sv) ve hemato­poietik (2-10 Sv) sendromlardır. Sendromların ortaya çıkışı absorbe edilen dozla ilişkilidir.4 Bu sendromlar bir süre sonra bireyi ölüme götürür. Radyasyonun kronik etkileri ise hücrenin ölümüne yol açmayan ancak genetik materyallerinde onarılamayan bozukluklara neden olan olaylar sonucunda ortaya çıkarlar. Kanser yapı­cı etkisi, genetik etkisi ve ömür kısaltıcı etkisi bunlara örnektir.
Canlıların somatik ve genetik özellikleri kromozomlarda taşındığı için radyasyonun kromozomlarda meydana getirdiği zararlı etkiler günümüzde ve gelecekte toplum sağlığı açısından oldukça önemlidir.
Dozimetri Çeşitleri ve Biyolojik Dozimetri
Toplu halde veya bireysel olarak radyasyona maruz kalan bireylerin absorbe ettikleri radyasyon dozu; fiziksel veya biyolojik yöntemlerden biri ile yada her ikisiyle birlikte belirlenebilir. Bu işlem dozimetri olarak adlandırılır. Meslekleri gereği radyasyonla çalışanların fiziksel dozimetri çeşidi olan Film, Cep ve Termolüminesan dozimetrilerden birini taşımaları gerekir. Ancak fiziksel dozimetrenin vücut üzerindeki konumu nedeni ile yetersiz kalması, büyük kitlelerin zarar gördüğü toplumsal radyasyon kazalarında ise bireylerde fiziksel dozimetrenin bulunamaması ve biyolojik çeşitlilik nedeniyle kişilerin radyo duyarlılığının farklı olması biyolojik dozimetriye üstünlük sağlamakta bu nedenle de fiziksel ölçümlerin biyolojik metotlarla desteklenmesi gerekmektedir. Uluslararası Atom Enerjisi Ajansı(IAEA) radyasyon kazası durumlarında, fiziksel dozimetri ile birlikte biyolojik dozimetrinin de absorbe edilmiş dozun belirlenmesinde bağımsız olarak kullanılmasını önermiştir. Şekil 1’de dozimetri çeşitleri özetlenmiştir.
Biyolojik dozimetri, genel anlamı ile kişilerin absorbe ettikleri radyasyon dozunun biyolojik indikatörler (belirleyiciler) kullanılarak ortaya çıkarılmasına denir.
Biyolojik Dozimetri için ideal koşullar;
1-Dozları tahmin etmek için seçilen etkiler iyonizan radyasyonlara özgü olmalı (dientrik aberasyonları gibi),
2-Radyasyona maruz kalma sonucu oluşan etki kalıcı olmalı, eğer kalıcı değilse zamana bağlı olarak oluşan değişiklikler bilinmeli,
3-Oluşturulan kontrol doz-cevap eğrilerinde dozların aralığı mesleki ışınlamalarda olduğu gibi çok küçük dozları ve kaza durumlarında olduğu gibi birkaç Gy’e varan dozları da içermeli,
4-Farklı radyasyon kalitelerinde uygulanabilmeli (Co, X-ışını, nötron v.b),
5-Biyolojik materyal kolay elde edilebilmeli (kan gibi),
6-Ölçümler kolay ve hızlı olmalı kısa sürede sonuç elde edilmeli,
7-Kronik ve homojen olmayan ışınlamalara da uygun olmalı.
Yukarıdaki özellikleri taşıyan ideal bir biyolojik dozimetri yöntemi bilinmemektedir. Fakat, insan periferal kanından lenfosit kültüründen kromozom analizinin yapılması bugün için bilinen en iyi biyolojik dozimetri yöntemidir. Biyolojik dozimetri çeşitlerinden olan kromozom dozimetrisi (sitogenetik dozimetri), kişilerin absorbe ettikleri radyasyon dozu ile insan lenfositlerinde oluşan kromozom aberasyonları arasındaki kantitatif ilişki esasına dayanır.
