b'\n_START_ARTICLE_\nMagnetno pogojeno lo\xc4\x8devanje celic\n_START_SECTION_\nPrincip delovanja\n_START_PARAGRAPH_\nZa magnetno-pogojeno lo\xc4\x8devanje celic potrebujemo osnovno opremo, ki jo sestavljajo mikro-kroglice, separator in kolone. Mikro-kroglice so superparamagnetni delci premera 50 nm. Zgrajene so iz biorazgradljivega matriksa, zato njihova odstranitev po zaklju\xc4\x8dku separacije ni potrebna. MACS mikro-kroglice ne vplivajo na stukturo, funkcijo ali aktivnost celice, hkrati pa tudi ni znano, da bi bile mote\xc4\x8d dejavnik v nadaljnih postopkih raziskav._NEWLINE_Magnetno-pogojeno lo\xc4\x8devanje celic poteka v posebnih kolonah, ki ne po\xc5\xa1kodujejo celic, so odporne proti po\xc5\xa1kodbam pri spiranju in primerne za delo v sterilnih pogojih. Ko v separator, ki ga gradi mo\xc4\x8dan permanenten magnet, vstavimo kolono, se na njej inducira visok gradient magnetnih delcev. Gradient je dovolj mo\xc4\x8dan da se celice ozna\xc4\x8dene z minimalno koli\xc4\x8dino mikro-kroglic zadr\xc5\xbeijo v koloni. Neozna\xc4\x8dene celice nemoteno preidejo kolono in se izlo\xc4\x8dijo po ve\xc4\x8dkratnem spiranju kolone. Ozna\xc4\x8dene celice se izlo\xc4\x8dijo \xc5\xa1ele, ko odstranimo kolono iz magneta. Po tem principu lahko preprosto in z visoko \xc4\x8distostjo izoliramo tako ozna\xc4\x8dene kot neozna\xc4\x8dene celice. Celoten postopek pozitivne selekcije (opisana spodaj) je kon\xc4\x8dan v nekaj urah, celice pa lahko nemudoma uporabimo v nadaljnih eksperimentih.\n_START_SECTION_\nMagnetno ozna\xc4\x8devanje celic\n_START_PARAGRAPH_\nCelice se pred lo\xc4\x8devanjem ozna\xc4\x8di z direktnim ali indirektnim postopkom.\n_START_SECTION_\nDirektno ozna\xc4\x8devanje celic\n_START_PARAGRAPH_\nJe najhitrej\xc5\xa1i na\xc4\x8din magnetnega ozna\xc4\x8devanja, ker zahteva le en korak, saj je specifi\xc4\x8dno protitelo vezano neposredno na magnetni delec. Direktno ozna\xc4\x8devanje zmanj\xc5\xa1a \xc5\xa1tevilo potrebnih korakov spiranja, s \xc4\x8dimer se zmanj\xc5\xa1ajo tudi nepotrebne izgube celic. Na voljo so visoko specifi\xc4\x8dna monoklonska protitelesa, ki omogo\xc4\x8dajo optimalno lo\xc4\x8ditev. Tar\xc4\x8da protiteles so povr\xc5\xa1inski ozna\xc4\x8devalci na celicah razli\xc4\x8dnih organizmov, npr. \xc4\x8dloveka, mi\xc5\xa1i, podgane in ne-\xc4\x8dlove\xc5\xa1kih primatov._NEWLINE_Dodatno prednost v analizi prina\xc5\xa1ajo protitelesa konjugirana s fluorokromi, ki omogo\xc4\x8dajo analizo magnetno lo\xc4\x8denih frakcij z uporabo preto\xc4\x8dnega citometra ali flourescentnega mikroskopa.\n_START_SECTION_\nIndirektno ozna\xc4\x8devanje celic\n_START_PARAGRAPH_\nUporablja se kadar za doti\xc4\x8den tip celic ni na voljo primernih direktnih mikro-kroglic. Za indirektno ozna\xc4\x8devanje se lahko uporabi prakti\xc4\x8dno vsako monoklonsko ali poliklonsko protitelo, medtem ko je tar\xc4\x8da lahko katerakoli celica iz poljubnega predstavnika katerkoli vrste. Celice se ozna\xc4\x8di s primarnim protitelesom, ki ni konjugirano, biotinizirano ali konjugirano s fluorokromom. V naslednjem koraku sledi magnetno ozna\xc4\x8devanje z uporabo anti-imunoglobin, anti-biotin, streptavidin ali anti-flouorokrom mikro kroglic. Mo\xc5\xbena je tudi uporaba me\xc5\xa1anice protiteles za hkratno izolacijo ve\xc4\x8d celi\xc4\x8dnih tipov. Ker indirektno ozna\xc4\x8devanje oja\xc4\x8da magnetno oznako je prav to ozna\xc4\x8devanje bolj primerno, kadar delamo s slabo izra\xc5\xbeenimi antigeni.