如何检测 DNA 甲基化？
在检测 DNA 甲基化之前，首先要了解 DNA 甲基化在基因组中的概况。 人类大约有 30 亿个碱基对，DNA 主要发生在 CpG 二核苷酸上，基因组中大约有 2800 万个 CpG 位点。这些 CpG 位点中，大约 60~80% 被甲基化，而在一些特定的区域，比如启动子，存在 CpG 位点富集的序列，我们称之为 CpG 岛，CpG 岛通常未被甲基化。但在肿瘤细胞中，整体甲基化水平降低至 20~50%，与正常细胞相比，即可能有 10~60% 的 CpG 位点的甲基化状态发生了改变，也就是大约 280~1680 万个 CpG 位点。 总体而言，人类基因组中 DNA 甲基化位点数量巨大，要搞清楚每个位点的 DNA 甲基化状态，技术难度大，而且很烧钱。庆幸的是，很多时候我们并不总是需要检测全基因组的 DNA 甲基化状态。 根据不同的实验目的，研究者已经开发了众多 DNA 甲基化检测方法。这些方法包括重亚硫酸盐转化测序（BS-Seq）、MeDIP-Seq、RRBS-Seq、WGBS、MBD-Seq、SMRT 等，还有比较新的方法，比如纳米孔测序以及我们实验室去年发表的“导向定位测序（Guide positioning sequencing，GPS）”。当然，甲基化检测方法并不止这些，甲基化检测方法多达上百种。 我这样说完，估计大家还是一头雾水。接下来，我会按照我们实际研究过程中的思考逻辑，对现有的主流 DNA 甲基化检测方法进行分类解读。 我的策略是提几个问题。首先，摸一下自己的口袋，或者查一下自己课题组的银行账户，我有钱吗？如果你想要做全基因的 DNA 甲基化，并不便宜，有钱才好办事。第二个问题，检测 DNA 甲基化要花多久？我如果希望做短平快的课题，不要让我搞好几年才有结果，或者研究生急着要毕业。当然，如你所愿，有一些快速评估DNA甲基化的方法。第三个问题，我打算检测 cfDNA 的甲基化，DNA 量非常少，这个时候我该怎么办？也不用担心，也有一些适合微量 DNA 的甲基化检测方法。最后，我有钱也有样本，使用这种方法，最后产生什么样的数据，我可以发表什么样的文章呢。 这四个问题是我们在开始选择 DNA 甲基化检测方法时需要认真考虑的。当然，这是四个问题的通俗版本。从实际课题研究的角度，我们有另外四个问题，引导我们选择合适的 DNA 甲基化检测方法。第一个问题是，我们要检测整体的（global）甲基化还是位点特异性的甲基化。需要特别强调的是，global 并不等于 genome-wide，global 是看整体 DNA 甲基化的高低，但是不知道特定基因或者特定位点的 DNA 甲基化水平。这就好比两袋糖果，你称一下，知道一袋糖果比另一袋更重，但是你并不知道这一袋糖果中，每一颗有多重，你无法对每一颗的重量进行比较。当然，有时候，我们可能需要先知道整体的变化情况，比如我们刚才提到的，肿瘤细胞中整体低甲基化。如果我要检测整体的 DNA 甲基化的高低，我该使用什么方法呢？ Global DNA 甲基化的检测 HPLC-UV 一种比较简单快捷，不需要繁琐建库过程的方法是 HPLC-UV。首先使用 DNaseI、Nuclease P1 和碱性磷酸酶三种核酸酶将 DNA 水解为单个核苷，随后通过高效液相色谱分离不同的核苷，最后在 254nm 和 280nm下检测吸光值，计算 dC 和 5mdC 的含量[1]。对于 HPLC 而言，首先，你得有高效液相色谱仪可用，而且需要的 DNA 量为 1-5ug。 LC-MS/MS 如果采用色谱和串联质谱联用，可降低对起始 DNA 量的需求，起始 DNA 50-100ng 即可，还有文献报道用 5ng DNA 进行检测[3]。LC-MS/MS 对于不同质量的 DNA 没有偏好性，比如低质量的 FFPE 样本，这就像你吃东西的时候，不管你吃的山珍海味还是粗茶淡饭，到肚子里面都差不多。显而易见的是，这种方法依赖于色谱和串联质谱仪，还需要专业的操作人员。当然，你们医院或者机构有这样的设备，LM-MS/MS 其实是很好的方法。 基于 ELISA 的方法 还可以用基 ELISA 的方法快速估计 DNA 甲基化的水平。