b'\n_START_ARTICLE_\nEndotoksin\n_START_PARAGRAPH_\nEndotoksini so toksi\xc4\x8dne snovi, ki so sestavina celi\xc4\x8dne stene gramnegativnih bakterij in so iz lipopolisaharidov. Endotoksini se zadr\xc5\xbeujejo v bakteriji in se sprostijo v okolje le v primeru uni\xc4\x8denja celi\xc4\x8dne stene bakterije. V manj\xc5\xa1ih koli\xc4\x8dinah pa se spro\xc5\xa1\xc4\x8dajo tudi med rastjo in delitvijo bakterij. Za biolo\xc5\xa1ki odziv telesa na endotoksin je odgovoren del lipopolisaharida, imenovan lipid A._NEWLINE_Vpliv endotoksinov na vreten\xc4\x8darje je odvisen od reakcije s specifi\xc4\x8dnimi receptorji na imunskih celicah, kot so: monociti, makrofagi, dendriti\xc4\x8dne celice in druge.\n_START_SECTION_\nZgodovina\n_START_PARAGRAPH_\nEndotoksin in njegovo biolo\xc5\xa1ko aktivnost je prvi opisal Richard Friderich Johannes Pfeiffer leta 1892, kot temperaturno stabilen material, izoliran iz bakterije Vibrio cholerae, ki je pri morskih pra\xc5\xa1i\xc4\x8dkih izzvala toksi\xc4\x8dno reakcijo. Izpostavil je tudi bistveno razliko od na temperaturo ob\xc4\x8dutljivih eksotoksinov, strupov, ki jih izlo\xc4\x8dajo bakterije.\n_START_SECTION_\nGram negativne bakterije\n_START_PARAGRAPH_\nEndotoksini so veliki, temperaturno stabilni lipopolisaharidi (LPS), ki so glavni gradnik celi\xc4\x8dne stene Gram negativnih bakterij in so odgovorni za nastanek \xc5\xa1tevilnih bolezni. V raztopinah imajo negativni naboj ter se zdru\xc5\xbeujejo v skupke. So hidrofobni in se adsorbirajo na hidrofobne povr\xc5\xa1ine. Kljub temu, da termin endotoksin in LPS uporabljamo izmeni\xc4\x8dno, pa je potrebno opozoriti, da niso vsi bakterijski LPS endotoksini, prav tako niso vsi endotoksini (\xc5\xa1e posebej ekstakti kloroocetne kisline)LPS._NEWLINE_LPS predstavljajo 45% komponent zunanje membrane in se med bakterijami razlikujejo. Vsem LPS  je skupna osnovna zgradba: lipid A na katerega je kovalentno vezana oligosaharidna sredica in polisaharidni O-antigen. Lipid A je najbolj ohranjen del LPS molekule in je poleg tega, da ohranja strukturo molekule, odgovoren za biolo\xc5\xa1ko aktivnost LPS. Ravno lipid A je tisti del molekule, ki se med bakterijami razlikuje in posledi\xc4\x8dno se razlikuje tudi biolo\xc5\xa1ka aktivnost LPS med bakterijami. Oligosaharidna sredica je sestavvljena iz 6-12 razvejanih sladkorjev in je odgovorna za strukturo in funkcionalno integriteto zunanje membrane. O-antigen imenujemo tudi O-specifi\xc4\x8dna veriga.. Razlog za to je, da se ta del LPS molekule nahaja na povr\xc5\xa1ju in je tako najbolj neposredno v stiku z gostiteljem. O-specifi\xc4\x8dnih verig ne tvorijo vse Gram- negativne bakterije. Ali bakterija ima O-specifi\xc4\x8dno verigo lahko sklepamo \xc5\xbee po videzu. Bakterije, ki imajo O-specifi\xc4\x8dno verigo tvorijo gladke kolonije, ostale pa  hrapavo kolonijo. LPS so veliki okoli 10kDa, tvorijo pa lahko agregate, ki dose\xc5\xbeejo