b"\n_START_ARTICLE_\nGensko zdravljenje\n_START_PARAGRAPH_\nGensko zdravljenje pomeni vnos specifi\xc4\x8dnega gena v celico z namenom popraviti kako specifi\xc4\x8dno napako. Prednost genskega zdravljenja je delovanje na dejavnike oziroma povzro\xc4\x8ditelje bolezni, ne pa le odprava simptomov.\n_START_SECTION_\nZgodovina\n_START_PARAGRAPH_\nTemeljna zamisel genske tehnologije se je porodila leta 1973, ko sta biokemika Herbert Boyer in Stanley Cohen posku\xc5\xa1ala izolirati gene iz celice, jih v epruveti spremeniti in razrezati ter dele na novo sestaviti. Te na novo sestavljene gene pa sta potem posku\xc5\xa1ala ponovno spraviti v celico. Pri tem je bilo klju\xc4\x8dno vpra\xc5\xa1anje ali bodo geni po tem posegu \xc5\xa1e delovali. Poskus se je posre\xc4\x8dil in genetiko iz sveta \xc4\x8diste znanosti izstrelil v vsakdanje \xc5\xbeivljenje._NEWLINE_Klini\xc4\x8dni preskusi genske terapije so se za\xc4\x8deli \xc5\xbee leta 1990 za zdravljenje dedne bolezni SCID; to je skupina bolezni, ki se v ve\xc4\x8dini populacij redko pojavlja, pogostej\xc5\xa1a pa je pri novorojen\xc4\x8dkih Indijancev na jugozahodu ZDA. SCID nastane zaradi okvare enega izmed genov, kar povzro\xc4\x8di motnje v razvoju limfocitov B in T, kar se ka\xc5\xbee v pomanjkljivem delovanju imunskega sistema. Leta 1990 so v kulture limfocitov T dveh deklic vnesli gen za adenozinsko deaminazo. Zdravljenje je bilo uspe\xc5\xa1no, kljub izrednemu uspehu tega zdravljenja, pa ni mogo\xc4\x8de potrditi, da je izbolj\xc5\xa1ano delovanje imunskega sistema izklju\xc4\x8dno posledica vnosa nadomestnega gena, saj sta deklici so\xc4\x8dasno prejemali tudi nadomestne odmerke manjkajo\xc4\x8dega encima.\n_START_SECTION_\nNevirusni vektorji\n_START_PARAGRAPH_\nTi vektorji imajo nekatere prednosti pred virusnimi, saj je delo z njimi veliko la\xc5\xbeje, kapaciteta za DNK sekvence je zelo visoka, toksi\xc4\x8dnost je relativno nizka, lahko so specifi\xc4\x8dno usmerjeni v tar\xc4\x8dno tkivo in niso imunogeni, kar omogo\xc4\x8da ponavljajo\xc4\x8de doziranje. Problem, s katerim se sre\xc4\x8dujemo pri takih vektorjih, je zelo nizka u\xc4\x8dinkovitost transdukcije. Med nevirusne vektorje pri\xc5\xa1tevamo liposome, molekularne konjugate, golo DNK, biolistiko in elektroporacijo.\n_START_SECTION_\nLiposomi\n_START_PARAGRAPH_\nPri tem genskem prenosu je DNA \xc2\xbbovita\xc2\xab\xc2\xa0v liposomalni pla\xc5\xa1\xc4\x8d, ki dovoljuje adsorpcijo na celi\xc4\x8dno membrano in vstop v celico s pomo\xc4\x8djo endocitoze. U\xc4\x8dinkovitost transdukcije v tem primeru je odvisna od velikosti liposoma in njegove lipidne sestave. U\xc4\x8dinkovitost lahko pove\xc4\x8damo z vstavitvijo monoklonskih protiteles v lipidni kompleks, tako je izklju\xc4\x8dena lizosomska pot.\n_START_SECTION_\nBiolistika\n_START_PARAGRAPH_\nOsnovni princip biolistike je \xc2\xbbbombardiranje\xc2\xab\xc2\xa0tanke plasti celic z zlatimi delci, na katere nanesemo molekule DNK. V nekaterih celicah, skozi katere potuje zlati delec, se DNK sprosti in stabilno integrira v celi\xc4\x8dni genom.