Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex | Protocol (Translated to Turkish)
Serebral kortekse bir gelişme genlerin işlevine hızlı bir değerlendirme yapmak için, ilgili yöntemler açıklanmaktadır
Serebral korteks yüksek bilişsel fonksiyonları yönlendirir. Bu altı tabakalı yapı son doğan nöronlar beyin 1 yüzeyine doğru ilk doğan nöronlar geçen geçiş sırasında ilk doğan nöronlar ventrikül yakın kalır olan bir içten-birinci dış-son şekilde, oluşturulur. Nöronal migrasyon 2 ek olarak, normal kortikal işlev için bir anahtar işlemi nöronal morfojenezini 3 arasında bir düzenlemedir. Nöronal morfogenez primer kültürlerinde in vitro okudu olabilir iken, bu süreçleri doku ortamlarda nasıl düzenlendiği öğrenilecek çok şey var.
Biz serebral korteks 4,6 organotipik dilimler halinde nöronal migrasyon ve / veya morfonogenezi analiz teknikleri anlatıyoruz. Bir pSilencer modifiye vektör çift zincirli RNA firkete süren bir U6 organizatörü ve b tahrik GFP protein kodlar ayrı bir ifade kaseti hem de içerir kullanılırya CMV organizatörü 7-9. Bizim yaklaşımımız aday genler belirli devirme üzerine akson uzantısı kusurların hızlı değerlendirme sağlar ve başarılı bir akson uzantısı 8 düzenleyiciler için bir ekran kullanılmıştır. Hücrelerin sadece bir alt kümesini RNAi yapıları ifade Çünkü, organotipik dilim potansiyeli fenotipleri bir mozaik analizi için izin verir. Bu analizin in vivo ortamda bir yanında yaklaşık yapılır, çünkü Dahası, bu bilinmeyen kortikal fonksiyonunun genleri için düşük maliyetli ve transjenik hayvanların ya da boşaltma üretimi için hızlı bir alternatiftir. Son olarak, in vivo elektroporasyon teknolojisi ile karşılaştırıldığında, ex vivo elektroporasyon deneylerin başarıya yetkin cerrahi beceri geliştirme bağımlı değildir ve kısa bir eğitim süresi ve beceri ile yapılabilir.
1. (Değil video) Kültür ve Medya Çözümleri hazırlanması
1x HBSS, 2,5 mM Hepes (pH7.4), 30 mM D-glukoz, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO 4 ve 4 mM NaHCO 3 içeren Complete Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS), 1 litre hazırlayın. Çift distile su (GKD 2 O) ekleyin. 4 at 0.2-mikron filtre ve mağaza ° C ile sterilize filtreleme
Bazal ortam Eagle Medium, 35 mL kültür ortamı kullanılarak dilim, Complete HBSS 12.9 mL, 20 mM D-glikoz (1 M çözeltiden 1.35 mL), 1 mM Glutamax (200 mM a çözeltisi 0.25 mL), 0.5 ml penisilin hazırlamak -streptomisin 100x stok. Bir 0.2-mikron filtre ile sterilize filtre uygulayın, sonra% 5 oranında bir son konsantrasyon serum ısı ile inaktive edilmiş at ekleyin.
1 mg / distile deiyonize su ile Laminin mL stok çözelti yaparak Laminin çalışma çözeltisi hazırlayın. -80 Az 0,5 ml Eppendorf tüplerinde 100 mcL alikotları hazırlayın ve dondurma ° C
Böylece poli-L-lizin çalışma hazırlamakbir 1 mg / mL stok solüsyonu yapmak için poli-L-lizin 5 mg steril H2O 5 mL ekleyerek Direkt Ekspres. -20 ° C'de 1 ml hacimde ve dondurma hazırlayın
Steril su ile 12 ml nihai hacme poli-L-lizin, 1 ml ve laminin 100 uL seyreltilmesi ile kaplama çözeltisi hazırlayın. Her defasında taze bu çözüm olun.
2. Organotipik Dilim Uçlar (değil video) hazırlanması
Tek bir kültür insert başına iyi steril forseps kullanarak iki adet altı-iyi plakaları hazırlayın. Kültür ekler altında steril GKD 2 O 2 mL ekleyin.
