b'\n_START_ARTICLE_\nMicroscopia confocal\n_START_PARAGRAPH_\nA Microscopia confocal \xc3\xa9 uma t\xc3\xa9cnica imagiol\xc3\xb3gica desenvolvida primariamente por Marvin Minsky, em 1955. Apesar do funcionamento do Microsc\xc3\xb3pio Confocal ser semelhante ao do Microsc\xc3\xb3pio de fluoresc\xc3\xaancia, o primeiro \xc3\xa9 utilizado para aumentar o contraste da imagem microsc\xc3\xb3pica e construir imagens tridimensionais atrav\xc3\xa9s da utiliza\xc3\xa7\xc3\xa3o de um orif\xc3\xadcio de abertura, pinhole, que permite uma grande defini\xc3\xa7\xc3\xa3o de imagem em amostras mais espessas que o plano focal._NEWLINE_Esta t\xc3\xa9cnica tem vindo a adquirir uma grande popularidade e possui diversas aplicabilidades na ci\xc3\xaancia, nomeadamente na obten\xc3\xa7\xc3\xa3o de imagens de amostras vivas e de informa\xc3\xa7\xc3\xa3o computadorizada tridimensional na pesquisa biol\xc3\xb3gica, na an\xc3\xa1lise qu\xc3\xadmica e de materiais, principalmente na \xc3\xa1rea de neuroanatomia e neurofisiologia.\n_START_SECTION_\nLentes\n_START_PARAGRAPH_\nN\xc3\xa3o se sabe ao certo quando as lentes foram inventadas, mas, em 721 a.C, h\xc3\xa1 relatos de um cristal de rocha recortado com propriedades de amplia\xc3\xa7\xc3\xa3o. Conhecido, posteriormente, como lente de Lanyard, pensa-se que este objecto possa ter sido a primeira lente criada pelo homem. Contudo, as lentes passaram a ser realmente conhecidas e utilizadas por volta do ano de 1280, em It\xc3\xa1lia, com a inven\xc3\xa7\xc3\xa3o dos \xc3\xb3culos. Com sua r\xc3\xa1pida populariza\xc3\xa7\xc3\xa3o, logo come\xc3\xa7aram as primeiras experi\xc3\xaancias de combina\xc3\xa7\xc3\xa3o de lentes para aplica\xc3\xa7\xc3\xa3o em instrumentos de amplia\xc3\xa7\xc3\xa3o de imagens, resultando na cria\xc3\xa7\xc3\xa3o do primeiro microsc\xc3\xb3pio composto (com duas ou mais lentes).\n_START_SECTION_\nAparecimento do Microsc\xc3\xb3pio\n_START_PARAGRAPH_\nA denomina\xc3\xa7\xc3\xa3o de "microsc\xc3\xb3pio" foi dada pelo membro da Academia de Lincei e m\xc3\xa9dico em Roma a servi\xc3\xa7o do Papa Urbano VII, Johann Giovanni Faber (1570-1640) de Bamberg em 1624. O substantivo prov\xc3\xa9m da jun\xc3\xa7\xc3\xa3o de dois voc\xc3\xa1bulos gregos: micros (pequeno) e skopein (ver, examinar)._NEWLINE_O cr\xc3\xa9dito pela inven\xc3\xa7\xc3\xa3o do microsc\xc3\xb3pio \xc3\xa9 dado ao holand\xc3\xaas Zacharias Jansen, por volta de 1595. Como era muito jovem na \xc3\xa9poca, pensa-se que o primeiro microsc\xc3\xb3pio, com duas lentes, tenha sido desenvolvido pelo seu pai, Hans Jansen. Por\xc3\xa9m, era Zacharias que montava os microsc\xc3\xb3pios distribu\xc3\xaddos pela realeza europeia, dado que, na altura, o instrumento era considerado um brinquedo, pois possibilitava a observa\xc3\xa7\xc3\xa3o de pequenos objectos._NEWLINE_N\xc3\xa3o obstante, a paternidade do microsc\xc3\xb3pio tem sido muito discutida e disputada, uma vez que os italianos atribuem este singular invento ao seu compatriota, fundador do m\xc3\xa9todo experimental e da ci\xc3\xaancia din\xc3\xa2mica e eminente f\xc3\xadsico e matem\xc3\xa1tico, o famoso Galileu Galilei (1564-1642), natural de Pisa. Segundo testemunhos, Galileu, em 1609, apenas combinou lentes ou cristais de aumento num tubo de chumbo ou papel\xc3\xa3o, aplicando-as ao estudo da astronomia, embora se tenha apoiado no conhecimento do aparato \xc3\xb3ptico inventado pelos Jansen. Este instrumento de Galileu permitia um aumento de