\n_START_SECTION_\nGola DNK\n_START_PARAGRAPH_\nPlazmidna DNK se direktno vnese v tkivo (mi\xc5\xa1i\xc4\x8dne celice, ko\xc5\xbene celice in jetrne celice). Tako se lahko tvori zadovoljiv imunski odgovor na protein, katerega zapis se nahaja na vstavljeni DNK.\n_START_SECTION_\nVirusni vektorji\n_START_PARAGRAPH_\nVirusi iz razli\xc4\x8dnih dru\xc5\xbein (retrovirusi, adenovirusi, herpesvirusi, pikornavirusi in alfavirusi) so bili uporabljeni pri sestavljanju virusnega vektorja. Prvi uporabljeni virusi za gensko terapijo so bili retrovirusi.\n_START_SECTION_\nOsnovni koncept retrovirusnih vektorjev in t. i. pomagalnih sistemov\n_START_PARAGRAPH_\nPo vstopu virusa v celico sledi vgrajevanje in podvojevanje le-tega. Prihaja do sestavljanja novih virusov in kon\xc4\x8dno do zadnje stopnje v razmno\xc5\xbeevanju, do izstopanja iz celice. Virusi lahko vstopijo v celice \xc5\xa1ele, ko se s posebnimi proteinskimi ligandi, ki so na povr\xc5\xa1ini virusov (v ovojnici), pritrdijo na specifi\xc4\x8dne proteinske receptorje na membrani tar\xc4\x8dnih celic. Tako se npr. \xc4\x8dlove\xc5\xa1ki virus imunske pomankljivosti (HIV) pritrdi na CD4 in CXCR4, ali CCR5 receptorje limfocitov T in makrofagov. Njegov ligand je gp120, katerega zapis se nahaja v regiji env. Zato v ve\xc4\x8dini genskih terapij ni za\xc5\xbeeleno, da se dostavi virus, ki ima popolno zmo\xc5\xbenost podvojevanja, saj bi lahko pri\xc5\xa1lo do infekcij okoli\xc5\xa1kega tkiva in s tem do patogenega u\xc4\x8dinka. Prav zaradi omenjenega so v ve\xc4\x8dini retrovirusnih sistemov, namenjenih za gensko terapijo, virusne komponente razdeljene v vektor in t. i. pomagalni sistem. S tem se zmanj\xc5\xa1a mo\xc5\xbenost, da bi se virus prosto podvojeval. _NEWLINE_Ve\xc4\x8dina vektorjev ima delecijo enega ali ve\xc4\x8d genov, ki imajo zapis za virusne proteine. Pomagalni sistemi so sestavljeni tako, da nosijo zapis za virusne proteine, s tem je omogo\xc4\x8deno podvojevanje vektorjev. Pomagalni sistemi so ve\xc4\x8dinoma t. i. celice pomagalke ali pomagalni virusi. Slednjih se ne uporablja tako pogosto zaradi mo\xc5\xbenega nastanka kompetentno podvojevalnega virusa, saj je namre\xc4\x8d stopnja rekombinacije zelo velika. Ve\xc4\x8dina retrovirusnih vektorjev je vzdr\xc5\xbeevanih kot bakterijski plazmid zaradi la\xc5\xbeje manipulacije in podvojevanja.\n_START_SECTION_\nPomagalni sistem\n_START_PARAGRAPH_\nPri pomagalnem sistemu z \xc2\xbbenim genomom\xc2\xab\xc2\xa0(One-Genome Helper Constructs) so celi\xc4\x8dne linije klonirane s provirusno DNK, ki nima signala za sestavljanje. U\xc4\x8dinkovitost razmno\xc5\xbeevanja retrovirusnega vektorja je v tem primeru zelo velika. Omenjeni sistem vsebuje veliko virusnega genoma in si tako deli visoko stopnjo homologije z retrovirusnim vektorjem. Zaradi