b'\n_START_ARTICLE_\nAgarozna gelska elektroforeza\n_START_PARAGRAPH_\nAgarozna gelska elektroforeza je metoda, ki se uporablja v biokemiji in molekularni biologiji za lo\xc4\x8devanje molekul DNK ali RNK glede na njihovo velikost. To dose\xc5\xbeemo s premikanjem negativno nabitih molekul nukleinskih kislin skozi agarozni gel v elektri\xc4\x8dnem polju. Kraj\xc5\xa1e molekule se premikajo hitreje in posledi\xc4\x8dno pripotujejo dlje od dalj\xc5\xa1ih._NEWLINE_Agaroza je linearni polisaharid, ki je topen v vro\xc4\x8di vodi oziroma v ustreznem pufru, pri ohlajanju pa polimerizira in tvori gel. Prednosti gela so, da se ga enostavno vlije in da ne denaturira vzorcev. Vzorce se lahko iz gela tudi ponovno pridobi in uporabi. Ve\xc4\x8dinoma uporabljamo gele z 0,7 do 2% agarozo.\n_START_SECTION_\nDejavniki, ki vplivajo na hitrost potovanja DNK\n_START_PARAGRAPH_\nNajbolj pomemben dejavnik je dol\xc5\xbeina DNK molekule; manj\xc5\xa1e molekule pripotujejo dlje, ker se la\xc5\xbeje prebijajo skozi pore v gelu in ustvarjajo manj\xc5\xa1i upor trenju. Prav tako vpliva na hitrost potovanja oblika DNK molekule. Pri obi\xc4\x8dajnih pogojih elektroforeze najhitreje potuje dodatno zvita oblika plazmida, nekoliko po\xc4\x8dasneje linearna in najpo\xc4\x8dasneje kro\xc5\xbena oblika plazmida._NEWLINE_\xc4\x8ce pove\xc4\x8damo koncentracijo agaroze, se hitrost potovanja DNK molekul zmanj\xc5\xa1a, s tem omogo\xc4\x8dimo lo\xc4\x8ditev manj\xc5\xa1ih molekul, zato v gelu z dolo\xc4\x8deno gostoto lo\xc4\x8dujemo le molekule dolo\xc4\x8denih velikosti. Vpliva tudi napetost, vi\xc5\xa1ja je le ta, hitreje potuje DNK. Pri previsoki napetosti bi se gel preve\xc4\x8d segrel, in bi se v kon\xc4\x8dni fazi lahko za\xc4\x8del topiti. Hitrost potovanja molekul DNK je zato sorazmerna z uporabljeno mo\xc4\x8djo elektri\xc4\x8dnega polja le pri nizkih napetostih, pri vi\xc5\xa1jih napetostih pa se ve\xc4\x8dji fragmenti za\xc4\x8dnejo gibati relativno hitro in je njihovo lo\xc4\x8devanje slab\xc5\xa1e, torej se zmanj\xc5\xa1a resolucija (nad 5 do 8 V/cm).\n_START_SECTION_\nVizualizacija\n_START_PARAGRAPH_\nNajpogosteje uporabljeno barvilo pri agarozni gelski elektroforezi je etidijev bromid ali kraj\xc5\xa1e EtBr. Slednji fluorescira pod ultravijoli\xc4\x8dno svetlobo (UV) svetlobo, ko se vstavi (interkalira) v DNK ali RNK. Ko potujejo molekule DNK skozi gel, ki vsebuje EtBr in gel izpostavimo UV svetlobi, postane vsak pas, ki vsebuje ve\xc4\x8d kot 20 ng DNK jasno viden. EtBr s svojim vgrajevanjem v molekule DNK tudi zmanj\xc5\xa1a njihovo mobilnost (za pribli\xc5\xbeno 15 odstotkov). Zaradi vgrajevanje v DNK, je EtBr znan mutagen, zato so na voljo tudi varnej\xc5\xa1e alternative, ki pa so obi\xc4\x8dajno precej dra\xc5\xbeje za proizvodnjo. Omeniti velja SYBR Green, SYBR Safe in GelRed._NEWLINE_SYBR Green proizvaja Invitrogen in je precej dra\xc5\xbeji, a 25-krat bolj ob\xc4\x8dutljiv in verjetno varnej\xc5\xa1i kot EtBr, \xc4\x8deprav ni podatkov o njegovi mutagenosti in toksi\xc4\x8dnosti. SYBR Safe pa je razli\xc4\x8dica SYBR Green-a, ki ima dokazano dovolj nizko raven mutagenosti in toksi\xc4\x8dnosti, da v ZDA ne spada med nevarne odpadke. Njegova ob\xc4\x8dutljivost je podobna kot pri etidijevemu bormidu, le da je tako kot SYBR Green ob\xc4\x8dutno dra\xc5\xbeji. GelRed so razvili pri Biotiumu in ima skoraj enake absorpcijske in emisijske spektre kot EtBr, torej ne potrebujemo nobenih novih naprav ali nastavitev. GelRed ni mutagen in ni toksi\xc4\x8den ter je okolju prijazen._NEWLINE_Ker molekule DNK, obarvane z EtBr, niso vidne pod naravno svetlobo, dodamo vzorcu negativno nabit nana\xc5\xa1alni pufer, predno ga nalo\xc5\xbeimo v gel. Nana\xc5\xa1alni pufri so uporabni, ker so vidni pod naravno svetlobo in ko-sedimentirajo z DNK, kar pomeni, da se premikajo z enako hitrostjo kot DNK dolo\xc4\x8dene dol\xc5\xbeine. Med tak\xc5\xa1ne pufre spadajo ksilen cianol in bromofenol modro (potujeta enako hitro kot fragmenti v velikosti 300 in 5000 bp) ter kresol rde\xc4\x8de in oran\xc5\xbe G (potujeta enako hitro kot fragmenti v velikosti 50 in 125 bp).\n_START_SECTION_\nPufri\n_START_PARAGRAPH_\nPri agarozni gelski elektroforezi se lahko uporablja ve\xc4\x8d pufrov. Med pogosteje uporabljane spadajo: tris acetatni pufer ali TAE (tris/acetat/EDTA), tris boratni pufer ali TBE (tris/borat/EDTA) ter litijev boratni pufer ali LB. TAE ima najni\xc5\xbejo pufersko kapaciteto in omogo\xc4\x8da najbolj\xc5\xa1o resolucijo za ve\xc4\x8dje molekule DNK. To pomeni dalj\xc5\xa1i \xc4\x8das lo\xc4\x8devanja pri ni\xc5\xbeji napetosti, a bolj\xc5\xa1i rezultat. LB je relativno nov pufer, in je neu\xc4\x8dinkovit pri fragmentih ve\xc4\x8djih kot 5 kbp, po drugi strani pa zaradi njegove slabe prevodnosti lahko uporabimo precej vi\xc5\xa1jo napetost (do 35 V/cm), kar pomeni, da bo \xc4\x8das lo\xc4\x8devanja kraj\xc5\xa1i.\n_START_SECTION_\nAnaliza\n_START_PARAGRAPH_\nKo je elektroforeza kon\xc4\x8dana, gel osvetlimo z UV svetlobo in ga fotografiramo. Z etidijevim bromidom obarvana DNK fluorescira rde\xc4\x8de-oran\xc5\xbeo. Pas DNK lahko tudi izre\xc5\xbeemo iz gela, ga raztopimo, in izolirano DNK uporabimo za nadaljnje delo.'