b"\n_START_ARTICLE_\nGelska izklju\xc4\x8ditvena kromatografija\n_START_SECTION_\nUporaba\n_START_PARAGRAPH_\nV glavnem se gelska filtracija uporablja za lo\xc4\x8devanje proteinov in ostalih vodotopnih polimerov, medtem ko se gelska permeacija uporablja za analizo porazdelitve molekulske mase polimerov topnih v organskih topilih. Nobene od metod se ne sme zamenjevati z gelsko elektroforezo, ki temelji na lo\xc4\x8devanju nabitih molekul v elektri\xc4\x8dnem polju._NEWLINE_Gelska kromatografija je zelo raz\xc5\xa1irjena tehnika za \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denje in analizo sinteti\xc4\x8dnih in biolo\xc5\xa1kih polimerov, kot so proteini, polisaharidi in nukleinske kisline. Kot nosilec po navadi uporabljamo gel - obi\xc4\x8dajno poliakrilamid, dekstran ali agarozo \xe2\x80\x93 pri nizkih tlakih ali pa silicijev oksid ter pre\xc4\x8dno povezan polistiren pri visokih tlakih. Nosilec predstavlja stacionarno fazo in je sestavljen iz zamre\xc5\xbeenih sferi\xc4\x8dnih delcev.\n_START_SECTION_\nPrednosti\n_START_PARAGRAPH_\nPrednost metode je dobra lo\xc4\x8ditev velikih molekul od majhnih z minimalno koli\xc4\x8dino eluata. Metoda je obi\xc4\x8dajno povezana z ostalimi, ki lo\xc4\x8dujejo molekule glede na kislost, bazi\xc4\x8dnost, naboj in afiniteto do dolo\xc4\x8denih spojin. Pri gelski kromatografiji ne prihaja do izgube vzorca, ker ni interakcij med topljencem in stacionarno fazo.\n_START_SECTION_\nOdkritje\n_START_PARAGRAPH_\nGelsko kromatografijo sta izna\xc5\xa1la Grant Henry Lathe in Colin R Ruthven, ki sta delovala na Queen Charlotte's Hospital v Londonu. Kasneje sta za izum prejela nagrado John Scott. Medtem ko sta Lathe in Ruthven za gelski nosilec uporabila \xc5\xa1krob, sta Jerker Porath in Per Flodin kasneje predstavila dekstran._NEWLINE_Obstajali so tudi poskusi lo\xc4\x8devanja sinteti\xc4\x8dnih dolgih polimerov. Leta 1964 je J. C. Moore objavil svoje delo o pripravi gelskih permeacijskih kolon, ki temeljijo na zamre\xc5\xbeenem polistirenu z nadzorovano velikostjo por in s tem se je za\xc4\x8dela raziskovalna dejavnost na tem podro\xc4\x8dju hitro pove\xc4\x8devati. Ugotovili so, da je z gelsko permeacijo mo\xc5\xbeno pridobiti molske mase ter informacijo o porazdelitvi molske mase sinteti\xc4\x8dnih polimerov. Zaradi teh odkritij je pri\xc5\xa1la metoda v \xc5\xa1iroko rabo.\n_START_SECTION_\nTeorija in metode\n_START_PARAGRAPH_\nEna od zahtev gelske kromatografije je, da analit ne interagira s povr\xc5\xa1ino stacionarne faze. Delci razli\xc4\x8dnih velikosti se skozi stacionarno fazo eluirajo z razli\xc4\x8dno hitrostjo: velike molekule ne morejo vstopiti v sistem por in se eluirajo prej kot male molekule, ki vstopajo v sistem in se eluirajo kasneje. S tem lo\xc4\x8dujemo delce glede na velikost. Pod pogojem, da so vsi nane\xc5\xa1eni isto\xc4\x8dasno, naj bi delci iste velikosti prepotovali enako pot._NEWLINE_Obstajajo razli\xc4\x8dna merila za merjenje velikosti makromolekul, zato se pojavi problem izbire ustreznega parametra velikosti, na podlagi katerega poteka lo\xc4\x8devanje razli\xc4\x8dnih vrst molekul. Benoit