visoke homologije lahko pride do rekombinacije med sekvencami v genomu pomagalnega sistema in retrovirusnega vektorja, kar lahko vodi do nastanka samostojnega kompetentnega virusa. _NEWLINE_Poznamo \xc5\xa1e t. i. \xc2\xbbrazdeljen genski pomagalni sistem\xc2\xab\xc2\xa0(Split-Genome Helper Construct), pri katerem celi\xc4\x8dne linije vsebujejo dva plazmida. Eden nosi zapis za Gag/Gag-Pol poliproteine, drugi pa zapis za Env proteine. Tak sistem naj bi bil mnogo varnej\xc5\xa1i, saj pri tem te\xc5\xbeje prihaja do rekombinacije._NEWLINE_Znanih je kar nekaj pomagalnih sistemov, katerih bistvena vloga ostaja enaka, to je, da dobivamo visoke titre retrovirusnih vektorjev in da je zagotovljena visoka varnost. Omeniti velja \xc5\xa1e t. i. sisteme, ki tvorijo psevdoviruse. Pojem \xc2\xbbpsevdo\xc2\xab\xc2\xa0se v tem primeru nana\xc5\xa1a na novo zgrajene viruse, ki imajo nukleinsko kislino enega in beljakovinski pla\xc5\xa1\xc4\x8d drugega virusa.\n_START_SECTION_\nKloniranje oz. mesta kloniranja pri retrovirusih\n_START_PARAGRAPH_\nMLV (Murine Leukemia Virus) vektorji so najpogosteje uporabljeni retrovirusni vektorji. Osnovni princip takega vektorja je prikazan na sliki. Poznanih je nekaj proteinov ovojnice, ki so odgovorni za razpon gostitelja. Virusi, ki imajo ekotropi\xc4\x8dne ovojnice, lahko oku\xc5\xbeijo samo mi\xc5\xa1je celice. Mi\xc5\xa1je celice in celice drugih vrst pa lahko oku\xc5\xbeijo virusi z amfotropi\xc4\x8dno ovojnico. Virusi s ksenotropi\xc4\x8dno ovojnico lahko oku\xc5\xbeijo samo celice drugih vrst in ne mi\xc5\xa1jih celic. SNV (Spleen Necrosis Virus) vektorji so podobni MLV vektorjem, vendar niso pogosto uporabljeni v genskem zdravljenju.\n_START_SECTION_\nRekombinantni adenovirusni vektorji\n_START_PARAGRAPH_\nPrva generacija adenovirusnih vektorjev pri genskem prenosu je bila uporabljena \xc5\xbee leta 1985. Najpogostej\xc5\xa1a metoda pri pridobivanju rekombinantnih adenovirusov vklju\xc4\x8duje homologno rekombinacijo v celici sesalcev, ki je zmo\xc5\xbena \xc2\xbbdopolniti\xc2\xab\xc2\xa0nepopolne adenoviruse. Pri tej metodi potrebujemo dva vektorska sistema t. i. \xc2\xbbshuttle\xc2\xab\xc2\xa0in pomagalni plazmid. Prvi vektor ve\xc4\x8dinoma vsebuje 5' konce adenovirusnega genoma, pri katerem sta E1A in E1B gena zamenjana s transgenom. _NEWLINE_Izra\xc5\xbeanje transgena je vodeno s svojimi lastnimi regulatornimi elementi. Pomagalni sistem preskrbi ve\xc4\x8dino adenovirusnega genoma. Sestava novega virusa samo s pomagalnim sistemom ni mo\xc5\xbena zaradi tega, ker imajo le-ti delecijo E1 ali ostalih nujno potrebnih genov. Z vstavitvijo obeh vektorjev v celico se s pomo\xc4\x8djo homologne rekombinacije transgen vstavi v virusni genom in s tem zamenja E1A in E1B gene. \xc4\x8ceprav je sama metoda zelo uspe\xc5\xa1na, se je potek pokazal za dokaj te\xc5\xbeavnega in \xc4\x8dasovno zamudnega. Prav zaradi omenjenega posku\xc5\xa1ajo izbolj\xc5\xa1ati u\xc4\x8dinkovitost rekombinacije.