b'\n_START_ARTICLE_\nKapilarna elektroforeza\n_START_SECTION_\nZgodovina\n_START_PARAGRAPH_\n\xc2\xbbVerjetno je \xc5\xa1e prezgodaj, da bi lahko predvideli, kak\xc5\xa1no prakti\xc4\x8dno vrednost bo dosegla ta metoda \xe2\x80\xa6\xc2\xab\xc2\xa0To so besede \xc5\xa1vedskega znanstvenika Arneja Tiseliusa, s katerimi je zaklju\xc4\x8dil svoj govor, ko so mu leta 1948 podelili Nobelovo nagrado za kemijo. Arne Tiselius je v tridesetih letih dvajsetega stoletja razvil elektroforezo, takrat povsem novo tehniko, s katero je prou\xc4\x8deval serumske proteine, in leta 1937 o njej objavil tudi prvi znanstveni \xc4\x8dlanek. Njegova aparatura je predstavljala cev z zmesjo proteinov, ki jo je priklju\xc4\x8dil na elektri\xc4\x8dno napetost in ugotovil, da molekule iz vzorca potujejo v smeri in s hitrostjo, ki sta odvisni od naboja in mobilnosti._NEWLINE_Prvi za\xc4\x8detki kapilarne elektroforeze so povezani z letoma 1979 in 1981, ko je metoda do\xc5\xbeivela svoje prve znanstvene objave. V letih, ki so sledila, pa je do\xc5\xbeivela pravi razcvet in slabih sedemdeset let kasneje predstavlja orodje, ki je nepogre\xc5\xa1ljivo v vsakem sodobnem laboratoriju.\n_START_SECTION_\nOsnove elektroforezne lo\xc4\x8ditve\n_START_PARAGRAPH_\nLo\xc4\x8ditev molekul pri kapilarni elektroforezi temelji na osnovah klasi\xc4\x8dne elektroforeze. Nabite molekule, ki jih izpostavimo elektri\xc4\x8dnemu polju, potujejo k elektrodi z nasprotnim nabojem. Hitrost njihovega potovanja je odvisna od mo\xc4\x8di elektri\xc4\x8dnega polja (E), celokupnega naboja proteina (q) ter zavornega koeficienta (f) (ena\xc4\x8dba 1). Mo\xc4\x8d elektri\xc4\x8dnega polja predstavlja razmerje med potencialno razliko med elektrodama (U) in razdaljo med elektrodama (d) (ena\xc4\x8dba 2)._NEWLINE_Ena\xc4\x8dba 1_NEWLINE_v \xe2\x80\xa6 hitrost potovanja [m/s] E \xe2\x80\xa6 mo\xc4\x8d elektri\xc4\x8dnega polja (V/m) q \xe2\x80\xa6 naboj f \xe2\x80\xa6 zavorni koeficient [Vs/m2]_NEWLINE_Ena\xc4\x8dba 2_NEWLINE_U \xe2\x80\xa6 potencialna razlika med elektrodama [V] D \xe2\x80\xa6 razdalja med elektrodama [m]_NEWLINE_Delce z nabojem poganja proti elektrodi sila Eq. Njihovemu potovanju nasprotuje zavorna sila, ki jo dolo\xc4\x8da zavorni koeficient in je odvisna od velikosti in oblike delca, poroznosti medija, skozi katerega se giblje delec, ter viskoznosti elektrolita. Hitrost potovanja delca definiramo z elektroforezno mobilnostjo, ki predstavlja razmerje med hitrostjo potovanja (?) in mo\xc4\x8djo elektri\xc4\x8dnega polja (E) oziroma razmerje med nabojem (q) in zavornim koeficientom (f) (ena\xc4\x8dba 3)._NEWLINE_Ena\xc4\x8dba 3_NEWLINE_\xc2\xb5 \xe2\x80\xa6 elektroforezna mobilnost [m2/Vs]_NEWLINE_Z elektroforezo lo\xc4\x8dimo delce z razli\xc4\x8dnimi naboji, ker se razlikujejo njihove elektroforezne mobilnosti, kot tudi delce z enakimi naboji, \xc4\x8de so razli\xc4\x8dne velikosti ali oblike, ker nanje delujejo razli\xc4\x8dne zavorne sile.