b'\n_START_ARTICLE_\nKonfokalni mikroskop\n_START_PARAGRAPH_\nKonfokalna ali so\xc5\xbeari\xc5\xa1\xc4\x8dna mikroskopija je mikroskopska tehnika, ki nadgrajuje klasi\xc4\x8dno presevno mikrosopijo. Od navadnega mikroskopa se razlikuje po tem, da se naenkrat osvetli le izbrano rezino vzorca, kar mo\xc4\x8dno izbolj\xc5\xa1a kontrast slike in omogo\xc4\x8da trirazse\xc5\xbeno slikanje. To se dose\xc5\xbee z dvema zaslonkama, postavljenima v gori\xc5\xa1\xc4\x8dnih ravninah. Konfokalna mikroskopija se navadno uporablja v kombinaciji s fluorescentno mikroskopijo za opazovanje biolo\xc5\xa1kih vzorcev. V kombinaciji s fluorescentnimi ozna\xc4\x8devalci se pridobi odli\xc4\x8den kontrast z dobro razlo\xc4\x8dljivimi podrobnostmi biolo\xc5\xa1kih vzorcev, ki z navadno mikrosopijo ni dosegljiv.\n_START_SECTION_\nZgodovina\n_START_PARAGRAPH_\nPrvi konfokalni mikroskop je sestavil Marvin Minsky leta 1955, a je bilo pridobivanje trirazse\xc5\xbene slike s premikanjem vzorca zelo po\xc4\x8dasno. Minsky je vlo\xc5\xbeil patentno prijavo leta 1957. V \xc5\xa1estdesetih letih je Mojm\xc3\xadr Petr\xc3\xa1\xc5\x88 z Medicinske fakultete  Karlove univerze v Pragi v Plze\xc5\x88u razvil tandemsko-vrsti\xc4\x8dni mikroskop, prvi komercialni konfokalni mikroskop, ki je za hitrej\xc5\xa1e pridobivanje slike uporabljal Nipkowov disk._NEWLINE_Leta 1969 in 1971 sta M. David Egger in Paul Davidovits z Univerze Yale prvi\xc4\x8d opisala konfokalni mikroskop, ki je za osvetljevanje vzorca uporabljal laserski snop. Leta 1985 sta J. G. White in W. B. Amos predstavila uporabniku prijazen in\xc5\xa1trument za trirazse\xc5\xbeno lokalizacijo fluorescentnih ozna\xc4\x8devalcev na osnovi konfokalnosti: prvi fluorescentni konfokalni mikroskop. Ta se je v devetdesetih letih 20. stoletja pri\xc4\x8del s pridom uporabljati v biologiji in znanosti o materialih. Na osnovi konfokalne mikroskopije se razvili mnogo mikroskopskih tehnik, ki ponujajo dober vpogled v biolo\xc5\xa1ke vzorce.\n_START_SECTION_\nOsnovno na\xc4\x8delo konfokalne mikroskopije\n_START_PARAGRAPH_\nZa razliko od opti\xc4\x8dnih mikroskopov, kjer se osvetljuje celoten vzorec hkrati, se s konfokalnim mikroskopom omeji osvetljevanje vzorca na le eno to\xc4\x8dko v gori\xc5\xa1\xc4\x8dni ravnini. Shema presevnega konfokalnega mikroskopa je slede\xc4\x8da. Vpadno svetlobo se pred vpadom na le\xc4\x8do omeji z re\xc5\xbeo. Na ta na\xc4\x8din se ustvari to\xc4\x8dkovni izvor svetlobe in se omeji zbiranje svetlobe na ustrezno to\xc4\x8dko v gori\xc5\xa1\xc4\x8dni ravnini, kamor se postavi opazovani vzorec. Simetri\xc4\x8dno glede na vzorec se postavi enako le\xc4\x8do in zaslonko na ustreznih razdaljah, tako da gori\xc5\xa1\xc4\x8de druge le\xc4\x8de pade v re\xc5\xbeo druge zaslonke. S tem se dose\xc5\xbee, da se sveti na tisto ravnino, iz katere se svetlobo zajema. Ime