b"\n_START_ARTICLE_\nPoliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti natrijevega lavrilsulfata\n_START_SECTION_\nPriprava vzorca\n_START_PARAGRAPH_\nVzorec je lahko kakr\xc5\xa1en koli material, ki vsebuje proteine, na primer prokarionske ali evkarionske celice, tkiva, virusi, vzorci iz okolja ali \xc4\x8disti proteini. V primeru tkiv so ta pogosto prvo raz\xc4\x8dlenjena na manj\xc5\xa1e delce, in sicer mehansko z uporabo me\xc5\xa1alnika (za ve\xc4\x8dje volumne vzorca), homogenizatorja (za manj\xc5\xa1e volumne vzorca), s sonikacijo ali s cikli visokih pritiskov. Na enak na\xc4\x8din lahko razbijemo tudi celice. Razli\xc4\x8dne celi\xc4\x8dne komponente in organele tako obdelanih tkiv in celic pred izvedbo elektroforeze lo\xc4\x8dimo s kombinacijo biokemi\xc4\x8dnih in mehanskih tehnik, ki vklju\xc4\x8dujejo razli\xc4\x8dne tipe filtracij in centrifugiranje. Vzorcu za analizo dodamo natrijev lavrilsulfat (SDS), anionski detergent, ki denaturira sekundarno in terciarno strukturo proteina z izjemo disulfidnih vezi, prav tako pa proteinu prida negativen naboj, ki je sorazmeren z maso proteina. Segrevanje vzorca na najmanj 60 \xc2\xb0C pripomore k vezavi SDS, kar povzro\xc4\x8di denaturacijo proteina._NEWLINE_Vzorcu proteinov lahko dodamo tudi ozna\xc4\x8devalec oziroma barvilo, ki ima ve\xc4\x8djo elektroforezno mobilnost kot proteini, kar omogo\xc4\x8da sledenje elektroforezni fronti med procesom njihovega potovanja v elektroforeznem gelu.\n_START_SECTION_\nPriprava akrilamidnega gela\n_START_PARAGRAPH_\nGel je obi\xc4\x8dajno sestavljen iz akrilamida, bisakrilamida, SDS in pufra z ustreznim pH. Raztopino razplinimo v vakuumu, s \xc4\x8dimer prepre\xc4\x8dimo tvorbo zra\xc4\x8dnih mehur\xc4\x8dkov med polimerizacijo. Reakcijo polimerizacije spro\xc5\xbeimo z dodatkom vira prostih radikalov in stabilizatorjev, amonijevim persulfatom in TEMED. Zaradi dodanega bisakrilamida, ki pre\xc4\x8dno pove\xc5\xbee poliakrilamidne molekule in tako povzro\xc4\x8di premre\xc5\xbeenje, med polimerizacjo nastane gel. Razmerje bisakrilamda in akrilamida je 1:35, vendar pa je le-to lahko tudi druga\xc4\x8dno za razli\xc4\x8dne namene. Dele\xc5\xbe akrilamida v gelu je obi\xc4\x8dajno med 5\xc2\xa0% in 25\xc2\xa0%. Gel z ni\xc5\xbejim dele\xc5\xbeem akrilamida je primernej\xc5\xa1i za lo\xc4\x8devanje proteinov z visoko molekulsko maso, tisti z vi\xc5\xa1jim dele\xc5\xbeem pa za lo\xc4\x8devanje manj\xc5\xa1ih proteinov. Polimerizacija gela pote\xc4\x8de med dvema steklenima plo\xc5\xa1\xc4\x8dama v kadi\xc4\x8dki, z vstavitvijo glavnika na vrhu oblikujemo \xc5\xbeepke za nanos vzorca. Po kon\xc4\x8dani reakciji polimerizacije glavnik odstranimo, tako je gel pripravljen za izvedbo elektroforeze.