1 KLİNİK ÖRNEKTEN SONUÇ RAPORUNA MANTAR ENFEKSİYONLARINA LABORATUVAR YAKLAŞIMI Antifungal duyarlılık testleri Dr.Ayşe Kalkancı Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,Ankara
2 DİRENÇ İlacın özellikleri Konak faktörleri Mantara ait faktörler
3 DUYARLILIK In vitro duyarlılık In vivo duyarlılık In vivo-in vitro uyumszuluk kuralı
4 90-60 kuralı Enfeksiyona neden olan etken in vitro olarak duyarlı bulunmuş ise, tedaviye % 90 oranında yanıt alınacağını, % 10?? Dirençli bulunmuş ise de % 60 oranında yanıt alınacağını açıklamaktadır. % 40???
5 Antifungal duyarlılık testleri Temel olarak tedavinin takibinde, İki veya daha fazla antifungalin etkinliğinin in vitro olarak belirlenmesi amacı ile, Duyarlı bir popülasyon içinde direnç gelişiminin takip edilmesi için, Yeni bulunmuş bir deneysel ilacın etkinliğinin belirlenmesi amacıyla uygulanmaktadır.
6 Klinik bir Candida kökeni ile antifungal duyarlılık testinin rutin olarak yapılması için, Bu kökenin steril bir vücut bölgesinden izole edilmiş olması ve invaziv bir enfeksiyonun söz konusu olması, C. glabrata gibi en az bir antifungale dirençli olduğu iyi bilinen bir türün izole edilmiş olması, Candida enfeksiyonu sırasında beklenmedik bir tedavi başarısızlığı gelişmesi, Antifungal tedavi sonrası gelişmiş olduğu düşünülen sekonder direncin gösterilmesi koşulları bulunmalıdır.
7 Standardizasyon Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), eski adı ile National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), 1982 yılında kurulmuş Amerika Birleşik Devletleri kökenli bir kuruluştur. European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) ise Avrupa merkezlidir.
8 Yöntemler Sıvı makro ve mikrodilüsyon yöntemleri Agar difüzyon Disk difüzyon E-test Agar dilüsyon yöntemi Akım sitometrisi Moleküler yöntemler
9 Mayaların antifungal duyarlılık testleri Mikrodilüsyon testi CLSI M27-A3 (2008) EUCAST-E.DEF.7.1 (2008) Candida türleri ve Cryptococcus neoformans Trichosporon yok Flukonazol, itrakonazol, vorikonazol ve 5flusitozin
10 Besiyeri L-glutamin eklenmiş Sodyum bikarbonatsız RPMI 1640 sıvı besiyeri ph sı molar morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) ile 7.0 olacak şekilde tamponlanır. CLSI (% 0.2 glukoz) EUCAST (% 2 glukoz)
11 İnokülum %.0.85 lik NaCl içinde 0.5 McFarland (106KOB/ml) CLSI 0,5-2,5 x 103 KOB/ml EUCAST 1-5 x 105 KOB/ml
12 Antifungal ilaçlar Klinikteki preperatlar kullanılmaz Etken madde üretici firmalardan istenebilir Kimyasal madde olarak satın alınabilir Amfoterisin B
13 İlaç dilüsyon aralıkları 5-FC ve flukonazol için 0,12-64 g/ml Diğer ilaçlar için 0,03-16 g/ml Test öncesi ilaç stok dilüsyonları 2 kat yoğunlukta hazırlanır. Flukonazol, kaspofungin ve 5-FC çözeltileri test besiyeri kullanılarak, amfoterisin B, diğer azoller, anidulafungin ve mikafungin çözeltileri çözücü kullanılarak hazırlanmalıdır. Çözücüler Dimetil sülfoksit (DMSO) Polietilen glikol Dimetil formamit
14 Plaklar ve inkübasyon süresi CLSI 96 kuyucuklu, U tabanlı, polipropilen mikroplaklar, EUCAST 96 kuyucuklu, düz tabanlı, polipropilen mikroplaklar CLSI M27-A3 48 saatlik inkübasyon ve görsel değerlendirme EUCAST 24 saatlik inkübasyon ve 530 nm de spektrofotometrik değerlendirme
15 Değerlendirme Amfoterisin B için MİK değeri üremenin olmadığı, ilk berrak kuyucuğun değeridir. 5-FC ve azoller için MİK değeri, üremede belirgin azalmanın görüldüğü, kontrol kuyucuğuna göre en az % 50 daha berrak olan ilk kuyucuğun değeridir.
