b'\n_START_ARTICLE_\nPol\xc3\xbcmeraasi ahelreaktsioon\n_START_PARAGRAPH_\nPol\xc3\xbcmeraasi ahelreaktsioon ehk PCR (l\xc3\xbchend ingliskeelsest vastest polymerase chain reaction) on meetod DNA v\xc3\xb5i RNA j\xc3\xa4rjestuse amplifikatsiooniks ehk kordistamiseks. PCR-meetod v\xc3\xb5imaldab v\xc3\xa4ga v\xc3\xa4ikesest DNA l\xc3\xb5igust luua miljoneid koopiaid._NEWLINE_PCR metoodika t\xc3\xb6\xc3\xb6tas 1983. aastal v\xc3\xa4lja Kary Mullis, kes 1993. aastal sai koos Michael Smithiga selle eest Nobeli keemiaauhinna._NEWLINE_PCR metoodika v\xc3\xb5imaldab in vitro paljundada konkreetset DNA fragmenti, kasutades selleks termostabiilset DNA pol\xc3\xbcmeraasi. Esimene termostabiilne DNA pol\xc3\xbcmeraas (Taq pol\xc3\xbcmeraas), mida kasutati PCR-i l\xc3\xa4biviimiseks, isoleeriti termofiilsest bakterist Thermus aquaticus. Taq pol\xc3\xbcmeraas on monosub\xc3\xbchikuline ens\xc3\xbc\xc3\xbcm, millel puudub replikatsioonivigu parandav 3\xe2\x80\x99-5\xe2\x80\x99eksonukleaasne aktiivsus. Seet\xc3\xb5ttu on Taq pol\xc3\xbcmeraasi poolt l\xc3\xa4biviidav DNA s\xc3\xbcntees k\xc3\xbcllaltki vigaderohke. Selleks, et amplifitseerida kindlat DNA j\xc3\xa4rjestust, peab v\xc3\xa4hemalt osaliselt teadma uuritava DNA nukleotiidset j\xc3\xa4rjestust. Uuritava DNA regiooniga k\xc3\xbclgnevatele j\xc3\xa4rjestustele s\xc3\xbcnteesitakse komplementaarselt kaks l\xc3\xbchikest, \xc3\xbcksikahelalist DNA fragmenti ehk praimerit, millest \xc3\xbcks on komplementaarne kodeeriva ahelaga, teine matriitsahelaga.\n_START_SECTION_\nPCR-i p\xc3\xb5him\xc3\xb5te\n_START_PARAGRAPH_\nPCR-reaktsioon toimub kolmes etapis:_NEWLINE_1. DNA ahelate denatureerimine. _NEWLINE_Kui DNA on rakust eraldatud ja puhastatud, v\xc3\xb5ib alustada PCR-anal\xc3\xbc\xc3\xbcsi. PCR-i puhul on v\xc3\xb5imalik kasutada ka puhastamata DNA-d, kuid see on ebaefektiivne. DNA denatureerimiseks kuumutatakse DNA-d 90\xe2\x80\x9395\xc2\xa0\xc2\xb0C juures, mille k\xc3\xa4igus DNA biheeliks laguneb kaheks \xc3\xbcksikahelaks. See on vajalik huvipakkuvate fragmentide paljundamiseks. S\xc3\xbcntees saab toimuda vaid \xc3\xbcksikahelalt._NEWLINE_DNA denatureerumine toimub j\xc3\xa4rskude etappidena v\xc3\xa4ga kindlatel temperatuuridel. DNA denatureerimistemperatuuri nimetatakse DNA sulamistemperatuuriks. Mida suurem on G-C paaride sisaldus v\xc3\xb5rreldes A-T paaridega, seda k\xc3\xb5rgem on sulamistemperatuur._NEWLINE_PCR-i puhul on vaja teada l\xc3\xbchikesi j\xc3\xa4rjestusi kahel pool s\xc3\xbcnteesitavat piirkonda. K\xc3\xbclgnevate j\xc3\xa4rjestuste j\xc3\xa4rgi on s\xc3\xbcnteesitud komplementaarsed praimerid, tavaliselt 15\xe2\x80\x9325 nukleotiidi pikkused oligonukleotiidid. Nende seondumine DNA-ga on vajalik, kuna alad, kuhu praimerid kinnituvad, on fragmentide s\xc3\xbcnteesi