konfokalni oz. so\xc5\xbeari\xc5\xa1\xc4\x8dni mikroskop tako izhaja iz tega, da gori\xc5\xa1\xc4\x8di sovpadata. Brez druge re\xc5\xbee bi se zajemalo svetlobo tudi iz drugih ravnin vzorca, osvetlitvi katerih se tudi pri fluorescentnem vzbujanju ne more izogniti. Zaradi tega dodatnega vzbujanja je pri klasi\xc4\x8dni presevni mikroskopiji dobljena slika zamegljena, pri konfokalnem mikroskopu pa se svetlobo iz zunajgori\xc5\xa1\xc4\x8dnih ravnin odstrani z drugo re\xc5\xbeo.\n_START_SECTION_\nFluorescentna konfokalna mikroskopija\n_START_PARAGRAPH_\nIzraz konfokalni mikroskop se navadno uporablja za kombinacijo konfokalnega mikroskopa s fluorescentnim. Molekule, na katere se ve\xc5\xbee fluorescentne ozna\xc4\x8devalce, se osvetljuje s svetlobo izbrane valovne dol\xc5\xbeine. Fluorescentni ozna\xc4\x8devalci izsevajo svetlobo pri dalj\xc5\xa1i valovni dol\xc5\xbeini (na skici zelena) kot svetloba, s katero se nanje sveti (na skici modra). Polprepustno zrcalo na sredini je izbrano tako, da svetlobo z valovno dol\xc5\xbeino izvora odbije, svetlobo fluorescentnih ozna\xc4\x8devalcev pa prepusti. Svetloba izvora preide prvo zaslonko, se na polprepustnem zrcalu odbije in v vzorcu vzbudi fluorescentno svetlobo. Ta je \xc4\x8dez polprepustno zrcalo prepu\xc5\xa1\xc4\x8dena in \xc4\x8dez drugo zaslonko vpade na kamero. Zaslonki le\xc5\xbeita v ustreznih gori\xc5\xa1\xc4\x8dnih ravninah. V sistem se lahko doda \xc5\xa1e dva filtra, ki se ju postavi za izvor in pred detektor in s tem svetlobo \xc5\xa1e dodatno omeji na to\xc4\x8dno dolo\xc4\x8deno obmo\xc4\x8dje valovnih dol\xc5\xbein. Tako se izbolj\xc5\xa1a kontrast, saj se poleg filtracije signala iz zunajgori\xc5\xa1\xc4\x8dnih ravnin s konfokalnima re\xc5\xbeama odstrani \xc5\xa1e signal ostalih molekul, ki niso ozna\xc4\x8dene s fluorescentnimi ozna\xc4\x8devalci, in se jih ne \xc5\xbeeli opazovati. Na ta na\xc4\x8din postanejo ozna\xc4\x8dene biolo\xc5\xa1ke strukture zelo dobro vidne.\n_START_SECTION_\nSvetlobni vir\n_START_PARAGRAPH_\nEna mo\xc5\xbenost za izbiro izvora, s katerim se osvetljuje vzorec, je laser, ki je koherenten in monokromatski izvor svetlobe. Monokromatski pomeni, da sveti le pri eni valovni dol\xc5\xbeini. Druga mo\xc5\xbena izbira izvora je \xc5\xa1irokopasovni izvor, ki ima valovne dol\xc5\xbeine svetlobe porazdeljene preko celotnega vidnega dela spektra valovnih dol\xc5\xbein in je prostorsko nekoherenten na skali, na kateri se opazuje vzorec. Kot \xc5\xa1irokopasovni izvori se uporabljajo: izvor na volframovo nitko, kvar\xc4\x8dna halogenska lu\xc4\x8d ali oblo\xc4\x8dne lu\xc4\x8di razli\xc4\x8dnih elementov (ksenon, \xc5\xbeivo srebro, ogljik). Tako laserski kot \xc5\xa1irokopasovni izvor morata biti \xc4\x8dim manj koherentna, da se izogne popa\xc4\x8denju slike zaradi interference med svetlobo, ki se jo zaznava, in svetlobo, ki se siplje na opti\xc4\x8dnih elementih. Ker je laser izvor koherentne svetlobe, je treba pred vpadom na opti\xc4\x8dne elemente njegovo svetlobo napraviti nekoherentno.