Ponksiyonu ile membran bakımı olmayan alarak membran üst kaplama solüsyonu 1 ml ilave edilir. 37 nemlendirilmiş bir inkübatörde gece inkübe ° C ve% 5 CO 2.
Kaplama ortamı çıkarın ve steril H 2 0 üç kez membran yıkayın. Kullanmadan önce kuru ekler edelim. ° C inkübatör 37 kesit kültürü, orta ve yerin 1.8 mL ekleyin. Parafilm ile kullanılmayan tabak sarınve 4 haftaya kadar 4 ° C'de saklayın.
3. (Değil video) Elektroporasyon için hazırlanıyor
Elektroporasyon için RNAi yapıları hazırlayın. Çift dallı RNA firkete ekler pSilencer vektörünün içine klonlandı. Plazmid içerir: 1) çift bükümlü RNA'nın kuşak süren bir U6 promotör, ve 2), bir GFP ifade kaseti CMV promotör 8,9 tarafından tahrik. Bu plazmid önceden Konishi ve arkadaşları, 9 ve diğerleri 7,8 tarafından tarif edilmiştir. Plazmidler, bir Qiagen Maxi-hazırlık kiti kullanılarak saflaştırıldı, ve 1 mg / mL 'lik bir konsantrasyonda kullanılır.
Enjekte ederken DNA canlandırmak için,% 0.5 'lik hızlı yeşil boya solüsyonu hazırlamak ve (genellikle hızlı yeşil 1 uL sahip DNA 20 ul) enjekte edilecek olan DNA ile 01:20 olarak kullanılabilir. Arta kalan DNA'nın hızlı yeşil bir boya karışımı bir hafta boyunca -20 ° C'de saklanabilir.
Temiz disseksiyon alanında, dissecting araçları ve% 70 etanol ile vibratome gemi. O buz gibi soğuk olacak şekilde tam HBSS soğutun. Hızlı soğutma için bir miktar su ile vibratome içinde etrafına buz paketleyip Chill vibratome gemi. Tam HBSS kullanılarak% 3 düşük erime noktası agaroz hazırlayın. 1 dakikalık mikrodalga. Kaynar kaçının. Kullanımı kadar 42 ° C su banyosunda tutun.
Elektroporasyon parametreleri aşağıdaki gibi ayarlanır. Bir E15 embriyo kullanımı 35 V için 5 bakliyat, 100 ms uzunluğu, darbeler arasında 900 ms aralığı. Yaşlı hayvanlar için elektroporasyon sağlamak için, 50 V yüksek voltaj kadar kullanmak veya 8 darbeleri darbe sayısını artırmak. Genç hayvanlarda doku zarar vermemek için, 25 ya da daha az darbeler veya en fazla 2 bakliyat ve düşük voltaj kadar kullanmak V. Bu parametreler çeşitlidir ve ampirik hayvanın yaşına bağlı olarak belirlenebilir.
4. Diseksiyon ve Elektroporasyon (video)
Hamile bir kadın euthanizing sonra, buz gibi tam HBSS içine embriyo dışarı incelemek. Kebireysel plasental keseler her embriyo ep.
Embriyo dışarı inceleyin ve ilk vertebra sonra kafasını kesti. Buz gibi tam HBSS tutun.
Enjeksiyon için, petri üstüne parafilm parçasının üzerine kafa yerleştirin. Kortikal veziküller her iki lateral ventrikül doldurmak için üçüncü ventrikül ile hızlı yeşil boya karışımı: Özel kullanarak Hamilton enjektörü DNA 8 ila yaklaşık 6 uL enjekte (Tablo I bakınız) yaptı. Alternatif olarak, enjeksiyon her lateral ventrikül doğrudan yapılabilir.
Ex vivo elektroporasyon için BTX-cımbız platin elektrot kullanın. Eğer dorsal korteks için kafa yani üst electroporate istediğiniz korteksin tarafına doğru pozitif elektrot yerleştirin.
Elektroporasyon sonra diseksiyon önce en az 5 dakika buz üzerinde kafaları inkübe.
