b'\n_START_ARTICLE_\nPolihistidinski podalj\xc5\xa1ek\n_START_PARAGRAPH_\nPolihistidinski podalj\xc5\xa1ek ali repek je aminokislinski motiv v beljakovinah, ki je sestavljen iz najmanj \xc5\xa1estih histidinskih (His) ostankov, ki se obi\xc4\x8dajno nahajajo na N- ali C- koncu beljakovine. Znan je tudi pod imeni heksahistidinski podalj\xc5\xa1ek, 6xHis-podalj\xc5\xa1ek, His6-podalj\xc5\xa1ek ali pa pod za\xc5\xa1\xc4\x8ditenim imenom \xc2\xbbHis-tag\xc2\xab (registrirano pri EMD Biosciences). Podalj\xc5\xa1ek so izumili pri podjetju Roche, z uporabo histidinov in njegovih vektorjev pa se ukvarja Qiagen. Razli\xc4\x8dne \xc4\x8distilne sete za beljakovine, ozna\xc4\x8dene s histidini, tr\xc5\xbeijo podjetja Qiagen, Sigma, Thermo Scientific, GE Healthcare, Macherey-Nagel, Clontech, Bio-Rad in druga.\xc2\xa0_NEWLINE_Uporaba polihistidinskega podalj\xc5\xa1ka za akademske uporabnike je neomejena; komercialni uporabniki pa morajo za uporabo pla\xc4\x8dati licen\xc4\x8dnino podjetju Roche. Prvotni patent je potekel 11. februarja 2003, tako da bi do zdaj moral biti \xc5\xbee javna lastnina, ampak trenutna pravica do licen\xc4\x8dnine temelji na precej o\xc5\xbejem naboru novej\xc5\xa1ih patentov. Primerna zaporedja podalj\xc5\xa1ka so dostopna za komercialno uporabo zastonj; na primer MK(HQ)6 se lahko uporablja za okrepljeno izra\xc5\xbeanje v E. coli in odstranitev podalj\xc5\xa1ka. Celokupno \xc5\xa1tevilo histidinskih ostankov v podalj\xc5\xa1ku lahko variira. Podalj\xc5\xa1ku lahko sledi tudi primerno aminokislinsko zaporedje, ki olaj\xc5\xa1a odstranitev polihistidinskega podalj\xc5\xa1ka z endopeptidazami. To dodatno zaporedje ni potrebno, \xc4\x8de se za odstranitev podalj\xc5\xa1ka z N-konca uporabijo eksopeptidaze (npr.: Qiagen TAGZyme). Poleg tega se lahko z rezanjem z eksopeptidazami izognemo nespecifi\xc4\x8dnemu rezanju, ki ga opazimo, ko odstranjujemo podalj\xc5\xa1ek z endoproteazami. Ozna\xc4\x8devanje s polihistidinskimi podalj\xc5\xa1ki se pogosto uporablja za afinitetno \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denje gensko spremenjenih beljakovin.\xc2\xa0\n_START_SECTION_\n\xc4\x8ci\xc5\xa1\xc4\x8denje proteinov\n_START_PARAGRAPH_\nPolihistidinski podalj\xc5\xa1ki se pogosto uporabljajo pri afinitetnem \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denju rekombinantnih proteinov, ozna\xc4\x8denih s polihistidinskim podalj\xc5\xa1kom, ki se izra\xc5\xbeajo v Escherichii coli ali v drugih prokariontskih ekspresijskih sistemih. S centrifugiranjem izvedemo \xc5\xbeetev bakterijskih celic in dobljeno celi\xc4\x8dno usedlino liziramo s fizikalnimi metodami, z uporabo detergentov in encimov (npr. lizocim) ali pa s katerokoli kombinacijo le-teh. Na tej stopnji lizat ne vsebuje samo rekombinantnega proteina, ampak tudi mnoge druge proteine, katerih vir je bakterijski gostitelj. To me\xc5\xa1anico inkubiramo z afinitetnim nosilcem, ki vsebuje vezane dvovalentne nikljeve ali kobaltove ione, ki so dostopni na trgu v razli\xc4\x8dnih oblikah. Nikelj in kobalt imata podobne lastnosti, sta sosednja atoma v \xc4\x8detrti periodi periodnega sistema. Nosilci so v glavnem okrogli delci sefaroze ali agaroze, funkcionalizirani s kelatorjem, kot so iminodiacetatna kislina (Ni-IDA) in nitrilotriacetatna kislina (Ni-NTA) za nikelj ter karboksilmetilaspartat (Co-CMA) za kobalt, na katere se z mikromolarno afiniteto ve\xc5\xbeejo polihistidinski podalj\xc5\xa1ki. Kolono speremo s fosfatnim pufrom, s \xc4\x8dimer se znebimo proteinov, ki ne interagirajo specifi\xc4\x8dno s kobaltovimi ali nikljevimi ioni. \xc4\x8ce stacionarna faza vsebuje nikljeve ione, lahko \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denje izbolj\xc5\xa1amo z dodatkom 20 mM imidazola (proteini se obi\xc4\x8dajno eluirajo s 150-300 mM imidazolom). Stacionarna faza z nikljem ima vi\xc5\xa1jo kapaciteto vezave, stacionarna faza s kobaltom pa daje najvi\xc5\xa1jo \xc4\x8distost. \xc4\x8cistost in vsebnost proteinov lahko ocenimo s poliakrilamidno gelsko elektroforezo in Western blot-om._NEWLINE_\xc4\x8ce se rekombinantni protein izra\xc5\xbea v prokariontskih organizmih, je u\xc4\x8dinkovitost \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denja z afinitetnim \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denjem z uporabo polihistidinskih podalj\xc5\xa1kov po navadi precej visoka \xe2\x80\x93 daje relativno \xc4\x8diste proteine. Odvisno od nadaljnih aplikacij, vklju\xc4\x8dno s \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denjem proteinov za preu\xc4\x8devanje proteinskih interakcij, pa \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denje proteinov iz vi\xc5\xa1jih organizmov v\xc4\x8dasih potrebuje TAP metodo \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denja (\xc2\xbbTandem affinity purification\xc2\xab) pri kateri za dosego vi\xc5\xa1je \xc4\x8distosti uporabimo dva podalj\xc5\xa1ka. Druga\xc4\x8de pa daje \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denje v enem koraku z uporabo imobiliziranih kobaltovih ionov ve\xc4\x8djo \xc4\x8distoto izoliranega proteina s polihistidinskimi podalj\xc5\xa1ki in potrebuje ni\xc5\xbeje koncentracije imidazola za elucijo kot pri \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denju z uporabo nikljevih ionov.\xc2\xa0_NEWLINE_Afinitetna kromatografija proteinov, ozna\xc4\x8denih s polihistidinskim podalj\xc5\xa1kom je primerna metoda za \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denje rekombinantnih proteinov v denaturirajo\xc4\x8dih pogojih, saj je njen na\xc4\x8din delovanja odvisen le od primarne strukture proteinov. Na splo\xc5\xa1no pri takih metodah \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denja uravnavamo vezavo histidina s pH-jem raj\xc5\xa1i kot s spiranjem z imidazolom \xe2\x80\x93 pri visokih vrednostih pH-ja je histidin vezan na nikelj ali kobalt, pri ni\xc5\xbejih pH-jih (~6 za kobalt in ~4 za nikelj) pa je histidin protoniran in ni vezan na kovinski ion. Pri drugih metodah \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denja (pri na primer \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denju s protitelesi ali \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denju z glutation S-transferazo) pa je predpogoj, da so proteini zviti v nativni konformaciji._NEWLINE_Kolone, ki jih uporabimo pri takem \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denju, zadr\xc5\xbeijo \xc5\xa1tevilne dobro poznane proteine kot ne\xc4\x8disto\xc4\x8de. Eden izmed njih je SlyD, 25-kDa peptidil prolil izomeraza, ki spada v dru\xc5\xbeino FKBP proteinov. Na splo\xc5\xa1no se ne\xc4\x8distot znebimo s sekundarno kromatografsko metodo, ali pa z izra\xc5\xbeanjem rekombinantnega proteina v sevu E. Coli, v katerem se SlyD ne izra\xc5\xbea. Za \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denje v enem koraku pa lahko uporabimo nosilec s kobaltom, saj ta ne ve\xc5\xbee SlyD iz E. coli.\xc2\xa0\n_START_SECTION_\nLo\xc4\x8devanje enega od dveh polihistidinskih podalj\xc5\xa1kov\n_START_PARAGRAPH_\nProteini z razli\xc4\x8dnim \xc5\xa1tevilom polihistidinskih podalj\xc5\xa1kov se razli\xc4\x8dno eluirajo s stacionarne faze z nikljem. Za proteine z enim heksahistidinskim podalj\xc5\xa1kom je za elucijo z Ni-NTA dovolj spiranje s 75 mM imidazolom, za proteine z dvema heksahistidinskima podalj\xc5\xa1koma pa potrebujemo 100 mM imidazol. Tako postopno elucijo lahko uporabimo, ko \xc5\xbeelimo izolirati posebno skupino proteinov iz me\xc5\xa1anice, kot na primer definirane heteromultimere (npr.: AB heterodimer iz me\xc5\xa1anice, ki vsebuje tudi AA in BB homodimere, \xc4\x8de ima samo B podenota polihistidinski podalj\xc5\xa1ek). Tak pristop so uporabili pri izolaciji monovalentnega streptavidina.