\n_START_SECTION_\nNastanek slike\n_START_PARAGRAPH_\nPri konfokalnem mikroskopu se zajame svetlobo iz le ene to\xc4\x8dke ravnine, pri \xc4\x8demer se odstrani nepotrebno ozadje signala iz zunajgori\xc5\xa1\xc4\x8dnih ravnin. Za zajem celotne rezine vzorca je treba zajeti vsako to\xc4\x8dko ravnine, kar se lahko stori na dva na\xc4\x8dina. Na\xc4\x8din zajema slike je odvisen od izbire vira.\n_START_SECTION_\nLaserski zajem\n_START_PARAGRAPH_\nZ laserskim snopom se pomika vzdol\xc5\xbe vrstic in se pridobi sliko vsake to\xc4\x8dke posebej. Tako se vrsti\xc4\x8dno zajame sliko celotnega vzorca. Postopek pridobivanja celotne slike traja med 0,5 s in 2 s. Starej\xc5\xa1i mikroskopi so premikali mizo z vzorcem prek celotnega vidnega polja. Pri sodobnej\xc5\xa1ih izvedbah je miza z vzorcem pri miru, kar je za opazovanje biolo\xc5\xa1kih vzorcev mnogo primernej\xc5\xa1e. V tak sistem je treba dodati \xc5\xa1e dve zrcali, ki se ju postavi med polprepustno zrcalo in vzorec, in se ju nadzoruje prek dveh sinhroniziranih galvanometrov. S tema zrcaloma se izbere osvetljevano to\xc4\x8dko v ravnini.\n_START_SECTION_\nKonfokalni disk\n_START_PARAGRAPH_\nPri konfokalnih mikroskopih s \xc5\xa1irokopasovnim izvorom se uporabi drug na\xc4\x8din zajema. Svetlobo na to\xc4\x8dno dolo\xc4\x8deno to\xc4\x8dko se usmeri s konfokalnim diskom, znanim tudi pod imenom Nipkowov disk. Tak na\xc4\x8din zajema je mnogo hitrej\xc5\xa1i, saj zajem slike traja le 1 ms, in je primeren za spremljanje dinami\xc4\x8dnih procesov. _NEWLINE_Konfokalni disk je plo\xc5\xa1\xc4\x8da s spiralno razporejenimi luknjicami, skozi katere se lahko hkrati osvetli in zajame ve\xc4\x8d to\xc4\x8dk iz izbrane ravnine. Konfokalni disk se postavi za polprepustno zrcalo, tako da svetloba, s katero se vzbuja, in svetloba, s katero se zajame sliko, potujeta skozi isto konfokalno re\xc5\xbeo in imata isto opti\xc4\x8dno pot. S tem se zagotovi, da sta ravnini, v katerih se vzbuja in zaznava, res so\xc5\xbeari\xc5\xa1\xc4\x8dni. Ko se enkrat presvetli konfokalni disk, se pridobi sliko z ve\xc4\x8d to\xc4\x8dk ravnine vzorca, ne pa z vseh to\xc4\x8dk. Celotno ravnino vzorca se posname tako, da se disk postopoma vrti. Celotno ravnino vzorca se posname po polnem obratu diska.\n_START_SECTION_\nZajem ve\xc4\x8d rezin\n_START_PARAGRAPH_\nInformacijo iz preostalih ravnin se pridobi s spreminjanjem gori\xc5\xa1\xc4\x8da ali pa s spreminjanjem lege vzorca v navpi\xc4\x8dni smeri. Z ustrezno programsko opremo iz zajema ve\xc4\x8d zaporednih rezin se rekonstruira trirazse\xc5\xbeno sliko vzorca.