b"\n_START_ARTICLE_\nFluorescen\xc4\x8dna spektroskopija\n_START_PARAGRAPH_\nFluoresc\xc3\xa9n\xc4\x8dna spektroskop\xc3\xadja (tudi fluorometrija ali spektrofluorometrija) je vrsta elektromagnetne spektroskopije, pri kateri se analizira fluorescen\xc4\x8dni odziv vzbujenega vzorca. Navadno se z uporabo snopa svetlobe vzbudi elektrone v molekulah in tako povzro\xc4\x8di, da sevajo svetlobo (ne nujno v vidnem spektru). Fluorescenca se meri z fluorometri. Najpogostej\xc5\xa1a uporaba je v analizni kemiji za dolo\xc4\x8danje vrste in koli\xc4\x8dine prisotnih snovi.\n_START_SECTION_\nTeorija\n_START_PARAGRAPH_\nAtomi in molekule lahko zasedajo razli\xc4\x8dne energijske nivoje. V ravnovesnem stanju navadno zasedajo najni\xc5\xbeja energijska oz. elektronska stanja, ko pa so vzbujeni, preidejo v vi\xc5\xa1ja stanja (npr. iz n=1 v n=2). Vzbujena stanja so nestabilna in navadno traja le nekaj nanosekund, da se atomi/molekule vrnejo v osnovno stanje. Molekule imajo znotraj elektronskih nivojev \xc5\xa1e vibracijska in rotacijska stanja, katerih energijski prehodi pa so veliko o\xc5\xbeji. Atome/molekule vzbudimo z elektromagnetnim valovanjem: molekula absorbira foton in elektron sko\xc4\x8di v enega od vibracijskih nivojev v vi\xc5\xa1jem elektronskem nivoju; na katerega, pa je odvisno od energije oz. od valovne dol\xc5\xbeine vzbujevalnega EM valovanja._NEWLINE_Ker molekule med seboj trkajo, izgubljajo vibracijsko energijo in elektroni prehajajo v ni\xc5\xbeja vibracijska stanja vi\xc5\xa1jega elektronskega nivoja. Pri prehodu med elektronskima nivojema pa se emitira foton._NEWLINE_Ker je tako v osnovnem kot v vzbujenem stanju atomov/molekul mo\xc5\xbenih ve\xc4\x8d vibracijskih stanj, so izsevane frekvence fotonov lahko razli\xc4\x8dne. Z analizo teh frekvenc se lahko dolo\xc4\x8di strukturo nivojev molekul, z analizo izsevanega spektra pa koli\xc4\x8dino fluorescen\xc4\x8dnih delcev v vzorcu. Atomi nimajo vibracijskih nivojev, zato je emitirana svetloba enake valovne dol\xc5\xbeine kot vzbujevalna svetloba; ta proces re-emitiranja se imenuje resonan\xc4\x8dna flourescenca in ga lahko opazimo tudi pri molekulah.\n_START_SECTION_\nFluorescenca\n_START_PARAGRAPH_\nFotoluminicsenca je poimenovanje sevanja svetlobe iz poljubne snovi, ki se izseva pri prehodu iz vzbujenega v ni\xc5\xbeje elektronsko stanje. Deli se na fluorescenco in fosforescenco glede na na\xc4\x8din vzbujenega stanja._NEWLINE_Pri fluorescenci gre za vzbujeno singletno stanje, kjer ima par vzbujenega in ne-vzbujenega elektrona nasproten spin; prehod nazaj v osnovno stanje je dovoljen in se zgodi zelo hitro. Tipi\xc4\x8den \xc5\xbeivljenjski \xc4\x8das fluorescence je 10 ns. Pri fosforescenci pa gre za tripletno vzbujeno stanje: vzbujen in osnovni elektron imata enako obrnjen spin, prehod nazaj v osnovno stanje je prepovedan, zato so \xc5\xbeivljenjski \xc4\x8dasi fosforescence tipi\xc4\x8dno zelo dolgi (milisekunde ali sekunde). Razlo\xc4\x8devanje med fluorescenco in fosforescenco ni vedno o\xc4\x8ditno, saj obstajajo tudi snovi, ki imajo tako singletna kot tripletna stanja.