b'\n_START_ARTICLE_\nDegron\n_START_PARAGRAPH_\nDegron on spetsiifiline aminohapete j\xc3\xa4rjestus valgus, mis on valgu lagundamise alguspunktiks._NEWLINE_Degronj\xc3\xa4rjestus v\xc3\xb5ib olla nii N- kui ka C-terminaalses otsas, seega on olemas vastavalt eraldi nii N-degronid kui C-degronid. Lisaks indutseeritakse valkude lagundamist erinevalt, kas temperatuurimuutusega kasvukeskkonnas v\xc3\xb5i degradeerimist indutseeriva aine lisamisega kasvukeskkonda._NEWLINE_Degron on nimetuse saanud degradeerimise ehk lagundamise j\xc3\xa4rgi.\n_START_SECTION_\nDegroni kasutamise eelised\n_START_PARAGRAPH_\nDegron on heaks viisiks valkude uurimisel, kuna antud juhul ei ole valgu geen rakust t\xc3\xa4ielikult eemaldatud. Selle asemel saab valgu kogust vastavalt soovile rakus kiiresti v\xc3\xa4hendada ning seej\xc3\xa4rel keskkonnatingimuste optimeerimisel valgu kogus rakus uuesti normaalsele tasemele viia. Nii saab hoiduda k\xc3\xb5rvalm\xc3\xb5judest, mis v\xc3\xb5ivad tekkida terve geeni eemaldamisel genoomist: kui sihtm\xc3\xa4rkgeen kodeerib elut\xc3\xa4htsat valku, siis ei ole eemaldatud geeniga rakud eluv\xc3\xb5imelised._NEWLINE_Erinevalt RNA interferentsist, kus on v\xc3\xb5imalik v\xc3\xa4line m\xc3\xb5jutamine, mida p\xc3\xb5hjustab aeglane mRNA eemaldamine, ning mittet\xc3\xa4ielik valgu vaigistamine, on degron hea v\xc3\xb5imalus valkusid uurida, kuna valku saab kiiresti ning vastavalt soovile rakus kas toota v\xc3\xb5i lagundada. Kui vaadelda RNA interferentsi j\xc3\xa4rel moodustunud rakkude kolooniaid ning p\xc3\xa4rast degronit moodustunud kolooniaid, siis rakkude v\xc3\xb5imel kolooniaid moodustada erinevusi ei ole. Siiski ilmnevad fenot\xc3\xbc\xc3\xbcbi uurimisel vedelkultuuris olulised erinevused. Geeni transkriptsiooni allasurumine p\xc3\xb5hjustab kiire sihtm\xc3\xa4rkgeenilt transkribeeritud mRNA koguse v\xc3\xa4henemise rakus, kuid valgu eemaldamine rakust on palju astmelisem. See p\xc3\xb5hjustab defekte rakuts\xc3\xbckli faasis G2 v\xc3\xb5i mitoosis._NEWLINE_Alternatiivseks variandiks degronile ja RNA interferentsile on valgu seostumine rapam\xc3\xbctsiini v\xc3\xb5i steroidhormoonidega, kuid selle meetodiga saab uurida vaid kindlaid valke, n\xc3\xa4iteks tuumas asuvaid ja makromolekulaarsetes interaktsioonides osalevaid valke.\n_START_SECTION_\nDegront\xc3\xbcve konstrueerimine\n_START_PARAGRAPH_\nDegron sisestatakse sihtm\xc3\xa4rkgeeni kromosomaalsesse lookusesse, integreerides sinna varem pol\xc3\xbcmeraasi ahelreaktsiooniga (PCR) amplifitseeritud DNA-kasseti. Seda DNA-kassetti kasutatakse rakkude transformeerimiseks. \xc3\x95igesse kohta integreerumiseks valitakse pol\xc3\xbcmeraasi ahelreaktsiooni jaoks oligonukleotiidid nii, et DNA-kasseti otste j\xc3\xa4rjestused oleksid identsed sihtm\xc3\xa4rkgeeni kromosomaalse lookuse j\xc3\xa4rjestustele._NEWLINE_DNA-kassetis on 3 komponenti: kanMX geen, millele j\xc3\xa4rgneb CUP1 promootor ning degron ise. Geen kanMX on selektiivseks markeriks, kuna see tagab resistentsuse antibiootikum G418-le. CUP1 promootorit kasutatakse degroni ekspresseerimiseks, kuna DNA-kasseti integreerimine sihtm\xc3\xa4rkgeeni h\xc3\xa4irib geenisisese promootori