\n_START_SECTION_\nKlini\xc4\x8dni poskusi\n_START_PARAGRAPH_\nPo podatkih revije Gene Medicine, so v klini\xc4\x8dnih poskusih pri genskem zdravljenju najpogosteje uporabljeni adenovirusni in retrovirusni vektorji. Prvi zavzemajo 25%, slednji pa 24%. Uporabljajo se predvsem za dostavo citokinov (26%), predstavitev antigenov (15%), zaviranje tumorske rasti (12%), ter apoptozo celic (7%). Prvi klini\xc4\x8dni testi genskega zdravljenja pri \xc4\x8dloveku so bili namenjeni zdravljenju genske bolezni imenovane ADA (adenozin deaminaza). Tak bolnik ima mo\xc4\x8dno prizadet imunski sistem. Pri tem bolniku so izolirali bele krvni\xc4\x8dke in jih inficirali z MLV vektorjem, ki je izra\xc5\xbeal ADA in neomicin fosfotransferazni gen (neo), kateri je slu\xc5\xbeil kot ozna\xc4\x8devalec. Nato se celice vstavili nazaj v bolnika. Bolniku se je stanje izbolj\xc5\xa1alo, prav tako so pa nekaj let kasneje na\xc5\xa1li provirus, ki je vseboval ADA.\n_START_SECTION_\nZdravljenje raka\n_START_PARAGRAPH_\nNamen pri zdravljenju raka je selektivno uni\xc4\x8denje tumorskega tkiva in celic. V splo\xc5\xa1nem se za zdravljenje uporabljajo geni, ki so ob\xc4\x8dutljivi na zdravila (npr. herpesna timidin kinaza), imunski spodbujevalci (IL-2, IL-12), antigeni melanoma (tumor melaninskih celic) (npr. MART-1), tumorski zaviralci (npr. p53). Do danes je bilo z adenovirusnimi vektorji zdravljenih mnogo vrst raka (melanoma, rak prostate, rak pankreasa, rak plju\xc4\x8d,...). Han in sodelavci so izdelali retrovirusni vektor, kateri je bil namenjen zdravljenju raka dojk (in vitro). Ekotropi\xc4\x8dno ovojnico Mo-MLV (Moloney murine leukemia virus) so spremenili z vstavitvijo sekvenc, ki so imele zapis za humani heregulin. Pri okoli 20% raka dojk, je rak posledica pretiranega izra\xc5\xbeanja HER-2 (receptor za \xc4\x8dlove\xc5\xa1ki epidermalni rastni faktor (EGF)). Zasledili so tudi dve ostali dru\xc5\xbeini, HER-3 in HER-4. Ligand za omenjene receptorje je heregulin. Tako so v celi\xc4\x8dnih linijah uspeli zni\xc5\xbeati izra\xc5\xbeanje HER-2,3,4. _NEWLINE_Druga skupina je uporabila pri zdravljenju raka dojk \xc2\xbbpopravljalni\xc2\xab\xc2\xa0pristop. Mutacija ali delecija v genih p53 in BRCA1 lahko vodi do nastanka raka dojk. S popravljanim pristopom lahko \xc2\xbbpopravimo\xc2\xab\xc2\xa0omenjena gena._NEWLINE_Mo\xc5\xbenosti s katerimi bi lahko zdravili raka je ve\xc4\x8d, in sicer:_NEWLINE_- Celi\xc4\x8dna smrt: v tumorske celice bi lahko vnesli gene za encime, ki bi neko netoksi\xc4\x8dno predzdravilo pretvorili v toksin, ki bi zaustavil delitev celice. Poznamo \xc4\x8dloveku lastne gene s tak\xc5\xa1nim delovanjem, \xc5\xa1e primernej\xc5\xa1i pa bi bili tuji geni, saj pri njih ne bi pri\xc5\xa1lo do pretvorbe predzdravila v toksi\xc4\x8dni metabolit v nobeni drugi celici, kot v tisti, ki bi ji vstavili encim potreben za pretvorbo._NEWLINE_- Virusno posredovana