b'\n_START_ARTICLE_\nMonoklonska protitelesa\n_START_PARAGRAPH_\nMonoklonska protitelesa (mAb) so monospecifi\xc4\x8dna in monoafinitetna protitelesa, usmerjena torej proti enemu antigenu in enemu epitopu._NEWLINE_K\xc3\xb6hler in Milstein sta leta 1975 izdelala metodo za pridobivanje monoklonskih protiteles s hibridizacijo celic. S to metodo je mogo\xc4\x8de pridobiti specifi\xc4\x8dna protitelesa po \xc5\xbeelji v neomejenih koli\xc4\x8dinah. Ta metoda temelji na zlitju (fuziji) ali somati\xc4\x8dni hibridizaciji med normalnim limfocitom B, ki proizvaja protitelesa, in mielomsko celico ter selekcijo zlitih celic, ki izlo\xc4\x8dajo protitelesa \xc5\xbeelene specifi\xc4\x8dnosti. Take, z zlitjem pripravljene nesmrtne linije celic, imenujemo hibridomi in protitelesa, ki jih izdelujejo, monoklonska protitelesa. Uspeh te metode je temeljil na pripravi mielomskih celi\xc4\x8dnih linij, ki se razmno\xc5\xbeujejo v normalnem goji\xc5\xa1\xc4\x8du za kulturo celic, vendar se ne razmno\xc5\xbeujejo v selekcijskem goji\xc5\xa1\xc4\x8du, ker nimajo potrebnih genov za sintezo DNK v tem goji\xc5\xa1\xc4\x8du. Normalne celice po zlitju z mielomskimi celicami prispevajo potrebne gene, tako da se v selekcijskem goji\xc5\xa1\xc4\x8du lahko razmno\xc5\xbeujejo samo somati\xc4\x8dni celi\xc4\x8dni hibridi, lastnosti mielomske celice pa napravijo take hibridome nesmrtne.\n_START_SECTION_\nNastanek in selekcija hibridnih celic\n_START_PARAGRAPH_\nPo zlitju dveh somati\xc4\x8dnih celic nastane celica, ki ji pravimo heterokariont. Zlitje lahko dose\xc5\xbeemo z inkubiranjem suspenzije dveh celic z inaktiviranim virusom Sendai ali pa s polietilenglikolom (PEG). Oba omogo\xc4\x8data zlitje plazemskih membran, pri \xc4\x8demer nastane hibridna celica z dvema lo\xc4\x8denima jedroma \xe2\x80\x93 heterokariont. Po ve\xc4\x8d delitvah se jedri zdru\xc5\xbeita v eno veliko jedro, ki ima kromosome obeh star\xc5\xa1evskih celic. V tem stadiju je celica nestabilna, se razmno\xc5\xbeuje in izgublja razli\xc4\x8dno \xc5\xa1tevilo kromosomov od enega ali obeh partnerjev, dokler se kon\xc4\x8dno ne stabilizira. Naklju\xc4\x8dna izguba kromosomov pa lahko povzro\xc4\x8di, da se izgubijo kromosomi, ki so potrebni za pre\xc5\xbeivetje celice, in tak hibridom odmre. Lahko se seveda izgubijo tudi kromosomi, ki so potrebni za sintezo protiteles._NEWLINE_Pri postopku fuzije se dejansko zlije le majhen odstotek celic in nekatere zlite celice nastanejo iz homogenih star\xc5\xa1evskih celic A-A ali B-B in samo nekatere so \xc5\xbeeleni hibridi A-B. Hibridne celice je zato treba lo\xc4\x8diti od homogenih zlitih celic in od nezlitih celic. Pri najbolj pogosto uporabljeni metodi za osamitev hibridov A-B vzamemo mielomske celice, ki zaradi mutacije ne zmorejo sinteze nukleotidov po eni od dveh sinteznih poti. Zlite celice gojimo nato v goji\xc5\xa1\xc4\x8du HAT (H = hipoksantin, A = aminopterin, T = timidin), v katerem pre\xc5\xbeivijo samo hibridne celice A-B.f>_NEWLINE_Podlaga za selekcijo v goji\xc5\xa1\xc4\x8du HAT je ugotovitev, da sesalske celice lahko sintetizirajo nukleotide po dveh razli\xc4\x8dnih sinteznih poteh: po poglavitni poti, imenovani pot de novo, in po pomo\xc5\xbeni poti. Pot de novo, po kateri se formilne ali metilne skupine prenesejo iz aktivirane oblike tetrahidrofolata, blokira