\n_START_SECTION_\nLo\xc4\x8dljivost\n_START_PARAGRAPH_\nPri konfokalni mikroskopiji se lahko govori o ravninski (lateralni) in navpi\xc4\x8dni (aksialni) lo\xc4\x8dljivosti, ki sta omejeni z uklonsko mejo. V ravnini se lahko dose\xc5\xbee lo\xc4\x8dljivost do 200 nm, kar je pribli\xc5\xbeno enako dol\xc5\xbeini ve\xc4\x8djih nanocevk. V navpi\xc4\x8dni smeri se dose\xc5\xbeemo lo\xc4\x8dljivost pribli\xc5\xbeno 500 nm, kar je najmanj\xc5\xa1a debelina plasti, ki se jo lahko razlo\xc4\x8di v optimalnih pogojih. _NEWLINE_Lo\xc4\x8dljivost je omejena z valovno dol\xc5\xbeino vpadne svetlobo in numeri\xc4\x8dno aperturo le\xc4\x8de. Na lo\xc4\x8dljivost vplivajo tudi poravnava opti\xc4\x8dnih elementov, odprtost konfokalne re\xc5\xbee in zna\xc4\x8dilnosti vzorca.\n_START_SECTION_\nVdorna globina\n_START_PARAGRAPH_\nVdorna globina je globina, iz katere se \xc5\xa1e lahko zazna signal, znatno ve\xc4\x8dji od ozadja. Mo\xc4\x8dno je odvisna od medija, v katerem je vzorec, in vrste fluorescentnih molekul, s katerimi se vzorec ozna\xc4\x8di. Najve\xc4\x8dja globina, ki se jo lahko dose\xc5\xbee, je reda 1 mm za polprepustne vzorce in pribli\xc5\xbeno 100  za nepropustne vzorce. Polprepustni vzorci so vzorci, ki se jih lahko presvetli in opazuje svetlobo, ki vzorec preide na drugo stran, nepropustni vzorci pa svetlobe ne prepu\xc5\xa1\xc4\x8dajo.\n_START_SECTION_\nUporaba\n_START_PARAGRAPH_\nUporablja se v biologiji, fizikalni kemiji, mikrobiologiji, nevroanatomiji, nevrofiziologiji in \xc5\xa1tevilnih drugih podro\xc4\x8djih. Nekatere izmed raziskovalnih podro\xc4\x8dij so \xc5\xa1tudija zarodnih celic, hibridizacija DNK ter uporaba membranskih in ionskih ozna\xc4\x8devalcev._NEWLINE_Konfokalni mikroskop je v kombinaciji s fluorescentnimi ozna\xc4\x8devalci ena od vodilnih metod, ki se uporabljajo za prou\xc4\x8devanje biolo\xc5\xa1kih vzorcev. Eden od razlogov je dejstvo, da so celice sestavljene iz fosfolipidnih membran, v katere se z lahkoto vgradi fluorescentne ozna\xc4\x8devalce. Z njimi se ozna\xc4\x8di izbrane strukture v vzorcu in se jih s tem lo\xc4\x8di od okolice. Laserski zajem slike omogo\xc4\x8da bolj\xc5\xa1o navpi\xc4\x8dno lo\xc4\x8dljivost, zajem s konfokalnim diskom pa s svojo hitrostjo zajema omogo\xc4\x8da spremljanje dinami\xc4\x8dnih procesov v vzorcu._NEWLINE_Kot slikovna tehnika ima odli\xc4\x8dno lo\xc4\x8dljivost, ki da podrobne informacije o zgradbi tkiv in dinamiki dolo\xc4\x8denih biolo\xc5\xa1kih procesov. Uporablja se tudi kot spektroskopska tehnika, s katero se analizira lokalno kemijsko okolico posameznih delov biolo\xc5\xa1kih objektov. Iz meritev spektra svetlobe, ki jo izsevajo fluorescentni ozna\xc4\x8devalci, se lahko dolo\xc4\x8di vrsta lokalnih medmolekulskih interakcij.