in sodelavci so uvedli pojem \xe2\x80\x93 hidrodinami\xc4\x8dni volumen, ki je postal temelj za umerjanje. To je volumen zvitega polimera, kadar je le-ta v raztopini. Odvisen je od molekulske mase polimera in njegovih interakcij s topilom. Kljub temu uporaba dinami\xc4\x8dnega volumna pri razlagi podatkov ni povsem jasna. Kromatografija poteka pod nizko preto\xc4\x8dnimi pogoji, kjer naj bi imel hidrodinami\xc4\x8dni faktor majhen vpliv na lo\xc4\x8ditev._NEWLINE_Vsak kolona ima nek razpon molekulskih mas, ki jih lahko lo\xc4\x8di. Izklju\xc4\x8ditvena omejitev opredeljuje molekulsko maso na zgornji meji razpona; nad to mejo so molekule prevelike, da bi se ujele v stacionarno fazo. Meja prepustnosti dolo\xc4\x8da molekulsko maso na spodnjem delu razpona; molekule so dovolj majhne, da v celoti prodrejo v pore stacionarne faze. Kolona je sestavljena iz votle cevi, napolnjene z izredno majhnimi poroznimi kroglicami, ki imajo prisotne pore razli\xc4\x8dnih velikosti. Ko vzorec potuje po koloni navzdol, manj\xc5\xa1i delci pridejo v pore. Delci, ki so ve\xc4\x8dji od por, ne morejo prodreti vanje in se hitreje izperejo. Filtrirana raztopina zbrana na koncu se imenuje eluat.\n_START_SECTION_\nDejavniki, ki vplivajo na filtracijo\n_START_PARAGRAPH_\nDelci v raztopini nimajo fiksne velikosti, zaradi \xc4\x8desar je verjetnost, da delec, ki bi ga sicer pore upo\xc4\x8dasnile, potuje mimo. Prav tako tudi delci stacionarne faze niso to\xc4\x8dno definirani; tako delci kot pore se lahko razlikujejo glede na velikost. Elucijske krivulje so zato podobne Gaussovi porazdelitvi. Stacionarna faza lahko na neza\xc5\xbeelene na\xc4\x8dine interagira z delci in vpliva na retencijski \xc4\x8das._NEWLINE_Kot tudi pri drugih oblikah kromatografij pove\xc4\x8danje dol\xc5\xbeine kolone pove\xc4\x8da lo\xc4\x8dljivost, pove\xc4\x8danje premera pa pove\xc4\x8da kapaciteto kolone. Pravilno polnjenje kolone pripomore k pove\xc4\x8dani lo\xc4\x8dljivosti: v prenapolnjeni koloni se pore sesedejo, kar se ka\xc5\xbee v zmanj\xc5\xa1ani lo\xc4\x8dljivosti. Premalo napolnjene kolone pa imajo zmanj\xc5\xa1ano relativno povr\xc5\xa1ino stacionarne faze.\n_START_SECTION_\nAnaliza\n_START_PARAGRAPH_\nPri preprostih kolonah zbiramo topilo v enakih koli\xc4\x8dinah, frakcijah. Podobno veliki delci so v isti frakciji in niso zaznani lo\xc4\x8deno. Pri bolj naprednih kolonah so ta problem re\xc5\xa1ili z nenehnim spremljanjem topila. Zbrane frakcije po navadi analiziramo s spektroskopskimi tehnikami za dolo\xc4\x8danje koncentracije eluiranih delcev._NEWLINE_Elucijski volumen je volumen, ki je potreben, da se neka snov spere z vrha do iztoka kolone in okarakterizera obna\xc5\xa1anje molekule v gelskem nosilcu. Zmanj\xc5\xa1uje se pribli\xc5\xbeno linearno z logaritmom molekulske hidrodinami\xc4\x8dne prostornine. Kolone so pogosto umerjene z uporabo 4-5 standardnih vzorcev (npr. zvitih proteinov z znano molekulsko maso), in vzorcem, ki vsebuje zelo veliko molekulo kot je tiroglobulin, za dolo\xc4\x8ditev ni\xc4\x8delnega volumna. Dekstran ni primeren za ugotavljanje ni\xc4\x8delnega volumna, saj je molekula raznolika in lahko dobimo spremenljive rezultate.