Buz HBSSby baş tarafında küçük bir kesi yapmak ve baş tarafı kapalı cilt soyma beyinde parçalara ayır. Ile, bir sonrakiyavaşça sıyırın ince forseps beyinden pia. Kortekse zarar vermemeye özen, kafatası sağlam beyin çıkarın.
5.. (Video) gömme ve Electroporated korteksleri Kesit
Buz üzerine yerleştirilmiş büyük bir kalıp içine% 3 düşük erime noktası agaroz aktarın. Kalıbın tabanındaki hızlı kalıbın alt aşağı batmasını beyinleri önleyecek olan katılaşmaya başlayacaktır. Nazikçe, ince forseps bir Kimwipe veya filtre kağıdı ile aşırı tamponu çıkardıktan sonra tek tek ile beyni aktarın. Agaroz ve beyin dokusu arasında maksimum arayüz sağlamak için kalıbın içerisine girdap beyinlerine 10 uL pipet ucu kullanın.
Tüm beyinleri sağlamak için yönlendirmek beyinleri aynı yönde ve agaroz yaklaşık aynı seviyededir. Agaroz yaklaşık 5 dakika süreyle katılaşmaya edelim. Olfaktör ampuller ayakta böylece agaroz blokları eklemek yapıştırma (deli yapıştırıcı) kullanın. Bloklar tutturulur hemen sonra, i eklemece soğuk HBSS ve emin tek tek dilimler için agaroz kırpmak her beyin için elde edilmiştir.
, Dilim bloklar düşük hızlı (yarı maksimum hakkında) için vibratome hızına ayarlayın ve en yüksek ayarda bıçak titreşim frekansı ayarlamak için. 250 mikron kalınlığında koronal dilimleri oluşturun. Boynu bükük ince spatula ile dilim almak ve ince bir fırça veya forseps ile doku kuyu aktarabilirsiniz.
Doku kültürü kaputu, kaplamalı uçlar içine dilimlerini aktarabilir. Transferi kolaylaştırmak için her ekleme için kesit kültürü medya 500 uL ekleyin. En fazla 5 dilimleri eklemek için başına yerleştirilebilir. Dilimleri üst fazla olan ortamı çıkarın ve 37 ° C'de nemli inkübatörde inkübe.
6. Kültür ve Organotipik Dilimler Analizi (video)
Sağlıklı dilimler korumak amacıyla, taze ortam ortam her yarım değiştirerek membranı altında en az iki günde ilave edilmelidir.
D sonra dilimleri analiz etmek içinkültür esired gün, membran dilimleri düzeltin. ° C üç kez 10 dakika, her sefer için 37 1x fosfat salin tamponu (PBS) ile yıkayın. Sonra, 4 ° C'de ya da oda sıcaklığında 1 saat için gece boyunca 4% paraformaldehit (PFA) ile sabitlemek.
Dilimler, farklı hücresel belirteçleri ile analiz veya electroporated ve non-electroporated hücreleri canlandırmak için tek başına Hoechst ile boyanmış olabilir. Geçirgenliği ve% 10 serum keçi, yumuşak çalkalama ile 1x PBS içinde% 0.1 Triton ile oda sıcaklığında 2 saat boyunca dilimleri bloke eder.
Oda sıcaklığında 1 saat boyunca Hoechst ile lekesi, her seferinde nazik çalkalanarak 1x 10 dakika PBS ile 3 defa yıkanır.
Dilimleri bir neşter ile membran kesilerek monte ve buzlu cam dilim içeren membran aktarmak için güzel bir forseps kullanmak için bir su haznesi içinde kayar. Kadar 5 dilim cam slayt başına yerleştirilebilir. Fazla suyu uzaklaştırınız, ve her beyin dilime Flourmount bir damla ekleyin. Yavaşça beyin dilimleri üstünde coverslip yerleştirin ve bir kaldırmay hava kabarcıklar. Bir konfokal mikroskop kullanılarak dilimleri analiz edin.
7. Organotipik Dilimler Alternatif Parafin Gömme (değil video)
Organik tip dilimler da bu amaçla, daha ince bir morfolojik analizi için parafin için gömülebilir organotipik dilim içeren membran PFA yukarıda açıklandığı gibi% 4 sabitlenebilir.
