b'\n_START_ARTICLE_\nDializa\n_START_PARAGRAPH_\nDializa je biokemijski proces lo\xc4\x8devanja snovi, ki se uporablja predvsem za \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denje beljakovin. Osnovana je na prehajanju delcev (poleg beljakovin \xc5\xa1e soli, sladkorjev, vode itd.) skozi polprepustno membrano.\n_START_SECTION_\nUporaba dialize\n_START_PARAGRAPH_\nDializa temelji na uporabi prozorne membrane, ki zadr\xc5\xbeuje molekule, ve\xc4\x8dje od por, molekule, ki so manj\xc5\xa1e od por, pa prepu\xc5\xa1\xc4\x8da. Uporablja se predvsem takrat, ko beljakovine obarjamo s solmi, ki pa jih moremo po obarjanju odstraniti in bi lahko motile nadaljnje dolo\xc4\x8devanje; tak postopek imenujemo razsoljevanje. Dializni postopek lahko uporabimo tudi, \xc4\x8de \xc5\xbeelimo odstraniti ione ali majhne molekule, ki so \xc5\xa1ibko vezane na biolo\xc5\xa1ke molekule. Ker se lahko zgodi, da se encimska aktivnost beljakovin med dializo spremeni, je dobro, \xc4\x8de prihranimo nekaj prvotnega vzorca za nadaljnjo analizo.\n_START_SECTION_\nDializno \xc4\x8drevo\n_START_PARAGRAPH_\nPri dializi uporabljamo tanko membrano v obliki \xc4\x8drevesa. Dializno \xc4\x8drevo je lahko razli\xc4\x8dnih razse\xc5\xbenosti z razli\xc4\x8dno velikimi porami, navadno je narejeno iz acetilirane celuloze ali nitroceluloze, lahko pa tudi iz karbometil celuloze, kolodija ali celofana z velikostjo por od 1\xe2\x80\x9320 nm, vendar obi\xc4\x8dajno polprepustna membrana dializnega \xc4\x8drevesa ne prepu\xc5\xa1\xc4\x8da molekul, ve\xc4\x8djih od 15.000\xe2\x80\x9320.000 Da. Pred dializo moramo dializno \xc4\x8drevo primerno pripraviti, saj se lahko zgodi, da so \xc5\xbee pripravljena dializna \xc4\x8drevesa onesna\xc5\xbeena z glicerolom, ioni te\xc5\xbekih kovin, spojinami, ki vsebujejo \xc5\xbeveplo, ali celo encimi, ki jih moramo nujno odstraniti, saj bi sicer lahko nepovratno reagirali z vzorcem.\n_START_SECTION_\nPriprava dializnega \xc4\x8drevesa\n_START_PARAGRAPH_\nDializno \xc4\x8drevo pripravimo tako, da najprej odre\xc5\xbeemo primerno dol\xc5\xbeino dializnega \xc4\x8drevesa, nato pa ga za eno uro namo\xc4\x8dimo v 1% raztopino ocetne kisline. Po prete\xc4\x8denem \xc4\x8dasu ga prenesemo v destilirano vodo. Kovinske ione odstranimo s sve\xc5\xbee pripravljeno prevreto raztopino EDTA (1% raztopina NaHCO\xe2\x82\x83 in 10 mM EDTA) tako, da znova pustimo namakati eno uro. Nato dializno \xc4\x8drevo \xc5\xa1e najmanj petkrat speremo z destilirano vodo. Z metodo predpriprave dializnega \xc4\x8drevesa lahko dolo\xc4\x8dimo, katere molekule bomo odstranjevali med postopkom dialize.\n_START_SECTION_\nIzvedba in potek dializnega postopka\n_START_PARAGRAPH_\nMetodo dialize izvedemo tako, da dializno \xc4\x8drevo ustreznih razse\xc5\xbenosti in s primerno velikimi porami napolnimo z raztopino vzorca, dializno \xc4\x8drevo na obeh straneh dobro stisnemo in spnemo ter nato potopimo v ve\xc4\x8dji volumen raztopine, v katero \xc5\xbeelimo odstraniti dolo\xc4\x8dene snovi iz vzor\xc4\x8dne raztopine. Molekule vode ter ioni oziroma molekule topljencev z majhno molekulsko maso lahko prehajajo iz dializnega \xc4\x8drevesa v zunanjo raztopino (lahko pa se tudi vrnejo), beljakovine, ki pa so ve\xc4\x8dje od por, pa ostanejo v dializnem \xc4\x8drevesu. Ker gre za pasivno difuzijo, je za hiter prehod topljenca skozi membrano dializnega \xc4\x8drevesa potrebna \xc4\x8dim ve\xc4\x8dja koncentracijska razlika, ki jo lahko dose\xc5\xbeemo z me\xc5\xa1anjem z magnetnim me\xc5\xa1alom. Prehajanje se ustavi, ko je koncentracija dolo\xc4\x8dene snovi na obeh straneh membrane enaka (ko dose\xc5\xbeemo ravnovesje). Rezultat sta dializni preostanek (kar ne difundira skozi membrano) in dializat (vse kar preide skozi membrano). Visoke koncentracije soli ali organskih razkrojil v vzorcu povzro\xc4\x8dijo, da voda vstopi v dializno \xc4\x8drevo, preden sol preide v okoljno raztopino. To ima za posledico pove\xc4\x8danje volumna v dializnem \xc4\x8drevesu, zaradi \xc4\x8desar lahko pride do odma\xc5\xa1itve enega ali obeh koncev dializnega \xc4\x8drevesa, lahko pa tudi raznese dializno \xc4\x8drevo. Temu se lahko izognemo tako, da po napolnjenju dializnega \xc4\x8drevesa le-tega ne zapremo preve\xc4\x8d tesno, ampak pustimo nekaj prostora.