aminopterin, analog folne kisline. \xc4\x8ce je poglavitna pot blokirana, uporabi celica pomo\xc5\xbeno pot, ki obide aminopterinsko blokado. Encima, ki katalizirata sintezo po pomo\xc5\xbeni poti, sta hipoksantin-gvanozin fosforibozil transferaza (HGPRT)  in timidin kinaza (TK). Goji\xc5\xa1\xc4\x8de HAT tako zaradi aminopterina blokira poglavitno pot, hipoksantin in timidin pa delujeta kot substrata za sintezo nukleinskih kislin po alternativni poti. \xc4\x8ce zlijemo dve celici, eno z mutiranim genom za TK in eno z mutiranim genom za HGPRT, se bodo v goji\xc5\xa1\xc4\x8du HAT lahko razmno\xc5\xbeevale le fuzirane hibridne celice, ki imajo vse potrebne encime za razmno\xc5\xbeevanje v tem goji\xc5\xa1\xc4\x8du.\n_START_SECTION_\nPriprava in \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denje monoklonskih protiteles\n_START_PARAGRAPH_\nZa enega fuzijskega partnerja vzamemo mielomske celice, ki ne izdelujejo protiteles, so torej Ig\xe2\x81\xbb in so tudi HGPRT\xe2\x81\xbb. Te celice ne pre\xc5\xbeivijo v goji\xc5\xa1\xc4\x8du HAT, podelijo pa zlitim celicam nesmrtnost. Drugi fuzijski partner pa so vrani\xc4\x8dne celice, ki vsebujejo aktivirane limfocite B (so Ig\xe2\x81\xba in HGPRT\xe2\x81\xba). Nezlite vrani\xc4\x8dne celice so kon\xc4\x8dno diferencirane, \xc5\xbeivijo le kratek \xc4\x8das, zato izven organizma kmalu odmrejo. Po fuziji razdelimo zlite celice v jamice za mikrokulturo, kjer je goji\xc5\xa1\xc4\x8de HAT. Po 7\xe2\x80\x9310 dneh so v ve\xc4\x8dini jamic celice mrtve, v nekaterih pa so vendarle majhne gru\xc4\x8de \xc5\xbeivih celic, ki jih lahko odkrijemo z obrnjenim (invertnim) faznokontrastnim mikroskopom. Vsaka gru\xc4\x8da predstavlja klonsko ekspanzijo enega hibridoma. Posamezne celice iz teh gru\xc4\x8d prenesemo in jih gojimo v lo\xc4\x8denih jamicah, da si zagotovimo monoklonskost za vsako izlo\xc4\x8deno protitelo. Klone iz posameznih celic testiramo glede na navzo\xc4\x8dnost protiteles v supernatantni teko\xc4\x8dini. Klone, ki proizvajajo \xc5\xbeelena protitelesa, lahko naprej subkloniramo, da si zanesljivo zagotovimo \xc4\x8distost klona v vsaki vdolbinici za mikrokulturo._NEWLINE_Ko dobimo \xc4\x8diste klone hibridomov, ki proizvajajo protitelesa, jih testiramo glede na \xc5\xbeeleno specifi\xc4\x8dnost protiteles. Najbolj uporabljeni tehniki sta encimskoimunski test (ELISA) in radioimunski test (RIA). Po dolo\xc4\x8ditvi hibridoma, ki izlo\xc4\x8da \xc5\xbeeleno protitelesno specifi\xc4\x8dnost, ta hibridom znova kloniramo z metodo kon\xc4\x8dnega razred\xc4\x8denja, da si zagotovimo, da je kultura v resnici monoklonska. Klonirane hibridome nato razmno\xc5\xbeujemo na razli\xc4\x8dne na\xc4\x8dine in pridobivamo velike koli\xc4\x8dine monoklonskih protiteles. Hibridome lahko gojimo v steklenicah za tkivno kulturo ali pa v peritonealni votlini histokompatibilnih (singenskih) mi\xc5\xa1i, kjer se protitelesa izlo\xc4\x8dajo v ascites v velikih koncentracijah, vendar se zaradi eti\xc4\x8dnih razlogov ta na\xc4\x8din proizvodnje protiteles vse bolj opu\xc5\xa1\xc4\x8da._NEWLINE_Tako v tkivni kulturi kot v ascitesu je poleg \xc5\xbeelenih monoklonskih protiteles \xc5\xa1e mnogo drugih molekul, ki jih moramo za nadaljnjo uporabo protiteles odstraniti. V tkivni kulturi so ne\xc5\xbeelene komponente, predvsem