b'\n_START_ARTICLE_\nVeri\xc5\xbena reakcija s polimerazo\n_START_PARAGRAPH_\nVeri\xc5\xbena reakcija s polimerazo, znana tudi pod angle\xc5\xa1ko kratico PCR (Polymerase Chain Reaction), je metoda, ki omogo\xc4\x8da kopiranje odsekov DNA s pomo\xc4\x8djo encima DNA-polimeraze. Lahko re\xc4\x8demo, da s to metodo kloniramo DNA, ne da bi za to potrebovali \xc5\xbeive celice, to pa pred odkritjem PCR prakti\xc4\x8dno ni bilo mogo\xc4\x8de. Metodo je leta 1983 razvil ameri\xc5\xa1ki biokemik Kary Mullis, za kar je leta 1993 prejel Nobelovo nagrado za kemijo._NEWLINE_Bistvo kloniranja DNA je v izolaciji posamezne verige DNA iz kompleksne me\xc5\xa1anice DNA molekul. Kloniranje je omogo\xc4\x8dilo velik napredek pri razumevanju sestave in delovanja genov in genoma. Klasi\xc4\x8dno kloniranje ima veliko pomanjkljivost in sicer, da je izredno \xc4\x8dasovno potratno ter tehni\xc4\x8dno zahtevno. Klasi\xc4\x8dno kloniranje fragmentov DNA lahko traja ve\xc4\x8d dni, saj so potrebne obse\xc5\xbene spremembe DNA za vnos v klonirni vektor. Tej fazi sledi prenos vektorja v gostujo\xc4\x8do celico in kasneje tudi izbor ustreznih rekombinant. PCR izpopolnjuje kloniranje tako, da omogo\xc4\x8da \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denje specifi\xc4\x8dnega fragmenta DNA v samo nekaj urah. Kljub temu ima PCR nekaj omejitev. Najpomembnj\xc5\xa1a je ta, da moramo nujno poznati vsaj en del\xc4\x8dek fragmenta, ki ga \xc5\xbeelimo klonirati._NEWLINE_Kopiranje odsekov DNA poteka tako, da uporabimo dve kratki molekuli DNA, ki sta komplementarni za\xc4\x8detnemu in kon\xc4\x8dnemu delu segmenta, ki ga \xc5\xbeelimo kopirati, dodamo encim, raztopino soli in deoksiribonukleotide (gradnike DNA). Reakcija poteka veri\xc5\xbeno; to pomeni, da jo ve\xc4\x8dkrat ponovimo. Pri vsaki ponovitvi se \xc5\xa1tevilo kopij pomno\xc5\xbeevanega odseka podvoji; tako lahko po 20 ponovitvah reakcije dobimo iz 1 kopije DNA teroreti\xc4\x8dno ve\xc4\x8d kot 1 milijon kopij. Temperatura reakcije se mora kontrolirano spreminjati. Za vezavo kratkih molekul DNA (za\xc4\x8detnih oligonukleotidov) na matrico, ki jo \xc5\xbeelimo pomno\xc5\xbeevati, je namre\xc4\x8d nujno, da je matrica v enoveri\xc5\xbeni obliki (DNA je obi\xc4\x8dajno dvoveri\xc5\xbena molekula), to pa dose\xc5\xbeemo tako, da DNA za kratek \xc4\x8das segrejemo na 92\xc2\xa0\xc2\xb0C ali ve\xc4\x8d (to stopnjo imenujemo denaturacija DNA). Da pride do prileganja za\xc4\x8detnih oligonukleotidov na matrico je treba temperaturo spet zni\xc5\xbeati (na 37\xc2\xa0\xc2\xb0C - 55\xc2\xa0\xc2\xb0C), nato pa spet prilagoditi pogojem, ki so optimalni za delovanje DNA-polimeraze._NEWLINE_Nekaj let po tem, ko je Mullis opisal metodo PCR, so jo drugi avtorji izpopolnili tako, da so namesto DNA-polimeraze iz bakterije Escherichia coli (ta ima optimalno temperaturo za delovanje 37\xc2\xa0\xc2\xb0C in pri visokih temperaturah denaturacije DNA razpade) uporabili polimerazo iz bakterije Thermus aquaticus, ki so jo na\xc5\xa1li v vro\xc4\x8dih vrelcih v ameri\xc5\xa1kem narodnem parku Yellowstone. Ta polimeraza je termostabilna: optimalno deluje pri 72\xc2\xa0\xc2\xb0C, prenese pa tudi kratkotrajna segrevanja nad 90\xc2\xa0\xc2\xb0C. Zato odtlej ni bilo ve\xc4\x8d potrebno v vsakem ciklu dodati sve\xc5\xbeega encima, kar je omogo\xc4\x8dilo avtomatizacijo postopka._NEWLINE_PCR izvajamo v natan\xc4\x8dnih termostatih, ki jih je mogo\xc4\x8de programirati. Dolo\xc4\x8dimo lahko temperature, trajanje inkubiranja, \xc5\xa1tevilo ponovitev ciklov in podobno. Reakcije potekajo v volumnih od 20 \xce\xbcl do 100 \xce\xbcl. Pri klasi\xc4\x8dni izvedbi, kakr\xc5\xa1na je \xc5\xa1e vedno najbolj pogosta, po kon\xc4\x8dani reakciji produkte analiziramo z elektroforezo v agaroznem gelu. Novej\xc5\xa1a izvedba, PCR v realnem \xc4\x8dasu, pa omogo\xc4\x8da sprotno zasledovanje koli\xc4\x8dine nastalega produkta in je zato hitrej\xc5\xa1a, omogo\xc4\x8da pa tudi kvantificiranje to\xc4\x8dno dolo\xc4\x8dene DNA v za\xc4\x8detnem vzorcu.'