16 Kalite kontrolü C. parapsilosis ATCC C. krusei ATCC 6258 C. albicans 10231
17 Kısıtlamalar Amfoterisin B için elde edilen in vitro duyarlılık değeri, tedavi cevabını göstermemektedir. Amfotersin B ye duyarlı ve dirençli kökenlerin birbirinden ayrılamadığı bildirilmektedir. Azoller için kısmi inhibisyon ve trailing etkisi MİK değerlerinin okunmasında karışıklığa neden olmaktadır. Ekinokandinler için duyarlılık sınır değerleri belirlenmemiştir. Bu kısıtlamaların engellenmesi için plakların okunmadan önce çalkalanması, Candida cinsi ve ekinokandin grubu antifungaller için 24 saatlik inkübasyon süresinin kullanılması önerilmektedir.
18 Antifungal MİK değeri ( g/ml) Duyarlı Doza bağlı Sınıflandırılama duyarlı Dirençli yan Flukonazol Itrakonazol 0,125 0,25-0,5-1 Vorikonazol Flusitozin CLSI M27-A3 belgesinde Candida için belirtilen duyarlılık ve dirençlilik sınır MİK değerleri
19 Antifungal MİK değeri ( g/ml) Flukonazol Dirençli > 4 Amfoterisin B Dirençli > 4 Itrakonazol Belirli değil Vorikonazol > ( epidemiyolojik direnç sınırı) Posakonazol, Kaspofungin, Belirli değil Anidulafungin, Mikafungin Belirli değil EUCAST belgelerine göre Candida için belirtilen duyarlılık ve dirençlilik sınır değerleri
20 CLSI M27-A3 EUCAST-E-DEF 7.1 Uygulama alanı Candida ve Cryptococcus Candida İnokülum 0.5x x103 CFU/ml 0.5x x105 CFU/ml İnokülum standardizasyonu Spektrofotometrik Hemositometrik Besiyeri RPMI 1640 RPMI % 2 glukoz Buffer MOPS, ph MOPS, ph Mikrodilüsyon plağı U tabanlı Düz tabanlı Değerlendirme Görsel Spektrofotometrik Isı 350C 350C İnkübasyon süresi saat (C. neoformans 72 saat) 24 saat Sınır değer Amfoterisin B için üreme olmayan kuyucuk, azoller, ekinokandinler için % 50 inhibisyon Amfoterisin B için % 90 inhibisyon, azoller, ekinokandinler için % 50 inhibisyon Arikan S. Current status of antifungal susceptibility testing. Med Mycol 2007; 45:
21 Kolorimetrik değerlendirme sıvı mikrodilüsyon yöntemi Sensititre YeastOne FUNGITEST Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts (ASTY)
22 Kolorimetrik mikrodilüsyon Kyokuto Pharmaceutical Industrial, Tokyo, Japonya Mikrodilüsyon (amfoterisin B, 5-FC, flukonazol, mikonazol, itrakonazol, vorikonazol ve mikafungin) Sensititre YeastOne Trek Diagnostic Systems Inc. Westlake, Ohio Flukonazol, itrakonazol ve 5-FC duyarlılığının belirlenmesinde FDA onayı almıştır. Azoller ve 5-FC için 24 saatlik inkübasyon, amfoterisin B için 48 saatlik inkübasyon önerilmektedir.
23 Agar difüzyon yöntemleri Disk difüzyon yöntemi Agar dilüsyon yöntemleri
24 Disk difüzyon yöntemi CLSI M44-A 25 g flukonazol, 1 g vorikonazol, 5 g posakonazol % 2 dekstroz eklenmiş Mueller Hinton agar 0,5 g/ml metilen mavisi
25 Antifungal İnhibisyon zon çapı (mm) Duyarlı Doza bağlı duyarlı Dirençli Flukonazol (25 g) Vorikonazol (1 g) CLSI M44-A belgesinde Candida için belirtilen disk difüzyon testi zonlarının sınır değerleri
26 E test yöntemi Flukonazol, itrakonazol ve 5-FC için FDA onayı E test ile en iyi sonuç % 2 glikoz eklenmiş RPMI agar AB Biodisk Zon içindeki mikrokoloniler, disk difüzyon testinde olduğu gibi, göz ardı edilmelidir.
27 Otomatize sistemler VITEK 2 AST-YS01 Amfoterisin B, flukonazol, 5-FC ve vorikonazol Bu sistemin CLSI ve EUCAST referans yöntemleri ile karşılaştırıldığı çalışmalarda tekrarlanabilirliğinin ve uyumunun yüksek olduğu bildirilmiştir.