rastni faktorji, hormoni in transferini, medtem ko vzorec in vivo vsebuje poleg monoklonskih protiteles \xc5\xa1e druga protitelesa, proteaze, nukleaze, nukleinske kisline in viruse. V obeh primerih so lahko hibridomi v vzorec izlo\xc4\x8dili tudi citokine, prav tako pa so vzorci lahko kontaminirani z bakterijami in njihovimi izlo\xc4\x8dki (endotoksini). _NEWLINE_Vzorec z monoklonskimi protitelesi najprej pripravijo za \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denje tako, da celice in njene dele, lipide in \xc5\xa1e druge mo\xc5\xbene ve\xc4\x8dje ne\xc4\x8disto\xc4\x8de odstranijo s centrifugiranjem, ki ji sledi filtracija s porami filtra 0,45 \xc2\xb5m. V primeru nezadostnih koncentracij monoklonskih protiteles te skoncentrirajo z ultrafiltracijo ali z dializo._NEWLINE_Ve\xc4\x8dino nabitih ne\xc4\x8disto\xc4\x8d predstavljajo anioni, kot so nukleinske kisline in endotoksini. Teh se znebimo z ionsko-izmenjevalno kromatografijo. Pri kation-izmenjevalni kromatografiji pri dovolj nizki vrednosti pH se \xc5\xbeelena protitelesa ve\xc5\xbeejo na kolono, medtem ko anioni potujejo skozi, pri anion-izmenjevalni kromatografiji pri dovolj visoki vrednosti pH pa \xc5\xbeelena protitelesa potujejo skozi kolono, medtem ko se anioni ve\xc5\xbeejo.Beljakovine lahko lo\xc4\x8dujemo glede na njihovo izoelektri\xc4\x8dno to\xc4\x8dko (pI). Primer: albumin ima izoelektri\xc4\x8dno to\xc4\x8dko pri 4,8, kar je precej manj od izoelektri\xc4\x8dne to\xc4\x8dke ve\xc4\x8dine monoklonskih protiteles, ki imajo pI okoli 6,1. Po drugi strani pa s to metodo ne moremo dobro lo\xc4\x8diti monoklonskih protiteles od transferinov, ki imajo izoelektri\xc4\x8dno to\xc4\x8dko pri 5,9. Za dobro lo\xc4\x8ditev namre\xc4\x8d velja, da mora biti razlika v pI vsaj za 1. Transferin tako od vzorca raje lo\xc4\x8dujemo z gelsko kromatografijo. Mnogo hitrej\xc5\xa1a, enostopenjska metoda za \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denje pa je afinitetna kromatografija z uporabo proteina A/G ali specifi\xc4\x8dnega antigena._NEWLINE_Protitelesa lahko lo\xc4\x8dimo od drugih beljakovin tudi z obarjanjem, pri tem uporabljamo natrijev sulfat ali amonijev sulfat. Protitelesa se namre\xc4\x8d oborijo \xc5\xbee pri nizkih koncentracijah soli, medtem ko ve\xc4\x8dina drugih beljakovin \xc5\xa1ele pri vi\xc5\xa1jih koncentracijah._NEWLINE_Dose\xc5\xbeeno \xc4\x8distost vzorca lahko analiziramo s kromatogramom. Kakr\xc5\xa1nakoli ne\xc4\x8disto\xc4\x8da bo dala vrh, povr\xc5\xa1ina pod vrhom pa nakazuje na koli\xc4\x8dino te ne\xc4\x8disto\xc4\x8de. Alternativno lahko izvedemo tudi gelsko elektroforezo in kapilarno elektroforezo, pri \xc4\x8demer za vsako ne\xc4\x8disto\xc4\x8do tudi tukaj dobimo lise razli\xc4\x8dnih intenzitet, odvisno od mno\xc5\xbeine ne\xc4\x8disto\xc4\x8de.\n_START_SECTION_\n\xc4\x8clove\xc5\xa1ka monoklonska protitelesa\n_START_PARAGRAPH_\nPriprava \xc4\x8dlove\xc5\xa1kih monoklonskih protiteles je precej te\xc5\xbeavna. Najve\xc4\x8djo te\xc5\xbeavo predstavlja izolacija aktiviranih limfocitov B. \xc4\x8clove\xc5\xa1ke hibridome je namre\xc4\x8d treba pripraviti iz \xc4\x8dlove\xc5\xa1ke periferne krvi, ki pa ima zelo malo aktiviranih limfocitov B. Ljudi seveda ne moremo imunizirati, kot lahko to storimo pri mi\xc5\xa1ih. To te\xc5\xbeavo so posku\xc5\xa1ali re\xc5\xa1iti z imunizacijo humanih celic in vitro, vendar je odziv druga\xc4\x8den kot in vivo, posledica tega je, da celice B navadno izdelujejo samo \xc5\xa1ibko afinitetna protitelesa IgM. Imunizaciji humanih celic in vitro se lahko izognemo z vgraditvijo genov, ki zapisujejo humana protitelesa, v t. i. SCID-humano mi\xc5\xa1. Mutiranemu sevu mi\xc5\xa1i, ki so brez limfocitov B, so vgradili humani pri\xc5\xbeeljc in bezgavke.  