\n_START_SECTION_\nElektroforeza\n_START_PARAGRAPH_\nPri SDS-PAGE glede na naravo vzorca in namen izvedbe elektroforeze uporabimo razli\xc4\x8dne pufrne sisteme. Prav tako se razlikujejo elektroforezni pufri, uporabljeni pri anodi in katodi._NEWLINE_V gelu se v elektri\xc4\x8dnem polju negativno nabiti proteini pomikajo proti pozitivno nabiti elektrodi, anodi. Potovanje proteinov v gelu je odvisno od njihove velikosti, in sicer manj\xc5\xa1i proteini potujejo hitreje, saj la\xc5\xbeje prodirajo skozi pore gela, ve\xc4\x8dji pa imajo pri tem ve\xc4\x8d te\xc5\xbeav in zato potujejo po\xc4\x8dasneje. Po dolo\xc4\x8denem \xc4\x8dasu (obi\xc4\x8dajno nekaj ur, odvisno od jakosti elektri\xc4\x8dne napetosti v gelu; pri ve\xc4\x8djih napetostih proteini potujejo hitreje, a je lo\xc4\x8dljivost slab\xc5\xa1a) se bodo proteini lo\xc4\x8dili glede na njihovo velikost, in sicer bojo manj\xc5\xa1i potovali dlje v gelu, ve\xc4\x8dji pa bojo ostali bli\xc5\xbeje mestu nanosa. Proteine tako lahko grobo lo\xc4\x8dimo glede na njihovo velikost, torej molekulsko maso, vseeno pa lahko pri dolo\xc4\x8denih glikoproteinih na SDS gelu pride do odstopanj.\n_START_SECTION_\nNadaljnja obdelava\n_START_PARAGRAPH_\nPo elektroforezi lahko gel obarvamo, obi\xc4\x8dajno s Coomassie Brilliant Blue R-250 ali srebrovimi solmi, s \xc4\x8dimer detektiramo lo\xc4\x8dene proteine, v nadaljevanju lahko izvedemo prenos western. Po barvanju lo\xc4\x8dene proteine zaznamo kot razli\xc4\x8dne izrazite lise v gelu. Pogosto poleg vzorcev v lo\xc4\x8den \xc5\xbeepek v gelu dodamo tudi ozna\xc4\x8devalce velikosti znanih molekulskih mas, saj tako kalibriramo gel, hkrati pa lahko na podlagi primerjanj prepotovanih dol\xc5\xbein z ozna\xc4\x8devalci velikosti ocenimo molekulsko maso neznanih proteinov. SDS-PAGE je zanesljiva in enostavna metoda, zato je obi\xc4\x8dajno prva izbira pri dolo\xc4\x8danju \xc4\x8distosti proteinov. Razli\xc4\x8dni proteini se lahko razli\xc4\x8dno obarvajo, kar vodi do napak pri kvantitativni detekciji. SDS-PAGE je kot preparativna tehnika prav tako lahko za\xc4\x8detna stopnja v procesu \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denja proteinov, kadar potrebujemo le malo koli\xc4\x8dino vzorca, ki je lahko denaturiran, npr. za dolo\xc4\x8ditev mase z masno spektroskopijo ali za dolo\xc4\x8ditev N-kon\xc4\x8dnega zaporedja aminokislin z Edmanovo degradacijo.\n_START_SECTION_\nKemijske komponente in njihova vloga\n_START_PARAGRAPH_\nPoliakrilamidni gel: medij za elektroforezo. Ima ustrezne lastnosti za izvedbo elektroforeze, je sinteti\xc4\x8den, termostabilen, transparenten, \xc4\x8dvrst, kemi\xc4\x8dno prete\xc5\xbeno inerten gel, v katerem lahko oblikujemo razli\xc4\x8dno velike pore, kar omogo\xc4\x8da njegovo raznovrstno uporabo. Velikost por gela dolo\xc4\x8data dva dejavnika, in sicer koncentracija akrilamida in koncentracija pre\xc4\x8dnega povezovalca, bisakrilamida. Ve\xc4\x8dje koncentracije akrilamida tvorijo manj\xc5\xa1e pore. Najmanj\xc5\xa1e pore dose\xc5\xbeemo pri koncentraciji bisakrilamida 5\xc2\xa0%; \xc4\x8de je le tega ve\xc4\x8d ali manj, se tvorijo ve\xc4\x8dje pore, saj v tem primeru dobimo manj homogene povezave polimernih verig v gelu. Poliakrilamid tudi prenese visok napetostni gradient, omogo\xc4\x8da razli\xc4\x8dna barvanja in ekstrakcijo posameznih frakcij, kot suh je primeren za avtoradiografijo.