\n_START_SECTION_\nPrincip lo\xc4\x8ditve\n_START_PARAGRAPH_\nLo\xc4\x8ditev analitov poteka v stekleni kapilari, napolnjeni z elektroforeznim pufrom, ob priklju\xc4\x8ditvi visoke napetosti. Zaradi razlike v napetosti med anodo in katodo za\xc4\x8dnejo delci z nabojem potovati. Na njihovo potovanje pa vpliva \xc5\xa1e dodatni teko\xc4\x8dinski tok, ki ga imenujemo elektroosmozni tok. Elektroosmozni tok nastane zaradi negativnega naboja silanolnih skupin ob steni kapilare, ki privla\xc4\x8di katione, predvsem oksonijeve ione H30+. Ko priklju\xc4\x8dimo napetost, za\xc4\x8dnejo hidratirani oziroma solvatirani kationi potovati proti katodi in s seboj potegnejo celotno raztopino. Elektroosmozni tok je pomemben pri vrednostih pH nad 3. Zaradi elektroosmoznega toka se molekule gibljejo neodvisno od naboja, v isto smer (obi\xc4\x8dajno proti katodi), saj je elektroossmozni tok mo\xc4\x8dnej\xc5\xa1i od elektroforezne mobilnosti molekul. Najhitreje se zato gibljejo majhni delci s pozitivnim nabojem, sledijo jim veliki delci s pozitivnim nabojem, nato nevtralni delci \xe2\x80\x93 ti potujejo s hitrostjo elektroosmoznega toka \xe2\x80\x93 in nazadnje \xc5\xa1e delci z negativnim nabojem (slika 2). Elektroosmozni tok zmanj\xc5\xa1amo s pove\xc4\x8danjem ionske mo\xc4\x8di ali viskoznosti pufra, z zmanj\xc5\xa1anjem pH pufra, z dodatkom organskih topil (etanola, metanola, acetonitrila) ali zmanj\xc5\xa1anjem napetosti.\n_START_SECTION_\nInjiciranje\n_START_PARAGRAPH_\nOsnovne komponente kapilarne elektroforeze so vir visoke napetosti, dve elektrodi, dva rezervoarja s pufrom, kapilara, detekcijski sistem in sistem za zapis in obdelavo signala (slika 1). Postopek analize poteka tako, da kapilaro napolnimo s pufrom in vanjo injiciramo nekaj nanolitrov vzorca. Injiciranje je lahko elektrokineti\xc4\x8dno, pri \xc4\x8demer za dolo\xc4\x8den \xc4\x8das (navadno 0,5-30 s) priklju\xc4\x8dimo napetost, ki povzro\xc4\x8di, da preide dolo\xc4\x8dena koli\xc4\x8dina vzorca v kapilaro. Ta koli\xc4\x8dina je dolo\xc4\x8dena s \xc4\x8dasom in napetostjo injiciranja. Drugi na\xc4\x8din je hidrodinamsko injiciranje, kjer vnesemo vzorec v kapilaro s pomo\xc4\x8djo razlike tlakov med obema koncema kapilare (z natego, nadtlakom ali s podtlakom). V prvem primeru vialo z vzorcem za dolo\xc4\x8den \xc4\x8das dvignemo nad kapilaro, pri \xc4\x8demer je koli\xc4\x8dina vzorca, ki vstopi v kapilaro, odvisna od vi\xc5\xa1ine in \xc4\x8dasa dviga. Nadtlak oziroma podtlak vzpostavimo preko sistema ventilov, koli\xc4\x8dina injiciranega vzorca je v tem primeru odvisna od tla\xc4\x8dne razlike. Ko je injicirajne kon\xc4\x8dano, konec kapilare ponovno potopimo v pufer in priklju\xc4\x8dimo visoko napetost (0-\xc2\xb130 kV). Tok, ki pri tem ste\xc4\x8de skozi kapilaro, navadno ne prese\xc5\xbee 200 \xc2\xb5A, odvisen pa je od napetosti, koncentracije in vrste pufra ter dol\xc5\xbeine in premera kapilare.