b'\n_START_ARTICLE_\nTransformacija (genetika)\n_START_PARAGRAPH_\nV molekularni biologiji je transformacija genetska sprememba celice, do katere pride zaradi neposredne absorpcije in vklju\xc4\x8ditve eksogenega genskega materiala iz njegove okolice skozi celi\xc4\x8dno membrano. Za transformacijo morajo biti bakterije, ki prevzemajo eksogeni genski material kompetentne, kar je v naravi posledica odziva na stresne pogoje (stradanje in gostota celic), kompetenco pa lahko dose\xc5\xbeemo tudi v laboratoriju._NEWLINE_Transformacija je eden od treh na\xc4\x8dinov horizontalnega prenosa genov, pri katerem eksogeni genski material prehaja iz ene bakterije v drugo. Druga dva na\xc4\x8dina sta \xc5\xa1e konjugacija in transdukcija. Transformacija je posledica prilagoditve na popravljanje po\xc5\xa1kodovane DNK, podedovane od prokariontskih prednikov. Na tak na\xc4\x8din se pove\xc4\x8duje tudi genetska raznolikost._NEWLINE_Od leta 2014 je znanih pribli\xc5\xbeno 80 vrst bakterij, ki so sposobne transformacije (\xc5\xa1tevilo je pribli\xc5\xbeno enakomerno porazdeljeno med gram-pozitivnimi in gram-negativnimi bakterijami). \xc5\xa0tevilka je morda precenjena, saj je kar nekaj poro\xc4\x8dil podprtih le s posamezni dokumenti.\n_START_SECTION_\nZgodovina\n_START_PARAGRAPH_\nTransformacijo v bakteriji je leta 1928 prvi\xc4\x8d prikazal britanski bakteriolog Frederick Griffith.\xc2\xa0\xc2\xa0Ugotovil je, da lahko sev Streptococcus pneumoniae naredi virulenten, \xc4\x8de ga izpostavi virusu, ki je bil toplotno ubit. Leta 1944 so Oswald Avery, Colin MacLeod in Maclyn McCarty tak\xc5\xa1en princip transformacije ozna\xc4\x8dili kot genetski. Izolirali so DNK iz virulentnega seva Streptococcus pneumoniae in z uporabo samo tega DNK so lahko naredili varen sev virulenten. Tak\xc5\xa1no vpeljavo so poimenovali transformacija (Avery-MacLeod-McCartyjev poskus). Ta eksperiment je bil sprva skepti\xc4\x8dno sprejet v znanstvenih krogih, vse dokler ni pri\xc5\xa1lo do napredka pri razumevanju genetskih markerjev in odkritja drugih procesov prenosa genov (konjugacije leta 1947 in transdukcije leta 1953)._NEWLINE_V poznih osemdesetih letih je bila razvita transformacija z uporabo elektroporacije, kar je pove\xc4\x8dalo u\xc4\x8dinkovitost in-vitro transformacij in \xc5\xa1tevilo bakterijskih sevov, ki jih je mogo\xc4\x8de transformirati._NEWLINE_Leta 1982 so prvi\xc4\x8d izvedli prenos gena za rastni hormon iz podgane v mi\xc5\xa1ji zarodek in tako odkrili transformacijo \xc5\xbeivalskih celic.\xc2\xa0\n_START_SECTION_\nTerminologija\n_START_PARAGRAPH_\nTransformacija je eden od treh na\xc4\x8dinov horizontalnega prenosa genov, ki se pojavljajo v naravi med bakterijami. DNK, ki kodira dolo\xc4\x8deno lastnost se prenese iz ene bakterije v drugo in se lahko integrira v genom druge bakterije s homologno rekombinacijo. Genetski material prehaja skozi vmesni medij in absorpcija je popolnoma odvisna od prejemne bakterije. Druga dva na\xc4\x8dina prenosa genov sta konjugacija (gen se prena\xc5\xa1a z neposrednim stikom med bakterijama) in transdukcija (vstavitev tuje DNK s pomo\xc4\x8djo bakteriofagnega virusa).