\n_START_SECTION_\nFluorescen\xc4\x8dne snovi\n_START_PARAGRAPH_\nEnergijski nivoji elektronov v kristalih so zdru\xc5\xbeeni v pasove z manj\xc5\xa1imi energijskimi razmaki kot pri posameznih gradnikih in tako je omogo\xc4\x8dena fluorescenca v vidnem delu spektra. Podobno se ustvari tudi v nekaterih organskih snoveh, ki navadno vsebujejo sisteme dvojnih vezi ali aromatskih obro\xc4\x8dev. Te funkcionalne skupine molekul po njihovi lastnosti imenujemo flourofori (npr.: kinin, klorofil, fluorescin, rodamin, zeleni fluorescen\xc4\x8dni protein - GFP).\xc2\xa0_NEWLINE_Molekulam, ki bi jih \xc5\xbeeleli opazovati, a same po sebi niso fluorescen\xc4\x8dne, se lahko s kemijskimi postopki doda funkcionalno skupino, tako da tudi te oddajajo svetlobo. Pri na\xc4\x8drtovanju spojine je treba paziti, da se njeno delovanje zaradi dodanega fluorofora \xc4\x8dim manj spremeni. Celotna metoda je danes tako razvita, da je zares mo\xc5\xbeno slediti posameznim molekulam in spremljati procese v realnem \xc4\x8dasu.\n_START_SECTION_\nDiagram Jablonskega in Stokesov premik\n_START_PARAGRAPH_\nAbsorpcija in emisija elektromagnetnega valovanja sta kvantno-mehanska procesa, kjer se pojavijo diskretni energijski nivoji. Prehode med temi nivoji se shematsko prika\xc5\xbee z diagramom Jablonskega. La prikazuje razli\xc4\x8dne fizikalne procese, ki se lahko zgodijo v vzbujenih stanjih atomov in molekul. Na vsakem energijskem nivoju imajo molekule lahko ve\xc4\x8d vibracijskih stanj. Hitro lahko preidejo v najni\xc5\xbeje vibracijsko stanje energijskega nivoja z notranjo konverzijo (internal conversion) oziroma termalizacijo, ki je posledica prekrivanja stanj. Tak proces pote\xc4\x8de, \xc5\xa1e preden se izseva svetloba. Elektronu se lahko zamenja tudi smer spina, a ker so prehodi med singletnimi in tripletnimi stanji prepovedani, se to ne zgodi pogosto. Nekaj energije tudi izgubi na ra\xc4\x8dun interakcij molekule s raztopino._NEWLINE_Tipi\xc4\x8dno je energija emisije manj\xc5\xa1a kot energija absorbcije - fluorescenca se navadno zgodi pri manj\xc5\xa1ih energijah oziroma dalj\xc5\xa1ih valovnih dol\xc5\xbeinah. Ta premik je Stokesov premik. Ker so fluorofori zelo ob\xc4\x8dutljivi na svojo neposredno okolico, se lahko s Stokesovim premikom zlahka dolo\xc4\x8da lego vezavnih to\xc4\x8dk na makromolekulah._NEWLINE_\xc5\xa0e ena klju\xc4\x8dnih lastnosti fluorescence je, da izsevan spekter ni mo\xc4\x8dno odvisen od valovne dol\xc5\xbeine vzbujevalne svetlobe, saj se pri vzbuditvi v vi\xc5\xa1ja energijska in vibracijska stanja prese\xc5\xbeek energije hitro razgubi in molekula je spet v najni\xc5\xbejem vibracijskem nivoju. Seveda obstajajo izjeme._NEWLINE_Emisijskin in absorbcijski spekter sta prakti\xc4\x8dno zrcala, saj oba spektra prikazujeta enake elektronske prehode in so si vibracijski nivoji v osnovnem in vzbujenem stanju podobni.