t\xc3\xb6\xc3\xb6tamist. CUP1 promootor vajab t\xc3\xb6\xc3\xb6tamiseks CuSO\xe2\x82\x84 olemasolu kasvukeskkonnas, seega tuleb valgu lagundamise indutseerimiseks lisada rakkude kasvukeskkonda ka CuSO\xe2\x82\x84. Degroni kasseti v\xc3\xb5ib integreerida nii haploidsesse kui diploidsesse rakuliini._NEWLINE_Kiireim viis saada soovitud tulemust on degroni sisestamine haploidsesse rakuliini. Sellises rakuliinis on GAL1, 10 promootori kontrolli all ainult 1 koopia UBR1 geeni._NEWLINE_Teiseks viisiks on sisestada degroni kassett diploidsesse rakuliini. Nii on rakus \xc3\xbchte sihtm\xc3\xa4rkgeeni koopiasse integreerunud degron ning teine koopia geenist on metsikt\xc3\xbc\xc3\xbcpi. Nii on rakus p\xc3\xa4rast degroniga valgu degradeerimist olemas ka funktsioneeriv valk. Selle meetodi l\xc3\xa4biviimiseks kasutatakse rakuliine, milles GAL1, 10 promootor kontrollib vaid 1 koopia UBR1 geeni ekspresseerumist. Teise koopia promootoriks on endogeenne promootor. P\xc3\xa4rast transformeerimist eraldatakse kolooniad, milles on toimunud transformatsioon. Diploidsetest rakkudest saadakse sporuleerumise teel tetraadid, mida anal\xc3\xbc\xc3\xbcsitakse. Tetraadide anal\xc3\xbc\xc3\xbcsimise teel saadakse haploidne rakuliin, mis ekspresseerib GAL-UBR1 ning millel on sihtm\xc3\xa4rkvalgule lisatud degronj\xc3\xa4rjestus.\n_START_SECTION_\nTemperatuuritundlik degron\n_START_PARAGRAPH_\nTemperatuuriga indutseeritava valkude degradeerimise s\xc3\xbcsteemi korral on degroni kassetiga m\xc3\xa4rgistatud valk tundlik temperatuurimuutusele. Antud kassett asub avatud lugemisraami alguses. Valk degradeerub, kui rakkude kasvukeskkonnas viia temperatuur 24\xc2\xa0\xc2\xb0C pealt 37\xc2\xa0\xc2\xb0C-ni. Degron algab ubikvitiini molekuliga, mis kiiresti p\xc3\xa4rast translatsiooni eemaldatakse._NEWLINE_Temperatuuritundlik degron on N-reegli p\xc3\xb5hine: N-terminaalne aminohappej\xc3\xa4\xc3\xa4k destabiliseeritakse ning see v\xc3\xa4hendab in vivo oluliselt valgu poolestusaega._NEWLINE_Temperatuuritundliku degroni korral on degron ubikvitiinist, arginiinist ja DHFR-ist (dih\xc3\xbcdrofolaatreduktaasist) integreerunud valk. Dih\xc3\xbcdrofolaatreduktaas on hiirest eraldatud ens\xc3\xbc\xc3\xbcm, mis on vajalik aminohappe t\xc3\xbcmiini s\xc3\xbcnteesiks. Seda ens\xc3\xbc\xc3\xbcmi on leitud ka teistest imetajatest ning bakteritest. See ens\xc3\xbc\xc3\xbcm on ebastabiilne: k\xc3\xb5rgemal temperatuuril kui 37\xc2\xa0\xc2\xb0C valgu kokku pakitud struktuur avaneb veidi ning paljastuvad sisemised l\xc3\xbcsiinij\xc3\xa4\xc3\xa4gid. Neil l\xc3\xbcsiinij\xc3\xa4\xc3\xa4kidel toimub pol\xc3\xbcubikvitiniseerumine. Proteol\xc3\xbc\xc3\xbcs on kiire ning t\xc3\xb5hus, valk lagundatakse proteosoomis._NEWLINE_Degronit on v\xc3\xb5imalik sisestada nii uuritava valgu geeni kui ka \xc3\xbcle kanda plasmiidile. N-degroni n\xc3\xa4itel paljastub arginiini j\xc3\xa4\xc3\xa4k, mis asub N-terminuses. Sellele seondub Ubr1, mis on seotud ubikvitiini konjugeeriva ens\xc3\xbc\xc3\xbcmiga. Ubr1-l on potentsiaal indutseerida valgu pinnale j\xc3\xa4\xc3\xa4vate l\xc3\xbcsiinij\xc3\xa4\xc3\xa4kide ubikvitiiniga seondumist ning seel\xc3\xa4bi valgu lagunemist. Tegelikkuses on selleks vaja aga temperatuurimuutust v\xc3\xb5i indutseeriva aine olemasolu, n\xc3\xa4iteks dih\xc3\xbcdrofolaatreduktaasi.