03 / Fasc . 12                              Jornal Oficial das Comunidades Europeias                                        121
377R1058
N? L 128 /6                                 Jornal Oficial das Comunidades Europeias                                 24. 5 . 77
                                        REGULAMENTO (CEE) N? 1058/77 DA COMISSÃO
                                                      de 18 de Maio de 1977
               relativo às características dos azeites e de certos produtos que contêm azeite e que altera a
                               nomenclatura da pauta aduaneira comum no que diz respeito ao azeite
A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,                              risticas dos azeites bem como de certos produtos que
                                                                   contêm azeite (7), foi alterado várias vezes, nomeada­
Tendo em conta o tratado que institui a Comunidade
Económica Europeia,
                                                                   mente pelo Regulamento (CEE) n? 3366/75 (8); que,
                                                                   tendo em conta as novas alterações a fazer ao referido
Tendo em conta o Regulamento n? 136/66/CEE do                      regulamento, considerou-se oportuno revogá-lo e reto­
Conselho, de 22 de Setembro de 1966, que estabelece a              mar num novo regulamento o conjunto das disposições ;
organização comum de mercado no sector das matérias
gordas ('), com a última redacção que lhe foi dada pelo             Considerando que as medidas previstas no presente regu­
Regulamento (CEE) n? 1707/73 (2), e, nomeadamente, o               lamento estão em conformidade com o parecer do Co­
n? 4 do seu artigo 13? e o n? 3 do seu artigo 18 ?,                mité de Gestão das Matérias Gordas,
Tendo em conta o Regulamento n? 162/66/CEE do
Conselho, de 27 de Outubro de 1966, relativo às trocas             ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO :
de matérias gordas entre a Comunidade e a Grécia (}), e,
nomeadamente, os n?s 4 e 9 do seu artigo 3?,
Tendo em conta o Regulamento (CEE) n? 443 /72 do                                                Artigo 1°
Conselho, de 29 de Fevereiro de 1972, relativo aos direi­           1 . Só se considera como azeite, na acepção da subpo­
tos niveladores aplicáveis ao azeite que foi submetido a           sição 15.07 A da pauta aduaneira comum, o óleo prove­
um processo de refinação, bem como a certos produtos               niente exclusivamente do tratamento das azeitonas, com
que contêm azeite (4) e, nomeadamente, o seu artigo 8 ?,           exclusão do azeite reesterificado e de qualquer mistura
                                                                   de azeite com óleos de outra natureza .
Considerando que, actualmente, todos os azeites virgens
estão incluídos na subposição 15.07 A II a) da pauta
aduaneira comum ; que, em consequência, está fixado                A verificação da presença de azeite reesterificado ou de
                                                                   óleos de outra natureza efectua-se através dos métodos
para esses produtos um único direito nivelador; que, a
fim de permitir que o direito nivelador sobre a importa­           retomados respectivamente nos Anexos VII e VIII.
ção atinja o seu objectivo, convém fixá-lo de acordo com
os diferentes tipos de azeite virgem e, com este fim, dis­         2 . Pertencem às subposições 15.07 A I a), 15.07 A I b)
tinguir os azeites de acordo com as suas características           e 15.07 A I c) da pauta aduaneira comum os óleos que
fisioquímicas ; que, em consequência, é oportuno adaptar           têm as características indicadas nos pontos 1 , 2 e 3 do
a nomenclatura da pauta aduaneira comum ;                          Anexo I. Para a determinação das características acima
                                                                   referidas, utilizam-se os métodos descritos nos Anexos
Considerando que a nomenclatura aduaneira resultante               IV, V e VI.
da aplicação do Regulamento n? 136/66/CEE é reto­
mada na pauta aduaneira comum em anexo ao Regula­
mento (CEE) n? 950/68 (5), com a última redacção que               3 . Pertencem à subposição 15.07 A II a) da pauta
lhe foi dada pelo Regulamento (CEE) n? 874/77 (6);                 aduaneira comum os óleos que têm as características re­
                                                                   tomadas no ponto 4 do Anexo I.
Considerando que, pára assegurar o funcionamento cor­
recto do sistema de direitos niveladores aplicáveis à im­          4 . Não pertencem à subposição 15.17 A da pauta
portação de bagaços de azeitona, convém prever um mé­              aduaneira comum os produtos da subposição 15.17 que
todo único para a determinação do teor em óleo desse               tenham as características indicadas no Anexo II .
produtos ;
Considerando que o Regulamento (CEE) n? 618 /72 da                                              Artigo 2°
Comissão, de 29 de Março de 1972, relativo às caracte­
                                                                    1 . O teor em azeite dos bagaços e outros resíduos da
O   JO n? 172 de 30. 9. 1966, p. 3025/66.
                                                                   extracção de azeite da subposição 23.04 A é determinada
O   JO n? L 175 de 29. 6. 1975, p. 5 .
                                                                   em conformidade com o método que consta do
                                                                   Anexo IX.
O   JO n? 197 de 29. 10 . 1966, p. 3393/66.
(4) JO n? L 54 de 3 . 3. 1972, p. 3 .
(5) JO n? L 172 de 22. 7. 1968 , p. 1 .                            O JO n? L 78 de 31 . 3. 1972, p. 5 .
(6) JO n? L 106 de 29. 4 . 1977, p. 20.                            (8) JO n? L 333 de 30 . 12 . 1975 , p. 13 .
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2 . O teor em azeite referido no n? 1 exprime-se em                   1 . Os termos «do n? 15.07» da nota complementar 1 do
percentagem do seu peso relacionado com o da matéria                      capítulo 15 são substituídos por «da subposição
seca .                                                                    15.07 D ».
                                                                      2 . As notas complementares 2 , 3 e 4 do capítulo 15 são
                        Artigo 3 ?                                        substituídas pelas notas complementares 2, 3 e 4 que
                                                                          constam do Anexo III do presente regulamento.
A pauta aduaneira comum em -anexo ao Regulamento
(CEE) n? 950/68 passa a ter a seguinte redacção :                     3 . A subposição 15.07 A passa a ter a seguinte redacção :
                                                                                                  Taxa dos direitos
              Número da                                                                  autónomos
                                                    Descrição
                pauta                                                                    . . 0/0 .           convencionais
                                                                                     ou direito nivelador           °/o
                                                                                              (P)
                  1                                    2                                       3                     4 ·
                15.07       A. Azeite :
                                 I. Não tratado :
                                     a) Azeite virgem                                      20 (P)
                                     b) Azeite virgem iluminante                           20 (P)                   —
                                     c) Outro                                              20 (P)
                                II . Outro :
                                     a) Obtido por tratamento dos óleos das
                                        subposições 15.07 A I a) ou 15.07 A I b),
                                        mesmo traçado com azeite virgem                    20 (P)
                                     b) Não especificado                                   20 (P)                   —
                                                              Artigo 4o.
           Em todos os actos comunitários em que se faz referência às subposições 15.07 A II ou 15.07 A
           I a) e b) da pauta aduaneira comum, essas referências devem considerar-se como dizendo
           respeito, de acordo com as características do produto em causa, respectivamente às subposições
            15.07 A I a), b) e c) e 15.07 A II a) e b) da pauta aduaneira comum.
                                                              Artigo 5 ?
           É revogado o Regulamento (CEE) n? 618 /72 da Comissão.
                                                              Artigo 6?
           O presente regulamento entra em vigor no quadragésimo terceiro dia seguinte ao da sua publi­
           cação no Jornal Oficial das Comunidades Europeias.
           O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e directamente aplicável em
           todos os Estados-membros .
           Feito em Bruxelas em 18 de Maio de 1977 .