SCID-humana mi\xc5\xa1 ima tako humane limfocite B in T. Po imunizaciji teh mi\xc5\xa1i lahko iz vranice osamimo aktivirane limfocite B in jih uporabimo za pripravo humanih monoklonskih protiteles. Druga velika te\xc5\xbeava pri pripravljanju humanih monoklonskih protiteles je pomanjkanje humanih mielomskih celic, ki bi bile nesmrtne, primerne za selekcijo v goji\xc5\xa1\xc4\x8du HAT in ki ne izdelujejo protiteles. Na\xc4\x8din, da se naredi humane celice nesmrtne, je tak, da normalne limfocite B transformirajo z virusom Epstein-Barr. \xc4\x8ce limfocite B kultiviramo skupaj z antigenom v navzo\xc4\x8dnosti tega virusa, se nekateri limfociti B transformirajo in pridobijo lastnost trajnega razmno\xc5\xbeevanja in izdelovanja protiteles. Kloniranje takih spremenjenih in aktiviranih celic lahko uporabimo za pripravo \xc4\x8dlove\xc5\xa1kih monoklonskih protiteles\n_START_SECTION_\nImunotoskini\n_START_PARAGRAPH_\nImunotoksini, ki so sestavljeni iz monoklonskih protiteles, specifi\xc4\x8dnih za tumor, na katerih je pritrjen toksin, so potencialne zdravilne u\xc4\x8dinkovine. Toksini, ki jih uporabljamo za pripravljanje imunotoksinov, so ricin, toksin \xc5\xa1iga in davi\xc4\x8dni toksin. Primerni so \xc5\xa1e \xc5\xa1tevilni drugi. Vsi ti prepre\xc4\x8dujejo sintezo beljakovin. Vsak tak toksin je sestavljen iz dveh funkcijsko razli\xc4\x8dnih polipeptidov: toksinske verige in verige, ki se pritrdi na celi\xc4\x8dni povr\xc5\xa1inski receptor. Brez pritrjevalnega polipeptida je toksin ne\xc5\xa1kodljiv, ker ne more v celico. Imunotoksine pripravimo tako, da nadomestimo pritrjevalni polipeptid z monoklonskim protitelesom, specifi\xc4\x8dnim za dolo\xc4\x8den tumorski antigen. Pritrjeno protitelo teoreti\xc4\x8dno usmeri toksin specifi\xc4\x8dno na tumorsko celico in jo ubije s tem, da prepre\xc4\x8di sintezo beljakovin. Klini\xc4\x8dno preizku\xc5\xa1ajo ve\xc4\x8d imunotoksinov. Spodbudne rezultate so dosegli pri levkemijah in limfomih, medtem ko so bili rezultati pri bolnikih z velikimi tumorji do zdaj neuspe\xc5\xa1ni.\n_START_SECTION_\nZ genskim in\xc5\xbeeniringom preoblikovana monoklonska protitelesa\n_START_PARAGRAPH_\n\xc4\x8ce vbrizgnemo mi\xc5\xa1ja monoklonska protitelesa ljudem, jih ti spoznajo za tuje in razvijejo proti njim protitelesni odziv. Nastala \xc4\x8dlove\xc5\xa1ka protitelesa proti mi\xc5\xa1jim protitelesom hitro zmanj\xc5\xa1ajo u\xc4\x8dinkovitost mi\xc5\xa1jih monoklonskih protiteles in jih odstranijo iz telesa. Poleg tega pa lahko kro\xc5\xbee\xc4\x8di kompleksi mi\xc5\xa1jih in \xc4\x8dlove\xc5\xa1kih protiteles povzro\xc4\x8dijo alergi\xc4\x8dne reakcije. Te neza\xc5\xbeelene reakcije mo\xc4\x8dno omejujejo uporabo mi\xc5\xa1jih monoklonskih protiteles pri ljudeh. En na\xc4\x8din, da se izognemo vsaj nekaterim od teh zapletov, je razumljivo uporaba \xc4\x8dlove\xc5\xa1kih monoklonskih protiteles. Zaradi tehni\xc4\x8dnih te\xc5\xbeav pri pripravi le-teh in zaradi zapletov, ki jih povzro\xc4\x8da uporaba mi\xc5\xa1jih monoklonskih protiteles pri ljudeh, sku\xc5\xa1ajo raziskovalci preoblikovati monoklonska protitelesa z rekombinantno tehnologijo DNK.