\n_START_SECTION_\nPozitivna selekcija\n_START_PARAGRAPH_\nPozitivna selekcija se izvaja, kadar magnetno ozna\xc4\x8dimo \xc5\xbeelene tar\xc4\x8dne celice in izoliramo frakcijo celic, ki se zadr\xc5\xbei v koloni._NEWLINE_Strategija pozitivne selekcije je primerna kadar \xc5\xbeelimo izjemno \xc4\x8distost pripravka (npr. obogatitev redkih celi\xc4\x8dnih linij), visoko stopnjo okrevanja in hitre rezultate. Pozitivna selekcija je najbolj neposreden in specifi\xc4\x8den na\xc4\x8din izolacije tar\xc4\x8dnih celic iz heterogenih celi\xc4\x8dnih suspenzij. Vezava protiteles, ki so del mikro kroglic, ne prizadane ne viabilnosti, niti funkcije celic. Obe frakciji, ozna\xc4\x8dena in neozna\xc4\x8dena, lahko regeneriramo in spet uporabimo. Zahvaljujo\xc4\x8d \xc5\xbeelezovemu oksidu in polisaharidom, glavnima komponentama mikrokroglic, so le-te biorazgradljive in navadno izginejo po nekaj dneh gojenja v kulturi.\n_START_SECTION_\nNegativna selekcija\n_START_PARAGRAPH_\nNegativno selekcijo izvedemo z ozna\xc4\x8devanjem ne\xc5\xbeeljenih celic. Celice, ki niso magnetno ozna\xc4\x8dene se izlo\xc4\x8dijo iz me\xc5\xa1ane kulture celic. Tar\xc4\x8dne celice v tem primeru niso magnetno ozna\xc4\x8dene, torej se izlo\xc4\x8dijo v tej prvi frakciji. Negativna izolacija je primerna za izolacijo \xc5\xbeelene celi\xc4\x8dne populacije, kadar ne obstajajo primerna specifi\xc4\x8dna protitelesa, kadar vezava protitelesa na celico ni za\xc5\xbeeljena ali kadar sledi nadaljnja izolacija celi\xc4\x8dnih podtipov s pozitivno selekcijo. Danes je na voljo mnogo razli\xc4\x8dnih pred-pripravljenih kitov za optimizirano izolacijo celic, ki vsebujejo protitelesa za ne-tar\xc4\x8dne celice.\n_START_SECTION_\nIzlo\xc4\x8danje in pozitivna selekcija\n_START_PARAGRAPH_\nRazli\xc4\x8dne tipe celic lahko najprej lo\xc4\x8dimo z izlo\xc4\x8danjem celic, ki niso ozna\xc4\x8dene, \xc4\x8demur sledi pozitivna selekcija \xc5\xbeeljenega tipa celic. Strategija je uporabna, kadar ne\xc5\xbeelene celice v celi\xc4\x8dni suspenziji izra\xc5\xbeajo enake antigene kot ga uporabljamo za pozitivno selekcijo ozna\xc4\x8denih celic. Tak sistem je lahko uporaben tudi pri izolaciji izjemno redkih celic. Takrat iz suspenzije najprej izlo\xc4\x8dimo neozna\xc4\x8dene celice. Pozitivno selekcijo, ki sledi, izpeljemo s predhodno obogateno frakcijo, s \xc4\x8dimer si zagotovimo zelo \xc4\x8disto celi\xc4\x8dno populacijo.\n_START_SECTION_\nStrategija MultiSort\n_START_PARAGRAPH_\nZ uporabo posebnih MultiSort kitov lo\xc4\x8dimo visoko \xc5\xa1tevilo razli\xc4\x8dnih celic, ozna\xc4\x8denih s specifi\xc4\x8dnimi markerji na povr\xc5\xa1ini celic. Uporaba kitov omogo\xc4\x8da tudi zaporedno pozitivno selekcijo._NEWLINE_Tar\xc4\x8dne celice najprej magnetno ozna\xc4\x8dimo in jih lo\xc4\x8dimo glede na prvi \xc5\xbeeleni parameter. Dobljeno frakcijo celic nato inkubiramo z reagentom, ki encimsko odstrani mikrokroglice. Sledi druga pozitivna selekcija, pri kateri se celice lo\xc4\x8dujejo glede na drugo vrsto antigena.'