b"\n_START_ARTICLE_\nTest skraj\xc5\xa1anega proteina\n_START_PARAGRAPH_\nS testom skraj\xc5\xa1anega proteina (angl. Protein truncation test, okraj\xc5\xa1ano PTT), v\xc4\x8dasih imenovanim tudi\xc2\xa0\xc2\xbbin vitro synthesized-protein (IVSP) test\xc2\xab, pregledujemo kodirajo\xc4\x8de regije genov in i\xc5\xa1\xc4\x8demo mutacije, ki so odgovorne za pred\xc4\x8dasno zaustavitev (terminacijo) prevajanja (translacije) mRNA. _NEWLINE_Za\xc4\x8dnemo z izolacijo DNK ali RNK, temu sledi pomno\xc5\xbeevanje s PCR in ugotavljanje in vitro prepisovanja in prevajanja. Skraj\xc5\xa1ane proteine ugotovimo s SDS-PAGE. Ve\xc4\x8dji ekson gena lahko pomno\xc5\xbeujemo neposredno iz genomske DNK v nekaj prekrivajo\xc4\x8dih se fragmentih. Celotno kodirajo\xc4\x8de zaporedje\xc2\xa0\xc2\xbbvelikega\xc2\xab\xc2\xa0gena, ki ima mnogo manj\xc5\xa1ih eksonov, lahko pomno\xc5\xbeujemo v nekaj prekrivajo\xc4\x8dih se fragmentih s RT-PCR._NEWLINE_Ob\xc4\x8dutljivost PTT pove\xc4\x8damo s pomno\xc5\xbeevanjem gena v nekaj segmentih, ki se prekrivajo med seboj (300\xe2\x80\x93500 bp). Skraj\xc5\xa1ana mutacija, ki se nahaja na 3'-koncu enega segmenta, se bo pojavila tudi blizu 5'-konca drugega prekrivajo\xc4\x8dega segmenta. S tem se pove\xc4\x8da verjetnost, da bomo ugotovili\xc2\xa0\xc2\xbbskraj\xc5\xa1an\xc2\xab\xc2\xa0protein. Za PTT je potreben specialni za\xc4\x8detni oligonukleotid. Le-ta ima podalj\xc5\xa1an 5'-konec. Vsebuje zaporedja promotorja T7, evkariontsko konsenzno zaporedje za za\xc4\x8detek prepisovanja in za\xc4\x8detno mesto ATG. Donos in specifi\xc4\x8dnost PCR pomno\xc5\xbeevanja ugotovimo z agarozno gelsko elektroforezo. Nato alikvot PCR produkta uporabimo kot matrico za in vitro transkripcijo in translacijo . Radioaktivna aminokislina se po navadi vgradi v prepisan protein, kar omogo\xc4\x8di kasnej\xc5\xa1o detekcijo._NEWLINE_Opisane so bile tudi neradioaktivne PTT metode. Prepisani proteini so lo\xc4\x8deni s SDS-PAGE, \xc4\x8demur sledi avtoradiografija. Prisotnost proteina, ki je manj\xc5\xa1i od celotnega proteina, nakazuje na translacijsko terminacijsko mutacijo._NEWLINE_Velikost\xc2\xa0\xc2\xbbskraj\xc5\xa1anega\xc2\xab\xc2\xa0proteina ka\xc5\xbee na mesto prezgodnjega zaklju\xc4\x8dnega kodona. Da potrdimo mutacijo, dolo\xc4\x8dimo zaporedje DNK. Pri ve\xc4\x8dini mutacij gre za premik bralnega okvirja in nesmiselne mutacije. Zasledimo tudi mutacije, ki povzro\xc4\x8dijo nepravilno izrezovanje eksonov. S samo eno reakcijo lahko s PTT hitro ugotovimo nekaj kilobaznih segmentov gena, po drugi strani pa PTT ugotavlja tiste mutacije, ki imajo jasen patolo\xc5\xa1ki u\xc4\x8dinek na funkcijo proteina. Druga\xc4\x8dnosmiselnih mutacij in nevtralnih polimorfizmov s PTT ne moremo ugotoviti. \xc4\x8ce je pomembno, da se ugotovi druga\xc4\x8dnosmiselna mutacija, lahko uporabimo SSCP (single-strand conformation polymorphism \xe2\x80\x93 analiza konformacijskih polimorfizmov enoveri\xc5\xbenih DNK) v povezavi s PTT._NEWLINE_Test PTT so prvi\xc4\x8d opisali leta 1993, kot tehniko za dolo\xc4\x8devanje mutacije translacijske terminacije gena distrofin. Kasneje se je metoda za\xc4\x8dela uporabljati za ugotovitev\xc2\xa0\xc2\xbbskraj\xc5\xa1anih\xc2\xab\xc2\xa0mutacij gena APC, ki povzro\xc4\x8da dru\xc5\xbeinsko adenomatozno polipozo (angl. familial adenomatous polyposis, FAP). Od takrat je PTT uporabljen za ugotovitev translacijskih terminacijskih mutacij mnogih genov.