先将 DNA 结合到反应孔中，洗掉未结合的 DNA；加入 5mC 特异性抗体，然后加入用于检测的二抗，加入显色剂，测量吸光值。甲基化的 DNA 越多，OD450nm 的值越高。基于 ELISA 的方法优缺点很明显，优点是非常快速，而且操作简单，缺点是结果不稳定，干扰因素比较多，适用于检测整体 DNA 甲基化非常显著的情况，比如整体DNA甲基化水平变化了 1.5-2 倍。基于 ELISA 的方法需要的 DNA 量为 100ng-2ug，而且目前市面上有多种可选择的试剂盒。 重复序列 DNA 甲基化 第四种方法是检测人类基因组中的重复序列的 DNA 甲基化高低。人类基因中蛋白质编码序列大约只占了 1.5%，人类基因组中含有大量的重复序列，包括 LINE-1、SINE、LTR 等。一种简便的评估整体 DNA 甲基化水平的策略是，检测 LINE-1 的甲基化，作为整体 DNA 甲基化水平的替代。 检测原理是：biotin 标记的 LINE-1 探针与 MseI 消化的基因组片段杂交，随后吸附到包被了 streptavidin 的板子上，随后洗掉非特异性结合，这个时候板子上依次结合了streptavidin-biotin-LINE-1 探针-LINE-1片段，加入 5mC 抗体特异性，然后用 HRP 偶联的二抗识别，最后进行显色。 可以先用已知的 LINE-1 甲基化水平，绘制甲基化与灰度值的标准曲线。这种方法的检测灵敏度大约为 0.5%。当然，对于 LINE-1 重复序列，先用重亚硫酸盐转化，随后 PCR，可以区分 5% 的 DNA 甲基化水平。 LUMA（luminometricmethylation assay） 还有一种我们比较常用的方法叫 LUMA。先用一个 CpG 甲基化敏感的酶 HpaII 以及一个甲基化不敏感的酶 MspI 平行消化 DNA，它们都会切割 CCGG 位点，产生 5'-CG 悬挂。在酶切反应中，同时含有 EcoRI 酶，作为内参，在酶切后产生 5'-AATT 悬挂。随后进行焦磷酸反应，依次加入 dATP，A 跟 T 结合，延伸后释放 2 个焦磷酸；第二步，加入 dCTP 和 dGTP，释放两个焦磷酸；第三步，加入 dTTP，释放两个焦磷酸；第四步，加入 dCTP 和 dGTP，此时由于没有地方延伸，因此不会释放焦磷酸。释放的焦磷酸在硫酸化酶的作用下，产生 ATP 和腺苷腺硫酸。随后，在荧光素酶和 ATP 的作用下，荧光素转化为氧化荧光素，并产生部分可见光，信号可以被 CCD 捕获。 对于 CG 位点，如果没有被甲基化，那么 HpaII 和 MspI 都可以切割，于是可以产生 C+G 的信号；如果被甲基化，这个时候 HpaII 不能切割，因此不能产生 C+G 的信号；而 MspI 依然可以切割，可以继续产生 C+G 的信号。HpaII/Msp1 两种情况下 C+G 信号的比值与样本中未甲基化 DNA 的量成比例。由于在焦磷酸反应中添加的核苷酸的序列是已知的，因此这种方法的特异性非常高，变异性很低，这对于检测总体甲基化中的微小变化非常关键。LUMA 需要的 DNA 起始量为 100-500ng，但是需要高质量的 DNA 来保证发生完全的酶催反应。另外，聚合酶延伸反应需要焦磷酸测序仪和相关的试剂。我们总体对比一下，前两种是偏分析化学的方法，对DNA质量没有要求，反正最后都是水解为核苷，但是 LC-MS/MS 的灵敏度更高一些。基于 ELISA 的方法比较快速，而且有商业化的 kit 可用，但是结果并不稳定，而且灵敏度不高。基于 LINE-1 的方法，以局部反映整体情况。最后是 LUMA，由于需要进行限制性内切酶酶切以及延伸，因此对 DNA 的质量要求比较高，而且需要焦磷酸测序仪。 位点特异性的 DNA 甲基化 刚才我们介绍了总体 DNA 甲基化水平的检测，但是这些方法都没有提供序列信息。如果我们需要知道位点特异性的甲基化信息，这个时候需要问第二个问题，我是只检测感兴趣的几个基因就行了，还是需要知道全基因组每一个基因的甲基化状态。如果我们只需要检测特定基因的 DNA 甲基化状态，紧接着，我们需要问第三个问题，我们只是定性地看看甲基化状态，还是定量地看甲基化的水平。 