                                                                                                      Pela Comissão
                                                                                                   Finn GUNDELACH
                                                                                                      Vice-Presidente
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                                                        ANEXOS
                                                         Sumário
                                                                                                             Páginas
             ANEXO I :    Características dos azeites                                                           124
             ANEXO II :   Produtos da subposição 15.17A                                                         125
             ANEXO III :  Notas complementares 2, 3 e 4 do capítulo 15 da pauta aduaneira comum ....            125
             ANEXO IV :    I. Tratamento da amostra pelo alumínio activado                                      127
                          II. Neutralização e descoloração do azeite em laboratório                             127
             ANEXO V :    Pesquisa da presença de óleo de bagaço de azeitona nos azeites                        129
                          A. Método chamado «de Bellier»                                                        129
                          B. Método chamado «de Vizern modificado»                                              129
             ANEXO VI :   Pesquisa dos sabões pela evidenciação da alcalinidade                                 131
             ANEXO VII :  Pesquisa da presença dos óleos reesterificados                                        131
             ANEXO VIII : Pesquisa da presença de outros óleos no azeite : análise da fracção esterólica dos
                          corpos gordos                                                                         135
             ANEXO IX :   Teor em óleo de bagaço de azeitona                                                    139
 ---pagebreak--- 124                                 Jornal Oficial das Comunidades Europeias                                  03 / Fasc. 12
                                                       ANEXO I
                                        CARACTERÍSTICAS DOS AZEITES
    1 . Considera-se como azeite virgem, na acepção da subposição 15.07 A I a) da pauta aduaneira comum, o
        azeite natural obtido unicamente por processos mecânicos, incluindo a pressão, com exclusão de qual­
        quer mistura com azeite obtido de forma diferente, e que apresente as seguintes características :
        a) Um teor em ácidos gordos livres, expresso em ácido oleico, não superior a 3 % ;
        b) Um coeficiente de extinção K270 (absorvência sob uma espessura de 1 cm de uma solução a 1 g de
            óleo para 100 ml no isooctano (2.2.4 trimetilpentano) para o comprimento de onda de 270 nm) não
           superior a 0,25 e, após tratamento da amostra de óleo sobre alumina activada não superior a 0,11 ;
        c) Uma variação do coeficiente de extinção próxima de 270 nm não superior a 0,01 .
           Esta variação é definida por :
                                             A K = Km - 0,5 Km .4 + Km+4
           Km            designa o coeficiente de extinção ao comprimento de onda do máximo da curva de
                         absorção próxima de 270 nm,
           Km_4 e K^+4 designam os coeficientes de extinção aos comprimentos de onda inferior e superior em
                         4 nm ao de Km ;
        d) Reacções de Bellier e de Vizern modificada negativas, efectuadas em conformidade com os métodos
           retomados nas partes A e B do Anexo V;
        e) Uma pesquisa de sabões negativa, efectuada em conformidade com o método descrito no Anexo VI.
    2 . Considera-se como azeite virgem iluminante, na acepçãó*da subposição 15.07 A I b) da pauta aduaneira
        comum, seja qual for a sua acidez, o azeite que apresenta as seguintes características :
        a) Um coeficiente de extinção K270 superior a 0,25 e, após tratamento da amostra sobre alumina acti­
           vada não superior a 0,11 .
           Óleos que tenham um teor em ácidos gordos livres, expresso em ácido oleico, superior a 3 % podem
           ter, após passagem sobre alumina activada, um coeficiente de extinção K270 superior a 0,11 . Nesse
           caso, após neutralização e descoloração efectuadas em laboratório, em conformidade com o método
           retomado no Anexo IV, devem ter as seguintes características :
           — um coeficiente de extinção K270 não superior a 1,10,
           — uma variação do coeficiente de extinção próximo de 270 nm superior a 0,01 e não superior a
                0,16 ;
        b) Reacções de Bellier e de Vizern modificada negativas, efectuadas em conformidade com os métodos v
           retomados nas partes A e B do Anexo V;
        c) Um pesquisa dos sabões negativa, efectuada em conformidade com o método descrito no Anexo VI.
    3 . Consideram-se como pertencendo à subposição 15.07 A I c) da pauta aduaneira comum os óleos, no­
        meadamente os óleos de «bagaço de azeitona», que apresentem as seguintes características :
        a) Um teor em ácidos gordos livres, expresso em ácido oleico, superior a 3 % ;
        b) Reacções de Bellier e de Vizern modificada positivas, efectuadas em conformidade com os métodos
            retomados nas partes A e B do Anexo V ;
        c) Uma pesquisa dos sabões negativa, efectuada em conformidade com o método retomado no Anexo
           VI .
    4 . Considera-se como pertencente à subposição 15.07 A II a) da pauta aduaneira comum o azeite obtido
        por tratamento dos óleos das subposições 15.07 A I a) e 15.07 A I b), mesmo traçado com azeite
        virgem, que apresente as seguintes características :
        a) Um teor em ácidos gordos livres, expresso em ácido oleico, de 3 % no máximo ;
        b) Uma pesquisa dos sabões positiva, efectuada em conformidade com o método descrito no Anexo VI,
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                      ou :
                      — um coeficiente de extinção K270 superior a 0,25 e não superior a 1,10 e, após tratamento da
                           amostra de óleo sobre alumina activada, superior a 0,11 ,
                           e
                      — uma variação do coeficiente de extinção próxima de 270 nm superior a 0,01 e não superior
                           a 0,16 .
                      Esta variação é definida por :
                                                           A K = Km — 0,5 (Km_4 + Km+4)
                      Km              designa o coeficiente de extinção ao comprimento de onda do máximo da curva de
                                      absorção próxima de 270 nm,
                      Km_4 e Km+4 designam os coeficientes de extinção aos comprimentos de onda inferior e superior de
                                      4 nm ao de Km ;
                   c) Reacções de Bellier e de Vizern modificada negativas, efectuadas em conformidade com os métodos
                      retomados nas partes A e B do Anexo V.
                                                                 ANEXO II
                                                  PRODUTOS DA SUBPOSIÇÃO 15.17 A
               São excluídos da subposição 15.17 A :
               a) Os resíduos provenientes do tratamento das matérias gordas contendo óleo cujo índice de iodo, deter­
                   minado pelo método de Wijs sem catalisador, seja inferior a 70 ou superior a 100 ;
               b) Os resíduos provenientes do tratamento das matérias gordas contendo óleo cujo índice de iodo esteja
                   compreendido em 70 e 100, mas cuja superfície do vértice, representando o volume de retenção do
                   beta-sitosterol, determinada de harmonia com as disposições indicadas no Anexo VIII, seja menos de
                   93 % da superfície total dos vértices dos esteróis.
                                                                 ANEXO III
                   NOTAS COMPLEMENTARES 2, 3 E 4 DO CAPÍTULO 15 DA PAUTA ADUANEIRA COMUM
               2 . A. Só se considera como azeite, na acepção da subposição 15.07 A, o óleo proveniente exclusivamente
                      do tratamento das azeitonas, com exclusão do azeite reesterificado e de qualquer mistura de azeite
                      com óleos de outra natureza .
                   B. Consideram-se como azeites não tratados os óleos definidos nos pontos I, II e III seguintes.
                       I. Só se considera como azeite virgem, na acepção da subposição 15.07 A I a), o azeite natural
                           obtido exclusivamente por processos mecânicos, incluindo a pressão, com exclusão de qualquer
                           mistura com azeite obtido de forma diferente, e que apresente as seguintes características :
                           a) Um teor em ácidos gordos livres, expresso em ácido oleico, de 3 % no máximo ;
                           b) Um coeficiente de extinção K270 (absorvência sob uma espessura de 1 cm de uma solução a
                               1 g de óleo para 100 ml no isooctano (2.2.4 trimetilpentano) para o comprimento de onda de
                               270 nanómetros) não superior a 0,25 e, após tratamento da amostra de óleo sobre alumina
                               activada, não superior a 0,11 ;
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            c) Uma variação do coeficiente de extinção próxima de 270 nanómetros não superior a 0,01 .
                 Esta variação é definida por :
                                                  A K = Km — 0,5 (Krø.4 +
                 Km                designa o coeficiente de extinção ao comprimento de onda do máximo da
                                   curva de absorção próxima de 270 nanómetros,
                 Km_4 e Km+4 designam os coeficientes de extinção aos comprimentos de onda inferior e
                                   superior em 4 nanómetros ao de Km ;
            d) Reacções de Bellier e de Vizern modificada negativas ;
            e) Uma pesquisa de sabões negativa.
        II. Considera-se como azeite virgem iluminante, na acepção da subposição 15.07 A I b), seja qual
            for a sua acidez, o azeite que apresente as características seguintes :
            a) Um coeficiente de extinção K270 superior a 0,25 e, após tratamento da amostra sobre alumínio
                 activado, não superior a 0,11 . Óleos que tenham um teor em ácidos gordos livres, expresso
                 em ácido oleico, superior a 3 % podem ter, após passagem sobre alumina activada, um coefi­
                 ciente de extinção K270 superior a 0,11 . Nesse caso, após neutralização e descoloração efe­
                 ctuadas em laboratório, em conformidade com o método retomado no Anexo IV, devem ter
                 as seguintes características :
                 — um coeficiente de extinção K270 não superior a 1,10,
                 — uma variação do coeficiente de extinção próximo de 270 nm superior a 0,01 e não supe­
                     rior a 0,16 ;
            b) Reacções de Bellier e de Vizern modificada negativas ;
            c) Uma pesquisa de sabões negativa.