\n_START_SECTION_\nFluorescen\xc4\x8dni \xc5\xbeivljenjski \xc4\x8das in kvantni izkoristek\n_START_PARAGRAPH_\nNajpomembnej\xc5\xa1i karakteristiki fluorofora sta kvantni izkoristek in \xc4\x8das flouresciranja. \xc2\xa0Merilo za u\xc4\x8dinkovitost procesa je kvantni izkoristek Q (angl. quantum yield), definiran kot \xc5\xa1tevilo izsevanih fotonov glede na \xc5\xa1tevilo absorbiranih fotonov. Za zna\xc4\x8dilne fluorescen\xc4\x8dne vzorce zavzema vrednosti med 0,01 in 1 (snovi z ve\xc4\x8djimi kvantnimi izkoristki imajo svetlej\xc5\xa1e emisije). Izkoristek je vedno manj\xc5\xa1i od 100% zaradi Stokesovih izgub. Intenziteta fluorescence se lahko zmanj\xc5\xa1a zaradi razli\xc4\x8dnih procesov, temu pravimo du\xc5\xa1enje: trki z drugimi molekulami v raztopini, du\xc5\xa1enje vzbujevalne svetlobe v fluoroforu ... Kvatni izkoristek je tako_NEWLINE_,_NEWLINE_kjer je z  ozna\xc4\x8dena hitrost emisije, s  pa hitrost ne-sevalnega upadanja._NEWLINE_\xc4\x8cas, v katerem fluorofor interagira z okolico ali difundira, imenujemo \xc5\xbeivljenjski \xc4\x8das fluoresciranja in ga ozna\xc4\x8dimo s . Definiran je kot povpre\xc4\x8dni \xc4\x8das, ki ga molekula pre\xc5\xbeivi v vzbujenem stanju, preden preide nazaj v osnovno. \xc5\xbdivljenjski \xc4\x8das je navadno okoli 10 ns, enak pa je_NEWLINE_._NEWLINE_Intenziteta flourescence se lahko zmanj\xc5\xa1a zaradi razli\xc4\x8dnih procesov, na primer ob stiku z drugimi molekulami v raztopini se deaktivira in preide v osnovno stanje, temu procesu pravimo zunanja konverzija (angl. external conversion). Tak\xc5\xa1ni procesi pri meritvi \xc5\xbeivljenjskih \xc4\x8dasov fluorescence omogo\xc4\x8dajo merjenje razli\xc4\x8dnih dinami\xc4\x8dnih procesov v raztopini ali v makromolekulah. Absorpcijski spekter ni odvisen od molekularne dinamike, emisijski pa je (dinamika molekul je po\xc4\x8dasnej\xc5\xa1a od absorpcijskega \xc4\x8dasa). \xc4\x8ce sta denimo znana difuzijski koeficient  pri nekih dolo\xc4\x8denih pogojih in \xc5\xbeivljenjski \xc4\x8das fluorescen\xc4\x8dnih ozna\xc4\x8devalcev, lahko z Einsteinovo ena\xc4\x8dbo izra\xc4\x8dunamo povpre\xc4\x8den kvadrat razdalje, ki jo molekula v tem \xc4\x8dasu prepotuje_NEWLINE_.\n_START_SECTION_\nFluorescen\xc4\x8dna anizotropija\n_START_PARAGRAPH_\nMeritve anizotropije se uporabljajo predvsem v biokemi\xc4\x8dnih aplikacijah fluorescence, saj posredujejo informacije o velikosti in obliki proteinov, togosti razli\xc4\x8dnih molekul, fluidnosti membran, medsebojni interakciji med proteini, itd._NEWLINE_Meritve anizotropije so osnovane na principu fotoselektivnosti vzbujanja fluoroforov s polarizirano svetlobo. Fluorofori preferen\xc4\x8dno absorbirajo fotone, katerih vektorji elektri\xc4\x8dnega polja so poravnani