Sabit bir dilim% 1 agaroz (37 ° C ila önceden ısıtılmış) içine gömülü, ve 30 dakika süreyle buz içinde katılaştırılmış edilir. Agaroz bloklar daha sonra 30 dakika süreyle 4 ° C'de% 4 PFA post-tespit edilebilir.
Organotipik dilim içeren agaroz blok sonra parafine gömüldü ve daha önce açıklandığı gibi 10 immünfloresan için işlenecektir.
Organotipik dilimlerin murin korteks ve kültür elektroporasyon şematik bir temsilini Şekil 1 'de gösterilmiştir. Bu yöntem, rapi için yararlı bir stratejiNöronal gelişimi 11 yer genlerin işlevine d değerlendirmesi. DNA electroporated miktarını ve elektroporasyon azından embriyonik aşamada bağlı olarak, transfeksiyon verim olarak değişecektir. Dilimler en az 8 saat sonrası elektroporasyon ve hücrelerin kültür nörojenik olaylar (proliferasyon, göç, ve erken nöronal farklılaşma) normal sırasını uğrayacaktır GFP ifade başlayacaktır. Şekil 2 pSilencer-GFP bir kontrol ifade edilen bir electroporated beyin kesit gösterir vektör ve bir nöronal ataları, göç nöronlar ve dilim farklı nöronların gözlemleyebilirsiniz. Bu membranlar iyi bir ortam hava arayüzü tutulur ve kültür alanında en az 5 gün öncesine kadar kullanılabileceği gibi Organotipik dilim sürece kendi morfolojisi devam edecektir.
Şekil 1.. Ex vivo elektroporasyon ve organotipik dilim İllüstrasyonkültür testi. E14.5 embriyosu çıkarılmış, ve ayrı ayrı enjeksiyon görselleştirmek için hızlı yeşil boya ile karıştırılır DNA ile enjekte edilir. Lateral ventrikül doldurmak için resimde veya üçüncü ventrikül de tasvir edildiği gibi DNA lateral ventrikül hem enjekte edilebilir. Enjeksiyon sonrası, beyin beynin istenilen tarafında pozitif elektrot yerleştirerek, bir kare dalga elektroporatörün ile electroporated edilir. Beyinler% 3 düşük erime noktası agaroz ve vibratome kullanarak kesitli gömülür. 250 mikron beyin kesitleri 0,4 mikron ekler yerleştirilir ve bir hafta kadar kültürlenmiştir. GFP 8 saat sonra transfeksiyon sonrasında görülebilir.
Şekil 2. Electroporated beyin kesitleri analizi. Electroporated beyin kesitleri Hoescht için boyandı. Dorsal korteks ventriküler zon (vz) at electroporated nöronal ataları gösterir. Ulna dia nöronlarıncal plakası (cp) marjinal zon (mz) tarafından sınırlandırılır. Beyaz oklar göç nöronlar göstermektedir. Bu durumda, beyin E15.5 enjekte edildi ve bir pSilencer GFP kontrol vektörü ile electroporated. Bölümlerde 4 gün elektroporasyon sonra kortikal eksplantları temsil eder. Ölçek çubuğu 100 mikron.
Düşük transfeksiyon verim: en az 1 mg / ml için kullanılan DNA konsantrasyonu ayarlayın. Gerekiyorsa bir endo-free Quiagen kiti DNA arındırmak için ise her zaman bir maxi hazırlık çok temiz DNA kullanın.
Bir istenenden daha farklı bir beyin bölgesinde transfekte edilmiş hücrelerin: elektrotlar electroporated edilecek beyin tarafına doğru pozitif elektrot pozisyonu ile düzgün bir şekilde konumlandırılır dikkat ediniz.
Her gün Değişim medya ve dilimler medya yüzen kalmamalarını sağlamak: Organotipik dilimleri morfolojisi kaybetmek
Onlar vi kesiliyorlar olarak Dilimleri agaroz dökülmekbratome: düşük erime noktası agaroz in beyinleri gömerken iyi bir hale arayüz olmasına dikkat ediniz.