       III. Consideram-se como produtos da subposição 15.07 A I c) os óleos, nomeadamente os óleos de
            «bagaços de azeitona», que apresentem as seguintes características :
            a) Um teor em ácidos gordos livres, expresso em ácido oleico, superior a 3 % ;
            b) Reacções de Bellier e de Vizern modificada positivas ;
            c) Uma pesquisa de sabões negativa.
    C. Pertence à subposição 15.07 A II a) o azeite obtido por tratamento dos óleos das subposições
       15.07 Ala) e/ou 15.07 A I b), mesmo traçados com azeite virgem, que apresente as seguintes
       características :
       a) Um teor em ácidos gordos livres, expresso em ácido oleico, de 3 % no máximo ;
       b) Uma pesquisa de sabões positiva
           — um coeficiente de extinção K270 superior a 0,25 e não superior a 1,10 e, após tratamento da
                 amostra de óleo sobre alumina activada, superior a 0,11 ,
                 e
            — uma variação do coeficiente de extinção próxima de 270 nanómetros superior a 0,01 e não
                 superior a 0,16.
            Esta variação é definida por :
                                                 AK = Km - 0,5 (Km_4 + Km+4)
            Km              designa o coeficiente de extinção ao comprimento de onda do máximo da curva de
                            absorção próxima de 270,
            K.,,.4 e Km+4 designam os coeficientes de extinção aos comprimentos de onda inferior e superior
                            em 4 nanómetros ao de Km ;
       c) Reacções de Bellier e de Vizern modificada negativas.
 ---pagebreak--- 03 / Fasc . 12                                     Jornal Oficial das Comunidades Europeias                                    127
               3 . São excluídos da subposição 15.17 A :
                   a) Os resíduos provenientes do tratamento das matérias gordas contendo óleo cujo índice de iodo,
                       determinado pelo método de Wijs sem catalisador, seja inferior a 70 ou superior a 100 ;
                   b) Os resíduos provenientes do tratamento das matérias gordas contendo óleo cujo índice de iodo esteja
                       compreendido entre 70 e 100 , mas cuja superfície do vértice, representando o volume de retenção do
                       beta-sitosterol, determinada de harmonia com as disposições indicadas no Anexo VIII, seja menos de
                       93 % da superfície total dos vértices dos esteróis.
               4 . Os métodos de análise para a determinação das características dos produtos acima referidos são os
                   previstos respectivamente nos anexos do Regulamento (CEE) n? 1058 /77 .
                                                                     ANEXO IV
                I. TRATAMENTO DA AMOSTRA PELA ALUMINA ACTIVADA
                   1 . Introduzir 30 g de alumina básica, obtida de acordo com o processo descrito no n? 2, numa coluna
                       de cromatografia com cerca de 35 mm de diâmetro e de 450 mm de comprimento, munida de um
                       tubo de escoamento com cerca de 10 mm de diâmetro .
                       Comprimir mecanicamente a alumina, deixando cair lentamente a coluna mantida na vertical, de
                       forma repetida, sobre uma superfície de madeira. Introduzir, na coluna preparada deste modo,
                       100 ml de uma solução a 10 % de óleo no hexano.
                       Recolher o eluato e evaporar o solvente no vácuo a uma temperatura inferior a 25 °C.
                       Sobre o óleo obtido desta forma, deve fazer-se imediatamente a determinação do coeficiente de
                       extinção a 270 nm.
                   2 . Obtém-se a alumina básica de actividade Brockmann I (0 % de água) aquecendo durante três horas
                       a 380-400 °C alumina básica (para cromatografia) com uma granulometria compreendida entre
                       30 jxm e 130 um (80 um de média). A 100 g deste produto, adicionar 5 ml de água destilada para
                       obter alumina básica de uma actividade Brockmann compreendida entre II e III. Agitar frequente­
                       mente e deixar repousar durante uma noite num recipiente hermeticamente fechado.
                       Verificação da actividade da alumina
                       Introduzir 30 g de alumina básica (obtida da forma acima indicada) numa coluna para cromatografia
                       com cerca de 35 mm de diâmetro e 450 mm de comprimento, fazer passar nessa coluna, nas condi­
                       ções especificadas pelo método, uma mistura de 95 % de azeite virgem com um coeficiente de extin­
                       ção K27 O inferior a 0, 1 8 e de 5 °/o de um óleo de amendoim tratado aquando da refinação pelas terras
                       descolorantes e com um coeficiente de extinção K270 não inferior a 4. Se a mistura apresentar um
                       coeficiente de extinção superior a 0,11 , a alumina é aceitável. Se a eluição dos treines conjugados
                       sobre essa alumina não se produzir, é necessário utilizar uma alumina mais hidratada, após se ter
                       verificado se satisfaz as exigências do teste anterior.
               II. NEUTRALIZAÇÃO E DESCOLORAÇÃO DO AZEITE EM LABORATÓRIO
                   A. NEUTRALIZAÇÃO DO ÓLEO
                        1 . Aparelhagem
                            — copo de 300 ml de forma alta,
                            — centrifugadora de laboratório com tubos de 100 ml,
                            — copo de 250 ml,
                            — balões de 100 ml ,
                            — frasco para decantar de 1 litro.
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       2 . Reagentes
           —   solução aquosa de hidróxido de sódio a 12 % ,
           —   solução etanólica a 1 % de fenolftaleína,
           —   hexano puro para análise,
           —   álcool isopropílico puro para análise.
       3 . Modo operatório
           a) Óleos de acidez expressa em ácido oleico inferior a 30 %
              Introduzir, num copo de 300 ml de forma alta, 50 g de óleo bruto e aquecer a 65 °C em
              banho-maria. Agitando lentamente, acrescentar uma quantidade de solução de hidróxido de
              sódio a 12 % correspondente à acidez livre do óleo, com um excesso de 5 % . Continuar a
              agitar durante cinco minutos, mantendo a temperatura a 65 °C.
              Transferir o conjunto para tubos centrifugadores de 100 ml, separar a pasta saponária por
              centrifugagem. Verter o óleo decantado para um copo de 250 ml e lavar com 50-60 ml de
              água destilada a ferver eliminando a camada aquosa com a ajuda de um sifão. Repetir as
              lavagens até à eliminação completa dos vestígios do sabão residual (desaparecimento da colo­
              ração rosa com fenolftaleína).
              Centrifugar o óleo para eliminar as pequenas quantidades de água residual.
           b) Óleos com acidez expressa em ácido oleico superior a 30 %
              Introduzir, num frasco de decantar de 1 litro, 50 g de óleo bruto, 200 ml de hexano, 100 ml
              de álcool isopropílico e uma quantidade de solução de hidróxido de sódio a 12 °/o correspon­
              dente à acidez livre do óleo, com um excesso de 0,3 % . Agitar energicamente durante um
              minuto. Acrescentar 100 ml de água destilada, agitar de novo e deixar repousar.
              Após separação das camadas, deixar escoar a camada inferior que contém os sabões . Entre as
              duas camadas (oleosa por cima e aquosa por baixo) forma-se muitas vezes uma camada inter­
              média constituída por mucilagens e substâncias insolúveis que deve ser igualmente eliminada.
              Proceder em seguida à lavagem da solução hexânica de óleo neutro com porções de 50-60 ml
              de uma solução de álcool isopropílico/água destilada 1 / 1 (v/v) até ao desaparecimento da
              coloração rosa com fenolftaleína. Proceder em seguida à eliminação completa do hexano por
              destilação no vácuo (por exemplo, pelo evaporador rotativo).
    B. DESCOLORAÇÃO DO ÓLEO NEUTRALIZADO
       1 . Aparelhagem
           — balão de 250 ml com 3 bocas polidas que permita inserir :
               a) um termómetro graduado em graus e que permita fazer leituras até 90 ° C ;
               b) um agitador mecânico que gire a 250-300 voltas por minuto equipado para o funciona­
                    mento no vácuo ;
               c) uma ligação com a bomba de v4cuo,
           — bomba de vácuo, munida de um manómetro, capaz de dar pressões residuais de 15-30 miliba­
               res .
       2 . Modo operatório
           Pesar no balão de 3 bocas cerca de 100 g de óleo neutralizado. Inserir o termómetro e o agita­
           dor, ligar à bomba de vácuo e aquecer até 90 °C agitando.
           Manter esta temperatura, continuando a agitar, até que o óleo a analisar esteja totalmente livre
           de humidade (cerca de trinta minutos).
           Interromper então a vácuo e acrescentar 2 a 3 g de terra activada. Restabelecer o vácuo até à
           obtenção de uma pressão residual de 15-30 milibares e, ainda a uma temperatura de 90 °C, agitar
           durante trinta minutos a cerca de 250 voltas por minuto.