z dipolnim momentom fluorofora (le-ta je poravnan z osjo molekule). V izotropni raztopini so fluorofori orientirani naklju\xc4\x8dno in \xc4\x8de vzbujamo s polarizirano svetlobo, se ve\xc4\x8dinsko vzbudijo tisti fluorofori, ki imajo os dipola poravnano s polarizacijo, posledica tega je delno polarizirana izsevana svetloba; emitira se namre\xc4\x8d tudi svetloba polarizirana vzdol\xc5\xbe osi fluorofora. Fluorescen\xc4\x8dna anizotropija  in polarizacija  sta definirani kot:_NEWLINE_Z  smo ozna\xc4\x8dili intenziteti navpi\xc4\x8dno in horizontalno polarizirane emisije, kadar je vzorec vzbujen z navpi\xc4\x8dno polarizirano svetlobo.\xc2\xa0_NEWLINE_Izmerjeno anizotropijo zmanj\xc5\xa1uje predvsem rotacijska difuzija, ki toliko zasu\xc4\x8de fluorescen\xc4\x8dne ozna\xc4\x8devalce med njihovim \xc5\xbeivljenjskim \xc4\x8dasom, da emisijski spekter ni ve\xc4\x8d polariziran. Rotacijske difuzije lahko natan\xc4\x8dno merimo s fluorescentno anizotropijo in tako preu\xc4\x8dujemo interakcije med biolo\xc5\xa1kimi makromolekulami.\n_START_SECTION_\nResonan\xc4\x8dni prenos energije\n_START_PARAGRAPH_\nTa proces se zgodi, kadar se emisijski spekter fluorofora donorja prekriva z absorpcijskim spektrom druge molekule, akceptorja, ki ni nujno fluorescentna molekula. Gre za dipol-dipolno interakcijo, in ne za prenos fotona; ne pride do emisije fotona. Prenos energije je odvisen od razdalje med molekulama in ta proces lahko uporabimo kor 'spektroskopsko ravnilo' za merjenje razdalj v proteinih.\xc2\xa0\n_START_SECTION_\nMerjenje fluorescence in spektroskopija\n_START_PARAGRAPH_\nSpektroskopske metode odli\xc4\x8dno delujejo za raziskovanje vzorcev preproste sestave. Vzorec iz homogene snovi prispeva enak signal iz vsake to\xc4\x8dke, kar omogo\xc4\x8di dovolj natan\xc4\x8dne meritve, u\xc4\x8dinkovito analizo in smiselno interpretacijo zbranih podatkov. Pri nehomogenih vzorcih, (na primer vsi biolo\xc5\xa1ki sistemi), pa spektroskopija postane te\xc5\xbeje razumljiva. Iz posameznih predelov vzorca prihajajo razli\xc4\x8dne informacije, ki se med seboj se\xc5\xa1tejejo ali izpovpre\xc4\x8dijo v skupen spekter, ki ga zaznamo z detektorjem. Razstavljanje signala na posamezne komponente je te\xc5\xbeaven in velikokrat nemogo\xc4\x8d proces, interpretacija rezultatov, od kod prihaja posamezni prispevek spektra, pa lahko zahteva veliko kontrolnih poskusov._NEWLINE_V prej\xc5\xa1nem stoletju se je razvilo mnogo spektroskopskih metod, s katerimi raziskujejmo fizikalne in kemi\xc4\x8dne lastnosti snovi. Le-te se dolo\xc4\x8da iz interakcije gradnikov z elektromagnetnim valovanjem, natan\xc4\x8dneje iz spektra absorbirane (sprejete), oddane (emitirane) ali sipane svetlobe. Glede na namen se uporablja valovanje v ustreznem obmo\xc4\x8dju valovnih dol\xc5\xbein, od gama in rentgenskih \xc5\xbearkov, ultravijoli\xc4\x8dno, vidno in infrarde\xc4\x8do svetlobo pa tudi mikro- in radijske valove. Vsaka metoda posreduje svoje informacije in doda delec znanja.