İyonizan radyasyonların kromozomlarda oluşturdukları hasar 20.yy başlarından beri bilinmektedir. İlk olarak X-ışınlarının Drosophila'da kromozom aberasyonu oluşturduğunun bulunması ve takip eden yıllarda araştırıcıların yaptıkları çalışmalar sonucunda ilk olarak 1962 yılında kromozom aberasyonları, radyasyona maruz kalan bireylerde absorbe edilen radyasyon miktarını tespit etmek için kullanılmıştır. Kromozom aberasyonlarının absorbe radyasyon dozunun belirlenmesinde kantitatif biyolojik indikatör olarak kullanılmasından bu yana radyasyon kazaları sonunda absorbe edilmiş olan doz tayininde standartlaşmış bir yöntem olarak kullanılmaktadır.
Radyasyonun canlılarda oluşturduğu etkileri değerlendirmek için başka biyolojik indikatör sistemler de geliştirilmiştir. Elekton spin rezonans, Biyokimyasal indikatörler (kıl, tükürük, saç, sperm vs), Retikülosit sayımı, Mutasyon noktalarının analizi, Monoklonal antibodyler vs. Bu tür sistemlerin çoğu örnek almadaki güçlükler, hücrelerin asenkron popülasyon (hücre siklusunun farklı evrelerinde) şeklinde bulunması ve hücrelerin yaşam sürelerinin kısa olması, yöntemin belli dozlarda etkili olması ve bazen de ışınlanma süresinin önemi nedeniyle dozimetri amacıyla rutin olarak kullanılamazlar.
Biyolojik Dozimetri Amacıyla Kullanılan Kromozom Aberasyonları
Unstabil (kalıcı olmayan) asimetrik kromozom aberasyonlarından olan disentrik aberasyonlar ve eşdeğerleri (trisentrik ve sentrik halka) absorbe radyasyon dozunun indikatörü olarak diğer aberasyonlara göre daha çok güvenilirdirler. Çünkü disentrik kromozom aberasyonları radyasyona özgüdürler yalnızca özel birkaç radiomimetik kimyasal (bleomisin, endoksan vs) tarafından oluşturulabilir. Doğal görülme sıklıkları (back-ground) düşüktür (1/2000) ve kolay belirlenirler. Bazı araştırıcılar doz tahminlerinde disentrik eşdeğeri kabul edilen sentrik halka (ring) kromozomları da disentriklerle birlikte kullanmaktadırlar. Sentrik halka oluşumu unstabil kromozomlarının oluşum yüzdesi içinde %5-10 civarında olduğundan doz hesaplamalarında kullanılmamaları önemli bir kayıp değildir. Serbest asentrikler, disentrik, trisentrik ve sentrik halka gibi kromozom aberasyonlarına eşlik etmez ve onlardan bağımsız olarak bulunurlar. Bu aberasyonlar radyasyon dışıetkenlerle de oluşturulabildikleri için tek başına doz tahmininde kullanılmamaktadırlar. Disentrik, trisentrik ve sentrik halka kromozom aberasyonlarının oluşumu Şekil 2’de şematize edilmiştir.