velikost tudi do 1000kDa. _NEWLINE_LPS se tekom \xc5\xbeivljenjskega cikla bakterije spro\xc5\xa1\xc4\x8da v okolico, vendar v zelo majhnih koli\xc4\x8dinah. Iz celice se sprosti \xc5\xa1ele po smrti bakterije. Pomembna lastnost je toplotna obstojnost. Razpade \xc5\xa1ele pri 180 \xc2\xb0C._NEWLINE_\xc4\x8clovek je sposoben tvorbe  protiteles proti endotoksinom, vendar le proti njegovim polisaharidnim verigam. S protitelesi se zavarujemo pred imunoaktivacijo sevno-specifi\xc4\x8dnih bakterij oz. njihovih specifi\xc4\x8dnih endotoksinov. Poskus na \xc4\x8dloveku je pokazal, da \xc5\xbee majhne koli\xc4\x8dine endotoksinov lahko privedejo do povi\xc5\xa1ane temperature, zmanj\xc5\xa1anega krvnega tlaka, vnetja in koagulacije. Endotoksini so glavni krivci za pojav bolezenskih znakov pri oku\xc5\xbebi z Gram negativnimi bakterijami, kot je npr. Neisseria meningitides. E.coli vsebuje okoli 2 milijona LPS molekul na celico, ki se nahajajo na zunanji strani celi\xc4\x8dne membrane. Na imunski sistem gostitelja za\xc4\x8dno delovati \xc5\xa1ele po tem, ko se sprostijo iz membrane. Spro\xc5\xa1\xc4\x8danje LPS iz celic pa je povezano s celi\xc4\x8dno delitvijo, smrtjo in lizo celic.\n_START_SECTION_\nGram pozitivne bakterije\n_START_PARAGRAPH_\n\xc5\xa0tudije iz leta 1979 ka\xc5\xbeejo na produkcijo substanc, podobnih endotoksinom, katerih produkcijski organizem je Listeria monocytogenes. Prav tako neko vrsto toksinov, imenovanih delta-toksini, producira tudi bakterija Bacillus thuringiensis. Delta toksini so proteini, ki se nahajajo v inkluzijskih telescih, tik ob endosporah in so toksi\xc4\x8dni za larve ter insekte, za \xc4\x8dloveka pa so nenevarni. _NEWLINE_S \xc5\xa1tevilnimi \xc5\xa1tudijami so ovrgli predvidevanja o produkciji endotoksinov pri Gram pozitivnih bakterijah\n_START_SECTION_\nMehanizem\n_START_PARAGRAPH_\nEndotoksini lahko spro\xc5\xbeijo \xc5\xa1tevilne biolo\xc5\xa1ke odzive in vivo: povi\xc5\xa1ano telesno temperaturo, povi\xc5\xa1ano \xc5\xa1tevilo levkocitov v krvi, intravaskularne koagulacije, nekroze, hipotenzijo, \xc5\xa1ok, smrt. Kak\xc5\xa1na bo aktivnost LPS molekule pa je odvisno od same strukture molekule. Ve\xc4\x8dino teh odzivov spro\xc5\xbei regija lipida A na LPS molekuli. Imunski sistem se namre\xc4\x8d spro\xc5\xbei, ko se LPS odcepi od membrane in je lipid A izpostavljen celicam imunskega sistema. Nekatere Gram negativne bakterije lahko spro\xc5\xa1\xc4\x8dajo endotoksine tudi, \xc4\x8de ne pride do lize celic. Vzrok za to so lahko okoljski dejavniki ali posledica delovanja antibiotikov, vklju\xc4\x8dno z inhibitorji sinteze proteinov. Izlo\xc4\x8danje endotoksinov, zaradi delovanja antibiotikov ni omejeno le na antibiotike, ki uni\xc4\x8dijejo celi\xc4\x8dno steno, kot so npr. beta-laktamski antibiotiki. Nekateri inhibitorji sinteze proteinov, kot je kloramfenikol, vzpodbujajo izlo\xc4\x8danje LPS, tako da vplivajo na samo