\n_START_SECTION_\nUporaba\n_START_PARAGRAPH_\nGen distrofin je zelo dolg. Vsebuje 79 majhnih eksonov, ki so znotraj regije 2400 kb. \xc4\x8ce gre za delecijo enega ali ve\xc4\x8d eksonov, lahko pri bolnikih z Duchennovo mi\xc5\xa1i\xc4\x8dno distrofijo ugotovimo ve\xc4\x8dino distrofi\xc4\x8dnih mutacij. Vendar je pribli\xc5\xbeno 1/3 distrofi\xc4\x8dnih mutacij nesmiselnih mutacij ali pa posledica premika bralnega okvirja, kar se ka\xc5\xbee v pred\xc4\x8dasni zaustavitvi (terminaciji) prevajanja mRNA._NEWLINE_Z uporabo konvencionalnih metod, kot je npr. SSCP, je za iskanje omenjenih mutacij protrebnega ogromno \xc4\x8dasa in metoda je manj kot 100% ob\xc4\x8dutljiva. Direktno dolo\xc4\x8devanje zaporedja je \xc4\x8dasovno zamudno in drago. PTT je bil razvit za dolo\xc4\x8devanje distrofi\xc4\x8dnega gena, specifi\xc4\x8dno za translacijsko-terminacijsko mutacijo, ki ji sledi pomno\xc5\xbeevanje dolgih segmentov gena z ugnezdeno veri\xc5\xbeno reakcijo s polimerazo (angl. nested PCR). Celotna kodirajo\xc4\x8da zaporedja distrofina so lahko pomno\xc5\xbeena in ugotovljena v samo 10 prekrivajo\xc4\x8dih se fragmentih. Whittock in sod. so leta 1997 opisali hkratni PCR za dolo\xc4\x8ditev distrofi\xc4\x8denga gena._NEWLINE_Dru\xc5\xbeinska adenomatozna polipoza je redka avtosomno-dominantna bolezen, pri kateri se razvije 500\xe2\x80\x932500 adenomatoznih polipov v debelem \xc4\x8drevesu in danki. Polipi se razvijejo med 20. in 30. letom in v srednjih letih pogosto preidejo v raka. Gen APC, odgovoren za to bolezen, je na dolgem q delu 5. kromosoma (5q21)._NEWLINE_Pribli\xc5\xbeno 95\xc2\xa0% mutacij je bilo posledica prezgodnje zaustavitve prevajanja proteina. Gen APC ima 15 eksonov in kodirajo\xc4\x8de zaporedje dol\xc5\xbeine 8,5 kb. Ekson 15 gena APC je dolg 6,5 kb in pribli\xc5\xbeno 70\xc2\xa0% vseh mutacij, ki jih najdemo pri bolnikih s FAP, se pojavijo na 5'-koncu eksona 15. Pribli\xc5\xbeno 65\xc2\xa0% somati\xc4\x8dnih mutacij, ki jih najdemo pri sporadi\xc4\x8dnih kolorektalnih rakih, se nahajajo znotraj majhne regije eksona 15. Teoreti\xc4\x8dno lahko z direktnim pomno\xc5\xbeevanjem 2 kb dolgega segmenta eksona 15 gena APC iz genomske DNK in enim PTT ugotovimo 50\xc2\xa0% za\xc4\x8detnih mutacij pri bolnikih s FAP in 75\xc2\xa0% somati\xc4\x8dnih mutacij pri sporadi\xc4\x8dnem kolorektalnem raku. PTT analizo celotne kodirajo\xc4\x8de regije gena APC lahko dose\xc5\xbeemo s pomno\xc5\xbeevanjem celotnega gena v 5 ali 6 prekrivajo\xc4\x8dih se segmentih. Ekson 15 je neposredno pomno\xc5\xbeen iz genomske DNK v 4 prekrivajo\xc4\x8dih se segmentih. Eksoni 1\xe2\x80\x9314 so pomno\xc5\xbeeni v eni ali dveh prekrivajo\xc4\x8dih se segmentih z RT-PCR (RNA). Z uporabo te metode je bilo ugotovljenih 82\xc2\xa0% bolnikov s FAP."