\n_START_SECTION_\nAuksiinitundlik degron\n_START_PARAGRAPH_\nAuksiinist s\xc3\xb5ltuv degron aitab in vivo uurida valkude funktsiooni ning reguleerida geeniekspressiooni._NEWLINE_Auksiinid on taimehormoonide perekond, mis kontrollib geeniekspressiooni taime kasvu ning arengu ajal. Auksiini perekonna hormoonid, nagu n\xc3\xa4iteks indool-3-atsetaat hape, soodustavad ubikvitiini ligaasi interaktsiooni, ning seel\xc3\xa4bi lagundatakse valk auksiinist s\xc3\xb5ltuva degradatsioonis\xc3\xbcsteemi kaudu. Auksiin seondub F-box transpordi inhibiitorile reageeriva valguga ning aitab kaasa E3 ubikvitiini ligaasi SCF-TIR1 ja auksiini transkriptsiooni repressori interaktsioonile. SCR-TIR1 paneb t\xc3\xb6\xc3\xb6le E2 ubikvitiini konjugeeriva ens\xc3\xbc\xc3\xbcmi, mis seej\xc3\xa4rel pol\xc3\xbcubikvitineerib auksiini. See protsess viib valgu kiirele degradatsioonile proteosoomis. K\xc3\xb5ikidel eukar\xc3\xbcootidel on palju SCF eri vorme, kuid TIR1 ja auksiini on leitud ainult taimerakkudes._NEWLINE_Auksiinist s\xc3\xb5ltuv degroni rada on \xc3\xbcle v\xc3\xb5etud taimerakkudest. Selle s\xc3\xbcsteemi abil saab vastavalt vajadusele valku inaktiveerida v\xc3\xb5i seda rakust kustutada. Auksiinitundliku degroni meetod annab v\xc3\xb5imaluse kiirelt, 30 minuti jooksul, valgu kogust rakus v\xc3\xa4hendada, kui keskkonda lisada auksiini. See reaktsioon on p\xc3\xb6\xc3\xb6rduv ning seda saab reguleerida. Sellist valkude funktsiooni uurimist saab kasutada enamikus eukar\xc3\xbcootides, v\xc3\xa4lja arvatud taimedes.\n_START_SECTION_\nDegroni puudused\n_START_PARAGRAPH_\nNii auksiini indutseeritava kui ka temperatuuritundliku degroni puuduseks on see, et endogeenseid valke pole v\xc3\xb5imalik uurida antud geeni manipuleerimata. Temperatuuritundliku degroni puuduseks on ka see, et selle meetodiga pole v\xc3\xb5imalik uurida protsesse, mis ei toimu 37\xc2\xa0\xc2\xb0C juures v\xc3\xb5i sellest k\xc3\xb5rgemal temperatuuril._NEWLINE_Auksiinitundliku degroni puuduseks on asjaolu, et valkude lagundamise algatamiseks on vaja keskkonda lisada auksiini, pole v\xc3\xb5imalik degradatsiooni indutseerimine lihtsalt rakukultuuri \xc3\xbchest keskkonnast teise viimisega.\n_START_SECTION_\nDegroni head k\xc3\xbcljed\n_START_PARAGRAPH_\nAuksiini indutseeritava degroni suureks eeliseks on rakukultuuride s\xc3\xa4ilitamine konstantsel temperatuuril. Kasutades auksiini indutseeritavat degronit, on v\xc3\xb5imalik uurida protsesse, mis ei toimu 37\xc2\xa0\xc2\xb0C juures, n\xc3\xa4iteks meioosi. Lisaks sellele on v\xc3\xb5imalik v\xc3\xa4ltida rakkude stressi, mis tekib temperatuurimuutusel._NEWLINE_Temperatuuritundliku degroni eeliseks on lihtne s\xc3\xbcsteem valkude degradeerimise indutseerimiseks: rakukultuur tuleb lihtsalt viia teise kasvukeskkonda, lisamata kasvukeskkonda \xc3\xbchtki ainet.\n_START_SECTION_\nEestis\n_START_PARAGRAPH_\nEestis tegeldakse degront\xc3\xbcvede konstrueerimise ning sel meetodil valkude uurimisega Tartu \xc3\x9clikooli molekulaar- ja rakubioloogia instituudis molekulaarbioloogia \xc3\xb5ppetoolis.'