Çift sarmallı RNA hairpins 8 ve 4 çok özel avantajlar sağlar organotipik dilim kültürü kodlayan plazmidlerin ex vivo elektroporasyon içeren bu yöntemleri. İlk olarak, bu yöntemler RNAi-türevi fenotip hızlı bir şekilde değerlendirilmesi için olanak sağlar. Çift RNA firkete tahrik U6 promot.örünü içerir, aynı pSilencer vektör içinde bir ifade kaseti kodlama GFP dahil edilmesi RNAi vektörü ile electroporated hücrelerinin hızlı bir tanımlama ve karakterizasyonu için olanak sağlar. Zaman-verim ek olarak, bu yöntemler birkaç eleme hatları üretimi ile karşılaştırıldığında oldukça maliyet-etkilidir. İkincisi, hayvan ve elektroporasyon başarı hayatta kalmasını sağlamak için uzun eğitim ve beceri geliştirme gerektirir hayatta elektroporasyon teknolojisi 12 ile karşılaştırıldığında, yöntemleri burada açıklanan kısa bir eğitim süresi ve beceri ile yapılabilir. In vivo yaşam surgeries de hayvan (anne ve yavru) morbidite ile ilişkili olabilir bir temel başarısızlık oranı ile saplanmış durumda. Bu hayvanlar sıklıkla makul yetenekli personel ve / veya hayvan tesis gelen veteriner hekimler tarafından değerlendirilmesi gerekir. Onlar kadar in vitro 5 gün veya daha fazla kültüre, çünkü, bizi nöronal proliferasyon, hücre kaderinin belirlenmesinde, nöronal migrasyon ve nöronal olgunlaşma erken dönemlerinde (akson uzantısı) ile ilgili soruları geniş bir yelpazeye hitap Üçüncü sağlar. Kültür çalışıyoruz çünkü Dördüncü, biz de tarif nörogelişimsel mekanizmalarında büyüme faktörleri ve ilaç ajanlarının rolü test etmek için dışsal faktörler ekleyebilirsiniz. Bunun tam elektrotlar yönlendirilmesi ile beyinleri belirli bölgelerde hedefleme sağlar çünkü Beşinci olarak, elektroporasyon yaklaşımı ex vivo gen tabancası yaklaşımın tercih edilir. Son olarak, organotipik dilimlerin viral transdüksiyonu ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir elektroporasyon yaklaşım sağlar traBirincil hücre nsfection verimliliği.
Bu yöntemler, birkaç sınırlaması var. Dilim tekniği, uzun kültür dönemlerinden sürdürmek için modifiye sürece, bu yöntemler daha sonra ortaya sinaptogenez veya gelişimsel olayları değerlendirmek için ideal olmayabilir. Ek bir sınırlandırma sonuçlarının tekrarlanabilirliği elektrot yerleştirilmesi çok bağımlı olduğunu olabilir. Bazı pratik sonuçların tekrarlanabilirliği artar aynı beyin bölgesinin elektroporasyon sağlamak için gereklidir. Son olarak, hava / sıvı arayüzü bakım sağlıklı dilim sağlamak da çok önemlidir. Yukarıda açıklandığı gibi, bu becerileri kolayca Jove okuyucular tarafından alınan ve bu yöntemlerin gücünü önemli ölçüde uygun uygulama verilen sınırlamalar baskın olduğu tahmin edilebilir. Özet olarak, omurgalı nöro genler, çok sayıda tarafından kontrol edilir. Özellikle Nöronal morfonogenezi çok ilginç ve önemli bir konudur. Bu yaklaşım sağlarnörogelişimsel sırasında tarama gen fonksiyonu için son derece etkili bir yöntem ve deneysel amaçlarla çok geniş bir yelpazede hizmet verebilir.
Biz pSil-GFP yapı, Şekil 1 resimde Dr Alper Uzun ve konfokal mikroskopi için Leduc biyogörüntüleme kolaylığı sağlanması için Dr Şirin Bonni teşekkür ederim. EMM Burroughs Wellcome Fonu, bir NARSAD Genç Araştırmacılar Ödülü ve NIH NCRR Cobre P20 RR018728-01 Tıp Bilim Kariyer Ödülü tarafından desteklenmektedir. SBL NIH NCRR Cobre P20 RR018728-01 tarafından desteklenen ve PHS NRSA 5T32MH019118-20 destek aldı.