Translokasyon olarak adlandırılan iki kro­mozom arasındaki simetrik değişimler de son yıllarda geliştirilen floresan boyama teknikleri (fluorescens in situ hybridisation; FISH) sayesinde biyolojik dozimetri amacıyla kullanılmaktadır. Kromatid tipi kırıklar büyük oranda kimyasal ajanlar tarafından oluşturulduğundan biyolojik dozimetri amacıyla kullanılmamaktadır. Son yıllarda yine insan periferal lenfositleri kullanılarak absorbe edilen radyasyon dozunun belirlenmesi amacıyla Mikronukleus testi çalışmaları yapılmaktadır. Mikronukleuslar sitoplazma içinde ana nukleusun dışında fakat nukleus ile şekil, yapı ve boyanma özellikleri bakımından aynı olan küçük küresel yapılardır. Radyasyona maruz kalmış lenfositlerde hasar gören kromozomlar ve onların asentrik parçaları veya mitotik iğdeki hatalar sonucu kromozomun tamamının kutuplara çekilememesi sonucu oluşurlar. Şekil 3 A’da bölünmekte olan binukleat bir hücrede kutuplara çekilemeyen bütün bir kromozom ve asentrik fragmentten mikronukleus, B’de ise yine binukleat bir hücrede disentrik köprüden nukleoplazmik köprü ve mikronukleus oluşumu şematize edilmiştir. Binukleat hücrelerdeki hücre başına düşen mikronukleus sıklığının mononukleat hücrelerdekinin iki kat olması nemlidir.
Kromozom aberasyonlarının doğal oluşum sıklığı konusunda, farklı populasyonlar ile yapılan araştırmalarda özellikle disentrik sıklığında farklılıklar gözlenmiştir. Doğal disentrik oluşum sıklığının farklı bulunması, laboratuva koşulları, sayıcı ve değerlendiriciler arasındaki farklılıklar nedeniyle her biyolojik dozimetri laboratuarının kendi koşullarında, çeşitli radyasyon kalitelerinde ve farklı radyasyon dozlarında oluşturacakları kontrol doz-cevap eğrilerine sahip olmasını gerekli kılmıştır. Olası bir radyasyon kazasında alınacak radyas­yonun tipine göre, absorbe radyasyon dozunun miktarı o tipteki kontrol doz-cevap eğrilerin­den faydalanılarak bulunmaktadır.
Kontrol doz-cevap eğrileri daha önce radyasyonla çalışmamış yada herhangi bir şekilde radyasyona maruz kalmamış sağlıklı bireyler­den alınan kanların akut ve homojen ışınlanmaları sonucunda oluşturulur. Biyolojik dozi­ metri amacıyla yapılan kontrol doz-cevap eğri­leri genellikle 50 mGy ile 4 Gy arasında yapılır. Eğriler oluşturulurken 0 ve 1 Gy arasında en az 5 doz noktasının olmasına özen gösterilir. Çünkü radyasyon kazaları genelde bu dozlar arasında meydana gelir.10 Standart eğri oluşturulurken çok küçük doz (<0.5 Gy) nokta­larında doz-cevap ilişkisini ortaya koymak için çok fazla hücre saymak gereklidir. Kalibras­yon eğrisini oluşturmak için toplam 10.000­15.000 hücre, bireysel doz tahmini yapmak için ise 500-1000 hücre saymak yeterli­dir. Elde edilen aberasyon verimi dikka­te alınarak %95 güvenilirlik sınırları içinde kontrol doz-cevap eğrisi çizilir. Aynı laboratuvar koşullarında 200 kV X-ışını ve Co­60 gamma radyasyonu ile ışınlanma sonucu oluşturulan kontrol doz-cevap eğrileri birlikte Şekil 4’de görülmektedir.
Materyalin Elde Edilmesi, Işınlanması
Kontrol doz-cevap eğrilerini oluşturmak amacıyla elde edilen kan örnekleri genç, sağlıklı, sigara içmeyen, radyasyonla çalışmamış yada herhangi bir şekilde radyasyona maruz kalmamış bireylerden alınır. Kontrol grubu ve birinci mitozun (M1) ikinci mitoza (M2) oranını belirlemek için alınan kanlar ayrılır. Kan örnekleri steril, içleri heparin kaplı tüpler içine alınır. Eğriyi oluştururken, kullanılan doz noktalarına ait kan örnekleri radyasyon kalitesine uygun şekilde, doz hızı, dozun homojenitesi gibi kriterlere özen gösterilerek 370C’da ışınlanır.