produkcijo LPS. Tudi produkcija LPS molekul se med bakterijami razlikuje. Gram negativne bakterije, ki tvorijo gladke kolonije producirajo 10 krat manj LPS kot tiste, ki imajo hrapave kolonije._NEWLINE_Imunske celice na svoji povr\xc5\xa1ini izra\xc5\xbeajo receptorski kompleks TLR4/MD-2 (Toll-like receptor 4, myeloid differentiation-2), ki omogo\xc4\x8da prepoznavanje endotoksinov in posledi\xc4\x8dno uravnavanje celi\xc4\x8dnega odziva. TLR4 je membranski glikoprotein in je odgovoren za prenos signala preko membrane v celico, vendar sam direktno ne ve\xc5\xbee LPS. Za prepoznavanje LPS je odgovoren koreceptorski protein MD-2, ki je vezan na izvenceli\xc4\x8dno domeno in je nujno potreben za aktivacijo celic. Signaliziranje LPS torej poteka preko TLR4/MD-2. Ko se TLR4 aktivira pride do znotrajceli\xc4\x8dne aktivacije, ki spro\xc5\xbei imunski odziv (sintezo razli\xc4\x8dnih vnetnih posrednikov, med drugim interlevkina 1\xce\xb2 (IL-1\xce\xb2), interlevkina 6 (IL-6) in tumorje nekrotizirajo\xc4\x8dega faktorja \xce\xb1 (TNF-\xce\xb1). Poleg citokinov, pa kot odziv na LPS molekule, makrofagi za\xc4\x8dno izlo\xc4\x8dati razli\xc4\x8dne encime in prostaglandine._NEWLINE_Za aktivacijo monocitov in makrofagov je dovolj \xc5\xbee majhna koli\xc4\x8dnina LPS. Odziv na LPS pri ljudeh je mo\xc4\x8d opaziti \xc5\xbee pri vbrizganju 4ng endotoksinov na kilogram telesne te\xc5\xbee. S tretiranjem monocitov in makrofagov z nizkimi koncentracijami LPS lahko dose\xc5\xbeemo toleranco na endotoksine. To pomeni, da se ob naslednjem stiku z LPS, imunski odgovor celic ne bo spro\xc5\xbeil oz. bo minimalen.\n_START_SECTION_\nEndotoksemija\n_START_PARAGRAPH_\nPrisotnost endotoksinov v krvi imenujemo endotoksemija. \xc4\x8ce to traja dalj \xc4\x8dasa lahko pride do septi\xc4\x8dnega \xc5\xa1oka, ki je smrten v 20\xe2\x80\x9350\xc2\xa0%. Vendar pa izpostavljenost majhnim koli\xc4\x8dinam endotoksinov prina\xc5\xa1a organizmu tudi koristi, saj utrjuje imunski sistem pri prepre\xc4\x8devanju oku\xc5\xbeb in nastanku novotvorb.\n_START_SECTION_\nLAL test\n_START_PARAGRAPH_\nZnanih je ve\xc4\x8d kot 20 testov za detekcijo endotoksinov.Eden izmed njih je LAL test (Limulus Amebocyte Lysate). Prednosti tega testa so predvsem: ob\xc4\x8dutljivost, zmo\xc5\xbenost kvantifikacije, reaktivnost z biolo\xc5\xa1ko komponento lipidom A in enostavnost. Z LAL testom lahko zaznamo \xc5\xbee zelo majhne koli\xc4\x8dine LPS, za katere pa vemo, da lahko pri \xc4\x8dloveku povzro\xc4\x8dijo velike te\xc5\xbeave._NEWLINE_Leta 1956 je Frederick Bang odkril, da krvne celice imenovane amebocite, pridobljene iz podkvaste rakovice (Limulus polyphemus), vsebujejo strjevalni protein, ki napade endotoksine Gram negativnih bakterij.  Raziskave so pokazale, da je ekstrakt amebocit ekstremno ob\xc4\x8dutljiv na endotoksine. Limus amebocitni ekstrakt je tako predstavljal potencialni biolo\xc5\xa1ki reagent, ki bi ga lahko uporabili kot diagnosti\xc4\x8dno orodje za detekcijo in kvantifikacijo bakterijskih endotoksinov. 