\n_START_SECTION_\nNa\xc4\x8dina fluorescen\xc4\x8dne meritve\n_START_PARAGRAPH_\nFluorescentne meritve lahko grobo razdelimo na dve veji. Prvo, t.i. steady-state, ko imamo konstantno osvetljevanje in opazovanje; vzorec je osvetljen s konstantnim snopom svetlobe in intenziteta ali spekter emisije je izmerjen. Ve\xc4\x8dina meritev je tega tipa, zaradi kratkega \xc5\xbeivljenskega \xc4\x8dasa fluorescence (ns).\xc2\xa0_NEWLINE_Drugi tip meritev je t.i. time-resolved , in je v uporabi za merjenje upadnja intenzitete ali anizotropije. Vzorec je izpostavljen sunku svetlobe, ki je navadno kraj\xc5\xa1i od razpadnega \xc4\x8dasa vzorca. Upad intenzitete je posnet s high-speed detekcijskim sistemom, ki omogo\xc4\x8da merjenje intenzitete in anizotropije v nanosekundni \xc4\x8dasovni skali. Prakti\xc4\x8dno gledano je steady-state meritev le povpre\xc4\x8denje time-resolved meritev \xc4\x8dez upad intenzitete v vzorcu.\xc2\xa0\n_START_SECTION_\nInstrumenti in postavitev poskusa\n_START_PARAGRAPH_\nFluorescenco merimo z opti\xc4\x8dnim sistemom, s t.i. spektrofluorometrom, ki omogo\xc4\x8da analizo izsevane fluorescence. Z njimi lahko merimo tako absorbcijski kot emisijski spekter. Emisijski spekter je porazdelitev intenzitete izsevane svetlobe po valovni dol\xc5\xbeini, pri posamezni valovni dol\xc5\xbeini vzbujevalne svetlobe._NEWLINE_Opti\xc4\x8dni sistem je sestavljen iz svetila, ki vzbuja fluorescenco, monokromatorja (uklonske mre\xc5\xbeice) ali filtrov, plo\xc5\xa1\xc4\x8dice z vzorcem, delilca \xc5\xbearkov (beam splitter) in detektorja. Za merjenje anizotropije lahko dodamo \xc5\xa1e polarizatorje._NEWLINE_Filtri omogo\xc4\x8dajo izbiro valovne dol\xc5\xbeine vzbujevalne svetlobe, ki na vzorcu povzro\xc4\x8di fluorescenco, sekundarni filter pa omogo\xc4\x8da merjenje posamezne valovne dol\xc5\xbeine izsevane svetlobe. S pravo postavitvijo, lahko z eno uklonsko mre\xc5\xbeico analiziramo vpadno in izsevano svetlobo._NEWLINE_Svetoba od izvora najprej potuje skozi primerni vzbujevalni filter, ki prepusti le pas valovnih dol\xc5\xbein okoli vrha absorpcijskega spektra ciljnega fluorofora. Ko pade svetloba na vzorec, je ve\xc4\x8dina potuje skozi, nekaj se je odbije od stekla ali siplje v vzorcu, del pa je absorbirajo fluorofori in nato pri dalj\xc5\xa1i valovni dol\xc5\xbeini izsevajo v vse smeri. Fluorescen\xc4\x8dno svetlobo najla\xc5\xbee zaznamo, \xc4\x8de prepu\xc5\xa1\xc4\x8dena in sipana vzbujevalna svetloba ne moti opazovanja. Vzbujevalno svetlobo najla\xc5\xbeje od fluorescence lo\xc4\x8dimo z dvobarvnimi (dichroic) zrcali, ki zaradi stopni\xc4\x8daste karakteristike prepustijo nek del spektra in odbijejo drug del spektra - tako se lo\xc4\x8di obi\xc4\x8dajno kraj\xc5\xa1o valovno dol\xc5\xbeino vzbujevalne svetlobe in dalj\xc5\xa1o valovno dol\xc5\xbeino