b'\n_START_ARTICLE_\nRestrikcijski encim\n_START_PARAGRAPH_\nRestrikcijski encim, restriktaza ali restrikcijska endonukleaza je encim, ki razre\xc5\xbee dvojnovija\xc4\x8dno DNK na specifi\xc4\x8dnih mestih nukleotidnih sekvenc, imenovanih restrikcijska mesta. Ti encimi so se razvili v bakterijah in v arhejah kot obrambni mehanizem pred virusi. V bakterijski celici kot gostiteljici virusa restrikcijski encim razre\xc5\xbee oz. razcepi virusno DNK v procesu, ki se imenuje restrikcija. Do restrikcije bakterijske DNK ne pride, saj je le-ta metilirana (z encimom metilaza). Restrikcijski encim in metilaza skupaj tvorita restrikcijski modifikacijski sistem. Restrikcijski encim razre\xc5\xbee DNK na dveh mestih \xe2\x80\x93 na vsaki verigi dvojne vija\xc4\x8dnice po enkrat._NEWLINE_Prou\xc4\x8devali so preko 3000 restrikcijskih encimov, ve\xc4\x8d kot 600 jih je komercialno dostopnih in se rutinsko uporabljajo pri delu z DNK v laboratorijih.\n_START_SECTION_\nZgodovina\n_START_PARAGRAPH_\nPrvi izolaciji restrikcijskega encima leta 1970 (Hindll) so sledila odkritja in karakterizacije \xc5\xa1tevilnih restrikcijskih endonukleaz, leta 1978 so na tem podro\xc4\x8dju raziskovalci Daniel Nathans, Werner Arber in Hamilton O. Smith prejeli Nobelovo nagrado za fiziologijo ali medicino. Njihovo odkritje je vodilo v razvoj tehnologije rekombinantne DNK, ki na primer omogo\xc4\x8da produkcijo humanega inzulina za zdravljene sladkorne bolezni z uporabo bakterije E. Coli.\n_START_SECTION_\nPrepoznavno mesto\n_START_PARAGRAPH_\nRestrikcijski encimi prepoznajo specifi\xc4\x8dno sekvenco nukleotidov in naredijo rez v obeh verigah DNK. Prepoznavna mesta po navadi obsegajo 4 do 8 nukleotidov. Mnoga prepoznavna mesta so palindromska, kar pomeni da se du\xc5\xa1ikove baze berejo enako v obe smeri. V teoriji obstajata dva tipa palindromskih sekvenc: ogledalu podoben (angl. mirror-like) in obratno ponovljen (angl. inverted repeat). Za ogledalu podoben palindrom je zna\xc4\x8dilno, da se sekvenca bere enako znotraj ene verige v molekuli DNK, na primer GTAATG. Obratno ponovljen palindrom se prav tako bere enako v obe smeri, le da se tak\xc5\xa1ne sekvence nahajajo na komplementarnih verigah molekule DNK, na primer GTATAC (kar je komplementarno CATATG). Pogostej\xc5\xa1i so obratno ponovljeni palindromi, ki imajo pomembnej\xc5\xa1o biolo\xc5\xa1ko vlogo kot pa ogledalu podobni._NEWLINE_EcoRI razcepi verigo tako, da dobimo lepljive ("sticky") konce:_NEWLINE_ _NEWLINE_Restrikcijski encim SmaI pa razcepi do topih ("blunt") koncev:_NEWLINE_Sekvence DNK, ki jih restrikcijski encim prepozna, se od encima do encima razlikujejo, in sicer v dol\xc5\xbeini in vrsti sekvence ter v orientaciji verige lepljivih koncev (5\xe2\x80\x99 ali 3\xe2\x80\x99 konec)._NEWLINE_Neo\xc5\xa1izomere so razli\xc4\x8dni restrikcijski encimi, ki prepoznajo isto sekvenco, a razcepijo DNK na razli\xc4\x8dnih mestih znotraj prepoznane sekvence._NEWLINE_Izo\xc5\xa1izomere pa so razli\xc4\x8dni restrikcijski encimi, ki prepoznajo in tudi razcepijo na enakih mestih molekule DNK.\n_START_SECTION_\nTip I\n_START_PARAGRAPH_\nRestrikcijski encimi tipa I so bili prvi, ki so bili odkriti, prav tako so bili predstavniki te skupine prvi najdeni v dveh razli\xc4\x8dnih sevih E. coli (K-12 in B). Ti encimi cepijo na razli\xc4\x8dnih mestih, ki so naklju\xc4\x8dno oddaljeni (vsaj 1000 bp) stran od njihovega prepoznavnega mesta. Razcepitvi sledi proces translokacije DNK. Prepoznavno mesto je asimetri\xc4\x8dno, sestavljeno iz dveh delov (prvi vsebuje 3-4 nukleotide, drugi pa je iz 4-5 nukleotidov), med katerima je vmesnik iz 6-8 nukleotidov. Ti encimi so multifunkcionalni, sposobni so restrikcije in modifikacijske aktivnosti, odvisno od metiliranosti tar\xc4\x8dne DNK. Za popolno aktivnost so potrebni kofaktorji: S-adenozil-L-metionin (AdoMet), ATP in magnezijevi ioni. Endonukleaze tipa I so sestavljene iz treh podenot: HsdR, HsdM in HsdS. HsdR je potrebna za restrikcijo, HsdM za pripenjanje metilnih skupin na molekulo DNK (metiltransferazna aktivnost), HsdS pa je pomembna za specifi\xc4\x8dnost prepoznave dolo\xc4\x8dene sekvence DNA.