           Em seguida, filtrar a quente numa estufa termostática (50-60 °C)
 ---pagebreak--- 03 / Fasc . 12                                Jornal Oficial das Comunidades Europeias                                    129
                                                               ANEXO V
                        PESQUISA DA PRESENÇA DE ÓLEO DE BAGAÇOS DE AZEITONA NOS AZEITES
               A. MÉTODO DITO DE BELLIER
                  1 . Material
                      — balão de 100 ml, munido de um refrigerante com refluxo,
                      — pipeta de 5 ml graduada em décimos,
                      — sistema de aquecimento que permita atingir a temperatura de cerca de 80 °C,
                      — termómetro de 15 a 60 °C .
                  2 . Reagentes
                      — solução hidro-alcoólica de potássio (42,5 g de KOH dissolvidos em 72 ml de água destilada,
                          sendo o volume completado até 500 ml com álcool etílico a 95 ° ),
                      — solução de álcool etílico com uma graduação de 70 ° ,
                      — solução aquosa de ácido acético 1+2 (em volume), ajustada de forma a que 1,5 ml neutralizem
                          exactamente 5 ml da solução hidro-alcoólica de hidróxido de potássio em presença de fenolfta­
                          leína .
                  3 . Preparação da amostra
                      O óleo é privado de água por decantação e filtragem sobre papel efectuadas a uma temperatura
                      ligeiramente superior ao ponto de fusão de certos constituintes concretos que se tenham separado da
                      matéria gorda fluida.
                  4. Modo operatório
                      Introduzir no balão cerca de 1 ml de óleo preparado como se indica no n? 3 . Acrescentar 5 ml de
                      solução hidro-alcoólica de potássio. Adaptar o refrigerante com refluxo e levar à ebulição durante
                      dez minutos agitando de vez em quando. Deixar arrefecer até à temperatura ambiente. Acrescentar
                      1,5 ml de solução aquosa de ácido acético e 50 ml de solução de álcool etílico previamente levada à
                      temperatura de 50 °C. Misturar por agitação, introduzir o termómetro e deixar arrefecer, obser­
                      vando o aspecto da solução assim que ela atingir a temperatura de 45 °C. Se se formar um precipi­
                      tado flocoso a uma temperatura superior a 40 °C, a reacção é positiva. Na ausência de um precipi­
                      tado flocoso caracterizado, manter o líquido à temperatura ambiente, que deve estar compreendida
                      entre 20 e 22 °C durante pelo menos vinte e quatro horas, e se necessário durante quarenta e oito
                      horas. Observar de novo a solução : a formação de um precipitado flocoso em suspensão no meio do
                      líquido indica igualmente que a reacção é positiva.
                  Expressão dos resultados
                  Pesquisa do óleo de bagaços (método de Bellier) positiva ou negativa.
               B. MÉTODO DITO DE VIZERN MODIFICADO
                  O insaponificável do óleo a analisar é isolado e o seu comportamento em solução no álcool a 85 ° é
                  estudado em certas condições.
                  1 . Material
                      — balões de 300 ml de vidro resistente aos alcalinos e munido de um refrigerante de refluxo,
                      — frascos de decantação de 500 ml ou de 1 000 ml,
                      — copos de 300 ml e de 250 ml,
                      — proveta de vidro.
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    2 . Reagentes
        — solução alcoólica de hidróxido de potássio 2N,
        — éter de petróleo,
        — álcool etílico a 50 % ,
        — álcool etílico a 96 % medido com o alcoómetro,
        — água oxigenada a 10 volumes,
        — álcool etílico a 85 % medido com o alcoómetro.
    3 . Modo operatório
        Pesar cerca de 5 g da amostra a analisar num balão de 300 ml. Acrescentar 50 ml da solução alcoó­
        lica de hidróxido de potássio 2N. Instalar o refrigerante de refluxo e levar a uma ligeira ebulição.
        Agitar após uma hora de aquecimento, arrefecer a 30-35 °C e verter para um frasco de decantação
        utilizando 50 ml de água destilada.
        Lavar cuidadosamente o balão com 50 ml de éter de petróleo, repetir a operação várias vezes. Verter
        o éter de petróleo para um frasco de decantação. Agitar energicamente o conteúdo pouco mais de
        um minuto. Após decantação, eliminar a fase aquosa vertendo-a para outro frasco de decantação.
        Acrescentar mais 50 ml de éter de petróleo, agitar energicamente o conteúdo durante pouco mais de
        um minuto e deixar decantar. A fase aquosa é vertida para um terceiro frasco de decantação à qual
        se acrescentam mais 50 ml de éter de petróleo. Agitar em seguida energicamente e deixar decantar.
        Recolher num frasco de decantação os extractos etéreos provenientes das diferentes extracções do
        insaponificável e lavar pelo menos três vezes com álcool a 50 % (50 ml de cada vez) até que o
        líquido de lavagem já não dê reacção alcalina à fenolftaleína.
        Filtrar a solução do insaponificável para um copo de 300 ml, lavar o filtro com éter de petróleo e
        eliminar o solvente por destilação. Acrescentar 10 ml de álcool a 96 ° e após aquecimento moderado
        (cerca de 40 °C), filtrar para um copo de 100 ml. Lavar o copo de 300 ml com 10 ml de álcool a
        96 ° e em seguida filtrar para o segundo copo.
        No copo de 100 ml que contêm os extractos alcoólicos do insaponificável, acrescentar 5 ml de água
        oxigenada a 10 volumes, aquecer em banho-maria até à evaporação completa. Acrescentar ainda
        20 ml de álcool a 96 ° e 5 ml de álcool a 96° e 5 ml de água axigenada ; deixar evaporar de novo
        completamente.
        Retirar o copo do banho-maria e acrescentar 20 ml de álcool a 85 Aquecer prudentemente em
        banho-maria tendo muito cuidado em não provocar perdas de álcool para não diminuir a concentra­
        ção. Trata-se de um elemento muito importante que não se deve negligenciar.
        Filtrar em papel, arrefecer e axaminar o comportamento da solução ao fim de uma hora, e depois de
        quatro horas. Se, ao fim de uma hora, a solução estiver absolutamente transparente, a análise é
        negativa, o que .quer dizer que não há óleo de bagaços.
        Se, ao fim de uma hora, a solução estiver turva, repetir a observação quatro horas depois.
        Se, ao fim de quatro horas, a solução ainda estiver turva, mas não apresentar flocos, a análise conti­
        nua a ser negativa. Em contrapartida, se se observar a formação de flocos, a análise é positiva e
        encontramo-nos em presença de óleo de bagaços.
    Expressão dos resultados
    Pesquisa de óleo de bagaços (método de Vizern modificado) : positiva ou negativa.
    Observações
    Os azeites dão uma solução transparente ou no máximo ligeiramente opalina durante todo o ensaio. Os
    óleos de bagaços puros ou misturados apresentam flocos característicos que ficam em suspensão como
    pequenas nuvens e que acabam por se depositar ao fim de várias horas de repouso.
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                                                               ANEXO VI
                              PESQUISA DOS SABÕES PELA EVIDENCIAÇAO DA ALCALINIDADE
              Princípio do método
              Evidenciação dos sabões alcalinos pela acção sobre o azul de bromofenol.
              Reagentes
              — solução a 0,1 % de azul de bromofenol no etanol a 96 % (v/v),
              — acetona acabada de destilar, adicionada de 2 % água (v/v).
              A acetona a 2 % de água deve apresentar uma coloração amarela ou amarelo esverdeado em presença de
              algumas gotas da solução de azul de bromofenol.
              Material
              Tubo de ensaio de 150 mm x 15 mm .
              Modo operatório
              Introduzir no tubo de ensaio 10 ml de acetona e 1 gota de solução de bromofenol. A solução deveria ficar
              amarela. Senão, enxaguar o tubo e a rolha com acetona até ao desaparecimento da coloração azul. Intro­
              duzir 10 g de óleo no tubo, obturar com uma rolha limpa, agitar e deixar repousar. Se a camada superior
              de acetona ficar azulada, significa a presença de sabão.
              Expressão dos resultados
              Os resultados são expressos como positivos ou negativos .
                                                              ANEXO VII
                                   PESQUISA DA PRESENÇA DE ÓLEOS REESTERIFICADOS
              Este método tem por finalidade determinar, nos óleos e nas gorduras, a composição da fracção dos ácidos
              gordos que são esterificados na posição 2 (posição B, ou posição interna) do glicerol, contendo os azeites
              reesterificados mais ácido palmítico na posição B do que os azeites não reesterificados.