\n_START_SECTION_\nReducirajo\xc4\x8da SDS-PAGE\n_START_PARAGRAPH_\nPoleg dodajanja SDS lahko proteine tudi za kratek \xc4\x8das segrejemo do skoraj\xc5\xa1njega vrenja ob prisotnosti reducenta, kot sta ditiotreitol (DTT) ali 2-merkaptoetanol (beta-merkaptoetanol (BME)). Oba \xc5\xa1e dodatno denaturirata proteine z reduciranjem disulfidnih povezav, s \xc4\x8dimer se izognemo nastanku nekaterih oblik terciarnega zvijanja proteinov in omogo\xc4\x8dimo razpad kvartarnih proteinskih struktur (oligomerne podenote). Ta proces je znan kot reducirajo\xc4\x8da SDS-PAGE in je tudi najpogosteje uporabljen.\n_START_SECTION_\nBarvanje srebrom\n_START_PARAGRAPH_\nV 14. stoletju so tehniko barvanja s srebrom razvili za obarvanje steklenih povr\xc5\xa1in. Za ta namen so ga v veliki meri uporabljali do 16. stoletja. Prva obarvanja s srebrom so omogo\xc4\x8dila nastanek barve v obmo\xc4\x8dju med svetlo rumeno in oran\xc5\xbeno-rde\xc4\x8do barvo. Camillo Golgi je izbolj\xc5\xa1al tehniko barvanja s srebrom za \xc5\xa1tudije \xc5\xbeiv\xc4\x8dnega sistema. Golgijeva metoda naklju\xc4\x8dno obarva le omejeno \xc5\xa1tevilo celic v celoti. Natan\xc4\x8den kemijski mehanizem, ki to omogo\xc4\x8da, je \xc5\xa1e vedno v veliki meri neznan. Barvanje s srebrom sta Kerenyi in Gallyas predstavila kot ob\xc4\x8dutljivo metodo za detekcijo proteinov v gelu, kjer so dovolj \xc5\xbee koli\xc4\x8dine v sledeh. Tehniko so izbolj\xc5\xa1ali za \xc5\xa1tudije drugih biolo\xc5\xa1kih makromolekul. Klasi\xc4\x8dno barvanje s Coomassie Brilliant Blue lahko obi\xc4\x8dajno zazna 50 ng-lise proteina, barvanje s srebrom pa zna\xc4\x8dilno pove\xc4\x8da ob\xc4\x8dutljivost petdesetkrat. Veliko spremenljivk lahko vpliva na intenziteto barve, prav tako ima vsak protein svoje karakteristike obarvanja. Klju\xc4\x8dni dejavniki za uspe\xc5\xa1no barvanje so tako \xc4\x8dista steklovina, \xc4\x8disti reagenti in voda najvi\xc5\xa1je \xc4\x8distosti.\n_START_SECTION_\nPufrski sistemi\n_START_PARAGRAPH_\nVe\xc4\x8dino lo\xc4\x8ditev proteinov izvajajo z uporabo diskuntinuiranega (DISC) puferskega sistema, ki zna\xc4\x8dilno izbolj\xc5\xa1a ostrino in obliko lis v gelu. V prekinjenem gelskem sistemu se v zgodnji fazi elektroforeze oblikuje ionski gradient, ki povzro\xc4\x8di, da se vsi proteini zberejo v eni ostri lisi. Nastanek ionskega gradienta je posledica izbire prave pH vrednosti, pri kateri so ioni v pufru le deloma nabiti v primerjavi s proteini, ki so prekriti z SDS. Take razmere zagotavljajo okolje, v katerem Kohlrauscheve reakcije dolo\xc4\x8dajo molarno prevodnost. Kot rezultat tega se s SDS prekriti proteini skoncentrirajo za ve\xc4\x8d razredov v ozkem obmo\xc4\x8dju 19 \xce\xbcm v vsega nekaj minutah. Na tej stopnji vsi proteini potujejo z enako hitrostjo zaradi vpliva izotakoforeze. To