trinta vezes, sendo ainda considerado o primeiro telesc\xc3\xb3pio produzido._NEWLINE_Mas de facto parece n\xc3\xa3o ser ele o seu inventor, pois o seu contempor\xc3\xa2neo Hans Lippershey tinha um telesc\xc3\xb3pio, cujos fundamentos foram indagados por Galileu, construindo, baseado neles, o seu pr\xc3\xb3prio telesc\xc3\xb3pio aperfei\xc3\xa7oado. O facto de ter constru\xc3\xaddo os seus pr\xc3\xb3prios instrumentos, tal como aconteceu com diversos cientistas, n\xc3\xa3o lhe credita obter a patente de inventor, como seus bi\xc3\xb3grafos pretendem. Pelas computa\xc3\xa7\xc3\xb5es cronol\xc3\xb3gicas, a inven\xc3\xa7\xc3\xa3o do instrumento pertence, de facto, aos Jansen.\n_START_SECTION_\nCi\xc3\xaancia e o Microsc\xc3\xb3pio\n_START_PARAGRAPH_\nO s\xc3\xa9culo XVII foi um per\xc3\xadodo de grande interesse pelos microsc\xc3\xb3pios. A pr\xc3\xb3pria palavra microsc\xc3\xb3pio foi oficializada na \xc3\xa9poca pelos membros da Academia de Lincei, uma importante sociedade cient\xc3\xadfica. Contudo, ainda havia d\xc3\xbavidas sobre a import\xc3\xa2ncia do instrumento para a ci\xc3\xaancia. A amplia\xc3\xa7\xc3\xa3o dos objectos, em torno de nove vezes, n\xc3\xa3o permitia observar coisas realmente novas, de tal forma que ainda n\xc3\xa3o se suspeitava que uma estrutura presente em todos os tecidos vivos estaria ao alcance do olho humano com a ajuda dos microsc\xc3\xb3pios: a c\xc3\xa9lula.\n_START_SECTION_\nGera\xc3\xa7\xc3\xa3o Seguinte\n_START_PARAGRAPH_\nNo final do s\xc3\xa9culo XVII, os microsc\xc3\xb3pios sofreram uma mudan\xc3\xa7a no seu desenho b\xc3\xa1sico. Devido provavelmente \xc3\xa0 instabilidade do sistema lateral de sustenta\xc3\xa7\xc3\xa3o, passou-se a utilizar um trip\xc3\xa9 de apoio. O primeiro esquema de microsc\xc3\xb3pio com trip\xc3\xa9 foi divulgado na Alemanha em 1631. Contudo, somente em 1683, o microscopista ingl\xc3\xaas John Yarwell construiu o primeiro modelo de que se tem not\xc3\xadcia.\n_START_SECTION_\nMelhorias do S\xc3\xa9culo XVIII\n_START_PARAGRAPH_\nO s\xc3\xa9culo XVIII foi uma \xc3\xa9poca de melhorias nas lentes e nos microsc\xc3\xb3pios, nomeadamente a n\xc3\xadvel de estabilidade, precis\xc3\xa3o de focagem e facilidades de uso. Os instrumentos passaram a ser anunciados em diversas publica\xc3\xa7\xc3\xb5es pelo mundo inteiro, e v\xc3\xa1rios microscopistas lan\xc3\xa7aram os seus modelos. Por volta do ano de 1742, os microsc\xc3\xb3pios que projectavam imagens fizeram grande sucesso. Uma das divers\xc3\xb5es da \xc3\xa9poca era visitar os espect\xc3\xa1culos de projec\xc3\xa7\xc3\xa3o microsc\xc3\xb3pica.\n_START_SECTION_\nMicrosc\xc3\xb3pios no S\xc3\xa9culo XIX\n_START_PARAGRAPH_\nNo s\xc3\xa9culo XIX, os fabricantes de microsc\xc3\xb3pios desenvolveram novas t\xc3\xa9cnicas para fabrica\xc3\xa7\xc3\xa3o de lentes e passaram, tamb\xc3\xa9m, a utilizar espelhos curvos para melhorar a capacidade de focagem desses instrumentos. Em 1840, os Estados Unidos come\xc3\xa7aram a fabricar microsc\xc3\xb3pios, uma actividade at\xc3\xa9 ent\xc3\xa3o restrita basicamente \xc3\xa0 Inglaterra. Finalmente, por volta de 1880, os chamados microsc\xc3\xb3pios \xc3\xb3pticos atingiram a resolu\xc3\xa7\xc3\xa3o de 0,2 micr\xc3\xb3metros, limite que permanece at\xc3\xa9 aos dias de hoje.