              Princípio
              Este método baseia-se na hidrólise parcial e específica dos triglicéridos pela lipase pancreática com forma­
              ção preferencial de mono-2 glicéridos. Esta hidrólise leva a uma mistura composta, para além de triglicéri­
              dos não hidrolisados, dos diglicéridos, dos mono-2 glicéridos e dos ácidos gordos livres. Essa mistura é
              fraccionada por cromatografia numa camada fina e os monoglicéridos são isolados. Esses monoglicéridos
              são metanolizados, e os esteres metílicos obtidos são analisados por cromatografia em fase gasosa.
              O produto analisado deve ser considerado como tendo-lhe sido acrescentado óleo reesterificado quando a
              percentagem de ácido palmítico verificado na posição 2 dos triglicéridos é superior a 2 % .
              1.   Material
                   — frasco de decantar de 500 ml,
                   — coluna de vidro para cromatografia de 13 mm de diâmetro interior e de 400 mm de comprimento,
                        equipada com uma placa de vidro calcinado e uma torneira,
                   — balão de 250 ml de boca larga,
                   — balão de 100 ml ,
                   — tubo de centrifugadora de 1 0 ml, com rolha polida,
                   — seringa hipodérmica de 1 ml, equipada com uma agulha fina,
                   — balão de 25 ml, com refrigerante de ar com cerca de 1 m de comprimento com um apel de ligação
                       polido,
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           —   copo de 50 ml,
           —   boreta de 5 ml, graduada em 1 /20 ml,
           —   expositor para cromatografia em camada fina, com placas dè vidro de 20 x 20 cm,
          —    micro-seringa que deite gotas de 3-4 jxl,
          —   tina de revelação para cromatografia em camada fina,
          —    evaporador rotativo,
          —   estufa regulável a 103 °C ± 2° C,
          —   termostato regulável entre 30 °C e 45 °C a ± 0,5 °C,
          —   agitador eléctrico vibrante que permita uma agitação enérgica do tubo da centrifugadora,
          —   pulverisador para cromatografia em camada fina,
          —   lâmpada ultravioleta para o exame das placas cromatográficas,
          —   agitador de laboratório, de tipo adequado para a dispersão e a mistura de materiais heterogéneos,
          — pH-metro,
          — agitador a hélice
          — cronometro .
    2.    Reagentes
          —   solução aquosa de hidróxido de sódio a 12 % (m/v),
          —   solução a 1 % (m/v) de fenolftaleína no etanol a 95 % (v/v),
          —   óxido dietílico, isento de peróxidos,
          —   álcool isopropílico, ou álcool etílico a 95 % (v/v), para análises,
          —   alumina activada para cromatografia neutra, com um grau de actividade Brockmann I, recente­
              mente activada durante duas horas a 260 °C e conservada num dessecador,
          —   hexano ou, na sua ausência, éter de petróleo (Eb = 30-50 °C), para cromatografia,
          —   ácido fórmico al 98 % (m/m) no mínimo,
          —   lipase pancreática com uma actividade conveniente (nota 1 , nota 2),
          —   solução tampão : solução aquosa 1 M de tris-hydroximetil-aminometano levado a pH 8 pelo ácido
              clorídrico 6 N (controlo potenciométrico)
          — solução aquosa a 0,1 % (m/v) de colato de sódio (qualidade enzimática),
          — solução de ácido clorídrico 6 N,
          — solvente de ampliação : hexano (ou, na sua ausência, éter de petróleo)/óxido dietílico/ácido fór­
              mico 70/30/ 1 (v/v/v),
          — solução aquosa de goma arábica a 10 % (m/v)
          — solução aquosa de cloreto de cálcio (CAC12) a 22 % (m/v),
          — solução alcoólica a 0,2 % (m/v) de dicloro-2'-7' fluoresceína, ligeiramente alcalinizado por adição
              de uma gota de hidróxido de sódio IN por 100 ml,
          — sílica em pó, com aglomerante, com qualidade para cromatografia em camada fina,
          — solução aquosa de colato de colato de sódio a 20 % (m/v),
          — solução aquosa de hidróxido de sódio 0,1 N,
          — óleo vegetal neutralizado.
    3.    Preparação da amostra
          Amostra com tima acidez inferior a 3 °/o : neutralização directa sobre alumina de acordo com 3.2 .
          Amostra de actividade superior a 3 % : neutralização pelos alcalis em presença de solvente de acordo
          com 3.1 , e depois passagem sobre alumina de acordo com 3.2 .
    3.1 . Neutralização pelos alcalis em presença de solvente
          Verter para um frasco de decantar de 500 ml cerca de 10 g de óleo bruto, 100 ml de hexano ou, na
          sua ausência, de éter de petróleo, 50 ml de álcool isopropílico ou de álcool etílico a 95° , algumas
          gotas da solução de fenolftaleína e uma quantidade da solução de hidróxido de sódio a 12 % corres­
          pondente à acidez livre do óleo, mais um excedente de 0,3 % . Agitar energicamente durante um
          minuto ; acrescentar 50 ml de água destilada, agitar de novo e deixar repousar.
          Após decantação, eliminar a camada inferior que contém os sabões . Eliminar as eventuais camadas
          intermédias (mucilagens e substâncias insolúveis), lavar a solução hexânica do óleo neutralizado com
          porções sucessivas 25 ou 30 ml de uma solução de álcool isopropílico, ou etílico, e de água destilada
          1-1 (v/v) até ao desaparecimento da coloração rosada da fenolftaleína.
          Eliminar a maior parte do hexano por destilação no vácuo, e secar o óleo a 30-40 °C no vácuo com a
          ajuda de uma corrente de azoto puro até à eliminação total do solvente.
 ---pagebreak--- 03 /Fasc . 12                                   Jornal Oficial das Comunidades Europeias                                     133
              3.2 . Passagem sobre alumina
                    Preparar uma suspensão de 15 g de alumina activada em 50 ml de hexano ou, na sua ausência, de éter
                    de petróleo, e verter, agitando, para uma coluna de vidro para cromatografia. Regularizar a repartição
                    de alumina e deixar correr o selvente até 1-2 mm acima do nível superior do absorvente. Verter
                    cuidadosamente para a coluna uma solução preparada cerca de quinze minutos antes por dissolução
                    de 5 g de óleo em 25 ml de hexano ou, na sua ausência, de éter de petróleo, e recolher a totalidade do
                    líquido que sai da coluna para um balão de 100 ml .
                    Eliminar a maior parte do solvente por destilação no vácuo, depois secar o óleo a 30-40 °C no vácuo
                    com a ajuda de uma corrente de azoto puro até à eliminação total do solvente.
              4.    Preparação das cromatoplacas
                    Colocar, num balão de 250 ml de boca larga, 30 g de sílica em pó com aglomerante e 60 ml de água
                    destilada, e agitar até obter uma papa bastante homogénea. Desgaseificar mantendo sob o vácuo da
                    bomba injectora de água durante um minuto.
                    Espalhar nas condições normais a papa sobre as placas com a espátula regulando a espessura da ca­
                    mada a 0,25 mm .
                    A quantidade de papa acima referida é suficiente para a preparação de 5 placas 20 x 20 cm.
                    Deixar secar as placas ao ar durante cerca de quinze minutos e, em seguida, secá-las numa estufa a
                    103 °C ± 2°C durante duas horas .
                    Conservar as placas assim preparadas num dessecador.
              5.    Modo operatório
              5.1 . Hidrólise pela lipase pancreática
                    Pesar, no tubo da centrifugadora de cerca de 10 ml, 0,1 g da amostra preparada.
                    Acrescentar 20 mg de lipase e 2 ml de solução tampão. Agitar cuidadosamente e com precaução,
                    depois acrescentar 0,5 ml da solução de colato de sódio a 0,1 % e 0,2 ml da solução de cloreto de
                    cálcio. Fechar o tubo com a rolha polida, agitar com cuidado (evitando molhar a rolha) e pôr imedia­
                    tamente o tubo no termostato, regulado a 40 °C ± 0,5 °C agitando exactamente durante 1 minuto.
                    Retirar o tubo do termostato e agitar energicamente durante exactamente dois minutos.
                    Arrefecer imediatamente sob uma corrente de água ; acrescentar 1 ml de ácido clorídrico 6 N e 1 ml
                    de óxido dietílico. Tapar e agitar energicamente. Deixar repousar e retirar a fase orgânica superior
                    com a ajuda de uma seringa.
              5.2 . Separação dos monoglicéridos por cromatografia em camada fina
                    Depositar o extracto sobre a placa cromatográfica a cerca de 1,5 cm da borda inferior em linha
                    contínua e uniforme a fim de obter uma linha de partida o mais fina possível.