Methylation-specific PCR，MSP 如果只是定性地看甲基化的状态，最简单快捷的是甲基化特异性的 PCR。MSP 可以快速检测 CpG 岛中任意一组 CpG 位点的 DNA 甲基化状态。 首先抽提 DNA，进行重亚硫酸盐转化，未甲基化的 C 转变为 U，随后用两对引物进行 PCR，一对引物是甲基化特异性的引物，可以结合甲基化的 DNA，另一对可以特异性结合未甲基化的 DNA。如果一开始被甲基化了，那么利用甲基化特异性的引物可以扩增出来；如果一开始呈现未甲基化状态，那么使用特异性结合未甲基化的引物可以扩增出来；随后通过琼脂糖凝胶电泳即可检测。我们可以看到，这里最关键的是针对特定的区域设计两对 PCR 引物，我们可以借助 Methprimer 网站（http://www.urogene.org/methprimer/）设计甲基化的引物；MSP 最大的优势是，非常简单和快速，你只需要有一台 PCR 仪就可以进行了，但是最大的局限在于你每次可能只能检测一两个 CpG 位点。 MethyLight 当然，我们还可以选用基于荧光的方法，比如 MethyLight。比如在甲基化特异性的引物的 5’ 端偶联上 FAM 的荧光团，而在未甲基化特异性的引物的 5’ 端偶联上另一种荧光团 VIC，在 real-time PCR 过程中，会不断释放 FAM 和 VIC，通过检测 FAM 和 VIC，来鉴定甲基化的状态；通过测定 Ct 值，对甲基化进行定量。对于每个 PCR 反应而言，模板量小于 100 ng  重亚硫酸盐转化的 DNA。 Bisulfite cloning & Sequencing MSP 和 MethyLight 都是简单快速的方法，都需要借助甲基化的引物。对于检测特定基因的甲基化，最常用的可能是重亚硫酸盐转化&克隆测序（Bisulfite cloning & Sequencing）。首先针对特定的区域设计引物，随后用限制性内切酶消化基因组DNA，接着用重亚硫酸盐处理，PCR，挑克隆测序。这里推荐一些引物设计过程中可能需要用到的软件或网址，包括如何寻找 CpG 岛，如何设计甲基化的引物等。通常，结果呈现是如图 16（右下）。 焦磷酸测序（Pyrosequencing） 当然，检测特定基因甲基化状态的“金标准”还是焦磷酸测序（Pyrosequencing）。先用重亚硫酸盐转化，随后进行焦磷酸测序，焦磷酸测序的原理此前已经讲解，不再赘述。 前面我们已经问了三个问题，基于这三个问题，分别讲解了 global DNA 甲基化的检测方法、特定基因的甲基化检测方法，而且其中还区分是定性检测还是定量检测。那么，如果我们想要做较为深入的研究，我们可能需要知道全基因组的 DNA 甲基化状态，试图从中找到一些线索。这个时候，我们要问第 4 个问题，检测全基因组 DNA 甲基化时，使用芯片还是高通量测序。 基于芯片的全基因组 DNA 甲基化检测方法 如果我们使用基于芯片的方法，核心都是先获得 DNA 片段，随后杂交到 microarray 上。策略主要有三种，最常用的还是先用重亚硫酸盐转化（不再赘述）；一种是基于甲基化抗体或 MBD （Methyl-CpG-Binding Domain）亲和的富集方法，另一种是用限制性内切酶进行酶切。 甲基化抗体或 MBD 亲和富集 对于甲基化抗体或 MBD 亲和的富集方法，核心策略都是先把基因组打断，随后把甲基化的 DNA 片段富集出来，并杂交到 microarray 上，当然也可以用二代测序。 限制性内切酶消化 对于用限制性内切酶进行酶切的方法，存在一些可以特异性区分甲基化状态的限制性内切酶，经过这些特别的限制性内切酶处理后，甲基化和未甲基化的序列中只有一种是完整的，随后对这些完整的序列加上标签，并杂交到芯片上。而另一些片段中含有内切酶的识别位点，被切割掉，因此不能扩增。 比如差异甲基化杂交技术（differential methylation hybridization，DMH）借助限制性内切酶和 microarray 对人类基因组中 CGI 的甲基化状态进行检测。首先利用 MseI 对基因组 DNA 进行片段化（小于 200bp），MseI 的识别位点很少出现在 GC 富集的区域，因此 CGI 得到保留。