\n_START_SECTION_\nMicrosc\xc3\xb3pio de Fluoresc\xc3\xaancia\n_START_PARAGRAPH_\nA Microscopia de fluoresc\xc3\xaancia foi inventada h\xc3\xa1 quase um s\xc3\xa9culo atr\xc3\xa1s, quando alguns investigadores experimentavam o uso de luz ultravioleta para obter uma maior resolu\xc3\xa7\xc3\xa3o. No in\xc3\xadcio, as observa\xc3\xa7\xc3\xb5es microsc\xc3\xb3picas eram limitadas aos esp\xc3\xa9cimes que tinham auto-fluoresc\xc3\xaancia, por\xc3\xa9m rapidamente se come\xc3\xa7ou a estudar corantes com fluoresc\xc3\xaancia. No entanto, s\xc3\xb3 a partir da d\xc3\xa9cada de 1940 \xc3\xa9 que a Microscopia de fluoresc\xc3\xaancia come\xc3\xa7ou a ganhar popularidade, quando Coons e Kaplan apresentaram uma t\xc3\xa9cnica que marcava anticorpos com um corante fluorescente para estudar interac\xc3\xa7\xc3\xb5es antig\xc3\xa9nio-anticorpo, o que promoveu uma profunda altera\xc3\xa7\xc3\xa3o no campo da Imunocitoqu\xc3\xadmica._NEWLINE_A descoberta que realmente trouxe a Microscopia de fluoresc\xc3\xaancia para a vanguarda veio em 1994, quando Chalfie M. et al conseguiram expressar naturalmente uma prote\xc3\xadna fluorescente, a prote\xc3\xadna fluorescente verde (Green Fluorescent Protein - GFP), em organismos vivos. Este foi um marco na evolu\xc3\xa7\xc3\xa3o desta \xc3\xa1rea, pois permitiu toda uma nova classe de m\xc3\xa9todos de marca\xc3\xa7\xc3\xa3o._NEWLINE_Na hist\xc3\xb3ria do Microsc\xc3\xb3pio de Fluoresc\xc3\xaancia, a tecnologia foi um trampolim multidisciplinar da Engenharia \xc3\x93ptica, Qu\xc3\xadmica e Biologia, em que todas as disciplinas contribu\xc3\xadram para visualizar as subst\xc3\xa2ncias fluorescentes unidas \xc3\xa0s prote\xc3\xadnas, aumentando a compreens\xc3\xa3o da actividade celular. A import\xc3\xa2ncia da Microscopia de fluoresc\xc3\xaancia foi reconhecida recentemente com o pr\xc3\xa9mio Nobel de Qu\xc3\xadmica do ano de 2008, que foi concedido pelo desenvolvimento da GFP.\n_START_SECTION_\nMicrosc\xc3\xb3pio Confocal\n_START_PARAGRAPH_\nO desenvolvimento do Microsc\xc3\xb3pio Confocal foi impulsionado, em grande parte, pelo desejo de se obter uma imagem de eventos biol\xc3\xb3gicos que ocorrem in vivo._NEWLINE_A inven\xc3\xa7\xc3\xa3o deste objecto \xc3\xa9 atribu\xc3\xadda a Marvin Minsky que, em 1955, enquanto estudante de p\xc3\xb3s-doutoramento na Universidade de Harvard, construiu um microsc\xc3\xb3pio com o objectivo de obter uma imagem de redes neurais, utilizando prepara\xc3\xa7\xc3\xb5es n\xc3\xa3o coradas de tecido cerebral vivo._NEWLINE_Todos os Microsc\xc3\xb3pios Confocais modernos empregam o mesmo princ\xc3\xadpio da imagiologia confocal patenteada em 1957._NEWLINE_A inven\xc3\xa7\xc3\xa3o de Marvin Minsky permaneceu despercebida durante algum tempo, provavelmente devido \xc3\xa0 falta de fontes de luz intensas necess\xc3\xa1rias para se obter imagens e de um computador com uma pot\xc3\xaancia suficiente para lidar com grandes quantidades de dados._NEWLINE_Na sequ\xc3\xaancia do trabalho de Marvin Minsky, surgem M. David Egger e Mojmir Petran, no final dos anos 1960, que fabricam um Microsc\xc3\xb3pio Confocal de feixes m\xc3\xbaltiplos, onde utilizaram um disco girat\xc3\xb3rio (disco de Nipkow) para examinar sec\xc3\xa7\xc3\xb5es de tecido cerebral n\xc3\xa3o corado e c\xc3\xa9lulas ganglionares._NEWLINE_Prosseguindo nesta \xc3\xa1rea, foi em 1973 que M. David Egger desenvolveu o primeiro Microsc\xc3\xb3pio Confocal a laser mecanicamente digitalizado e publicou as primeiras imagens reconhec\xc3\xadveis de c\xc3\xa9lulas._NEWLINE_Durante o final dos anos 1970 e na d\xc3\xa9cada de 1980, os avan\xc3\xa7os da inform\xc3\xa1tica e da tecnologia