\xc2\xa0_NEWLINE_Kompetenca se nana\xc5\xa1a na za\xc4\x8dasno stanje celic, ki omogo\xc4\x8da sprejetje eksogene DNK iz okolja in se lahko izvede v laboratoriju._NEWLINE_Pojem transformacija se lahko uporablja tudi za opisovanje vstavljanja novega genskega materiala v nebakterijske celice, vklju\xc4\x8dno z \xc5\xbeivalskimi in rastlinskimi celicami. Transformacija v \xc5\xbeivalski celi\xc4\x8dni biologiji ima druga\xc4\x8den pomen, in sicer pomeni, da so celice pridobile lastnosti rakavih celic, zato se za \xc5\xbeivalske celice uporablja pojem transfekcija, ki predstavlja spremembo celi\xc4\x8dnega materiala z vnosom DNK.\n_START_SECTION_\nNaravna kompetenca in transformacija\n_START_PARAGRAPH_\nNaravno kompeten\xc4\x8dne bakterije nosijo skupine genov, ki zagotavljajo, da beljakovinski mehanizem prenese DNK preko celi\xc4\x8dne membrane. Prenos eksogene DNK v celico lahko zahteva proteine, ki sodelujejo pri sestavljanju sistema pilus tipa II, tipa IV, kot tudi DNK translokazni kompleks na citoplazemski membrani._NEWLINE_Zaradi razlik v strukturi celi\xc4\x8dnega ovoja med gram-pozitivnimi in gram-negativnimi bakterijami obstajajo nekatere razlike v mehanizmih absorpcije DNK v teh celicah, vendar jih ima ve\xc4\x8dina skupne lastnosti, ki vklju\xc4\x8dujejo sorodne proteine. DNK se najprej ve\xc5\xbee na povr\xc5\xa1ino kompetentnih celic na DNK receptorju in preide skozi DNK citoplazemsko membrano preko DNK translokaze.\xc2\xa0Samo enoveri\xc5\xbena DNK lahko prehaja skozi membrano, pri \xc4\x8demer se druga veriga razgradi z nukleazami. Prene\xc5\xa1ena enoveri\xc5\xbena DNK se nato lahko integrira v bakterijske kromosome s procesom, ki je odvisen od RecA. V gram-negativnih celicah, zaradi prisotnosti dodatne membrane, prenos DNK zahteva prisotnost kanala, ki ga tvorijo sekretini na zunanji membrani. Za kompetenco je verjetno pomemben tudi protein pilin, vendar njegova vloga \xc5\xa1e ni jasna. Absorpcija DNK je na splo\xc5\xa1no sekven\xc4\x8dno nespecifi\xc4\x8dna, \xc4\x8deprav v nekaterih vrstah lahko prisotnost specifi\xc4\x8dnih sekvenc DNK olaj\xc5\xa1a u\xc4\x8dinkovito absorpcijo DNK.\n_START_SECTION_\nNaravna transformacija\n_START_PARAGRAPH_\nNaravna transformacija je bakterijska adaptacija za prenos DNK, ki je odvisna od izra\xc5\xbeanja \xc5\xa1tevilnih bakterijskih genov, katerih produkti\xc2\xa0 so odgovorni za ta proces.\xc2\xa0Na splo\xc5\xa1no je transformacija kompleksen, energetsko zahteven razvojni celi\xc4\x8dni proces. Da se bakterija ve\xc5\xbee, absorbira in rekombinira eksogeno DNK v svoj kromosom, mora biti kompetentna, kar pomeni, da mora biti v posebnem fiziolo\xc5\xa1kem stanju. Razvoj kompetentnosti v Bacillus subtilis zahteva izra\xc5\xbeanje pribli\xc5\xbeno 40 genov. DNK, vgrajena v kromosom gostitelja, obi\xc4\x8dajno (z redkimi izjemami) izhaja iz druge bakterije iste vrste in je tako homologna reziden\xc4\x8dnemu kromosomu._NEWLINE_Kompetenco za transformacijo po navadi povzro\xc4\x8da visoka gostota celic in/ali prehranske omejitve ter pogoji, ki so povezani s stacionarno fazo bakterijske rasti. Transformacija pri Haemophilus influenzae je najbolj u\xc4\x8dinkovita na koncu eksponentne rasti, ko se bakterijska rast pribli\xc5\xbea stacionarni fazi.\xc2\xa0Transformacija pri bakteriji Streptococcus mutans, pa tudi pri \xc5\xa1tevilnih drugih streptokokih, se pojavlja pri visoki celi\xc4\x8dni gostoti in je povezana s tvorbo biofilma._NEWLINE_Obstaja domneva, da nekateri bakteriofagi s spro\xc5\xa1\xc4\x8danjem nepo\xc5\xa1kodovane gostiteljske in plazmidne DNK prispevajo k transformaciji.