\n_START_SECTION_\nHimerna monoklonska protitelesa\n_START_PARAGRAPH_\nEn pristop k preoblikovanju protitelesa je kloniranje rekombinantne DNK, ki ima zaporedja za promotor, vodilno zaporedje in zaporedje za variabilno regijo mi\xc5\xa1jega protitelesnega gena ter eksone in konstantne regije \xc4\x8dlove\xc5\xa1kega protitelesnega gena. Protitelo, ki ga kodira tak rekombinantni gen, je himerno protitelo mi\xc5\xa1-\xc4\x8dlovek. Njegova specifi\xc4\x8dnost za antigen, ki jo dolo\xc4\x8da variabilna regija, izhaja iz mi\xc5\xa1je DNK, njegov izotip (razred protiteles), ki ga dolo\xc4\x8da konstantna regija, pa iz humane DNK. Taka protitelesa imajo veliko manj antigenskih determinant in so zato manj imunogena kot mi\xc5\xa1ja protitelesa, \xc4\x8de jih vbrizgnemo ljudem._NEWLINE_Ker mi\xc5\xa1ja variabilna regija himernih protiteles tudi lahko spodbudi imunski odziv v ljudeh, so razvili humanizirana protitelesa, ki vsebujejo samo hipervariabilne regije mi\xc5\xa1jega izvora. Taka protitelesa so za ljudi manj imunogena kot himerna protitelesa.\n_START_SECTION_\nBispecifi\xc4\x8dna protitelesa\n_START_PARAGRAPH_\nBispecifi\xc4\x8dna protitelesa so hibridi dveh razli\xc4\x8dnih protitelesnih molekul. Razvili so razli\xc4\x8dna bispecifi\xc4\x8dna protitelesa, pri katerih je ena polovica specifi\xc4\x8dna za tumor in druga polovica za membransko molekulo imunske efektorske celice, npr. naravne celice ubijalke, makrofaga ali citotoksi\xc4\x8dne celice T. Taka bispecifi\xc4\x8dna protitelesa lahko pove\xc5\xbeejo imunsko efektorsko celico s tumorjem in tako posredujejo razkroj tumorske celice.\n_START_SECTION_\nUporaba monoklonskih protiteles\n_START_PARAGRAPH_\nMonoklonska protitelesa so izredno koristna kot diagnosti\xc4\x8dni in terapevtski reagenti. V za\xc4\x8detku so uporabljali monoklonska protitelesa predvsem kot diagnosti\xc4\x8dne reagente in vitro, danes pa so na voljo za dolo\xc4\x8danje krvnih skupin, ugotavljanje nose\xc4\x8dnosti, odkrivanje \xc5\xa1tevilnih patogenih mikrobov, merjenje serumske koncentracije \xc5\xa1tevilnih zdravil za usklajevanje histokompatibilnostnih antigenov in odkrivanje nekaterih tumorskih antigenov. Radioaktivno zaznamovana protitelesa lahko uporabimo za odkrivanje tumorskih antigenov in vivo, kar omogo\xc4\x8da zgodnjo diagnozo nekaterih primarnih ali metastatskih tumorjev pri bolnikih. Monoklonska protitelesa se uspe\xc5\xa1no uporabljajo tudi pri zdravljenju.\n_START_SECTION_\nZdravljenje avtoimunih bolezni\n_START_PARAGRAPH_\nMonoklonska protitelesa, ki se uporabljajo za zdravljenje avtoimunih bolezni, vklju\xc4\x8dujejo infliksimab in adalimumab, ki sta u\xc4\x8dinkovita proti revmatoidnemu artritisu, Crohnovi bolezni in ulcerativnem kolitisu zaradi vezave na TNF-\xce\xb1 in njegovo posledi\xc4\x8dno deativacijo. Basiliksimab in daklizumab zavirata IL-2 na aktiviranih limfocitih T in s tem pomagata prepre\xc4\x8diti akutno zavrnitev presajenih ledvic. Omalizumab zavira \xc4\x8dlove\xc5\xa1ki imunoglobulin E (IgE) in se uporablja pri zmerni do hudi astmi.'