do laser, juntamente com os novos algoritmos para manipula\xc3\xa7\xc3\xa3o digital de imagens, levou ao aumento do interesse pela Microscopia Confocal._NEWLINE__NEWLINE_Pouco tempo depois da patente de Marvin Minsky ter expirado, os desenhos pr\xc3\xa1ticos do Microsc\xc3\xb3pio Confocal a laser foram traduzidos em instrumentos de trabalho por v\xc3\xa1rios investigadores. O f\xc3\xadsico holand\xc3\xaas G. Fred Brakenhoff desenvolveu um Microsc\xc3\xb3pio de Varrimento Confocal em 1979. Quase em simult\xc3\xa2neo, Colin Sheppard contribuiu para a t\xc3\xa9cnica com a Teoria da Forma\xc3\xa7\xc3\xa3o da Imagem. Tony Wilson, Brad Amos e John White alimentaram o conceito e, mais tarde (durante o final dos anos 1980), demonstraram a utilidade da Imagem Confocal Latente no exame de amostras biol\xc3\xb3gicas fluorescentes. _NEWLINE_Enquanto investigadores em Cambridge, Brad Amos e John White tentaram observar as primeiras divis\xc3\xb5es mit\xc3\xb3ticas dos embri\xc3\xb5es de C. elegans, atrav\xc3\xa9s de imunofluoresc\xc3\xaancia com anticorpos antitubulina, numa tentativa de determinar os planos de clivagem das c\xc3\xa9lulas. No entanto, n\xc3\xa3o conseguiram atingir o seu objectivo, visto que a maioria da fluoresc\xc3\xaancia observada estava fora do plano de focagem. Foi ent\xc3\xa3o que estes investigadores adoptaram a t\xc3\xa9cnica de Microscopia Confocal proposta por Minsky. Em 1987, foi constru\xc3\xaddo o primeiro Microsc\xc3\xb3pio Confocal com a capacidade de produzir imagens com bastante utilidade, combinando tecnologias de laser, de computador e de microelectr\xc3\xb3nica. Amos e White constru\xc3\xadram o primeiro prot\xc3\xb3tipo do Microsc\xc3\xb3pio Confocal que incorporava estas tecnologias e conseguiram, finalmente, obter imagens com melhor focagem dos embri\xc3\xb5es de C. elegans. Foi, ent\xc3\xa3o, em 1987 que os primeiros instrumentos comercializados apareceram._NEWLINE_Durante os anos 1990, os avan\xc3\xa7os da \xc3\xb3ptica e da electr\xc3\xb3nica ofereceram lasers mais est\xc3\xa1veis e mais poderosos de alta efici\xc3\xaancia. Al\xc3\xa9m disso, iniciava-se a sintetiza\xc3\xa7\xc3\xa3o de fluorocromos que eram mais cuidadosamente combinados \xc3\xa0s linhas de excita\xc3\xa7\xc3\xa3o do laser. Aliado ao r\xc3\xa1pido avan\xc3\xa7o da velocidade de processamento dos computadores e ao aumento da disponibilidade tecnol\xc3\xb3gica de armazenamento de grande volume, emergente no final dos anos 1990, a etapa foi definida como uma explos\xc3\xa3o virtual, no que diz respeito ao n\xc3\xbamero de aplica\xc3\xa7\xc3\xb5es que poder\xc3\xa3o ser alvo da Microscopia Confocal._NEWLINE_Os Microsc\xc3\xb3pios Confocais modernos podem ser considerados como sistemas electr\xc3\xb3nicos totalmente integrados, onde o microsc\xc3\xb3pio desempenha um papel central numa configura\xc3\xa7\xc3\xa3o, constitu\xc3\xadda por um ou mais detectores electr\xc3\xb3nicos, o computador (imagem para visualiza\xc3\xa7\xc3\xa3o, processamento, produ\xc3\xa7\xc3\xa3o e armazenamento), v\xc3\xa1rios sistemas de lasers combinados com dispositivos de selec\xc3\xa7\xc3\xa3o e um feixe de varrimento de montagem. Na maioria dos casos, a integra\xc3\xa7\xc3\xa3o entre as v\xc3\xa1rias componentes \xc3\xa9 t\xc3\xa3o profunda que toda a Microscopia Confocal \xc3\xa9 frequentemente referida como um sistema colectivo de imagem digital ou de v\xc3\xaddeo, capaz de produzir imagens electr\xc3\xb3nicas._NEWLINE_Estes microsc\xc3\xb3pios est\xc3\xa3o agora a ser integrados na rotina de investiga\xc3\xa7\xc3\xb5es sobre mol\xc3\xa9culas, c\xc3\xa9lulas e tecidos vivos, o que n\xc3\xa3o era poss\xc3\xadvel h\xc3\xa1 apenas alguns anos atr\xc3\xa1s.