se pojavi v obmo\xc4\x8dju gela, ki ima ve\xc4\x8dje pore in tako matriks gela ne ovira potovanja med pojavom fokusiranja oziroma zbiranja. Lo\xc4\x8devanje proteinov glede na velikost dose\xc5\xbeemo v spodnjem, lo\xc4\x8devalnem obmo\xc4\x8dju gela. Lo\xc4\x8ditveni gel ima obi\xc4\x8dajno veliko manj\xc5\xa1e pore, kar vodi do presejalnega efekta, ki sedaj dolo\xc4\x8da elektroforezno mobilnost proteinov. Isto\xc4\x8dasno ima lo\xc4\x8devalni del gela pH vrednost, pri kateri ioni v pufru nosijo v povpre\xc4\x8dju ve\xc4\x8dji naboj, kar povzro\xc4\x8di, da prehitijo proteine prekrite s SDS in tako izni\xc4\x8dijo ionski gradient ter obenem tudi pojav zbiranja._NEWLINE_Zelo raz\xc5\xa1irjena razli\xc4\x8dica diskuntinuiranega puferskega sistema je sistem tris-glicina oziroma Laemmli sistem, ki omogo\xc4\x8da zbiranje pri pH 6.8 in lo\xc4\x8devanje pri vrednosti pH okoli 8.3-9.0. Pomanjkljivost tega sistema je, da lahko te vrednosti pH spodbudijo nastanek disulfidnih povezav med cisteinskimi ostanki v proteinih, saj pKa cisteina zna\xc5\xa1a med 8 in 9, prav tako reducent, ki je prisoten v nana\xc5\xa1alnem pufru, ne potuje skupaj s proteini. Nedavni napredki v puferski tehnologiji zmanj\xc5\xa1a ta problem z lo\xc4\x8devanjem proteinov pri pH, ki je dosti ni\xc5\xbeja od pKa cisteina (npr. bis-tris, pH 6.5) in vklju\xc4\x8dujejo reducente (npr. natrijev bisulfit), ki se premaknejo v gel pred proteini in tako vzdr\xc5\xbeujejo reducirajo\xc4\x8de okolje. Dodatna prednost uporabe pufrov z ni\xc5\xbejimi vrednostmi pH je, da je na ta na\xc4\x8din akrilamidni gel bolj obstojen pri ni\xc5\xbejih pH vrednostih in ga tako lahko pred uporabo shranimo za dalj\xc5\xa1e \xc4\x8dasovno obdobje.\n_START_SECTION_\nGelska elektroforeza proteinov z gradientom SDS\n_START_PARAGRAPH_\nKo priklju\xc4\x8dimo napetost, anioni (in negativno nabite molekule v vzorcu) potujejo proti pozitivni elektrodi (anodi) v spodnjem predelu. Vodilni ion je Cl- (visoka mobilnost in visoka koncentracija); glicinat je 'trailing ion' oz. zastajajo\xc4\x8di ion (nizka mobilnost in nizka koncentracija). Delci SDS-protein ne potujejo prosto na meji med Cl- gelskega pufra in Gly- katodnega pufra. Friedrich Kohlrausch je odkril, da Ohmov zakon velja tudi za raztopljene elektrolite. Zaradi padca napetosti med klorovim in glicinskim pufrom, so proteini stisnjeni (zbrani) v mikrometer tanke plasti. Meja med obema se premika skozi gradient por in stisnjeni proteini se postopoma razpr\xc5\xa1ijo zaradi pove\xc4\x8danja navzkri\xc5\xbene odpornosti v matriksu gela. Zbiranje in razpr\xc5\xa1evanje se pojavi nepretrgoma v gradientu gela za vsak protein na razli\xc4\x8dni poziciji. Za popolno razpr\xc5\xa1itev proteinov mora koncentracija poliakrilamidnega gela prese\xc4\x8di 16\xc2\xa0%. Sistem Laemmli dveh gelov je preprost gradientni gel. Prekinjen pH pufrov nima vpliva na kvaliteto lo\xc4\x8ditve proteinov in gel za zbiranje proteinov z razli\xc4\x8dnim pH ni potreben."