1983 je FDA odobrila LAL test, kot standardni test za detekcijo endotoksinov.  _NEWLINE_Danes je poznanih \xc5\xbee ve\xc4\x8d metod/analiz LAL testa: Gel clot metoda, turbidimetri\xc4\x8dna kineti\xc4\x8dna metoda, kromogena kineti\xc4\x8dna metoda. Izmed katerih pa se najpogosteje izvajata dve: gel clot analiza in kromatogena kineti\xc4\x8dna analiza. _NEWLINE_Za kromatogeno kineti\xc4\x8dno analizo se uporablja modificiran  Limus amebocitni ekstrakt in sinteti\xc4\x8dni kromogen substrat. Test je kvantitativen, saj je intenziteta barve proporcionalna vsebnosti endotoksinov v vzorcu. Test izvedemo s pomo\xc4\x8djo \xc4\x8ditalca mikrotiterskih plo\xc5\xa1\xc4\x8d. Vzorcu dodamo Limus amebocitni ekstrakt in substrat, ter inkubiramo 60 min. Po inkubaciji preverimo obarvanost vzorca. \xc4\x8ce se vzorci obarvajo, to ka\xc5\xbee na prisotnost endotoksinov. Obarvanost lahko pomerimo s spektrofotometrom. Pozitivne lastnosti testa: hiter, zelo ob\xc4\x8dutljiv, omogo\xc4\x8da kvantifikacijo, potrebna majhna koli\xc4\x8dina vzorca. Slabosti testa: \xc4\x8de bi na\xc5\xa1 vzorec vseboval snovi, ki bi reagirale s substratom, bi dobili la\xc5\xbeno pozitivne rezultate. _NEWLINE_Gel clot analiza omogo\xc4\x8da detekcijo endotoksinov in temelji na zlepljanju lizata v prisotnosti endotoksinov. Test izvedemo v testnih vialah v katerih je reagent, LAL raztopina, \xc4\x8dlove\xc5\xa1ki serumski albumin (stabilizator), NaCl in \xc5\xa1e nekateri ioni. V vialo dodamo na\xc5\xa1 vzorec (enak volumen kot je LAL raztopine) in inkubiramo 60 min na 37 \xc2\xb0C. \xc4\x8ce po inkubaciji opazimo nastanek gela, to pomeni, da so v vzorcu prisotni endotoksini. Slabosti testa: \xc4\x8de nismo dovolj previdni se lahko gel tekom postopka sesede in test bo la\xc5\xbeno negativen. Pozitivne lastnost testa: hiter, enostaven, specifi\xc4\x8den, potrebna majhna koli\xc4\x8dina vzorca._NEWLINE_LAL testi so zelo uporabni tudi za detekcijo endotoksinov (kot ne\xc4\x8disto\xc4\x8d) v zdravilih.\n_START_SECTION_\nTestiranje na kuncih\n_START_PARAGRAPH_\nTest na kuncih je bil standardni test za detekcijo endotoksinov, odobren s strani FDA, vse do odobritve LAL testa._NEWLINE_Test na kuncih temelji na merjenju telesne temperature kuncev po intravenoznem ubrizganju preu\xc4\x8devanega vzorca. Za test so uporabljali 3 kunce v \xc5\xa1tirih ponovitvah. Po vbrizganju vzorca so po\xc4\x8dakali 72h in nato  kuncem pomerili temperaturo. Povi\xc5\xa1ana temperatura je bila pokazatelj prisotnosti endotoksinov v vzorcu. Enega kunca so uporabili za 25-30 testov. Slabosti testa: uporaba \xc5\xbeivali, test ni natan\xc4\x8den, saj lahko dvig temperature povzro\xc4\x8dijo druge snovi v vzorcu, test traja zelo dolgo \xc4\x8dasa, la\xc5\xbeno pozitiven rezultat lahko dobimo, ker so \xc5\xbeivali pod stresom.'