                    Introduzir a placa na tina de revelação bem saturada e revelar com o solvente de revelação até cerca
                    de 1 cm da borda superior. A revelação da placa deve fazer-se à temperatura de cerca de 20 °C.
                    Secar a placa ao ar à temperatura da tina e pulverizar a solução com dicloro-2'-7' fluoresceína. Delimi­
                    tar a faixa dos monoglicéridos (Rf = 0,035 mais ou menos) sob uma luz ultravioleta, recuperá-los
                    com a ajuda de uma espátula metálica (evitando retirar os componentes que ficaram na linha de
                    partida) e recolher a sílica no balão de metilaçâo de 25 ml.
                    Transformar os monoglicéridos em esteres metílicos, tratando directamente nas condições do método
                    geral de preparação dos metiles esteres dos ácidos ordos indicados no ponto 7.3 a sílica anteriormente
                    recolhida, depois proceder à cromatografia em fase gasosa dos esteres de acordo com o método indi­
                    cado no ponto 7.4.
                    Determinar na mesma amostra a composição dos ácidos gordos totais, cuja comparação com a dos
                    ácidos gordos na posição 2 é útil para a interpretação dos resultados obtidos.
              6.    Expressão dos resultados
                    Calcular a composição dos ácidos gordos na posição 2 em % com um número decimal (nota 3).
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     7.     Notas
     7.1 . Controlo da actividade lipásica
           Preparar uma emulsão de óleo agitando, num misturado adequado durante cerca de 10 minutos, uma
           mistura constituída por 165 ml da solução de goma arábica a 10 % , 15 g de gelo picado e 20 ml de
           um óleo previamente neutralizado.
           Num copo de 50 ml, pôr sucessivamente 10 ml da emulsão acima referida, 0,3 ml de solução de colato
           de sódio a 20 % e 20 ml de água destilada.
           Colocar o copo num termostato regulado a 37 °C ± 0,5 °C e introduzir no copo os eléctrodos de um
          •pH-metro e um agitador de hélice.
           Com uma boreta de 5 ml, acrescentar gota a gota uma solução de hidróxido de sódio 0,1 N até à
           obtenção de um pH de 8,5 .
           Acrescentar um volume adequado de uma suspensão de pó de lipase na água (ver adiante). Quando o
           pH-metro indicar um pH de 8,3 , pôr o cronometro em funcionamento e acrescentar a solução de
           hidróxido de sódio 0,1 N ao ritmo necessário para manter o pH no valor de 8,3 . Anotar todos os
           minutos o volume de solução alcalina consumido.
           Registar os dados obtidos num esquema de eixos de coordenadas, indicando em abcissas os tempos e
           em ordenadas os ml de solução alcalina consumida para manter o pH constante. Deve obter-se um
           gráfico linear.
           A suspensão de lipase referida no parágrafo precedente é uma suspensão a 1 % em peso na água.
           Tomar para cada ensaio a quantidade necessária dessa suspensão para que, em cerca de quatro ou
           cinco minutos, seja consumido 1 ml de solução alcalina. Normalmente, este resultado obtém-se com 1
           a 5 mg de pó.
           A unidade lipase é definida como a quantidade de enzima que liberta 10 micro-equivalentes de ácido
           por minuto.
           Actividade A do pó utilizado, medida em unidade lipase por mg :
                                                          .   V x 10
                                                         A =
                                                                 m
           V = número de ml de solução de hidróxido de sódio 0,1 N por minuto, calculado a partir do grá­
                  fico,
           m = massa da amostra de pó tomada para análise, em mg.
           A lipase utilizada deve ter uma actividade compreendida entre 0,8 e 2 unidades lipase por mg.
    7.2. Preparação da lipase
           Existem no comércio lipases com uma actividade lipásica satisfatória. É igualmente possível prepará-la
           no laboratório da seguinte forma :
           Arrefecer a 0 °C 5 kg de pâncreas fresco de porco, limpos da gordura sólida e do tecido conjuntivo
           que os envolve, e triturá-los numa trituradora para obter uma pasta fluida. Agitar essa pasta a frio
           durante quatro a seis horas com 2,5 1 de acetona anidra, depois centrifugar: Extrair o resíduo mais três
           vezes com o mesmo volume de acetona, duas vezes com uma mistura acetona-óxido dietílico 1 / 1
           (v/v), e duas vezes com óxido dietílico.
           Secar o resíduo durante quarenta e oito horas no vácuo para obter um pó estável que deve ser conser­
           vado no refrigerador.
    7.3 . Preparação dos esteres metílicos de ácidos gordos
           De acordo com o método descrito no ponto II do Anexo VI do Regulamento (CEE) n? 72/77 da
           Comissão, de 13 de Janeiro de 1977, que altera o Regulamento (CEE) n? 1470/68 relativo à colheita e
           à redução das amostras bem como à determinação do teor em óleo, em impurezas e em humidade das
           sementes oleaginosas (*).
    7.4 . Cromatografia em fase gasosa dos esteres metílicos de ácidos gordos
           De acordo com o método descrito no ponto III do Anexo VI do Regulamento (CEE) n? 72 /77 .
    (') JO n? L 12 de 15 . 1 . 1977, p. 11 .
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                                                               ANEXO VIII
              PESQUISA DA PRESENÇA DE OUTROS ÓLEOS NO AZEITE : ANALISE DA FRACÇAO ESTERÓ­
                                                       LICA DOS CORPOS GORDOS
              Princípio
              Análise por cromatografia em fase gasosa dos esteróis preparados por cromatografia sobre camadas finas a
              partir do insaponificável seco com precaução.
              Aparelhagem
              1 . Aparelhagem para a cromatografia sobre camada fina, compreendendo em particular quatro placas de
                   vidro de 20 x 20 x 0,4 cm, duas de 20 x 5 x 0,4 cm e uma micro-seringa de 0,1 ml,
              2 . Copo de laboratório de 50 ml,
              3 . Filtros porosos, porosidade 3, diâmetro 15 mm,
              4 . Balão de 100 ml,
              5 . Proveta de centrifugadora, de fundo cónico, de 10 ml, munida de uma rolha polida,
              6. Pipetas graduadas de 1 ml,
              7. Aparelho de cromatografia em fase gasosa, equipado com um detector de ionização de chama com um
                   injector de prata ou de vidro ou sistema de injecção directa na coluna e ligado a um registador,
              8 . Coluna de cromatografia em fase gasosa, de vidro ou aço inoxidável em U ou espiral, de 1 a 2 m de
                   comprimento e 3 a 4 mm de diâmetro interior, fase estacionária de goma de silicone [tipo metil (')]
                   estável até pelo menos 300 °C, impregnando a uma taxa de 2 a 4 % uma terra de diátomes calcinada,
                   lavada com ácidos e silanizada, com granulometria 80/ 100 ou 100 / 120 mesh,
                   Observação : Como certos tipos de aço inoxidável podem provocar resultados erróneos por deterioração
                   de esteróis , recomenda-se o vidro .
              9 . Micro-seringa que possa fornecer doses que atinjam 5 ou 10 |ii
              Reagentes
                1 . Cloroformo para cromatografia,
                2 . Benzeno para cromatografia,
                3 . Heptano,
                4 . Gel de sílica (por exemplo Kieselgel G),
                5 . Solução de referência para a cromatografia sobre placa constituída de colesterol a 5 % no cloroformo,
                6. Acetona para cromatografia,
                7. Solução a 0,1 % no álcool etílico absoluto de sal sódico de 2'7' diclorofluoresceína,
                8 . Piridina,
                9 . Hexametildisilazana,
              10 . Trimetil clorosilane,
              11 . Solução para o teste de sensibilidade : 1 mg de colesterol por ml de n-pentano,
              12 . Solução para o teste da resolução dos vértices : 0,9 mg de fitosteróis de óleo de colza e 0,1 mg de
                    colesterol por ml de n-pentano. Os esteróis devem ser acabados de preparar de acordo com o procedi­
                    mento descrito na parte B do modo operatório,
              13 . Solução para o teste de referência : 1 mg de fitosteróis de óleo de girassol por ml de n-pentano, aca­
                    bado de preparar como se descreve na parte B do modo operatório.
              Preparação das placas para cromatografia
              Colocar em ordem, sobre o mostrador, uma placa 20 x 5 x 0,4 cm, quatro placas 20 x 20 x 0,4 cm e
              uma placa 20 x 5 x 0,4 cm.
              (') Por exemplo SE 30 .