\n_START_SECTION_\nDetekcija\n_START_PARAGRAPH_\nMolekule, ki se lo\xc4\x8dijo, na koncu kapilare preidejo skozi detektor, kar nam da signale, ki se zapi\xc5\xa1ejo na elektroferogramu. Najbolj obi\xc4\x8dajna vrsta detekcije je v obmo\xc4\x8dju UV-VIS-spektra, njena velika pomanjkljivost pa je majhna ob\xc4\x8dutljivost. Razlog za to je kratka pot svetlobe skozi vzorec, ki ima dol\xc5\xbeino notranjega premera kapilare. Drugi na\xc4\x8dini detekcije so \xc5\xa1e fluorescen\xc4\x8dna, kemiluminiscen\xc4\x8dna, amperometri\xc4\x8dna, konduktometri\xc4\x8dna in potenciometri\xc4\x8dna detekcija ter detekcija z masno spektrometrijo._NEWLINE_\xc4\x8ce molekule iz vzorca nimajo kromoforov in ne morejo absorbirati svetlobe oziroma ne fluorescirajo, lahko nanje pred ali med analizo ve\xc5\xbeemo spojine, ki imajo te lastnosti. Razvili so tudi indirektno detekcijo, pri kateri dodamo v pufer spojino, ki dobro absorbira svetlobo (natrijev kromat) ali intenzivno fluorescira (kinin), zaradi \xc4\x8desar nam daje detektor visok signal, ko pa do njega pridejo molekule iz vzorca, jakost signala pade in zapi\xc5\xa1ejo se negativni signali.\n_START_SECTION_\nKapilare\n_START_PARAGRAPH_\nKapilare so osrednji element celotnega sistema, saj v njih poteka lo\xc4\x8ditev molekul. Najpogosteje so izdelane iz kremen\xc4\x8devega stekla, ki prepu\xc5\xa1\xc4\x8da UV-svetlobo, je obstojno v \xc5\xa1irokem obmo\xc4\x8dju pH in nereaktivno. Zunanja stran je prevle\xc4\x8dena s plastjo poliimida, ki zagotovi mehansko odpornost. Na kon\xc4\x8dnem delu kapilare, kjer je t. i. detekcijski mehur\xc4\x8dek, je poliimidna za\xc5\xa1\xc4\x8dita odstranjena. Kapilare so lahko oblo\xc5\xbeene tudi v notranjosti. Njihov premer sega od 20-100\xc2\xa0\xc2\xb5m, dol\xc5\xbeina pa od 25\xe2\x80\x93122\xc2\xa0cm.\n_START_SECTION_\nPufer\n_START_PARAGRAPH_\nVrsta in koncentracija delovnega pufra sta velikega pomena za uspe\xc5\xa1no lo\xc4\x8ditev molekul. Najpogosteje gre za raztopine anorganskih soli v vodi, to sta na primer fosfatni in boratni pufer, ki jim lahko dodamo povr\xc5\xa1insko aktivne snovi, organske modifikatorje ali kiralne spojine. Pri izbiri pufra moramo upo\xc5\xa1tevati topnost in stabilnost molekul iz vzorca v pufru.\n_START_SECTION_\nKapilarna conska elektroforeza\n_START_PARAGRAPH_\nS kapilarno consko elektroforezo lo\xc4\x8dujemo le nabite molekule, saj metoda temelji na razliki v njihovi elektroforezni mobilnosti. Nevtralne molekule potujejo z elektroosmoznim tokom. Na elektroforezno mobilnost lahko vplivamo s spreminjanjem pH, ionske mo\xc4\x8di in sestave pufra, vendar pa s tem spremenimo tudi elektroosmozni tok, kar lahko povzro\xc4\x8di te\xc5\xbeave pri optimizaciji metode.