\n_START_SECTION_\nTransformacija kot prilagoditev popravljanja po\xc5\xa1kodovane DNK\n_START_PARAGRAPH_\nKompetenco specifi\xc4\x8dno povzro\xc4\x8dijo po\xc5\xa1kodbe DNK. Na primer, transformacijo v Streptococcus pneumoniae povzro\xc4\x8di sredstvo za premre\xc5\xbeenje DNK (mitomicin C) in fluorokinolon (inhibitor topoizomeraze, ki povzro\xc4\x8di prekinitev dvovija\xc4\x8dne verige). V Bacillus subtilis se transformacija pove\xc4\x8da zaradi UV svetlobe, ki povzro\xc4\x8da po\xc5\xa1kodbo DNK.  UV svetloba povzro\xc4\x8di kompetenco tudi pri L. pneumophila.\xc2\xa0_NEWLINE_Da bi preizkusili ali je transformacija prilagoditvena funkcija za popravilo po\xc5\xa1kodb DNK, so izvedli vrsto eksperimentov z B. subtilis, ki so jih obsevali z UV svetlobo kot \xc5\xa1kodljivim sredstvom.\xc2\xa0Rezultati teh poskusov so pokazali, da transformacija DNK omogo\xc4\x8da popravilo potencialno smrtonosne DNK po\xc5\xa1kodbe, ki jo ustvari UV-svetloba v prejemni DNK. Transformacijo v bakterijah je mogo\xc4\x8de obravnavati kot primitivni spolni proces, saj vklju\xc4\x8duje interakcijo homologne DNK iz dveh posameznikov, z namenom, da se tvori rekombinantna DNK, ki se prenese na naslednje generacije. Bakterijska transformacija v prokariontih je morda podedovan proces, ki je povzro\xc4\x8dil mejoti\xc4\x8dno spolno razmno\xc5\xbeevanje v evkariontih.\n_START_SECTION_\nBakterije\n_START_PARAGRAPH_\nUmetno kompetenco lahko povzro\xc4\x8dimo z laboratorijskimi postopki, tako da bakterijo izpostavimo pogojem, ki obi\xc4\x8dajno niso prisotni v naravi.\xc2\xa0\xc2\xa0Pri tem celice postanejo pasivno prepustne za DNK. Za doseganje tak\xc5\xa1nih pogojev se celice inkubirajo v raztopini, ki vsebuje dvovalentne katione (pogosto\xc2\xa0kalcijev klorid, ki moti celi\xc4\x8dno membrano) pri mrzlih pogojih, na kar celice izpostavimo vro\xc4\x8dinskemu valu (toplotni \xc5\xa1ok). Kalcijev klorid delno moti povr\xc5\xa1ino celi\xc4\x8dne membrane, kar omogo\xc4\x8di, da lahko rekombinantna DNK vstopi v gostiteljsko celico. Celice, ki lahko absorbirajo DNK, se imenujejo kompetentne celice._NEWLINE_Ugotovljeno je bilo, da rast gram-negativnih bakterij v 20 mM magneziju zmanj\xc5\xa1uje \xc5\xa1tevilo vezi med proteini in lipopolisaharidi s pove\xc4\x8danjem razmerja med ionskimi in kovalentnimi vezmi, kar pove\xc4\x8da poroznost membrane in olaj\xc5\xa1a transformacijo.\xc2\xa0_NEWLINE_Elektroporacija je druga metoda za transformacijo (kompetentnih) celic. Pri tej metodi so celice na kratko \xc5\xa1okirane z elektri\xc4\x8dnim poljem 10-20 kV/cm, pri kateri naj bi nastajale luknje v celi\xc4\x8dni membrani, skozi katere lahko vstopi plazmidna DNK. Po elektri\xc4\x8dnem \xc5\xa1oku luknje hitro zapirajo mehanizmi za popravilo membrane celice.\n_START_SECTION_\n\xc5\xbdivali\n_START_PARAGRAPH_\nVstavitev DNK v \xc5\xbeivalske celice se imenuje transfekcija.\n_START_SECTION_\nPrakti\xc4\x8dni vidiki transformacije v molekularni biologiji\n_START_PARAGRAPH_\nU\xc4\x8dinkovitost, s katero lahko dolo\xc4\x8dena kultura absorbira eksogeno DNK in izrazi svoje gene, je znana kot u\xc4\x8dinkovitost transformacije in se meri v enoti za oblikovanje kolonije (cfu) na \xce\xbcg uporabljene DNK.\xc2\xa0_NEWLINE_Pri transformaciji s kalcijevim kloridom celice pripravimo s hlajenjem celic v prisotnosti Ca2+ v raztopini CaCl2. Pri tem celica postane prepustna za plazmidno DNK. Celice inkubiramo na ledu z DNK in jih nato na kratko toplotno \xc5\xa1okiramo (npr. 42 \xc2\xb0 C za 30-120 sekund). Ta metoda obi\xc4\x8dajno zelo dobro deluje pri kro\xc5\xbeni plazmidni DNK, ne pa pri linearni, verjetno zato ker naravne eksonukleaze hitro razgrajujejo linearno DNK. Nasprotno pa se obi\xc4\x8dajno celice, ki so naravno kompetentne bolj u\xc4\x8dinkovito transformirajo z linearno DNK kot s plazmidno DNK.