initsiaatoriteks. Praimerid seonduvad komplementaarsusprintsiibi alusel m\xc3\xb5lemale poole piirkonda._NEWLINE_2. Praimerite seondumine DNA ahelatega.Praimerite seondumine ehk annealing toimub 50\xe2\x80\x9370\xc2\xa0\xc2\xb0C juures. Selleks, et kinnitustemperatuur m\xc3\xb5istlik oleks, tulebki praimerid teha 20 nukleotiidi pikkused. Sellisel juhul ongi nende sulamistemperatuur vajalikus vahemikus. Praimerite G-C sisaldus on ka oluline \xe2\x80\x93 see peaks j\xc3\xa4\xc3\xa4ma 50\xe2\x80\x9355% ulatusse, v\xc3\xa4iksema sisalduse korral tuleb praimereid pikendada._NEWLINE_3. DNA s\xc3\xbcntees._NEWLINE_Kui praimerid on amplifitseeritava DNA j\xc3\xa4rjestuse kahelt poolt kindlaks teinud ja piiranud, s\xc3\xbcnteesib termostabiilne DNA pol\xc3\xbcmeraas praimerite 3\xe2\x80\x99 otsast alates m\xc3\xb5lemale DNA \xc3\xbcksikahela fragmendile komplementaarse fragmendi, kasutades selleks segusse lisatud nukleotiide. Protseduur toimub 72\xc2\xa0\xc2\xb0C juures ning selleks kasutatakse termostabiilset Taq pol\xc3\xbcmeraasi._NEWLINE_Neid ts\xc3\xbckleid korratakse 20\xe2\x80\x9330 korda, et amplifitseerida piisav arv DNA molekule._NEWLINE_Juhul kui amplifitseeritakse otse rakkudest p\xc3\xa4rit DNA-d v\xc3\xb5i kui kasutatava DNA pol\xc3\xbcmeraasi aktivatsiooniks on vajalik eelnev temperatuuri t\xc3\xb5stmine, eelkuumutatakse PCR segu ligikaudu 10 minutit 96\xc2\xa0\xc2\xb0C juures._NEWLINE_Samuti on soovitatav kasutada p\xc3\xa4rast PCR ts\xc3\xbcklite l\xc3\xb5petamist DNA s\xc3\xbcnteesi lisaetappi 10 minutit 72\xc2\xa0\xc2\xb0C juures. Lisas\xc3\xbcntees on vajalik selleks, et Taq DNA pol\xc3\xbcmeraas saaks l\xc3\xb5puni s\xc3\xbcnteesida k\xc3\xb5ik seni DNA s\xc3\xbcnteesil \xc3\xbcksikahelaliseks j\xc3\xa4\xc3\xa4nud DNA otsad._NEWLINE_DNA s\xc3\xbcnteesi kiiruseks arvestatakse PCR programmis keskmiselt 1000 aluspaari minutis. Teise PCR ts\xc3\xbckliga tekib kaks DNA molekuli, mille \xc3\xbches otsas on m\xc3\xa4rklaudj\xc3\xa4rjestuse pikkused ja teises otsas 3 \xc3\xbcleulatuvat \xc3\xbcksikahelalist ala. PCR kolmandas ts\xc3\xbcklis tekib DNA fragmente, mis sisaldavad ainult m\xc3\xa4rklaudj\xc3\xa4rjestusi. Selliste DNA fragmentide osakaal hakkab j\xc3\xa4rgnevate ts\xc3\xbcklite jooksul eksponentsiaalselt kasvama, j\xc3\xb5udes 30 ts\xc3\xbckli j\xc3\xa4rel 1 073 741 766 molekulini. Pikemate PCR fragmentide hulk on 30 ts\xc3\xbckli l\xc3\xb5ppedes vaid 60 molekuli. See arvutusk\xc3\xa4ik on teoreetiline ja kehtib vaid juhul, kui PCR reaktsioon on alustatud \xc3\xbche DNA molekuliga ja kui DNA pol\xc3\xbcmeraasi reaktsioon iga PCR ts\xc3\xbckli jooksul on t\xc3\xa4ielikult toimunud.