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31990R1864

REGULAMENTO  (CEE) N* 1864/90 DA COMISSAO  de 29 de Junho de 1990  que altera o Regulamento (CEE) n* 1470/68, relativo à colheita e reduçao das amostras bem como aos métodos de analise das sementes oleaginosas  

Jornal Oficial nº L 170 de 03/07/1990 p. 0027 - 0034 Edição especial finlandesa: Capítulo 3 Fascículo 33 p. 0023  Edição especial sueca: Capítulo 3 Fascículo 33 p. 0023 



*****REGULAMENTO  (CEE) Nº 1864/90 DA COMISSÃO  de 29 de Junho de 1990  que altera o Regulamento (CEE) nº 1470/68, relativo à colheita e redução das amostras bem como aos métodos de análise das sementes oleaginosas  A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,  Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Europeia,  Tendo em conta o Regulamento nº 136/66/CEE do Conselho, de 22 de Setembro de 1966, que estabelece a organização comum de mercado no sector das matérias gordas (1), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CEE) nº 2902/89 (2), e, nomeadamente, o seu artigo 24ºA,  Considerando que a denominação « duplo zero » para as sementes de colza e de nabita depende do seu teor de glucosinatos; que, para determinar esse teor, é conveniente prever o método mais adequado;  Considerando que o Regulamento (CEE) nº 1470/68 da Comissão (3), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CEE) nº 2435/86 (4), define o método comum para a Comunidade de determinação do teor de glucosinatos das sementes de colza; que, de então para cá, foi aperfeiçoado e testado um método de análise melhor; que é necessário alterar o método comum para a Comunidade de determinação do teor de glucosinatos;  Considerando que as medidas previstas no presente regulamento estão em conformidade com o parecer do Comité de Gestão das Matérias Gordas,  ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:  Artigo 1º  O anexo VIII do Regulamento (CEE) nº 1470/68 é substituído pelo anexo do presente regulamento.  Artigo 2º  O presente regulamento entra em vigor na data da sua publicação no Jornal Oficial das Comunidades Europeias.  É aplicável a partir de 1 de Julho de 1990.  O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e directamente aplicável em todos os Estados-membros.  Feito em Bruxelas, em 29 de Junho de 1990.  Pela Comissão  Ray MAC SHARRY  Membro da Comissão  (1) JO nº 172 de 30. 9. 1966, p. 3025/66.  (2) JO nº L 280 de 29. 9. 1989, p. 2.  (3) JO nº L 239 de 28. 9. 1968, p. 2.  (4) JO nº L 210 de 1. 8. 1986, p. 55.  ANEXO  « ANEXO VIII  SEMENTES OLEAGINOSAS - DETERMINAÇÃO DOS GLUCOSINOLATOS  Por cromatografia líquida de alta resolução  1.2 // 1.   // ÂMBITO DE APLICAÇÃO   //   // O presente anexo define o método de determinação de diferentes glucosinolatos em sementes oleaginosas de espécies Brassica, especialmente na colza, por meio da cromatografia líquida de alta resolução. Este método não faz a determinação para os glucosinolatos que são substituídos na molécula de glicose, mas estes compostos têm pouca importância na colza comercial.   // 2.  // REFERÊNCIAS   //   // A preparação de amostras para análise deve ser efectuada em conformidade com os respectivos anexos do presente regulamento. Em especial, são importantes os seguintes anexos:   //   // anexo II - redução das amostras para laboratório em amostras para análise,   //   // anexo III - determinação do teor em água e substâncias voláteis.   // 3.  // FUNDAMENTO   //   // A extracção dos glucosinolatos numa solução de metanol, seguida de purificação e de dessulfatação enzimática em resinas de troca iónica. Determinação através de uma cromatografia líquida de alta resolução em fase inversa, com gradiente de eluição e detecção no ultravioleta.   // 4.  // REAGENTES   //   // Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica e a água utilizada deve ser destilada ou ter pelo menos uma pureza equivalente.   // 4.1.   // Metanol, solução a 70 % (V/V) em água.   // 4.2.   // Acetato de sódio, solução a 0,02 mol/l, com pH 4,0.   // 4.3.   // Acetato de sódio, solução a 0,2 mol/l.   // 4.4.   // Formato de imidazole, solução a 6 mol/l.   //   // Dissolver 204 g de imidazole em 113 ml de ácido fórmico, num balão volumétrico de 500 ml. Desfazer até 500 ml com água.   // 4.5.   // Padrão interno   //   // Utilizar a sinigrina (monoidrato potássico de alilglucosinolato, PM = 415,49) cuja pureza deve ser verificada como indicado no ponto 4.5.3.   // 4.5.1.   // Solução de sinigrina a 5 mmol/l   //   // Dissolver 207,7 mg de monoidrato potássico de alilglucosinolato em água, num balão volumétrico de 100 ml, e perfazer até à marca.   // 4.5.2.   // Solução de sinigrina a 20 mmol/l   //   // Dissolver 831,0 mg de monoidrato potássico de alilglucosinolato em água, num balão volumétrico de 100 ml, e perfazer até à marca.   //  // Guardar estas soluções num frigoríico, a aproximadamente 4 °C, se a armazenagem for de curta duração (por exemplo, uma semana), ou num congelador, a -18°C para períodos mais longos.  // 4.5.3.   // Controlo da pureza da sinigrina   //  // Utilizar um ou mais dos três testes seguintes:   //   // - a análise por CLAR, utilizando o presento método, apenas deve originar um pico principal,   //   // - a análise da sinigrina intacta por CLAR (técnica iões-emparelhamento) apenas deve originar um pico principal,   //   // - a análise da sinigrina dessulfatada e sililada por cromatografia em fase gasosa apenas deve originar um pico principal.  //  // Nestes testes, o pico principal deve representar pelo menos 98 % do total das áreas dos picos.   //   // Confirmar através da determinação da quantidade de glicose libertada após hidrólise com mirosinase (tioglucósido-gluco-hidrólase CE 3.2.3.1). A glicose deve ser medida através de meios enzimáticos, utilizando um equipamento de teste comercial. É necessário ter em conta toda a glicose livre presente, que deve ser determinada sem adição de mirosinase. A concentração molar de glicose medida deve ser pelo menos 98 % da concentração molar da solução de sinigrina testada.   // 4.5.4.   // Padrão interno alternativo: glucotropaeolina   //   // Em determinadas sementes de espécies Brassica ou em sementes de espécies similares (cultivadas ou não), a sinigrina pode estar presente naturalmente. Quando a sinigrina estiver presente naturalmente, um outro padrão interno, a glucotropaeolina (sai potássico de benzilglucosinolato, PM = 447,52), deverá ser utilizado, mas a sua separação dos outros glucosinolatos naturais secundários é por vezes difícil.   //   // Utilizar a glucotropaeolina da mesma forma que a sinigrina (soluções a 5 e 20 mmol/l), após verificação da sua pureza, em conformidade com o processo descrito no ponto 4.5.3, e verificar se o seu factor de resposta, em comparação com a sinigrina, corresponde ao indicado no ponto 7.2.   // 4.6.   // Fases móveis   // 4.6.1.  // Eluente A: água (de qualidade CLAR).   // 4.6.2.  // Eluente B: acetonitrilo (de qualidade CLAR) em solução em água (de qualidade CLAR) a 20 % (V/V). A concentração pode ser modificada em função das colunas utilizadas.   // 4.7.  // Resina de troca iónica   // 4.7.1.   // DEAE Sepharose C1-6B, em suspensão e vendida pronto para utilização   //  // ou   // 4.7.2.   // DEAE Sephadex A25, em suspensão preparada do seguinte modo:   //   // misturar 10 g de resina num excesso de ácido acético a 2 mol/l. Deixar em repouso. Juntar ácido a 2 mol/l até que o volume da suspensão seja igual a duas vezes o volume de material sedimentado.   // 4.8.  // Sulfatase, tipo H1 (CE 3.1.6.1) Helix pomatia, previamente purificada e sujeita a uma verificação como atrás indicado e depois diluída   // 4.8.1.   // Preparação das colunas de troca iónica   //   // Cortar cinco pipetas de Pasteur (5.9) 7 cm acima do gargalo e colocar uma rolha de lã de vidro na extremidade (5.8). Colocar as pipetas verticalmente num suporte e deitar em cada uma uma suspensão de resina de troca iónica DEAE Sepharose C1-6B (4.7.1), de modo a que, uma vez drenada a água, seja obtido um volume de 500 ml de resina.   //  // Deitar 1 ml de solução de formato de imidazole a 6 mol/l (4.4) em cada pipeta e enxaguar duas vezes com 1 ml de água.  // 4.8.2.   // Purificação da sulfatase   //   // Pesar, com uma aproximação de 0,1 mg, 25 mg de Helix pomatia do tipo H1, dissolver em 2,5 ml de água e transferir 500 ml desta solução para cada uma das colunas regeneradas (4.8.1). Lavar cada coluna com 1,5 ml de água, removendo o efluente. Em seguida, adicionar 1,5 ml de uma solução de acetato de sódio a 0,2 mol/l (4.3), recuperar e recolher os eluídos das cinco colunas num tubo de ensaio.   //   // Concentrar os eluídos por filtração num filtro Milipore PTGC 11K25, até que seja obtido um resíduo de aproximadamente 100 ml (a sulfatase com uma massa molar superior a 5 000 não é removida). Adicionar 2,5 ml de água e concentrar mais uma vez por filtração, até que seja obtido um resíduo de aproximadamente 100 ml. Diluir até 2,5 ml com água e guardar a sulfatase purificada num congelador a -18 °C (em pequenas quantidades, de modo a permitir a descongelação da quantidade necessária para utilização imediata).   // 4.8.3.  // Teste da actividade da sulfatase   // 4.8.3.1.  // Preparação de uma solução de sinigrina a 0,15 mmol/l, tamponada a pH 5,8  //  // Preparar successivamente as seguintes soluções:   //   // a) Transferir 1 ml de ácido acético para um balão de 500 ml e perfazer com água até à marca;   //   // b) Transferir 1 ml de etilenodiamina para um balão de 500 ml e perfazer com água até à marca;  //  // c) Misturar 73 ml da solução a) e 40 ml da solução b);  //   // d) Ajustar a pH 5,8 com as soluções a) ou b).   //  // Deitar 3 ml da solução de sinigrina a 5 mmol/l (4.5.1) para um balão de 100 ml e perfazer com a solução c) até à marca.  // 4.8.3.2.   // Teste da actividade  //  // Uma unidade de actividade é expressa como sendo a produção de um micromole de sinigrina dessulfatada por minuto, a 30 °C e pH 5,8.   //  // Para o teste, transferir 2 ml de solução de sinigrina tamponada (4.8.3.1) para as células de referência e de medição do espectrómetro (5.3) ajustado a um comprimento de onda de 228 nm, sendo a temperatura das células de 30 °C. No instante t = 0, colocar 50 ml de sulfatase purificada (4.8.2) na célula de medição e ligar o registador. Para o registador quando a absorvência deixa de variar (Ae),  traçar a tangente no ponto t = 0 e medir o seu gradiente D A D t .  //  // A actividade de sulfatase, expressa em unidades de actividade por mililitro de solução de sulfatase, é igual a:  1.2.3.4.5.6.7 //   // D A D t   // ×   // V D E   // ×   // 1 000 50   // × 106  1.2 //  // em que:  1.2.3 //   // D A D t   // é o gradiente da tangente no ponto t = 0, em unidades de absorvência por minuto;   //   // V   // é o volume, em litros, do meio de reacção (isto é 2,0510 × 10-3 l);   //   // D E   // é a diferença entre os coeficientes de extinção molar e da sinigrina dessulfatada a 228 nm  1.2.3.4 //   //   // D E =   // D Ae e × c  1.2.3 //   //   // em que:  1.2.3.4 //   //   // D Ae   // é a diferença entre a absorvência no equilíbrio da sinigrina dessulfatada e a absorvência no instante t = 0   //   //   // e   // é o comprimento da célula, em centímetros (isto é, 1 cm);  //   //   // c   // é a concentração da sinigrina dessulfatada no equilíbrio, em moles por litro (isto é,  1.2.3.4.5.6 //  //   //   // c =   // 0,15 × 10-3 × 0,95 × 2 2,05   // = 1,39 × 10-4 mol/l).  