b'\n_START_ARTICLE_\nAfinitetna kromatografija\n_START_SECTION_\nNosilec\n_START_PARAGRAPH_\nNosilec je del stacionarne faze. Biti mora inerten, kemi\xc4\x8dno stabilen pri pogojih, pr katerih se kromatografija izvaja (pH, temperatura) in omogo\xc4\x8dati mora vezavo liganda. Najpogosteje se za stacionarno fazo uporablja substituirana sefaroza z 2, 4 ali 6\xc2\xa0% vsebnostjo agaroze (od tod tudi poimenovanje: sefaroza 2B, 4B ali 6B), poleg tega se uporabljata tudi agaroza in poliakrilamid. Tu sefaroza ne deluje kot matriks za lo\xc4\x8devanje po velikosti, saj z aktivacijo (npr. z divinilsulfonom, CNBr,...) lahko nanjo ve\xc5\xbeemo razli\xc4\x8dne ligande in tako to vrsto gelske kromografije nadgradimo v afinitetno kromtografijo. Z divinilsufonom aktivirana sefaroza reagira z amino, hidroksilimi in sulfhidrilnimi skupinami in omogo\xc4\x8da vezavo mnogim ligandom.\n_START_SECTION_\nImunoafinitetna kromatografija\n_START_PARAGRAPH_\nAfinitetna kromatografija se uporablja za afinitetno \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denje protiteles in krvnega seruma. \xc4\x8ce je znano, da serum vsebuje protitelesa proti dolo\xc4\x8denim antigenom, lahko ta protitelesa izoliramo iz seruma s pomo\xc4\x8djo afinitetne kromatografije. Te antigene ve\xc5\xbeemo na nosilec in na antigene se ve\xc5\xbeejo protitelesa, ki jih nato eluiramo iz kolone. Elucijo protiteles po navadi izvedemo s pufrom, ki ima nizek pH, kot je recimo glicin, ki ima pH 2,8. Eluat zbiramo v nevtralne epruvete ali fosfatni pufer, ki nevtralizira elucijski pufer z nizkim pH in s tem prepre\xc4\x8dimo denaturacijo protiteles, ki bi s tem izgubila svojo funkcijo.\n_START_SECTION_\nAfinitetna kromatografija z imobiliziranim kovinskim ionom\n_START_PARAGRAPH_\nMetoda temelji na specifi\xc4\x8dnih koordinativnih vezeh med kovinskimi ioni in aminokislinami, konkretno histidinom. \xc4\x8ci\xc5\xa1\xc4\x8denje beljakovin ali peptidov, ki imajo v svoji strukturi histidin, se izvaja z ioni kobalta, niklja in bakra, za \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denje beljakovin ali peptidov, ki so fosforilirani, pa se uporabljajo ioni \xc5\xbeeleza, cinka in galija. Ve\xc4\x8dina naravnih beljakovin nima afinitete do kovinskih ionov, zato se uporablja tehnologijo rekombinantne DNA, s katero lahko vgradijo v beljakovino del, ki ima afiniteto do kovinskih ionov, s tem pa ga lahko potem o\xc4\x8distijo iz zmesi. Za elucijo se tu uporablja sprememba pH ali dodajanje kompetitivnih molekul, kot je na primer imidazol.\n_START_SECTION_\nIzolacija rekombinantnih proteinov\n_START_PARAGRAPH_\nVerjetno se afinitetna kromatografija najbolj uporablja za \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denje rekombinantnih beljakovin, pridobljenih s pomo\xc4\x8djo tehnike rekombinantne DNA. Beljakovino genetsko spremenijo tako, da vanjo vgradijo skupino, ozna\xc4\x8devalec, ki ima znano afiniteto, z namenom omogo\xc4\x8diti \xc4\x8di\xc5\xa1\xc4\x8denje proteina iz zmesi. Ozna\xc4\x8devalca sta na primer glutation-S-transferaza in histidinski ozna\xc4\x8devalec. Histidinski ozna\xc4\x8devalec ima afiniteto do nikljevih in kobaltovih ionov. Pri tej kromatografiji se uporabljajo za elucijo kompetitivni ligandi, kot je imidazol. Glutation-S-transferaza ima afiniteto do glutationa. Tega dobimo v komercialnih kolonah, ki imajo kot stacionarno fazo glutation agarozo. Pri tak\xc5\xa1nih kolonah se za elucijo uporablja prosti glutation.'