\n_START_SECTION_\nPrinc\xc3\xadpios F\xc3\xadsicos do Funcionamento do Microsc\xc3\xb3pio Confocal\n_START_PARAGRAPH_\nExistem tr\xc3\xaas tipos de Microsc\xc3\xb3pios Confocais comercialmente dispon\xc3\xadveis: (1) o Confocal Laser Scanning Microscope (LSCM), o modelo mais utilizado devido \xc3\xa0 elevada qualidade de imagem que permite a obten\xc3\xa7\xc3\xa3o de imagens de alta resolu\xc3\xa7\xc3\xa3o atrav\xc3\xa9s de cortes \xc3\xb3pticos, posteriormente agrupados para se fazer a reconstru\xc3\xa7\xc3\xa3o tridimensional da topografia de objectos complexos; (2) o Spinning-Disk Confocal Microscope, com um disco de Nipkow, cujo r\xc3\xa1cio de constru\xc3\xa7\xc3\xa3o \xc3\xa9 mais r\xc3\xa1pido e eficaz que o LSCM, sendo, por isso, \xc3\xbatil em observa\xc3\xa7\xc3\xb5es din\xc3\xa2micas; e (3) o Programmable Array Microscope (PAM)._NEWLINE_O sistema \xc3\xb3ptico usado neste tipo de Microsc\xc3\xb3pios \xc3\xa9 o mesmo que \xc3\xa9 aplicado nos Microsc\xc3\xb3pios de Fluoresc\xc3\xaancia. No entanto, nestes \xc3\xbaltimos, o campo \xc3\xa9 todo iluminado, enquanto que no Microsc\xc3\xb3pio Confocal focaliza somente um ponto em determinada profundidade no esp\xc3\xa9cimen.\n_START_SECTION_\nConstitui\xc3\xa7\xc3\xa3o do Microsc\xc3\xb3pio Confocal\n_START_PARAGRAPH_\nUm Microsc\xc3\xb3pio Confocal, no geral, \xc3\xa9 constitu\xc3\xaddo por (1) um Laser, que corresponde \xc3\xa0 fonte de luz projectada na amostra e que pode ter um comprimento de onda espec\xc3\xadfico; (2) um Scanner que \xc3\xa9 um digitalizador por unidade, ou seja, move o laser de modo a focalizar a amostra linha por linha; (3) o Z control, que permite a focagem da amostra e a aquisi\xc3\xa7\xc3\xa3o da imagem em sec\xc3\xa7\xc3\xb5es nos eixos X e Z; (4) os Fotomultiplicadores (Photomultipliers - PMT), que v\xc3\xa3o detectar os fot\xc3\xb5es emitidos e/ou reflectidos pela amostra; (5) o Pinhole, respons\xc3\xa1vel pela discrimina\xc3\xa7\xc3\xa3o profunda e pela posi\xc3\xa7\xc3\xa3o nos eixos X e Y; (6) o Beam Splitter ou Via de Fluoresc\xc3\xaancia, que \xc3\xa9  definida pela combina\xc3\xa7\xc3\xa3o dos espelhos dicr\xc3\xb3icos (principal e secund\xc3\xa1rio) e filtros de emiss\xc3\xa3o; e (7) as Objectivas, respons\xc3\xa1veis pela forma\xc3\xa7\xc3\xa3o \xc3\xb3ptica da imagem, que determina as propriedades de qualidade da imagem, assim como as resolu\xc3\xa7\xc3\xb5es nos eixos X, Y e Z, e caracterizada pela abertura num\xc3\xa9rica, que determina o tamanho da imagem no local (conjuntamente com os comprimentos de onda) e influencia substancialmente a espessura m\xc3\xadnima vi\xc3\xa1vel.\n_START_SECTION_\n\xc3\x93ptica\n_START_PARAGRAPH_\nO mecanismo de funcionamento \xc3\xb3ptico deste microsc\xc3\xb3pio \xc3\xa9 melhor entendido como um par de lentes, com o esp\xc3\xa9cimen situado no ponto focal de uma das lentes e com a forma\xc3\xa7\xc3\xa3o de imagem no ponto focal da outra. O princ\xc3\xadpio b\xc3\xa1sico do Microsc\xc3\xb3pio Confocal \xc3\xa9 captar apenas a por\xc3\xa7\xc3\xa3o do esp\xc3\xa9cimen situada no ponto focal de lente mais pr\xc3\xb3xima deste. Esta meta \xc3\xa9 conseguida atrav\xc3\xa9s da associa\xc3\xa7\xc3\xa3o de um orif\xc3\xadcio de abertura ou pinhole, que