\xc2\xa0\n_START_SECTION_\nTest vezave\n_START_PARAGRAPH_\nOzna\xc4\x8devanje s polihistidinskimi podalj\xc5\xa1ki lahko uporabimo tudi za detekcijo interakcij protein-protein, ampak naj bi bila ta metoda manj ob\xc4\x8dutljiva in omejena z nekaterimi bolj zahtevnimi vidiki te metode \xe2\x80\x93 na primer ne smemo uporabiti reducirajo\xc4\x8dih pogojev ter EDTA-e in mnogih drugih detergentov. Nedavni napredek v dvojni polarizacijski interferometriji je omogo\xc4\x8dil uporabo EDTA in \xc5\xa1ir\xc5\xa1ega ranga reagentov, uporaba takih prostorsko-specifi\xc4\x8dnih oznak pa zelo poenostavi neposredne meritve, povezane s konformacijskimi spremembami.\n_START_SECTION_\nFluorescentne oznake\n_START_PARAGRAPH_\nRazvili so tudi heksahistidinske CyDye oznake. Te izkori\xc5\xa1\xc4\x8dajo vezavo nikljevih ionov na EDTA skupine, ki so vezane na fluorofore, da se ustvari barvilo, ki se ve\xc5\xbee na polihistidinski podalj\xc5\xa1ek. Ta metoda je u\xc4\x8dinkovita, ko \xc5\xbeelimo opazovati migracijo proteinov. Nedavna odkritja ka\xc5\xbeejo tudi na to, da je ta metoda lahko u\xc4\x8dinkovita pri merjenju razdalje s Fluorescentnim resonantnim energijskim transferjem.\n_START_SECTION_\nDodajanje polihistidinskih podalj\xc5\xa1kov\xc2\xa0\n_START_PARAGRAPH_\nNajbolj pogosti polihistidinski podalj\xc5\xa1ki so sestavljeni iz \xc5\xa1estih histidinskih ostankov - ti se dodajajo na N-koncu, pred katerim je metionin, ali na C-koncu, pred stop kodonom v kodirajo\xc4\x8dem zaporedju proteina, ki nas zanima. Izbira konca za dodajanje polihistidinskega podalj\xc5\xa1ka je odvisna od karakteristike proteina in metode, ki jo bomo izbrali za odstanitev podalj\xc5\xa1ka. Nekateri konci so zakopani v jedro proteina, drugi pa so pomembni za funkcijo in strukturo proteina. V takih primerih je izbira omejena na drugi konec proteina.\xc2\xa0 Po drugi strani pa najbolj dostopne eksopeptidaze lahko odstranijo polihistidinski podalj\xc5\xa1ek samo z N-konca; za odstranitev podalj\xc5\xa1ka s C-konca bi potrebovali druge metode._NEWLINE_Obstajata dva na\xc4\x8dina dodajanja polihistidinov. Najbolj preprost na\xc4\x8din je, da se vstavi DNA, ki kodira protein v vektor, ki kodira polihistidinski podalj\xc5\xa1ek, tako, da bo ta samodejno pritrjen na enega izmed koncev proteina(Glej sliko). Druga metoda je izvedba PCR-ja z za\xc4\x8detnimi oligonukleotidi, ki imajo ponavljajo\xc4\x8de se histidinske kodone (CAT ali CAC) tik ob START ali STOP kodonu poleg \xc5\xa1tevilnih (16 ali ve\xc4\x8d) baz od enega izmed koncev DNA, ki kodira protein, ki bo ozna\xc4\x8den (Glej primer za\xc4\x8detnega oligonukleotida spodaj).\xc2\xa0_NEWLINE_Primer za\xc4\x8detnega oligonukleotida, na\xc4\x8drtovanega za dodajanje polihistidinskega podalj\xc5\xa1ka s PCR. Osemnajst baz, ki kodirajo \xc5\xa1est histidinov, je vstavljenih tik po START kodonu ali tik pred STOP kodonom. Vsaj 16 baz, specifi\xc4\x8dnih za gen, mora biti poleg polihistidinskega podalj\xc5\xa1ka. Heksahistidinski podalj\xc5\xa1ek doda proteinu vsaj 1 kDa molekulske mase. Opomba: pogosto je med proteinom in heksahistidinskim podalj\xc5\xa1kom vstavljen distan\xc4\x8dnik (kot na primer gly-gly-gly ali gly-ser-gly) zato, da polihistidinski podalj\xc5\xa1ek ne bi vplival na aktivnost ozna\xc4\x8denega proteina.\xc2\xa0\n_START_SECTION_\nDetekcija\xc2\xa0\n_START_PARAGRAPH_\nPolihistidinske podalj\xc5\xa1ke lahko uporabljamo tudi za detekcijo proteinov s pomo\xc4\x8djo protiteles proti polihistidinskim podalj\xc5\xa1kom, ali pa pri poliakrilamidni gelski elektroforezi v prisotnosti natrijevega lavrilsulfata (SDS-PAGE). To je uporabno pri subcelularni lokalizaciji, ELISA-i, Western-blotu in drugih imuno-analiti\xc4\x8dnih metodah.\xc2\xa0\n_START_SECTION_\nImobilizacija\xc2\xa0\n_START_PARAGRAPH_\nPolihistidinske podalj\xc5\xa1ke uporabljamo tudi za imobilizacijo proteinov na povr\xc5\xa1ino, kot na primer na z nilkjem ali kobaltom prekrite mikrotitrske plo\xc5\xa1\xc4\x8de ali pa na proteinsko mre\xc5\xbeo.\xc2\xa0'