28 Yeni seçenekler Akım sitometrisi kullanılması Ergosterol miktarının ölçümü Moleküler yöntemler
29 Moleküler yöntemler ERG11 genindeki mutasyonlar Atım pompalarının fazla ifadelenmesi ATP binding cassette transporters=abct) Majör kolaylaştırıcılar (Major Facilatators=MF). PCR veya Array
30 Kombinasyon testleri Dama tahtası yöntemi Time-kill yöntemi E test sinerji yöntemi
31 KÜFLERİN ANTİFUNGAL DUYARLILIK TESTLERİ Sıvı makro ve mikrodilüsyon yöntemleri Agar difüzyon yöntemleri Disk difüzyon E test Agar dilüsyon yöntemleri
32 Sıvı dilüsyon yöntemleri CLSI M38-A2 EUCAST-E-DEF.9.1 Aspergillus, Fusarium, Rhizopus türleri ile Pseudallescheria boydii ve Sporothrix schenckii Amfoterisin B, flusitozin, flukonazol, ketokonazol, itrakonazol, posakonazol, ravukonazol, vorikonazol
33 CLSI M38-A2 RPMI besiyeri İlaçlar aynı İnokülum!!! Patates dekstroz agar 7 günlük koloniler % 0.85 lik NaCl den 1 ml dökülür ve koloniler üzerinde hafif çalkalama hareketleri yapılarak konidyumlar toplanır. 0,4x104 5x104 KOB/ml
34 CLSI M38-A2 EUCAST-E-DEF 9.1 Uygulama alanı Konidya ve spor oluşturan tüm küf mantarları Aspergillus türleri ve küfler İnokülum 0.4x104-5x104 CFU/ml 1x x105 CFU/ml İnokülum standardizasyonu Spektrofotometrik Hemositometrik Besiyeri RPMI 1640 RPMI %2 glukoz Buffer MOPS, ph MOPS, ph Mikrodilüsyon plağı U tabanlı Düz tabanlı Isı 350C 350C 20C İnkübasyon süresi saat 48 saat Sınır değer Azol ve polienler için üreme olmayan kuyucuk MİK Ekinokandinler için MEK Azol ve polienler için üreme olmayan kuyucuk MİK Ekinokandinler için MEK Perkhofer S, et al. In vitro susceptibility testing in fungi: what is its role in clinical practice? Curr Infect Dis Rep 2010; 12:
35 Agar difüzyon yöntemleri Disk difüzyon yöntemi E test yöntemi Agar dilüsyon yöntemleri Yeni seçenekler
36 Koç AN. ANKEM Derg 2012; 26 (Ek 2) :
37 Duyarlılık Testi Sonuçları İle Tedavi Cevabı Arasındaki Uyum Sorunu In vitro olarak test edilen antifungale duyarlı bulunan bir köken ile oluşan enfeksiyonun o antifungal ile tedavi edilme olasılığı %100 değildir kuralı
38 DİRENÇ İlacın özellikleri Konak faktörleri Mantara ait faktörler
39 Sınır değerler ( g/ml) Antifungal Duyarlı Doza bağlı Dirençli Yorum duyarlı Flukonazol kuralı geçerlidir. Kökenlerin %90 ı duyarlıdır. Itrakonazol 0,12 0,25-0, kuralı geçerlidir. Kökenlerin %96 sı duyarlıdır. Flusitozin kuralı geçerlidir. Kökenlerin %95 i duyarlıdır. Bu tablo Anaissie EJ, McGinnis MR, Pfaller MA (Ed). Clinical Mycology. 2nd ed. 2009; sayfa 72 den alınmıştır.
40 Sınır değerler ( g/ml) Antifungal Duyarlı Doza bağlı Dirençli Yorum duyarlı Vorikonazol kuralı geçerlidir. Kökenlerin %98 i duyarlıdır. Anidulafungin 2 Belirlenmemiş (B) B Kökenlerin %99 u duyarlıdır. Kaspofungin 2 B B Kökenlerin %99 u duyarlıdır. Bu tablo Anaissie EJ, McGinnis MR, Pfaller MA (Ed). Clinical Mycology. 2nd ed. 2009; sayfa 72 den alınmıştır.
41 Sınır değerler ( g/ml) Antifungal Duyarlı Doza bağlı Dirençli Yorum duyarlı Mikafungin 2 B B Kökenlerin %100 ü duyarlıdır. Posakonazol B B B Kökenlerin %98 i duyarlıdır. Amfoterisin B 1 >1 E test kullan Bu tablo Anaissie EJ, McGinnis MR, Pfaller MA (Ed). Clinical Mycology. 2nd ed. 2009; sayfa 72 den alınmıştır.
42 Sonuç ve öneriler Rutinde yapılması gerekli kökenler için hazır olunmalıdır Referans yöntem CLSI & EUCAST Her merkezin kendi direnç durumunu bilmesi gerekir Klinisyen sonuçların yorumu konusunda bilgilendirilmelidir