\n_START_SECTION_\nNapredne tehnike\n_START_PARAGRAPH_\nVe\xc4\x8dfotonska fluorescenca in ve\xc4\x8dfotonska fluorescenca s konfokalnim mikroskopom (Multi Photon Confocal Fluorescence Microscopy): Vzorec se vzbuja s svetlobo z dvakrat dalj\xc5\xa1o valovno dol\xc5\xbeino (vsak foton take svetlobe ima pol manj energije), kot je potrebna za obi\xc4\x8dajno vzbujanje vzorca. Za vzbuditev vsake od fluorescirajo\xc4\x8dih molekul se v tem primeru potrebuje dva fotona, kar omeji vzbujanje vzorca na to\xc4\x8dko, kjer je jakost svetlobe najve\xc4\x8dja. Na ta na\xc4\x8din se vzbujanje lokalizira, kar mo\xc4\x8dno izbolj\xc5\xa1a kontrast. Konfokalni na\xc4\x8din le \xc5\xa1e prispeva k dodatnemu izbolj\xc5\xa1anju kontrasta._NEWLINE_Vzbujeno praznjenje emisije (STED - Stimulated Emission Depletion) je ena od tako imenovanih super lo\xc4\x8dljivostnih tehnik, pri katerem se z lo\xc4\x8dljivostjo se\xc5\xbee pod uklonsko mejo. Pri tej tehniki se svetlobo vzbujenih molekul v vzorcu zadu\xc5\xa1i povsod, razen v gori\xc5\xa1\xc4\x8du posebej v ta namen skonstruirane le\xc4\x8de._NEWLINE_Svetlobno aktivirana lokalizacija (PALM - PhotoActivated Localization Microscopy) in stohasti\xc4\x8dna opti\xc4\x8dna rekonstrukcija (STORM - Stohastic Optical Reconstruciton Microscopy) sta prav tako superlo\xc4\x8dljivostni tehniki. Obe temeljita na lokalizaciji posameznih fluorescentnih ozna\xc4\x8devalcev. Pri obeh tehnikah se zajame ve\xc4\x8d slik na istem mestu v nekaj zaporednih kratkih \xc4\x8dasovnih intervalih. Podatke se nato ra\xc4\x8dunalni\xc5\xa1ko obdela, pri \xc4\x8demer se upo\xc5\xa1teva gaussovsko porazdelitev zaznavanih fotonov, s \xc4\x8dimer se uspe lokalizirati fluorescentni ozna\xc4\x8devalec na obmo\xc4\x8dje, ki je manj\xc5\xa1e od ukonske limite._NEWLINE_Fluorescenca pri popolnem odboju (TIRFM - Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy): pri tej tehniki se izkori\xc5\xa1\xc4\x8da evanescetno polje, ki se \xc5\xa1iri v snov, \xc4\x8de se vzorec osvetljuje pod kotom, ve\xc4\x8djim od kota popolnega odboja. Vpadni \xc5\xbearek se od vzorca odbije, evanescetno polje pa v tanki plasti vzbudi fluorescenco. Ker se dobi signal le iz plasti, debele pribli\xc5\xbeno 10 nm, je lo\xc4\x8dljivost izbolj\xc5\xa1ana mnogo pod uklonsko mejo. Ker evanescetno polje pojema eksponentno z globino, je ta tehnika omejena na opazovanje vzorcev debeline 100-200 nm, oz. pri debelej\xc5\xa1ih vzorcih na opazovanje njihove povr\xc5\xa1ine. Tudi to je ena izmed superlo\xc4\x8dljivostnih tehnik._NEWLINE_Zajem \xc5\xbeivljenjskega \xc4\x8dasa fluorescence (FLIM - Fluorescence Lifetime Imaging): ta tehnika je druga\xc4\x8dna od zgoraj na\xc5\xa1tetih, saj se namesto jakosti svetlobe meri \xc5\xbeivljenjsko dobo fluorescence. To je \xc4\x8das, ki ga vzorec porabi, da potem, ko se nanj posveti s kratkim mo\xc4\x8dnim sunkom svetlobe, tudi sam sunkoma zasveti. S tem se zmanj\xc5\xa1a vpliv sipanja svetlobe na tkivu in se posledi\xc4\x8dno izbolj\xc5\xa1a kontrast na sliki.'