b'\n_START_ARTICLE_\nKolorimetrija\n_START_SECTION_\nKolorimeter\n_START_PARAGRAPH_\nKolorimeter je naprava, ki izmeri absorbanco raztopine pri dolo\xc4\x8deni valovni dol\xc5\xbeini.Pri uporabi kolorimetra potrebujemo, raztopine razli\xc4\x8dnih red\xc4\x8denj, vklju\xc4\x8dno z referen\xc4\x8dno raztopino znane koncentracije. Pri vizuelnem kolorimetru (npr. Dubosq kolorimeter) lahko spreminjamo dol\xc5\xbeino svetlobne poti skozi raztopino in primerjamo filtrirano svetlobo. Na podoben na\xc4\x8din deluje tudi Nessler-jeva cev (najbolj znana po uporabi Nesslerjevega reagenta, ki pa se lahko uporablja le za razli\xc4\x8dne kolorimetri\xc4\x8dne kemi\xc4\x8dne teste). Uporabljamo \xc5\xa1e elektronske avtomati\xc4\x8dne kolorimetre, ki jih je potrebno pred uporabo kalibrirati s kiveto s kontrolno raztopino.Koncentracija vzorca se lahko izra\xc4\x8duna iz intenzitete svetlobe pred in po prehodu skozi vzorec s pomo\xc4\x8djo Beer-Lambert-ovega pravila. Barva ali valovna dol\xc5\xbeina izbranega filtra je izjemno pomembna, saj mora biti valovna dol\xc5\xbeina svetlobe, kolorimetra enaka valovni dol\xc5\xbeini, ki jo absorbira preiskovani vzorec (\xc4\x8de je raztopina modra, nastavimo filter kolorimetra na rde\xc4\x8de).\n_START_SECTION_\nBiuretska metoda\n_START_PARAGRAPH_\nZ biuretsko reakcijo dolo\xc4\x8damo prisotnost peptidnih vezi. V alkalnih pogojih tvori bakrov(II) ion koordinacijsko spojino s \xc5\xa1tirimi skupinami \xe2\x80\x93NH iz peptidnih vezi. Nastali kompleks je vijoli\xc4\x8dne barve in ima absorpcijski vrh pri 540-560nm.Dobra lastnost te metode je, da ni interakcij med prostimi aminokislinami in ni velike odvisnosti od aminokislinske sestave, ker baker reagira s peptidno verigo ne s stranskimi skupinami.Glavna pomanjkljivost, ki mo\xc4\x8dno omejuje njeno uporabnost,pa je njena nizka ob\xc4\x8dutljivost\xc2\xa0: 1-6 mg proteina/ml. Ob\xc4\x8dutljivost bi lahko zvi\xc5\xa1ali\xc2\xa0: -z lo\xc4\x8ditvijo kompleksa baker-protein, z gelsko filtracijo gela, kateri sledi sprostitev bakra iz kompleksa in kolorimetri\xc4\x8dna meritev -z merjenjem absorbance standardne biuretske reakcije pri 310nm.Nekateri pufri, \xc5\xa1e posebej tisti, ki temeljijo na uporabi Trisa, lahko motijo Biuretsko reakcijo; enako tudi amonijak, ki ote\xc5\xbeuje meritve frakcij, dobljenih z amonijevim sulfatom.\n_START_SECTION_\nLowryjeva metoda\n_START_PARAGRAPH_\nLowryjeva metoda (Folin-Ciocalteaujeva metoda) temelji na biuretski reakciji proteinov z bakrom v alkalnih pogojih.Z redukcijo Folin-Ciocalteaujevega reagenta (zmes fosfatov,molibdatov in volframatov) pride do nastanka molibdenskega modrila , Do redukcije pride zaradi oksidacije aromatskih aminokislin, reakcije, ki jo katalizira baker. Metoda je bolj ob\xc4\x8dutljiva kot biuretska reakcija (0.1-1 mg proteina/ml). Za potek reakcije je zelo pomembna vrednost pH, ki mora biti med 10 in 10.5. Poleg tega je F-C reagent zelo nestabilen v alkalnem okolju, kar zahteva veliko natan\xc4\x8dnost \xc4\x8dasovne izvedbe (molibden se v alkalnem po\xc4\x8dasi razkraja), da dobimo to\xc4\x8dne in ponovljive rezultate. Na potek Lowryjeve metode vpliva veliko snovi\xc2\xa0: amino derivati, aminokisline, pufri, ma\xc5\xa1\xc4\x8dobe, sladkorji, nukleinske kisline, soli, idr.Predvsem je pomembno, da Lowryjeva metoda ne dopu\xc5\xa1\xc4\x8da prisotnosti razli\xc4\x8dnih detergentov (anionskih, neionskih), saj se ti reagenti pogosto uporabljajo za raztapljanje proteinov. Prednost te metode je kot re\xc4\x8deno visoka ob\xc4\x8dutljivost, saj z red\xc4\x8danjem vzorca red\xc4\x8dimo tudi mote\xc4\x8de snovi in s tem zmanj\xc5\xa1amo njihov \xc5\xa1kodljivi vpliv. Dodatna pomanjkljivost tega postopka, ki se pogosto spregleda, je nelinearna standardna krivulja pri vi\xc5\xa1jih koncentracijah.\n_START_SECTION_\nBradfordova metoda\n_START_PARAGRAPH_\nPri dolo\xc4\x8denih pogojih kisle in bazi\xc4\x8dne skupine proteina reagirajo z organskimi barvili in nastane barvna oborina. To lastnost bi zlahka izkoristili za kvantitativno analizo, vendar so \xc5\xa1tevilna barvila neob\xc4\x8dutljiva (npr.Orange G) oziroma, imajo druge pomanjkljivosti. Pristop je postal uporaben \xc5\xa1ele, ko je B. M. Bradford uporabil barvo Coomassie Brilliant Blue G-250. Vezava tega barvila na protein povzro\xc4\x8di premik absorpcijskega vrha iz rde\xc4\x8de v modro (465nm na 595nm). Osnovno raztopino barvila se pripravi v fosforni ali perklorov kislin. Interakcija med anionom barvila in proteinom so elektrostatske in hidrofobne. Metoda je hiter, preprost, enostopenjski postopek: reagent dodajemo vzorcu in merimo absorbanco pri 595nm.Glede na to da je metoda relativna, potrebujemo umeritveno krivuljo, ki jo nari\xc5\xa1emo glede na izmerjeno absorbanco znanih koncentracij proteina.Za analizo lahko uporabljamo steklene kivete,vendar se kompleks protein-barvilo ve\xc5\xbee na steklene povr\xc5\xa1ine in ga moramo vsaki\xc4\x8d odstraniti z namakanjem v 0.1 M HCl. Lahko uporabimo tudi kivete za enkratno uporabo. Metoda je zelo ob\xc4\x8dutljiva: 0.2-1.4 mg proteina/ml za standardno raztopino oziroma 5-100\xce\xbcg/ml. Ka\xc5\xbee veliko odvisnost od amino-kislinske sestave proteina zaradi vezave, barvila na bazi\xc4\x8dne (zlasti arginin) in aromatske amino-kislinske preostanke. V ve\xc4\x8dini primerov je bolj\xc5\xa1a kot Lowryeva metoda. --FFAstudent 20:34, 28. januar 2010 (CET)Marija Andjelkovic'