\n_START_SECTION_\nDrugi na\xc4\x8dini uporabe\n_START_PARAGRAPH_\nDializiramo lahko tudi s pomo\xc4\x8djo posebnih aparatov. S pomo\xc4\x8djo dialize lahko poleg razsoljevanja in zamenjave pufrov ugotavljamo tudi konstanto vezave nizkomolekularnih ligandov na molekule (npr. dvovalentnih kationov na encim), vendar v tem primeru potrebujemo \xc5\xa1e dodatne analitske tehnike, s katerimi lahko natan\xc4\x8dno spremljamo prehajanje nizkomolekularnega liganda skozi polprepustno membrano.\n_START_SECTION_\nTemperatura dialize\n_START_PARAGRAPH_\nObi\xc4\x8dajno se izmenjava pufrov oziroma razsoljevanje izvaja pri nizkih temperaturah (+4 \xc2\xb0C).\n_START_SECTION_\nLastnosti dializnih pufrov\n_START_PARAGRAPH_\nPufri, ki jih uporabljamo, morajo imeti nizko ionsko mo\xc4\x8d, paziti pa moramo tudi na to, da ne uporabimo snovi, ki bi reagirale z molekulo, ki jo \xc5\xbeelimo izolirati, ali je celo uni\xc4\x8dile, prav tako pa moramo biti pozorni na pH pufra.\n_START_SECTION_\n\xc4\x8cas izvajanja dialize\n_START_PARAGRAPH_\n\xc4\x8cas, ki je potreben za uravnote\xc5\xbeenje koncentracije, je odvisen od volumnov in me\xc5\xa1anja, vendar postopek dialize obi\xc4\x8dajno ne traja ve\xc4\x8d kot tri ure. Dializni sistem, ki je dobro me\xc5\xa1an, lahko v 2\xe2\x80\x933 urah dose\xc5\xbee 90% osmotsko ravnote\xc5\xbeje. Z eno samo dializo dolo\xc4\x8denega topljenca ne moremo popolnoma odstraniti, saj je koncentracija snovi, ki je bila sprva samo v dializnem \xc4\x8drevesu (in jo \xc5\xbeelimo iz raztopine izlo\xc4\x8diti), po enem dializnem postopku enaka znotraj dializnega \xc4\x8drevesa in v dializnem pufru. Iz tega razloga izvedemo ve\xc4\x8d zaporednih dializ, od katerih naj bi dve navadno trajali tri ure, ena pa preko no\xc4\x8di, volumen pufra pa mora biti vsaj 100\xe2\x80\x931000-krat ve\xc4\x8dji, kot je volumen vzorca. \xc4\x8ce je volumen dializnega pufra 50\xe2\x80\x93krat ve\xc4\x8dji od volumna raztopine, ki se nahaja v dializnem \xc4\x8drevesu, bo kon\xc4\x8dna koncentracija topljenca, katerega koncentracijo \xc5\xbeelimo zmanj\xc5\xa1ati, kve\xc4\x8djemu 51\xe2\x80\x93krat manj\xc5\xa1a od za\xc4\x8detne. Nadaljnje zmanj\xc5\xa1anje koncentracije lahko dose\xc5\xbeemo z ve\xc4\x8dkratno zamenjavo dializnega pufra. Z ve\xc4\x8dkratno zamenjavo manj\xc5\xa1ih volumnov pufra dose\xc5\xbeemo bolj\xc5\xa1i u\xc4\x8dinek kot pa z enkratno dializo z velikim volumnom pufra.\n_START_SECTION_\nPogoji za uspe\xc5\xa1no izveden dializni postopek\n_START_PARAGRAPH_\nNevarnost kemijskega onesna\xc5\xbeenja snovi, ki jo izoliramo, je ve\xc4\x8dja, kadar imamo zelo razred\xc4\x8deno raztopino beljakovin, medtem ko je razmerje membrana/beljakovine veliko. Za raztopine beljakovin s koncentracijo 10 mg/ml ali manj je verjetneje, da lo\xc4\x8ditev ne bo uspe\xc5\xa1na, zato je bolje, da raztopino, ki jo \xc5\xbeelimo o\xc4\x8distiti, nalijemo v suho dializno \xc4\x8drevo in ga zapremo \xc5\xa1ele po omo\xc4\x8denju.\n_START_SECTION_\nPrednosti dialize\n_START_PARAGRAPH_\nPrednost dialize je ta, da prakti\xc4\x8dno ne pride do sprememb volumna vzorca.\n_START_SECTION_\nSlabosti dialize\n_START_PARAGRAPH_\nDializo, ki je bila v\xc4\x8dasih standardni postopek lo\xc4\x8devanja beljakovin, izveden pri skoraj vsakem \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denju beljakovin, je danes zamenjala gelska filtracija. \xc4\x8ceprav je postopek dialize preprost, poceni in zanj ne potrebujemo veliko opreme, pa ima dve glavni pomanjkljivosti: dolg \xc4\x8das, ki ga porabimo za izvedbo ene dialize, in poraba velikih volumnov dializnega pufra.'