\xc2\xa0_NEWLINE_U\xc4\x8dinkovitost transformacije z uporabo CaCl\xe2\x82\x82 se manj\xc5\xa1a z ve\xc4\x8danjem velikosti plazmida, zato je elektroporacija lahko bolj u\xc4\x8dinkovita metoda za absorpcijo velike plazmidne DNK. Celice, ki se uporabljajo pri elektroporaciji, pripravimo tako, da jih najprej operemo v hladni dvojno destilirani vodi, da odstranimo nabite delce, ki lahko med postopkom elektroporacije ustvarjajo iskrenje.\n_START_SECTION_\nSelekcija in re\xc5\xa1etanje pri transformaciji plazmida\xc2\xa0\n_START_PARAGRAPH_\nPri transformaciji po navadi nastane relativno malo transformiranih celic in zelo veliko netransformiranih celic, zato moramo za nadaljnje postopke lo\xc4\x8diti le-te.\xc2\xa0Plazmide ozna\xc4\x8dimo s selektivnim ozna\xc4\x8devalcem, da pride pri celicah brez plazmida do ustavitve rasti ali smrti. Kot ozna\xc4\x8devalec za prokarionte se pogosto uporablja odpornost proti antibiotikom. Transformiran plazmid vsebuje gen, ki daje odpornost proti antibiotiku na katerega so bakterije sicer ob\xc4\x8dutljive. Zmes zdravljenih celic z antibiotikom gojimo na mediju, ki vsebuje antibiotik, na katerem rastejo le transformirane celice. Druga metoda je uporaba auksotrofnih markerjev, ki lahko kompenzirajo nezmo\xc5\xbenost presnove nekaterih aminokislin, nukleotidov ali sladkorjev. Tak\xc5\xa1na metoda zahteva uporabo sevov, ki imajo pomanjkljivo sintezo ali uporabnost dolo\xc4\x8denih biomolekul in medij, ki omogo\xc4\x8da rast le tistim celicam, ki vsebujejo plazmid._NEWLINE_V eksperimentu s kloniranjem se lahko vstavi gen v plazmid, ki se uporablja za transformacijo. Vendar pa v takem poskusu vsi plazmidi ne vsebujejo uspe\xc5\xa1no vstavljenega gena. Zato se lahko uporabijo dodatne tehnike za pregled transformiranih celic, ki vsebujejo plazmid z vstavljenim genom.\xc2\xa0Strukturni geni, so lahko uporabljeni kot markerji, kot na primer lacZ gen (gen za \xc3\x9f-galaktozidazo) ki ga izkori\xc5\xa1\xc4\x8damo pri belo-modrem testu. Test temelji na \xce\xb1-koplementaciji, kjer fragment lacZ gena (lacZ\xce\xb1) v plazmidu lahko komplementira \xc5\xa1e en mutiran gen lacZ (lacZ\xce\x94M15) v celici. Oba gena posebej proizvajata nefunkcionalne peptide, \xc4\x8de pa se izrazita skupaj tvorita funkcionalno \xc3\x9f-galaktozidazo. Prisotnost \xc3\x9f-galaktozidaze lahko odkrijemo, \xc4\x8de celice gojimo na goji\xc5\xa1\xc4\x8dnih plo\xc5\xa1\xc4\x8dah, ki vsebujejo X-gal, v primeru, da je bakterija transformirana s plazmidom z vstavkom bodo nastale bele kolonije (uspe\xc5\xa1na ligacija moti gen lacZ\xce\xb1 in ne more nastati nobena funkcionalna \xce\xb2-galaktozidaz), v primeru, da bakterije vsebujejo prazen plazmid pride do modrega obarvanja._NEWLINE_Drugi pogosto uporabljani strukturni geni so zeleni fluorescentni proteini (GFP), ki proizvaja celice, ki sijejo zeleno pod modro svetlobo in encim luciferazo, ki katalizira reakcijo z luciferinom za oddajanje svetlobe. Rekombinantno DNK lahko tudi odkrijemo z uporabo drugih metod, kot je hibridizacija nukleinske kisline z radioaktivnim iskalnim RNK fragmentom. Celice, ki izra\xc5\xbeajo \xc5\xbeeleni protein iz plazmida, pa se lahko detektirajo z uporabo imunolo\xc5\xa1kih metod.'