随后，酶切后的片段连接到合成的接头上，并被甲基化敏感的限制性内切酶 BstUI 或 HpaII 切割，超过 80% 的 CGI 中含有 BstUI 识别位点。甲基化的 DNA 可以抵抗限制性内切酶的酶切，而未甲基化的 DNA 被切割。之后，借助已知的接头序列进行 PCR。甲基化的 DNA 完整保留，可以扩增出来；未甲基化的 DNA 被酶切，无法扩增。PCR 产物被标记上荧光染料，Cy3 用于标记正常对照样本的 DNA，Cy5 用来标记癌症样本中的 DNA。与等量的扩增子混匀并被覆盖到有人类 CGI 文库探针的 DMH microarray slide。在严格的杂交后，微弱的和未结合的扩增子被严苛的条件洗掉，留下来的 microarray slide 随后利用激光束进行高分辨率的荧光扫描。每一个位点的 Cy5 比 Cy3 的强度可以反映肿瘤相对于正常组中的甲基化状态。与之截然相反，McrBC 可以切割甲基化的 DNA，最后扩增出来的产物完全相反。 当然，目前使用最多的芯片还是 450K 芯片；450K 芯片覆盖整个基因组的多个位置，而且相对比较便宜；可同时检测 12 个样本；每个样本覆盖 45 万个甲基化位点，而且可以做到碱基分辨率；而且适用于 FFPE 样本。 基于高通量测序的全基因组 DNA 甲基化检测方法 接下来，我们看一下第四个问题的另一种答案，我们用高通量测序来检测全基因组的 DNA 甲基化。之所以最后讲这个，是因为这个比较烧钱，而且后续的生物信息学分析比较复杂。 WGBS & RRBS 对于二代测序的方法，WGBS（Whole-Genome Bisulfite Sequencing）是目前的“金标准”。WGBS 想必大家都已经很熟悉了，但是考虑到 WGBS 成本较高，因此还有一种跟 WGBS 十分相似，但是只测基因组中的一部分的方法，即 RRBS（Reduced representation bisulfite sequencing）。 两者的差别在于，WGBS 通常使用超声打断整个基因组，并对整个基因组进行重亚硫酸盐处理和测序；但是 RRBS 使用 MspI 限制性内切酶。RRBS 可以检测到人类基因组中 85% 的 CpG 岛。RRBS 大约需要 100ng-1ug 的 DNA，而对于 WGBS 而言，需要 50-100ng DNA。尽管 WGBS 被誉为检测 DNA 甲基化的“金标准”，但是依然存在很多的不足。首先，重亚硫酸盐必须转化未甲基化的 DNA，否则会造成假阳性，不过目前我们可以通过加入 spike-in 作为对照来克服这个问题；还有，目前测到的 DNA 甲基化是多个细胞的平均甲基化状态，单细胞的 DNA 甲基化检测可能克服这个问题；其次，重亚硫酸盐转化，会降低基因组的复杂度，造成后续的 mapping 率不高；重亚硫酸盐转化还可能造成 DNA 断裂，这使得扩增长片段比较困难。另外，WGBS 的成本还是非常高的。 Guide Positioning Sequencing (GPS) 为了克服 WGBS 的这些困难（尤其是 mapping 率问题），我们课题组开发了 GPS，原理我不再赘述。从结果来看， GPS 可以准确率非常高，而且 mapping 率显著高于 WGBS。 从成本上来看，GPS 也要更便宜，每 100 万个 CpG 位点的成本为 12.6 美元，而 WGBS 的为 14.2 美元。如果长期使用 GPS，可以为你们实验室省下不少钱。 Padlock probes 此外，还有一种比较独特的使用 padlock 探针来富集基因组的选定区域。这些线性的寡核苷酸探针经过专门设计，每一端与目的区域的一侧杂交，DNA 聚合酶在捕获区域延伸，随后线性化，并经过扩增、片段选择，最后测序。 SMRT（single molecule real-time） 前面我们介绍的方法都是基于二代测序的，近些年还涌现出三代测序的方法，比如 Pacific Bioscience 公司开发的单分子实时测序技术 SMRT。 