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    Colocar, num balão de 500 ml de boca larga, 40 g de gel de sílica e cerca de 80 ml de água. Agitar com
    uma varinha de vidro, eventualmente com um agitador mecânico de vidro até se obter uma suspensão
    homogénea. Eliminar os gases eventuais fazendo o vácuo com a ajuda de uma bomba injectora de água
    durante um minuto pelo menos . Colocar em seguida a suspensão sobre o mostrador, regulando a espessura
    a 0,5 mm e cobrir uniformemente as placas. Deixar secar as placas ao ar durante cerca de quinze minutos e
    secar em seguida numa estufa a 105 °C durante duas horas. Conservar as placas assim preparadas num
    dessecador no vácuo .
                                              MODO OPERATORIO
    A. Preparação do insaponificável
        Introdução
        Designam-se pelo nome de insaponificável as substâncias solúveis na matéria gorda, que, após saponifi­
        cação, são insolúveis na água e solúveis no solvente utilizado para a dosagem. Compreende os consti­
        tuintes naturais das matérias gordas (esteróis, álcoois, hidrocarboretos), bem como as substâncias orgâ­
        nicas não voláteis a 100 °C (óleos minerais) estranhas às matérias gordas que podem eventualmente
        conter. Como solvente, utiliza-se o éter de petróleo ou então o óxido de etil. É preciso ter em conside­
        ração que os resultados com os dois solventes são, na maioria dos casos, diferentes e que se encontram
        teores em % mais elevadas com o óxido de etil. Para o azeite, tendo em conta as condições climáticas
        em que se encontra a maioria dos laboratórios de análises, o éter de petróleo foi reconhecido como o
        solvente a empregar.
        Método com éter de petróleo
        Material
       — balão de cerca de 150 ml que possa ser adaptado a um refrigerante de refluxo,
       — frascos de decantação de cerca de 500 ml,
       — estufa regulada a 103 °C ± 2 o C.
        Reagentes
       — solução etanólica de KOH cerca de 2 N no etanol a 95 % (v/v). O reagente não deverá ser mais
            escuro do que a cor amarela da palha nova,
       — éter de petróleo que destile entre 40 e 60 °C, que possua um índice de bromo inferior a 1 , isento de
            resíduo .
        Modo operatório
        Pesar exactamente com uma diferença de 0,01 g cerca de 5 g de matéria gorda no balão. Acrescentar
        50 ml da solução etanólica de KOH cerca de 2 N. Adaptar ao refrigerante de refluxo. Aquecer durante
        uma hora por meio de ebulição ligeira. Parar o aquecimento. Acrescentar pela parte de cima do refrige­
        rante cerca de 50 ml de água destilada e agitar.
        Verter após arrefecimento para um frasco de decantação e enxaguar o balão várias vezes, com cerca de
        50 ml de éter de petróleo no total.
        Agitar energicamente durante um minuto.
        Deixar repousar até separação completa de duas fases e recolher a solução saponária num outro frasco
        de decantação. Se se formar, por excepção, uma emulsão, destruí-la por adição de pequenas quantida­
        des de etanol ou de solução concentrada de hidróxido de potássio.
        Retirar a extracção de solução saponária mais duas vezes com cerca de 50 ml de éter de petróleo de
        cada vez .
        Reunir as 3 fracções etéreas num mesmo frasco, lavá-las três vezes com cerca de 50 ml de etanol a
        50 % (v/v).
        Pela parte de cima do frasco, verter, por várias vezjss se necessário, quantitativamente a solução de éter
        de petróleo num balão de 250 ml graduado (efectuando pequenas enxaguadelas do frasco com éter de
        petróleo).
        O solvente elimina-se aquecendo-se prudentemente no vácuo, os resíduos secam-se a uma temperatura
        inferior a 50 °C no vácuo, a fim de evitar oxidações indesejáveis.
 ---pagebreak--- 03 / Fasc. 12                                  Jornal Oficial das Comunidades Europeias                                    137
              B. Separação da fracção esterólica por cromatografia sobre camada fina
                 Introduzir na tina de amplição a mistura heptano n/acetona 85/ 15 ou benzol/acetona 95/5 (v/v) até à
                 altura de cerca de 1 cm ; fechar com a tampa e deixar repousar durante pelo menos três horas de forma
                 a que o equilíbrio líquido/vapor se estabeleça. Aconselha-se igualmente fixar nas superfícies interiores
                 da câmara tiras de papel filtro que mergulhem no éluente. Esta precaução oferece a vantagem de redu­
                 zir de cerca de um terço a duração de migração da face do líquido e de fazer eluir os componentes de
                 forma mais uniforme .
                 Preparar entretanto uma solução a 5 % de insaponificável extraído com éter de petróleo no cloroformo.
                 Recolher aproximadamente 0,3 ml desta solução e depositá-la com a micro-seringa de 0,1 ml sobre a
                 placa cromatográfica a cerca de 1,5 cm do bordo inferior, em faixa contínua e uniforme de forma a
                 obter uma linha de partida o mais fina possível. De acordo com a técnica habitual, depositar numa
                 extremidade da placa alguns ml da solução de referência que contém colesterol a fim de identificar o Rf
                 da fracção esterólica.
                 Colocar a placa na tina de ampliação preparada da forma acima indicada. A temperatura ambiente deve
                 ser de 20 °C aproximadamente. Fechar com a tampa e ampliar até que a face do solvente tenha chegado
                 a cerca de 1 cm do bordo superior da placa. Retirar a placa da câmera de ampliação e deixar evaporar o
                 solvente numa corrente de azoto quente.
                 Revelar vaporizando uniformemente e,com cuidado a solução alcoólica de sal sódico da 2'T dicloro­
                 fluoresceína sobre a placa. Examinando a placa à ultravioleta, determina-se a posição dos esteróis gra­
                 ças ao alinhamento com a mancha de colesterol proveniente da solução de referência. Recuperar ras­
                 pando com uma espátula metálica a faixa de esteróis. Introduzir o gel de sílica separado num copo de
                 50 ml com 15 ml de cloroformo quente, agitar e verter a totalidade de gel de sílica para um filtro
                 poroso e filtrar.
                 Lavar três vezes o filtro de cada vez com uma porção de 15 ml de cloroformo quente, recolhendo o
                 filtrado num balão de 100 ml .
                 Evaporar a solução clorofórmica até 4 a 5 ml e vertê-la na proveta para centrifugadora munida de uma
                 rolha polida, previamente pesada. Secar, evaporando o solvente através de um aquecimento ligeiro
                 numa corrente de azoto e pesar a fracção esterólica assim obtida.
              C. Análise cromatográfica em fase gasosa dos esteróis
                 1 . Preparação dos trimetilsileteres (TMSE)
                     Para cada mg de esterol, acrescentar na proveta 0,02 ml de reagente para a silanização, composto de
                     uma mistura de piridina-hexametilazana-trimetilclorosilana 9/3 / 1 (v/v/v), tendo o cuidado de evitar
                     qualquer vestígio de humidade . Colocar a proveta num dessecador durante cerca de trinta minutos,
                     depois fechar, centrifugar durante alguns minutos. Retirar, para a análise a praticar em seguida, a
                     solução restante.
                 2 . Condições da análise por cromatografia em fase gasosa
                     Temperatura da coluna : 220 a 250 °C.
                     Temperatura do sistema de injecção se for aquecido separadamente : 20 a 40 °C acima da tempera­
                     tura da coluna. Consumo do azoto : 50 a 60 ml por minuto. Desligar o detector e equilibrar as novas
                     colunas nestas condições durante dezasseis a vinte e quatro horas. Ligar o detector, acender a chama
                     e regular os consumos de hidrogénio, de oxigénio ou de ar de forma a obter uma altura de chama e
                     uma sensibilidades adequadas. Pôr o registador a funcionar e deixar o papel correr a uma velocidade
                     adequada ; acrescentar o zero e o atenuador. Se a linha de base for estável, o aparelho está pronto a
                     ser utilizado.
                 3 . Teste de sensibilidade
                     Recolher 5 ml da solução do teste de sensibilidade, evaporar o solvente, tratar como indicado em 1 ;
                     injectar 0,1 a 0,2 jxl da solução assim preparada (TMSE). Só deve surgir no cromatograma um
                     vértice de colesterol .
                     Regular o atenuador de forma a utilizar aproximadamente toda a escala do registador.
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        4. Teste de resolução dos vértices
            Recolher 5 ml da solução preparada para o teste de resolução.
            Evaporar o solvente, tratar como indicado em 1 .
            Injectar 0,1 a 0,2 (0,1 da solução assim preparada (TMSE).