fluorescence._NEWLINE_Za vzbujanje fluorescence je obi\xc4\x8dajna lu\xc4\x8d mikroskopa pre\xc5\xa1ibka, zato se uporabljajo mo\xc4\x8dnej\xc5\xa1i izvori svetlobe: laserji, svetle\xc4\x8de diode, \xc5\xbeivosrebrne ali ksenonskelu\xc4\x8di. Za vpadni spekter enakomerne intenzitete v obmo\xc4\x8dju 300 \xe2\x80\x93 800 nm uporabljamo ksenonsko \xc5\xbearnico. Pri osvetljevanju biolo\xc5\xa1kih sistemov je ustrezna jakost svetlobnega toka zelo pomembna. \xc4\x8ce je vzbujevalne svetlobe premalo, je \xc5\xa1ibko izsevano svetlobo te\xc5\xbeko zaznati, pri premo\xc4\x8dnem vzbujanju pa slika zopet zbledi, saj je v gori\xc5\xa1\xc4\x8dni ravnini naenkrat ve\xc4\x8d fluoroforov tako v vzbujenem kot v osnovnem stanju. Dodatni fotoni v tem delu ne najdejo ustreznega prejemnika energije, signal iz ne\xc5\xbeelenih predelov pa \xc5\xa1e vedno nara\xc5\xa1\xc4\x8da in zmanj\xc5\xa1uje kontrast slike. \xc4\x8ce se jakost svetlobe \xc5\xa1e pove\xc4\x8duje, pa se fluorofori trajno uni\xc4\x8dijo (razpad funkcionalne skupine povzro\xc4\x8di absorpcija drugega fotona, medtem ko je elektron \xc5\xbee v vzbujenem stanju). Molekula, ki preide iz vzbujenega singletnega v vzbujeno tripletno stanje, lahko z molekulami v okolici tvori nove stabilne kovalentne vezi, s \xc4\x8dimer izgubi sposobnost fluorescence. Obi\xc4\x8dajno \xc5\xbeelimo opazovati le izbrano vrsto molekul, zato vzorec osvetlimo le z ustreznim delom spektra svetila (oz. izberemo pravi laser)._NEWLINE_Za detektor se navadno uporabljajo CCD kamere, fotodiode ali fotopomno\xc5\xbeevalke. Spektralni razpon detektorja je pogojen s tipom fotodiod, tako za merjenje izsevane fluorescen\xc4\x8dne svetlobe izberemo tak\xc5\xa1nega, ki omogo\xc4\x8da merjenje svetlobe pri valovni dol\xc5\xbeini, kjer fluorescira vzorec.\n_START_SECTION_\nAnaliza spektralnih podatkov\n_START_PARAGRAPH_\nFluorescen\xc4\x8dna intenziteta bo v splo\xc5\xa1nem sorazmerna koncentraciji fluorescen\xc4\x8dnih ozna\xc4\x8devalcev, \xc4\x8de je le ta dovolj majhna (da je zveza \xc5\xa1e linearna), pri ve\xc4\x8djih koncentracijah pride do reabsorbcije fluorescen\xc4\x8dne svetlobe \xe2\x80\x93 k temu prispevajo druge molekule, ki absorbirajo svetlobo v obmo\xc4\x8dju, kjer fluorofori sevajo, ali pa pride do ve\xc4\x8dkratnega absorbiranja in sevanja in to kvari spekter. \xc4\x8ce je koncentracija fluoroforov prevelika lahko zaradi reabsorbcije celo napa\xc4\x8dno presodimo, da vzorec ni fluorescenten. Pri meritvah je treba upo\xc5\xa1tevati tudi druge pojave, ki kvarijo meritve. Faktorji, ki kvarijo signal so lahko povezani z opti\xc4\x8dnim sistemom, oziroma merilno napravo, ali pa z vzorcem, katerega se meri.