Kültür ve Tespit İşlemleri
Kontrol doz-cevap eğrileri oluşturmak için ışınlanmış kan örnekleri ve radyasyona maruz kalmış bireylerde absorbe dozun tayini için alınan (~5 ml) kan örnekleri steril şartlarda, Moorhead ve arkadaşlarının mikrokültür tekniğine uygun olarak kültüre alınır. Bu yöntemde genellikle kültür stok medyumu olarak RPMI-1640+L-Glutamin, Penicilin ve Streptomicin kullanılır. Kültür ortamına mitojen olarak PHA (phytohemaglutinin) ve hücrelerin metafazda durmaları için Kolsemid kullanılır. Kültür süresi sonunda (toplam 48 saat) 0,075M KCL ile hipotonik şok uygulanır. Bu işlem sonunda 1:3 oranında asetik asit/metanol karışımı ile tespit işlemleri tamamlanır ve metafaz kromozomlarının lamlar üzerinde iyi bir şekilde dağılmaları sağlanır. % 5 Giemsa boyası ile boyanarak incelenecek duruma getirilir. Uygulanan kültür metodu Şekil 5’­de kısaca özetlenmiştir.
M2/M1 Oranı ve Biyolojik Dozimetride Önemi
İnsan vücudunda yaklaşık 5.2x1012 lenfosit dolaşır. Lenfositlerin % 70’i T- lenfositlerdir ve bunların yaklaşık %98’i ufak, hücre siklusunun bölünmeyen bir fazında (G0) bulunur. G0 fazında olmaları dolayısı ile biyolojik ömürleri uzundur. Metabolik olarak inaktiftirler. T-lenfositlerin kolay elde edilebilmeleri, radyasyona duyarlı olmaları, biyolojik ömürlerinin uzun olması (%90’nın yaşam süresi ortalama 3 yıl) (38) ve akut vücut ışınlamalarından 3 yıl sonra dahi lenfositlerdeki kromozom aberasyonlarının %50 sinin hala korunuyor olması, kaza üzerinden uzun yıllar geçse bile absorblanan dozun belirlenmesine olanak tanır.
İnsan periferal kanında bulunan lenfositler stimüle edilerek G0 fazından çıkıp hücre siklusunda ilerlemeye başlarlar. Siklusta ilerleme hızı hücreler arasında farklılık gösterdiğinden periferal kanda senkronize olan lenfositler bölünmeye teşvik edildikleri invitro ortamda asenkron hücre popülasyonu haline gelirler. Bu yüzden bazı lenfositler M1 bölünmede iken siklusta hızlı ilerleyen bazı lenfo­sitler M2 da olurlar. Radyasyona maruz kalındıktan sonraki ilk bölünme (M1) de lenfositlerde oluşan disentrik kromozom aberasyonlarının %50’si kaybolur. Bu yüzden doz tahmini yapılırken, M1 lenfositlerde bulunan disentrik kromozom aberasyonlarının sayımı esas alınır. M2/M1 belirlenmesi için kültür ortamına BrdU (bromodeoksiüridin) ila­ve edilir. Timidin analogu olan BrdU, DNA replikasyonu esnasında timidinin yerini alır. DNA’nın yapısına girer. Floresan Plus Giemsa (FPG) boyama tekniği32 ile boyanan metafaz kromozomları Floresan mikroskopta incelenerek M2 ve M1’de olan hücreler ayırt edilir. Metodun iyi çalıştığının göstergesi olarak, M2 de olan hücreler M1den %10 daha az olmalıdır. Bu değerlerin üzerinde bulunduğunda absorbe radyasyon dozunun hesaplanmasında bazı düzeltme faktörleri kulanılır. Kültür ortamına BrdU ilave edildikten sonra DNA replikasyonu sırasında BrdU’nun DNA’nın yapısına girişi, M1 ve M2’deki hücrelerde BrdU almış kromozomların görünüşü Şekil 6’da gösterilmiştir.