n\xc3\xa3o \xc3\xa9 mais do que uma superf\xc3\xadcie com um orif\xc3\xadcio. Desta forma, o orif\xc3\xadcio \xc3\xa9 estrategicamente colocado no ponto focal da lente oposta (isto \xc3\xa9, no extremo contr\xc3\xa1rio do sistema de lentes relativamente ao esp\xc3\xa9cimen) sendo, portanto, atravessado apenas pela luz referente ao ponto focal captado pelo sistema._NEWLINE_De acordo com o mecanismo de funcionamento do pinhole, podemos ser levados a pensar que quando mais pequeno for o orif\xc3\xadcio, melhor. Quando maior a capacidade de eliminar a luz de fundo mais definida ser\xc3\xa1 a imagem obtida. De facto, em termos te\xc3\xb3ricos, \xc3\xa9 esse o racioc\xc3\xadnio correcto. Na pr\xc3\xa1tica, no entanto, um pinhole muito pequeno poder\xc3\xa1 eliminar tamb\xc3\xa9m a luz necess\xc3\xa1ria para a forma\xc3\xa7\xc3\xa3o da imagem, isto \xc3\xa9, a capacidade de seccionamento \xc3\xb3ptico ou optical seccioning seria t\xc3\xa3o elevada que as sec\xc3\xa7\xc3\xb5es de luz emitida seriam demasiado finas para serem captadas pelo fotomultiplicador._NEWLINE_Uma forma de evitar este evento poderia residir no aumento da intensidade da luz emitida pelo laser ou no aumento da concentra\xc3\xa7\xc3\xa3o de fluor\xc3\xb3foros. No primeiro caso, sabe-se que demasiada intensidade luminosa leva \xc3\xa0 satura\xc3\xa7\xc3\xa3o ou mesmo degrada\xc3\xa7\xc3\xa3o dos fluor\xc3\xb3foros. No segundo, a excessiva concentra\xc3\xa7\xc3\xa3o destas mol\xc3\xa9culas pode levar \xc3\xa0 interac\xc3\xa7\xc3\xa3o entre elas levando a fen\xc3\xb3menos de quenching (fen\xc3\xb3meno que designa a perda de luminosidade de uma determinada subst\xc3\xa2ncia). Como os fluor\xc3\xb3foros s\xc3\xa3o excitados por um comprimento de onda diferente daquele que emitem, a presen\xc3\xa7a de muitos fluor\xc3\xb3foros juntos n\xc3\xa3o permite que eles captem eficazmente a luz excitat\xc3\xb3ria, isto \xc3\xa9, captam um determinado comprimento de onda e come\xc3\xa7am a emitir noutro, emiss\xc3\xa3o esta que interfere com a capta\xc3\xa7\xc3\xa3o de fluor\xc3\xb3foros demasiado pr\xc3\xb3ximos. De certa forma, para uma concentra\xc3\xa7\xc3\xa3o muito grande de fluor\xc3\xb3foros, o aumento da intensidade de luz emitida inibe-se a si pr\xc3\xb3pria, uma vez que diminui a taxa de excita\xc3\xa7\xc3\xa3o molecular._NEWLINE_Experimentalmente, observou-se que pinholes com dimens\xc3\xb5es inferiores \xc3\xa0s do disco de Airy n\xc3\xa3o oferecem benef\xc3\xadcios. O pinhole desej\xc3\xa1vel ter\xc3\xa1 um tamanho igual ao disco de Airy (ponto de focagem m\xc3\xa1ximo que se consegue obter com uma lente perfeita. O tamanho deste disco \xc3\xa9 vari\xc3\xa1vel consoante o comprimento de onda a que est\xc3\xa1 subjacente), uma vez que poder\xc3\xa1 ser ultrapassado pela totalidade da luz no ponto focal e ter\xc3\xa1 capacidade para eliminar luz indesej\xc3\xa1vel. A focagem de um ponto \xc3\xbanico permite obter aquilo a que se designa por optical seccioning, isto \xc3\xa9, permite formar uma imagem plana de uma fina sec\xc3\xa7\xc3\xa3o focada do esp\xc3\xa9cimen. Como a luz emitida pelo esp\xc3\xa9cimen fora do ponto focal \xc3\xa9 eliminada pelo pinhole, a imagem obtida com Microsc\xc3\xb3pio Confocal \xc3\xa9 bastante mais definida em rela\xc3\xa7\xc3\xa3o a outros tipos de microscopia. Uma das grandes vantagens do Microsc\xc3\xb3pio Confocal adv\xc3\xa9m precisamente da capacidade para optical seccionning. Com a obten\xc3\xa7\xc3\xa3o