\n_START_SECTION_\nBiokemi\xc4\x8dna aplikacija\n_START_PARAGRAPH_\nNa splo\xc5\xa1no ima gelska kromatografija nizko lo\xc4\x8dljivost, zato se jo pogosto uporabi za kon\xc4\x8dno \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denje. S tehniko lahko dolo\xc4\x8dimo kvartarno strukturo \xc4\x8distih proteinov. Prav tako lahko preverimo terciarno strukturo proteinov s pomo\xc4\x8djo merjenja hidrodinami\xc4\x8dnega volumna. Ta je namre\xc4\x8d pri zvitem in nezvitem proteinu razli\xc4\x8den. Na primer, hidrodinami\xc4\x8dni premer tipi\xc4\x8dne domene proteina je 14 \xc3\x85 za zvito in 36 \xc3\x85 za nezvito obliko, torej ju z gelsko kromatografijo lahko lo\xc4\x8dimo.\n_START_SECTION_\nSinteze polimerov\n_START_PARAGRAPH_\nGelska kromatografija se lahko uporablja kot merilo tako za velikost kot polidisperznost sintetiziranega polimera, tj. zmo\xc5\xbenost dolo\xc4\x8devanja porazdelitve velikosti polimernih molekul. \xc4\x8ce najprej izmerimo standarde, lahko nari\xc5\xa1emo kalibracijsko krivuljo s pomo\xc4\x8djo katere nato dolo\xc4\x8dimo velikosti drugih polimerov v topilu, ki smo ga izbrali za analizo (pogosto je to tetrahidrofuran). Alternativa opisanemu postopku s kalibriranjem so postopki kot je merjenje razpr\xc5\xa1enosti svetlobe in/ali viskoznosti v kombinaciji z gelsko kromatografijo, s katerimi dobimo absolutne molekulske mase, ki ne temeljijo na standardih znane molekulske mase. Te metode so splo\xc5\xa1no bolj za\xc5\xbeelene zaradi razlike v velikosti med dvema polimeroma z enako molekulsko maso. Z gelsko kromatografijo lahko hitro (v pribli\xc5\xbeno pol ure) dobimo podatke o velikosti in polidisperznosti vzorca. Preparativna gelska kromatografija se lahko uporabi za lo\xc4\x8devanje polimerov v ve\xc4\x8djih koli\xc4\x8dinah.\n_START_SECTION_\nSlabosti\n_START_PARAGRAPH_\nPri gelski kromatografiji je poudarek na merjenju hidrodinami\xc4\x8dnega obsega polimernih molekul. Pribli\xc5\xbeno molekulsko maso se lahko izra\xc4\x8duna iz podatkovne baze gelske kromatografije, kjer je mogo\xc4\x8de najti to\xc4\x8dno razmerje med molekulsko maso in hidrodinami\xc4\x8dnim volumnom za polistiren (polistiren se uporablja za standard). Vendar pa razmerje med prostornino in hidrodinami\xc4\x8dnim volumnom ni enako za vse polimere, zato lahko sklepamo le o pribli\xc5\xbenih meritvah. Druga slabost je mo\xc5\xbenost interakcije med stacionarno fazo in analitom. Vsaka interakcija vodi do ve\xc4\x8djega elucijskega \xc4\x8dasa, kar da rezultate, ki bi jih dobili pri analitu manj\xc5\xa1e velikosti. Prav tako je slabost dejstvo, da mora med dvema makromolekulama obstajati vsaj 10% razlika v molekulski masi, \xc4\x8de ju \xc5\xbeelimo uspe\xc5\xa1no lo\xc4\x8diti.\n_START_SECTION_\nAbsolutna gelska kromatografija\n_START_PARAGRAPH_\nAbsolutna gelska kromatografija je tehnika, ki pove\xc5\xbee gelsko kromatografijo z in\xc5\xa1trumentom za dinami\xc4\x8dno sipanje svetlobe, kar nam omogo\xc4\x8da merjenje absolutne velikosti proteinov in makromolekul, ko se ti eluirajo iz kromatografskega sistema."