onkoliza: nekateri virusi se iz oku\xc5\xbeenih celic \xc5\xa1irijo ob citolizi, zato bi lahko mehanizem lize gostiteljskih celic uporabili pri zdravljenju tumorjev, tako da bi zagotovili selektivno razmno\xc5\xbeevanje virusov v tumorskih celicah in onemogo\xc4\x8dili njihovo razmno\xc5\xbeevanje v zdravem tkivu. To bi lahko storili z izrezovanjem virusnih genov, ki so potrebni za pomno\xc5\xbeevanje v normalnih celicah, vendar niso potrebni za replikacijo znotraj tumorskih celic. Primeri takih virusov so adenovirusi in HSV._NEWLINE_- Za\xc5\xa1\xc4\x8dita ob kemoterapiji: nekateri tumorji imajo gene, s katerimi se varujejo pred citotoksi\xc4\x8dnimi u\xc4\x8dinki, tak\xc5\xa1en gen je tudi MDR-1. Ta gen spada med gene, ki kodirajo transportne beljakovine za odpornost na \xc5\xa1tevilna zdravila, zato bi lahko toksi\xc4\x8dne u\xc4\x8dinke kemoterapije zmanj\xc5\xa1ali s selektivnim vnosom za\xc5\xa1\xc4\x8ditnih genov MDR-1 v zdrave celice, s \xc4\x8dimer bi, kljub visokim dozam kemoterapevtika, ohranili za obrambo telesa potrebo \xc5\xa1tevilo celic naravnega in imunskega odgovora.\n_START_SECTION_\nNevarnosti genskega zdravljenja\n_START_PARAGRAPH_\nPri vektorjih, ki se v celicah vrinejo v celi\xc4\x8dni genom, \xc5\xa1e ne znamo kontrolirati mesta vrivanja v genom, zato bi lahko vnos vektorja prekinil kak pomemben celi\xc4\x8dni gen ali spremenil uravnavanje izra\xc5\xbeanja sosednjih genov. Prekinitev za celico pomembnega gena bi lahko vodila v razvoj druge genetske bolezni ali okvare, \xc4\x8de pa bi bil gen s spremenjenim izra\xc5\xbeanjem pri katerem se v celico vnesejo nukleinske kisline, za nadomestilo, spremembo ali uti\xc5\xa1anje izra\xc5\xbeanja genov tumorski supresor ali onkogen, pa bi lahko pri\xc5\xa1lo do maligne transformacije. Mo\xc4\x8dan imunski odziv na vnos vektorja pa je lahko tudi smrten, saj lahko povzro\xc4\x8di odpoved organov._NEWLINE_Obstaja pa tudi mo\xc5\xbenost genske obdelave zarodnih celic oziroma oplojenih jaj\xc4\x8dec, s \xc4\x8dimer bi se popravljeni gen z delitvijo zarodne celice prenesel v vse celice zarodka oz. novorojen\xc4\x8dka, hkrati pa bi s tem prekinili morebiten prenos okvarjenega gena na naslednje generacije. Tveganje tak\xc5\xa1nega zdravljenja je veliko, saj bi lahko \xc5\xbee majhna tehnolo\xc5\xa1ka napaka vplivala na vse naslednje generacije, zato so tovrstni posegi v \xc4\x8dlove\xc5\xa1ke zarodne celice prepovedani._NEWLINE_Prvi bolnik, ki je umrl zaradi genskega zdravljenja, je bil Jesse Gelsinger. Imel je okvaro jetrnega encima ornitin transkarbamilaze (OTC), ki kontrolira metabolizem amonija. Uporabljen je bil adenovirusni vektor, ki je imel zapis za izra\xc5\xbeanje OTC. Po inficiranju z vektorjem se vektor ni dostavil samo v jetra, temve\xc4\x8d tudi v druga tkiva. Pri\xc5\xa1lo je do sistemati\xc4\x8dnega vnetnega odziva. Bolnik je dobil visoko vro\xc4\x8dino, kateri je sledila koma in nazadnje smrt. Kot