\n_START_SECTION_\nPCR-masin ehk termots\xc3\xbckler\n_START_PARAGRAPH_\nTermots\xc3\xbckler ehk PCR-masin on pol\xc3\xbcmeraasi ahelreaktsiooniks vajalik aparatuur, mis sisaldab reaktsioonituubide hoidjat ja programmi, mis automatiseerib tuubide aluse kuumutamise kindlal temperatuuril kindlate ajavahemike kaupa. T\xc3\xa4nap\xc3\xa4evaks on loodud PCR-masinad, mis detekteerivad amplikonide tekkimist reaalajas ning suudavad anal\xc3\xbc\xc3\xbcsida mRNA pealt s\xc3\xbcnteesitud DNA kogust ja geenide ekspressiooni taset. See k\xc3\xb5ik on v\xc3\xb5imalik fluorestseeruvate m\xc3\xa4rgiste abil, mille olemasolu _NEWLINE_detekteeritakse fotodetektoritega, mis on \xc3\xbchenduses PCR masinaga. PCR reaktsioone v\xc3\xb5ib olla erinevaid ning selle tagab temperatuuri, praimerite kasutuse, ts\xc3\xbcklite ja reaktsiooni arvu muutmise v\xc3\xb5imalus.\n_START_SECTION_\nPCR-saaduste anal\xc3\xbc\xc3\xbcs\n_START_PARAGRAPH_\nAmplifitseeritud piirkondade pikkust m\xc3\xa4\xc3\xa4ratakse, nagu klassikalise DNA anal\xc3\xbc\xc3\xbcsi puhulgi, geelelektroforeesil. PCR produktid kantakse geeli kaevudesse ning eraldi foreesirajale pikkusmarker (juba teadaolevate pikkustega DNA l\xc3\xb5ikude segu). Forees viiakse l\xc3\xa4bi 150 V juures 30 minuti v\xc3\xa4ltel. PCR-saadused visualiseeritakse arvutijuhitavate laseritega ja tulemused esitatakse graafikuna.\n_START_SECTION_\nPCR-meetodi eelised ja puudused\n_START_PARAGRAPH_\n\xc3\x9cheks PCR-meetodi eeliseks on selle kiirus ja kasutamise lihtsus. \xc3\x9che fragmendi amplifitseerimiseks piisavas koguses kulub vaid 2\xe2\x80\x933 tundi ning lihtsuse tagab protseduuri automatiseeritus. Kiirust lisab ka see, et \xc3\xbche PCR protseduuri k\xc3\xa4igus on erinevates tuubides v\xc3\xb5imalik korraga t\xc3\xb6\xc3\xb6delda 4\xe2\x80\x936 erinevat piirkonda. T\xc3\xa4htsaks eeliseks on PCR anal\xc3\xbc\xc3\xbcsi suur tundlikkus \xe2\x80\x93 kui klassikalise DNA anal\xc3\xbc\xc3\xbcsi jaoks l\xc3\xa4heb vaja v\xc3\xa4hemalt 20\xc2\xa0ng puhastatud DNA-d, piisab PCR-i puhul \xc3\xbchest nanogrammist ning protseduur v\xc3\xb5ib isegi \xc3\xb5nnestuda vaid \xc3\xbche raku olemasolul._NEWLINE_Samuti ei ole PCR-i puhul DNA puhtus nii oluline kui klassikalise anal\xc3\xbc\xc3\xbcsi korral. Restriktaase, mille t\xc3\xb6\xc3\xb6d DNA saastatus m\xc3\xb5jutada v\xc3\xb5ib, ei kasutata ning elektroforeesifragmendid on PCR-i k\xc3\xa4igus juba s\xc3\xbcnteesitud ja seega lisaaineteta._NEWLINE_Puuduseks on esiteks vajadus teada DNA t\xc3\xa4pseid j\xc3\xa4rjestusi, mille alusel s\xc3\xbcnteesida praimerid. Lisaks ka asjaolu, et piirkonnad on l\xc3\xbchikesed, mist\xc3\xb5ttu n\xc3\xa4iteks isikute tuvastamisel v\xc3\xb5i isadustestis on juhuslik kokkulangevus t\xc3\xb5en\xc3\xa4olisem. DNA s\xc3\xbcnteesimise k\xc3\xa4igus v\xc3\xb5ib tekkida ka vigu, sest ei ole vajalikke kontrollmehhanisme, mis eksisteerivad loodusliku replikatsiooni puhul.'