1.2 //   // A produção no equilíbrio da dessulfatação da sinigrina é de 0,95.   //   // Calcular DE, que deve ser da ordem de 1 500 l.mol-1. cm-1.   //   // A actividade da sulfatase pode também ser calculada utilizando a seguinte forma simplificada:  1.2.3 //   // Actividade =   // D A × 5,7 D t × D Ae  1.2 //   // A actividade encontrada deve ser superior a 0,5 mmol/m.n ml da solução de sulfatase purificada (4.8.2).   // 4.8.4.   // Diluição   //  // Utilizando uma pipeta, transferir 1 ml de sulfatase purificada (4.8.2) para um balão volumétrico de 10 ml, perfazer com água até à marca e misturar.   //   // Dividir a solução em pequenas quantidades e armazenar a -18 °C.   // 5.  // APARELHOS E UTENSÍLIOS   //   // Equipamento habitual de laboratório e, em especial:   // 5.1.   // Cromatógrafo líquido de alta resolução, para obtenção de um gradiente de eluição e controlo da temperatura da coluna a 30 °C, ligado a um detector UV que permita medições a 229 nm.   // 5.2.   // Coluna cromatográfica para CLAR, do tipo C18 ou C8, com uma dimensão das partículas  5 mm, ou, por exemplo:  1.2.3 //  // Lichrosorb RP 18  5 mm   // (150 mm × 4,6 mm)   //  // Spherisorb ODS2  5 mm   // (250 mm × 4-5 mm)   //  // Novapak C18 4 mm   // (150 mm × 4 mm)   //   // Lichrospher RP8  5 mm   // (125 mm × 4 mm)   //   // Nucleosil C18  5 mm  // (200 mm × 4 mm) 1.2 //  // A resolução da coluna escolhida deve ser controlada regularmente, utilizando de preferência uma amostra de referência de colza (é aconselhada a utilização de glucosinolatos dessulfatados, obtidos de preferência a partir de amostras provenientes do Serviço Comunitário de Referência). Em especial, a coluna não deve degradar a 4-hidroxiglucobrassicina, glucosinolato importante mas relativamente instável.   //   // As novas colunas devem ser submetidas a um funcionamento preliminar, de modo a obter resultados reprodutíveis.   // 5.3.   // Espectrómetro de feixe duplo, que possa funcionar no ultravioleta e, se possível, com um controlo da temperatura a 30 °C, equipado de células de quartzo e, possível, de um sistema de registo.   // 5.4.  // Triturador, por exemplo moinho de café.   // 5.5.  // Centrifugadora, para tubos de 6 ml, susceptível de obter uma aceleração centrífuga de 5 000 g.   // 5.6.   // Banho de água quente ou bloco de aquecimento, ajustável a 75 °C.  // 5.7.   // Tubos de polipropileno, de 6 ml de capacidade.  // 5.8.   // Lã de vidro.   // 5.9.   // Pipetas de Pasteur, de 150 mm de comprimento.   // 6.   // TÉCNICA   // 6.1.  // Preparação da amostra de ensaio   //   // Reduzir as amostras laboratoriais a amostras para análise em conformidade com o anexo 11 e proceder à sua trituração no triturador (5.4) durante 20 segundos. Misturar a farinha e triturar de novo durante cinco segundos.   //   // Se as sementes tiverem um teor de humidade superior a 10 % (m/m), secá-las primeiro utilizando uma corrente de ar a aproximadamente 45 °C.   //  // Nota: quando são analisadas sementes tratadas, lavá-las antes da trituração com diclorometano.   // 6.2.  // Determinação do teor de humidade e substâncias voláteis  //   // Proceder a esta determinação na amostra para análise, em conformidade com o anexo III.   // 6.3.   // Toma de ensaio  //   // Preparar dois tubos (5.7) e transferir 200 mg da amostra para análise de sementes oleaginosas, pesadas com uma aproximação de 0,1 mg, para cada um.   // 6.4.   // Extracção dos glucosinolatos   //   // Colocar os tubos no banho de água quente ou no bloco de aquecimento (5.6) regulado a 75 °C e deixar durante um minuto. Juntar 2 ml de solução em ebulição de metanol a 70 % (4.1) e adicionar imediatamente:   //   // - no primeiro tubo A, 200 m de solução de sinigrina a 5 mmol/l (4.5.1),   //   // - no segundo tubo B, 200 ml de solução de sinigrina a 20 mmol/l (4.5.2).   //   // Continuar o aquecimento no banho a 75 °C durante 10 minutos, agitando regularmente. Misturar o conteúdo de cada tubo e centrifugar com uma aceleração de 5 000 g durante três minutos. Transferir cada sobrenadante para outro tubo (5.7).   //   // Juntar 2 ml da solução em ebulição de metanol a 70 % (4.1) a cada sedimento e voltar a aquecer no banho a 75 °C durante 10 minutos, agitando regularmente. Centrifugar durante três minutos e juntar o sobrenadante ao original. Ajustar o volume a aproximadamente 5 ml com água e misturar.   //   // Este extracto pode ser conservado durante duas semanas, ao abrigo da luz, num congelador a -18 °C.   // 6.5.   // Preparação das colunas de troca iónica   //   // Cortar o número necessário de pipetas de Pasteur (5.9), isto é, uma pipeta por amostra, de modo a deixar um volume de 1,2 ml na parte de cima do gargalo e colocar uma rolha de lã de vidro (5.8) no mesmo. Colocar as pipetas verticalmente num suporte.   //   // Deitar 0,5 ml de suspensão de DEAE Sephadex A 25 (4.7.2) bem misturada em cada coluna e deixar em repouso.   //   // Lavar as colunas com 2 ml de formato de imidazole a 6 mol/l (4.4) e, em seguida, duas vezes com 1 ml de água.  1.2 // 6.6.   // Purificação e dessulfatação   //  // Adicionar 1 ml do extracto (6.4) à coluna preparada (6.5) sem interferir na superfície de resina a deixar drenar. Juntar duas vezes 1 ml de tampão de acetato de sódio a 0,02 mol/l de pH 4,0 (4.2), deixando drenar de cada vez.   //   // Colocar 75 ml da solução diluída e purificada de sulfatase (4.8.4). Deixar em repouso durante uma noite à temperatura ambiente. Eluir os glucosinolatos dessulfatados obtidos com, duas vezes, 1 ml de água, deixando drenar entre cada adição. Recolher o eluído num tubo. Misturar bem o eluído a armazenar, ao abrigo da luz, num congelador a -18 °C, caso não seja imediatamente sujeito a cromatografia.   // 6.7.   // Teste de referência   //   // Se necessário (ver 7.3), efectuar um teste de referência nas mesmas condições, numa toma de ensaio idêntica, mas eliminando a solução de padrão interno de sinigrina, a fim de detectar e quantificar a eventual sinigrina presente na toma de ensaio.  // 6.8.   // Cromatografia   // 6.8.1.   // Equilibração do equipamento   //   // Taxa de fluxo da fase móvel: depende da natureza da coluna (ver 6.8.2)   //   // Temperatura da coluna: 30 °C   //   // Comprimento de onda de detecção: 229 nm  // 6.8.2.   // Teste e gradiente de eluição   //   // De acordo com as instruções de funcionamento do equipamento, injectar não mais de 50 ml da solução de glucosinolatos dessulfatados, obtida em 6.6.   //   // Consoante a coluna utilizada, podem ser adequados diversos gradientes:   //   // - coluna de Spherisorb RP 18 5 mm (150 mm × 4,6 mm):   //   // - 100 % de eluente A (4.6.1.) + 0 % de eluente B (4.6.2.) durante um minuto,   //   // - gradiente de eluição linear em 20 minutos, até à obtenção de 0 % de eluente A e 100 % de eluente B,   //   // - gradiente de eluição linear em cinco minutos, até à obtenção de 100 % de eluente A e 0 % de eluente B,   //  // - para equilibrar, 100 % de eluante A e 0 % de eluente B, durante cinco minutos,   //   // - coluna de Lichrospher RP8 5 m m (125 mm × 4,0 mm):   //   // - 100 % de eluente A durante dois minutos e 30 segundos,   //   // - gradiente de eluição linear em 18 minutos, até à obtenção de 0 % de eluente A + 100 % de eluente B,   //   // - 100 % de eluente B durante cinco minutos,   //   // - gradiente de eluição linear em dois minutos de 0 % de eluente A + 100 % de eluente B, até à obtenção de 100 % de eluente A e 0 % de eluente B,   //   // - equilibrar durante cinco minutos.   //   // Nota: os perfis dos gradientes podem ser alterados com vista a obter separações óptimas consoante as colunas utilizadas.   // 6.8.3.   // Exame dos cromatogramas.   //   // Ter em conta apenas os picos com uma área superior a 1 % da soma total das áreas dos picos glucosinolatos.   //   // A ordem de eluição dos picos com uma coluna do tipo C18 e um gradiente de eluição de 6.8.2 é geralmente a seguinte:   //   // 1. Glucoiberina dessulfatada  //   // 2. Progoitrina dessulfatada   //   // 3. Epiprogoitrina dessulfatada   //   // 4. Sinigrina dessulfatada   //   // 5. Glucorafanina dessulfatada   //   // 6. Gluconapoleiferina dessulfatada   //   // 7. Glucoalissina dessulfatada   //   // 8. Gluconapina dessulfatada   //   // 9. 4-Hidroxiglucobrassicina dessulfatada   //   // 10. Glucobrassicanapina dessulfatada   //   // 11. Glucotropaeolina dessulfatada   //   // 12. Glucobrassicina dessulfatada   //  // 13. Gluconasturtiina dessulfatada   //   // 14. 4-Metoxiglucobrassicina dessulfatada   //   // 15. Neoglucobrassicina dessulfatada  // 7.   // RESULTADOS   // 7.1.   // Cálculo do teor de cada glucosinolato   //   // O teor de cada glucosinolato, expresso em micromoles por grama da totalidade de sementes secas, é igual a:  1.2.3.4 //   // área do pico de glucosinolato dessulfatado área do pico de sinigrina dessulfatada   // ×  // quantidade de padrão interno adicionado ao tubo em 6.4 (em m moles) peso da amostra de sementes extraída 1.2.3.4 //  // × factor de resposta de glucosinolato dessulfatado (7.2)   // ×  // 100 100 - H  1.2 //   // em que:   //   // H é o tzeor de humidade e de substâncias voláteis, expresso em percentagem em massa, da amostra para análise (6.2).   //   // Em determinados casos, é necessário expressar os resultados a um nível específico de humidade (presentemente, 9 %). Nesses casos, multiplicar o resultado obtido para a matéria seca por   //  // 100 - humidade 100  // 7.2.   // Factores de resposta   //  // Os valores dos factores de resposta foram determinados experimentalmente; foram fixados por consenso entre diversos laboratórios que participaram nesses ensaios e podem necessitar, a seu tempo, de uma revisão.   //   // Glucoiberina dessulfatada 1,07   //   // Glucobrassicanapina dessulfatada 1,15   //   // Glucorafanina dessulfatada 1,07   //  // 4-Hidroxiglucobrassicina dessulfatada 0,28   //  // Glucoalissina dessulfatada 1,07   //   // Glucobrassicina dessulfatada 0,29   //   // Progoitrina dessulfatada 1,09   //  // Neoglucobrassicina dessulfatada 0,20   //  // Epiprogoitrina dessulfatada 1,09   //   // Glucotropaeolina dessulfatada 0,95   //   // Sinigrina dessulfatada 1,00   //  // Gluconasturtiina dessulfatada 0,95   //   // Gluconapina dessulfatada 1,11   //   // Gluconapoleiferina dessulfatada 1,00   //   // 4-Metoxiglucobrassicina dessulfatada 0,25   //  // Outros glucosinolatos dessulfatados 1,00   // 7.3.  // Teor total de glucosinolatos   //   // O teor total de glucosinolatos, expresso em mmoles por grama de matéria seca da amostra, é igual à soma de todos os glucosinolatos cujas áreas de pico sejam superiores a 1 % da soma total das áreas dos picos.   //   // A utilização de padrões internos de referência com duas concentrações (4.5.1 e 4.5.2) torna possível a determinação da sinigrina contida na amostra ou da presença de um composto desconhecido que co-elua com a sinigrina.   //  // - Se a diferença entre os resultados do teor total de glucosinolatos das duas repetições estiverem em conformidade com as condições de repetibilidade (8.2), não há contaminação do padrão interno de referência. O resultado é a média aritmética das duas determinações,   //   // - Se a diferença entre os resultados não estiver em conformidade com as condições de repetibilidade (8.2), repetir a determinação com duas outras amostras para análise e efectuar um ensaio de referência (6.7) sem solução de padrão interno. A área contaminante é deduzida da área de padrão interno, para obter a área real do padrão interno de referência utilizada na fórmula do ponto 7.1. O resultado é a média aritmética dos resultados das duas novas determinações.   // 8.   // PRECISÃO E EXACTIDÃO   // 8.1.   // Precisão (repetibilidade e reprodutividade)  //   // Em 1988, foi organizado um estudo interlaboratorial, numa base internacional, que contou com a participação de 12 laboratórios; cada um destes efectuou duas determinações para cada amostra, tendo sido obtidos os resultados estatísticos indicados no quadro 1 (determinados em conformidade com a norma ISO 5752 « Aplicação estatística - exactidão dos métodos de ensaio - determinação de um método de ensaio normalizado por ensaio interlaboratorial »).  //  // Quadro 1: Valores de repetibilidade e de reprodutibilidade obtido a partir do estudo interlaboratorial 1.2.3.4.5 //    //   //   //   //   // Amostras  // Colza A  // Colza B   // Colza C   // Colza D   //    //   //   //  //   // Número de laboratórios após eliminação dos resultados díspares   // 11   // 11   // 11   // 11   //    //   //   //  //   // Média   // 20,6   // 14,1   // 4,9   // 25,6   //  //   //   //   //   // Desvios-padrão de repetibilidade típicos   // 1,7   // 0,6   // 0,3   // 0,8   // Coeficiente de variação da repetibilidade   // 8,5 %   // 4,4 %   // 6,7 %  // 3,3 %   // Repetibilidade   // 4,9   // 1,7   // 0,9  // 2,4   //    //   //   //   //   // Desvios-padrão de reprodutibilidade típicos   // 3,4   // 2,5   // 1,5   // 2,4  // Coeficiente de variação de reprodutibilidade   // 17 %  // 18 %   // 31 %   // 9,4 %   // Reprodutibilidade   // 9,6  // 7,1   // 1,4   // 6,8   //    //   //   //   // 1.2 // 8.1.1.   // Repetibilidade   //   // Aplicando os resultados anteriores (8.1), a diferença entre os valores de duas determinações, efectuadas rapidamente uma após a outra, pelo mesmo analista e utilizando o mesmo equipamento com a mesma amostra de ensaio, não deve exceder 2 mmoles/g para os teores inferiores a 20 mmoles/g e 4 mmoles/g para os teores compreendidos entre 20 e 35 mmoles/g.   // 8.1.2.  // Reprodutibilidade   //   // Aplicando os resultados anteriores (8.1), a diferença entre os valores dos resultados finais obtidos por dois laboratórios, utilizando o presente método para a análise da mesma amostra laboratorial, não deve exceder 4 mmoles/g para teores inferiores a 20 mmoles/g e 8 m moles/g para teores compreendidos entre 20 e 35 mmoles/g.  // 8.2.   // Exactidão   //   // A utilização correcta do método será verificada efectuando as medidas repetitivas sobre os materiais de referência com teor certificado em glucosinolatos totais de cobrindo a gama de concentração referida.   //   // Os materiais apropriados de teor certificado podem ser obtidos junto do gabinete comunitário de referência (BCR) da Comissão das Comunidades Europeias.   //  // O protocolo para comparar os resultados de laboratórios obtidos com os materiais de referência de teor certificado é descrito no parágrafo « instruções para uso » do relatório que acompanha os materiais de referência.   // 9.   // RELATÓRIO DE ENSAIO   //   // O relatório de ensaio deve descrever o método utilizado e os resultados obtidos. Deve igualmente mencionar quaisquer pormenores do funcionamento não especificados na norma internacional ou considerados facultativos, bem como quaisquer acontecimentos que possam ter afectado o resultado.  //   // O relatório de ensaio deve dar todas as informações necessárias para a identificação completa da amostra. »  