\n_START_SECTION_\nMicelna elektrokineti\xc4\x8dna kromatografija\n_START_PARAGRAPH_\nMicelno elektrokineti\xc4\x8dno kromatografijo so prvi\xc4\x8d uporabili leta 1984  in zelo hitro je postala metoda izbora za analizo nevtralnih molekul. Njena posebnost je priprava pufra, ki mu dodamo povr\xc5\xa1insko aktivno snov, ki nad kriti\xc4\x8dno micelno koncentracijo tvori micele, sferi\xc4\x8dne agregate. Te strukture imajo v notranjosti hidrofobno jedro, na povr\xc5\xa1ini pa so hidrofilni deli povr\xc5\xa1insko aktivne snovi, ki so v stiku z vodno fazo pufra. Premer micela je navadno 30-50 A. Znotraj kapilare imamo tako dve fazi, po\xc4\x8dasno psevdostacionarno micelno fazo in vodno fazo, ki se giblje hitreje. Mehanizem lo\xc4\x8ditve pri micelni elektrokineti\xc4\x8dni kromatografiji temelji na hidrofobnih interakcijah med molekulami iz vzorca in miceli, \xc4\x8de pa imajo molekule pri pH pufra naboj, je pomembna tudi elektroforezna mobilnost.\n_START_SECTION_\nKapilarna elektroforeza DNK\n_START_PARAGRAPH_\nPri kapilarni elektroforezi fragmente DNK lo\xc4\x8dujemo v tanki kapilari, ki je v elektri\xc4\x8dnem polju. Fragmenti so ozna\xc4\x8deni s fluorescen\xc4\x8dnimi barvili, napetosti pa so precej visoke. Fragmenti se zaradi razli\xc4\x8dne afinitete do negativnega potenciala med seboj lo\xc4\x8dijo. Na koncu kapilare te fragmente presvetlimo z laserjem, ki povzro\xc4\x8di, da ozna\xc4\x8dena DNK fluorescira. Oddano svetlobo (fluorescenco) zazna poseben detektor, podatke pa potem lahko analiziramo oz. interpretiramo z analitsko programsko opremo, ki nam izri\xc5\xa1e elektroferograme.\n_START_SECTION_\nPrednosti in omejitve kapilarne elektroforeze\n_START_PARAGRAPH_\nNajpomembnej\xc5\xa1e prednosti kapilarne elektroforeze pred drugimi analiznimi metodami so \xc5\xa1irok spekter vzorcev, ki jih lahko analiziramo (na primer peptidi, proteini, oligonukleotidi, DNA, aminokisline, ogljikovi hidrati, flavonoidi, vitamini, kiralne spojine, pesticidi), majhna poraba vzorcev in pufrov, hiter \xc4\x8das analize in avtomatizacija._NEWLINE_Glavna omejitev kapilarne elektroforeze je nizka meja detekcije, saj zaradi majhnega premera kapilare in posledi\xc4\x8dno nizkega volumskega pretoka ne moremo uporabljati klasi\xc4\x8dnih detektorjev, primernih za HPLC. Izbolj\xc5\xa1anje ob\xc4\x8dutljivosti je prinesel razvoj sistemov kapilarne elektroforeze z zdru\xc5\xbeenimi metodami, kot sta na primer teko\xc4\x8dinska kromatografija visoke lo\xc4\x8dljivosti in masna spektrometrija, ter lasersko inducirana fluorescenca.\n_START_SECTION_\nKlini\xc4\x8dna uporaba\n_START_PARAGRAPH_\nKapilarno elektroforezo so prvi\xc4\x8d uporabili v klini\xc4\x8dne namene za analizo serumskih proteinov. Zaradi hitrih analiz, avtomatiziranega dela, majhne porabe vzorcev, primerljivih rezultatov ter s tem povezanih manj\xc5\xa1ih stro\xc5\xa1kov se je metoda razvila v dobro alternativo gelski elektroforezi. V nekaterih modernej\xc5\xa1ih laboratorijih uporabljajo kapilarno elektroforezo za rutinske analize serumskih proteinov  in oblik hemoglobina , za kvantifikacijo hemoglobina A2  in proteinov v urinu  ter identifikacijo monoklonskih proteinov v serumu in urinu. Kapilarna elektroforeza je izjemnega pomena pri diagnosticiranju nekaterih redkih motenj. Omogo\xc4\x8da analizo DNA za ugotavljanje Downovega sindroma z , analizo onkogena P-53 , ugotavljanje pomanjkanja adenilosukcinat-liaze  ter profiliranje acidurij.'