navaja FDA (Food and Drugs Administration) naj bi bilo kr\xc5\xa1enih ve\xc4\x8d pravil. FDA namre\xc4\x8d ni bila obve\xc5\xa1\xc4\x8dena o tem, da sta imela predhodna bolnika, zdravljena na enak na\xc4\x8din, zelo resne te\xc5\xbeave. Raziskovalci niso sporo\xc4\x8dili, da sta pri izvajanju poskusov na dveh opicah obe umrli, prav tako naj bi imel Gelsinger visoko po\xc5\xa1kodbo ledvic, zato naj se ne bi izvedli poskusi. Verjetno Gelsinger ni bil edini, ki je umrl zaradi genskega zdravljenja, zato je pomembno v prvi vrsti zagotoviti varnost bolnika.\n_START_SECTION_\nKomisija evropskih skupnosti\n_START_PARAGRAPH_\nIzdelki za gensko in somatsko celi\xc4\x8dno zdravljenje so razvr\xc5\xa1\xc4\x8deni kot zdravila in kot tak\xc5\xa1ni obravnavani v Skupnosti (Del IV Priloge I k Direktivi 2001/83/ES, kakor je bila spremenjena z Direktivo 2003/63/ES), zlasti izdelki tkivnega in\xc5\xbeenirstva pa so trenutno zunaj katerega koli zakonodajnega okvira Skupnosti. To vodi k razli\xc4\x8dnim nacionalnim pristopom glede pravnega razvr\xc5\xa1\xc4\x8danja in pridobivanja dovoljenja za promet, s \xc4\x8dimer se kr\xc5\xa1i prosti pretok izdelkov tkivnega in\xc5\xbeenirstva v Skupnosti in ovira dostop bolnikov do teh inovativnih oblik zdravljenja.\n_START_SECTION_\nOdbor za napredno zdravljenje\n_START_PARAGRAPH_\nV okviru agencije EMEA (European Medicines Agency) je Odbor za zdravila za uporabo v humani medicini (Committee for Medicinal Products for Human Use \xe2\x80\x93 CHMP) odgovoren za pripravo mnenja Agencije o kakr\xc5\xa1nih koli znanstvenih zadevah glede vrednotenja zdravil za humano uporabo in za zagotovitev doslednosti pri presoji tveganj in koristi za vse kategorije zdravil._NEWLINE_Vendar pa ocenjevanje zdravil za napredno zdravljenje pogosto zahteva zelo posebno strokovno znanje, ki presega okvire tradicionalnega farmacevtskega podro\xc4\x8dja in zajema mejna podro\xc4\x8dja z drugimi sektorji, kot so biotehnologija ali medicinski pripomo\xc4\x8dki. Zato je primerno znotraj Agencije ustanoviti Odbor za napredno zdravljenje (Committee for Advanced Therapies \xe2\x80\x93 CAT), s katerim bi se CHMP posvetoval glede ocene podatkov o zdravilih za napredno zdravljenje in ki bi pri tem ostal odgovoren za izdana znanstvena mnenja.\n_START_SECTION_\nUredba evropskega parlamenta in sveta\n_START_PARAGRAPH_\nEvropski parlament in Svet Evropske unije sta ob upo\xc5\xa1tevanju Pogodbe o ustanovitvi Evropske skupnosti, zlasti \xc4\x8dlena 95 Pogodbe, ob upo\xc5\xa1tevanju predloga Komisije, ob upo\xc5\xa1tevanju mnenja Ekonomsko-socialnega odbora, ob upo\xc5\xa1tevanju mnenja Odbora regij, v skladu s postopkom iz \xc4\x8dlena 251 Pogodbe in ob upo\xc5\xa1tevanju 28 alinej sprejela 30 \xc4\x8dlenov za uredbo, ki dolo\xc4\x8da posebna pravila v zvezi pridobivanjem dovoljenja za zdravila za napredno zdravljenje, njihovim nadzorom in farmakovigilanco. Celotna uredba je dostopna na spletu."