            Os vértices de colesterol, de brassicasterol, de campesterol e de 6-sitosterol devem surgir no croma­
            tograma. Medir as distâncias de retenção (distância do ponto de injecção ao ponto de altura máxima
            do vértice) dos vértices, dCH para o colesterol, dB para o brassicasterol, dc para o campesterol e ds
            para o 6-sitosterol e as larguras na base dos vértices (comprimento de retenção entre as intersecções
            com a linha de base das tangentes nos pontos de inflexão situados nos lados anterior e posterior do
            vértice) ωCH para o colesterol e coB para o brassicasterol. A resolução dos vértices expressa pela se­
            guinte fórmula.
                                                          PR = 2 (Q" — dCH)
                                                                   ωB + ωCH
            deve ser pelo menos igual 1 .
            Calcular os tempos de retenção relativos (colesterol = 1,00) para o brassicasterol, o campesterol e o
            6-sitosterol .
        5 . Teste de referência
            Recolher 5 ml da solução do teste de referência, evaporar o solvente tratar como indicado em 1 ,
            injectar 0,1 a 0,2 µl da solução assim preparada (TMSE). Os vértices de campesterol, de estigmaste­
            nol, de 6-sitosterol e A 7 estigmastenol devem surgir no cromatograma.
            Medir as distâncias de retenção dos vértices dc para o compesterol, dSx para o estigmastenol, ds para
            6-sitosterol e dST — 7 para o A 7 estigmastenol.
            Calcular os tempos de retenção relativos que são aproximadamente :
                                           colesterol :                          1,0 ,
                                           brassicasterol :                      1,1 ,
                                           campesterol :                         1,3 ,
                                           estigmasterol :                       1,4 ,
                                           6-sitosterol :                        1,6 O.
                                          Δ 7 estigmastenol                      1,8 (2) .
        6 . Análise
            Injectar 0,1 a 0,2 µl da solução TMSE dos esteróis a analisar e registar o cromatograma.
    D. Expressão dos resultados
        Para a interpretação da composião da fraccão esterólica analisada, não se devem ter em conta cumes
        com tempos de retenção diferentes dos determinados experimentalmente para os 6 esteróis acima referi­
        dos .
        O teor em % em 6-sitisterol é dado pela fórmula :
                                                  Área do vértice do 6-sitosterol             ^
                                           Soma das áreas dos seis vértices de esteréis
        O conteúdo em 6-sitosterol não deve ser inferior a 93 % em relação à composição em % dos esteróis
        totais .
    (') Se outros esteróis tiverem, como o A 5 avenasterol, nestas condições, o mesmo volume de retenção que o 6-sitosterol ,
        são contados como 6-sitosterol .
    (!) Se outros esteróis tiverem, nestas condições, o mesmo volume de retenção que o A 7 estigmastenol, são contados como
        A 7 estigmastenol.
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                                                               ANEXO IX
                                          TEOR EM ÓLEO DOS BAGAÇOS DE AZEITONA
              Material
              — aparelho de extracção adequado munido de um balão de 200 a 250 ml,
              — banho de aquecimento eléctrico (banho de areia, banho de água, etc.) ou placa de aquecer,
              — balança analítica,
              — estufa regulada a 80 °C no máximo,
              — estufa com aquecimento eléctrico munido de um dispositivo de termorregulação regulado a 103 °C ±
                   2 ° C que permita realizar uma insuflação de ar ou uma pressão reduzida,
              — triturador mecânico fácil de limpar e que permita a trituração sem aquecimento e sem diminuição
                   sensível do seu teor em água e em óleo,
              — cartucho de extracção e algodão hidrófilo ou papel filtro, isentos de produtos extraíveis com hexano,
              — dessecador,
              — peneira com orifícios de 1 mm de diâmetro,
              — pedra-pomos em pequenos grãos, previamente seca.
              Reagente
              n-hexano técnico cujo resíduo na evaporação completa deve ser inferior a 0,002 g por 100 ml.
                                                          MODO OPERATORIO
              Preparação da amostra para análise
              Triturar a amostra para laboratório, se necessário, num triturador mecânico previamente bem limpo a fim
              de o reduzir em partículas que possam atravessar completamente a peneira.
              Utilizar cerca de um vigésimo da amostra para perfazer a limpeza do triturador, deitar essa parte fora,
              triturar o restante, recolhê-lo, misturá-lo com cuidado e analisar sem demora.
              Tomada de ensaio
              Pesar, com uma margem de 0,01 g, logo após o final da trituração, aproximadamente 10 g de amostra para
              análise .
              Preparação do cartucho de extracção
              Colocar a tomada de ensaio no cartucho e tapá-lo com o tampão de algodão hidrófilo. No caso de ser ter
              utilizado um papel filtro, embalar a moedura nesse papel.
              Pré-secagem
              Se o bagaço estiver muito húmido (teor em água e em matérias voláteis superior a 10 %), efectuar uma
              pré-secagem colocando durante um espaço de tempo conveniente o cartucho cheio (ou o papel filtro) na
              estufa aquecida a 8 °C no máximo, para reduzir o teor em água e em matérias voláteis a menos de 10 °/o .
              Preparação do balão
              Pesar, com uma margem de 1 mg, o balão que contém 1 a 2 grãos de pedra-pomos, previamente seco na
              estufa a 103 °C ± 2°Ce depois arrefecido durante pelo menos uma hora num dessecador.
              Primeira extracção
              Colocar no aparelho de extracção o cartucho (ou o papel filtro) que contém a tomada de ensaio. Verter
              para o balão a quantidade necessária de hexano. Adaptar o balão ao aparelho de extracção e colocar o
              conjunto sobre um banho com aquecimento eléctrico. Conduzir o aquecimento em condições tais que o
              consumo do refluxo seja pelo menos de três gotas por segundo (ebulição moderada, não tumultuosa).
              Após quatro horas de extracção, deixar arrefecer, tirar o cartucho do aparelho de extracção e colocá-lo
              numa corrente de ar a fim de eliminar a maior parte do solvente que o impregna.
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    Segunda extracção
    Despejar o cartucho no microtriturador e triturar o mais fino possível. Voltar a colocar quantitativamente a
    mistura no cartucho e esta no aparelho de extracção.
    Recomeçar a extracção ainda durante duas horas utilizando o mesmo balão que contém a primeira extrac­
    ção .
    A solução obtida no balão de extracção deve ser límpida. Se o não for, filtrá-la em papel filtro lavando
    várias vezes o primeiro balão e o papel filtro com hexano. Recolher o filtrado e o solvente de lavagem num
    segundo balão previamente seco e pesado com uma margem de 1 mg.
    Eliminação do solvente e pesagem do extracto
    Expulsar, por destilação sobre banho de aquecimento eléctrico, a maior parte do solvente. Eliminar os
    últimos vestígios de solvente aquecendo o balão na estufa a 103 °C ± 2 °C durante 20 minutos. Facilitar
    esta eliminação, quer insuflando ar de vez em quándo ou de preferência um gás inerte, quer actuando sob
    pressão reduzida.
    Deixar arrefecer o balão num dessecador durante pelo menos uma hora, e pesá-lo com uma margem de 1
    mg .
    Voltar a aquecer durante 10 minutos nas mesmas condições, arrefecer no dessecador e pesar.
    A diferença entre os resultados destas duas pesagens deve ser inferior ou igual a 10 mg. Se não, voltar a
    aquecer durante períodos de dez minutos seguidos do arrefecimento e da pesagem, até que a diferença de
    massa seja no máximo igual a 10 mg. Ter em consideração a última pesagem do balão.
    Efectuar duas determinações na mesma amostra para análise.
                                       EXPRESSÃO DOS RESULTADOS
    Modo de cálculo e fórmula
    a) O extracto expresso em percentagem em massa do produto tal como se apresenta é igual a :
                                                        c         100
                                                        S = m, x
                                                                   mc
            em que : S é a percentagem em massa de extracto do produto tal como se apresenta,
                     mc é a massa, em gramas, da tomada de ensaio,
                     m, é a massa, em gramas, do extracto após secagem.
        Tomar como resultado a média aritmética das duas determinações, se as condições de repetibilidade
        estiverem preenchidas.
        Exprimir o resultado com uma única decimal.
    b) O extracto é reduzido à matéria seca utilizando a seguinte fórmula :
                                       S x              = extracto em % gordo/seco
        em que :
        S é a percentagem em massa do extracto do produto tal como se apresenta (ver alínea a)),
        U é o seu teor em água e em matérias voláteis .
    Repetibilidade
    A diferença entre os resultados das duas determinações, efectuadas simultaneamente ou rapidamente uma
    após a outras pelo mesmo analista, não deve ser superior a 0,2 g de extracto com hexano para 100 g de
    amostra .                                    —
    No caso contrário, repetir a análise com outras duas tomadas de ensaio. Se ainda desta vez a diferença
    ultrapassar 0,2 g, tomar como resultado a média aritmética das quatro determinações efectuadas.