Kromozomların değerlendirilmesi Hazırlanan preparatlar değerlendirilirken kromozomları birbirinden belirgin olarak ayrılmış, görünüşleri düzgün ve iyi boyanmış diploid metafazlar dikkate alınır. Kromozomlar sayılırken sayıları 2n=46 ve üzeri olanlar değerlendirmeye alınır. Hücrede kararsız aberasyonlar (disentrik, sentrik halka ve serbest asentrik) bulunduğunda kromozom sayıları ile belirlenen aberasyonların birbirini dengelemesine özen gösterilir. Örneğin, hücrede bir disentrik aberasyonun varlığında ona eşlik eden bir asentrik ile sayının 46 da tutulması; bir sentrik halka bulunduğunda yine eşlik eden bir asentrik ile sayının 47 olması, bir trisentrik bulunduğunda ona eşlik eden 2 adet asentrik ile sayının 46 olması gibi durumlara dikkat edilir. Değerlendirmelerde bir trisentrik 2 disentriğe, bir sentrik halka bir disentriğe eşdeğer olarak kabul edilmektedir. 4 Gy 200 kv X-ışını uygulanan ve yukarıda anlatılan metoda uygun olarak hazırlanan ve değerlendirilen bir me­tafaz plağında disentrik ve asentrik kromozom aberasyonları Şekil 7’de görülmektedir.
İstatistiksel ve Matematiksel Yöntemler
Farklı iyonlaştırıcı radyasyonların eşit dozlarının birim uzaklıkta bıraktıkları enerjilerinin ve dolayısıyla oluşturdukları iyonlaşma yoğunluklarının farklı olması nedeniyle oluşturdukları kromozom aberasyonları verimleri de farklıdır.
Düşük Lineer Enerji Transfer (LET)’li radyasyonların herhangi bir dozunda iyonizasyon rastgele dağılır. Kromozom hasarının da aynı olasılıkla ger­çekleştiği düşünülürse aberasyon dağılımı da rast gele olacaktır. Bu rast gele dağılımın düşük fre kanslarda meydana gelmesi Poisson dağılımı ile uygunluk gösterir. Bu bilgilere dayanarak X-ışınları ve γ gibi düşük LET’li radyasyon ile akut ve homojen ışınlanma sonucunda oluşan kromozom aberas­yonlarının Poisson dağılımına uygunluk gösterdiği belirlenmiştir. Yüksek LET’li radyasyonlarda ise iyonizasyon yoğunluğu fazla olduğundan iyonizasyon hücreler arasında rast gele dağılmaya­caktır. Yüksek LET’li radyasyonların absorblanması sonucu birbirine yakın hücrelerde birden fazla aberasyonlu hücre oluşacak ve bu oluşum Poisson dağılımından uzaklaşacaktır. Homojen olmayan ışınlamalarda ve kronik ışınlamalarda disentriklerin hücrelere dağılımlarının Poisson dağılımından sapmaları büyük olacağından Poisson’a uygunluk göstermez. Bu yüzden kontrol doz-cevap eğrileri oluşturulurken ışınlama homojenitesini kontrol etmek için disentriklerin Poisson dağılımına uygunluklarının belirlenmesi gerekir. Elde edilen aberasyon dağılımının (disentrik) Poisson'a uygunluğunu araştırmak için ilk önce her doz noktasına ait varyanslar (σ²) hesaplanır. Daha sonra varyansların aberasyon (disentrik) frekanslarına (Y) oranından elde edilen dağılım oranı (σ²/Y) bulunur. Bu dağılım oranları U testi formülünde yerine konularak her doz noktasına ait U değerleri hesaplanır. U testi sonuçlarının –1,96 ve +1,96 arasında olması dağılımların Poisson’a uygunluğunu ispatlar.
Çoşkun M, Coşkun M. Biological dosimeter and related developments. Cerrahpaşa J Med 2003
#biyolojik #dozimetri #ilgili #gelişmeler