destas imagens bidimensionais muito definidas, \xc3\xa9 poss\xc3\xadvel obter sec\xc3\xa7\xc3\xb5es a toda a espessura do tecido e criar imagens tridimensionais atrav\xc3\xa9s da jun\xc3\xa7\xc3\xa3o das primeiras._NEWLINE_Pelo tamanho e caracter\xc3\xadsticas do pinhole, verifica-se que, a cada momento, a quantidade de fot\xc3\xb5es que chegam ao sensor \xc3\xa9 bastante pequena. Assim, \xc3\xa9 necess\xc3\xa1ria a utiliza\xc3\xa7\xc3\xa3o de uma fonte luminosa muito intensa, que, nos tempos da cria\xc3\xa7\xc3\xa3o do aparelho, era uma l\xc3\xa2mpada de zirc\xc3\xb3nio. Actualmente, opta-se pelos lasers, que ainda t\xc3\xaam a vantagem de emitir num comprimento de onda espec\xc3\xadfico, existindo v\xc3\xa1rios dispon\xc3\xadveis no mercado com comprimentos de onda diferentes._NEWLINE_Tendo em conta que no caso do Microsc\xc3\xb3pio Confocal, a objectiva \xc3\xa9 uma estrutura que a luz atravessa nos dois sentidos, ainda que comprimentos de onda diferentes, \xc3\xa9 necess\xc3\xa1rio um filtro capaz de separar esses comprimentos de onda sem que nenhum dos dois se perda. Assim, \xc3\xa9 colocado um espelho dicr\xc3\xb3ico (di \xe2\x80\x93 dois; cr\xc3\xb3ico \xe2\x80\x93 cor) ou dicrom\xc3\xa1tico para reflectir o laser e ser atravessado pela luz emitida ou vice-versa._NEWLINE_Al\xc3\xa9m do espelho dicr\xc3\xb3ico, o Microsc\xc3\xb3pio Confocal \xc3\xa9 tamb\xc3\xa9m equipado com espelhos m\xc3\xb3veis. Aquando da sua cria\xc3\xa7\xc3\xa3o, Minsky constituiu as suas imagens atrav\xc3\xa9s da mobilidade do esp\xc3\xa9cimen. Contudo, ainda que este m\xc3\xa9todo permita evitar defeitos nas lentes, levava muitas vezes a perdas de resolu\xc3\xa7\xc3\xa3o da imagem. Al\xc3\xa9m disso, a n\xc3\xadvel biol\xc3\xb3gico torna-se imposs\xc3\xadvel efectuar algumas manipula\xc3\xa7\xc3\xb5es (tal como microinjec\xc3\xa7\xc3\xa3o de sondas fluorescentes) quando o esp\xc3\xa9cimen \xc3\xa9 m\xc3\xb3vel. Desta forma, opta-se actualmente por manter o esp\xc3\xa9cimen est\xc3\xa1tico enquanto o laser "varre" toda a sua superf\xc3\xadcie. Este m\xc3\xa9todo \xc3\xa9 conseguido com espelhos, associados a pequenos motores, que rodam de forma a conseguir abranger uma \xc3\xa1rea limitada do esp\xc3\xa9cimen. De referir que os espelhos s\xc3\xa3o respons\xc3\xa1veis pela varrimento do laser apenas a duas dimens\xc3\xb5es._NEWLINE_Neste tipo de microscopia nunca h\xc3\xa1 uma imagem completa do esp\xc3\xa9cimen, uma vez que a cada instante apenas \xc3\xa9 observado um ponto. Assim, o microsc\xc3\xb3pio \xc3\xa9 acoplado a um sistema inform\xc3\xa1tico que constr\xc3\xb3i uma imagem, pixel a pixel, \xc3\xa0 medida que os pontos do esp\xc3\xa9cimen s\xc3\xa3o focados. Geralmente, uma imagem demora cerca de 0,1 a 1 segundos a ser gerada. Contudo, este per\xc3\xadodo poder\xc3\xa1 ser maior para obten\xc3\xa7\xc3\xa3o de uma imagem bidimensional de alta defini\xc3\xa7\xc3\xa3o ou tridimensional. \xc3\x89 fundamental que os fluor\xc3\xb3foros n\xc3\xa3o se encontrem demasiado expostos ao comprimento de onda que os excita, sob pena de sofrerem danos ou photobleaching (destrui\xc3\xa7\xc3\xa3o fotoqu\xc3\xadmica de um fluor\xc3\xb3foro). Assim, s\xc3\xa3o actualmente usados m\xc3\xa9todos de captura a alta velocidade, como, por exemplo a Microscopia Confocal com disco de Nipkow. Este disco det\xc3\xa9m milhares de pinholes em toda a sua superf\xc3\xadcie, o que permite a actua\xc3\xa7\xc3\xa3o de algumas centenas deles a cada momento.