SMRT 是一种非常有应用前景的单碱基测序技术，其原理是四种荧光标记的 dNTP 分子在 DNA 聚合酶催化下于纳米孔中高速延伸，标记在磷酸上的荧光基团随着 DNA 链的延伸而脱落，根据 dNTP 与不同修饰形式碱基在聚合反应中的动力学差异，检测荧光持续时间，从而直接对碱基修饰进行测序。因此，SMRT 具有超长的读长（tens of kilobases）、准确度高和不需要进行 PCR 扩增等优势[14]。 Nanopore sequencing（纳米孔技术） 另一个非常具有潜力的三代测序技术是纳米孔测序技术，其中 Oxford Nanopore 开发了一系列基于纳米孔测序的仪器。Nanopore 技术原理：在脂膜中置入一个蛋白纳米孔，单链DNA通过纳米孔，系统记录不同序列的 DNA 通过纳米孔时离子电流的变化。甲基化的碱基与未甲基化的碱基通过纳米孔时离子电流变化不同，因此可以检测 DNA 甲基化[15, 16]。 总体而言，纳米孔测序技术的技术特点为：可直接对 DNA/RNA 进行测序，也可以测 DNA 甲基化；长读长，可达数百 kb；单分子，对未扩增的 DNA 进行检测，而且不使用重亚硫酸盐；实时测序；一次反应可检测多种 DNA 修饰，包括 5mC 和 6mA；测序仪是便携式的，因此不需要额外的场地或其他成本；文库构建非常简单快速。 正是基于这些特点，使得 nanopore 可以在很多特殊的条件下使用，比如在一些非洲地区。不过这种 Oxford Nanopore 测序仪 MiniON 套装并不便宜，17271 元的套装里面包含两张 flow cell，每一张 flow cell 可以产生 30Gb 的 DNA 序列数据；如果是测 RNA，则可以产生 7-12 million reads.至此，我们通过四个问题，对主流的 DNA 甲基化检测方法进行了梳理。我们通过下图再快速回顾一下。 接下来，我们将假设几种研究场景，尝试选择较为合适的 DNA 甲基化检测方法。对于临床医生而言，可能有相对校对的 FFPE 样本资源。对于来源肿瘤的组织而言，DNA 甲基化会发生显著变化。第一种情况，如果我想要检测 FFPE 中整体的 DNA 甲基化的高低，我该怎么办？一般很多医院或平台都会有 HPLC 或 LC-MS/MS，因此还是推荐比较快速的 HPLC-UV 或 LC-MS/MS；当然，如果有焦磷酸测序仪可用，也可用 LUMA（不过考虑到 FFPE 中提取的 DNA 质量不高，LUMA 对 DNA 质量有较高要求，用 LUMA 可能有风险）。如果这些仪器都没有，酶标仪总能找到吧，那就先用基于 ELISA 的方法或者检测 LINE-1 甲基化的 kit 快速评估。第二种情况，如果发现整体的 DNA 甲基化有显著变化，我看了文献，发现有一些基因的甲基化可能会发生显著变化，我希望验证一下，我该如何选择？建议选择叫重亚硫酸盐转化&克隆测序，或者焦磷酸测序，这两种方法检测非常准确，在文献中出现的频率非常高，认可度也相对较高。 第三种情况，我其实没有太多的头绪，我希望测更多的基因或位点的甲基化，我该怎么办？这个时候可以考虑性价比比较高的芯片，比如 450K 或者 850K 芯片，它们分别可以检测全基因组 45 万和 85 万个甲基化位点，省时省力，价格也可以接受。第四种情况，我希望做比较深入的研究，比较不同条件下全基因组的甲基化差异，做一些 data-drive 的研究，那么我们可能会选择 WGBS 或 RRBS。不过如前所述，复旦于文强教授课题组开发了 GPS 方法，相比 WGBS，在准确度和 mapping 率方面更优，而且成本更低，可作为 WGBS 的替代方法。 本文提供了 DNA 甲基化检测方法的选择策略，希望对大家有帮助！ 全文完。 本文作者为复旦大学生物医学研究院博士生徐鹏。2019年11 月 10 日，徐鹏博士受邀参加在复旦大学附属中山医院举办的第三届现代临床分子诊断论坛——甲基化技术论坛分论坛，做了题为《Make Decision: DNA 甲基化检测方法，哪一款适合你？》的报告，本文根据报告整理而成。文中所有数据来源于文献，由于技术更新较快，数据更可能会发生变化。 参考文献： 1. 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