\n_START_SECTION_\nTip III\n_START_PARAGRAPH_\nRestrikcijski encimi tipa III (na primer EcoP15) prepoznajo dve lo\xc4\x8deni nepalindromski sekvenci, ki sta obratno orientirani. Molekulo DNK razcepijo pribli\xc5\xbeno 20-30 baznih parov stran od prepoznavnega mesta. Sestavljeni so iz ve\xc4\x8d podenot, za delovanje potrebujejo AdoMet in ATP kot kofaktorje za metilacijo in restrikcijo. So komponenta restrikcijsko-modifikacijskega mehanizma pri prokariontski DNK, ki varuje organizem pred vdorom tuje DNK. Encimi tipa III so hetero-oligomerne multifunkcionalne beljakovine, sestavljene iz dveh podenot: Res in Mod. Podenota Mod specifi\xc4\x8dno prepozna sekvenco DNK in deluje kot metiltransferaza (podobno kot podenoti M in S pri tipu I). Podenota Res je potrebna za restrikcijo, \xc4\x8deprav sama po sebi nima encimske aktivnosti. Ti encimi prepoznajo kratko 5-6 baznih parov dolgo sekvenco DNK in razcepijo 25-27 bp ni\xc5\xbeje, tako da na 5\'-koncu pustijo kratko, enoveri\xc5\xbeno izboklino. Za restrikcijo potrebujejo prisotnost dveh obratno orientiranih nemetiliranih prepoznavnih mest. Ti encimi metilirajo samo eno verigo DNK (na N-6 mestu adenozilnih preostankov), kar pomeni da bo imela na novo podvojena molekula DNK samo eno verigo metilirano, kar je dovolj za za\xc5\xa1\xc4\x8dito te nove DNK pred restrikcijo. Ta tip encimov sodi v beta-poddru\xc5\xbeino N6-adenin-metiltransferaz, saj za delovanje potrebuje AdoMet.\n_START_SECTION_\nUmetni restrikcijski encimi\n_START_PARAGRAPH_\nUmetne endonukleaze lahko pridobivamo s fuzijo vezavne domene DNK in nukleazne domene (pogosto razcepitvena domena tipa IIS endonukleaze FokI). Tak\xc5\xa1ni umetni encimi lahko ciljajo na velike predele DNK (do 36bp) in so lahko skonstruirani tako, da se ve\xc5\xbeejo na to\xc4\x8dno dolo\xc4\x8deno sekvenco DNK. Kot restrikcijski encimi se najpogosteje uporabljajo nukleaze s cinkovimi prsti. Le-te so splo\xc5\xa1no uporabljene v genskem in\xc5\xbeenirstvu, lahko pa se uporabljajo tudi v bolj klasi\xc4\x8dnem genskem kloniranju. Ostali umetni restrikcijski encimi temeljijo na DNK vezavni domeni efektorjev TAL.\n_START_SECTION_\nUporaba\n_START_PARAGRAPH_\nIzolirani restrikcijski encimi se uporabljajo pri delu z DNK v razli\xc4\x8dne raziskovalne namene._NEWLINE_Uporabljajo se kot pomo\xc4\x8d pri vstavljanju genov v plazmidne vektorje (pri raziskavah genskega kloniranja in izra\xc5\xbeanja beljakovin). Za optimalno uporabo plazmidov so le-ti modificirani, tako da vsebujejo polilinker, imenovan MCS (multiple cloning site), ki je bogat s prepoznavnimi sekvencami za restrikcijske encime. To omogo\xc4\x8da prilagodljivost pri vstavljanju genskih fragmentov v plazmidni vektor. Ker se moramo izogniti razcepitvi \xc5\xbeelene molekule DNK, a hkrati razrezati konce DNK, je izbor prave endonukleaze zelo pomemben (poznati moramo restrikcijske sekvence v molekuli DNK). Pri kloniranju genskih fragmentov v vektorjih se tako plazmidna DNA kot tudi genski vstavek razcepita z istim restrikcijskim encimov in se nato zlepita skupaj s pomo\xc4\x8djo DNK ligaze._NEWLINE_Endonukleaze se uporabljajo tudi za razlikovanje genskih alelov s prepoznavanjem zamenjav ene baze v molekuli DNK, kar poznamo kot polimorfizem posameznega nukleotida (SNP \xe2\x80\x93 angl. single nucleotide polymorphism). To je mogo\xc4\x8de le, \xc4\x8de SNP spremeni restrikcijsko mesto v alelu. V tej metodi se restrikcijski encim uporabi za genotipizacijo vzorca DNK, brez dragega genskega sekvenciranja. Vzorec DNK se na za\xc4\x8detku razre\xc5\xbee z restrikcijskim encimom na posamezne fragmente, ki se jih z gelsko elektroforezo nato lo\xc4\x8di. Pri alelih s pravimi prepoznavnimi mesti bomo videli dva trakova DNK, saj je pri\xc5\xa1lo do razcepitve verige z restrikcijskimi encimi. Pri tistih alelih, ki imajo spremenjeno prepoznavno sekvenco, pa bomo videli le en trak DNK, saj do razcepitve ni pri\xc5\xa1lo zaradi neprepoznavnosti sekvence za endonukleaze. \xc5\xa0tevilo trakov nam pove genotip posameznika kot primer restrikcijskega kartiranja._NEWLINE_Restrikcijski encimi se uporabljajo tudi za rezanje genomske DNK za gensko analizo z metodo Southernovega prenosa. Ta metoda omogo\xc4\x8da raziskovalcem dolo\xc4\x8diti \xc5\xa1tevilo kopij genov v genomu posameznika oziroma dolo\xc4\x8diti \xc5\xa1tevilo genskih mutacij v populaciji. Uporablja se tudi v RFLP (restriction fragment length polymorphism \xe2\x80\x93 polimorfizem dol\xc5\xbein restrikcijskih fragmentov).'