\n_START_SECTION_\nVisualiza\xc3\xa7\xc3\xa3o de uma Imagem\n_START_PARAGRAPH_\nO laser emite um feixe de luz que ir\xc3\xa1 incidir, em primeiro lugar, na objectiva e, de seguida, no espelho dicr\xc3\xb3ico, que reflecte a luz para uma segunda objectiva. Esta converge a luz para um \xc3\xbanico ponto na amostra. A luz fluorescente emitida pela amostra \xc3\xa9, ent\xc3\xa3o, captada pela segunda objectiva e passa atrav\xc3\xa9s do espelho dicr\xc3\xb3ico, enquanto que a luz do feixe \xc3\xa9 reflectida. Posteriormente, a luz fluorescente da amostra \xc3\xa9 convergida por uma terceira objectiva de modo a ser captada pelo fotomultiplicador. Antes desta ser detectada pelo mesmo, \xc3\xa9 parcialmente obstru\xc3\xadda de forma que apenas a luz proveniente do ponto focal seja captada. O fotomultiplicador transforma, ent\xc3\xa3o, o sinal luminoso em sinal el\xc3\xa9ctrico, que ser\xc3\xa1 gravado por um computador._NEWLINE_O microsc\xc3\xb3pio digitaliza a amostra sequencialmente, ponto por ponto e linha por linha, e converge os pix\xc3\xa9is numa imagem. Deste modo, sec\xc3\xa7\xc3\xb5es \xc3\xb3pticas da amostra s\xc3\xa3o imagens com grande contraste e resolu\xc3\xa7\xc3\xa3o nos eixos X, Y, Z, ou seja, s\xc3\xa3o tridimensionais.\n_START_SECTION_\nPrepara\xc3\xa7\xc3\xa3o de Amostras Biol\xc3\xb3gicas\n_START_PARAGRAPH_\nComo em qualquer t\xc3\xa9cnica laboratorial que envolva a an\xc3\xa1lise de amostras biol\xc3\xb3gicas \xc3\xa9 imprescind\xc3\xadvel ter em considera\xc3\xa7\xc3\xa3o quais os m\xc3\xa9todos de prepara\xc3\xa7\xc3\xa3o ideais. No caso da Microscopia Confocal as amostras podem ser organismos vivos, culturas celulares, amostras fixadas, cortes histol\xc3\xb3gicos de rotina, sendo as t\xc3\xa9cnicas adequadas ao tipo de amostra e procedimento._NEWLINE_A fixa\xc3\xa7\xc3\xa3o, tamb\xc3\xa9m nesta t\xc3\xa9cnica, deve estabelecer um equil\xc3\xadbrio com a manuten\xc3\xa7\xc3\xa3o da antigenicidade, sendo que o fixador mais comum \xc3\xa9 o Paraformalde\xc3\xaddo a 4% tamponado, utilizado a uma temperatura de 4\xc2\xa0\xc2\xb0C. O Formol comercial possui, na sua constitui\xc3\xa7\xc3\xa3o, Metanol (6-15%) e outras impurezas que podem afectar a fixa\xc3\xa7\xc3\xa3o e, consequentemente a t\xc3\xa9cnica._NEWLINE_A amostra deve ser submersa em fixador com ligeira agita\xc3\xa7\xc3\xa3o, sendo que os tecidos que se encontram osmoticamente activos podem apresentar algumas altera\xc3\xa7\xc3\xb5es morfol\xc3\xb3gicas (retrac\xc3\xa7\xc3\xa3o ou expans\xc3\xa3o tecidual)._NEWLINE_A espessura dos cortes histol\xc3\xb3gicos depende da dist\xc3\xa2ncia de trabalho de cada alvo, da penetrabilidade do anticorpo ou do fluorocromo utilizado para colora\xc3\xa7\xc3\xa3o e das propriedades de transpar\xc3\xaancia do tecido que forma a amostra._NEWLINE_O tempo de observa\xc3\xa7\xc3\xa3o deve ser limitado, uma vez que os radicais livres que s\xc3\xa3o produzidos durante o tempo de excita\xc3\xa7\xc3\xa3o dos fluorocromos danificam as c\xc3\xa9lulas e tecidos n\xc3\xa3o fixados._NEWLINE_As amostras devem ser protegidas da luz, analisadas rapidamente e armazenadas no frio.\n_START_SECTION_\nRiscos\n_START_PARAGRAPH_\nTendo em conta os reagentes utilizados nas t\xc3\xa9cnicas de Microscopia Confocal (fluorocromos, DAPI, meios de cultura, fixadores, entre outros) consideram-se m\xc3\xbaltiplos riscos, tais como, inflam\xc3\xa1veis, nocivos, irritantes, t\xc3\xb3xicos e cancer\xc3\xadgenos.'