\n_START_SECTION_\nInstrumentalne napake\n_START_PARAGRAPH_\nIzvor svetlobe s katerim osvetljujemo se s \xc4\x8dasom spreminja. Intenziteta in spekter se med meritvijo in med posameznimi meritvami spreminjata. Zaradi tega se ponavadi svetlobo iz svetila z delilnikom \xc5\xbearkov razdeli na dve veji. En \xc5\xbearek vzbuja fluorescenco, drugi \xc5\xbearek pa uporabljamo kot referenco. Zaradi tega ponavadi potrebujemo tudi dva detektorja. Ker opti\xc4\x8dni elementi niso idealni, moramo upo\xc5\xa1tevati tudi popravke le-teh, npr.: majhna prepustnost monokromatorja za valovne dol\xc5\xbeine, ki jih ne \xc5\xbeelimo, prepustnost varira tudi glede na valovno dol\xc5\xbeino in polarizacijo svetlobe. Zaradi staranja detektorja se spreminja njegov kvantni izkoristek in njegov odziv na razli\xc4\x8dne valovne dol\xc5\xbeine. Upo\xc5\xa1tevati je potrebno tudi opti\xc4\x8dne lastnosti drugih opti\xc4\x8dnih elementov ter kivete ali celice, oziroma posode z vzorcem. Za ta namen je primerno kvar\xc4\x8dno steklo, saj prepu\xc5\xa1\xc4\x8da svetlobo od 200 do 2500-3500 nm, torej interval, kjer se ponavadi opazuje fluroscenco. Paziti je treba tudi pri geometrijski postavitvi detektorja; v izogib prepu\xc5\xa1\xc4\x8dene svetlobe je pri visokih koncentracijah fluoroforov potrebno tudi upo\xc5\xa1tevati, da se fluorescenca vzorca vzol\xc5\xbe vpadne svetlobe razlikuje s pozicijo. Ob\xc4\x8dutljivost detektorja (fotopomno\xc5\xbeevalk) je odvisna od temnega toka, ki je odvisen od temperature, zaradi \xc4\x8desar je detektor za natan\xc4\x8dne meritve in izbol\xc5\xa1anje SNR-ja potrebno hladiti. Temu se lahko izognemo tudi z uporabo stroboskopa, kot svetlobnega izvora. Velika intenziteta bliskov povzro\xc4\x8di mo\xc4\x8dnej\xc5\xa1o fluorcenco in izbol\xc5\xa1anje SNR-ja. V ta namen ne moremo uporabljati kontinuiranih izvorov velike intenzitete, saj pride do fotodekompozicije fluroforov.\n_START_SECTION_\nNapake vzorca\n_START_PARAGRAPH_\nFluorescenca vzorca se s \xc4\x8dasom manj\xc5\xa1a zaradi fotodekompozicije fluroforov (bleaching), kar pomeni da se zaradi dolgo\xc5\xbeivega tripletnega stanja \xc5\xa1tevilo molekul, ki fluorescirajo, manj\xc5\xa1a. \xc4\x8ce uporabljamo kvantne pike, do tega pojava ne pride. Do detektorja pride tudi svetloba, ki se od vzorca siplje. Mote\xc4\x8de sipane svetlobe najve\xc4\x8d pride od Rayleighovega sipanja in Ramanovega sipanja.\n_START_SECTION_\nNovej\xc5\xa1e metode\n_START_PARAGRAPH_\nV zadnjih letih je napredek tehnologije omogo\xc4\x8dil nove uporabe fluorescence. Novej\xc5\xa1e metode so kratko opisane spodaj.\n_START_SECTION_\nVe\xc4\x8dfotonsko vzbujanje\n_START_PARAGRAPH_\nDvo- ali ve\xc4\x8d-fotonsko vzbujevanje in ve\xc4\x8dfotonska mikroskopija je ena od novej\xc5\xa1ih metod. Fluorescenca je obi\xc4\x8dajno posledica absorbcije posameznega fotona z valovno dol\xc5\xbeino v absorpcijskem pasu fluorofora. Pulzni laserji s femtosekundimi pulzi pa lahko vzbudijo fluorofore z dvo-fotonsko absorpcijo. \xc4\x8ce je laserska intenziteta dovolj velika, lahko fluorofor absorbira dva fotona hkrati \xe2\x80\x93 imamo vzbujeno singletno stanje (zgodi se zgolj v to\xc4\x8dki laserskega \xc5\xbearka, saj potrebne visoke intenzitete) \xe2\x80\x93 lokalizirana eksitacija. Femtosekundni laserji so v kratkem postali bolj dostopni; ena od mo\xc5\xbenih uporab je kombinacija z mikroskopijo, v t.i. fluorescen\xc4\x8dna mikroskopija. Pri fluorescen\xc4\x8dni mikroskopiranju lahko slikamo v gori\xc5\xa1\xc4\x8dni ravnini mikroskopa in se znebimo distorcije slike zaradi fluorescence na drugih mestih (nad ali pod gori\xc5\xa1\xc4\x8dno ravnino).\n_START_SECTION_\nFluorescen\xc4\x8dna korelacijska spektroskopija\n_START_PARAGRAPH_\nJe bazirana na kratkotrajnih fluktuacijah v majhnem opazovanem volumnu (femtoliter). Visoko ob\xc4\x8dutljiva metoda, ker opazujemo oz. merimo le nekaj fluoroforov naenkrat; in je ne moremo izvajati\xc2\xa0\xc4\x8de je vzorec preve\xc4\x8d koncentriran, saj se opazuje se fluktuacije intenzitete v odvosnosti od \xc4\x8dasa (manj fluoroforov pomeni ve\xc4\x8d fluktuacij in ve\xc4\x8d fluoroforov manj\xc5\xa1e fluktuacije in bolj konstantno povpre\xc4\x8dje). Fluktuacije so odvisne od difuzije fluoroformov; intenziteta se hitreje pove\xc4\x8da ali zmanj\xc5\xa1a, \xc4\x8de je difuzija ve\xc4\x8dja. Amplituda in hitrost fluktuacij sta uporabljeni za izra\xc4\x8dun korelacijske funkcije (vi\xc5\xa1ina krivulje je obratno sorazmerna povpre\xc4\x8dnemu \xc5\xa1tevilu opazovanih fluoroformov, difuzijski koeficient pa dolo\xc4\x8da pozicija krivulje na \xc4\x8dasovni osi).\n_START_SECTION_\nDetekcija posamezne molekule\n_START_PARAGRAPH_\nOpazovanje posameznih molekul je najvi\xc5\xa1ja mo\xc5\xbena ob\xc4\x8dutljivost meritev. Lasersko vzbujanje skozi objektiv mikroskopa, premikanje vzorca in konfokalna optika, ki blokira ne\xc5\xbeeljene signale.\xc2\xa0\n_START_SECTION_\nUporaba\n_START_PARAGRAPH_\nFluorescen\xc4\x8dna spektroskopija je eno osnovnih raziskovalnih orodij v biokemiji in biofiziki, biologiji; v zadnjih tridesetih letih se je namre\xc4\x8d uporaba fluorescence v biolo\xc5\xa1kih raziskavah znatno pove\xc4\x8dala in se na veliko uporablja v biotehnologiji, medicinski diagnostiki, genski analizi, citometriji, DNA sekvenciranju, forenziki, ipd._NEWLINE_Meritve pri tej vrsti spektroskopije nam podajo \xc5\xa1irok spekter informacij o molekularnih procesih, interakcijah molekul s fluorofori, rotacijski difuziji biomolekul, vezavne interakcije, razdalje med biomolekulami, \xc5\xa1e posebej pomembne so raziskave na \xc5\xbeivih celicah in tkivih, kot recimo lo\xc4\x8devanje malignih in benignih ko\xc5\xbenih tumorjev (fluorescen\xc4\x8dni spekter je namre\xc4\x8d ob\xc4\x8dutljiv na fizi\xc4\x8dno karakteriskiko celic \xe2\x80\x93 na njeno strukturo in urejenost proteinov)._NEWLINE_Novosti v tehnologiji celi\xc4\x8dnega slikanja in detekcije posameznih molekul \xc5\xa1e naprej raz\xc5\xa1irajo uporabo FS, ki tako prispeva k hitremu razvoju v biotehnologiji in nanotehnologiji."